FI81381B

FI81381B - Foerfarande foer framstaellning av stabila sulfoadenosyl-l-metionin (same)-salter.

Info

Publication number: FI81381B
Application number: FI851952A
Authority: FI
Inventors: Federico Gennari
Original assignee: Bioresearch Spa
Priority date: 1984-05-16
Filing date: 1985-05-16
Publication date: 1990-06-29
Also published as: DK215585A; MX7661E; ES543199A0; FI851952L; US5102791A; YU81185A; AU4251985A; YU44499B; HRP921151A2; CA1241285A; SI8510811A8; AU576577B2; IT8420938A0; DE3568581D1; FI81381C; IT1173990B; UA7079A1; ZA853295B; DK215585D0; IE58693B1

Description

1 81381

Menetelmä pysyvien sulfoadenosyyli-L-metioniini (SAMe)-suolojen valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien pysyvien 5 sulfoadenosyyli-L-metioniini (SAMe) -suolojen valmistamiseksi .

Tarkemmin sanottuna valmistetaan suoloja, jotka ovat peräisin SAMe:n ja disulfonihappojen välisestä reaktiosta. Kuvataan myös farmaseuttisia yhdistelmiä, jotka 10 sisältävät näitä uusia suoloja aktiivisina aineosina.

Nämä suolat ovat erityisen sopivia parenteraaliseen käyttöön.

SAMe on metyyliryhmien biologinen pääluovuttaja ja tästä ominaisuudesta johtuen se on varsin kiinnostava 15 sekä biologiselta kannalta että sen terapeuttisten käyttömahdollisuuksien kannalta.

Tämä tuote aiheuttaa kuitenkin ongelmia sen suur-mittakaavaisen käytön suhteen, jotka ongelmat liittyvät sen lämmönkestämättömyyteen, jopa ympäristön lämpötilassa, 20 sekä sen valmistuksen ja puhdistamisen monimutkaisuuden suhteen.

SAMe on sentähden ollut lukuisten patenttien kohteena, jotka kohdistuvat sekä uusien pysyvien suolojen saamiseen että valmistusprosessien aikaansaamiseen, jotka 25 voidaan toteuttaa teollisessa mittakaavassa.

Tämä patentin hakija on jättänyt useita patenttihakemuksia, jotka koskevat sekä uusia pysyviä suoloja että menetelmiä sulfoadenosyyli-L-metioniinin valmistamiseksi (IT-patentit 1 043 885, 1 022 016, 1 022 036 ja 1 054 175; 30 IT-patenttihakemukset 23603A/81 ja 22622A/83).

Hakijan keksimät, edellä mainittujen patenttien kattamat suolat ovat hyvin pysyviä ja ovat sopivia farmaseuttiseen käyttöön.

Niillä on kuitenkin haittana hyvin suuri happamuus 35 (suuret vahvan hapon ekvivalentit ekvivalenttia kohti 2 81 381 SAMe), minkä takia niiden injektoitavissa muodoissa lyofi-lisoidun ampullin, joka sisältää aktiivisen aineosan, mukana on oltava sopiva puskuriliuotin, joka asettaa lopullisen liuoksen pH:n fysiologisiin arvoihin.

5 Puskurin suuri suolapitoisuus estää sentähden suur ten tuoteannosten käytön.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavien uusien suolojen pääetu on, että ne sisältävät ainoastaan 3 hap-poekvivalenttia SaMe-ekvivalenttia kohti ja vaativat siten 10 huomattavasti pienemmän puskurimäärän neutraloimista varten.

Ne ovat siten erityisen sopivia SAMe:n parenteraa-lista käyttöä varten suurella annoksella, mikä on osoittautunut olevan tarpeen kliinisessä käytössä tiettyjä sai-15 rauksia varten.

Lisäksi tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat SAMe-suolat ovat äärettömän pysyviä ajan suhteen lämpötilaan 45 °C:seen asti ja ovat vesiliukoisia vähintäin 30 paino-%:n väkevyyteen asti ja ovat liukenemattomia taval-20 lisiin orgaanisiin liuottimiin.

Lisäksi näitä suoloja voidaan valmistaa helposti taloudellisesti teollisessa mittakaavassa suursaantomene-telmällä.

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan sulfo-25 adenosyyli-L-metioniini (SAMe)-suoloja, joilla on yleinen kaava: SAMe. 1,5(CH2)„(S03H)2 (I), 30 jossa m on on välillä 3-12, ja menetelmälle on tunnusomaista, että a) lähtöhiiva rikastetaan SAMe:11a, b) solut hajotetaan ja SAMe:n suhteen rikastettu liuos (solu-lysaatti) otetaan talteen, c) solulysaatti esipuhdistetaan ultrasuodatuksella; d) esipuhdistettu lysaatti viedään 35 pylvään läpi, jossa on heikon hapon ioninvaihtohartsia, ja 3 81 381 eluoidaan vaaditulla sulfonihapolla, e) tämän pylvään eluaatti viedään toisen pylvään läpi. Jossa on ab-sorptiohartsia, ja pestään vaaditulla sulfonihapolla, f) jälkimmäisen pylvään eluaatti väkevöidään käänteisosmoosia 5 käyttäen ja g) väkevöity liuos kuivataan.

Uusien SAMe-suolojen nämä ja muut ominaisuudet ja edut käyvät ilmi tämän jälkeen annetusta yksityiskohtaisesta selostuksesta, joka koskee erityisesti valmistusmenetelmää ja joka annetaan keksinnön valaisemiseksi.

10 Keksinnön mukaisen menetelmän vaiheet uusien SAMe- suolojen valmistamiseksi toteutetaan seuraavalla tavalla: a) lähtöhiivan rikastaminen SAMeilla lisäämällä me-tioniinia hiivojen Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis yms. viljelyihin Schlenk'in 15 [Enzymologia, 29 (1965) 238] kuvaamalla tavalla; b) solujen hajottaminen, jota seuraa SAMein suhteen rikastetun vesipitoisen liuoksen (solulysaatin) talteenotto: hajottaminen suoritetaan käsittelemällä rikastettua hiivaa ensin veden ja etyyliasetaatin liuoksella tilavuus- 20 suhteessa 3:1 - 0,5:1 ja edullisesti 1,2:1 - 0,8:1; käytetty määrä vesi/etyyliasetaatti-liuosta on edullisesti 1/20 - 1/2 ja erityisesti 1/4 - 1/5 osaa kosteiden solujen painosta ja käsittelyä jatketaan 15 - 45 minuuttia, edullisesti 30 minuuttia. Sitten lisätään 0,1 N - 0,5 N, edul-25 lisesti 0,35 N rikkihappoa määrässä 1:1 - 0,2:1, edullisesti 0,5:1 - 0,6:1 kosteiden solujen painon suhteen.

Käsittelyä jatketaan 1-2 tuntia, edullisesti 1,5 tuntia, ympäristön lämpötilassa. Tällä tavalla toteutettu solujen hajottaminen saa käytännöllisesti katsoen 100 % läsnäole-30 vasta SAMe:stä menemään liuokseen. On huomattava, että hiivasolujen hajottaminen orgaanisen liuottimen ja laimean rikkihapon seoksella on huomattavasti mukavampaa kuin per-kloorihapolla ympäristön lämpötilassa tai muurahais- tai etikkahapolla 60 °C:ssa jne., sikäli, että hajottaminen ei 35 ainoastaan tapahdu ympäristön lämpötilassa, mikä huomatta- 4 81 381 vasti edistää SAMe:n pysyvyyttä, vaan se suoritetaan sellaisissa olosuhteissa, että liuos voidaan helposti suodattaa solujäännöksistä eikä siten sisällä mitään niistä epäpuhtauksista, joita on läsnä, kun käytetään muita hajotus-5 väliaineita ja joita on vaikea poistaa tunnetuin menetelmin puhtaan SAMein valmistamiseksi; c) solulysaatin esipuhdistaminen ultrasuodatuksel-la: vaiheesta b) saatu solulysaatti saatetaan ultrasuoda-tusprosessiin käyttäen membraaneja, joiden nimellinen cut 10 off on 1000, mikä tekee mahdolliseksi proteiinijäännösten ja suuren molekyylipainon omaavien polysakkaridijäännösten poistamisen lysaatista, jotka jäännökset muutoin kiinnittyisivät ioninvaihtohartseihin seuraavassa vaiheessa vähentäen progressiivisesti hartsien aktiivisuutta. Ultra-15 suodatusprosessi voidaan toteuttaa joko tasomembraaneilla tai edullisesti putkimembraaneilla. On huomattava, että ultrasuodatuksen käyttö sallii seuraavan vaiheen hartsi-pylväiden syöttämisen huomattavasti puhtaammalla lysaatil-la, joka erityisesti on vapaa suurmolekyylipainoisista 20 aineista, jotka palautumattomasti kiinnittymällä hartsei-hin myrkyttäisivät niitä progressiivisesti vähentäen siten niiden aktiivisuutta ja siten niiden puhdistustehoa. Tämä esikäsittely pidentää siten huomattavasti hartsien keskimääräistä käyttöikää pylväissä, jotka hartsit muutoin 25 täytyisi usein korvata niiden myrkyttymisen takia, ja vähentää siten tuotantokustannuksia; d) esipuhdistetun lysaatin vieminen heikon hapon ioninvaihtohartsin läpi: vaiheesta c) peräisin oleva per-meaatti viedään pylvään läpi, jossa on heikkoa happohart- 30 siä (C00H) H*-muodossa pHrssa 3,5 - 7, edullisesti pH:ssa 5, määrässä väliltä 1-3 nestetilavuutta/tunti/hartsi-tilavuus, ja edullisesti määrässä 2 nestetilavuutta/tun-ti/hartsitilavuus. Käytetty hartsimäärä on alueella 10-50, edullisesti 30 litraa/kg SAMe. Lysaatti viedään pyl-35 vään läpi, joka sitten pestään tislatulla vedellä ja sit- 5 81 381 ten 0,1 M etikkahapolla kunnes eluaatin pH on alle 3, ja sitten tislatulla vedellä ja lopuksi SAMe eluoidaan vaaditun disulfonihapon 0,2 N liuoksella. SAMe:tä sisältävä eluaatti sisältää pieniä määriä värillisiä epäpuhtauksia 5 ja 3 % - 10 % 5'-deoksi 5'-metyylitioadenosiinia (SAMe:n päähajoamistuote). Nämä epäpuhtaudet poistetaan käyttäen absorptiohartseja (vaihe e); e) edeltävän pylvään eluaatin vieminen absorptio-pylvään läpi ja pesu vaaditulla sulfonihapolla: yllättäen 10 on havaittu, että Amberlite XAD2-, Amberlite XAD4- tai Am-berlite XAD7-tyyppiset absorptiopolymeerit, kun ne ovat voimakkaasti happamessa liuoksessa kuten edeltävästä pylväästä (vaihde d) saadussa eluaatissa, eivät pidätä käytännöllisesti ollenkaan SAMe:tä samalla kun ne pystyvät 15 helposti adsorboimaan värillisiä epäpuhtauksia, adeniinia ja 5'-deoksi-5'-metyylitioadenosiinia. Vaihe e) toteutetaan viemällä vaiheen d) eluaatti pylvään läpi, jossa on jotakin edellä mainituista hartseista, edullisesti Amberlite XAD4:ää, määrässä väliltä 0,2-1 nestetilavuutta/tunti 20 hartsitilavuutta kohti, ja edullisesti 0,5 nestetilavuutta/tunti hartsitilavuutta kohti. Käytetty hartsimäärä on alueella 10 - 50, edullisesti 30 litraa/kg SAMe. SAMe-liuos viedään pylvään läpi, joka sitten pestään vaaditun disulfonihapon 20 nN liuoksella kunnes SAMe häviää eluaa-25 tista. Eluaatti, joka sisältää n. 10 g/1 hyvin puhdasta SAMertä, syötetään jälkeen tulevaan väkevöimisvaiheeseen f). On huomattava, että tekniikan tasoon kuuluvissa menetelmissä värilliset epäpuhtaudet poistetaan käyttäen aktiivihiiliä, jotka, vaikkakin toisaalta ovat tehokkaita 30 tämäntyyppisen epäpuhtauden poistamisessa, toisaalta absorboivat palautumattomasti huomattavan määrän SAMe:tä (n. 15 paino-% käytetystä hiilestä), johtaen siten huomattavaan saannon vähenemiseen. Absorptiohartsien etu perustuu siihen tosiasiaan, että saavutetaan sama puhtausaste, 35 mutta huomattavasti suuremmalla saannolla kuin aktiivihiiltä käytettäessä; 6 81 381 f) vaiheen e) eluaatin väkevöiminen käänteisosmoo-sin avulla: vaihe f) toteutetaan saattamalla eluaatti vaiheesta e) käänteisosmoosiprosessiin käyttäen suolaa poistavia membraaneja, joilla on suuri NaCl-torjuvuus ja jot- 5 ka pystyvät käytännöllisesti täydellisesti pidättämään SAMein samalla kun ne sallivat veden ja osan disulfoni-haposta kulkea läpi permeaattina. Polyamidimembraaneja käytetään edullisesti niiden suuren kestävyyden takia voimakkaasti happamessa liuoksessa. Väkevöiminen käänteisos-10 moosilla sallii vaiheen e) eluaatin väkevöimisen 10 g:sta/l 100-150 g:aan/l ja edullisesti 120 g:aan/l. Kään-teisosmoosilla väkevöity SAMe-liuos analysoidaan SAMein ja disulfonihappo-väkevyyksien määrittämiseksi. Sopiva määrä disulfonihappoa lisätään tarvittavan stökiometrisen koos-15 tumuksen (edullisesti 3 happoekvivalenttia/SAMe-ekviva- lentti) saamiseksi. Tämä liuos syötetään jälkeentulevaan kuivausvaiheeseen g), jossa käytetään ruiskukuivuria lopputuotteen saamiseksi; g) väkevöidyn liuoksen kuivaaminen: tässä vaiheessa 20 tuote hienonnetaan kuivauskammiossa, johon syötetään kuumaa ilmaa. Syöttöliuoksen väkevyys (ilmaistuna SAMeinä) on 100 - 200 g/1, edullisesti 120 g/1. Kuivausilman, josta kosteus on edullisesti etukäteen poistettu, lämpötila on 140 - 200 °C, edullisesti 160 °C. Poistoilman lämpötila on 25 edullisesti 40 °- 100 °C, edullisesti 60 °C. Näissä olosuhteissa poistuvan tuotteen lämpötila on 40 °-60 “C ja se jäähdytetään ympäristön lämpötilaan ilmalla, josta kosteus on poistettu. Edullisesti toiminnassa olevassa laitoksessa on sopiva laite kuivan tuotteen jatkuvasti uuttamisek-30 si. On huomattava, että ruiskukuivurin käytöstä tuotteen lopullista kuivausta varten, verrattuna aikaisemmin tunnettuihin menetelmiin, kuten lyofilisointiin, on tuloksena huomattava kustannusten aleneminen ja se on helpommin toteutettavissa suurmittakaavaisessa tuotannossa.

35 SAMe-suoloja muodostavia disulfonihappoja, joita 7 81 381 käytetään eluointiin heikon hapon ioninvaihtohartsia sisältävässä pylväässä (vaihe d), voidaan saada joko kaupallisesti tai valmistaa helposti dinatriumsuolojen muodossa vastaavista dibromideista reaktiolla natriumsulfiitin 5 kanssa seuraavan yhtälön mukaisesti: (CH2 )„( Br )2 + 2Na2S03 -> (CH2 )B( S03Na )2 + 2NaBr jossa m voi olla 3-13.

10 Reaktio toteutetaan keittämällä palautus jäähdyttäen vesi/alkoholi-seoksessa, joka sisältää edullisesti 7,5 osaa vettä, 2 osaa 95-%:ista etanolia ja 0,5 osaa n-buta-nolia, edullisesti kolmen päivän aikana.

1 mooli edellä määriteltyä alkyylidibromidia sus-15 pendoidaan 1 l:aan edellä määriteltyä vesi/alkoholi-seos-ta, seokseen lisätään 2,2 moolia vedetöntä natriumsul-fiittia ja seosta keitetään palautusjäähdyttäen 3 päivää.

Reaktion päätyttyä alkoholit poistetaan tislaamalla, vesipitoinen liuos väkevöidään 0,5 - 1 l:n tilavuu-20 teen ja sulfonihapon dinatriumsuolan annetaan kiteytyä kylmässä (4 °C).

Tuote kiteytetään uudelleen yhtä suuresta tilavuudesta vettä ja suodatetaan ja kuivataan tyhjössä. Dinatriumsuolan keskimääräinen saanto on 90 mooli-%.

25 Dinatriumsuola liuotetaan uudelleen sellaiseen mää rään vettä, että saadaan 0,3 N liuos ja saatu liuos syötetään pylvään läpi, jossa on vahvan hapon ioninvaihtohartsia (Amberlite IR 120 tai Dovrex 50) H*-muodossa, joka hartsi on huolellisesti aktivoitu ja pesty. Hartsi pidät-30 tää natriumin ja pylvään ulosvirtauksessa saadaan disul-fonihapon liuos.

Pylvästä pestään tislatulla vedellä pH-arvoon 4, eluaatti titrataan ja laimennetaan antamaan disulfonihapon 0,2 N liuos.

35 Tätä liuosta käytetään SAMein valmistuksen vaihees sa d) ja e).

8 8 1 381

Seuraavaksi annetaan ei-rajoittavia, valaisevia esimerkkejä keksinnön mukaisesta menetelmästä disulfoni-happojen uusien pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi sekä näiden suolojen farmaseuttisten yhdistelmien valmis-5 tamiseksi.

Esimerkki 1

Disulfonihappojen, joilla on yleinen kaava (CH?)„(SOH^)7/_0,2 N liuosten valmistus 75 1 tislattua vettä, 20 1 95-%:ista etanolia ja 5 10 1 n-butanolia lisätään 21,6 kg:aan (100 mooliin) 1,4-di- bromibutaania. Lisätään 26,46 kg (210 moolia) vedetöntä natriumsulfiittia ja seosta keitetään palautusjäähdyttäen 3 päivää.

Reaktion päätyttyä lisätään 20 1 tislattua vettä 15 ja seosta tislataan kunnes alkoholit ovat täysin poistu neet.

Seos laimennetaan 60 l:n lopputilavuuteen vedellä ja kuumennetaan kunnes täydellinen liukeneminen on tapahtunut.

20 Saadun 1,4-butaanidisulfonihapon dinatriumsuolan annetaan kiteytyä yli yön 4 °C:ssa.

Tuote suodatetaan erilleen ja pestään 10 1:11a vettä. Emäliuokset haihdutetaan tyhjössä 20 l:n tilavuuteen ja jätetään kiteytymään yli yön 4 °C:ssa. Tuote suo-25 datetaan erilleen ja pestään 4 1:11a vettä. Kidemassa kahdesta suodatuksesta suspendoidaan uudelleen 50 l:aan vettä ja liuotetaan kuumissa olosuhteissa.

Liuoksen annetaan kiteytyä yli yön 4 °C:ssa.

Tuote suodatetaan ja pestään 5 1:11a vettä. Butaa-30 nisulfonihapon natriumsuola kuivataan tyhjössä. Lisäjae tuotetta saadaan väkevöimällä emäliuokset 10 l:ksi ja antamalla näiden kiteytyä yli yön 4 °C:ssa, suodattamalla sitten tuote ja kuivaamalla se tyhjössä.

Tällä tavalla saadaan 25,2 kg 1,4-butaanidisulfo-35 nihapon dinatriumsuola-monohydraattia (90 moolia, 90 moo-li-%:n saanto).

9 81 381

Tuote identifioitiin alkuaineanalyysillä ja se vastaa kaavaa C4H806S2Na2.H20:

%C %H %S

Laskettu 17,1 3,6 22,9 5 Löydetty 17,1 3,7 22,9

Valmistettiin pylväs, joka sisälsi 200 1 Amberlite IR 120 hartsia, joka oli etukäteen aktivoitu 6N HClrllä, kunnes Na*-ioni hävisi eluaatista, ja pesty tislatulla 10 vedellä kunnes Cl-ioni hävisi eluaatista.

25,2 kg 1,4-butaanidisulfonihapon dinatriumsuola-monohydraattia liuotetaan 300 l:aan vettä ja syötetään pylvään yläpäähän. Eluaatti, joka sisältää 1,4-butaanidisulfonihapon, kerätään ja pylvästä pestään vedellä kunnes 15 eluaatin pH on saavuttanut arvon 4.

Se laimennetaan 900 l:n lopputilavuuteen 1,4-butaanidisulfonihapon 0,2 N liuoksen saamiseksi, joka käytetään sellaisenaan vastaavan SAMe-suolan valmistukseen.

Toimien yhdenmukaisella tavalla, mutta käyttäen 20 lähtöaineena 20,2 kg 1,3-dibromipropaania, saadaan 900 1 1,3-propaanidisulfonihapon 0,2 N liuosta.

Käyttäen 23 kg 1,5-dibromipentaania saadaan 900 1 1,5-pentaanidisulfonihapon 0,2 N liuosta.

Käyttäen 24,4 kg 1,5-dibromiheksaania saadaan 900 1 25 1,6-heksaanidisulfonihapon 0,2 N liuosta.

Käyttäen 27,2 kg 1,8-dibromioktaania saadaan 900 1 1,8-oktaanidisulfonihapon 0,2 N liuosta.

Lopuksi, käyttäen 30 kg 1,10-dibromidekaania, saadaan 900 1 1,10-dekaanidisulfonihapon 0,2 N liuosta.

30 Esimerkki 2 SAMe.1,5(1,4-butaanidisulfonaatti)-suolan valmistus 220 1 etyyliasetaattia ja 220 1 vettä lisätään ympäristön lämpötilassa 1800 kg:aan hiivaa, joka on rikas-35 tettu SAMeilla (6,88 g/kg) Schlenk'in [Enzymologia 29 (1965) 283] kuvaamalla tavalla.

10 81 381 30 minuutin voimakkaan sekoittamisen jälkeen lisätään 1000 1 0,35 N rikkihappoa ja sekoittamista jatketaan vielä 1,5 tuntia.

Seos suodatetaan pyörivän suodattimen läpi, jota 5 pestään vedellä, antamaan 2800 1 liuosta, joka sisältää 4,40 g/1 SAMe, mikä vastaa 99,5 % lähtöaineessa läsnäol-leesta.

Tällä tavalla saatu SAMe-liuos (pH 2,5) syötetään ultrasuodatuslaitokseen, jossa käytetään putkimembraaneja, 10 joiden cut off on 10 000.

Membraaneilta poistuva permeaatti kerätään sopivaan astiaan, kun taas väkevöitettä kierrätetään jatkuvasti 200 l:n lopputilavuuteen. Tässä pisteessä lisätään tislattua vettä ja kierrättämistä jatketaan kunnes SAMe 15 on täysin uuttunut.

Saadaan 3500 1 ultrasuodatettua lysaattia, jonka pH asetetaan arvoon 5 lisäämällä 2 N NaOH.

Valmistetaan pylväs, joka sisältää 400 1 Amberlite CG 50-hartsia H*-muodossa, joka hartsi on huolellisesti 20 pesty tislatulla vedellä.

Lysaattia viedään hartsipylvään läpi nopeudella 800 1/h, mikä pidetään vakiona koko prosessin ajan.

400 1 tislattua vettä, 3200 1 0,1 M etikkahappoa ja 400 1 tislattua vettä viedään sitten peräkkäin pylvään 25 läpi.

SAMe eluoidaan 800 1:11a 0,2 N 1,4-butaanidisul-fonihappoa. Tällä tavalla saadut 800 1 eluaattia sisältävät n. 10 kg SAMe.

Valmistetaan pylväs, joka sisältää 400 1 Amberlite 30 XAD4-hartsia, joka oli sitä ennen aktivoitu 800 1:11a 0,1 N NaOH ja 800 1:11a 0,1 N H2S0« ja sitten huolellisesti pesty tislatulla vedellä. Edellä saatu SAMe-liuos viedään pylvään läpi nopeudella 200 1/h, mikä pidetään vakiona koko prosessin ajan.

35 Sitten pylvään läpi viedään 400 1 20 mN 1,4-butaa- nidisulfonihappoa.

11 81381

Eluaatti, joka sisältää SAMe:tä (n. 1000 1, joka sisältää 10 kg SAMe) kerätään.

Tällä tavalla saatu liuos syötetään käänteisosmoo-silaitokseen, joka on tasotyyppinen käyttäen polyamidi-5 suolanpoistomembraaneja.

Tässä laitoksessa SAMe-liuos väkevöidään 80 l:ksi, joka sisältää 9,9 kg SAMe.

Lisätään 5 1 butaanidisulfonihapon 2 N liuosta.

Tällä tavalla saatu liuos syötetään ruiskukuivaus-10 laitokseen, johon syötetään 160 °C:sta ilmaa.

Kuivaa tuotetta uutetaan jatkuvasti laitoksesta. Saadaan 18 kg jauhemaista tuotetta, jolla on seu-raava koostumus analyysin mukaan: SAMe 54,9 % 15 1,4-butaanidisulfonihappoa 44,9 % H20 0,2 % mikä vastaa SAMe.1,5 (1,4-butaanidisulfonaatti)-suolaa.

Tuote on kiteisen valkoisen jauheen muodossa, joka liukenee veteen 30 paino-%:iin muodostaen värittömän 20 liuoksen, ja on liukenematon tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

Käyttäen ohutlevykromatografiaa julkaisun Anal. Biochem. 4 (1971) 16-28 mukaisesti havaitaan tuotteen olevan vapaa kaikista epäpuhtauksista.

25 Alkuaineanalyysi:

Ci5H22N605S.1,5 C4H1006S2

%N %C %H

Laskettu 11,6 34,7 5,1 Löydetty 11,5 34,8 5,1 30 Tuotteen ultraviolettispektri osoittaa absorptio- maksimin (puskurissa, pH 4) 258,5 nm:ssä, jolloin E1%= 193.

Esimerkki 3 SAMe.l,5(l,3-propaanidisulfonaatin) valmistus 35 Seurataan esimerkin 2 menettelyä, mutta käyttäen 81 381 1.3- propaanidisulfonihappoa 1,4-butaanidisulfonihapon asemesta.

Saadaan 17,45 kg jauhetta, jolla analyysin mukaan on seuraava koostumus: 5 SAMe 56,5 % 1.3- propaanidisulfonihappo 43,3 % H20 0,2 % vastaten SAMe.1,5 (1,3-propaan±disulfonaatti)-suolaa.

Tuote on kiteisen valkoisen jauheen muodossa, joka 10 liukenee veteen 30 paino-%:iin asti muodostaen värittömän liuoksen, ja on liukenematon tavallisiin orgaanisiin liuottimiin. Ohutlevykromatografia julkaisun Anal.

Biochem. 4, (1971) 16-28 mukaisesti osoittaa, että tuote on vapaa kaikesta epäpuhtaudesta.

15 Alkuaineanalyysi: ^15^22^6^5^ .1,5 ^3^θ®6®2

%N %C %H

Laskettu 11,9 33,2 4,8 Löydetty 11,9 33,1 4,8 20 Tuotteen ultraviolettispektri osoittaa absorptio- maksimin (puskurissa, pH 4) 258,5 nm:ssä, jolloin Eu=199.

Esimerkki 4 SAMe.1,5(1,5-pentaanidisulfonaatti)-suolan valmis- 25 tus

Seurataan esimerkin 2 menettelyä, mutta käytetään 1.5- pentaanidisulfonihappoa 1,4-butaanidisulfonihapon asemesta.

Saadaan 18,5 kg jauhetta, jolla analyysin mukaan 30 on seuraava koostumus: SAMe 53,3 % 1.5- pentaanidisulfonihappo 46,5 % H20 0,2 % vastaten SAMe.1,5(1,5-pentaanidisulfonaatti)-suolaa.

35 Tuote on kiteisen valkoisen jauheen muodossa, joka 13 81 381 liukenee veteen 30 paino-%:iin muodostaen värittömän liuoksen, ja on liukenematon tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

Ohutlevykromatografia julkaisun Anal. Biochem. 4 5 (1971) 16-28 mukaisesti osoittaa tuotteen olevan vapaa kaikesta epäpuhtaudesta.

Alkuaineanalyysi: ^15^22^6^5^ * ' 5 C5H1206S2

%N %C %H

10 Laskettu 11,3 36,2 5,4 Löydetty 11,4 36,2 5,3

Tuotteen ultraviolettispektri (puskurissa, pH 4) osoittaa absorptiomaksimin 258,5 nm:ssä, jolloin E1!k=188. Esimerkki 5 15 SAMe.1,5 (1,6-heksaanidisulfonaatti)-suolan val mistus

Seurataan esimerkin 2 menettelyä, mutta käytetään 1.6- heksaanidisulfonihappoa 1,4-butaanidisulfonihapon asemesta.

20 Saadaan 19 kg jauhetta, jolla analyysin mukaan on seuraava koostumus: SAMe 51,8 % 1.6- heksaanidisulfonihappo 48 % H20 0 , 2 % 25 mikä vastaa SAMe.1,5 (1,6-heksaanidisulfonaatti)-suolaa.

Tuote on kiteisen valkoisen jauheen muodossa, joka liukenee veteen 30 paino-%:iin asti muodostaen värittömän liuoksen, ja on liukenematon tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

30 Ohutlevykromatografia julkaisun Anal. Biochem. 4 (1971) 16-28 mukaisesti osoittaa, että tuote on vapaa kaikesta epäpuhtaudesta.

Alkuaineanalyysi: ^15^22^()5^ · 1,5C6HU06S2 35 i4 81 381

%N %C %H

Laskettu 10,9 37,6 5,6 Löydetty 10,8 37,5 5,6

Tuotteen ultraviolettispektrl (puskurissa, pH 4) 5 osoittaa absorptiomaksimin 258, 5 nm:ssä, jolloin Elik=182. Esimerkki 6 SAMe.1,5 (1,8-oktaanldisulfonaatti)-suolan valmistus

Seurataan esimerkin 2 menettelyä, mutta käytetään 10 1,8-oktaanidisulfonihappoa 1,4-butaanidisulfonihapon ase mesta.

Saadaan 20 kg jauhetta, jolla analyysin mukaan on seuraava koostumus: SAMe 49,3 % 15 1,8-oktaanidisulfonihappo 50,5 % H20 0,2 % mikä vastaa SAMe.1,5 (1,8-oktaanidisulfonaatti)-suolaa.

Tuote on kiteisen valkoisen jauheen muodossa, joka liukenee veteen 30 %:iin asti muodostaen värittömän 20 liuoksen ja on liukenematon tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

Ohutlevykromatografia julkaisun Anal. Biochem. 4 (1971) 16-28 mukaisesti osoittaa, että tuote on vapaa kaikesta epäpuhtaudesta.

25 Alkuaineanalyysi: ^15^22^6^5^ * 1 ·

%N %C %H

Laskettu 10,4 40,0 6,0 Löydetty 10,4 39,9 5,9 30 Tuotteen ultraviolettispektri (puskurissa, pH 4) osoittaa absorptiomaksimin 258,5 nm:ssä, jolloin E1!S=173. Esimerkki 7 SAMe.1,5(1,10-dekaanidisulfonaatti)-suolan valmistus 35 Seurataan esimerkin 2 menettelyä, mutta käytetään is 81381 1.10- dekaanidisulfonihappoa 1,4-butaanidisulfonihapon asemesta.

Saadaan 21 kg jauhetta, jolla analyysin mukaan on seuraava koostumus: 5 SAMe 46,8 % 1.10- dekaanisulfonihappo 53 % H20 0,2 % mikä vastaa SAMe.1,5 (1,10-dekaanidisulfonaatti)-suolaa.

Tuote on kiteisen valkoisen jauheen muodossa, joka 10 liukenee veteen 20 paino-%:iin asti muodostaen värittömän liuoksen ja on liukenematon tavallisiin orgaanisiin liuottimiin.

Ohutlevykromatografia julkaisun Anal. Biochem. 4 (1971) 16-28 mukaisesti osoittaa, että tuote on vapaa 15 kaikesta epäpuhtaudesta.

Alkuaineanalyysi: ^15^22^6^55 · 1,5C10H2206S2

%N %C %H

Laskettu 9,8 42,3 6,5 20 Löydetty 9,9 42,4 6,5

Tuotteen ultraviolettispektri (puskurissa, pH 4) osoittaa absorptiomaksimin 258,5 nm:ssä, jolloin Eu=164. Esimerkki 8

Injektoitavia farmaseuttisia yhdistelmiä, jotka 25 sisältävä disulfonihappojen S-adenosyyli-L-metioniini- suoloja, lysiini puskurina a) lyofilisoitu ampulli sisältää: SAMe.1,5 (1,4-butaanidisulfo-naatti)-suola 364 mg 30 ekvivalentti SAMe-ionimäärälle 200 mg liuotinampulli sisältää: lysiiniemästä 150 mg vettä injektoitavia liuoksia varten lisätty 3 ml:ksi 35 b) lyofilisoitu ampulli sisältää: ie 81381 SAMe.1,5 (1,4-butaanidisulfo-naattia) 729 mg ekvivalentti SAMe-ionimäärälle 400 mg liuotinampulli sisältää: 5 lysiiniemästä 300 mg vettä injektoitavia liuoksia varten lisätty 5 ml:ksi c) lyofilisoitu ampulli sisältää: SAMe.1,5 (1,4-butaandisulfo- 10 naattia) 1821 mg ekvivalentti SAMe-ionimäärälle 1000 mg liuotinampulli sisältää: lysiiniemästä 750 mg vettä injektoitavia liuoksia 15 varten lisätty 10 ml:ksi.

20

Claims

81381

1. Menetelmä pysyvien sulfoadenosyyli-L-metioniini (SAMe)-suolojen valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava: 5 SAMe · 1,5 (CH2) B (S03H) 2 (I), jossa m on välillä 3-12, tunnettu siitä, että a) lähtöhiiva rikastetaan SAMeillä, 10 b) solut hajotetaan ja SAMe:n suhteen rikastettu liuos (solulysaatti) otetaan talteen, c) solulysaatti esipuhdistetaan ultrasuodatuksel- la, d) esipuhdistettu lysaatti viedään pylvään läpi, 15 jossa on heikon hapon ioninvaihtohartsia ja eluoidaan vaaditulla disulfonihapolla, e) tämän pylvään eluaatti viedään toisen pylvään läpi, jossa on absorptiohartsia, ja pestään vaaditulla disulfonihapolla, 20 f) jälkimmäisen pylvään eluaatti väkevöidään kään- teisosmoosia käyttäen, g) väkevöity liuos kuivataan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu sii- 25 tä, että vaihe a) toteutetaan lisäämällä metioniinia mikro-organismien, kuten Saccharomyces cerevisiae, Torulop-sis utilis, Candida utlilis viljelyihin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu sii- 30 tä, että vaihe b) toteutetaan käsittelemällä rikastettua hiivaa ensin veden ja etyyliasetaatin liuoksella ja sitten 0,1 N - 0,5 N, edullisesti 0,35 N rikkihapolla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu sii- 35 tä, että vaihe c) toteutetaan saattamalla solulysaatti ie 81381 ultrasuodatukseen käyttäen membraaneja, joiden nimellinen cut off on 10000.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu sii- 5 tä, että vaihe d) toteutetaan viemällä esipuhdistettu ly-saatti pylvään läpi, jossa on heikkoa happohartsia (C00H) H*-muodossa pH:ssa väliltä 3,5-7, edullisesti pH-arvossa 5.

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 5 mukainen menetelmä 10 pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vaihe d) toteutetaan viemällä esipuhdistettu lysaatti pylvään läpi nopeudella 1-3 nestetilavuut-ta/tunti hartsitilavuutta kohti, edullisesti nopeudella 2 nestetilavuutta/tunti hartsitilavuutta kohti.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 5 tai 6 mukai nen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vaihe d) toteutetaan viemällä esipuhdistettu lysaatti pylvään läpi, joka sisältää hartsimäärän väliltä 10-50 1/kg SAMe ja edullisesti 30 20 1/kg SAMe.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 5, 6 tai 7 mu kainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vaiheessa d) SAMe eluoidaan 25 0,2N rikkihappoliuoksella.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vaihe e) toteutetaan viemällä vaiheen d) eluaat-ti pylvään läpi, jossa on styreeni/divinyylibentseeni- 30 tyyppistä absorptiohartsia, nopeudella 0,2-1 nestetila vuutta/tunti hartsitilavuutta kohti, edullisesti nopeudella 0,5 nestetilavuutta/tunti hartsitilavuutta kohti.

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 9 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu 35 siitä, että vaiheessa e) SAMe-liuoksen läpikulun jälkeen 19 81 381 pylvästä pestään disulfonihappoliuoksella kunnes SAMe häviää eluaatista.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu sii- 5 tä, että vaihe f) toteutetaan käänteisosmoosilla käyttäen suolanpoistomembraaneja, joilla on suuri NaCl-torjuvuus ja jotka edullisesti ovat polyamidityyppiä.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, tunnettu siilo tä, että vaihe g) toteutetaan kuivaamalla väkevöity SAMe- liuos surmattamalla se kammiossa, johon syötetään kuumaa ilmaa.

13. Patenttivaatimuksen 1 tai 12 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, t u n - 15. e t t u siitä, että vaiheessa g) liuos syötetään kammioon SAMe-väkevyydessä väliltä 100-200 g/1, edullisesti 120 g/1.

14. Jonkin patenttivaatimuksista 1, 12 tai 13 mukainen menetelmä pysyvien SAMe-suolojen valmistamiseksi, 20 tunnettu siitä, että vaiheessa g) kuumaa ilmaa, josta kosteus on edullisesti poistettu, syötetään kammioon lämpötilassa 140 ° - 200 °C, edullisesti lämpötilassa 160 °C, ja se poistuu kammiosta lämpötilassa 40 * -100 °C, edullisesti lämpötilassa 60 °C. 25 20 8 1 381