FI92714B - Kahden uuden hybridooman tuottamia apolipoproteiini-B-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita - Google Patents

Description

! 92714

Kahden uuden hybridooman tuottamia apolipoproteiini-B-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita

Esillä oleva keksintö koskee yleisesti uusia hybridoomia ja erityisemmin hybridoomia, jotka tuottavat reseptorimolekyyle-jä, jotka immunoreagoivat apolipoproteiini B-100:n kanssa, siten tuotettuja reseptorimolekyyleja, kuin myös diagnostisia menetelmiä ja systeemejä, joissa käytetään reseptorimolekyyle jä .

Lipoproteiinit ovat plasman kolesterolin ja triglyseridien primäärisiä kuljettajia. Ne ovat misellaarisia lipidi-proteiinikomplekseja, jotka sisältävät proteiinia (nimitettynä apoproteiiniksi) ja polaarisia lipidejä järjestäytyneinä pinta-kalvossa, joka ympäröi neutraalilipidiydintä (triglyseridi ja kolesteryyliesteri). Lipoproteiineja identifioitiin alunperin perustuen niiden ominaispainoihin mitattuna ultrasentrifugoimal-la. Sen mukaisesti tunnetaan neljä päätiheysluokkaa: kylomikro-nit, hyvin pienitiheydelliset lipoproteiinit (VLDL), pieniti-heydelliset lipoproteiinit (LDL), ja suuritiheydelliset lipoproteiinit (HDL).

Rinnan ultrasentrifugaalisten erotusten teknologian edistymisen kanssa on LDL- ja HDL-tiheysluokat jaettu edelleen lisäksi neljään homogeenisuudeltaan suurempaan alaluokkaan. LDL voidaan esimerkiksi jakaa keskitiheydelliseksi lipoproteiini (IDL)-ja LDL2~alaluokiksi. Nämäkin alaluokat koostuvat kuitenkin toiminnallisesti heterogeenisistä lipoproteiinipartikkelien populaatioista, johtuen niiden vaihtelevasta apoproteiini-pitoisuudesta.

Kahdeksan pääapoproteiinia, A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, ja E, on eristetty, ja vähäisempien aooproteiinien ryhmästä, joita voidaan ottaa talteen suurempina määrinä tietyistä tiheysluokista, useimpia voidaan myös tavata muista tiheysluokista. Näin ollen useimmat LDL-partikkelit sisältävät 9271 4 2 ainoastaan apo B:tä, joidenkin partikkelien sisältäessä kuitenkin myös muita apoproteiineja, ja tämä selittää ne pienet määrät apo C-I:tä, apo C-II:ta, C-III:a ja apo E:tä, jotka ovat läsnä tässä tiheysluokassa.

Joissakin tapauksissa tiettyjä toimintoja on katsottu kuuluvaksi tietyille apoproteiineille. Esimerkiksi, erästä apo B-lajia, joka syntetisoituu maksassa, nimeltä apo B-lOO, tunnistavat ja sitovat solun LDL-reseptorit. Sitomalla apo B-lOO:aa nämä reseptorit sitovat LDL-partikkeleita ja vetävät niitä pois plasmasta. LDL joutuu siinä yhteydessä solujen sisään ja hajotetaan, jolloin se luovuttaa kolesterolinsa kunkin solun tarpeita varten. Apo B-LDL-reseptori-vuorovaikutuksella on siten huomattava osa LDL-kolesterolin poistamisessa verestä.

LDL-reseptori ei tunnista toista apo B-lajia, nimeltä apo B-48. Tätä apo B-lajia, jonka koko apo B-100:aan nähden on vain 48 %, syntetisoituu ihmisissä vain suolessa. Liooproteiinit, jotka sisältävät apo B-48:aa, kuten esimerkiksi kylomikronit ja kylomikronijäänteet, eivät sitoudu LDL-reseotoriin.

Vaikkakin nämä kaksi apo B-lajia näyttävät olevan geneettisesti erillisesti säädeltyjä (on kuvattu yksittäistä potilasta, jonka ruumiissa kehittyy apo B-48:aa, mutta ei aoo B-100:aa), immunologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että apoproteii-neilla B-100 ja B-48 on yhteneväiset antigeeniset paikat (determinantit). Vähintään kolme tutkimusryhmää on raportoinut kaikkiaan seitsemän eri monoklonaalisen vasta-aineen kehittämisestä, jotka sitoutuvat joko apo B-100:aan tai apo B-48:aan. Noiden tutkijoiden raportoimista tuloksista voidaan selvästi päätellä, että apo B-48 ja apo B-100 ovat rakenteeltaan samantapaisia; so. että apo B-48 voi vastata osaa apo B-100-proteii-nista. On esitetty myös aineistoa, jonka mukaan apo B-48;aa ja apo B-lOO:aa ei tavata samassa lipoproteiinipartikkelissa, mikä osoittaa, että on olemassa erillisiä apo B-partikkeleita.

li 3 92714

Useat tutkijat ovat viime aikoina esittäneet, että plasman apo B-tasot voivat antaa paremmin viitteitä sepelvaltimotauti-riskistä (coronary artery disease, CAD) kuin plasman LDL-koles-terolitasot. Sniderman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 604-608 (1980). Koska valtimonkovetustauti ja siihen liittyvät komplikaatiot ovat edelleen suurin syy kuolemaan ja heikkouteen länsimaissa, on lääketieteellinen teollisuus pitkään tuntenut tarvetta löytää määrityssysteemejä, joilla kyetään toteamaan CAD:n riskihenkilöt.

Monentyyppisistä plasman apoproteiini B:n immunomäärityksistä on raportoitu, joissa käytetään hyväksi soesifisiä antibodeja sisältäviä antiseerumeita, mukaanlukien kompetitiiviset neste-ja kiinteäfaasiset radioimmunomääritykset (RIA), entsyymi-kytkeiset immunosorbenttimääritykset (ELISA), radiaaliset immunodiffuusiomääritykset ja muut määritykset. Ongelmia, jotka rajoittavat näiden apo B-immunomääritysten laajalle levinnyttä käyttöä, ovat olleet toistettavuus ja käytettyjen anti-seerumien laatu ja spesifisyys. Kokooma-artikkeleita metodologisista ongelmista, koskien kutakin erityyppistä apo B-määritys-tä, ovat kirjoittaneet Currey et ai., Clin. Chem. 24, 280-286 (1978) ja Rosseneu et ai., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983).

Useat tutkijat ovat raportoineet paneelien kehittämisestä, jotka sisältävät monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen apo B:tä vastaan, käytettäväksi tämän antigeenisen rakenteen ja lipo-proteiinimetabolisen merkityksen tutkimiseen. Lisäksi on esiintynyt raportteja koskien monoklonaalisten anti-apo B-vasta-aineiden käyttämistä plasman apo B-tasojen mittaamiseen neste-faasisissa RlA-määrityksissä. Patton et ai., Clin. Chem. 29, 1898-1903 (1983) ja Maynard et ai., Clin. Chem. 30, 1620-1624 (1984). Yksi ryhmä on lisäksi raportoinut monoklonaalisten anti-apo B-vasta-aineiden seoksen käytöstä plasman apo B:n radiaalisessa immunodiffuusiomäärityksessä. Marconvina et ai. Clin. Chim. Acta 147, 117-125 (1985). Näitä määritysmenetelmiä haittaavat kuitenkin tarve pitkiin inkubointeihin, toistuvaan 4 9271 4 sentrifugointiin tai radioaktiivisten aineiden käyttöön.

Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö reagensseina, määritettäessä apo B-100:n läsnäoloa ihmisen ruumiinnestenäytteissä on houkuttelevaa, koska sellaisia reagensseja voidaan tuottaa niiden aikaan saamisen jälkeen suhteellisen suurissa määrissä tasalaatuisesti. On olemassa kuitenkin joukko tekijöitä, jotka ovat erityisen monoklonaalisen vasta-aineen käyttöä vastaan sen ollessa komponenttina apo B-100-määrityssysteemissä.

Ensiksi, tieteen mukaan on tunnettua, että monoklonaalinen vasta-aine voi olla liian immunospesifinen ollakseen käyttökelpoinen kohdeantigeenin antigeenisestä heterogeenisyydestä johtuen. Tavanomaisten polyklonaalisia vasta-aineita sisältävien antiseerumien spesifisyys riippuu satojen tuhansien erilaisten vasta-aineiden samasuuntaisuudesta, jotka sitoutuvat antigeenisiin determinantteihin ja kattavat suurimman osan tai kaiken antigeenisen proteiinin. Tämän seurauksena, pienet muutokset antigeenin rakenteessa, johtuen geneettisestä monimuotoisuudesta, heterogeenisyydestä glykosylaatiossa tai lievästä denaturoitu-misesta, vaikuttavat tavallisesti hyvin vähän polyklonaalisen vasta-aineen sitoutumiseen. Samalla tavalla, vaihtelevan suuruinen vasta-aineiden alajoukko polyklonaalisista antiseerumeista sitoo antigeenejä, joita on modifioitu tai denaturoitu.

Vastakohtana, monoklonaaliset vasta-aineet sitoutuvat tavallisesti antigeenimolekyylillä olevaan yhteen antigeeniseen determinanttiin (epitooppi). Jos, syystä tai toisesta, sitä determinanttia muutetaan, antibodi voi tai ei voi jatkaa sitoutumista. Se, onko tämä ongelma vai etu, riippuu yksittäisistä olosuhteista. Jos, kuten esillä olevassa tapauksessa, monoklonaa-lista vasta-ainetta on tarkoitus käyttää apoproteiinin diagnostisessa määrityksessä, voisi vähäinen antigeeninen muunnos tuossa proteiinissa aiheuttaa selviä virheitä.

Apoproteiini B-lOO:n antigeeninen heterogeenisyys on hyvin d dokumentoitu. Esimerkiksi apo B:n epitoopin ilmenemisen on n 5 9271 4 todettu vaihtelevan sen mukaan mikä on (1) yhteen liittyneiden lipidien koostumus, (2) immunoreaktion lämpötila, (3) LDL:n eristämisaste sen luonnollisesta ympäristöstä, ja (4) yksilöiden välinen geneettinen ilmeneminen.

Toiseksi, ainutlaatuisen spesifisyytensä johdosta monoklonaali-sen vasta-aineen (MoAb) menestyksellinen käyttö on usein riippuvaista sen affiniteetistä kohdeantigeenia kohtaan. Esimerkiksit vaikka MoAbrn affiniteetti saattaa olla riittävä ollakseen hyödyksi sidottaessa neste- ja kiinteätaasista antigeeniä, samalla kun MoAb itse on nestefaasissa, sama vasta-aine ei ehkä ole käyttökelpoinen kiinteänä kiinnitettynä vasta-aineena, joka on käyttökelpoinen antigeenin sitomisessa ja "poisvetämisessä" liuoksesta.

Edellä olevat ongelmat ovat tunnusomaisia monoklonaalisten vasta-aineiden käytölle. Alaa tuntevat ovat sen vuoksi havainneet, että on välttämätöntä testata ja karakterisoida monoklonaaliset vasta-aineet jokaisessa määrityssysteemissä, jossa niitä on tarkoitus käyttää. Katso Goding, James W., Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice." Sivut 40-46, Academic

Press, New York (1983).

Yhdeltä näkökannalta tässä keksinnössä tarkastellaan hybridoomaa, jolla on merkintä HL130C2.3C5, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746. Tähän hybridoomaan ja sen reseptorimolekyyleihin viitataan tässä myös merkinnällä MB47.

Toiselta näkökannalta tässä keksinnössä tarkastellaan reseptori-molekyylejä, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-lOO:n kanssa, ja joita erittää hybridooma ATCC HB 8746.

Vielä toiselta näkökannalta tässä keksinnössä tarkastellaan hybridoomaa, jolla on merkintä V82A6.1G4, jonka ATCC-talletus-numero on HB 8742. Tähän hybridoomaan ja sen reseDtorimolekyy-leihin viitataan tässä myös merkinnällä MB24.

6 92714

Vielä toiselta näkökannalta tässä keksinnössä tarkastellaan reseptorimolekyylejä, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja joita erittää hybridooma ATCC HB 8742.

Toiselta näkökannalta tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan soluviljelmää, joka käsittää (a) tämän keksinnön mukaisen hybri-dooman; (b) mainitun hybridooman erittämiä reseptorimolekyylejä, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa; ja (c) vilje-lyalustan hybridoomalle.

Eräältä lisänäkökannalta tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan menetelmää apoproteiini B-lOO:n läsnäolon määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä, joka menetelmä käsittää vaiheet: (a) otetaan määritettäväksi tarkoitettu ruumiinnestenäyte; (b) tuotetaan reseptorimolekyylejä biologisesti aktiivisessa muodossa, jotka (i) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja (ii) joita erittää joko hybridooma HB 8746 tai HB 8742; (c) sekoitetaan ruumiinnestenäyte reseptorimolekyylien kanssa: (d) pidetään seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka reseptorimolekyylien kannalta on riittävä sitomaan immunologisesti näytteessä läsnä olevaa apoproteiini B-100:aa immunoreaktantin muodostamiseksi; ja (e) määritetään muodostuneen immunoreaktantin määrä.

· Toisessa näkökohdassa tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan menetelmää apoproteiini B-100:n määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä, joka menetelmä käsittää vaiheet: (a) otetaan määritettäväksi tarkoitettu ruumiinnestenäyte; (b) tuotetaan kiinteä kantaja, joka käsittää kiinteän matriisin, johon on kiinnittyneenä ensimmäinen reseptori biologisesti aktiivisessa muodossa, joka reseptori immunoreagoi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota erittää hybridooma, jonka ATCC-talletus-numero on HB 8746; (c) tuotetaan biologisesti aktiivista toista reseptoria, joka immunoreagoi apoproteiini B-lOO:n kanssa, ja jota erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, mainitun 11 9271 4 7 toisen reseptorin ollessa liittynyt leimana toimivaan entsyymiin, jonka avulla on mahdollista ilmaista mainitun toisen reseptorin läsnäolo immunoreaktantissa; (d) sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti: (i) mainittu ruumiista otettu näyte; (ii) ensimmäinen reseptori; ja (iii) leimattu toinen reseptori kiinteä/nestefaasisen immuno-reaktioseoksen muodostamiseksi; (e) pidetään seosta biologisissa määritvsolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka aika on ensimmäisen reseptorin ja leimatun toisen reseptorin kannalta riittävä sitomaan immunologisesti näytteessä läsnä oleva apoproteiini B-100 kiinteätaasisen, kerroksellisen immunoreaktantin muodostamiseksi; (f) erotetaan mainittu kiinteätaasinen, kerroksellinen immuno-reaktantti nestefaasista; ja (g) määritetään muodostuneessa kiinteätaasisessa, kerroksellisessa immunoreaktantissa sidottuna olevan leimatun toisen reseptorin määrä.

Toiselta näkökannalta tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan kompetitiivista menetelmää apoproteiini B-100:n määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä, joka menetelmä käsittää vaiheet: (a) otetaan määritettäväksi ruumiinnestenäyte; (b) tuotetaan kiinteä kantaja, joka käsittää kiinteän matriisin, johon on kiinnittyneenä ennalta määrätty määrä reagenssia apoproteiini B-100; (c) oleellisesti samanaikaisesti sekoitetaan (i) näyte ruumiista; (ii) kiinteä kantaja; ja (iii) ennalta määrätty määrä reseptorimolekyvlejä, jotka reagoivat immunologisesti apoproteiini B-100:n kanssa, joka on erittynyt joko hybridoomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridoomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, kiinteä/nestef aasisen seoksen muodostamiseksi; 9271 4 8 (d) pidetään seosta biologisissa määritysolosuhteissa se aika, joka reseptorimolekyylien kannalta on riittävä sitoutumaan immunologisesti kiinteällä kantajalla oleviin apoproteiini B-100-molekyyleihin, ja ruumiinnestenäytteessä läsnä oleviin apoproteiini B-100-molekyyleihin ja muodostamaan kiinteäfaasinen immunoreaktantti ja nestefaasinen immunoreaktantti; (e) erotetaan kiinteäfaasinen immunoreaktantti mainitusta nestefaasista; (f) sekoitetaan kiinteäfaasinen immunoreaktantti biologisesti aktiivisen toisen reseptorin kanssa, joka immunoreagoi ensimmäisen reseptorin kanssa toisen kiinteä/nestefaasisen immunoreak-tioseoksen muodostamiseksi, toisen reseptorin ollessa liittynyt leimana toimivaan entsyymiin, jonka avulla pystytään ilmaisemaan mainitun toisen reseptorin läsnäolo immunoreaktantissa; (g) pidetään mainittua toista seosta biologisissa määritysolosuhteissa se aika, joka leimatun toisen reseptorin kannalta on riittävä sitoutumaan immunologisesti ensimmäiseen reseptoriin, joka on läsnä kiinteäfaasisena immunoreaktanttina, kiinteäfaasisen kerroksellisen immunoreaktantin muodostamiseksi; (h) erotetaan kiinteäfaasinen, kerroksellinen immunoreaktantti nestefaasista; ja (i) määritetään leimatun toisen reseptorin määrä, joka on sitoutunut mainittuun kiinteäfaasiseen, kerrokselliseen immuno-reaktanttiin.

Toisessa näkökohdassa, tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan soluviljelmää, joka käsittää: (a) hybridooman, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746; (b) hybridooman erittämiä reseptorimolekyylejä, jotka reagoivat immunologisesti apoproteiini B-100:n kanssa; ja (c) viljelyalustan hybridoomalle.

Toisessa näkökohdassa, tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan koostumusta, joka käsittää: (a) hybridooman, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742;

II

9271 4 9 (b) hybridooman erittamiä reseptorimolekyylejä, jotka reagoivat immunologisesti apoproteiini B-lOO:n kanssa; ja (c) viljelyalustan hybridoomalle.

Toisessa näkökohdassa, tämän keksinnön mukaisesti tarkastellaan diagnostista systeemiä apo B-lOO:n määrän määrittämiseksi ruumiinnäytteestä, joka systeemi käsittää: (a) biologisesti aktiivisen ensimmäisen spesifisen sitovan aineen, joka käsittää reseptorimolekyylejä, jotka (i) immunorea-goivat apoproteiini B-100:n kanssa; ja (ii) ovat joko reseptori-molekyylejä, joita erittää hybridooma ATCC HB 8746, tai reseptorimolekyyle jä , joita erittää hybridooma ATCC HB 8742; ja (b) biologisesti aktiivisen, leimatun toisen spesifisen sitovan aineen ilmaisemaan ensimmäisen sitovan aineen immunoreaktio-ta apo B-lOO:n kanssa.

Kiinteä matriisiaffiniteettisorbentti, joka käsittää kiinteä-faasisen matriisin kiinnitettynä biologisesti aktiivisiin re-septorimolekyyleihin, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja jotka valitaan ryhmästä, joka käsittää: (a) reseptorimolekyylejä, joita erittää hybridooma HB 8746; (b) reseptorimolekyylejä, joita erittää hybridooma ATCC HB 8742; ja (c) seoksen, joka sisältää reseptorimolekyylejä kohdista (a) ja (b).

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön useita hyötyjä ja etuja.

Eräs esillä olevan keksinnön mukainen etu on se, että voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisia hybridoomia tuotettaessa suhteellisen suurina määrinä tasalaatuisia reseptoreja, jotka immunoreagoivat apo B-100:n kanssa.

Toinen esillä olevan keksinnön mukainen etu on se, että tämän keksinnön mukaiset reseptorit ovat käyttökelpoisia, muun muassa 9271 4 10 määritettäessä kolesterolia kuljettavan apo B-100:n määrää ruumiinnestenäytteestä.

Eräs esillä olevan keksinnön mukainen hyöty on se, että tämän keksinnön mukaisia reseptoreita voidaan käyttää apo B-l00:n entsyymikytkeisissä immunosorbenttimäärityksissä formaateissa, joissa ei tarvita sentrifugointeja.

Toinen hyöty on se, että tämän keksinnön mukaiset määritysmenetelmät voidaan saattaa päätökseen suhteellisen lyhyissä aikajaksoissa .

Esillä olevan keksinnön mukaiset muut edut ja hyödyt käyvät selviksi niille, jotka tuntevat alaa, seuraavasta keksintöä koskevasta kuvailusta, piirroksista ja liitteenä olevista patenttivaatimuksista.

Piirrosten lyhyt kuvailu

Kuvio 1 esittää valokuvaa Western Blot-määrityksen autoradio-grammista, jossa on osoitettu MB47- ja MB24-reseptorimolekyvlien kyky immunoreagoida apo B-100:n ja apo B-48:n kanssa, jotka on saatu lipidivapaista kylomikroneista ja VLDLtstä. VLDL ja kylomikronit delipidoitiin ja saatettiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesiin (SDS-PAGE) käyttäen 3-6 prosentin gradient-tigeelejä. Kuusikymmentä mikrogrammaa ( ^ug) VLDL-proteiinia ja 20 ^ug kylomikroniproteiinia ajettiin geelin vuorottaisilla kaistoilla, erottaen siten kunkin valmisteen proteiinit koon mukaan. Proteiini juovia sisältävän elektroforeesiliuskan visualisointi, värjäämällä geeli 0,1 prosenttisella Coomassie Blue-värillä, toi esille apo B-100- ja apo B-48-juovat kylomikro-neissa ja VLDL:ssä. Proteiinia sisältävät juovat kiinnitettiin sen jälkeen elektroforeettisen siirtämisen avulla nitroselluloo-sapaperille kiinteän alustan järjestämiseksi. Kiinteälle alustalle kiinnitettyjen apoproteiiniantigeenien annettiin sitten erikseen immunoreagoida immunopuhdistettujen MB47- ja MB24-resep-torimolekyylien kanssa. Monoklonaaliset MB47 ja monoklonaaliset MB24 reseptorimolekyylit, jotka olivat immunologisesti sitoutuneet 9271 4 11 kiinteään faasiin kiinnitettyyn antigeeniin, ilmaistiin käyt- 125 ....

tämällä J-leimattua vuohi anti-hiiri-Ig:ta 3a autoradio- grafiaa.

Paneeli A kuvaa, että monoklonaalinen MB24 immunoreagoi apo B-lOO:n ja apo B-48:n kanssa VLDL:stä (V) ja kylomikroneista (C). Paneeli B kuvaa, että monoklonaalinen MB47 immunoreagoi apo B-lOO:n kanssa V:stä ja C:stä, mutta ei apo B-48:n kanssa joko V:stä tai C:stä. Paneeli C on negatiivinen kontrolli, joka osoittaa, että lampaan punasoluille spesifinen monoklonaalinen vasta-aine ei immunoreagoi minkään läsnä olevan antigeenin kanssa. Paneeli D on toinen negatiivinen kontrolli, joka osoittaa, että immunopuhdistettu polyklonaalinen antiseerumi fenyyli-beeta-O-glukosidille ei tunnista mitään läsnä olevaa antigeeniä. Paneeli E on positiivinen kontrolli, joka osoittaa, että immunopuhdistettu kanin polyklonaalinen antiseerumi ihmisen LDL-apopro-teiinia vastaan tunnistaa sekä apo B-100:n että apo B-48:n sekä V:ssä että C:ssä.

125

Kuviossa 2 on käyrä, joka osoittaa sitoutuneiden J-leimattu-jen LDL-partikkelien prosenttimäärän (ordinaatta) monoklonaalisen vasta-aineen MB47 kasvavan molaarisen konsentraation suhteen /abskissa; Ab-konsentraatio (MoAb_)_/ nestefaasisessa radioimmuno-määrityksessä (RIA).

LDL valmistettiin lo henkilöstä yhteenkerätystä plasmasta (----) tai yhdestä normaalirasvaverisestä henkilöstä (_).

Plasma saatiin henkilöiden plasmafaresian avulla suunnilleen kaksitoistatuntisen paastojakson jälkeen.

Kuviossa 3 on pylväsdiagrammi, joka osoittaa inhibitioastetta, jonka vasta-aine MB47 (tyhjät pylväät: MB47) ja ylimäärä ihmisen leimaamatonta LDL:ää (viivoitetut pylväät: LDL) aiheuttavat 125 ihmisen J-LDL:n sitoutumiselle, sisäänmenolle ja hajoamiselle ihmisen viljellyillä fibroblasteilla. Fibroblastien yksisolu-kerroksia viljeltiin 35 millimetrin kuopissa DME:ssä, joka sisälsi 10 prosenttia vasikan sikiön seerumia.

9271 4 12

Fibroblastien LDL-reseptoreita stimuloitiin suunnilleen 24 tuntia kestävällä fibroblastien esi-inkuboinnilla kasvualustassa, joka sisälsi 2,5 milligrammaa per millilitra (mg/ml) lipoproteiinis- ta vapaata seerumia (LDS) (DME-LDS). DME-LDS:ää, joka sisälsi 12 5 2,5 mikrogrammaa per millilitra ^ug/ml ) J-LDL:ää ja joko 20 prosenttia MB47 hybridooman viljelysupernatanttia (v/v) tai 200-kertäinen ylimäärä leimaamatonta LDL:ää (loppukonsentraa-tio, 500 ^ug/ml), sekoitettiin ja pidettiin (inkuboitiin) noin 16 tuntia 4°C:ssa ennen lisäämistä fibroblastien yksisolukerros-ten päälle.

Sitoutumisen, sisäänkuljettamisen ja hajottamisen määrittäminen suoritettiin kolmena rinnakkaismäärityksinä, ja ne ilmaistaan prosenttimäärinä kontrol1iarvoista, jotka määritettiin monoklo-naalisen reseptorin MB47 poissa ollessa. Monoklonaalisen reseptorin MB47 aiheuttama inhibitio spesifiseen sitoutumiseen, sisäänkuljetukseen ja hajotukseen oli verrattavissa siihen, minkä 200-kertäinen ylimäärä leimaamatonta LDL:ää tuottaa.

Kuvio 4 sisältää kaksi käyrää, jotka osoittavat monoklonaalisen vasta-aineen MB47 monovalenttisten Fab-kappaleiden kyvyn inhiboi-125 da ihmisen J-LDL:n sitoutumista ja hajoamista ihmisen fibro- blasteilla. Yksittäiset alustat, jotka sisälsivät kasvavia 12 5 määriä MB47-Fab-kappaleita ja vakiomäärän J-LDL:ää (2,5 ^ug/ml) sekoitettiin keskenään, ja niitä pidettiin (inkuboitiin) noin 15 tunnin ajan 4°C:ssa ennen lisäämistä fibroblastien yksi-solukerrosten päälle. Fab-konsentraatio ilmaistaan molaarisena Fab/LDL-suhteena, joka on läsnä kussakin alustassa (olettaen Fab:n molekyylipainon (MW) olevan 40 000 daltonia, ja apo B:n molekyylipainon olevan 550 000 daltonia).

Sitoutumista ja hajoamista ilmaistaan prosenttimäärinä kontrolli-arvoista MB47-Fab-kappaleiden poissa ollessa. Kaikki määritykset suoritettiin rinnakkaismäärityksinä. Ylimäärä leimaamatonta LDL:ää (loppukonsentraatio, 500 ,ug/ml) tuotti enemmmän kuin 95 % inhibition J-LDL:n sitoutumisessa (paneeli A) ja hajo- 11, * t 13 92714 tuksessa (paneeli B). Samanlaisia tuloksia saavutettiin kolmessa tutkimuksessa monoklonaalisen reseptorin MB47 erilaisten Fab-valmisteiden kanssa.

Kuvio 5 sisältää kaksi graafista esitystä. Esitys A kuvaa pipar-juuriperoksidaasileimattujen MB47 (HRPO-MB47) reseptorien, joita on tunnettu, vakiomäärä, kykyä immunoreagoida kiinteään faasiin kiinnitetyn reagenssi apo B-100:n kanssa MB24 reseptorimolekyy-lien läsnäollessa, joiden määrä on kasvava. Ordinaatta on suhteellisina optisen tiheyden yksikköinä, kun taas abskissa on yksikköinä mikrogrammaa/millilitra leimatonta vasta-aineproteii-neja lisättynä (^.ug/ml) kilpailijaksi.

Vakioinen määrä (20 ^ug) HRPOrhon liitettyjä MB47 reseptoreja sekoitettiin olennaisesti samanaikaisesti kasvavien määrien kanssa leimaamattomia MB47 (·) tai leimaamattomia MB24 (4 ) reseptoreja ja kiinteään faasiin kiinnitetyn reagenssi apo B-l00:n (LDL) kanssa. Seoksia pidettiin 3 tuntia 25°C:ssa antamalla siten reseptorien sitoa immunologisesti reagenssi apo B-100:aa ja muodostaa kiinteäfaasinen immunoreaktantti. Kiinteään faasiin sidotun leimatun MB47:n määrä määritettiin sen jälkeen kuten kompetitiivisessa ELISA:ssa, jota kuvataan Materiaalit ja menetelmät osassa.

Graafinen esitys A kuvastaa sitä, että leimaamattomien MB47-reseptorien määrien kasvaessa immunoreaktioseoksessa, alenee vastaavasti leimattujen MB47-reseptorien määrä, joka on sidottuna kiinteäfaasisena immunoreaktanttina. Leimaamaton MB47 kilpailee näin ollen leimatun MB47:n kanssa LDLrstä.

Graafinen esitys A kuvastaa toisaalta myös sitä, että leimaamattomien MB24-reseptorien määrän kasvaessa, leimatun MB47:n määrä ei merkittävästi alene, joka on sitoutuneena kiinteäfaa-sisena immunoreaktanttina. Leimaamaton MB24 ei näin ollen kilpaile leimatun MB47:n kanssa sitoutumisesta LDL:ään.

· · 9271 4 14

Graafinen esitys B kuvastaa sitä, että samanlaisia tuloksia saadaan käyttämällä HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja ja leimaa-mattomia MB47-reseptoreja. MB47- ja MB24-reseptorit sitoutuvat sen vuoksi eri epitooppeihin, jotka ovat riittävän erillään apo B-100:n pinnalla, jotta molempien reseptorien sitoutuminen olisi mahdollista yhteen ainoaan apo B-lOO-molekyyliin ilman Eteeristä kilpailua ja sitoutumisen estymistä.

Kuvio 6 sisältää kaksi graafista esitystä. Esityksessä A esite-12 5 tään J-leimatun B-47:n sitoutumista LDL:ään nestefaasisessa RIA:ssa. Ordinaatta on esitetty yksikköinä femtomoolia (fmoolia) sitoutunutta, kun taas abskissa on yksikköinä nano-moolia (nM) vasta-ainetta sekoitettuna.

Immunologisesti puhdistettua monoklonaalista vasta-ainetta MB47 125 . .

jodattiin J:n kanssa käyttäen Iodogen-tekniikkaa spesifiseen aktiivisuuteen 3000 impulssia minuuttia kohti nanogrammaa kohti (cpm/ng). Perusteellisen dialysoinnin jälkeen fosfaattipuskuroi-tua saliinia (PBS) vastaan, yli 95 prosenttia radioaktiivisuudesta oli saostettavissa 10 prosenttisella trikloorietikkahapol-la (TCA). Yli 98 prosenttia 125J-MB47:stä sitoutui LDL-kolon- niin. Määritykset suoritettiin kolminkertaisina 10 x 75 milli- 125 metrin (mm) silikonipäällysteisissä lasiputkissa. J-MB47:aa lisättiin kasvavina konsentraatioina 0,1 ml:ssa naudan seerumin albumiini-barbitaali (BSA-barbitaali)-puskurissa (pH-arvo 8,0) lOO ng:aan yhteen kerättyä, normaalilipidemistä ihmisen LDL:ää laimennettuna 0,2 ml:ssa BSA-barbitaalipuskuria. Jokainen putki sisälsi 182 fmoolia LDL apo B:tä (olettaen apo B:n mole'kyy-lipainoksi 550 000 daltonia).

16 tunnin inkuboinnin (sekoittaminen ja seisottaminen) jälkeen 4°C:ssa, LDL saostettiin kvantitatiivisesti lipoproteiinivapaan kanin antiseerumin avulla, joka oli spesifinen ihmisen LDLrlle. /Vain sitä kanin antiseerumin fraktiota, jonka tiheys (d) oli enemmän kuin 1,21 g/ml, käytettiin koska monoklonaali-nen vasta-aine MB47 sitoo kanin apoliproteiini Brtä^/ 9271 4 15

Esitutkimukset osoittivat kanin delipidoidun antiseerumin oi- toisuuden, joka saosti enemmän kuin 98 prosenttia 100 ng:sta 125 ihmisen J-LDL:aa. Kanin antiseerumin lisäämisen jälkeen, putkia inkuboitiin noin 16 tunnin ajan 4°C:ssa.

Supernatantit poistettiin, ja pelletit pestiin kahdesti 2 ml:lla jääkylmää barbitaalipuskuria (pH-arvo 8,0). Epäspesifinen sitoutuminen ja saostuminen määritettiin kahdessa rinnakkaisputki-erässä. Ensimmäisessä erässä ei lisätty yhtään ihmisen LDL:ää alkuinkubointiin, vaan sama määrä kanin toista vasta-ainetta lisättiin. Toisessa putkiryhmässä, kanin ei-immuuni seerumi (fraktio, jossa d on suurempi kuin 1,21 mg/ml) korvasi kanin immuunin seerumin vasta-aineen.

Molemmilla menetelmillä saatiin oleellisesti samanlaisia arvoja ei-spesifiselle sitoutumiselle, joka oli lineaarista 125 J-MB47 monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatioiden lisääntyessä, ja se oli kaikissa tapaksissa alle 1 prosenttia lisä- 125 tyista kokonaismääristä. J-MB47:n spesifinen sitoutuminen LDL:ään saatiin vähentämällä ei-spesifinen sitoutuminen koko-naissitoutumisesta. Sitoutumistulokset analysoitiin käyttämällä hyväksi ligandisitoutumissysteemeissä käytettävän Scatchard-analyysin lineaarista regressio-ohjelmaa, mikä antoi estimaatin vasta-aineen affiniteettivakiolle (Ka) ja reseptorin tai epitoo-pin konsentraatiolle.

^^J-MB47:n Ka LDL:lle oli siten määritettynä 3,82 x 10^M ^ . Suoran ekstrapolointi vastaamaan olosuhteita vasta-aineen äärettömässä ylimäärässä antoi estimaatin, jossa 182 fmoolia (100 ng) LDLrää oli sitonut 212 fmoolia (35 ng) ^^J-MB47:ää, silloin kun apo B:n molekyylipainon oletetaan olevan 550 000 daltonia. Nämä tulokset esitetään tämän kuvion graafisessa esityksessä B, jossa ordinaatta on esitetty sidotun (B) ja vapaan (F) vasta-aineen suhteena (B/F), kun taas abskissa on esitetty sidotun vasta-aineen (fmoolia MB47:ää) fmooliyksikköinä.

• I* 92714

Kuvio 7 kuvaa korrelaatiota välillä mg LDL-kolesterolia desilitrassa (dl) näytettä määritettynä Lipid Research Clinic Procedures, HEW Julkaisun n:o 75-628 (NIH) sisältämän menetelmän mukaan, 2. painos, Wash., D.C. Goc. Print Off. (1974), ja mg apo B-100:aa näytedesilitrassa määritettynä käyttämällä ei-kompetitiivista ELISA-menetelmää, jota on kuvattu Materiaalit ja menetelmät j aksossa.

Korrelaatiokerroin, r = 0,89, määritettynä Spearman Rank Correlation-testillä parametrittomia tuloksia varten /Sokal et ai., Biometry, 2. painos, W.H. Freeman Co., San Fransisco, CA, 561-616 (19812/, osoittaa merkitsevää korrelaatiota apo B-100 määrien, määritettynä tässä yhteydessä kuvattavan ei-kompeti-tiivisen ELISA:n avulla, ja LDL-kolesterolimäärien välillä 60 ihmisen plasmanäytteessä.

Kuvio 8 on samanlainen kuin kuvio 7, ja kuvaa merkitsevää korrelaatiota, r = 0,92, apo B-100 määrien, määritettynä tämän keksinnön mukaisella kompetitiivisella ELISA-menetelmällä, ja LDL-kolesterolimäärien välillä samoista 60 ihmisnäytteestä.

Kuvio 9 kuvaa merkitsevää korrelaatiota, r = 0,92, määritettynä Spearman Rank Correlation-testillä, ei-kompetitiivista ELISA’.aa (ordinaatta) käyttäen saatujen tulosten ja kompetitiivista ; ELISA:aa käyttäen saatujen tulosten välillä (abskissa) samoilla 60 ihmisnäytteellä, joita on käytetty kuvioissa 7 ja 8.

I. Yleistä A. Määritelmiä

Ilmaisu "vasta-aine" viittaa reseptorimolekyyliin, joka on jäsenenä glykosyloitujen proteiinien perheessä, joita kutsutaan immunoglobuliineiksi, jotka voivat liittyä spesifisesti yhteen antigeenin kanssa.

"Vasta-aineen liittymispaikka" on se rakenteellinen osa vasta-ainemolekyylistä, joka käsittää raskaan ja kevyen ketjun muuntuvia ja hypermuuntuvia alueita, jotka sitovat antigeenin spesifisesti .

II

17 9271 4

Sanaa "antigeeni" on käytetty kautta aikojen merkitsemään kokonaisuutta, jonka vasta-aine sitoo, ja merkitsemään myös kokonaisuutta, joka indusoi vasta-aineen tuotannon. Nykyisempi käytäntö rajoittaa antigeenin tarkoituksen siksi kokonaisuudeksi, jonka vasta-aine sitoo, kun taas sanaa "immunogeeni" käytetään tarkoittamaan sitä kokonaisuutta, joka indusoi vasta-aineen tuotannon. Silloin kun tässä yhteydessä käytetty kokonaisuus on sekä immunogeeninen että antigeeninen, sitä nimitetään yleisesti antigeeniksi.

"Antigeeninen determinantti" viittaa siihen varsinaiseen rakenteelliseen osaan antigeeniä, joka sitoutuu immunologisesti vasta-aineen sitoutumispaikkaan. Ilmaisua käytetään myös vaihtovuo-roisesti "epitoopin" kanssa.

Ilmaisu "biologisesti aktiivinen" viittaa ainakin kykyyn sitoa spesifisesti ligandi tai spesifisesti sitoutuva aine, vaikkakin muita yleisiä tai tehostavia ominaisuuksia voi myös olla läsnä.

Sana "kompleksi", käytettynä tässä yhteydessä, viittaa tuotteeseen, joka on muodostunut, kun spesifisesti sitova aine sitoo kohdeligandin. Tyypillisiä kompleksejä ovat immunoreaktantit, proteiini A sitoutuneena vasta-aineeseen, ja vastaavat.

"ELISA" viittaa entsyymikytkennäiseen immunosorbenttimääri-tykseen, jossa käytetään vasta-ainetta tai antigeeniä sidottuna kiinteään faasiin, ja entsyymi-antigeeni- tai entsyymi-vasta-ainekonjugaattia ilmaisemaan ja kvantitoimaan näytteessä olevan antigeenin tai vasta-aineen määrää. ELISA-tekniikan kuvaileminen on löydettävissä luvusta 22 teoksen Basic and Clinical Immunology 4. painoksesta, kirjoittajina D.P. Sites et ai., julkaisijana Lange Medical Publications of Los Altos, CA vuonna 1982, ja US-patenttijulkaisuista 3 654 090; 3 850 752; ja 4 016 043, jotka kaikki on sisällytetty tässä viitteinä.

"Entsyymi" viittaa proteiiniin, joka kykenee kiihdyttämään tai tuottamaan katalyyttisen vaikutuksen avulla jonkin muutoksen substraatissa, jolle se usein on spesifinen.

9271 4 18 "Epitooppi" viittaa siihen osaan molekyyliä, jonka vasta-aineen sitoutumispaikka spesifisesti tunnistaa. Siitä käytetään myös nimitystä determinantti tai antigeeninen determinantti.

"Idiotoopit" eli "idiotyyppiset determinantit" ovat antigeenisiä determinantteja, jotka sijaitsevat vasta-ainemolekyylin muuntuvilla ja hypermuuntuvilla osilla, joita muiden vasta-aineiden yhteen liittävä paikka voi tunnistaa. Idiotoopit jaetaan tavallisesti kahteen tyyppiin, niihin, jotka ovat sitovia, paikkasidonnaisia determinantteja, ja niihin ,jotka ovat ei-sitovia, paikkasidonnaisia. Vasta-ainemolekyylillä olevien idiotooppien joukko muodostaa sen idiotyypin. Otaksutaan, että hybridooman tuottama vasta-aineen sitova paikka sisältää yksinkertaisen, erikoisen idiotooppien joukon; so. vasta-aineen erikoisen sidospaikka idiotyypin.

"Immunoreaktantti", käytettynä tässä yhteydessä, viittaa immunologisen reaktion tuotteeseen; so. siihen kokonaisuuteen, joka muodostuu, kun reseptorimolekyyli on immunologisesti sitonut ligandin. Immunoreaktantti on tietyn tyyppinen "kompleksi".

Sana "erillinen", käytettynä tässä yhteydessä reseptorimole-kyylien suhteen, tarkoittaa sitä, että olennaisesti vain yksi ; laji vasta-aineen sidontapaikkaa on läsnä.

Ilmaisut "leimausväliaine", "osoittava ryhmä" tai "leima" ovat tässä yhteydessä käytössä vaihtovuoroisesti ja sisältävät yksinkertaisia atomeja ja molekyylejä, jotka osallistuvat joko suoraan täi epäsuorasti ilmaistavan signaalin tuottamiseen immunoreaktantin läsnäolon osoittamiseksi. Mikä tahansa leimausväliaine voidaan liittää tai sisällyttää reseptoriin tai käyttää erikseen, ja niitä atomeja tai molekyylejä voidaan käyttää yksin tai yhdessä muiden reagenssien kanssa. Sellaiset osoittavat ryhmät tai leimat ovat itsessään hyvin tunnettuja immunokemiassa, ja ne muodostavat osan tätä keksintöä ainoastaan sikäli kun niitä käytetään muutoin uusien reseptorien, menetelmien ja/tai systeemien kanssa.

19 9271 4 "Ligandi" viittaa molekyyliin, joka sisältää rakenteellisen osan, jonka tietty reseptori sitoo, esim. antigeeniin, jonka reseptori sitoo.

Ilmaisu "reseptori" on tässä yhteydessä käytössä osoittamaan biologisesti aktiivista molekyyliä, joka sitoutuu immunologi-sesti antigeeniin (tai sen kanssa). Sellaista sitoutumista tapahtuu tyypillisesti affiniteetin ollessa noin 10 - noin 10^° litraa moolia kohti (M~^), ja se on antigeenin epitoopin spesifistä vuorovaikutusta reseptorin vasta-aineelle ominaisen sidontapaikan kanssa.

Esillä olevan keksinnön mukainen reseptorimolekyyli on mikä tahansa käsittelemätön vasta-aine, olennaisesti käsittelemätön vasta-aine tai vasta-aineen sisältämän vasta-aineelle ominaisen sidontapaikan idiotyyppisisältöinen polypeptidiosa (esim. Fab-kappale), sellaisia kuin vatsaontelonesteessä tai kudosviljely-supernatantissa.

Sanaa "reseptori" käytetään tässä yhteydessä myös solun pinnoilla olevista molekyyleistä, jotka sitovat muita molekyylejä. Solun pintareseptoreja nimitetään tässä yhteydessä aina sidotun kokonaisuuden nimellä edeltäen sanaa "reseptori" epäselvyyden välttämiseksi. Tyypillinen solun pinta"reseptori" on aikaisem-; min kuvattu LDL-reseptori .

Reseptorimolekyylin biologinen aktiivisuus tulee näkyviin reseptorin immunologisessa reaktiossa antigeenisen ligandinsa kanssa sekoitettaessa niitä keskenään vesipitoiseen alustaan immunoreaktantin muodostamiseksi, ainakin fysiologisissa pH-arvoissa ja ionivahvuuksissa. Biologinen aktiivisuus tulee esiin edullisesti biologisissa määritysolosuhteissa: so. niissä olosuhteissa, joissa tämän keksinnön mukaiset reseptorimole-kyylit sitoutuvat antigeeniseen ligandiin pH-arvojen rajoissa noin 5 - noin 9, ionivahvuuksissa, jotka vaihtelevat tislatun veden ionivahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin ioni- « · 20 92714 vahvuuteen, ja lämpötiloissa noin 4°C - noin 45°C. Kaikki tässä yhteydessä kuvatut reseptorimolekyylit olivat biologisesti aktiivisia.

Vasta-aineiden vasta-ainesidospaikan idiotyypin sisältämät poly-peptidiosat (vasta-aineen sidontapaikat) ovat niitä vasta-aine-molekyylien osia, jotka sisältävät sidontapaikkaidiotooppeja ja sitoutuvat ligandiin, ja sisältävät vasta-aineiden Fab-,

Fab', F(ab')2- ja F(ab 1)2-osia. Vasta-aineiden sisältämät Fab- ja F(ab')2-osat ovat alalla hyvin tunnettuja, ja niitä valmistetaan papaiinin ja pepsiinin proteolyyttisellä reaktiolla, tässä järjestyksessä, olennaisesti koskemattomien vasta-aineiden kanssa menetelmillä, jotka tunnetaan hyvin. Katso esimerkiksi US-patentti julkaisu 4 342 566 Theofilopolousille ja Dixonille.

Fab1-vasta-aineosat tunnetaan myös hyvin, ja niitä tuotetaan F(ab 1 )2~osista siten, että pelkistetään disulfidisidokset, jotka yhdistävät kahta raskasketjuosaa esim. merkaptoetanolilla, ja alkyloidaan sen jälkeen muodostunut proteiini merkaptaani reagenssilla kuten esim. jodoasetamidi. Käsittelemättömät vasta-aineet ovat edullisia, ja niitä käytetään yhdessä Fab-osien kanssa kuvaamaan tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia reseptorimolekyylejä.

Sanoja "erittää" ja "tuottaa" käytetään usein vaihtovuoroisesti . alalla koskien soluja, joista vasta-ainemolekyylejä saadaan.

Solut, jotka tuottavat vasta-aineita, eivät ehkä kuitenkaan eritä noita molekyylejä ympäristöönsä. Tässä yhteydessä kiinnostuksen kohteena olevat hybridoomasolut erittävät monoklonarali-sia vasta-aineita ympäristöönsä. Siitä huolimatta sellaisia soluja nimitetään usein tässä yhteydessä "vasta-aineita tuottaviksi" soluiksi, ja niiden vasta-aineiden sanotaan tulevan "tuotetuiksi", pysytellen alalla käytetyssä ilmaisussa.

Ilmaisu "spesifinen sitoutuva aine", käytettynä tässä yhteydessä, viittaa molekyylikokonaisuuteen, joka pystyy selektiivisesti sitomaan ligandin. Tyypillisiä spesifisesti sitoutuvia .. aineita ovat reseptorit, komolementtikappaleet, proteiini A

ja niiden kaltaiset.

Il 2i 9271 4

Ilmaisu "olennaisesti puhdas", käytettynä tässä yhteydessä resep-torimolekyylien suhteen, tarkoittaa sitä, että ilmaistavissa olevien rajojen puitteissa, vain yhtä vasta-ainesidontapaikkaa on läsnä tehokkaana apo B-lOO:aa sitovana aineena. Näin ollen vaikkakin olennaisesti puhdas reseptorimolekyylivalmiste voi sisältää enemmän kuin yhden vasta-ainesidontapaikkalajin, sellainen valmiste tuo näkyviin yhden ainoan apo B-100:aa sitovan affiniteetin. Esimerkiksi kudosviljelysupernatantit, joita tämän keksinön mukainen hybridooma tuottaa, sisältää tyypillisesti myeloomaproteiineja kuin myös tämän keksinnön mukaisia reseptoreja. Olennaisesti puhtaassa muodossa olevaa reseptorimolekyy-liä nimitetään tyypillisesti "monoklonaaliseksi vasta-aineeksi" niiden toimesta, jotka tuntevat alaa, koska sellaisia koostumuksia tuotetaan käyttäen monoklonaalisia hybridoomaviljelmiä.

Ilmaisu "oleellisesti samanaikaisesti", käytettynä tässä yhteydessä 3 tai useamman antigeeni- ja reseptorikomponentin sekoittamisen suhteen immunoreaktioseoksen muodostamiseksi tarkoittaa sitä, että kaikki komponentit ovat läsnä ja sekoitetaan keskenään yhtenä ainoana seoksena noin 15 minuutin sisällä ja edullisesti noin 5 minuutin sisällä minkä tahansa 2 komponentin seoksena .

B. Hybridoomat ja monoklonaaliset reseptorit . Esillä olevassa keksinnössä tarkastellaan hybridoomaa, jonka laboratoriomerkintä on HL130C2,3C5, joka tuottaa reseptori-molekyylejä, jotka: (a) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n pinnalla olevan kon-servoituneen antigeenisen determinantin kanssa; (b) inhiboivat kompetitiivisesti apoproteiini B-lOO:n sitoutumista LDL-reseptoriin; ja 9 _ i (c) sisältävät affiniteettivakion 3,82 x 10 M LDL:n suhteen nestefaasisessa kompetitiivisessa tasapainoradioimmuno-määrityksessä (RIA). Näistä reseptorimolekyyleistä käytetään tavallisesti nimitystä MB47.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti tarkastellaan myös hybridoomaa, jonka laboratoriotunnusmerkintä on V82A6,1G4, joka 22 9271 4 tuottaa reseptorimolekyyleja, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-lOO:n antigeenisen determinantin kanssa, ja jotka sisältävät 9 -1 af f miteettivakion noin 3,0 x 10 M LDL:n suhteen kiinteä-faasisessa kompetitiivisessa tasapaino-RIA:ssa. Näistä resep-torimolekyyleista käytetään tavallisesti nimitystä MB24.

Hybridoomat HL130C2,3C5 ja V82A6,1G4 talletettiin American Type Culture Collection'iin (ATCC), Rockville, MD maaliskuun 6. päivänä 1985 seuraavilla ATCC:n talletusnumeroilla:

Hybridooma Reseptori ATCC tailetusnumero _ Merkintä ___ V82A6,1G4 MB24 HB 8742 HL130C2,3C5 MB47 HB 8746

Edellä olevat ATCC-talletukset tehtiin Budapestin sopimuksen mukaisesti (the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure ) .

Esillä olevan keksinnön mukaiset hybridoomat muodostettiin sulauttamalla yhteen vasta-ainetta tuottava solu ja myelooma-solulinja. Sellaisia reseptoreja tuottavia soluja kuvasivat ensin Kohler ja Milstein, Nature, 256, 495 (1975), joka kuvaus on tässä yhteydessä sisällytetty viitteenä. Reseptoreja saadaan tyypillisesti hybridoomasoluviljelmien supernatanteista, edullisesti monoklonaalisista soluviljelmistä, tai vaihtoehtoisesti vatsaontelonesteestä tai muusta ruumiinnesteestä saatuna ei-humaaneista, lämminverisistä isäntäeläimistä, edullisesti sellaisista, jotka ovat histologisesti yhteensopivia tai immuno-logisesti sopivia, joihin hybridoomasolut siirrettiin ja viljeltiin .

Esillä olevan keksinnön mukaisessa toisessa suoritusmuodossa tarkastellaan näin ollen soluviljelmää, joka käsittää (a) tämän keksinnön mukaisen hybridooman; (b) reseptorimolekyylejä, joita hybridooma erittää, jotka molekyylit reagoivat immunologisesti • «

II

9271 4 23 apoproteiini B-lOO:n kanssa; ja (c) viljelyalustan hybridoomaa varten. Alustat, jotka ovat hyödyllisiä näiden koostumusten valmistamiseen, ovat sekä hyvin tunnettuja alalla että kaupallisesti saatavissa, ja niihin kuuluvat synteettiset alustat, kasvatetut hiiret ja vastaavat. Tyypillinen synteettinen alusta on Dulbeccon minimaalialusta /DNEM; Dulbecco et ai., Virol. 8, 396 (1959jy, johon on lisätty 4,5 g/1 glukoosia, 20 mg glutamii-nia, ja 20 % vasikan sikiön seerumia. Tyypillinen kasvatettu (jalostettu) hiirikanta on Balb/c.

Vielä toisessa suoritusmuodossaan esillä olevan keksinnön mukaisesti tarkastellaan reseptoreja, jotka on merkitty MB47 ja MB24, joita tuottavat hybridoomat, joita on merkitty HB 8746 ja HB 8742, vastaavasti ja jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa. Tämän keksinnön mukaista reseptoria voidaan näin ollen valmistaa viljelemällä sopivassa alustassa tämän keksinnön mukaista sopivaa hybridoomaa, ja ottamalla reseptori talteen alustasta.

Curtiss et ai,, J. Biol. Chem., 257, 15213 (1982) raportoivat aikaisemmin 11 apo B:lle spesifisen reseptorimolekyylin tuottamisesta ja karakterisoinnista, mukaanlukien MB24:llä merkitty reseotorimolekyyli, jota tuottaa hybridooma HB 8742. Hybridooma HB 8742 saatiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisemmin Materiaalit • ja menetelmät jaksossa, sulauttamalla yhteen ihmisen VLDL:llä immunisoitujen hiirten pernasoluja.

Vatsaontelonestettä sisältävä MB24:n IgG-fraktio, joka oli muodostunut HB 8742:n vatsaontelonsisäisestä kasvusta, karakterisoitiin isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF). Kuten Curtiss et ai., supra, ovat todenneet, yhteensulauttaminen suoritettiin P3x63Ag8 myeloomasolujen kanssa, jotka erittävät IgG^k-immunoglobuliinia. IEF:n yhteydessä todettiin sen vuoksi erikoinen, moninaisia proteiinijuovia sisältävä jakaumakuvio, jossa esiintyi umoimähkäisesti sekoittuneina raskas- ja kevyt-ketjusisältöisiä immunoglobuliinimolekyylejä P3x63Ag8 myelooma ·· IgG^k vasta-aineen ja MB24-reseptorin lisäksi.

9271 4 24

Hybridooma HB 8746 tuottaa MB47-reseptorimolekyylejä, ja se muodostettiin sulauttamalla yhteen LDL: 1 lä ja P3x63Ag8,653,1 myeloomasoluilla immunisoitujen hiirten pernasoluja. Tämä myeloomakantamuodon muunnos ei eritä myeloomaproteiinia.

HB 8746:n vatsaonteloneste tuo näkyviin erikoisen proteiini-juovia sisältävän jakaumakuvion, tuoden esiin IgG2a raskas- ja kappa-kevytketjuja. Molemmat tämän keksinnön mukaiset hybridoo-mat voidaan näin ollen karakterisoida osaksi niiden tuottamien reseptorimolekyylien IEF-tyypin perusteella.

Vaikkakin tämän keksinnön mukainen V82A6,1G4 hybridooma tuottaa enemmän kuin yhtä reseptorimolekyylityyppiä, tämän keksinnön mukaiset reseptorimolekyylit voidaan helposti identifioida ja eristää niiden yksilöllisten kykyjen perusteella immunoreagoida apo B-100 antigeenisten determinanttien kanssa. MB24:n ja MB47:n antigeenisiä spesifisyyksiä tutkittiin määrittämällä niiden yksilölliset kyvyt immunoreagoida apoproteiinien kanssa, joita saatiin kylomikroneista, VLDL:stä, LDL:stä ja HDL:stä, Western blot-määrityksessä, jota on kuvattu jäljempänä.

Siten saadut tulokset osoittivat, että MB47 ja MB24 immuno-reagoivat LDLrstä, VLDL:stä ja kylomikroneista saadun apo B-lOO:n kanssa, mutta ei apo B-48:n kanssa VLDL:stä tai kylomikroneista. Sekä MB47:n että MB24:n kyky immunoreagoida yksilölli- • sesti apo B-lOO:n kanssa kylomikroneista ja VLDLrstä esitetään kuviossa 1.

1. MB47:n immunologisesti sitoman apo B-lOO:n antigeenisen determinantin karakterisointi_

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet apo B-100:n olevan anti- geenisesti heterogeenistä. Se tarkoittaa sitä, että jotkut apo B-100:n epitoopit eivät ilmenny kaikista LDL-partikkeleista.

Sekoittaminen ylimäärän kanssa tiettyjä monoklonaalisia vasta- aineita nestefaasisessa RIArssa ei näin ollen johda kaikkien 12 5 radioaktiivisesti leimattujen LDL-( J-LDL)partikkeleiden immunologiseen sitoutumiseen.

• « 11 25 9 2 7 1 4

Sen määrittämiseksi, oliko MB47 reseptorimolekyylien tunnistama epitooppi tasaisesti kaiken LDL:n ilmentämä, MB47:n kykyä sitou- .125 tua immunologisesti ' J-LDL:aan nestefaasisessa RIA:ssa tutkittiin. LDL, joka oli eristetty 10 normaalin yksilön yhteenkerä-tystä plasmasta ja yhden normaaliyksilön plasmasta, radioleimat-tiin kuten on kuvattu jäljempänä, ja sekoitettiin biologisesti aktiivisten MB47 reseptorimolekyylien kanssa immunoreaktioseok-sen muodostamiseksi. Seosta pidettiin biologisissa määritysolo-suhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka MB47 reseptorimolekyylien kannalta riittää sitoutumaan immunologisesti apo B:hen kussakin näytteessä ja muodostamaan immunoreaktiotuotteen {immunoreaktantti) .

........ 125

Ylimäärän MB47 reseptorimolekyylejä sitoma maksimimäärä J- LDLtää määritettiin säestämällä kaikki reseptorimolekyylit

IgSORBrn avulla (The Enzyme Co., Boston, MA), ja kvantitoimalla 125 J-LDL:ään liittyvät imoulssit saostumassa gammalaskijassa.

Tulokset, ilmaistuina trikloorietikkahapon (TCA) avulla saostu- 125 . .......... .. , neen J-LDL:n prosenttisena maarana 3a esitettynä kuviossa 2, 125 osoittavat, että vasta-aine sitoi oleellisesti kaiken J-LDL:n; mikä osoittaa, että kaikki LDL-partikkelit ilmentävät epitoo-pin, jonka MB47 on tunnistanut ja sitonut.

2. Apo B-100:n sitoutumisen kompetitiivinen inhiboituminen r' LDL-reseptoriin MB47:n vaikutuksesta_

Apoproteiini B-100 on tärkein apoproteiini ihmisen ja muiden nisäkkäiden LDLrssä, ja se välittää LDL:n sitoutumista fibro-blastin LDL-reseptoriin. Aikaisemmissa tutkimuksissa on kuvattu LDL-reseptorin keskeistä roolia nisäkkään lipoproteiini-aineenvaihdunnassa. Se tosiseikka, että monesta eri eläinlajista eristetyt LDL-partikkelit sitoutuvat spesifisesti ihmisen LDL:n reseptoria sitovaan alueeseen merkitsee sitä, että apo B-100 molekyylillä olevan kiinnittymispaikan on oltava lajinkehityksellisesti säilynyt ja näin ollen LDL-partikkelei-den ilmentämä kaikista eläinlajeista.

• · 26 9271 4

Sen tutkimiseksi, immunoreagoivatko MB47 reseptorimolekyylit antigeenisen determinantin kanssa, joka sijaitsee ihmisen aoo B-100:n LDL-reseptoria sitovalla alueella, MB47:n kykyä inhiboida 125 J-LDL:n sitoutumista solun LDL-reseptoriin tutkittiin. Tämä toteutettiin sekoittamalla MB47 reseptorimolekyylejä, kokonais- 125 ten vasta-ainemolekyylien muodossa, J-LDL:n kanssa immunoreak-tioseoksen muodostamiseksi. Immunoreaktioseosta pidettiin sen jälkeen biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka MB47 reseptorimolekyylien kannalta riittää immunolo- 125 gisesti sitoutumaan läsnä olevaan J-LDL:aan ja muodostamaan immunoreaktantin.

Myöhemmin immunoreaktantin sisältävä immunoreaktioseos levitettiin kerroksena ihmisen fibroblastien päälle, jotka ilmentävät fibroblastin LDL-reseptoreja. Viljelmiä pidettiin sen jälkeen ennalta määrätty ajanjakso, joka fibroblastin LDL-reseptorien kannalta riittää spesifisesti sitomaan kaikki LDL:n reseptoria 125 sitovat paikat, jotka ovat saatavilla J-LDL-MB47 immunoreaktio-tuotteessa. Otaksutaan, että sellainen solun reseptori-LDL-vuorovaikutus inhiboituu, jos reseptorimolekyylit, kuten MB47 valaisee esimerkkinä, immunoreagoivat apo B-lOO antigeenisen determinantin kanssa, jonka rakenne on osallisena myös LDL-resep-torin sitomisessa.

Tämän tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty kuviossa 3, osoittavat, että MB47 reseptorimolekyylit inhiboivat ihmisen 125 .....

J-LDL:n solun reseptorivälitteistä sitoutumista, sisaan- kuljetusta ja hajottamista ihmisen fibroblastien toimesta siinä määrin, joka on verrattavissa siihen, minkä tuottaa 200- kertainen ylimäärä leimaamatonta LDL:ää.

Sen mahdollisuuden tutkimiseksi, että MB47 reseptorit sitoutuvat epitooppiin, joka sijaitsee apo B:n reseptorialueen vieressä, ja niiden koosta johtuen, estävät steerisesti apo B:n sitoutumisen LDL-reseptoriin, MB47 vasta-ainemolekyylien Fab-kappaleiden kykyä inhiboida ihmisen LDL:n sisäänkuljetusta ·. ja hajotusta tutkittiin myös edellä kuvatussa fibroblastimääri- tyksessä.

n: 27 9 2 7 1 4

Kuten on esitetty kuviossa 4, MB47-Fab-kappaleet estivät merkittävästi LDL:n spesifistä solutason sitoutumista ja hajotusta. Koska MB47-Fab-kappaleet ovat huomattavasti pienempiä kuin koskemattomat MB47 vasta-ainemolekyylit, uskotaan, että epitooppi, jonka MB47 vasta-aineen kiinnittymispaikka tunnistaa, sisältyy LDL apo B-100:n pinnalla olevaan LDL-reseptorin sitoutumis- alueeseen. Vasta-aine MB24:llä ei ole vasta-aineen MB47 omi- . 125 naisuuksia, eikä se inhiboi J-LDL:n sitoutumista 3a hajotusta viljeltyjen fibroblastien toimesta.

3. Steerinen inhibiitio

Joidenkin tämän keksinnön mukaisen määritysmenetelmän suoritusmuotojen suhteen, ensimmäisen ja toisen reseptorin on sitouduttava apo B-lOO-molekyylin eri epitooppeihin, ja niiden epitoop-pien on oltava riittävästi erillään niin, että yhden reseptorin sitoutuminen ei steerisesti estä toisen reseptorin sitoutumista. Sen vuoksi tutkittiin MB47:n ja MB24:n kykyä kompetitiivisesti inhiboida toistensa immunologista sitoutumista kiinteään faasiin kiinnitettyyn apo B-lOO-reagenssiin.

Tuon tutkimuksen tulokset, jotka on esitetty kuviossa 5, osoittavat, että 70-kertainen ylimäärä leimaamatonta MB24:ää ei merkittävästi inhiboinut peroksidaasileimatun MB47:n sitoutumista apo B-lOO-reagenssiin. Vastaavasti, 70-kertainen ylimäärä leimaamatonta MB-47:ää ei merkittävästi inhiboinut peroksidaasileimat-tua MB24:ää sitoutumasta apo B-lOO-reagenssiin. MB24 ja MB47 sitoutuvat näin ollen eri epitooppeihin apo B-100:n pinnalla, ja ne epitoopit ovat riittävästi erillään niin, että MB24 ja MB47 eivät koskemattomina vasta-aineina inhiboi toistensa sitoutumista yhteen ainoaan apo B-lOO-molekyyliin.

4. MB47:n apo B-100:aan sitoutumisen stökiometria ja affiniteetti_

Antigeenisten determinanttipaikkojen lukumäärän määrittämiseksi LDL:llä olevaa apo B-lOO-molekyyliä kohti, jotka MB47-reseptori-molekyylit tunnistivat, vasta-aineleimattua RIA:ta käytettiin. Tässä määrityksessä MB47 reseptorimolekyylejä puhdistettiin 28 92714 • 12 5 (eristettiin) vatsaontelonesteestä, ja radioleimattiin ( J-MB47) hyvin tunnetuilla menetelmillä, joita kuvataan yksityiskohtaisemmin Materiaalit ja menetelmät jaksossa.

........125 . ..

Kuten on esitetty kuviossa 6A, kasvavia maana J-MB47:äa sekoitettiin kiinteän määrän kanssa apo B-lOO:aa LDL:n muodossa erillisissä reaktioseoksissa. Seoksia pidettiin biologisissa 125 määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka J-MB47 reseptorimolekyylien kannalta riittää sitoutumaan immunologisesti apo B-lOO:aan (LDL) ja muodostamaan immunoreaktantin. Immunoreak-tantin läsnäolo määritettiin sen jälkeen saostamalla LDL (sidottu ja vapaa) kvantitatiivisesti käyttäen kanin antiseerumia, joka on spesifinen ihmisen LDL:lle, ja ilmaisemalla immuno- 125 ......

reaktanttina läsnäolevan J-MB47:n määrä gammalaskennalla.

12 5 J-MB47 reseptorimolekyylien spesifinen immunologinen sitoutuminen oli kyllästettävissä, kuten on esitetty kuviossa 6A. Näissä tutkimuksissa saatujen sitoutumistulosten Scatchard-käyrä oli lisäksi lineaarinen (kuvio 6B), mikä viittasi LDL-partikkeleilla olevien MB47:n sitoutumispaikkojen tasalaatuisuuteen.

Lisäksi, MB47:n näennäisen affiniteettivakion (Ka) ihmisen apo B-100:n suhteen LDL:n muodossa määritettynä vasta-aineleimatul- 9 -1 la RIA:lla todettiin olevan 3,82x10 M . Scatchard-analyysis- 125 sä tuli myös näkyviin, että maksimaalisesti 212 fmoolia J-MB47 vasta-ainetta sitoutui 182 fmooliin LDL:ää, mikä osoitti, että vain yksi MB47-molekyyli sitoutuu kuhunkin apo B-100-molekyyliin. Se tarkoittaa sitä, että MB47 sitoutuu yhteen ainoaan, erikoiseen apo B-lOO:n antigeeniseen determinanttiin.

MB47:n keskimääräinen affiniteettivakio apo B-lOO:n suhteen määritettiin myös edellä kuvatussa antigeenileimatussa RIArssa.

Tässä kompetitiivisessa tasapainoisessa nestefaasisessa RIA:ssa, LDL:nä läsnä oleva leimaamaton apo B-100 aiheutti 125 J-LDL:n täyden syrjäyttämisen. MB47 reseptorimolekyylien laskettu affiniteettivakio LDL:n suhteen, jotka olivat läsnä 9 —1 kokonaisena, koskemattomana vasta-aineena, oli 4x10 M f mikä

II

9271 4 29 oli hyvässä soousoinnussa sen Ka:n kanssa, joka oli määritetty tätä ennen kuvatulla vasta-aineleimatulla määrityksellä.

C. Määritysmenetelmät

Esillä olevan keksinnön mukaiset reseptorimolekyylit ovat erityisen hyödyllisiä apoproteiini B-lOO:n läsnäolon ja määrän määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä kuten veri, seerumi tai plasma.

Yhdessä suoritusmuodossa, esillä olevan keksinnön mukaisesti tarkastellaan menetelmää apoproteiini B-100:n määrän määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä, joka menetelmä käsittää seu-raavat vaiheet: (a) Tuotetaan näyte kehosta määritettäväksi. Sellainen näyte otetaan tavallisesti mitattuna määränä tai tunnettuna määränä verta, ja edullisemmin plasmana tai seerumina. Menetelmät veri-, plasma- ja seeruminäytteiden ottamiseksi ovat hyvin tunnettuja alalla eikä niitä käsitellä tässä yhteydessä enempää.

(b) Tuotetaan reseptorimolekyylejä biologisesti aktiivisessa muodossa, jotka (i) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa ja (ii) joita erittävät joko hybridooma, jonka ATCC-talletus-numero on HB8746 tai hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, ja joita on läsnä tehokkaana määränä määrityksen suorittamista varten.

Edullisissa suoritusmuodoissa reseptori on koskematon vasta-aine tai Fab-kappale.

Tehokas määrä reseptorimolekyylejä voi olla erilainen, muun muassa tietyn määritysmenetelmän mukaan, jota käytetään, kuten hyvin tiedetään. Hyvin tunnettu on myös se helppous, jolla tehokas määrä voidaan määrittää käyttäen standardia laboratorio-tekniikkaa alaa tuntevan toimesta.

(c) Sekoitetaan yhteen ruumiinnestenäyte vaiheen (b) reseptori- ‘ molekyylien kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi.

30 92714 (d) Seosta pidetään biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso minuuteista tunteihin, kuten esimerkiksi noin 10 minuutista biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrättyyn aikaan noin 16-20 tuntia, joka on reseptorimolekyylien vasta-aineen kiinnitymispaikkojen kannalta riittävä sitomaan immunologisesti apoproteiini B-100:aa kehonnäytteestä ja immuno-reaktantin (ensimmäinen kompleksi) muodostamiseksi. Biologiset määritysolosuhteet ovat sellaiset, jotka ylläpitävät tämän keksinnön mukaisten reseptorimolekyylien biologista aktiivisuutta, ja joille on ominaista lämpötila-alue noin 4°C - noin 45°C, pH-arvoalue noin 5 - noin 9, ja ionivahvuuden vaihtelu tislatun veden ionivahvuudesta noin yksimolaarisen natriumkloridin vastaavaan. Alalla tunnetaan hyvin menetelmät sellaisten olosuhteiden optimoimiseksi.

(e) Määritetään kaiken muodostuneen immunoreaktantin määrä ja siten mainitussa näytteessä läsnä olevan apo B-100:n määrä.

Edullisissa suoritusmuodoissa, vaiheen (a) ruumiinnestenäytettä preparoidaan edelleen määritystä varten vaiheen (e) mukaisesti seuraavien vaiheiden kautta: (f) Tuotetaan biologisesti aktiivisia toisia reseptorimolekyy-lejä, joita erittää vaiheen (b) kummankin hybridooman jäänteet; (g) Sekoitetaan ennalta määrätty määrä toisia reseptorimolekyy-lejä ruumiinnestenäytteen kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi .

(h) Pidetään toisen reseptorin/ruumiinnestenäytteen seosta, joka siten muodostui, samanlaisella tavalla kuin mitä kuvattiin vaiheessa (d) kerroksellisen immunoreaktantin (toinen kompleksi) muodostamiseksi, joka sisältää yhden MB47-molekyylin ja yhden MB24-molekyylin sitoutuneina immunologisesti yhteen apo B-100-molekyyliin.

Edellä kuvatut yleiset määritysmenetelmät voidaan suorittaa, kuten alalla hyvin tiedetään, käyttäen monia erilaisia formaatteja.

II

31 9271 4 Näin ollen, sitä vastoin kuin jäljempänä kuvattavissa spesifi-semmissä määritysmenetelmissä käytetään kiinteäfaasisia formaatteja, keksintö ei ole niin rajoitettu.

Kiinteäfaasiset määritysformaatit voidaan toteuttaa käyttäen joko reseptorimolekyylejä tai antigeeniä kiinnitettynä kiinteään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi. Niissä suoritusmuodoissa, joissa kiinteä kantaja sisältää reseptorin vaiheesta (b), seos vaiheesta (c) on kiinteä/nestefaasinen seos, ja immunoreak-tantti vaiheesta (d) on kiinteäfaasinen immunoreaktantti, joka sisältää ruumiinnäytteen apo B-100:n.

Niissä suoritusmuodoissa, joissa kiinteä kantaja sisältää apo B-lOO reagenssia, seos vaiheesta (c) on myös kiinteä/nesteseos, mutta ruumiinnäytteen apo B-lOO:aa sisältävä immunoreaktantti vaiheesta (d) on nestefaasinen immunoreaktantti. Reagenssi apo B-lOO on biologisesti aktiivista; so. antigeenistä, apo B-100, joka toimitetaan muusta lähteestä kuin mikä on tutkimuksessa, tyypillisesti eristetyn LDL:n muodossa.

Apo B-lOO:n määrän määrittäminen, joka on sidottuna immunoreak-tanttina vaiheessa (d), voidaan toteuttaa,suoraan tai epäsuorasti, määritysmenetelmillä, jotka tunnetaan hyvin alalla. Esimerkiksi homogeenisia määrityssysteemejä, kuten ne, joita on kuvattu US-patenttijulkaisuissa 4 536 479, 4 233 401, 4 233 402 ja 3 996 345, jotka kaikki on sisällytetty tässä viitteenä, voidaan käyttää.

Edullisissa kiinteäfaasisissa suoritusmuodoissa, ruumiinnestettä preparoidaan edelleen määritystä varten käyttäen leimattua spesifistä sitovaa ainetta. Leimatun spesifisen sitovan aineen tyyppi ja spesifisyys riippuvat, kuten alalla hyvin tiedetään, käytettävästä menetelmästä ja formaatista.

Edullisissa kiinteäfaasisissa suoritusmuodoissa, joissa kiinteä kantaja sisältää reseptorin vaiheesta (b); se tarkoittaa tämän keksinnön mukaista reseptoria, kiinteään faasiin sidotun apo B-100:n määrä preparoidaan määritystä varten seuraavien vaiheiden kautta: 9271 4 32 (i) Tuotetaan biologisesti aktiivisia leimattuja toisia resep-torimolekyyleja, jotka sitoutuvat ruumiinnäytteessä läsnä olevaan apoproteiini B-lOO:aan, jolloin muodostuu immunoreak-tanttia. Leimatun toisen reseptorin leima kykenee ilmaisemaan immunoreaktantissa olevan leimatun toisen reseptorin läsnäolon.

Erityisen edullisissa suoritusmuodoissa leimatut toiset resepto-rimolekyylit reagoivat immunologisesti toisen apo B-lOO-epitoo-pin kanssa, joka on erilainen kuin se epitooppi, jonka kanssa kiinteätaasiset reseptorimolekyylit reagoivat, eivätkä ne huomattavasti inhiboi kiinteätaasisia reseptorimolekyylejä reagoimasta apo B-lOO:n kanssa. Leimatut toiset reseptori-molekyylit ovat niitä, joita ovat erittäneet jäänteet kummastakin hybridoomasta vaiheesta (b); so. luetellut reseptori-molekyylit, joita ei valittu ensimmäisiksi reseptorimolekyy-leiksi .

Menetelmät sen määrittämiseksi inhiboiko (häiritseekö) reseptori-molekyyli toisen reseptorimolekyylin sitoutumista samaan antigeeniin tunnetaan alalla hyvin, ja niitä kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä.

(j) Sekoitetaan ennalta määrätty määrä leimattuja toisia reseptorimolekyylejä ruumiinnestenäytteen kanssa immunoreaktio-seoksen muodostamiseksi.

Siten muodostunut seos voi olla nestemäinen seos, kuten silloin kun vaihe (i) toteutetaan ennen edellä olevaa vaihetta (b), tai se voi olla kiinteä/nestemäinen seos, kun leimattu toinen reseptori sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti vaiheen (b) kanssa tai sen jälkeen. Kun vaihe (i) suoritetaan ennen tai oleellisesti samanaikaisesti vaiheen (b) kanssa, leimatut toiset reseptorimolekyylit immunoreagoivat toisen apo B-100-epitoopin kanssa, joka on eri kuin se epitooppi, jonka kanssa kiinteäfaa-siset reseptorimolekyylit reagoivat, eivätkä ne oleellisesti inhiboi kiinteään faasiin sidottuja reseptorimolekyylejä immuno-reagoimasta apo B-100:n kanssa.

li 33 9271 4

Edullisissa suoritusmuodoissa vaihe (i) suoritetaan oleellisesti samanaikaisesti vaiheen (b) kanssa tai jälkeen vaiheen (c).

(k) Leimatun toisen reseptorin/ruumiinnestenäytteen seosta, joka siten muodostui, inkuboidaan samalla tavalla kuin vaiheessa (d) kuvattua immunoreaktantin muodostamiseksi.

Kiinteään faasiin sidotut reseptorimolekyylit ja toiset resepto-rimolekyylit sitoutuvat siten immunologisesti ruumiinnestenäyt-teessä läsnä olevaan apo B-100:aan, muodostaen siten kiinteään faasiin sidotun kerroksellisen immunoreaktantin, joka sisältää leiman sidottuna osaan siitä. Se tarkoittaa sitä, että kiinteä-faasinen kerroksellinen immunoreaktantti, joka sisältää leiman, muodostuu kun yksi molekyyli apo B-lOO.-aa immunoreagoi sekä kiinteään faasiin sidotun reseptorimolekyylin kanssa että leimatun toisen reseptorimolekyylin kanssa. Edullisissa suoritusmuodoissa, kaikki leimatut toiset reseptorimolekyylit, jotka eivät muodosta osaa kiinteään faasiin sidotusta immunoreaktantista (so. ne, jotka eivät ole immunologisesti sitoutuneet apo B-100:aan, joka itse on sitoutunut kiinteäfaasisiin reseptorimolekyyleihin) erotetaan immunoreaktantista, edullisesti pesemällä ennen immuno-reaktantissa läsnä olevan leimatun toisen reseptorin määrän määrittämistä.

Vaiheen (e) mukaisesti muodostuneen immunoreaktantin määrän määrittäminen toteutetaan osana immunoreaktanttiin sidottuna olevan leimatun toisen reseptorin määrän määrittämisellä, joka immunoreaktantti sisältää apo B-100:n. Tämä antaa käyttöön suoran määrityksen näytteen sisältämän apo B-100:n määrälle.

Tuo määrä voi olla nolla, osoittaen siten, ettei näytteessä ole läsnä yhtään apo B:tä, niiden rajojen puitteissa, jotka voidaan ilmaista. Menetelmät leimatun toisen reseptorin määrän määrittämiseksi riippuvat käytettävästä leimasta, sellaisten leimojen ja määritysmenetelmien ollessa hyvin tunnettuja alalla.

Edullisissa kiinteäfaasisissa suoritusmuodoissa, joissa kiinteä kantaja sisältää apo B-100-reagenssia, vaiheessa (d) muodostu- „ 92714 34 neen immunoreaktantin määrä preparoidaan määritystä varten seuraavien vaiheiden kautta: (l) Sekoitetaan biologisesti aktiivista leimattua spesifisesti sitoutuvaa ainetta, edullisesti reseptorimolekyyli, joka sitoutui mihin tahansa reseptorimolekyyliin, joita käytettiin vaiheessa (b), joita on läsnä kiinteätaasisena immunoreaktanttina, kompleksin muodostamiseksi, edullisesti toisen immunoreaktantin. Leimatun spesifisen sitoutuvan aineen leima kykenee ilmaisemaan kompleksissa olevan leimatun spesifisen sitoutuvan aineen läsnäolon. Näiden määritystyyppien edullisissa suoritusmuodoissa vaiheet (i)-(k) suoritetaan vaiheen (d) jälkeen.

(m) Sekoitetaan ennalta määrätty määrä leimattua spesifistä sitoutuvaa ainetta ruumiinnestenäytteen kanssa reaktioseoksen, edullisesti immunoreaktioseoksen, muodostamiseksi.

(n) Siten muodostunutta leimatun spesifisen sitoutuvan aineen/ ensimmäisen immunoreaktantin seosta inkuboidaan samalla tavalla kuin kuvattiin vaiheessa (d) kompleksin muodostamiseksi.

Näin muodostunut kiinteäfaasinen kompleksi sisältää leiman sidottuna osaksi sitä. Edullisissa suoritusmuodoissa, kaikki leimattu spesifinen sitoutuva aine, joka ei ole sitoutunut osaksi kiinteäfaasista kompleksia, erotetaan kompleksista, edullisesti pesemällä, ennen kiinteään faasiin sidotun leiman läsnäolon määrittämistä.

Vaiheen (e) mukaisesti muodostuneen immunoreaktantin määrän määrittäminen toteutetaan määrittämällä osana kompleksia läsnä olevan leiman määrä. Tämä antaa käyttöön epäsuoran määrityksen näytteessä läsnä olevan apo B-lOO:n määrälle.

Proteiinisten antigeenien ja spesifisten sitoutuvien aineiden leimaaminen tunnetaan hyvin alalla. Hybridoomien tuottamia reseptoreja voidaan esimerkiksi leimata radioisotooppia sisältäviä aminohappoja metabolisesti liittämällä, jotka on toimi-

II

9271 4 35 tettu komponenttina kudosviljelyalustaan. Katso esimerkiksi Galfre et ai., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981).

Aktiivisten funktionaalisten ryhmien välityksellä tapahtuvat proteiinien konjugointi tai kytkentämenetelmät ovat erityisen käyttökelpoisia, ja johtavat siihen, että leima tulee kovalentti-sesti kytketyksi antigeeniin tai spesifiseen sitoutuvaan aineeseen. Katso esimerkiksi Aurameas, et ai., Scand. J. Immunol.

Voi. 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) ja US-patentti julkaisu 4 493 795, mikä on sisällytettynä tässä viitteenä. Lisäksi paikkakohdis-tettu liittämisreaktio voidaan suorittaa siten, että leima ei olennaisesti häiritse antigeenin tai reseptorin biologista aktiivisuutta, esimerkiksi Rodwell et ai., Biotech. 3, 889-894 (1985 ) .

Leimaava väliaine voi olla fluoresoiva leimaava aine, joka sitoutuu kemiallisesti vasta-aineisiin tai antigeeneihin denaturoimatta niitä, jolloin muodostuu fluorokromia (väri), joka on hyödyllinen immunofluoresoiva merkkiaine. Sopivia fluoresoivia leima-aineita ovat fluorokromit kuten esimerkiksi fluoreskeiini isosyanaatti (FIC), fluoreskeiini isotiosyanaatti (FITC), 5-dimetyyliamiini-l-naftaleenisulfonyylikloridi (DANSC), tetra-metyylirodamiini isotiosyanaatti (TRITC), lissamiini, rodamiini 8200 sulfonyylikloridi (RB 200 SC) ja vastaavat. Immunofluore-senssianalyysimenetelmien kuvailu löytyy teoksesta DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", Antibody As A Tool, Marchalonis et al., edit. J. Wiley & Sons, Ltd., s. 189-231, 1982, joka on sisällytetty tässä viitteenä.

Edullisissa suoritusmuodoissa osoittava ryhmä on entsyymi, kuten esimerkiksi piparjuuren peroksidaasi (HRPO), glykoosioksidaasi tai niiden kaltaiset. Silloin kun pääasiallinen osoittava ryhmä on entsyymi kuten HRPO tai glukoosioksidaasi, lisäreagensseja tarvitaan sen tosiasian visualisoimiseksi, että reseptori-ligandikompleksi (immunoreaktantti) on muodostunut. Sellaisiin lisäreagensseihin HRPO:ta varten kuuluvat vetyperoksidi ja ,R 92714 ό Ο hapettavan värin prekursori kuten diaminobentsidiini. Glukoosi-oksidaasin kanssa hyödyllinen lisäreagenssi on 2,2'-atsino-di-(3-etyyli-bentstiatsoliini-G-sulfonihappo) (ABTS).

Radioaktiiviset alkuaineet ovat myös hyödyllisiä leimaavia aineita, ja niitä kätyetään valaisevasti tässä yhteydessä.

Tyypillinen radioleima-aine on radioaktiivinen alkuaine, joka tuottaa gammasäde-emissioita. Alkuaineet, jotka itse emittoivat

, . · , ... 124 T 12 5 128 131 T 132T

gammasateita, kuten esimerkiksi J, J, j, J, J

ja ^Cr, edustavat yhtä luokkaa gammasäde-emissiota tuottavista radioaktiivisen alkuaineen sisältävistä osoittavista ryhmistä.

125

Erityisen edullinen on J. toinen ryhmä hyödyllisiä osoittavia ryhmiä sisältää niitä alkuaineita, kuten ^C, ^0 ja N, jotka itse emittoivat positroneja. Siten emittoidut positronit tuottavat gammasateita kohdatessaan eläinruumiissa läsnäolevia elektroneja. Myöskin hyödyllinen on beetaemittoija kuten 111. .. indium.

Esillä olevan keksinnön mukaisissa määritysmenetelmissä ja systeemeissä voidaan näin ollen käyttää hyväksi tai ne voivat käsittää tämän keksinnön mukaisen reseptorin kiinnitettynä kiinteään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi.

Antigeeni tai reseptori kiinnitetään tyypillisesti kiinteään matriisiin adsorption avulla vesipitoisesta alustasta, vaikkakin useita adsorptiotapoja, kuin myös muita kiinnittämistapoja, joita alaa tuntevat hyvin tuntevat, voidaan käyttää. Tyypillisiä sellaisia tapoja ovat reseptorin tai antigeenin reaktio reaktiivisen karboksyylisen toiminnallisuuden kanssa, joka on muodostunut syanogeenibromidin reaktiossa glukoosia sisältävien matriisien kanssa kuten esim. ristisidottu dekstroosi tai selluloosa, glutaraldehydi liittäjänä, kuten on käsitelty jäljempänä lateksi-partikkelien yhteydessä ja vastaavien.

Hyödylliset kiinteät matriisit tunnetaan hyvin alalla. Sellai-;· siin materiaaleihin kuuluvat ristisidottu dekstraani, jota on

II

9271 4 37 saatavissa kauppanimellä Sephadex Pharmacia Fine Chemicals'ilta (Piscataway, NJ); agaroosi; polystyreenipalloset, halkaisijalta noin 1 - noin 5 mm, saatavana Abbott Laboratories of North

Chicago'lta, IL; polyvinyylikloridi, polystyreeni, ristisidottu polyakryyliamidi, nitroselluloosa tai nailonpohjäiset kudokset kuten arkit, liuskat tai tangot; tai putket, levyt tai mikro-tiitterilevyn kuopat, kuten ne, jotka on tehty polystyreenistä tai polyvinyylikloridista.

Lateksipartikkelit, jotka ovat hyödyllisiä agglutinaatiotyyppi-sissä määrityksissä, ovat myös hyödyllisiä kiinteitä matriiseja. Sellaisia materiaaleja toimittaa the Japan Synthetic Rubber Company of Tokyo, Japan, ja niitä kuvataan karboksifunktionaali-sina partikkeleina dispergoituna anioniseen saippuaan. Sellaisten partikkeleiden tyypillisten erien keskimääräinen halkaisija on 0,308 mikronia ( ,u), ja ne sisältävät keskimääräisen karboksi- 2 funktionaalisen ryhmän jakaantuman noin 15 - noin 30 Angstrom karboksiryhmää kohti.

Ennen käyttöä partikkelien annetaan reagoida diamiinin kanssa kuten 1,3-diamino-2-propanoli, jotta muodostuisi suuri määrä amidisidoksia partikkelin karboksiryhmien kanssa jättäen samalla amiiniryhmät vapaiksi. Vapaiden amiinien annetaan sen jälkeen reagoida dialdehydin kanssa kuten glutaraldehydi ja reseptorin tai antigeenin kanssa Schiff'in emäksen reaktiotuotteiden muodostamiseksi. Schiff'in emäksen reaktiotuotteet pelkistetään sen jälkeen vesiliukoisella pelkistäjällä kuten natriumboro-hydridi hyödyllisen kiinteän kantajan tuottamiseksi.

Ne, jotka tuntevat alaa ymmärtävät, että on olemassa lukuisia menetelmiä kiinteäfaasisille immunomäärityksille, joita voidaan käyttää tässä yhteydessä. Tyypillisiin, hyödyllisiin kiinteä-faasisiin määrityksiin kuuluvat moninkertaiset entsyymi-immunomääritysmenetelmät (EMIT) ja fluoresenssi-immunomääri-tykset (FIA), erityisesti käsiteltyjen RIA- ja ELISA-määritys-ten lisäksi. Kuitenkin, mikä tahansa menetelmä, joka johtaa apo-proteiini B-100:n ilmaistavaan reaktioon tämän keksinnön mukaisten 9271 4 38 reseptorimolekyylien kanssa, pidetään osana tätä keksintöä. Kussakin noista määritysmenetelmistä voidaan käyttää yksinkertaista tai kaksinkertaista vasta-ainetekniikkaa, joissa käytetään osoittavaa väliainetta immunoreaktion ilmaisemiseksi, ja siten kaiken tämän keksinnön mukaisen reseptorin kanssa määritettävän apo-proteiini B-lOO:n sitoutumisen ilmaisemiseksi. Tyypillisiä menetelmiä voi löytää selostettuina teoksessa Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981); ja Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, NY (1980).

Yksi spesifisen menetelmän suoritusmuoto apo B-100:n määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä käyttäen tämän keksinnön mukaista kiinteään faasiin kiinnitettyä reseptoria, on ei-kompetitiivinen ELISA, jolle on tunnusomaista, että immunoreaktiot suoritetaan perättäisesti. Sellaisessa määrityksessä tasaeräinen määrä MB47-reseptoreja, esim. yleensä noin 1 - noin 500 yUg, kiinnitetään mikrotiitterikuopan sisäseinämiin kiinteän kantajan muodostamiseksi .

Kaiken otetussa kehonäytteessä läsnä olevan apo B-100:n annetaan sitten immunoreagoida kiinteään faasiin kiinnitettyjen reseptorien kanssa. Tämä toteutetaan sekoittamalla tunnettu määrä, esim. noin 10 - noin 200 mikrolitraa (yUl) näytettä (joka voidaan esilaimentaa), kuten seerumi tai plasma, mikrotiitterikuopassa kiinteään faasiin kiinnitettyjen reseptorien kanssa kiinteän/neste-faasisen seoksen muodostamiseksi. Seosta pidetään biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka kaiken näytteessä läsnä olevan apo B-l00:n kannalta riittää sitoutumaan immunologisesti reseptorimolekyvleihin ja muodostamaan kiinteafaasisen immunoreaktantin. Kiinteä ja nestemäinen faasi erotetaan sen jälkeen toisistaan, ja kiinteä faasi huuhdellaan tyypillisesti ei-spesifisesti sitoutuneiden materiaalien poistamisen varmistamisen helpottamiseksi.

Apo B-100:n, joka on läsnä kiinteätaasisena immunoreaktanttina ” (so. apo B-100 sidottuna kiinteään faasiin kiinnitettyihin li 39 9 2 7 1 4 MB47-reseptoreihin) annetaan sitten immunoreagoida entsyymilei-mattujen toisten reseptorimolekyylien kanssa. Tämä toteutetaan sekoittamalla ennalta määrätty määrä, esim. noin 0,1 - noin 10 ^,ug entsyymileimattuja toisia reseptorimolekyylejä vedelliseen puskuriliuokseen, edullisesti piparjuuriperoksidaasi (HRPO)-leimattuja MB24-reseptoreja, toisen kiinteän/nestemäisen seoksen muodostamiseksi. Toista seosta inkuboidaan kuten edellä on kuvattu, muodostaen näin kiinteäfaasisen immunoreaktantti "sandwich"'in, joka sisältää MB47-reseptorin, apo B-100:n ja entsyymileimattuja MB24-reseptoreja.

Nestefaasin erottamisen jälkeen kiinteästä faasista edellä kuvatulla tavalla, tasamäärä kromogeenistä substraattia, kuten o-fenyleenidiamiinia (OPD) HRPO:lle, sekoitetaan mikrotiitteri-kuoppaan, joka sisältää kiinteäfaasisen immunoreaktantin, kolmannen kiinteän/nestemäisen seoksen muodostamiseksi. Tätä seosta pidetään biologisen määrityksen olosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka kaiken immunoreaktanttina läsnä olevan entsyymin kannalta riittää muuttamaan vastaavan määrän substraattia värilliseksi tuotteeksi. Muodostuneen värillisen liuoksen optinen tiheys mitataan sen jälkeen, ja sitä verrataan tuloksiin, jotka on saatu käyttäen liuoksia, jotka sisältävät tunnettuja määriä apo B-100-reagenssia.

Ei-kompetitiivisen, jaksottaisen ELISAn kykyä, jota edellä on kuvattu ja kuvataan yksityiskohtaisemmin Materiaalit ja menetelmät jaksossa, ilmaista ruumiinnestenäytteen sisältämä apo B-100, tutkittiin. Niissä tutkimuksissa tasamäärät ihmisen lipo-proteiinivapaata plasmaa (LPD), johon sekoitettiin tunnettuja määriä apo B-100-reagenssia, toimi ruumiinnestenäytekontrollina.

Tuon tutkimuksen tulokset, esitettynä taulukossa 1 jäljempänä, osoittavat, että edellä kuvatulla menetelmällä voidaan tarkkaan määrittää ruumiinnestenäytteessä läsnä olevan apo B-lOO:n kliinisesti merkityksellisiä määriä.

• 9271 4 40

Taulukko 1

Ihmisen plasman sisältämän apo B-lOO:n ei-kompetitiivisia, jaksottaisia ELlSA-tutkimuksia___ Näyte1 Todelli- Ref.1 MB47/MB242 MB24/B183 nen2 _ _ B alhainen 40 32+44,3 42,6+5,0 31,7 B normaali 80 71+103 82,3+11,8 54,7 B korkea 150 126+180 149+24,7 119 T alhainen 22,3 12,6+17 16,2+0,62 15,4;9,0 T normaali 44,8 25,4+49,2 36,1+9,4 22,9;19,7 T korkea 89,5 64,0+101 77,4_+7,4 34,9:36,3 Ä 73 82,9+11,7 66,4 AM 76 67,1+8,1 46,8;61,0 B 86,5 69,8+4,6 68,5;90,5 C 145 129+3,8 147,173 D 109 81,0+7,4 76,3:98,2 K 95 98,4+16,5 77,5;88,9 r 60 64,2+7,5 51,3;52,9

Keräily 81,3 78,5+6,8 54,7;65,9

Cl 40,1 47,9+6,7 47,0;68,7 C2 74,8 88,6+13,2 81,3;98,2 C3 70,4 64,5+4,8 64,5;82,9 C4 39,9 56,7+6,6 48,5;58,0 1 Kliinisesti alhaisen, normaalin ja korkean apoproteiini B-100:n sisältämiä kontrolliliuoksia saatiin Johnson & Johnson Biotechnology Center Inc.'ltä, La Jolla, CA (B) ja Tago Inc.'Itä, Burlingame, CA (T). Plasmanäytteet saatiin kliinisesti normaaleista yksilöistä (yhden tai kahden kirjaimen merkinnät ja C1-C4), ja keräily edustaa 10 sellaisen näytteen seosta.

2 ...

Todellinen apoproteiini B-100-konsentraatio määritettynä näytteeseen lisätyn kokonaisproteiinin avulla. Kaikki taulukossa esitetyt konsentraatiot ovat mg/dl yksiköissä.

Il Λ ...

2

Apoproteiini B-lOO:n konsentraatio määritettynä siten, että 3 käytetään vertailumääritystä (ref), jota tämän jälkeen on kuvattu. Arvot annetaan kolmen standardipoikkeaman alueella.

4 9271 4 41

Apoproteiini B-lOO-konsentraatioita (keskiarvo + 3 standardi-poikkeamat), jotka on saatu käyttäen kiinteään faasiin kiinnitettyjä MB47-reseptoreja ja HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja ei kompetitiivisessa jaksollisessa ELISAssa kuten tätä ennen on kuvattu.

Apoproteiini B-lOO-konsentraatioita (esitetty toistoarvot silloin kun ne on tehty), jotka on saatu käyttäen kiinteään faasiin kiinnitettyjä MB24-reseptoreja ja HRPO-leimattuja B18-reseptore ja /Curtiss et ai., J. Biol. Chem., 257:15213-15221 (1982J7 ei-kompetitiivisessa ELISAssa, jossa immunoreaktiot suoritettiin perättäisesti kiinteäfaasisen immunoreaktantin tultua ensin muodostetuksi.

Toinen spesifisen menetelmän suoritusmuoto apo B-lOO:n määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä on ei-kompetitiivinen ELISA, jolle on tunnusomaista, että immunoreaktiot suoritetaan oleellisesti samanaikaisesti. Edellä kuvattuun mikrotiitterikuoppaan, joka sisältää kiinteään faasiin kiinnitettyjä MB47-reseptoreja, sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti otettu kehonäyte ja entsyymi-leimattuja toisia reseptoreja, jotka immunoreagoivat toisen apo B-lOO-epitoopin kanssa, eivätkä oleellisesti inhiboi MB47-resep-torien sitoutumista apo B-lOO:aan. Sellaiset entsyymileimatut toiset reseptorit ovat edullisesti MB24-reseptoreita.

Muodostunutta kiinteätä/nestemäistä seosta inkuboidaan sen jälkeen, seoksen faasit erotetaan, ja entsyymin määrä, joka on läsnä osana kiinteään faasiin sidottua immunoreaktantti-"sandwich"'ia, määritetään kuten aikaisemmin on kuvattu.

Edellä kuvattua ei-kompetitiivista ELISA:aa käytettiin plasmojen apo B-lOO-pitoisuuksien tutkimiseksi 20 potilaasta, joilla oli sepelvaltimotauti (CAD), 20 potilaasta, joilla oli tavallinen perheittäin esiintyvä hyperkolesterolemia ja 20 normaalista yksilöstä. Kuten on esitetty taulukossa 2 jäljempänä, keskimääräiseksi plasman apo B-100-tasoksi normaaleilla yksilöillä määritettiin 85 milligrammaa/desilitra (mg/dl) 2 standardipoikkeama- 42 9271 4 alueella + 21 mg/dl. Tämä arvo on hyvin sopusoinnussa apo B-IOO-arvojen normaalialueen kanssa, joista raportoivat Curry et ai., Clin. Chem. 24^ 280-286 (1987), ja Rosseneu et ai., Clin. Chem. 28, 427-433 (1983), joista kumpikin käytti eri immunomäärityksiä.

Edelleen plasman apo B-100-tasot potilailla, joilla oli CAD ja hyperkolesterolemia olivat korkeampia kuin normaaleilla tavattu 2 standardipoikkeama-alueen yläraja. Samanlaisia tuloksia, käyttäen muita menetelmiä CAD- ja hyperkolesterolemiapotilaille, ovat raportoineet Sniderman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 77, ja Lipid Research Council, JAMA 251, 351-364 (1984).

Taulukko 2

Ihmisen plasman sisältämän apo B-lOO:n simultaani-ELISA-kokeita 1 .2 ... 3

Yksilöt Lipoprotennitasot_ Apoprotenni B-tasot___

Kokon.3 HDL4 LDL1 2 Kompet° Ei- η RID8 RID9 koi. koi. koi. ELISA kompet #1 #2 _____ __ ___ _____ ELISA _____ ____

Normaali 186 60 111 85 82 102 69 +SD 37 16 30 21 22 20 19 CAD 205 37 133 109 104 138 84 +SD 35 7 37 24 23 20 24 FH 331 37 270 196 204 211 136 +SD 90 11 96 40 49 64 44

Yksilöihin lukeutuu 20 normaalilipidiveristä, tervettä kontrollia (normaali); 20 yksilöä, joilla on sepelvaltimotauti määriteltynä sydämen katetroinnilla (CAD); ja 20 yksilöä, joilla on tavallinen hyperkolesterolemia (FH).

2 . . .

Annetut arvot ovat keskiarvoja +2 standardipoikkeamaa keskiarvosta; (+SD) yksiköissä mg/dl.

3

Kokonaiskolesteroli.

4 . ....

Kolesteroli, joka on läsnä HDL:na.

I! 2

Kolesteroli, joka on läsnä LDL:nä.

„ 92714 4 3 ^ Apo B-lOO-taso määritettynä kompetitiivisella ELISA-(kompet.) menetelmällä, jota on kuvattu Materiaalit ja menetelmät jaksossa.

7

Apo B-100-taso, määritettynä ei-kompetitiivisella (Ei-kompet.) ELISA:lla, käyttäen kiinteään faasiin kiinnitettyjä MB47-reseoto-reja ja HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja, jossa yhteydessä näyte ja reseptorit sekoitettiin oleellisesti samanaikaisesti.

8

Apo B-taso, määritettynä käyttäen säteittäistä immunodiffuusio-kittimallia Diffu-gen RID, saatavissa Tago Inc.1lta, Burlingame, CA .

9 .........

Apo B-taso, määritettynä käyttäen sateittaista immunodiffuusio- kittimallia M-Partigen RlA, saatavissa Calbiochem-Behring'1tä,

La Jolla, CA.

Ruumiinnestenäytteen laimentamisen vaikutusta, ennen apo B-l00:n määrittämistä siitä ei-kompetitiivisellä simultaanilla ELISA-menetelmällä, tutkittiin myös. Nuo tulokset, esitettynä taulukossa 3 jäljempänä, osoittavat, ettei apo B-100-tasoissa ollut merkitsevää eroa määritettynä 5-kertäisellä alueella plasma-laimennuksia, so. 1:1000-1:5000.

Taulukko 3

Apo B-tasojen simultaani-ELISA-tutkimuksia määritettynä plasman eri laimennuksista_

Plasmalaimennus Plasma l3 Plasma 23 Plasma 33 1:1000 54,4 136,6 199,0 1:2500 57,5 142,5 194,2 1:5000 53,0 126,0 178,0

Keskiarvo2 55,0 135,0 190,0 S.D.3 1,88 6,83 8,98 % C.V.4 3,4 5,0 4,7 3 Plasman apo B-100-konsentraatio yksiköissä mg/dl.

2

Keskimääräinen plasman apo B-lOO-konsentraatio kaikille 3 laimennukselle.

44 9 2 7 1 4 3

Yksi standardipoikkeama.

4 Varianssikerroin prosentti tulosten välillä saatuna erilaisille laimennuksille.

Kuviossa 7 on esitetty korrelaatio LDL-kolesterolin ja plasman apo B-100-tasojen välillä, määritettynä ei-kompetitiivisella ELISA:lla normaaleille ja potilasnäytteille, joita edellä on kuvattu. Korrelaatiokerroin 0,89 on samanlainen kuin se, mitä raportoivat Albers et ai., Metabolism 24, 1339-1351 (1975) ja Slater et ai., Clin. Chem. 31, 841-845 (1985).

Tämän keksinnön mukaisten määritysmenetelmien suoritusmuotoja käyttäen kiinteää kantajaa, joka sisältää apo B-100-reagenssia kiinnitettynä kiinteään kantajaan, suoritetaan käyttäen seuraa-via vaiheita: (a) Ruumiinnestenäyte, joka sisältää apo B-lOO:aa, otetaan kuten on kuvattu tätä ennen.

(b) Sekoitetaan oleellisesti samanaikaisesti (1) nestenäyte; (2) ennalta määrätty määrä joko MB24- tai MB47-reseptorimole-kyylejä; ja (3) ennalta määrätty määrä kiinteään faasiin kiinnitettyä · apo B-100-reagenssia, neste/kiinteäfaasisen immunoreaktioseok- sen muodostamiseksi.

Seosta pidetään biologisissa määritysolosuhteissa ajanjakso, joka reseotorimolekyylien vasta-ainesidontapaikkojen kannalta on riittävä immunoreagoimaan (immunologisesti sitoutumaan) joko apo B-100-reagenssiin tai kaikkeen siihen apo B-lOO:aan, jota on läsnä ruumiinnestenäytteessä. Reseptorimolekyylit, jotka sitovat immunologisesti apo B-lOO:aa, jota on läsnä ruumiinnestenäy tteessä , muodostavat nestefaasisen immunoreaktantin, ja ne, jotka sitovat kiinteään faasiin kiinnitettyä apo B-100-reagenssia, muodostavat kiinteäfaasisen immunoreaktantin.

* II:.

« 9271 4 4 5 (c) Kiinteään faasiin kiinnitetyn immunoreaktantin läsnäolo määritetään sen jälkeen, ja näytteessä läsnä olevan apo B-lOO:n määrä määritetään siten vertaamalla sitoutumisen määrää, jota esiintyy, kun tunnettu määrä MB47:ää tai MB24:ää sekoitetaan samanlaiseen kiinteään faasiin kiinnitettyyn apo B-lOO:aan, kuten tämän jälkeen on käsitelty. Immunoreaktanttimääritys suoritetaan edullisesti sen jälkeen kun nestefaasinen ja kiinteä-faasinen immunoreaktantti vaiheesta (b) on erotettu toisistaan, esim. pesemällä. Näytteen sisältämän apo B-lOO:n määrä, joka on sidottuna nestefaasisena immunoreaktanttina, voidaan määrittää kuten käyttämällä leimattuja vasta-aineita, jotka immunoreagoi-vat tämän keksinnön mukaisten reseptorimolekyylien kanssa, kuten peroksidaasiin liitetty vuohen anti-hiiri Ig, tai kuten muutoin tässä on kuvattu.

Kompetitiivisen määrityksen erityisen edullisessa suoritusmuodossa, noin 1 ^ug - noin lO ^ug apo B-100-reagenssia kiinnitetään kiinteään matriisiin, edullisesti mikrotiitterikuopan seinämiin, kiinteän kantajan muodostamiseksi. Kaikki ei-spesifiset sitoutumispaikat kiinteällä kantajalla estetään tyypillisesti proteiinin avulla, kuten BSA tai vastaavat.

Ennalta määrätyn määrän tämän keksinnön mukaisia reseptori-molekyylejä, esim. yleensä noin 0,1 ^,ug - noin 10 ^ug, annetaan oleellisesti samanaikaisesti immunoreagoida kiinteään faasiin kiinnitetyn apo B-100-reagenssin ja kaiken ruumiinnestenäyt-teessä läsnä olevan apo B-lOO:n kanssa (joka näyte voidaan laimentaa), kuten seerumi tai plasma. Tämä toteutetaan sekoittamalla oleellisesti samanaikaisesti tasamäärä näytettä ja reseptorimolekyylejä mikrotiitterikuopassa, joka sisältää kiinteään faasiin kiinnitettyä apo B-100-reagenssia.

Siten muodostunutta kiinteää/nestemäistä seosta pidetään biologisissa määritysolosuhteissa ajanjakso, joka läsnä olevien reseptorimolekyylien kannalta on riittävä sitomaan immunologisesti läsnä olevaa apo B-l00:aa. Kiinteä ja nestemäinen faasi ; erotetaan sen jälkeen edullisesti toisistaan esim. pesemällä, 46 9271 4 ja kiinteää faasia huuhdellaan tyypillisesti ei-spesifisesti sitoutuneiden materiaalien poistamisen varmistamisen helDOtta-miseksi.

Kiinteään faasiin kiinnitettyjen immunoreaktanttien läsnäolo määritetään sen jälkeen tyypillisesti käyttämällä leimattuja vasta-aineita, jotka sitovat immunologisesti tämän keksinnön mukaisia reseptorimolekyylejä, kuten peroksidaasileimattua vuohen anti-hiiri IgG.

Komoetitiivisessa ELISA:ssa, potilasnäytteessä läsnä oleva apo B-lOO kilpailee vakioisen tunnetun määrän kanssa apo B-lOO-reagenssia vakioisesta tunnetusta määrästä reseptorimolekyylin vasta-ainekiinnityspaikkoja immunoreaktioseoksessa. Kilpailu, jonka näytteen sisältämä apo B-lOO tuo tullessaan, johtaa ilmaistavan kiinteään faasiin sidotun immunoreaktantin vähenemiseen; mitä suurempi vähenemä, sitä suurempi tutkimuksessa olevassa kehonäytteessä läsnä olevan apo B-lOO:n määrä.

Jotta saataisiin potilasplasmoissa läsnä olevan apo B-100:n suhteellisia määriä, verrattiin tuloksia, jotka saatiin käyttäen kilpailevia standardeja, jotka sisälsivät tunnettuja määriä apo B-100-reagenssia. Standardikäyrä valmistettiin, käyttäen LDL-konsentraatioita, jotka vaihtelivat alueella .. 32 mg/ml-0,25 mg/ml (320 mg/dl - 2,5 mg/dl).

Edellä kuvattua kompetitiivistä E LIS A:a a käytettiin tutkittaessa samoja normaaleja ja potilasnäytteitä, joita arvosteli tiin ei-kompetitiivisella ELISA:lla. Nuo tulokset, jotka myös on esitetty taulukossa 2 tätä ennen, ovat hyvin sopusoinnussa tulosten kanssa, jotka saatiin ei-kompetitiivisessä määrityksessä .

Ruumiinnestenäytteen laimentamisen vaikutusta ennen apo B:n määrittämistä siitä edellä kuvatussa kompetitiivisessa ELISA:ssa tutkittiin. Ne tulokset, esitettynä taulukossa 4 jäljempänä, osoittavat, ettei merkittäviä eroja ollut apo B- 47 9271 4 tasoissa määritettynä 4-kertaisella plasmalaimennusalueella; so. 1:100-1:400.

Taulukko 4

Apo B-tasojen tutkimuksia kompetitiivisella ELISA:lla määritettynä eri plasmalaimennuksista_

Plasmalaimennus Plasma 1^ Plasma 2 Plasma 3 1:100 32,8 63,3 175,8 1:200 30,0 58,5 183,2 1:300 31,8 64,8 190,9 1:400 33,8 62,6 190,0

Keskiarvo2 32,1 62,3 185,0 S.D.3 1,6 2,7 7,0 % C.V.4 5,0 4,3 3,8 ^ Plasman apo B-100-konsentraatio yksiköissä mg/dl.

2

Keskimääräinen plasman apo B-100-konsentraatio kaikille 3 laimennukselle.

3

Yksi standardipoikkeama.

4

Varianssikerrom prosentti tulosten välillä, jotka saatiin eri laimennuksille.

LDL-kolesterolin ja plasman apo B-tasojen välinen korrelaatio määritettynä kompetitiivisella ELISA:lla normaaleilla ja poti-lasnäytteillä, joita edellä on kuvattu, on esitetty kuviossa 8. Korrelaatiokerroin 0,92 on samanlainen kuin Albersin et ai. ilmoittama, Metabolism 2j4, 1339-1351 (1975 ), ja Slaterin et ai. ilmoittama, Olin. Chem., 31_, 841-845 (1985), osoittaen täten, että kompetitiivinen ELISA ennustaa tarkkaan kiertävän LDL-kolesterolin tasot.

Apo B-100-tasojen korreloimista, saatuna käyttäen kompetitii-vista ja ei-kompetitiivista ELISA:aa, tutkittiin. Kuten kuviossa 9 on esitetty, kussakin määrityksessä saatujen tulosten 48 92714 välillä oli suuri korrelaatio (r = 0,92).

Diagnostinen systeemi, edullisesti kitin muodossa, joka on hyödyllinen suoritettaessa edellisiä määritysmenetelmiä, sisältää, erillisissä pakkauksissa, (a) ensimmäisen spesifisen sitoutuvan aineen, jossa mainittu aine on (i) reseptori, joka immunoreagoi apo B-100:n kanssa, ja on valikoitu reseptoreista, joita erittää hybridooma HB 8746 (MB47) tai hybridooman HB 8742 erittämistä reseptoreista (MB24) ja (b) leimatun toisen spesifisen sitoutuvan aineen mainitun ensimmäisen sitoutuvan aineen immuno-reaktion apo B-100:n kanssa ilmaisemiseksi. Leimattu spesifinen sitoutuva aine on edullisesti reseptori, joka on kytketty entsyymiin. Edullisemmin leimattu aine on jäänne kummastakin edellä olevan kohdan (a) reseptorista, kytkettynä entsyymiin.

Systeemi sisältää edelleen edullisissa suoritusmuodoissa toisen reagenssi apo B-lOO-säiliön käytettäväksi kontrollina ja/tai kohdeantigeenina. Edullisia ovat myös suoritusmuodot, joille on tunnusomaista, että systeemi sisältää kiinteän matriisin, johon ensimmäinen spesifinen sitoutuva aine tai apo B-100-reagenssi on kiinnitetty kiinteän kantajan muodostamiseksi. Hyödyllisiä kiinteitä matriiseja on jo kuvattu. Edullisesti kuitenkin kiinteä matriisi on mikrotiitterilevyn kuoppa.

Tunnettuja määriä spesifisiä sitoutuvia aineita toimitetaan.

Ne määrät riittävät vähintään yhden määrityksen suorittamiseen. Käyttöön tulevat spesifiset sitoutuvat aineet toimitetaan tyypil1isesti muodossa ja määränä, joka on suunniteltu laimennettavaksi määrättyyn volyymiin vettä, saliinia tai puskuria, kuten fosfaattipuskuroitu saliini pHrssa 7,3-7,5.

Myös muita pakkauksia voi olla mukana systeemissä. Sellaiset pakkaukset voivat sisältää (i) puskurisuoloja kuivassa tai nestemäisessä muodossa, (ii) entsyymisubstraatteja kuten o-fenylee-nidiamiini, ja sen kaltaiset.

Il 49 9271 4

Tyypillisiin pakkauksiin kuuluu lasisia ja muovisia kuten poly-etyleeni ja polypropyleeni pulloja tai astioita; muovisia, muovimetallisia laminaatteja, muovimetallisia laminaatti-paperisia kuoria ja vastaavia. Spesifiset sitoutuvat aineet voidaan pakata vedellisessä nestemuodossa kuten vatsaontelo-nesteessä tai puskurissa, mutta ne toimitetaan edullisesti kuivatussa muodossa kuten sellaisessa, joka toimitetaan lyofili-soi tuna.

D . Affiniteettisorbentit

Esillä olevassa keksinnössä tarkastellaan myös affiniteetti-sorbenttia, edullisesti steriiliä, joka käsittää tämän keksinnön mukaisen biologisesti aktiivisen reseptorin kiinnitettynä kiinteään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi.Kiinteä matriisi on edullisesti partikkelimuodossa. Sellaiset affini-teettisorbentit ovat hyödyllisiä apoproteiini B-100:aa sisältävän lipoproteiinin (VLDL ja LDL) spesifiseksi poistamiseksi immunoadsorptiolla potilaiden plasmasta, jotka kärsivät hyper-kolesterolemiasta.

Kiinteä kantaja voi koostua laajasta joukosta materiaaleja, kuten esimerkiksi ristisidottu dekstraani, esim. Sephadex G-25, -50, -lOO, -200 ja vastaavat, joita on saatavissa Pharmacia Fine Chemicals’ilta, Piscataway, N.J., agaroosi ja ristisidottu .y agaroosi, esim. Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL4B ja vastaavat, myös saatavissa Pharmacia Fine Chemicals'il ta, tai Bio-Gel A-0,5M, A-1,5M, A-50M ja vastaavat, saatavissa Bio-Rad Labora-tories'ilta Richmon, CA, tai polyakryyliamidipalloset, esim.' Bio-Gel P-2, P-30, P-100, P-300 ja vastaavat, myös saatavissa Bio-Rad Laboratories’ilta. Agaroosi ja ristisidotut agaroosi-materiaalit ovat edullisia tässä yhteydessä niiden suuren huokoisuuden ja alhaisten ei-spesifisten sitomisominaisuuksien johdosta, ja niitä tullaan käyttämään valaisevasti kiinteänä matriisina.

Reseptorien ja kiinteän matriisin sterilointi suoritetaan ·· tavallisesti ennen liittämistä. Biologisen aktiivisuuden so 92714 säilyttämiseksi, reseptorit steriloidaan tavallisesti suodattamalla, esimerkiksi vetämällä läpi 0,22 mikronin nitroselluloosa-suotimen. Matriisin sterilointi riippuu, kuten hyvin tiedetään, matriisityypistä. Esimerkiksi Sepharosea ei voi steriloida autoklavoimalla, mutta se voidaan steriloida kemiallisesti, esimerkiksi käsittelemällä dietyylipyrokarbonaatin kanssa. Toisaalta, ristisidottu Sepharose voidaan steriloida autoklavoimalla pH-arvossa 7, 120°C 20 minuutin ajan.

Sephadex tai Sepharose aktivoidaan tyypillisesti liittämistä varten käyttäen syanogeenibromidia menetelmillä, jotka alalla tunnetaan hyvin. Aktivoitu matriisi pestään sen jälkeen ja liitetään reseptoreihin, jotka immunoreagoivat apo B-l00:n kanssa, ja joita erittää hybridooma HB 8746 tai hybridooma HB 8742. Matriisiin liitetty reseptori pestään sen jälkeen, ja se on valmis käyttöön. Kantajalla olevien reagoimattomien reaktiivisten ryhmien voidaan antaa reagoida amiinin kanssa, kuten etanoliamiini tai Tris, niin haluttaessa.

Affiniteettisorbenttia voidaan käyttää irtonaisessa tilassa, mutta se rajataan edullisesti kolonniin. Potilaan plasma, joka sisältää apo B-100:aa, sekoitetaan sen jälkeen affiniteet-tisorbentin kanssa immunoreaktioseoksen muodostamiseksi. Seosta pidetään biologisissa määritysolosuhteissa ajanjakso, joka kiinteään matriisiin kiinnitettyjen reseptorien kannalta on riittävä sitomaan immunologisesti plasmassa läsnä olevaa apo B-100:aa, ja muodostamaan kiinteä matriisiin kiinnitetty immuno-reaktantti. Plasma erotetaan sen jälkeen kiinteään matriisiin kiinnitetystä immunoreaktantista. Apo B-100- (LDL ja VLDL)-vapaa plasma, joka näin syntyi, voidaan sen jälkeen siirtää potilaaseen, josta se alunperin saatiin.

Affiniteettisorbentin valmistamista ja sen käyttöä apolipo-proteiini B:tä sisältävien lipoproteiinien poistamiseen plasmasta kuvaavat Stoffel et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 611-615 (1981), joka tässä sisällytetään viitteenä. Affiniteetti-.1 adsorbenttikolonnin, joka valmistettiin liittämällä oleellises ti puhtaita MB47-reseptoreja CNB4-aktivoituun Sepharose 4B:hen, n 9271 4 51 todettiin immunoadsorboivan (sitovan) 3 mg LDL:ää per ml kiinteää kantajaa.

II. Materiaalit ja menetelmät A. Ihmisen lipoproteiinien valmistaminen

Ihmisen lipoproteiinifraktioita eristettiin sentrifugoimalla seuraavissa tiheyksissä: VLDL, tiheys (d) alle 1,006 g/ml; LDL, d yhtä kuin 1,025-1,050 g/ml; HDL, d yhtä kuin 1,070-1,21 g/ml, ja LDS, d yhtä kuin 1,21 g/ml. Joissakin tapauksissa ihmisen LDL eristettiin myös d:n ollessa 1,019-1,063 g/ml tai 1,045-1,065 g/ml. Plasman ja kunkin fraktion proteiinipitoisuus määritettiin Lowryn menetelmällä _/Lowry et ai., J. Biol. Chem.

19 3, 265-275, (1951J_7 siten kuin modifioivat Markwell et ai., Anal. Biochem. 8_7, 206-210 (1978), käyttäen BSA-standardia.

Kutakin LDL- ja VLDL-fraktiota varten estimoitiin myös apo B-konsentraatio sen jälkeen kun apo B oli saostettu tetrametyyli-urealla (TMU) käyttäen Kane'n et ai. tekniikkaa, J. Clin. Invest., 5_6, 1622-1634, (1975 ) tai isopropyylialkoholilla

Equsan et ai. oppien mukaan, J. Lipid Res., 2_4, 1261-1267 (1983) .

Tuoretta, paastonneen ihmisen plasmaa saatiin normaaleista terveistä antajista plasmaforeesin avulla, ja se säädettiin 0,1 prosenttiseksi EDTA:n suhteen (s/v). Kolmesta tai useammasta antajasta kokoon saatua kokoomanäytettä käytettiin, ellei toisin mainita. Lipoproteiinit eristettiin plasman jaksottaisella ultrasentrifugoinnilla käyttäen kiinteää KBr:ää tiheyden (d) säätöön. Lipoproteiinifraktioihin kuuluivat VLDL, d alle 1,006 g/ml; IDL, d = 1,006-1,019 g/ml; LDL, d = 1,019-1,063; ja HDL, d = 1,063-1,25 g/ml.

Pöhjafraktio, joka sisälsi lipoproteiinivapaata seerumia (d suurempi kuin 1,25 g/ml), otettiin myös talteen.

Fraktioita dialysoitiin perusteellisesti lipoproteiinipuskuria vastaan, joka sisälsi 0,15 M NaCl:a, 0,3 mM EDTArta, 0,0005 52 9 2 7 1 4 prosenttia alfa-tokoferolia pH-arvossa 7,4.

Kylomikronifraktio erotettiin VLDL-fraktiosta ei-paastotusta yhteenkerätystä plasmasta laskettamalla kylomikronit lipoproteii-nipuskurin läpi ultrasentrifugaatiolla 120 000 x g 40 minuuttia 4°C:ssa.

Kaikki lipoproteiinit suodinsteriloitiin, ja säilytettiin 4° korkeintaan 20 päivää. Lipoproteiinien proteiinipitoisuus analysoitiin Lowryn menetelmän modifikaation mukaan, J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951), käyttäen BSA-standardia. Kaikki lipo-proteiinikonsentraatiot ilmaistaan perustuen proteiiniin.

Kunkin lipoproteiiniluokan apoproteiinikoostumus määritettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Kylomikronit sisälsivät havaittavia määriä apoproteiineja B, E ja C, kun taas VLDL sisälsi apoproteiineja B, E, C ja vähäisiä määriä apoproteiini A-I:tä.

IDL sisälsi apoproteiineja B, E ja C, kun taas LDL sisälsi vain apoproteiinia B. HDL sisälsi apoproteiineja AI, Ali ja C.

Näiden tutkimusten aikana lipoproteiinivalmisteilla näytti olevan tasalaatuinen apoproteiinikoostumus. Apoproteiinien mahdollisen proteolyysin kontrolloimiseksi, valikoituja plasma-kokoomanäytteitä eristettiin ja säilytettiin 1 mg/ml genta-mysiinisulfaatin, 0,2 prosenttisen natriumatsidin, ja 1 mM bentsamidiinin, 10 mM di-isopropyylifluorifosfaatin, 10 ^ug/ml soijapavun trypsiini-inhibiittorin läsnäollessa.

Näiden lipoproteiinien SDS-PAGE apoproteiini-värjäysmallien vertailu, kuin myös niiden, jotka eristettiin ilman antibiootteja ja proteiini-inhibiittoreita ultrasentrifugoinnin jälkeen ja säilytyksen jälkeen 3 viikkoon saakka, ei osoittanut mitään merkkejä proteolyysistä. Kaikki valmisteet, joita käytettiin, olivat steriilejä.

II

• · · 9271 4 53 B. Hybridoomatuotanto ja -viljely Käsittelemättömiä natiiveja lipoproteiineja, jotka oli eristetty kokoomaplasmasta, käytettiin immunisointiin. Neljästä viiteen viikkoa vanhoja Balb/c-hiiriä immunisoitiin vatsaontelon-sisäisesti 50 mikrogrammalla lipoproteiinia täydellisessä Freundin apuaineessa. Sekundääriset laskimonsisäiset ruiskeet, jotka sisälsivät 50 ^,ug lipoproteiinia lipoproteiinipuskurissa, annettiin päivien 28 ja 33 välissä. Pernat poistettiin immunisoiduista hiiristä 72 tuntia viimeisen ruiskeen jälkeen, ja yksi-solususpensioita preparoitiin HT-alustaan. Veri otettiin myös talteen, ja seerumia käytettiin positiivisena kontrollina kuhunkin immunomääritykseen.

Hiiren myeloomasolulinjoja pidettiin log-vaiheen kasvussa stationääriviljelmissä täydellisessä HT-alustassa /Kennet et ai., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 77-91 (1978), joka tässä sisällytetään viitteenä/, joka sisälsi 0,1 mM atsaguaniinia. Yhteensulauttamiset suoritettiin 30 prosenttisen (v/v) polyety-leeniglykolin lOOO läsnä ollessa (Sigma, St. Louis, MO) suhteessa immuunit pernasolut - P3x63Ag8 10:1. Kolme päivää fuusion jälkeen, solut siirrostettiin 96-kuoppaisille kudosviljely- 5 pitoisuudessa 1x10 elävää solua/kuoppa HT-alustassa, joka sisälsi 0,1 mM aminopteriiniä.

• Soluille annettiin 7 päivää fuusion jälkeen HT-alustaa, ja suunnilleen 4-5 päivän välein sen jälkeen tarvittaessa.

Kasvua seurattiin mikroskooppisesti, ja viljelmien supernatan-tit otettiin talteen päivän 14 kohdalla antigeeni-spesifisen' vasta-aineen tuotannon määritystä varten kiinteäfaasisella RIA:lla. Spesifiset vasta-ainetta tuottavat hybridoomat kloonattiin 19-47 päivää fuusion jälkeen rajoittavalla laimentamisella Balb/c pernan syöttösolujen läsnä ollessa, ja kuopissa olevat hybridoomat, jotka sisälsivät yksinkertaisia pesäkkeitä, seulottiin vasta-aineen tuotannon osalta kiinteäfaasisella RIArlla 10 päivän kuluttua. Kloonattuja hybridoomia viljeltiin alustassa, joka sisälsi 10 prosenttia vasikan seerumia, ja niitä säilytettiin jäädytettyinä nestetypessä.

54 9 2 7 1 4 C. LDL:n sitoutumisen, sisäänkuljetuksen ja hajotuksen inhibointi 125

Anti-apo B-lOO-reseptorien kyky inhiboida J-LDL:n sitoutumista, sisäänkulletusta ja hajotusta ihmisen fibroblasteilla mää- 125 ritettiin seuraavalla tavalla. LDL jodattun J:n kanssa (spesifinen aktiivisuus 200 cpm/ng) käyttäen jodimonokloridi-tekniikkaa Bilheimerin et ai. mukaan, J. Clin. Invest., 56, 1420-1430 (1975).

Vasta-aine-LDL-vuorovaikutuksen aikaansaamiseksi, 0,1 ml kutakin hybridooma-supernatanttia inkuboitiin (sekoitettiin ja 125 säilytettiin) J-LDL:n kanssa (loppukonsentraatio 2,5 mg/ml) 0,4 ml:ssa Dulbecco'n minimaalialustaa (DME), joka sisälsi 2,5 mg/ml lipoproteiinivapaata seerumia (LDS) 12 tunnin ajan 4°C:ssa. Sen jälkeen yksittäisesti inkuboidut seokset siirrettiin ihmisen esinahan fibroblastien monokerrosviljelmiin, jotka olivat kasvaneet DME:ssä mukana 10 prosenttia vasikan sikiön seerumia (FCS) 10 mm halkaisijan kuopissa. Näiden solujen LDL-reseptorit olivat maksimaalisesti ilmentyneet noiden solujen esi-inkuboinnissa 24 tunnin ajanjakson aikana DME:ssä, joka sisälsi 2,5 mg/ml LDS:ää.

Supernatantin ja fibroblastisolujen yksittäisten inkubointien jälkeen 6 tunnin ajan 37°C:ssa, ^^J-LDL hajoaminen soluissa määritettiin Drevon1 in et ai. menetelmän mukaisesti, J. Lipid res., 2_2, 37-46 ( 1981 ). Kontrollivil jelmillä oli 0,4 ml 12 5 DME:tä, joka sisälsi J-LDL:ää ja yhtä seuraavista: a) 0,1 ml tuoretta hybridooma-alustaa, joka sisälsi 20 prosenttia vasikan sikiön seerumia; tai b) 0,1 ml hybridooma-alustaa hybridoo-mapesäkkeiden kuopista, jotka olivat negatiivisia apo B-spesi-fisen vasta-aineen tuotannon suhteen; c) 0,1 ml DMErtä, joka sisälsi 2,5 mg/ml LDS:ää; tai d) 0,1 ml leimaamatonta LDL:ää (saattaen lopullinen leimaamattoman LDL:n konsentraatio alustassa tasolle 500 ^,ug/ml).

Il 9271 4 55 D. Anti-LDL immunoglobuliinin eristäminen

Vatsaontelonesteet, jotka sisälsivät tämän keksinnön mukaisia reseptoreita, saatiin 10 viikkoisista Balb/c-hiiristä, joita oli esikäsitelty 0,3 ml:lla mineraaliöljyä, ja joihin oli ruiskutettu vatsaontelonsisäisesti 3-50 x 10^ hybridoomasolua. Keskimääräinen aika askiteksen kehittymiseen oli 12 päivää. Kirkastamisen jälkeen sentrifugoinnin avulla 15 OOOxg 1 tunnin ajan 4°C:ssa, vatsaontelonesteet kerättiin yhteen, ja niitä säilytettiin jäädytettyinä -20°C:ssa.

Eristettyä vasta-ainetta MB47 valmistettiin kromatografoimalla monoklonaalisen hybridooman vatsaontelonesteitä proteiini A-Sepharose 4B-kolonnissa (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Vasta-aine eluoitiin kolonnista 0,1 molaarisella (M) etikkahapolla.

Eristettyjä reseptoreja valmistettiin myös proteiinien nopealla nestekromatografiällä (FPLC) käsitellen monoklonaalisen hybridooman vatsaontelonestettä Pharmacian Mono Q HR 5/5 anionin-vaihtokolonnissa Pharmacian FPLC-System’issä käyttäen 0-0,5 M NaCl-gradienttia 10 mM Trisrssä, pH 8,0, ja noudattamalla kolonnin mukana toimitettuja ohjeita.

E. Hybridoman vasta-aineiden karakterisointi .. Jokaisen vatsaontelonesteen kokoomanäytteen kokonais-gammaglobu- liini (Ig)-pitoisuus saatiin elektroforesoimalla 1-3 ml näytteitä selluloosa-asetaattiliuskoilla 75 mM veronaalipuskurissa, pH-arvossa 8,6 45 minuuttia kentässä 200 millivolttia (mV).

Kokonaisproteiinin prosenttimäärä, joka oli Ig:tä, kvantitoi-tiin Ponceau S-värjättyjen geelien densitometrisella skannauk-sella, ja kokonaisproteiini määritettiin muunnetulla Lowryn menetelmällä kuten aikaisemmin on käsitelty.

Hiiren Ig:n raskaat ja kevyet ketjut identifioitiin kaksois-diffuusiolla 0,9 prosenttisessa agaroosissa. Kymmenen mikro-litran sopivaa vatsaontelonestelaimennusta annettiin reagoida .I. yhtä suuren tilavuuden kanssa sopivasti laimennettua kanin 56 9271 4 anti-hiiri raskas- ja kevytketjuspesifistä antiseerumia (Litton Bionetics). Noin 15 tuntia 20°C:ssa kestäneen diffuusion ja pesun jälkeen, presipitiiniviivat identifioitiin värjäämällä 0,5 prosenttisen Coomassie briljanttisinisellä R-250.

Kunkin monoklonaalisen vasta-aineen isoelektriset profiilit saatiin fokusoimalla isoelektrisesti 0,01 ml:n näytteitä vatsa-ontelonestettä 0,8 prosenttisessa agaroosissa (EF 802-300 LKB), joka sisälsi 10 prosenttia sorbitolia, 2 prosenttia amfoliinia pH-arvoalueella 5-8 (LKB) 150 minuutin ajan 3 watin vakiovirras-sa. Fiksoinnin ja kuivauksen jälkeen geelit värjättiin Coomassien briljanttisinisellä ja valokuvattiin.

1. Western blottaus

Apoproteiinit erotettiin lipoproteiinien natriumdodekyyli-sulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (SDS-PAGE) pystysuorassa slab(liuska)geelilaitteella (14x12x0,15 cm) (Hoeffer Scientific Instruments, San Francisco, CA). Geelejä preparoitiin käyttämällä 25 mM Tris-glysiini-puskuria pH-arvossa 8,6. Ylempi päällysgeeli sisälsi 1 prosenttia SDS:ää, 3 prosenttia akryyliamidia, ja alempi ajogeelin gradientti poly-akryyliamidia, joka sisälsi 1 prosenttia SDS:ää, oli joko 3-20 prosenttia tai 3-6 prosenttia. Lipoproteiinien lipidi poistettiin keittämällä 3 minuuttia elektroforeesinäytepusku-rissa, joka sisälsi 1 prosenttia natriumdodekyylisulfaattia, 10 mM Tris:ä ja 0,24 mM EDTA:ta. Molekyylipainomarkkerit ja niiden vastaavat näennäiset suhteelliset molekyylimassat olivat: fibrinogeeni, 340 000; IgG, 140 000; albumiini, 69 000; ovalbumiini, 43 000; soijapavun trypsiini-inhibiittori, 20 500; ja lysotsyymi, 14 300. Geelejä elektroforesoitiin suunnilleen 18 tuntia 13,5 milliampeerin (mA) vakiovirrassa.

Geelejä pestiin tislatussa vedessä 10 minuuttia ja sen jälkeen 10 minuuttia 25 mM Tris-puskurissa, 192 mM glysiinissä, pH 8,3, joka sisälsi 20 prosenttia (v/v) metanolia. Siirto nitroselluloosalle (0,45 mikronia, Millipore Corp.) toteutettiin ·· elektroforesoimalla 1 tunti 400 mA. Jäljelle jääneet aktiiviset u 57 9 2 7 1 4 sidontapaikat nitroselluloosalla kyllästettiin uittamalla yli yön PBSrssä, joka sisälsi 3 prosenttia BSA:ta, 3 prosenttia normaalia vuohen seerumia, 0,01 prosenttia natriumatsidia (esto-liuos ) .

Fiksattuja geelejä tai nitroselluloosasiirtogeelejä inkuboitiin 18 tuntia 4°C:ssa joko immuunin hiiren seerumin kanssa tai vatsaontelonesteen kanssa, joka oli sopivasti laimennettu PBSrään, joka sisälsi 3 prosenttia BSArta, 3 prosenttia vuohen normaalia seerumia, 0,05 prosenttia Tween-20:tä (polyoksi-etyleeni(20 monolauraatti). Toistuvien pesujen jälkeen, vasta-aineen sitoutuminen havaittiin toisessa 4 tunnin inkubaatiossa 4°C:ssa 3J-vuohi anti-immuuni Ig:n kanssa (0,5 mikroCi/ml) samassa puskurissa, jota taas seurasi perusteellinen peseminen.

Epäspesifinen sitoutuminen nitroselluloosaan aleni merkittävästi pesemällä inkuboinnin jälkeen sekä ensimmäisellä että toisella vasta-aineella PBSrssä, joka sisälsi 3 prosenttia BSArta, 0,05 prosenttia Tween-20:tä ja sen jlkeeen 0,5 M LiClrssa, joka sisälsi 0,1 prosenttia SDSrää.

Geelit tai nitroselluloosasiirtokalvot kuivattiin ja analysoitiin autoradiografiän avulla (X-Omat; Eastman Kodak) -20°C:ssa. Tarvittaessa geelit värjättiin joko 0,1 prosenttisella Coomassien briljanttisinisellä R-250 50 prosenttisessa trikloo-rietikkahapossa tai hopeavärillä (Bio-Rad), kuten ovat kuvanneet Merril et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7_6, 4335-4339 (1979).

F. Fab-kappaleiden valmistaminen

Eristettyjen reseptorimolekyylien vasta-aineen Fab-kappaleita muodostettiin liuottamalla papaiinin kanssa. Vasta-aineen Fc-osat ja liukenemattomat vasta-aineet poistettiin ajamalla proteiini A-Sepharose-4B-kolonnilla. Fab-kappaleiden SDS-PAGE toi näkyviin kaksi erillistä juovaa, 25 000 ja 40 000 daltonia. Fab-kappaleiden immunoreaktiivisuus vahvistettiin spesifisellä .. sitoutumisella LDLrään kiinteäfaasisessa RIArssa (Milne et ai.,

Arteriosclerosis 3^, 23-30 (1983)).

58 9271 4 G. Radioimmunomääritykset (RIA) 125 1. Nestefaasinen J-leimattu antigeeni RIA 125

Sen J-LDL partikkelien fraktion, jota MB47 ja MB24 sitovat, määrittämiseksi käytettiin nestefaasista RIAraa /Curtiss ja

Edgington, J. Biol. Chem., 25, 15213-15221 ( 1982_)_/. Kahta erilaista LDL (d = 1,019-1,063 g/ml) valmistetta tutkittiin, toinen eristettynä 10 normaalin yksilön kokoomaplasmasta ja 125

toinen eristettynä yhden normaalin yksilön plasmasta. J-LDL

(2000 cpm/ng), joka oli valmistettu käyttäen Iodogen-tekniikkaa (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), oli 90 prosenttisesti trikloorietikkahapolla saostettavissa (TCA). Se laimennettiin 9 prosenttiseen naudan seerumin albumiiniin (BSA) (Sigma, St.

Louis, MO), ja sitä sentrifugoitiin 30 OOOxg 15 minuuttia ennen kutakin määritystä kompleksisen materiaalin poistamiseksi.

Määritykset suoritettiin 12x75 mm lasiputkissa kolminkertaisina 55 mM natriumbarbitaalipuskurissa, pH-arvossa 8, joka sisälsi 150 mM NaClria, 0,02 prosenttia natriumatsidia, 3 prosenttia 125 . .

BSA:ta, ja 1,5 mM natrium-EDTA:ta. 0,1 ml:aan J-LDL:aa (joka sisälsi 20 ng LDL-proteiinia) lisättiin 0,1 ml puskuria tai kilpailevaa antigeeniä 0,1 ml eristettyjä MB47-reseptoreja kasvavina konsentraatioina laimennettuna BSA-barbitaali-puskuriin. 18 tunnin kuluttua 4°C:ssa, 0,1 ml IgSorb’ia (The Enzyme Co., Boston, MA) sekoitettiin joukkoon. Kahden tunnin ylläpitoajan jälkeen, 2 ml BSA-vapaata barbitaalipuskuria lisättiin, ja putket sentrifugoitiin välittömästi 1500xg 60 minuuttia. Saostumia pestiin kahdesti barbitaalipuskurin kanssa. Maksimaalinen saostuva radioaktiivisuus määritettiin korvaamalla IgSorb 100 prosenttisella TCA:lla. Minimi saostuva 125 radioaktiviisuus määritettiin ilman MB47-reseptoreja. J-LDL:n sitoutumisprosentti laskettiin sen jälkeen.

125

2. Nestefaasinen_J-leimattu reseptori RIA

Koskemattomia vasta-aine MB47-reseptoreja, jotka oli eristetty . . 125 immunopuhdistuksella, jodattun J:n kanssa käyttäen Iodogen-tekniikkaa (spesifinen aktiivisuus 3000 cpm/ng) (Pierce). Perusteellisesta dialysoinnista PBS:ää vastaan seurasi se, että yli 95 prosenttia radioaktiivisuudesta oli saostettavissa 10

Il I

59 9271 4

12 S

prosenttisella TCA:lla. Enemmän kuin 98 prosenttia J-MB47:stä sitoutui ihmisen LDL affiniteetti-kolonniin. Määritykset suoritettiin kolminkertaisina 10x75 mm silikonipäällysteisissä 125 .........

lasiputkissa. J-MB47:aa lisättiin kasvavina konsentraatioi- na 0,1 ml:ssa BSA-barbitaalipuskuria 100 ng:aan koottua normaalia ihmisen LDL:ää laimennettuna 0,2 ml:aan BSA-barbitaalipuskuria. Kukin putki sisälsi 182 fmoolia LDL apo B:tä (olettaen apo B:n molekyylipainoksi 550 000 daltonia). 16 tunnin inkuboin-nin jälkeen 4°C:ssa, LDL saostettiin kvantitatiivisesti lipo-proteiinivapaan kanin antiseerumin avulla, joka oli spesifistä ihmisen LDLrlle. (Ainoastaan tiheyttä, joka on suurempi kuin 1,21 g/ml kanin antiseerumifraktiossa, käytettiin, koska vasta-aine MB47 sitoo kanin apo B:tä).

Esitutkimuksissa osoitettiin lipidivapaan kanin antiseerumin . 125 konsentraatio, joka saosti 97 prosenttia lOO ng:sta J-ihmisen LDL:ää. Kanin vasta-aineen sekoittamisen jälkeen putkia inkuboi-tiin 16 tuntia 4°C:ssa, ja sentrifugoitiin sen jälkeen 1500xg 50 minuuttia 4°C:ssa. Supernatantit poistettiin, ja pelletit pestiin kahdesti 2 ml:lla jääkylmää barbitaalipuskuria. Epäspesifinen sitoutuminen ja saostuminen määritettiin kahdessa erässä rinnakkaisputkia.

Ensimmäisessä erässä, yhtään ihmisen LDL:ää ei lisätty esi-inkubointiin, mutta sama määrä kanin toista vasta-ainetta lisättiin. Toisessa putkierässä ei-immuunin kanin seerumi (fraktio, jonka tiheys on suurempi kuin tai yhtä suuri kuin 1,21 g/ml) korvattiin immuunin kanin seerumin vasta-aineella.

Molemmilla menetelmillä saatiin identtiset arvot epäspesifiselle sitoutumiselle, joka oli lineaarista konsentraatioiden 125 .

kasvaessa J-MB47 vasta-aineella, ja kaikissa tapauksissa se oli alle 1 prosentti kaikesta lisätystä aktiivisuudesta.

125 J-MB47:n spesifinen sitoutuminen LDLraan saatiin vähentämällä epäspesifinen sitoutuminen kokonaissitoutumisesta. Sitoutumistulokset analysoitiin käyttäen lineaarista regressio-ohjelmaa Scatchard-analyysissä ligandin sitoutumissysteemeissä, βο 9271 4 mikä antoi estimaatin vasta-aineen affiniteettivakiolle (Ka) ja reseptorin tai epitoopin konsentraatiolle (Munson et ai., Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980)).

3. Kiinteään faasiin kiinnitetyn antigeenin RlA Seulontamääritys sen määrittämiseksi, tuottiko hybridoomaviljel-mä tämän keksinnön mukaisia reseptoreja, suoritettiin joustavilla pyöreäpohjäisillä polyvinyylikloridisilla mikrotiitteri-levyillä (Dynatech, Inc., Alexandria, VA), jotka toimivat kiinteänä matriisina. Lipoproteiiniantigeenit (reagenssi apo B-100) kiinnitettiin (sidottiin) mikrotiitterilevyn kuoppien sisäsei-nämiin, sekoittamalla 0,05 ml lipoproteiinia lipoproteiinipusku-riin, ja inkuboimalla levyjä huoneen lämpötilassa 3 tuntia vakioisen lopullisen sitoutuneen antigeenin konsentraation ja kiinteän kantajan tuottamiseksi. Alustavat suoran sitoutumisen tutkimukset, käyttäen radiojodattuja lipoproteiineja, osoittivat, että oli olemassa merkittäviä eroja tehokkuuksissa, joilla kukin lipoproteiineista sitoutui muovisiin mikrotiitterikuop-piin. Sen vuoksi, jotta saavutettaisiin lopullinen sitoutuneen antigeenin konsentraatio 50 ng proteiinia/kuoppa, VLDL:ää käytettiin pitoisuudessa 50 ^ug/ml, IDL:ää 6,2 ^ug/ml, LDL:ää 4,4 ^ug/ml ja HDL:ää 24 ^ug/ml. Epäspesifiset sitoutumispaikat estettiin sen jälkeen sekoittamalla 0,25 ml estoliuosta kuhunkin kuoppaan, inkuboimalla seosta yksi tunti, ja erottamalla sitten estoliuos kuopista, muodostaen tällä tavalla kiinteän kantajan, jonka epäspesifinen sitoutumiskapasiteetti on alhainen .

Määritystä varten, 0,050 ml antiseerumia, viljelmäsupernatant-tia, tai vatsaontelonestettä laimennettuna PBSrään, joka sisältää 3 prosenttia BSA:ta, 3 prosenttia normaalia vuohen seerumia, ja 0,05 prosenttia Tween-20:tä /polyoksietyleeni (20) sorbitaanimonolauraattiV sekoitettiin keskenään kuopissa kiinteä/nestefaasisten immunoreaktioseosten muodostamiseksi. Seoksia pidettiin (annettiin immunoreagoida) sen jälkeen 18 tuntia 4°C:ssa.

II

• » ei 9271 4

Kuoppien pesemisen jälkeen PBS:llä, joka sisälsi 3 prosenttia BSA:ta ja 0,05 prosenttia Tween-20:tä, sitoutumattoman materiaalin poistamiseksi, kiinteään faasiin sidottuja reseptoreja preparoitiin suoraa ilmaisua varten sekoittamalla 10 ng immunokemialli-sesti puhdistettua ja radiojodattua vuohen anti-hiiri Ig:tä kuhunkin kuoppaan toisen kiinteä/nestefaasisen seoksen muodostamiseksi. Tätä seosta pidettiin 4 tuntia 4°C:ssa sen sallimiseksi, että leimatut toiset reseptorit voisivat sitoa kiinteään faasiin sidottuja ensimmäisiä reseptoreja ja muodostaa kerroksellisen immunoreaktantin.

Loppupesun jälkeen, sitoutumattomien leimattujen reseptorien poistamiseksi, yksittäiset kuopat poistettiin, ja niistä lasket-. . . 125 _ . , ... 125 _ ...... , , tun J, ilmaistun J:n maaran ollessa suorassa suhteessa kiinteäfaasisena immunoreaktanttina sitoutuneiden ensimmäisten reseptorien määrään.

Immunokemiallisesti puhdistettua toista vasta-ainetta radio-jodattiin entsymaattisesti käyttäen immobilisoitua laktoperoksi-daasia ja glukoosioksidaasia (Enzymobeads, Bio-Rad Burlingame, CA) spesifisiin aktiivisuuksiin 3-4 mikroCi/mikrogramma.

4. Kompetitiivinen kiinteään faasiin kiinnitetyn reseptorin RIA _

Kompetitiivisia kiinteäfaasisia radioimmunomäärityksiä (RIAt) ihmisen apo Brlle suoritettiin käyttäen vasta-ainetta MB47. Poly-vinyylikloridikuopat päällystettiin 0,5 ml:lla ihmisen LDLrää (apo B-100-reagenssi) laimennettuna 10 ^ug/ml PBS:ään, pH 7,35, ja pidettiin 2 tuntia 37°C:ssa. Epäspesifiset sitoutumis-paikat estettiin päällystämällä 5 prosenttisella BSA:lla PBSrssä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Levyt pestiin sen jälkeen PBS-pesupuskurilla, joka lisäksi sisälsi 0,1 prosenttia BSA:ta, 0,01 prosenttia natriumatsidia ja 0,05 prosenttia Tween-20:tä.

Tuoretta ihmisen LDL:ää, joka oli valmistettu kootusta normaalista plasmasta, käytettiin apo B-100-reagenssina standardikäyrää varten laimennuksina alueella 0,4 ^ug/ml - 97,2 ^ug/ml. Kaikki 62 92714 laimennukset tehtiin PBS-puskuriin, joka sisälsi 3 prosenttia BSA:ta, 0,01 prosenttia natriumatsidia ja 0,05 prosenttia Tween-20:tä. Standardia LDL:äa tai kilpailijoita (0,025 ml) sekoitettiin LDL-päällysteisiin kuoppiin, jonka jälkeen lisättiin 0,025 ml puskuria, joka sisälsi kiinteän ja rajoittavan määrän monoklonaalista vasta-ainetta (vatsaonteloneste). Optimaalinen lopullinen vasta-ainekonsentraatio määritettiin alustavista vasta-aineen laimennustutkimuksista, ja valittiin määräksi vasta-ainetta, joka johtaa 50 prosenttiseen sitoutumiseen maksimaalisesta.

Levyjä inkuboitiin noin 18 tunnin ajanjakso 4°C:ssa, pestiin sen jälkeen PBS-pesupuskurilla. Hiiren vasta-aineen sitoutu-minen kvantitoitiin sen jälkeen sekoittamalla 0,05 ml J-immunopuhdistettua vuohen anti-hiiri Ig:tä (450 ng/kuoppa, 8000 cpm/ng). Neljän tunnin ylläpitoajan jälkeen 4°C:ssa levyt pestiin ja yksittäisten kuoppien laskenta suoritettiin.

H. Entsyymikytkeinen immunosorbenttimääritys (ELISA)

I. Ei-kompetitiivinen ELISA

Eristettyjä MB47-reseptoreja kiinnitettiin polystyreenisten mikrotiitterilevyn kuoppien seinämille (Nunc-Immuno Plate I) sekoittamalla 0,15 ml natriumbikarbonaattipuskuria pH 9,0, joka sisälsi l^ug/ml reseptoriproteiinia, kuhunkin kuoppaan. Kuoppia inkuboitiin 16 tuntia 4°C:ssa, ja pestiin sen jälkeen 3 kertaa PBSrllä, joka sisälsi 0,1 prosenttia BSA:ta ja 0,05 prosenttia Tweeniä. Jäljelle jääneet epäspesifiset sitoutumis-paikat estettiin sen jälkeen sekoittamalla kuhunkin kuopoaan .

0,2 ml BSA:ta PBS:ssä, inkuboimalla seosta 1 tunti 23°C:ssa, ja pesemällä sen jälkeen kuten edellä on kuvattu. Siten preparoituja kuoppia (kiinteät kantajat) voidaan käyttää noin yhteen kuukauteen saakka preparoinnin jälkeen, kun niitä säilytetään kosteutetussa kammiossa.

Apo B-100-reagenssia (ihmisen LDL) laimennettiin PBS:ään pitoisuuksiin, jotka vaihtelivat alueella 2,0-0,062^ug/ml käytettä-. väksi standardikontrolliliuoksina. Plasmanäytteet laimennettiin 1:2000 PBS:ään.

Il : „ 92714

Viisikymmentä mikrolitraa standardia tai näytettä sekoitettiin kuoppiin kolminkertaisina. Noin viiden minuutin sisällä sen jälkeen, 50 ^ul PBS:ää, joka sisälsi mg/ml HRPO-leimattuja MB24-reseptoreja, sekoitettiin kuhunkin kuoppaan. Immunoreaktio-seoksia pidettiin 30 minuuttia 25°C:ssa. Sitoutumaton materiaali erotettiin sen jälkeen kuopista pesemällä kuten edellä on kuvattu.

Kiinteään faasiin kiinnitetyn kerroksellisen immunoreaktantin määrä, joka sisälsi HRPO-leiman, määritettiin sen jälkeen sekoittamalla 0,1 ml vasta valmistettua substraattiliuosta (tislattu vesi, joka sisältää 3 prosenttia H202:ta ja 0,67 mg/ml o-fenylee-nidiamiinia (OPD)) kuhunkin kuoppaan. Värin annettiin kehittyä 30 minuuttia 25°C:ssa. Substraatin konversioreaktio pysäytettiin sen jälkeen sekoittamalla kuhunkin kuoppaan 0,05 ml 4N H2o2:ta. Liuosten optinen tiheys (O.D.) määritettiin 490 nano-metrin (nm) aallonpituudessa käyttäen Dynatechin MR600 (Dynatech, Alexandria, VA) mikrotiitterilevylukijaa.

2. Kompetitiivinen ELISA

Apo B-100-reagenssia kiinnitettiin joustavan polyvinyylikloridi-sen mikrotiitterilevyn kuoppien seinämille (Microtest III,

Falcon Labware, Becton, Dickinson & Co, Oxnard, CA) kiinteänä matriisina, sekoittamalla 0,2 ml PBS:ää, joka sisältää 5 ^ug/ml eristettyä ihmisen LDLrää, kuhunkin kuoppaan. Kuoppia pidettiin 16 tuntia 4°C:ssa, ja ne pestiin sen jälkeen 3 kertaa 0,2 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 1 prosentin BSArta, 0,5 prosenttia Tweeniä ja 0,02 prosenttia aprotiniinia (Sigma Chemical Co.). Jäljelle jääneet epäspesifisesti sitovat paikat estettiin kuten on kuvattu ei-kompetitiivisessa ELISArssa.

Standardikäyrää varten, joka kuului jokaiselle levylle, reagens-sia apo B-100 laimennettiin PBSrään, joka sisälsi 0,5 prosenttia lipoproteiinivapaata plasmaa (LPDP), jotta saataisiin konsentraatioita, jotka vaihtelevat alueella 32 mg/ml - 0,25 mg/ml.

9271 4 64

Plasmanäytteet laimennettiin 1:200 PBS:ään, joka sisälsi 0,5 prosenttia LPDP:tä. Viisikymmentä mikrolitraa standardeja tai näytteitä sekoitettiin kolminkertaisina kuoppiin. Noin 5 minuutin sisällä sen jälkeen, 50 ^ul PBS:ää, joka sisälsi 3 prosenttia BSA:ta ja noin 4 ^,ug/ml MB24-reseptoreja sekoitettiin kuhunkin kuoppaan. Siten muodostuneita seoksia pidettiin noin 18 tuntia 4°C:ssa. Sitoutumaton materiaali erotettiin sen jälkeen kiinteään faasiin kiinnitetyistä MB24-reagenssi apo B-100 immunoreaktiotuotteista pesemällä kuten edellä on kuvattu.

Kiinteäfaasisia immunoreaktantteja preparoitiin määritystä varten sekoittamalla 0,1 ml PBS:ää, joka sisälsi 1 prosentin BSArta ja tehokas määrä HRPO-leimattua vuohen anti-hiiri IgGrtä kuhunkin kuoppaan. Tätä toista immunoreaktioseosta pidettiin noin 1 tunti 24°C:ssa, ja pestiin sen jälkeen kuten edellä on kuvattu kerroksellisen immunoreaktantin muodostamiseksi.

Kiinteään faasiin kiinnitetyn kerroksellisen immunoreaktantin, joka sisälsi HRPO-leiman, määrä määritettiin kuten on kuvattu kompetitiivisessa ELISA:ssa.

I. Plasmanäytteet ja lipoproteiinin kvantitointi Plasmanäytteet saatiin 20 potilaalta, joilla oli sepelvaltimotauti sydänkatetrialalaboratiosta San Diegon, VA sairaalasta, ja 20 potilaalta, joilla oli tavallinen hyperkolesterolemia Kalifornian yliopistosta, San Diegon klinikalta. Plasmaa saatiin lisäksi 20 normaalilta yksilöltä.

Verta kerättiin putkiin, jotka sisälsivät 1,5 mg/ml etyleeni-diamiinitetra-asetaattia (EDTA), ja plasma erotettiin välittömästi sentrifugoimalla 4°C:ssa.

Plasman kokonaiskolesteroli ja triglyseridit mitattiin tuoreista plasmanäytteistä standardoidussa kliinisessä laboratoriossa käyttäen Abbot ABA-200 bikromaattista analysaattoria, ja Boehringer-Mannheimin suuritehoista kolesterolireagenssia ;. 236691 ja Abbot Laboratories'in triglyseridit A-gent. LDL-

II

92714 6 5 ja HDL-kolesteroli mitattiin käyttäen tekniikkaa, jota on kuvattu julkaisussa Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. No. 75-628 (NIH), 2 p., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974 ). Apoproteiini B-tasot määritettiin käyttäen kahta kaupallisesti saatavilla olevaa säteittäisimmunodiffuusiokittiä: Diffu-gen RID (Tago, Inc., Burlingame, CA), jota tässä nimitetään RID #1, ja M-Partigen RID, (Calbiochem- Behring, La Jolla, CA), jota nimitetään RID #2 tässä.

J. LDL:n sitoutuminen MB47-Sepharose-4B-kolonniin 50 milligrammaa oleellisesti puhtaita MB47-reseptoreita, saatuna proteiini A kolonnikromatografiällä, liitettiin 12 ml:aan syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharose 4B:hen (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.Y.), valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jälkeenpäin lisättiin 10 mg LDL:ää kolonniin, ja sitä inkuboitiin yli yön (noin 16 tuntia) 4°C:ssa. Sitoutumaton LDL eluoitiin sen jälkeen, ja siitä määritettiin LDL-proteiini kuten aikaisemmin on kuvattu.

Edellä oleva patenttihakemus, mukaanlukien spesifiset suoritusmuodot, on tarkoitettu esillä olevaa keksintöä valaisevaksi, eikä sitä tule pitää rajoittavana. Lukuisia muita variaatioita ja modifikaatioita voidaan toteuttaa poikkeamatta keksinnön mukaisten uusien käsitteiden todellisesta hengestä ja alueesta.

Claims (19)

9271 4

1. Hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746.

2. Reseptori, tunnettu siitä, että se (a) immuno-reagoi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota (b) erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen reseptori, tunnettu siitä, että se on koskematon vasta-aine.

4. Hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742.

5. Reseptori, tunnettu siitä, että se (a) immunorea-goi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota (b) erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen reseptori, tunnettu siitä, että se on koskematon vasta-aine.

7. Menetelmä apoproteiini B-100:n määrän määrittämiseksi ruumiinnestenäytteestä, tunnettu siitä, että menetelmään kuuluvat seuraavat vaiheet: (a) otetaan määritettäväksi tarkoitettu ruumiinnestenäyte; (b) tuotetaan reseptorimolekyylejä biologisesti aktiivisessa ·· muodossa, jotka (i) immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja joita (ii) erittää hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742; (c) sekoitetaan tunnettu määrä mainittua ruumiinnestenäytettä ennalta määrätyn määrän kanssa mainittuja reseptorimolekyylejä immunoreaktioseoksen muodostamiseksi; (d) pidetään mainittua seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka seoksessa läsnä olevien reseptori-molekyylien kannalta on riittävä sitomaan immunologisesti näytteessä läsnä olevaa apoproteiini B-100:aa, jolloin muodostuu immunoreaktanttia; ja (e) määritetään mainitussa seoksessa muodostuneen immunoreak-tantin määrä. Il 9271 4

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu ruumiinnestenäyte on joko plasma tai seerumi .

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu reseptori on koskematon vasta-aine.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ruumiinnestenäytettä preparoidaan lisäksi määritystä varten sisällyttämällä seuraavat lisävaiheet: (f) tuotetaan biologisesti aktiivisia toisia reseptorimole-kyylejä, jotka immunoreagoivat mainitussa ruumiinnestenäytteessä läsnä olevan apoproteiini B-100:n kanssa, ja jotka ovat jäännöksiä kummastakin reseptorimolekyylierästä, joita erittävät hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742; ja (g) sekoitetaan ennalta määrätty määrä mainittuja toisia resep-torimolekyylejä mainitun ruumiinnestenäytteen kanssa, jolloin muodostuu immunoreaktioseos; (h) pidetään mainittua immunoreaktioseosta biologisissa määri-tysolosuhteissa ennalta määrätty aika, joka seoksessa läsnä olevien reseptorimolekyylien kannalta on riittävä sitomaan immuno-logisesti näytteessä läsnä olevaa apoproteiini B-100:aa, jolloin muodostuu kerroksellista immunoreaktanttia.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu reseptori on koskematon vasta-aine.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensin mainittu reseptori kiinnitetään kiinteään matriisiin kiinteän kantajan muodostamiseksi; mainittu toinen reseptori sisältää leiman, jonka avulla voidaan ilmaista immunoreak-tantin sisältämän mainitun toisen reseptorin läsnäolo; ja vaiheessa (e) määritetty immunoreaktantti on kiinteätaasinen, kerroksellinen immunoreaktantti, joka sisältää mainitun leiman. 9271 4

13. Diagnostinen systeemi ruumiinnäytteessä olevan apo-B-100:n määrän määrittämistä varten, tunnettu siitä, että se käsittää: (a) ensimmäisen biologisesti aktiivisen, spesifisesti sitoutuvan aineen, joka käsittää reseptorimolekyylejä, jotka (i) immu-noreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, ja (ii) ovat joko hyb-ridooman ATCC HB 8746 erittämiä reseptorimolekyylejä tai hybri-dooman ATCC HB 8742 erittämiä reseptorimolekyylejä; ja (b) biologisesti aktiivisen, leimatun, toisen spesifisesti sitoutuvan aineen, sen immunoreaktion ilmaisemiseksi, johon mainittu ensimmäinen sitoutuva aine osallistuu apo B-100:n kanssa.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen määrityssysteemi, tunnettu siitä, että leimattu, toinen spesifisesti sitoutuva aine käsittää toisia reseptorimolekyylejä joko reseptoreista, joita erittää hybridooma ATCC HB 8746 tai reseptoreista, joita erittää hybridooma ATCC HB 8742.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen määrityssysteemi, tunnettu siitä, että leima on entsyymi.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen määrityssysteemi, tunnettu siitä, että mainittu ensimmäinen spesifisesti sitova aine on kiinnittynyt kiinteään matriisiin, jolloin muodostuu ;; kiinteä kantaja.

17. Steriili affiniteettisorbentti, jonka muodostavat biologisesti aktiiviset reseptorimolekyylit, jotka immunoreagoivat apoproteiini B-100:n kanssa ja valikoidaan ryhmästä, johon kuuluvat : (a) hybridooman HB 8746 erittämät reseptorimolekyylit; (b) hybridooman HB 8742 erittämät reseptorimolekyylit; ja (c) kohtien (a) ja (b) sisältämien reseptorimolekyylien seos; tunnettu siitä, että mainitut reseptorimolekyylit ovat kiinnittyneet kiinteään matriisiin, jolloin muodostuu kiinteä kantaja. « · · II 9271 4

18. Menetelmä ruumiinnestenäytteen sisältämän apoproteiini B-100:n määrittämiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: (a) otetaan määritettäväksi tarkoitettu ruumiinnestenäyte; (b) tuotetaan kiinteä kantaja, joka on muodostunut kiinteästä matriisista, johon on kiinnittyneenä sen lisäksi biologisesti aktiivisessa muodossa ensimmäinen reseptori, joka reagoi immuno-logisesti apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota erittää hybri-dooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746; (c) tuotetaan toinen biologisesti aktiivinen reseptori, joka immunoreagoi apoproteiini B-100:n kanssa, ja jota erittää hybri-dooma, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, mainitun toisen reseptorin ollessa liittyneenä leimaentsyymiin, jonka avulla pystytään ilmaisemaan mainitun toisen reseptorin läsnäolo im-munoreaktantissa; (d) sekoitetaan olennaisesti samanaikaisesti: (i) mainittu ruumiinnäyte; (ii) mainittu kiinteä kantaja; ja (iii) mainittu leimattu toinen reseptori kiinteä/nestefaasisen immunoreaktioseoksen muodostamiseksi; (e) pidetään mainittua seosta biologisissa määritysolosuhteissa ennalta määrätty ajanjakso, joka on mainitun ensimmäisen reseptorin ja mainitun toisen leimatun reseptorin kannalta riittävä sitomaan immunologisesti näytteessä läsnä olevaa apoproteiini ; B-100:aa, jolloin muodostuu kiinteäfaasinen kerroksellinen im- munoreaktantti ja nestefaasi; (f) erotetaan mainittu kiinteäfaasinen kerroksellinen immuno-reaktantti mainitusta nestefaasista; ja (g) määritetään leimatun toisen reseptorin määrä, joka on sitoutunut kiinteäfaasiseen kerrokselliseen immunoreaktanttiin.

19. Kompetitiivinen menetelmä ruumiinnestenäytteen sisältämän apoproteiini B-100:n määrittämiseksi, tunnettu siitä, että siihen kuuluvat seuraavat vaiheet: (a) otetaan määritettäväksi tarkoitettu ruumiinnestenäyte; (b) tuotetaan kiinteä kantaja, joka käsittää kiinteän matriisin, johon on sen lisäksi kiinnittyneenä ennalta määrätty määrä rea-genssia apoproteiini B-100; 7„ 9271 4 (c) sekoitetaan olennaisesti samanaikaisesti: (i) mainittu ruumiinnäyte; (ii) mainittu kiinteä kantaja; ia (iii) ennalta määrätty määrä reseptorimolekyylejä, jotka immuno-reagoivat apoproteiini B-100:n kanssa, erittyneinä joko hybri-doomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8746 tai hybridoomasta, jonka ATCC-talletusnumero on HB 8742, jolloin muodostuu kiinteä/ nestefaasiseos; (d) pidetään mainittua seosta biologisissa määritysolosuhteissa ajanjakso, joka reseptorimolekyylien kannalta riittää sitoutumaan immunologisesti kiinteän kantajan sisältämiin apoproteiini B-100-molekyyleihin ja ruumiinnestenäytteessä läsnä oleviin apoproteiini B-100-molekyyleihin ja muodostamaan kiinteätaasisen immunoreak-tantin ja nestefaasisen immunoreaktantin; ja (e) erotetaan mainittu kiinteätaasinen immunoreaktantti mainitusta nestefaasista; (f) sekoitetaan lisäämällä mainittuun kiinteätaasiseen immuno-reaktanttiin biologisesti aktiivista toista reseptoria, joka immunoreagoi mainitun ensimmäisen reseptorin kanssa, jolloin muodostuu toinen kiinteä/nestefaasinen immunoreaktioseos, jossa mainittu entsyymileimaan kytketty toinen reseptori pystyy ilmaisemaan immunoreaktantin sisältämän mainitun toisen reseptorin läsnäolon; (g) ylläpidetään mainittua toista seosta aika, joka leimatun toisen reseptorin kannalta on riittävä sitomaan immunologisesti kaikki ensimmäinen reseptori, joka on läsnä kiinteätaasisena immunoreaktanttina, jolloin muodostuu kiinteätaasinen kerroksellinen immunoreaktantti; (h) erotetaan mainittu kiinteän faasin kerroksellinen immunoreaktantti mainitusta nestefaasista; ja (i) määritetään leimatun toisen reseptorin määrä, joka on sitoutunut mainittuun kiinteätaasiseen kerrokselliseen immunoreak-tanttii n. « · II 71 9271 4