FI87646C

FI87646C - Foerfarande foer framstaellning av nya katekolderivat

Info

Publication number: FI87646C
Application number: FI863742A
Authority: FI
Inventors: Marc Bonato; Michel Follet
Original assignee: Scras
Priority date: 1985-09-26
Filing date: 1986-09-16
Publication date: 1993-02-10
Also published as: GB8623075D0; HK91289A; SE8603792L; AT396469B; CH668421A5; IT8621836A0; OA08417A; NL189334C; ZA866906B; NO863835D0; GB2189782B; CA1318686C; CH668261A5; SG65889G; DK165115C; FI863743L; NL189410B; IT8621837A0; FR2587699B1; NL189410C

Description

i 87646

Menetelmä valmistaa uusia katekolijohdannaisia - Förfarande för framställning av nya katekolderivat

Keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa uusia yleiskaavan I mukaisia katekolijohdannaisia

H°XX

HO — S - R ( I) jossa R on sykloheksyyliryhmä, joka voi olla substituoitu kahdella 1-3 hiiliatomisella alkyyliryhmällä, fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu yhdellä tai kahdella 1-2 hiiliatomisella alkyyliryhmällä, tai trifluorimetyyliryhmillä.

Edellä määritellyt yhdisteet ovat lipoksigenaasin ja syklo-genaasin inhibiittoreita. Niitä voidaan käyttää ihmislääketie-** teessä ei-steroidisina tulehdustenvastaisina, antitrombootti-sina, antiallergeenisina, anti-iskeemisina ja antianafylakti-: sinä aineina.

Keksinnön mukaisesti voidaan uudet katekolijohdannaiset valmistaa saattamalla refluksointitilassa seuraavan kaavan II mukainen S-(3,4-dihydroksi-fenyyli)-isotiourea reagoimaan vedettömässä alkanolissa seuraavan yleiskaavan III mukaisen tosylaatin kanssa, jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä 2 8 7 6 4 6 HO o ν^ΐι H _jT\ /KA X i \=/ HO S - C 0 \ nh2

II III

Reaktio suoritetaan parhaiten refluksoimalla reagensseja vedettömässä metanolissa 48 - 72 tuntia inertin kaasukehän alla. S-(3,4-dihydroksifenyyli)-isotioureaa II käytetään parhaiten hydrokloridinaan. Ryhmä R tosylaatissa III voi olla raseeminen tai optisesti aktiivinen.

S-(3,4-dihydroksifenyyli)-isotioureaa II voidaan valmistaa julkaisussa: J. DANEKE, U. JAENKE, B. PANKOW ja H.W. WANZLICK, Tetrahedron Letter 1970, 15., 1271 kuvatusta menetelmästä johdetulla menetelmällä. Tosylaattia III voidaan valmistaa julkaisussa: A. STRITWIESER Jr ja A.C. WAIS Jr, J. Org. Chem., 1962, 27., 290, kuvatusta menetelmästä johdetulla menetelmällä.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä. Esimerkkien 1, 2, 5 ja 6 otsikkoyhdisteet eivät sisälly kaavan I määrittelyyn.

Esimerkki 1 4-(2-metyylibutvvlitiol-katekoli (R - -CHo-CHtCHg)-CH2~CH23 22 g (0,1 moolia) S-(3,4-dihydroksifenyyli)-isotioureaa li 3 87646 liuotettiin 50 ml jaan vedetöntä mmetanolia 1 litran pullossa, joka oli varustettu magneettisekoittiT.elia, typpivirran alla. Liuosta kuumennettiin ja lisättiin natriummetoksidi 1iuns, joka sisälsi 9,2 g natriumia (4 ekvivalenttia) 150 mlsssa vedetöntä metanolila. Reaktio-seokseen kaudeLtiin metanolin kiehumispisteessä 24,2 g (0,1 moolia) 2-metyylibutyylitosylaattia liuoksena 50 ml:ssa meLanolia.

Reaktioseo8La reflukeoitiin 48 tuntia ja sen jälkeen liuotin haihdutettiin pois alipaineessa (2000 pascal). Jäännös otettii damineralisoituun veteen ja tehtiin happameksi 20-prosenttisella suolahapolla. Uutettiin dietyylieeLterillä, minkä jälkeen orgaaninen faasi pestiin vedellä ja kuivattii vedettömällä natriumsulfaatilla. Haihduttamalla dietyylieetteri pois saatiin punaista öljyä, joka puhdistettiin kromatograa fisesti silikageelillö käyttämällä e 1 uointiaineena heksaani:etyyliasetaattia (95:5, tilavuus). Saanto oli 54 ?ό. Tämän yhdisteen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektrosknpialla ja alkuaineiden mikroanalyysillä.

. . CMOS

• · · • · · • ♦ « • · ·

Laskettu, % 62,24 7,60 15,06 15,10 : Saatu, % 62,0B 7,69 15,18 14,99 • · • ·

Esimerkki 2 (+)-4-(2-metyylibutyylitio)-katekoli (R = -CH2.CH(CH jl-CIL-CHj)

Toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta .. 2-metyy1i-Imilyy11tosylaatin asemesta käytettiin 1-2 ** metyy1i-buIyy1itosyla a11ia. Otsikkoyhdistettä saatiin ·· 54 ?0 saannulla. Se on keltainen öljy. /a/1 = + 22,52, : : : C = 0,6, kloroformi. Sen identiteetti ja rakenne vahvis- • « « • · • 1 ♦ ·· · · • · · · • · · • · ♦ « • · · 4 8 7 6 4 6 t e 11 i n PMR-spektroskopialla ja alkuaineiden mikroanalyysi 11 a .

C H 0 S

Laskettu, ?ό 62,24 7,60 15,06 15,10

Saatu, % 62,21 7,67 15,22 15,01

Esimerkki 3 4-mentyy1itio-ka teko 1i (R s mentyyli) toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta 2-metyyli-butyyliLosylaatin asemesta käytettiin m e n -t y y 1 i t o s y 1 a a t. tiu. Otsikkoyhdistettä saatiin 8 % saannolla, fämä yhdiste on kiinteä aine, jonka sulamispiste on 124°C (Kofler). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektroskopiolla ja alkuaineanalyysillä.

CMOS

Laskettu, % 60,53 8,63 11,41 11,43

Saatu, % 68,48 8,74 11,23 11,28 t »

Esimerkki 4 -· 4-( + ) -mentyy 1 i tio-katekoli (K = ϋ,-mentyyli ) • »

Toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta 2-metyyli-butyylitosylaatin asemesta käytettiin £-mentyyli-tosylaattia. 01 s ik koy hd i s te saatiin 10 % saannolla. Tämä ytidiste on kiinteä aine, jonka sulamispiste on 119°C (Kofler). / /q^= + 93,98, C = 5, etanoli. Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektroskopialla ja alkuaineiden mikroanalyysillä. 1 « · • « 5 87646

CU OS

Laskettu, % 68,53 8,63 11,41 11,43

Saatu, % 67,99 8,37 11,22 12,05

Esimerkki $i: 4-(1-metyy1iueptyy1itio)-katekoli (R = -CH (CH^) -CH^) -CH, )

Toimit ti in samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta 2-metyyli-buLyylitosylaatin asemesta käytettiin 1-metyyli-heptanyylitosylaattia. Otsikkoyhdiste saatiin 26 % saannolla. Tämä yhdiste on öljy. Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektroskopialla ja alkuaineiden mikro-analyysi 11 ti.

C H OS

Laskettu, % :: 66,10 8,70 12,58 12,60

Saatu, % 65,90 8,65 12,74 12,50

Esimerkki o (+)-4-(l-metyyliheptyylitio)-katekoli) K --LH(CH3-(Lil2).-CH3 « ♦ · ♦ · ·

Toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta 2-metyvli-butyy1itosylaatin asemesta käytettiin A-l-metyyli-·11; heptyy 1 i tosy laa 11 ia . Otsikkoyhdistettä saatiin 6,5 % . saannolla, lämä on öljy. /ot/^ = + 7, C = 0,7, kloroformi.

Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektroskopialla ja alkuaineiden mikroanalyysillä.

Laskettu, S 66,10 8,70 12,58 12,60 :Y: Saatu, ii 65,97 8,68 12,83 12,71 * » 1 * · · « < ·· * » · · 6 87646

Esimerkki 7 4-fenyylitio-katekoli (R - fenyyli) 1oimittiin sumalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta 2-metyy1i-butyy1iLosyla atin asemesta käytettiin fenyyli-tosylaattia. Otsikkoyhdistettä saatiin 17 % saannolla.

Tämä yhdiste on kiinteä aine, jonka sulamispiste on 164°C (Kofler). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spekt roskup ial la .ja alk ua i neanal y y s i 1 lä .

Laskettu, !*o 66,03 4,62 14,66 14,69

Saatu, S 66,UO 4,70 14,64 14,66

Esimerkki 0 4-sykloheksyy1itio-katekoli (k = sykloheksyyli)

Toimittiin samalla tavoin kuin esimerkissä 1, mutta 2-metyyli-buty/litosylaatin asemesta käytettiin sykloheksyy 1 i t osy 1 aa t t i a . Otsikkoyhdistettä saatiin 31 % saannolla, lama yhdiste on kiinteä aine, jonka sulamispiste on 148°C (Kofler). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin . PMR-spekt rosknpia 1 la ja alkuaineiden mikroanalyysillä.

• · V Laskettu, 64,23 7,20 14,26 14,29 ' * Suutu, io 6 4,19 7,3 1 14,2 3 14,2 7

Esimerkki 9 4-(3,5-dimetyyli)-fenyylitio-katekoli (R = - (3,5-diinetyyli)-fenyyli ; ] Toimittiin sumulla tavoin kuin esimerkiusä 1, mutta 2-metyyli-buLyylitosylaatin asemesta käytettiin 3,5-dime- I; 7 87646 tyy1i-fenyy1 iLosylaa11ia . Otsikkoyhdistettä saatiin 23 % saariolla. liima yhdiste on öljy. Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektroskopian ja alkuaineiden mikroanalyysin avulla.

tn 0 S

Laskettu, % 68,26 5,73 12,99 13,D2

Saatu, % 68,20 3,93 12,91 12,96

Esimerkki 10 4-(2.6-di-triFluorim<,tyyli)-fenyylitio-katekoli) (R = 2,6-di-trifluorimetyyli)-fenyyli

Toimittiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla, mutta 2-metyy1i-bulyy1itosylaatin asemesta käytettiin (2,6-di-trifluorimetyyli)-fenyylitosylaattia. Otsikkoyhdistettä saatiin 13 ?b saannolla. Tämä yhdiste on kiinteä aine, jonka sulani i up is t.e on 110°C (Kofler). Sen identiteetti ja rakenne vahvistettiin PMR-spektroskopian ja alkuaineanalyysin avulla.

:-1‘i Laskettu, % 47,46 2,28 9,03 9,05 32,18 ...Γ Saatu, % 47,36 2,55 8,98 8,98 32,13

FARMAKOLOGIA

• · · ♦ · · L ipoksigenaasi t ( L□ s t) muuntavat arakidonihapon (AA) hydrokeijohdokseksi ia leukotrieneiksi. Nämä tuotteet ovat tehokkaita farmakologisia aineita, joilla on potentiaalisesti tärkeitä rooleja tulehdustaudeissa ja yiiherk-kyystaudeisua. Arakidonihappoon vaikuttaa useita lipoksi-uenaaseja, pääasiallisesti • · · * · · • · 1 • 1 • · · · 1 0 87646 5 LO jLihliiu leukotrieneihin, 12 LO jollina 12-liydroperoksie ikosatetraeenihappoon (12 H PII II'.) ja muihin 12-hydroksiyhdisteisiin, 13 LO joliLaa ]3 IIPETE-yhdisteeseeri ja muihin 15-hydroksi- yhdiateisiin, ja (ai haisa mma Iin lusoila) 8 LO ja 11 LO.

LO-reiltien kaikkein tärkeimpiä tuotteita ovat 5-L0:n tuottamat leukotrienit. SRS-A:n ehdotettu tärkeys astmassa ja anafylaktisissa reaktioissa ja havainto, että SRS-A kuului leukotrieneihin, lisäsi mielenkiintoa näiden aineiden biologisiin tutkimuksiin. LTSC 4 ja LTD 4 (0,1 -1 nM) aiheuttivat marsun ileumin konsentraatiosta riippuvia supistumisia, lätä on käytetty SRS - A;n biologisen aktiivisuuden määrittämiseen suhteessa histamiiniin. Moolipolijaltii laskettuna histamiinin havaittiin olevan 200 kertaa vähemmän aktiivista kuin LTC 4, mikä viittaa siihen, että yksi yksikkö SRS — Λ (6 ng Hist, HC1) vastaa noin 0,2 pikumoolia LfC 4.

LTC 4 ja LII) 4 lisäsivät myös suonten permeabiliteettia marsun iholla ja hiillä oli sileitä lihaksia stimuloivia ominaisuuksia, jotka olivat identtiset aikaisemmin SRS-A:lla : havaittujen kanssa. LiC 4:llä ja LTD 4:11ä on kriittinen • osuus sydämen tai keuhkojen mikroverenkierrossa.

LIB 4 vaikuttaa leukosyyttien kulkeutumiseen saattamalla leukosyytin kiinnittymään endoteliumiin kapillaarien jälkeisissä pikku laskimoissa ja tehokkaiden kemotaktisten vaikutusten avulla. Leukotrienit ovat siten tärkeitä välittäjäaineita isännän puolustusmekanismeissa·, kuten välittömissä yliherkkyysreaktioissa ja akuuteissa tulehdusreaktioissa. Lraidan syklo-oksigenaasi (CO)-tuotteiden ja leukotrienien vaikutukset ovat lisäksi toisiaan täydentäviä. Siten p 1 a aina vuo t oa aiheuttavien leukotrienien ja vasodi la at to ie iden PGE 2 ja PGI 2 välisellä synergialla

II

9 87646 v/oi olla tärkeä merkitys edeeman muodostumisessa. Lisäksi suuri merkitys on annettava leukotrienien ja tromboksaanin (TxA2) välisille synergistisille vaikutuksille keuhkoputken kuristumassa. LIC 4 ja LTD 4 aiheuttavat tromboksaalin vapautumisun marsun keuhkoissa. Koska TxA2 on ilmatiahyeifcä tehokkaasti kuristava aine, sen vapautuminen saattaa osaltaan vaikuLtaa keuhkoputken kouristukseen allergian ilmenemismuodoissa. Eräät tulokset näyttävät lisäksi osoittavan, että LTB 4 voi välittää eräitä PAF-aseetterin vaikutuksia, ti-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet (AINS) eivät estä anafylaksiaa. Ne päinvastoin lisäävät yliherkkyysreaktioita, koska ne mobilisoivat arakidonihapon 1 ipoksigenaasireitei11 e. Kortikosteroidit (CS) estävät prekursorin vapautumisen stimuloimalla lipomoduliinin, joka on fosΙο l ipaasin A2 peptidi-inhibiittori, synteesiä. Kun CS estä aragidonihapon vapautumisen, se estää C0-tuotteiden muodostumisen lisäksi myös LO-tuotteiden ja sen jälkeen leukotrienien muodostumisen.

Lisääntynyt Lieto LO-järjestelmästä näyttää viittaavan uusiin mahdo11isuuksiin kehittää uusia ja entistä terapeut-tisempia aineita, erityisest taudeissa, jotka liittyävät välittömiin y1iherkkyysreaktioihin, kuten astma, allergia, .·. : sydänanafylaksia, aivojen iskemia ja tulehdus. Tällaiset - lääkkeet saa Itäisivät perustua lopputuotteiden antagonis- mille tai a va i n v ä 1 i tuot teen LTA 4 muodostumiseen ja edelleenmuunlumiseen liittyvien entsyymien inhibiitio 1le.

: Arvokas saattaisi olla myös kaksoisvaikutus leukotrieni- reittiin ja uy k lo-oks igeriaasi-re i 11 iin .

1 ) 7 yhdisLeen "in vitro11 seulonta soijapapulipoksigenaasin potentiaalisina inhibiitteinä a. Johdanto • · • 1

Mononydrok si-eikosatetraeenihapot (HETEst) ovat kvantita- ; tiivisesti merkittäviä arakidonihapon (AA) metabo Li i t te j a « 1 • ♦ · · ·1·» 10 87646 monissa erilaisissa nisakässoluissa ja -kudoksissa.

Esimerkiksi 12-L-HETE on identifioitu verihiutaleista j 5-D-HETE kaniinin PMNistä; 12-L-HETE, 11-HETE ja 15-HETE marsun keuhkosoluista ja rotan syöttösoluista; ja 5-HETE, 8-HETE, 9-HETE, 11-HETE ja 12-HETE ihmisen neutrofiileistä.

HE TE-jakaantuma on lajista riippuva ja tyypillinen lipoksi-genaasien entsymaattisesti katalysoimalle AA-metabolialle.

Näiden tuotteiden mahdollisia biologisia merkityksiä ei ole vielii täysin selvitetty. Ihmisen verihiutaleista saadulla 12-HETEjllä oli kuitenkin kemotaktinen aktiivisuus ihmisen poiymorfonukleaarisiin leukosyytteihin nähden (.Siegel, M. I . et ai. Proc. N a 11. Acad. Sei. 7_7 > 308-312 ; 1980). 5-ΗΡΕΓΕ (hydrjperoksihappo) on SR5:n (Slow Reacting Substance) prekursori. SRS on hyvin tehokas sileitä lihaksia supistava aine, joka välittää välittömän yliherkkyyden oireet. Lipoksigenaasin inhibiitio näyttää siten olevan edullista, erityisesti, kun seulotaan anti-aller-geenisia tai anti-in f1ammatorisia lääkkeitä. Nisäkkään ja kasvin 1 ipoksigenaasi11a (soijapapu) on useita yhteisiä biokemiallisia ominaisuuksia, ja on osoitettu, että useimmat kasvientsyymin inhibiitit inhiboivat myös verihiutaleista tai leukoeyyteistä saatuja lipoksigenaaseja (Baumann, J. et ai., Prostaglandins 20^, 627-639, 1980).

. Soijapapulipoksigenaasi aiheuttaa 15-HPETE:n ekslusiivista ; muodostumista (C.P.A. Van Os et ai, Biochim. et Biophys.

Acta 663 , 177-193, 1981 ), ja sen on havaittu olevan *' kymmenen kertaa herkempi kuin verihiutale-lipoksigenaasi .1 (Wallach, D.P., et ai, Biochim. and Biophys. Acta 663.

361-372, 1981 ). 15-HETE on lisäksi tehokas ja spesifinen inhibiittori ve r ih iu t a le-1 ipoks igenaasi lie (12-HETE), joka epäsuoraan stimuloi tromboksaanin A^ muodostumista (Vanderhoek, J., et ai., J.Biolog. Chem. 225, 5996 5998; 1980). 15-iiydroperoksianalogin on myös raportoitu alentavan . sian aorta-prostasykliini-syntetaasin aktiivisuutta Γ (Grygleu/skj , R.J. et ai. Prostaglandins 1_2, 685-713; 1976). tämä inhibiitiovaikutus johtuu tuhoavien hapettavien • « · « • · · « 11 87646 aineiden, I odeniniköisesti OH-r ad ikaal i n tai aktiivisuudeltaan samanlaisten aineiden muodostumisesta (Weiss, S.J., et ai. Blood, 53, 1191, 1979).

1 b. Materiaalit ja menetelmät bl) Spektro I o tometrinen määritys

EntsyymiakLiivisuuden määrittämiseksi on kehitetty spektro- fotometrinen menetelmä, Corey E.J. et ai. (J. Amer.

Chem. Soc, 104, 1750-1752; 19Θ2). 1,8 ml:n lopputilavuudessa sekoitettiin 0,2 M ilmastettua Borax-puskuria, pH = i 9,00 500 yksikön kanssa soijapapu-lipoksigenaasia. Kun inhibiittoreita testattiin, niitä lisättiin 0,6 ml loppu- 3 8 konsentraatiossa välillä 10 M - 10 M, minkä jälkeen esi-inkuboitiin 10 minuuttia huoneen lämpötilassa. Reaktio käynnistettiin 10”^M arakidonihapolla. Inkuboitiin huoneen lämpötilassa 90 minuuttia, minkä jälkeen 15-HPETE määritettiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 236 nm.

b2) Tulosten ilmaiseminen : t>2) Tulosten ilmaiseminen '!'* Tämän menetelmän toimivuus vahvistettiin tunnetuilla 1 ipoksigenaauin inhibiitturei1la. Jokaisella testattavalla • · * • ♦' aineella oli mukana kontrolli, jossa oli mukana kiehu- * * * tettua lipoksigenaasia, jotta otettaisiin huomioon • · *.·.· yhdisteen muodollinen absorptio käytetyllä aallonpituu della. Entsymaattisen aktiivisuuden prosentuaalinen määrä laskettiin kullekin konsentraatiolle. Yhdisteen määrä, joka tarvitaan inhiboimaan entsyymiaktiivisuus .*.·. 50-p r oseri 11 i ses t i , laskettiin lineaarisen regression • · avulla Lulospisteistu, jotka esittävät prosentuaalisen inhibiitinn kutisen treat io (M)/inibiitioprosentti-logarit- • · · ·-- · me j a .

i·» • m • * • t* ··· 12 87646 c. Tulokset ICg0 (50 % .inhibiition

Yhdisteet konsentraatio) H0 |j ^NH Ei aktiivinen , HCl ''NHj hoy^i :

H0^k^!i-SH 9,-3 0 1(Γ5 M

H0Y^i 1

HO >nv<X~S—CH2 — CH — CH2-CH3 1.04 10 4 M

CH

ESIMERKKI 2 3

H° Y^\ JL

H0 2,41 10-5 M

ESIMERKKI 4__ : H°YX ί"3

/ HO ”"CH— (ch2) 5_CH3 2,76 J.0 D M

ESIMERKKI 5 H°'>y^Ss CHt [ |]_ 1 -5

HO-^X~S“_CH“"(CH2)5"CH'3 2>45 10 M

* ESIMERKKI 6 _ γ

Difenyylitiokarbatsuni 1,61 10 ® M

* 1 • ·

II

• · 1 • · · 2) Superoksidian ioni-radikaalin (Q„~) "in vitro11 potentiaa linen inhibiilio a. Johdanto 13 87646

Tulehdusprosessil 1 e on tunnusomaista ^ndoteliasolubarrierin pienentynyt eheys, suonipermeabiliteetin muuttuminen ja fagosyyttisolujen, kuten liuskatumaisten leukosyyttien (PMN) aktivoituminen ja tästä johtuva aktiivisten yhdisteiden, joiutii eriiäl ovat vapaita radikaaleja, vapautuminen ja muodostuminen solunulkoiseen tilaan. Näiden radikaali-lajien suhdetta tulehduksen muihin tunnusmerkkeihin ei täysin ymmärretä. Aktivoituneiden tulehdussolujen, kuten PMN-solujen respiratorisen purkauksen eräs oleellinen komponentti on yksivalenssinen entsymaattinen pelkis tyminen superoksidianioni-radikaaliksi O “. Suuri osa muodostuneesi a O^-radikaalista vapautuu solunulkoiseen tilaan, jossa voi tapahtua spontaani dismutaatio niin, että muodostuu samanaikaisesti vetyperoksidia ja happea.

O “-radikauiin, vetyperoksidin ja gelatoituneiden metalli-katalyyttien samanaikainen läsnäolo solunulkoisessa tilassa voi johtaa aktiivisempien happiperäisten molekyylien, kuten hydroksyyliradikaalin (OH.) ja singlettihapen (^O2 ) muodostumiseen. Superoksididismutaasi (SOD) toimii O^'-radikaalin entsymaattisena siepparina (McCord et ’-**: ai. J. Biol. Chem. 244. 6049-6055; 1969). Sen sijaan 1-metioniini ja DM50 ovat kummatkin OH.-sieppareita.

• * · » » « « · * # ♦ · * · · • » • · · * · · • · · • · * • * • · · » ·*· * • · · · m . 87646

Ents. -H - O Ents.+ O + 2H+ 2 2 ^

SOD

• l (sieppari) CAT metalli-ionit v - 1 o_ - H_o<—-H O -:-> OH. + OH + o 4 ^ / . · \ ^ Ä n ( h i eppar i) w2 ^ 1-metioniini tai DMSO « (sieppar i)

Vapaiden radikaalien muodostumisen substraatti-ksantiini-oksidaasi-mallin ehdotettu mekanismi KAAVIO 1

Substraatti-ksantiinioksidaasi-mallia vapaiden radikaalien . muodostumiselle on voimakkaasti tutkittu (Fridowich, .;!1 I., J. Bio 1 . them. 215., 4053-4057 ; 1970) ja käytetty vapaiden radikaalien muodostamiseen sekä "in vitro" *·'; että "in vivo" (Chmori, H., et ai. Biochem. Pharmacol.

22, 1397-1400; 197Θ).

0 "-radikaalin spesifiseen havaitsemiseen ja seuraamiseen tarkoitettu helppo ja herkkä spektro fotometrinen määritysmenetelmä perustuu tämän radikaalin kykyyn pelkistää ferrisytokrumi C (Eyt c"1+). Ksantiiniokidaasin, hypoksan-.·.· tiinin ja Oyt e 1f: n mukanaolo bikarbonaattipuskurissa muodostaa 0 " , joka aluksi pelkistää Cyt c‘>+:n Cyt :ksi • · · · · 15 87646 , (Del Maestro, H .1., Microvascular Res. 2^2, 255-2709; 1981), minkä jälkeen OH. hapettaa uudelleen osan Cyt c^+:sta (Fong, K., et ai., Chern. Biol. Intercat. 1_5, 77-89; 1976).

3+ v — 2+

Hypoksantiini 1 ksantiinioksidaasi + t: y O^ + Cyt c + OH1 Ύ

Cyt c3+

Vetyperoksidia muodostuu molekyylimuotoisen hapen kahden elektronin pe 1 kia Uimisen tai U^ jn dismutaation kautta. Katalaasi ((' Λ I ) pelkistää vetyperoksidin vedeksi.

b. Materiaalit ja menetelmät

Superoksid ia ruotii radikaalin Q^~ muodostaminen

Noudatettu menettely oli identtinen julkaisussa: Del Meastro, R.I., J. Björk ja K.E. Arfors, (Microvascular Res. 2_2, 239-254; 1981 kuvatun menetelmän kanssa. Sytokromin c3 + (Cyt c3+) pelkistyminen määritettiin nimittäin järjestelmässä, jonka koostumus oli 0,96 mM hypoksantiini,

: 5,10“3M Cyt c3 + bikarbonaattipuskurissa, pH r 7,35 (0,132M

*/ NaCl, 4,7,10"3M KC1, 2,10-3M CaCl2, 1,2,10'3M MgS0ft, **1 Q,018M Nallen ) . Reaktio aloitettiin lisäämällä ksantiini- • · ^ : 1’ oksidaasia konsentraatiossa 0,07 U/ml. Absorbanssin : .‘ (550 nm) kasvua seurattiin 37°C:ssa termostoidussa spektro- f o t ome t r i ky v e t i ssa joka minuutti 4 minuutin ajan.

• · • · ·

Kukin testattu yhdiste lisättiin ennen ksantiinioksidaasia. Ak t i i v i suusy |< s ik ök s i määriteltiin 0,001 yksikön muutos minuutissa. Lntsymaattisen aktiivisuuden prosentuaalinen määrä laskettiin testattujen yhdisteiden kullekin kon- » a .·,·. sen tr aa t i o 1 1 e . Aineen, joka tarvitaan inhiboimaan entsyymi • · · 50-prosentlisesl. i (1C,.), määrä laskettiin lineaarisen • · j u • · · • · « ·<· a · • · · · · * · * · • » m 16 87646 regression outilla Lulospisteistä, jotka esittävät kon-sentraal iu M /inhibiitio-%-logaritmeja.

ί • » * » * * * · * • · » · • « • · * · » · · * * · · 17 87646 ^-Tulnksal j-siepparin IC.-^ Y h ci i ij L u e L (50 % inhibiition konsentraatio)

H0·^ ^NH

H0^5^X-S—C 1 , HCl 1,00 10-4 M

''NHj ho^^>-SM, 4,91 10"6 M.

H°,vXV

ΓΗ XCH2CH3

ΗΟΛ/"5“ΟΗ2ΕΗ 4,48 10~5 M

ESIMERKKI 1__^__^

H0 v/V

* -5 —CH2-CH3 1,97 IQ 3 M.

-ESIMERKKI 2____^H3__

H0 v^\ JL

J 2.41 10~5 M

. . ESIME1TKK1 4 HOsv^Ts CHi 7 f 1 _6

H0 —CH — (CH2 ) 5-CH3 4,48 10 M

fv ESIMERKKI 5 :Y* -5

HO'^/“S_CH"‘(CH2)5"CH3 7'76 10 M

* ( ESIMERKKI* _______

Kamferoii „ ._-6 „

9 ,05 10 M

3,4-dihydroksifenyyli-

: 3,87 10 3 M

: etikkahappo • · · * · • * · • · · ib 87646 3) Yhdisteide n "in vitro" seulonta: arakidoni-kaskadimeta-bo 1 ia ihmisen verihiutalemikrosomeissa a. Materiaalit ja menetelmät

Entsymaattinen määritys suoritettiin silanoiduissa la siäs-tioissa Ρ.ΙΙο'π, P. Walters'in ja H. Sullivan'in ( P r os tay 1 and i ne 1_2_, 951; 1976 ) menetelmällä. Reaktioseosta, jonka koostumus oli: 50 mM Tris HCl-puskuri, pH = 7,9, 5 mM 2-1rypto taani, 2 M methemoglobiini, 0,2 mg mikrosomi-jauhe ja testattu yhdiste; kokonaistilavuus 0,2 ml, inkuboitiin 5 minuuttia 37°C:ssa, ennenkuin lisättiin 10 /-il tai 20 /jm^C ar a k i don i hap p oa (0,08 yuCI). 5 minuutin inkuboinnin jälkeen reaktio päätettiin lisäämällä 10 JM1 IM sitruuna ti a ppoa.

Seos uutettiin neljä kertaa 0,5 m1:11a vedetöntä dietyyli-eetteriä ja kuivattiin naLriumsulfaati11a. Jäännös suspen-doitiin uudelleen noin 40 /Ji jaan eetteriä ja kromato-grafoitiin »ilikageelilevyillä. Eluointijärjestelmä 011 di etyy l ieeLteri/metanoii/eLikkahappo (90:1:2). Rf-arvot mitattiin arakidonihapon suhteen. Ohutlevykromatografia levyt (TLC) valutettiin LKB-u11ra fiImi11ä noin 24 tuntia.

\· Täplien osittainen identifiointi suoritettiin ajamalla standardit (PGA PGB , PGE , PGF , PXB , arakidonihappo) U L· L· L· C im.

samassa 1iuotinjärjestelmässä. Kvantitatiiviset tulokset . . saatiin skannaamalla kehitetty kalvo transmissiotiheys- mittarilla (1C Apparatus 910), joka oli kytketty Heu/lett Packard 3390A-integraattoriin. Imidatsoli ja indometasiini olivat mukana positiivisina standardeina, jotka inhiboivat spesifisesti vastaavasti troinboksaanisyntetaasia ja s y k 1 o - o k s i g e n a a s i a .

» · · li 19 87646 b. Sykio-oksiijeuuasin inhibiitio ihmisen verihiutale-mikrosome is3a IC50 -(50 % inhibiition

Yhd i sI ee t . knnsentraatio) ho XX»»

H0 Y^S

H0 J^JLs-CH2CHCH2-CH3 4,31 ίο"6 M

CH

ESIMERKKI 2 3 hoXJLs-C*J 1,&8 1<T5 h LWMEUKKI 4___ H° SXTS CH- X μ I 3 .6

H0^s^-S-CH(CH2)6-CH3 3,46 10 ° M

A

ESIMERKKI 6 • · ------- - , - - ----- ----- - ..- --- - - ---- • a · Ψ » « ·;· -5

Indnme L as i in 1 1,12 10 M

<Λ* ' : ·’· -4

FenyylibutuLsoni 2,74 10 M

Aineiden aktiivisuus syklo-oksigenaasiin on kvantitatiso itu 2 täplällä, jotka vastaavat PGE2 ja 7xB2 (suhde PGE2/7x/B2).

* * · • * · 20 87646 4) Prostaglandiinisyntetaasin "in vitro" inhibiitio pässin siemeitnestevesikkelimikrosomeissa a. Materiaalit ja menetelmät

Baumann 1 in el ai (Nauny n-Selim i ede be r g 1 s Arch. Pharm.

307 , 73; 1979) ja C. Takeguchi’in et ai (Biochem. 10, 2372; 1971) julkaistuihin menetelmiin perustuen kehitettiin parannettu määritysmenetelmä. Entsymaattinen radiomääritys suoritettiin si Ianuiduissa lasiastioissa. Reaktioseosta, joka sisälsi SO wM Iris HCl-puskuria, pH = B,3, pelkistetyn glutationin (I.SII) läsnäollessa, 1 tnM, sekä 0,55 mM hydro-kinonia, I uisi ui liiuun yhdistettä ja 50 pg pässin siemen-nestevesikkeli-mikrosomijauhetta kokonaistilavuuden ollessa 0,2 ml, inkuboitiin 5 minuuttia 37°C:ssa, ennenkuin lisättiin 10 /i 1 arakidoniiiappoa 1Q“*M (0,08 uCI).

30 minuutin inkuhoinnin jälkeen, jolloin silloin tällöin ravisteltiin, reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 fil IM si t ruunahuppua.

Seos uutettiin neljä kertaa 0,5 rnl-.lla vedetöntä dietyyli-eetteriä ja kuivat Li in natriumsulfaatilla. Jäännös sus-pendoitiin uudelleen noin 40 P1 :aan eetteriä ja kromato-urafoitiin silikageelilevyillä. Eluointijärjestelmä .:. u L i diet, yylieelleri/inetanoli/etikkahappo (45:1:2). RF-arvot mitattiin a i a k i d un i hap on suiiteen. Ohu11evykromatogra fia 1 evyt .. . valotettiin I. KU-ultrafilmillänoin 20 tuntia. Täplien * alustava identifiointi suoritettiin ajamalla standardit (PGE PGt 2, PGf , PGF 2a , PGA , PGA2, PG8lf PGB2) samassa · 1 iuotin jär jeste 1 inäasä . Kvantitatiiviset tulokset saatiin densitometrian avulla.

• * · • · · • · • · » ··· ···· n

Ij . T u 1 o k s e I

21 87646

Autoradiograafinen kvanti- i Y h d i s 1.1· ι* [ tasointi muutos -% PGF'a PGE_ PGD- I £ £ L» ho>^>-SH +'64,25 - 44,77 - 19f53

8 10-5 M HP

YX

H0 ^^/*“9~CH2CHCH2-CH3 + 2.0 r 19 - 5,48 +11,70 ch3 '3,2 10 6 H [ ϋ llltHKKI 2 .

HO v^N

H0 s-i^Vj - 17,97 - 2 f 05 - 2,06 3, 2 10_s M L51ML«KKI 4 ; F enyy libul ai sun i - 43,36 - 15,37 - 21,98 *. i. m

8 10-5 M

22 87646 5 ) Ksan t i ini uk s i daas in inh ib i i t te inä potentiaalisten yhdisteiden "in vitro11 seulonta a. Materiaalit ja menetelmät

Ksanlii n i oksi daasi-aktiivisuus määritettiin H.M. Kalckar'in (J. Biol. Uhnm. 167, 429-443, 1947) menetelmällä, jossa mitataan spektro futometrise sti virtsahapon muodostuminen.

Spek t ro f o I. ome L r i ky ve 11 i in lisättiin ksantiinioksidaasia 0,01 yksi kk ci /ml loppukonsentraatioon, minkä jälkeen lisättiin tus laatii puskuri a 0,05M, pH = 7,4, tai inhibiittoria. Reaktio aloitettiin lisäämällä ksantiinia 5.10 ” ^ M loppukonsent raaLiussa. Virtsahapon vapautumista seurattiin aallonpituudella 295 nm joka 30. sekunti 2 minuutin ajan (lineaarinen vaihe). Aktiivisuusyksikkö määritettiin 0,001 muutokseksi minuutissa. Entsymaattisen aktiivisuuden prosentuaalinen määrä laskettiin testattujen yhdisteiden jokaiselle konsentrautiolle. Aineen se määrä, joka tarvitaan estämään entsyymi 50-prosenttisesti ( IC^ , laskettiin lineaarisen regression avulla tulospisteistä, jotka esittävät kanseiit raation M logaritmia inhibiitio-%:n , . funktiona.

• ♦ * »tl I » · * · t

II

b . I u I o k s n I

23 87646 ICcn (50 % inhibiition Yhdiste; I 50 konsentraatio ) H0 > 9

Hp 2.37 10~4 M

Y\ -4

CH2—CH — CH2-CH3 5.11 10 1 M

ESI ML UKKI J CH3 Y\ -4

HO>^>1-S-CH~>(CH2)5-CH3 5.57 10.1 M

ESIMERKKI 5

Foolihappu 6.76 10-7 M

• · • · ·

Kamferuli 7.89 10~^ M

• · · · I I < » • · · · • · · • · 24 87646 6 ) Ihmisen J uukosy y L t i-1 ipoks igenaasin (LO) inhibiitio a) 5- ja 12- lipuk sig en a a sien inhibiitio, humaani, iho n i t uma i ne n

Kokeen n:u 1 suoritustapa; 1. Inkuboidaan yhdessä 15 x 10^ ihmisen leukosyyttiä ml:ssa ja 2 mM Ca2+, 0,5 mM Mg2+ inhibiittien läsnäollessa 20 minuuttia 37°C:ssa.

2. Stimuloidaan 4 minuutin ajan 1 ug:lla ionoforia ( A 2 318 7 ) / m 1 .

3. Inkuboinli pysäytetään 1 tilavuudella metanolia.

A. RP-HP tl.' -ana i y y s i , k o tonni L’18, 5 fjm .

'> · Piikkiini kurkiuis mitalaan ja verrataan sisäiseen s l andani iin (I1(;Ii^ ) ,

Koe n;o j; lulosten analyysi • 1

Ic50

: Tuotteet 5—HETE LTB^ 12“HETE

H°yji f 3

H0 ^^JLscH2CHCH2-CH3 10-6 M 10 6 M 10 6 M

ESIMERKKI l :o "°Ύ^ι V: 2 1 10 Sm 2 X 10 6m 2 X 1(1 t:

II

· » 25 87646 1)) 5-, 12- jii i 5~ J ipoksiyenaasien inhibiitio, humaani, m o n i t u m n intin

Kokeen n:n 2 auo tilustapa : 1. I nkubo i cifinn ]] χ 10^ humaania leukosyyttiä ml:ssa inhibi i L l. i t:n kanssa 20 minuuttia 37°C:ssa (2 mM Ca2 + ja 0,5 mM My2+).

2. 51 imu 1 υ Hiiliin A minuulin ajan 10 /jy:lla arakidoniliappoa ja 1 /jgjila ionuforia (A23187)/ml.

3· Inkubointi pysäytetään 1 tilavuudella metanolia ja suoritetaan III’--IIP LC- analyysi .

A. Piikkien korkeus mitataan ja verrataan sisäiseen standardiin ( P 013 ) .

Koe n;u 2i InltisLen analyysi IC50 luotte el 5-HETE 12-HETE 15-HETE HHT LTB4 •v:j HvST........

HQ 10 6M 2,10 6M 5,10 5M 2,10 5M 3,10 6M

V::": f »3 HO J^jJ-S-CH2CH-CH2-CH3 10 6M 10 5M 10 5M 5.10 5M 3,10 6M E 51 HE UKKI l _____________________________ HOvr^i i"1 H-)x^x^'S“CH"(C:,,;?),i”CH3 10 6M 2,10 &M 10 5m 2?1° 6M 10~6m 1 S 1 Ml. UKKI 5 1 • ·· • · • ·

I u 1 o k s e L

26 87646

Edellä oleveii koi meri yhdisteen havaitaan stimuloivan 1 3 - 1 lpoks i cjtuiHHS i a k un a e n L r a a t i o s s a 10"^ M - 3 x 10~^M, kun taas 5 - I i μ ok :> i (j erin a s i mhiboituu näissä konsentraa-lioissa.

Huomattakoon, että kokeessa n:o 1 vain ionofori stimuloi leukosyyttejä ja kokeessa n:o 2 ionofori ja arakidonihappo stimuloivat soluja. Eksoyeenisen arakidonihapon mukanaolo lisää 10-k e rt. a isosti inhibiittien ID^-arvoa ; toisaalta arakidonihapon lisääminen mahdollistaa 15-lipoksi-yenaasiak1iivi»uuden mittaamisen, jota ei tavallisesti vo ula havaita vain ionoforilla stimuloiduissa leukosyyteissä.

li

Claims

27 87646 Patenttivaatimus Menetelmä valmistaa uusia yleiskaavan I mukaisia katekolijoh-dannaisia S - R (I) jossa R on sykioheksyyliryhmä, joka voi olla substituoitu kahdella 1-3 hiiliatomisella alkyyliryhmällä, fenyyliryhmä, joka voi olla substituoitu yhdellä tai kahdella 1-2 hiiliatomisella alkyyliryhmällä, tai trifluorimetyyliryhmi1lä, tunnet-t u siitä, että kaavan II mukainen S-(2,3-dihydroksifenyyli)-isotiourea saatetaan refluksointitilassa reagoimaan vedettömässä alkanolissa yleiskaavan III mukaisen tosylaatin kanssa, jossa R tarkoittaa samaa kuin edellä HO O Tl] .»H ,.ο-!-ΤΛ-«3 -:· TT S II \=T - HO S - C O NH2 (ID (III) 28 87646 Förfarande för framställning av nya katekolderivat med den allmänna formeln I Hori HO S - R ( I ) där R är en cyklohexy1grupp, som kan vara substituerad med tvä alkylgrupper med 1-3 kolatomer, en fenylgrupp, som kan vara substituerad med en eller tvä alkylgrupper med 1-2 kolatomer eller trifluormetylgrupper, kännetecknat därav, att S - (2,3-dihydroxifenyl)-isotiourea med formeln II i reflux-förhällanden omsätts i vattenfri alkanol med ett tosylat med den allmänna formeln III, där R avser det samma som ovan HO 0 Ν]^ίΓΝν|ΐ NH R - O - S — ft —CH3 ΛΛ ^ il \=/ HO S - C 0 ^ nh2 (II) (III) li