JP3283041B2 - 人工抗体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、人工抗体に関し、更に
詳しくは、抗体に人工の細胞接着活性の新機能が付加さ
れた多機能性人工抗体に関する。
詳しくは、抗体に人工の細胞接着活性の新機能が付加さ
れた多機能性人工抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、細胞と細胞外マトリックスの接着
の機構が分子レベルで解明されつつある。細胞外マトリ
ックスタンパク質の中で、細胞の接着に必須の配列が、
最初に明らかにされたのは、フィブロネクチン（以下Ｆ
Ｎと略する）である。すなわち、ＦＮの細胞接着ドメイ
ンに存在する配列表の配列番号１で表すアミノ酸配列
（以下、Ｒ−Ｓ配列と称す）が、細胞の接着に必須の単
位であることが、ルオスラティらによって明らかにされ
た〔ネーチャー（ Nature ) 、第３０９巻、第３０〜３
３頁（１９８４）〕。この配列中、ＲＧＤは、細胞の接
着に必須であり、他のアミノ酸に置換することができな
いが、Ｓは他のアミノ酸、例えば、Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｖに置
き換えることができる。しかし、ＰやＫでは活性を示さ
ないことも記載されている。ＲＧＤ配列を含むタンパク
質は、ＦＮのほかに、トロンビン、フォンビルブラント
因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ディスコイディ
ンＩ、λファージレセプターなどが知られており、ＲＧ
Ｄ配列が、タンパク質の機能と深くかかわっていること
が、示唆されている〔プロシーディングズ オブ ザナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ（ Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ）第８１
巻、第５８８５〜５９８８頁（１９８４）〕。しかしな
がら、ＲＧＤ配列がこれらの分子の中で細胞接着活性に
寄与しているかどうかは、なお不明な点が多い。例え
ば、フィブリノーゲンは、Ｒ−Ｓ配列を持っているにも
かかわらず、繊維芽細胞に対して細胞接着活性を示さな
いことが知られている。前記以外の細胞接着活性タンパ
ク質の例として、ラミニンが知られている。ラミニン
は、基底膜に存在する高分子糖タンパク質で、上皮系の
種々の細胞に対する接着活性を有する。この接着に関与
する最小単位として配列表の配列番号２で表すアミノ酸
配列（以下、Ｙ−Ｓ配列と称す）が報告されている〔セ
ル（ Cell) 第４８巻、第９８９〜９９６頁（１９８
７）〕。ラミニンもＲＧＤ配列を含むが、これが細胞接
着に関与しているか否かは不明である。このほか、ＦＮ
の IIIＣＳドメインに存在する配列表の配列番号３で表
すアミノ酸配列（以下、Ｅ−Ｖ配列と称す）がリンパ系
の細胞やメラノーマ細胞の接着に関与するとの知見もあ
る。一方、抗体とは抗原の刺激により生体内でつくら
れ、対応抗原と特異的に結合する活性を有する物質であ
る。免疫グロブリン（Ｉｇ) がその機能を担っており、
ＩｇはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのクラ
スに分類され、それぞれＨ鎖、Ｌ鎖による多重鎖の基本
構造より成っている。また抗体は定常部と可変部により
構成され、定常部とは遺伝的に決定された恒常的なアミ
ノ酸配列をもった部分であり、可変部とは抗原に対する
抗体の結合部位であり、抗体の抗原への特異性によって
アミノ酸配列は異なっている。
の機構が分子レベルで解明されつつある。細胞外マトリ
ックスタンパク質の中で、細胞の接着に必須の配列が、
最初に明らかにされたのは、フィブロネクチン（以下Ｆ
Ｎと略する）である。すなわち、ＦＮの細胞接着ドメイ
ンに存在する配列表の配列番号１で表すアミノ酸配列
（以下、Ｒ−Ｓ配列と称す）が、細胞の接着に必須の単
位であることが、ルオスラティらによって明らかにされ
た〔ネーチャー（ Nature ) 、第３０９巻、第３０〜３
３頁（１９８４）〕。この配列中、ＲＧＤは、細胞の接
着に必須であり、他のアミノ酸に置換することができな
いが、Ｓは他のアミノ酸、例えば、Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｖに置
き換えることができる。しかし、ＰやＫでは活性を示さ
ないことも記載されている。ＲＧＤ配列を含むタンパク
質は、ＦＮのほかに、トロンビン、フォンビルブラント
因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ディスコイディ
ンＩ、λファージレセプターなどが知られており、ＲＧ
Ｄ配列が、タンパク質の機能と深くかかわっていること
が、示唆されている〔プロシーディングズ オブ ザナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ（ Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ）第８１
巻、第５８８５〜５９８８頁（１９８４）〕。しかしな
がら、ＲＧＤ配列がこれらの分子の中で細胞接着活性に
寄与しているかどうかは、なお不明な点が多い。例え
ば、フィブリノーゲンは、Ｒ−Ｓ配列を持っているにも
かかわらず、繊維芽細胞に対して細胞接着活性を示さな
いことが知られている。前記以外の細胞接着活性タンパ
ク質の例として、ラミニンが知られている。ラミニン
は、基底膜に存在する高分子糖タンパク質で、上皮系の
種々の細胞に対する接着活性を有する。この接着に関与
する最小単位として配列表の配列番号２で表すアミノ酸
配列（以下、Ｙ−Ｓ配列と称す）が報告されている〔セ
ル（ Cell) 第４８巻、第９８９〜９９６頁（１９８
７）〕。ラミニンもＲＧＤ配列を含むが、これが細胞接
着に関与しているか否かは不明である。このほか、ＦＮ
の IIIＣＳドメインに存在する配列表の配列番号３で表
すアミノ酸配列（以下、Ｅ−Ｖ配列と称す）がリンパ系
の細胞やメラノーマ細胞の接着に関与するとの知見もあ
る。一方、抗体とは抗原の刺激により生体内でつくら
れ、対応抗原と特異的に結合する活性を有する物質であ
る。免疫グロブリン（Ｉｇ) がその機能を担っており、
ＩｇはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥのクラ
スに分類され、それぞれＨ鎖、Ｌ鎖による多重鎖の基本
構造より成っている。また抗体は定常部と可変部により
構成され、定常部とは遺伝的に決定された恒常的なアミ
ノ酸配列をもった部分であり、可変部とは抗原に対する
抗体の結合部位であり、抗体の抗原への特異性によって
アミノ酸配列は異なっている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】抗体は機能的に多様
で、例えば凝集素、沈降素、溶血素、補体結合抗体、抗
毒素、ウイルス中和抗体、アナフィラキシ−抗体等の機
能が知られている。しかし、前記ＦＮ、ラミニン等と同
様の作用機能での細胞接着活性については知られていな
い。生体防御の場において、貪食作用を示すマクロファ
ージの表面には、Ｒ−Ｓ配列依存性のレセプターの存在
が証明されている〔フェブス レターズ（ＦＥＢＳLett
ers 〕第２４２巻、第３７８〜３８２頁（１９８
９）〕。抗体分子内の適当な領域に細胞接着性ペプチ
ド、例えばＲ−Ｓ配列を導入することにより、異物と抗
体の免疫複合体に対する貪食作用の向上が期待できる。
また他の細胞性免疫担当細胞の活性化も期待できる。更
には生体内で機能している種々の細胞と、該抗体との親
和性を高めることにより、抗体の機能が生体内の各組
織、細胞の場において促進される。すなわち、本発明の
目的は抗原結合活性を有する抗体に、細胞及びマクロフ
ァージに対する親和性が付加された抗体を提供すること
にある。
で、例えば凝集素、沈降素、溶血素、補体結合抗体、抗
毒素、ウイルス中和抗体、アナフィラキシ−抗体等の機
能が知られている。しかし、前記ＦＮ、ラミニン等と同
様の作用機能での細胞接着活性については知られていな
い。生体防御の場において、貪食作用を示すマクロファ
ージの表面には、Ｒ−Ｓ配列依存性のレセプターの存在
が証明されている〔フェブス レターズ（ＦＥＢＳLett
ers 〕第２４２巻、第３７８〜３８２頁（１９８
９）〕。抗体分子内の適当な領域に細胞接着性ペプチ
ド、例えばＲ−Ｓ配列を導入することにより、異物と抗
体の免疫複合体に対する貪食作用の向上が期待できる。
また他の細胞性免疫担当細胞の活性化も期待できる。更
には生体内で機能している種々の細胞と、該抗体との親
和性を高めることにより、抗体の機能が生体内の各組
織、細胞の場において促進される。すなわち、本発明の
目的は抗原結合活性を有する抗体に、細胞及びマクロフ
ァージに対する親和性が付加された抗体を提供すること
にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は人工抗体に関し、抗原結合活性と人
工の細胞接着活性とを有し、配列表の配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有することを特徴とする。また、本
発明の第２の発明は、上記第１の発明の人工抗体をコー
ドするＤＮＡに関する。
発明の第１の発明は人工抗体に関し、抗原結合活性と人
工の細胞接着活性とを有し、配列表の配列番号１で表さ
れるアミノ酸配列を有することを特徴とする。また、本
発明の第２の発明は、上記第１の発明の人工抗体をコー
ドするＤＮＡに関する。
【０００５】本発明において、抗体とは抗原結合活性を
有するものをいい、この免疫学的特性を有するフラグメ
ント、例えばＦａｂフラグメントも使用することができ
る。また人工の細胞接着活性とは、細胞接着活性アミノ
酸配列を、目的の抗体分子にタンパク工学的手法や遺伝
子工学的手法により、挿入又は抗体分子のアミノ酸配列
と置換した結果、新たに発現された、細胞への接着活性
を意味する。細胞接着活性アミノ酸配列とは、例えば前
述のＲＧＤ、Ｙ−Ｒ、Ｅ−Ｖ配列があり、抗体に細胞接
着活性を付与できる配列であれば良い。該細胞接着活性
アミノ酸配列の抗体分子上の位置は、抗体分子の抗原活
性を損なわない位置であれば良いが、三次元構造的に抗
体分子の表面に露出し、親水性に富む領域が好ましい。
用いる細胞接着活性アミノ酸配列、該配列の抗体分子上
の位置を検討し、その細胞接着活性を測定し、最適の人
工抗体を選択すれば良い。
有するものをいい、この免疫学的特性を有するフラグメ
ント、例えばＦａｂフラグメントも使用することができ
る。また人工の細胞接着活性とは、細胞接着活性アミノ
酸配列を、目的の抗体分子にタンパク工学的手法や遺伝
子工学的手法により、挿入又は抗体分子のアミノ酸配列
と置換した結果、新たに発現された、細胞への接着活性
を意味する。細胞接着活性アミノ酸配列とは、例えば前
述のＲＧＤ、Ｙ−Ｒ、Ｅ−Ｖ配列があり、抗体に細胞接
着活性を付与できる配列であれば良い。該細胞接着活性
アミノ酸配列の抗体分子上の位置は、抗体分子の抗原活
性を損なわない位置であれば良いが、三次元構造的に抗
体分子の表面に露出し、親水性に富む領域が好ましい。
用いる細胞接着活性アミノ酸配列、該配列の抗体分子上
の位置を検討し、その細胞接着活性を測定し、最適の人
工抗体を選択すれば良い。
【０００６】遺伝子工学的に発現可能な抗体であれば、
この抗体をコードするＤＮＡ配列内に、前述の細胞接着
活性アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を例えば読取
りフレームが合うように接続し、このＤＮＡ配列を含有
するプラスミドを用い、抗体産生可能な細胞を用い、そ
の形質転換を行えば良い。この形質転換体を組織培養
中、又は生体内で増殖させることにより、目的の人工抗
体を産生させることができる。
この抗体をコードするＤＮＡ配列内に、前述の細胞接着
活性アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を例えば読取
りフレームが合うように接続し、このＤＮＡ配列を含有
するプラスミドを用い、抗体産生可能な細胞を用い、そ
の形質転換を行えば良い。この形質転換体を組織培養
中、又は生体内で増殖させることにより、目的の人工抗
体を産生させることができる。
【０００７】遺伝子工学的に発現される抗体としては、
例えば抗ホスホリルコリンＩｇＧ〔フェブス レター
ズ、第２４４巻、第３０３〜３０６頁（１９８９）〕が
ある。該抗体は、マウス由来抗ホスホリルコリン抗体の
Ｈ鎖可変部をコードするＤＮＡ配列及びヒトＩｇＧガン
マ型Ｈ鎖定常部ＤＮＡ配列を組込んだプラスミドｐＳＶ
２ＨＧ１Ｖｐｃ及びマウス由来抗ホスホリルコリン抗体
のＬ鎖可変部をコードするＤＮＡ配列及びヒトＩｇＧカ
ッパ型Ｌ鎖定常部ＤＮＡ配列を組込んだプラスミドｐＳ
Ｖ２ＨＣκＶｐｃでマウスミエローマＳＰ２／０細胞を
形質転換することにより産生されるヒト／マウスキメラ
型の抗体である。この抗体をコードするＤＮＡ配列、例
えばヒトＩｇＧガンマ型Ｈ鎖定常部ＣＨ３をコードする
ＤＮＡ配列内に、例えば前述のＲ−Ｓ配列をコードする
ＤＮＡ配列が挿入される様に部位特異的変異 ( Site-di
rected mutagenesis ) の手法で細胞接着活性アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を読取りフレームが合うよ
うに接続する。この改変された、ヒトＩｇＧガンマ型Ｈ
鎖定常部をコードするＤＮＡ配列と、マウス由来抗ホス
ホリルコリン抗体のＨ鎖可変部をコードするＤＮＡ配列
を接続し、このＤＮＡ断片を含有するプラスミドと、例
えば前述のプラスミドｐＳＶ２ＨＣκＶｐｃでＳＰ２／
０細胞を形質転換すれば、細胞接着活性アミノ酸配列の
付加された抗ホスホリルコリン抗体産生細胞を得ること
ができる。形質転換体により産生された抗体は、必要に
応じイオン交換クロマトグラフィーやアフィニティーク
ロマトグラフィー等を行うことにより、精製される。
例えば抗ホスホリルコリンＩｇＧ〔フェブス レター
ズ、第２４４巻、第３０３〜３０６頁（１９８９）〕が
ある。該抗体は、マウス由来抗ホスホリルコリン抗体の
Ｈ鎖可変部をコードするＤＮＡ配列及びヒトＩｇＧガン
マ型Ｈ鎖定常部ＤＮＡ配列を組込んだプラスミドｐＳＶ
２ＨＧ１Ｖｐｃ及びマウス由来抗ホスホリルコリン抗体
のＬ鎖可変部をコードするＤＮＡ配列及びヒトＩｇＧカ
ッパ型Ｌ鎖定常部ＤＮＡ配列を組込んだプラスミドｐＳ
Ｖ２ＨＣκＶｐｃでマウスミエローマＳＰ２／０細胞を
形質転換することにより産生されるヒト／マウスキメラ
型の抗体である。この抗体をコードするＤＮＡ配列、例
えばヒトＩｇＧガンマ型Ｈ鎖定常部ＣＨ３をコードする
ＤＮＡ配列内に、例えば前述のＲ−Ｓ配列をコードする
ＤＮＡ配列が挿入される様に部位特異的変異 ( Site-di
rected mutagenesis ) の手法で細胞接着活性アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を読取りフレームが合うよ
うに接続する。この改変された、ヒトＩｇＧガンマ型Ｈ
鎖定常部をコードするＤＮＡ配列と、マウス由来抗ホス
ホリルコリン抗体のＨ鎖可変部をコードするＤＮＡ配列
を接続し、このＤＮＡ断片を含有するプラスミドと、例
えば前述のプラスミドｐＳＶ２ＨＣκＶｐｃでＳＰ２／
０細胞を形質転換すれば、細胞接着活性アミノ酸配列の
付加された抗ホスホリルコリン抗体産生細胞を得ること
ができる。形質転換体により産生された抗体は、必要に
応じイオン交換クロマトグラフィーやアフィニティーク
ロマトグラフィー等を行うことにより、精製される。
【０００８】タンパク工学的手法や、遺伝子工学的手法
により、細胞接着活性アミノ酸配列の付加された抗体の
細胞接着活性は、例えば、ルオスラテイの方法に準じて
測定することができる〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー（ Methods in Enzymology )、第８２巻、第８０３
〜８３１頁、（１９８１）〕。すなわち、試料をＰＢＳ
等に溶かして、マイクロタイタープレートに吸着させ、
ＢＳＡでブロッキングした後、あらかじめ、前培養した
ＢＨＫ又はＮＲＫ細胞を添加し、３７℃でインキュベー
トする。顕微鏡下に、細胞の伸展を観察することによ
り、細胞接着活性の有無を判定する。その結果として、
例えばＲ−Ｓ配列を持たない抗ホスホリルコリンＩｇＧ
は、細胞接着活性を持たないが、Ｒ−Ｓ配列を組込んだ
抗ホスホリルコリンＩｇＧには、細胞接着活性が付加さ
れていることが証明される。また該改変抗体の抗原結合
活性は例えばホスホリルコリン−ＫＬＨへの結合性を測
定することにより証明される。該抗体の細胞接着活性の
発現は組込んだＲ−Ｓ配列に依存しているが、Ｒ−Ｓ配
列のＳは他のアミノ酸、例えばＶ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｆに変
えても細胞接着活性があり、Ｒ−Ｓ配列のＳは、Ｖ、
Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｆ等に置換しても良い。これらのＲ−Ｓ関
連配列、前述のＹ−Ｒ、Ｅ−Ｖ配列等の細胞接着活性ア
ミノ酸配列は遺伝子工学的手法により適当な制限酵素サ
イト部位に、また適当な制限酵素サイトがない場合で
も、部位特異的変異の手法を用いれば、任意の部位に目
的のアミノ酸配列を組込むことができる。しかし、その
結果として、細胞接着活性が付加されるかどうかを予測
することは容易でない。すなわち、組込まれる部位が、
細胞の受容体に認識され得る立体構造を保持しているこ
とが重要である。
により、細胞接着活性アミノ酸配列の付加された抗体の
細胞接着活性は、例えば、ルオスラテイの方法に準じて
測定することができる〔メソッズ イン エンザイモロ
ジー（ Methods in Enzymology )、第８２巻、第８０３
〜８３１頁、（１９８１）〕。すなわち、試料をＰＢＳ
等に溶かして、マイクロタイタープレートに吸着させ、
ＢＳＡでブロッキングした後、あらかじめ、前培養した
ＢＨＫ又はＮＲＫ細胞を添加し、３７℃でインキュベー
トする。顕微鏡下に、細胞の伸展を観察することによ
り、細胞接着活性の有無を判定する。その結果として、
例えばＲ−Ｓ配列を持たない抗ホスホリルコリンＩｇＧ
は、細胞接着活性を持たないが、Ｒ−Ｓ配列を組込んだ
抗ホスホリルコリンＩｇＧには、細胞接着活性が付加さ
れていることが証明される。また該改変抗体の抗原結合
活性は例えばホスホリルコリン−ＫＬＨへの結合性を測
定することにより証明される。該抗体の細胞接着活性の
発現は組込んだＲ−Ｓ配列に依存しているが、Ｒ−Ｓ配
列のＳは他のアミノ酸、例えばＶ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｆに変
えても細胞接着活性があり、Ｒ−Ｓ配列のＳは、Ｖ、
Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｆ等に置換しても良い。これらのＲ−Ｓ関
連配列、前述のＹ−Ｒ、Ｅ−Ｖ配列等の細胞接着活性ア
ミノ酸配列は遺伝子工学的手法により適当な制限酵素サ
イト部位に、また適当な制限酵素サイトがない場合で
も、部位特異的変異の手法を用いれば、任意の部位に目
的のアミノ酸配列を組込むことができる。しかし、その
結果として、細胞接着活性が付加されるかどうかを予測
することは容易でない。すなわち、組込まれる部位が、
細胞の受容体に認識され得る立体構造を保持しているこ
とが重要である。
【０００９】抗体Ｈ鎖定常部に細胞接着活性配列を付加
したアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、Ｈ鎖可変部ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを接続することにより、
細胞接着活性配列を有する抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ
を作成することができる。
したアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、Ｈ鎖可変部ア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡを接続することにより、
細胞接着活性配列を有する抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ
を作成することができる。
【００１０】抗体Ｈ鎖定常部に細胞接着活性配列を付加
したアミノ酸をコードするＤＮＡとしては、例えばヒト
ＩｇＧガンマ型Ｈ鎖定常部ＤＮＡ配列中にＲ−Ｓ配列を
コードするＤＮＡを組込んだ配列表の配列番号４で示す
ＤＮＡであり、該ＤＮＡを組込んだプラスミドｐＳＶ２
・ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２を保有する大腸菌としては、
Escherichia coli ＨＢ１０１／ＣＴ２ 微工研条寄第
３３９９号（ＦＥＲＭＢＰ−３３９９）がある。例え
ば、該微生物より、プラスミドを調製し、該プラスミド
に任意の抗体のＨ鎖可変部をコードするＤＮＡを組込む
ことにより、細胞接着配列を有する抗体Ｈ鎖をコードす
るＤＮＡを有するプラスミドを簡便に調製することがで
きる。次いで例えば対応する抗体Ｌ鎖をコードするＤＮ
Ａを有するプラスミドと共に宿主を形質転換することに
より、人工の細胞接着能の付与された抗体を遺伝子工学
的に製造することができる。任意のＨ鎖可変部とは、例
えばヒト型、マウス型であり、その認識抗原は、例えば
腫瘍抗原、糖鎖抗原である。
したアミノ酸をコードするＤＮＡとしては、例えばヒト
ＩｇＧガンマ型Ｈ鎖定常部ＤＮＡ配列中にＲ−Ｓ配列を
コードするＤＮＡを組込んだ配列表の配列番号４で示す
ＤＮＡであり、該ＤＮＡを組込んだプラスミドｐＳＶ２
・ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２を保有する大腸菌としては、
Escherichia coli ＨＢ１０１／ＣＴ２ 微工研条寄第
３３９９号（ＦＥＲＭＢＰ−３３９９）がある。例え
ば、該微生物より、プラスミドを調製し、該プラスミド
に任意の抗体のＨ鎖可変部をコードするＤＮＡを組込む
ことにより、細胞接着配列を有する抗体Ｈ鎖をコードす
るＤＮＡを有するプラスミドを簡便に調製することがで
きる。次いで例えば対応する抗体Ｌ鎖をコードするＤＮ
Ａを有するプラスミドと共に宿主を形質転換することに
より、人工の細胞接着能の付与された抗体を遺伝子工学
的に製造することができる。任意のＨ鎖可変部とは、例
えばヒト型、マウス型であり、その認識抗原は、例えば
腫瘍抗原、糖鎖抗原である。
【００１１】以上、詳細に説明した様に、本発明によ
り、人工の細胞接着活性が付加され、細胞への親和性が
増強された抗体が提供される。これらの多機能性抗体
は、抗体とエフェクター細胞より成る生体防御の場にお
いて有用である。また、抗体の生体組織への指向性が増
加し、組織での抗体の効果が増強される。
り、人工の細胞接着活性が付加され、細胞への親和性が
増強された抗体が提供される。これらの多機能性抗体
は、抗体とエフェクター細胞より成る生体防御の場にお
いて有用である。また、抗体の生体組織への指向性が増
加し、組織での抗体の効果が増強される。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により限定されるもの
ではない。
明するが、本発明はこれら実施例により限定されるもの
ではない。
【００１３】実施例１ Ｒ−Ｓ配列を含むＩｇＧを発現するプラスミドの構築 本発明者らが先に調製した前述フェブス レターズ記載
のプラスミドｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔにはヒトＩｇＧガ
ンマ鎖の定常部領域をコードする構造遺伝子が含有され
ている。このｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔのプラスミド地図
を図１に、構造遺伝子の一部のＤＮＡ配列を配列表の配
列番号５に示す。すなわち図１はプラスミドｐＳＶ２−
ＨＧ１ｇｐｔの構成を示す図、図２は図１のプラスミド
の一部の、制限酵素の切断部位、及びヒトＩｇＧＨ鎖の
定常部をコードする領域を示す図である。配列表の配列
番号５で表されるＤＮＡ中、塩基番号２０９〜５０２は
ＣＨ１をコードする領域、塩基番号８９１〜９３５はヒ
ンジをコードする領域、塩基番号１０５４〜１３８３は
ＣＨ２をコードする領域、塩基番号１４８０〜１８００
はＣＨ３をコードする領域、塩基番号１８３２〜１８５
１及び塩基番号１９３９〜１９６０はＰＣＲを行うため
のプライマー作成に使用する領域、塩基番号１９０２〜
１９０８はポリ（Ａ）部位である。このｐＳＶ２−ＨＧ
１ｇｐｔの１１５μｇを制限酵素反応用Ｔ−バッファー
（３３mM トリス・酢酸、ｐＨ７．９、１０mM 酢酸マ
グネシウム、０．５mM ジチオスレイトール、６６mM
酢酸カリウム）を含む反応液１０５μｌ中でＳmaＩの５
０ユニットを用いて、３７℃、２時間分解した。この反
応液を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ
ｇＧのガンマ鎖ＣＨ３ドメインをコードする遺伝子を大
部分含む約０．３kbp のＤＮＡ断片を精製した。次に、
プラスミドｐＵＣ１１８の５μｇを制限酵素反応用Ｔ−
バッファーを含む反応液２６μｌ中でＳｍａＩの１０ユ
ニットを用いて３７℃、２時間分解した。この分解反応
液に、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼ０．６ユニッ
トを加え、６５℃、１時間反応させた。この反応液に等
容のＴＥ（１０mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１mM
ＥＤＴＡ）飽和フェノールを加え、かくはんの後、室
温で１２，０００rpm 、５分間遠心し、上清（水層）を
得た。この上清に対し等容のフェノール・クロロホルム
混液（ＴＥ飽和フェノール１容のクロロホルム１容を混
合したもの）を加え、かくはん後、室温で１２，０００
rpm 、５分間遠心し、上清を得た。この上清に対し、等
容のクロロホルムを加え、かくはん後、室温で１２，０
００rpm 、５分間遠心し、上清（水層）を得た。この上
清より、エタノール沈殿法にてＤＮＡ断片を回収した。
このＳmaＩで分解し、脱リン酸化したｐＵＣ１１８と、
先のＩｇＧのガンマ鎖ＣＨ３ドメインをコードする遺伝
子を大部分含む約０．３kbp のＤＮＡをライゲーション
バッファー（６６mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．６、
６．６mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ジチオスレイトール、
０．５mM ＡＴＰ、１０％ ＰＥＧ６０００）中で、３
００ユニットのＴ４ＤＮＡ配列リガーゼを用い、３７
℃、１時間ライゲーション反応を行い、０．３kbp のＤ
ＮＡが組込まれたプラスミドを得た。次にこのプラスミ
ドを用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換した。この転換体を
５０μｇ／mlのアルピシリンを含むＬ−寒天培地プレー
ト（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％
ＮａＣｌ、１．５％ 寒天）に塗布し、プレート上に生
育したコロニーをＬ−ブロス（１％ トリプトン、０．
５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）で培養し、培
養終了後菌体からプラスミドを抽出した。得られたプラ
スミドの一部を用いて、制限酵素反応用Ｔ−バッファー
を含む反応液１０μｌ中で制限酵素ＳmaＩの１０ユニッ
ト、ＲＮase Ａ ０．５μｇを用いて、３７℃、２時間
反応させた。この反応液を６％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、約０．３kbp のバンドの検出を確認し
た。この０．３kbp の検出が確認されたプラスミドを選
択し、これらのプラスミドについては更に、制限酵素反
応用Ｈ−バッファー（５０mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、１０mM ＭｇＣｌ2、１mM ジチオスレイトー
ル、１００mM ＮａＣｌ) を含む反応液２０μｌ中で、
制限酵素ＢamＨＩ １２ユニット、ＮsiＩ １０ユニッ
ト、ＲＮase Ａ ０．５μｇを用いて、３７℃、２時間
反応させた。この反応液を６％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、予測される約２３０bpのバンドの出現
も確認した。前記０．３kbp 及び２３０bpのバンドの出
現するプラスミドを選択し、プラスミドｐＵＣ−ＣＨ３
と命名した。ｐＵＣ−ＣＨ３の構築工程を図３に示す。
のプラスミドｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔにはヒトＩｇＧガ
ンマ鎖の定常部領域をコードする構造遺伝子が含有され
ている。このｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔのプラスミド地図
を図１に、構造遺伝子の一部のＤＮＡ配列を配列表の配
列番号５に示す。すなわち図１はプラスミドｐＳＶ２−
ＨＧ１ｇｐｔの構成を示す図、図２は図１のプラスミド
の一部の、制限酵素の切断部位、及びヒトＩｇＧＨ鎖の
定常部をコードする領域を示す図である。配列表の配列
番号５で表されるＤＮＡ中、塩基番号２０９〜５０２は
ＣＨ１をコードする領域、塩基番号８９１〜９３５はヒ
ンジをコードする領域、塩基番号１０５４〜１３８３は
ＣＨ２をコードする領域、塩基番号１４８０〜１８００
はＣＨ３をコードする領域、塩基番号１８３２〜１８５
１及び塩基番号１９３９〜１９６０はＰＣＲを行うため
のプライマー作成に使用する領域、塩基番号１９０２〜
１９０８はポリ（Ａ）部位である。このｐＳＶ２−ＨＧ
１ｇｐｔの１１５μｇを制限酵素反応用Ｔ−バッファー
（３３mM トリス・酢酸、ｐＨ７．９、１０mM 酢酸マ
グネシウム、０．５mM ジチオスレイトール、６６mM
酢酸カリウム）を含む反応液１０５μｌ中でＳmaＩの５
０ユニットを用いて、３７℃、２時間分解した。この反
応液を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ
ｇＧのガンマ鎖ＣＨ３ドメインをコードする遺伝子を大
部分含む約０．３kbp のＤＮＡ断片を精製した。次に、
プラスミドｐＵＣ１１８の５μｇを制限酵素反応用Ｔ−
バッファーを含む反応液２６μｌ中でＳｍａＩの１０ユ
ニットを用いて３７℃、２時間分解した。この分解反応
液に、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼ０．６ユニッ
トを加え、６５℃、１時間反応させた。この反応液に等
容のＴＥ（１０mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１mM
ＥＤＴＡ）飽和フェノールを加え、かくはんの後、室
温で１２，０００rpm 、５分間遠心し、上清（水層）を
得た。この上清に対し等容のフェノール・クロロホルム
混液（ＴＥ飽和フェノール１容のクロロホルム１容を混
合したもの）を加え、かくはん後、室温で１２，０００
rpm 、５分間遠心し、上清を得た。この上清に対し、等
容のクロロホルムを加え、かくはん後、室温で１２，０
００rpm 、５分間遠心し、上清（水層）を得た。この上
清より、エタノール沈殿法にてＤＮＡ断片を回収した。
このＳmaＩで分解し、脱リン酸化したｐＵＣ１１８と、
先のＩｇＧのガンマ鎖ＣＨ３ドメインをコードする遺伝
子を大部分含む約０．３kbp のＤＮＡをライゲーション
バッファー（６６mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．６、
６．６mM ＭｇＣｌ2 、１０mM ジチオスレイトール、
０．５mM ＡＴＰ、１０％ ＰＥＧ６０００）中で、３
００ユニットのＴ４ＤＮＡ配列リガーゼを用い、３７
℃、１時間ライゲーション反応を行い、０．３kbp のＤ
ＮＡが組込まれたプラスミドを得た。次にこのプラスミ
ドを用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換した。この転換体を
５０μｇ／mlのアルピシリンを含むＬ−寒天培地プレー
ト（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％
ＮａＣｌ、１．５％ 寒天）に塗布し、プレート上に生
育したコロニーをＬ−ブロス（１％ トリプトン、０．
５％ 酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）で培養し、培
養終了後菌体からプラスミドを抽出した。得られたプラ
スミドの一部を用いて、制限酵素反応用Ｔ−バッファー
を含む反応液１０μｌ中で制限酵素ＳmaＩの１０ユニッ
ト、ＲＮase Ａ ０．５μｇを用いて、３７℃、２時間
反応させた。この反応液を６％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、約０．３kbp のバンドの検出を確認し
た。この０．３kbp の検出が確認されたプラスミドを選
択し、これらのプラスミドについては更に、制限酵素反
応用Ｈ−バッファー（５０mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、１０mM ＭｇＣｌ2、１mM ジチオスレイトー
ル、１００mM ＮａＣｌ) を含む反応液２０μｌ中で、
制限酵素ＢamＨＩ １２ユニット、ＮsiＩ １０ユニッ
ト、ＲＮase Ａ ０．５μｇを用いて、３７℃、２時間
反応させた。この反応液を６％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、予測される約２３０bpのバンドの出現
も確認した。前記０．３kbp 及び２３０bpのバンドの出
現するプラスミドを選択し、プラスミドｐＵＣ−ＣＨ３
と命名した。ｐＵＣ−ＣＨ３の構築工程を図３に示す。
【００１４】次に部位特異的変異を行うために、常法に
従い、このｐＵＣ−ＣＨ３を用い、下記の様に１本鎖Ｄ
ＮＡのｄＵ−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３を調製した。す
なわち、まず初めにｐＵＣ−ＣＨ３を用いて、大腸菌Ｍ
Ｖ１１８４を形質転換した。次に、１５０μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬ−寒天培地プレートに形質転換体を
塗布し、プレート上に生育したコロニーの一つを１５０
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロス中で、３７
℃、一晩培養した。次にこの培養液１０μｌを２mlの２
ＹＴ（１．６％ バクトトリプトン、１％ 酵母エキ
ス、０．５％ ＮａＣｌ) に加え、ヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７の２０μｌを添加し、３７℃、３０分間静置
後、７０μｇ／mlの濃度となるようカナマイシンを加
え、３７℃、２３０rpm 、１６時間培養した。この培養
液を１２，０００rpm 、４℃、１０分間遠心し、培養上
清を集め、この上清２０μｌをあらかじめＬ−ブロス中
で培養しておいた大腸菌ＢＷ３１３株に加えて、形質転
換し、この転換体を１５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ−寒天培地プレートに植菌した。３７℃で一晩培養
した後、生育したコロニーを一つ選び、１５０μｇ／ml
のアンピシリンを含む２ＹＴ培地に植菌し、２０μｌの
ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加え、３７℃、３０分
間静置した後、７０μｇ／mlの濃度となるようカナマイ
シンを加え、２３０rpm 、３７℃、一晩培養した。この
培養液１．５mlを、１２，０００rpm 、１０分間遠心
し、１mlの培養上清を回収した。この培養上清に２５０
μｌの２０％ ＰＥＧ６０００−２．５Ｍ ＮａＣｌを
加え、室温で３０分静置した後、１２，０００rpm 、１
０分間遠心し、上清を除き、得られた沈殿に、１００μ
ｌのＴＥを加えて溶かし、次にフェノール抽出を行い、
除タンパク質の後、エタノール沈殿を行い、デオキシウ
リジン（ｄＵ）の取込まれた１本鎖ＤＮＡ、すなわちｄ
Ｕ−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３を得た。
従い、このｐＵＣ−ＣＨ３を用い、下記の様に１本鎖Ｄ
ＮＡのｄＵ−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３を調製した。す
なわち、まず初めにｐＵＣ−ＣＨ３を用いて、大腸菌Ｍ
Ｖ１１８４を形質転換した。次に、１５０μｇ／mlのア
ンピシリンを含むＬ−寒天培地プレートに形質転換体を
塗布し、プレート上に生育したコロニーの一つを１５０
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロス中で、３７
℃、一晩培養した。次にこの培養液１０μｌを２mlの２
ＹＴ（１．６％ バクトトリプトン、１％ 酵母エキ
ス、０．５％ ＮａＣｌ) に加え、ヘルパーファージＭ
１３Ｋ０７の２０μｌを添加し、３７℃、３０分間静置
後、７０μｇ／mlの濃度となるようカナマイシンを加
え、３７℃、２３０rpm 、１６時間培養した。この培養
液を１２，０００rpm 、４℃、１０分間遠心し、培養上
清を集め、この上清２０μｌをあらかじめＬ−ブロス中
で培養しておいた大腸菌ＢＷ３１３株に加えて、形質転
換し、この転換体を１５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ−寒天培地プレートに植菌した。３７℃で一晩培養
した後、生育したコロニーを一つ選び、１５０μｇ／ml
のアンピシリンを含む２ＹＴ培地に植菌し、２０μｌの
ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加え、３７℃、３０分
間静置した後、７０μｇ／mlの濃度となるようカナマイ
シンを加え、２３０rpm 、３７℃、一晩培養した。この
培養液１．５mlを、１２，０００rpm 、１０分間遠心
し、１mlの培養上清を回収した。この培養上清に２５０
μｌの２０％ ＰＥＧ６０００−２．５Ｍ ＮａＣｌを
加え、室温で３０分静置した後、１２，０００rpm 、１
０分間遠心し、上清を除き、得られた沈殿に、１００μ
ｌのＴＥを加えて溶かし、次にフェノール抽出を行い、
除タンパク質の後、エタノール沈殿を行い、デオキシウ
リジン（ｄＵ）の取込まれた１本鎖ＤＮＡ、すなわちｄ
Ｕ−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３を得た。
【００１５】細胞接着活性アミノ酸配列を付加する位置
として、配列表の配列番号５のＣＨ３をコードするＤＮ
Ａ配列中の第１７８８番目のＧと第１７８９番目のＴの
間を選定した。この間に配列表の配列番号６で表すアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入することにより
目的のＲ−Ｓ配列が出現する。部位特異的変異を行うた
めの配列表の配列番号７で表すＤＮＡ断片をＤＮＡ合成
機で合成し、脱保護した後、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で精製した。ｄＵ−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３の
０．２pmolと配列表の配列番号７で表すＤＮＡ鎖の５′
末端をリン酸化した合成ＤＮＡ １pmolと共に２０mM
トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０mM ＭｇＣｌ2 、５
mM ＮａＣｌ、１mM ジチオスレイトールを含む反応液
１０μｌ中で６５℃、１５分間、３７℃、１５分間静置
し、アニールさせた。次に５０mM トリス・ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、０．６０mM 酢酸アンモニウム、５mM Ｍｇ
Ｃｌ2 、５mM ＤＴＴ、１mM ＮＡＤ、０．５mM ｄＮ
ＴＰ（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）を含む反応液２５μｌを加えた
後、１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼと６０ユニッ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、２５℃、１２０分間反
応させ、２本鎖環状ＤＮＡを合成した。合成された２本
鎖環状ＤＮＡの一部を用いて、大腸菌ＢＭＨ７１−１８
mut Ｓ株を形質転換した後、ヘルパーファージＭ１３Ｋ
０７を感染させ、３７℃、２３０rpm で、一晩培養し
た。培養液を１２，０００rpm 、５分間遠心して、培養
上清を調製し、一晩培養しておいて大腸菌ＭＶ１１８４
と混ぜ、１５０μｇ／mlのアンピシリンを含む、Ｌ−寒
天培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。生育したコロ
ニーを２mlの１５０μｇ／mlのアンピシリンを含む２Ｙ
Ｔに植菌し、２０μｌのヘルパーファージＭ１３Ｋ０７
を加え、３７℃、３０分間静置した後、７０μｇ／mlと
なるようにカナマイシンを加え、３７℃、２３０rpm
で、一晩培養した。培養上清を集め、１本鎖ＤＮＡを調
製し、Ｍ１３ジデオキシ法でＤＮＡの塩基配列を分析し
た。配列が、配列表の配列番号８で示すＤＮＡ配列、及
びアミノ酸配列から配列表の配列番号９で示すＤＮＡ配
列、及びアミノ酸配列に変換されているクローンを選
び、２本鎖ＤＮＡを調製した。得られた、新たにＲ−Ｓ
配列をコードするＤＮＡ配列が付加されたプラスミドを
ｐＵＣＣＴ１と命名した。
として、配列表の配列番号５のＣＨ３をコードするＤＮ
Ａ配列中の第１７８８番目のＧと第１７８９番目のＴの
間を選定した。この間に配列表の配列番号６で表すアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入することにより
目的のＲ−Ｓ配列が出現する。部位特異的変異を行うた
めの配列表の配列番号７で表すＤＮＡ断片をＤＮＡ合成
機で合成し、脱保護した後、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で精製した。ｄＵ−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３の
０．２pmolと配列表の配列番号７で表すＤＮＡ鎖の５′
末端をリン酸化した合成ＤＮＡ １pmolと共に２０mM
トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０mM ＭｇＣｌ2 、５
mM ＮａＣｌ、１mM ジチオスレイトールを含む反応液
１０μｌ中で６５℃、１５分間、３７℃、１５分間静置
し、アニールさせた。次に５０mM トリス・ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０、０．６０mM 酢酸アンモニウム、５mM Ｍｇ
Ｃｌ2 、５mM ＤＴＴ、１mM ＮＡＤ、０．５mM ｄＮ
ＴＰ（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）を含む反応液２５μｌを加えた
後、１ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼと６０ユニッ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、２５℃、１２０分間反
応させ、２本鎖環状ＤＮＡを合成した。合成された２本
鎖環状ＤＮＡの一部を用いて、大腸菌ＢＭＨ７１−１８
mut Ｓ株を形質転換した後、ヘルパーファージＭ１３Ｋ
０７を感染させ、３７℃、２３０rpm で、一晩培養し
た。培養液を１２，０００rpm 、５分間遠心して、培養
上清を調製し、一晩培養しておいて大腸菌ＭＶ１１８４
と混ぜ、１５０μｇ／mlのアンピシリンを含む、Ｌ−寒
天培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。生育したコロ
ニーを２mlの１５０μｇ／mlのアンピシリンを含む２Ｙ
Ｔに植菌し、２０μｌのヘルパーファージＭ１３Ｋ０７
を加え、３７℃、３０分間静置した後、７０μｇ／mlと
なるようにカナマイシンを加え、３７℃、２３０rpm
で、一晩培養した。培養上清を集め、１本鎖ＤＮＡを調
製し、Ｍ１３ジデオキシ法でＤＮＡの塩基配列を分析し
た。配列が、配列表の配列番号８で示すＤＮＡ配列、及
びアミノ酸配列から配列表の配列番号９で示すＤＮＡ配
列、及びアミノ酸配列に変換されているクローンを選
び、２本鎖ＤＮＡを調製した。得られた、新たにＲ−Ｓ
配列をコードするＤＮＡ配列が付加されたプラスミドを
ｐＵＣＣＴ１と命名した。
【００１６】次に細胞接着活性アミノ酸を付加する位置
として、配列表の配列番号５の、ＣＨ３をコードするＤ
ＮＡ配列中の第１７０４番目のＣと第１７０５番目のＡ
の間を選定した。この間に配列表の配列番号１０で表す
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入することに
より目的のＲ−Ｓ配列が出現する。部位特異的変異を行
うための配列表の配列番号１１で示すＤＮＡ断片をＤＮ
Ａ合成機で合成し、脱保護した後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で精製した。次に該ＤＮＡ断片と前述ｄＵ
−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３を用い、ｐＵＣＣＴ１の作
成手順に従い、配列が配列表の配列番号１２で示すＤＮ
Ａ配列及びアミノ酸配列から配列表の配列番号１３で示
すＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に変化されているクロー
ンを選び、２本鎖ＤＮＡを調製した。得られた、新たに
Ｒ−Ｓ配列をコードするＤＮＡ配列が付加されたプラス
ミドをｐＵＣＣＴ２と命名した。
として、配列表の配列番号５の、ＣＨ３をコードするＤ
ＮＡ配列中の第１７０４番目のＣと第１７０５番目のＡ
の間を選定した。この間に配列表の配列番号１０で表す
アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を挿入することに
より目的のＲ−Ｓ配列が出現する。部位特異的変異を行
うための配列表の配列番号１１で示すＤＮＡ断片をＤＮ
Ａ合成機で合成し、脱保護した後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で精製した。次に該ＤＮＡ断片と前述ｄＵ
−ssＤＮＡ ｐＵＣ−ＣＨ３を用い、ｐＵＣＣＴ１の作
成手順に従い、配列が配列表の配列番号１２で示すＤＮ
Ａ配列及びアミノ酸配列から配列表の配列番号１３で示
すＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に変化されているクロー
ンを選び、２本鎖ＤＮＡを調製した。得られた、新たに
Ｒ−Ｓ配列をコードするＤＮＡ配列が付加されたプラス
ミドをｐＵＣＣＴ２と命名した。
【００１７】（２）ポリ（Ａ）フラグメントの調製 ＩｇＧガンマ鎖のＣＨ３ドメインをコードしている遺伝
子の下流に転写に関与するポリ（Ａ）部位が存在する。
先の項目の約０．３kbp の断片のすぐ下流から、この領
域を含む断片を調製するために、配列表の配列番号１４
及び配列番号１５でそれぞれ表される二種類のＤＮＡを
前述と同様に合成、リン酸化し、この合成ＤＮＡをプラ
イマーとし、ｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔをテンプレートと
し、ポリメラーゼ チェイン リアクション〔 Polymer
ase chain reaction ：サイキ（Saiki )ら、サイエン
ス（ Science )、第２３０巻、第１３５０〜１３５４頁
（１９８５) 〕を行った。すなわち、これら二種類のプ
ライマーをそれぞれ、１．０μmol とテンプレートＤＮ
Ａを０．１μｇを２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、５０mM ＫＣｌ、１０
mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５mM ＭｇＣｌ
2 、０．０１％ ゼラチンを含む反応液１００μｌ中、
２．５ユニットのタックＤＮＡポリメラーゼを用いて、
両プライマーの間、約１３０bpを増幅した。反応条件は
９４℃、２分間の熱変性工程、３７℃、３分間のアニー
リング工程、７２℃、４分間のＤＮＡ鎖伸長工程の３工
程を順に２５回繰返した。反応後、増幅されたＤＮＡを
フェノール抽出、エタノール沈殿にて回収し、５０μｌ
のＴＥに溶かした。増幅されたＤＮＡをＰＯＬＡＰＣＲ
と命名した。
子の下流に転写に関与するポリ（Ａ）部位が存在する。
先の項目の約０．３kbp の断片のすぐ下流から、この領
域を含む断片を調製するために、配列表の配列番号１４
及び配列番号１５でそれぞれ表される二種類のＤＮＡを
前述と同様に合成、リン酸化し、この合成ＤＮＡをプラ
イマーとし、ｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔをテンプレートと
し、ポリメラーゼ チェイン リアクション〔 Polymer
ase chain reaction ：サイキ（Saiki )ら、サイエン
ス（ Science )、第２３０巻、第１３５０〜１３５４頁
（１９８５) 〕を行った。すなわち、これら二種類のプ
ライマーをそれぞれ、１．０μmol とテンプレートＤＮ
Ａを０．１μｇを２００μＭ ｄＮＴＰ（ｄＧＴＰ、ｄ
ＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ）、５０mM ＫＣｌ、１０
mM トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１．５mM ＭｇＣｌ
2 、０．０１％ ゼラチンを含む反応液１００μｌ中、
２．５ユニットのタックＤＮＡポリメラーゼを用いて、
両プライマーの間、約１３０bpを増幅した。反応条件は
９４℃、２分間の熱変性工程、３７℃、３分間のアニー
リング工程、７２℃、４分間のＤＮＡ鎖伸長工程の３工
程を順に２５回繰返した。反応後、増幅されたＤＮＡを
フェノール抽出、エタノール沈殿にて回収し、５０μｌ
のＴＥに溶かした。増幅されたＤＮＡをＰＯＬＡＰＣＲ
と命名した。
【００１８】（３）ＩｇＧガンマ鎖の定常領域をコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片のサブクローニング プラスミドｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔ ５７．５μｇを制
限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１０５μｌ中
で制限酵素ＥcoＲＩ ３０ユニット、ＢamＨＩ３０ユニ
ットを用いて、３７℃、２時間反応させた。反応液を
０．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約８．５kbp
のバンドを電気溶出法にてゲルより溶出させた。得られ
たＤＮＡ溶液を、フェノール抽出、エタノール沈殿によ
り回収した。回収したＤＮＡは、５０μｌのＴＥに溶か
し、この一部をあらかじめＥcoＲＩとＢamＨＩで分解
し、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し
たベクターｐＵＣ１１８の０．２μｇとライゲーション
バッファーを含む反応液２０μｌ中、３００ユニットの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、３７℃、１時間反応させ
た。この反応液の一部を用いて、大腸菌ＤＨ５を形質転
換した。次に、５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−
寒天培地プレートに生育したコロニーを、５０μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬ−ブロスで、培養し、菌体から
プラスミドを抽出した。この抽出されたプラスミドの一
部を用いて、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応
液１０μｌ中でＥcoＲＩとＢamＨＩそれぞれ１２ユニッ
トとＲＮaseＡ０．５μｇを用いて、３７℃、２時間反
応させた。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約８．５kbp のバンドを検出したプラスミドを選
択し、ｐＵＣ１１８−ＨＧ１と命名した。該プラスミド
の構築図及びその制限酵素の切断部位を示す図を図４に
示す。なお、以下、図中ＥＲはＥcoＲＩ、ＥはＥcoＴ２
２Ｉ、ＢはＢamＨＩをそれぞれ示す。
する遺伝子を含むＤＮＡ断片のサブクローニング プラスミドｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔ ５７．５μｇを制
限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１０５μｌ中
で制限酵素ＥcoＲＩ ３０ユニット、ＢamＨＩ３０ユニ
ットを用いて、３７℃、２時間反応させた。反応液を
０．５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約８．５kbp
のバンドを電気溶出法にてゲルより溶出させた。得られ
たＤＮＡ溶液を、フェノール抽出、エタノール沈殿によ
り回収した。回収したＤＮＡは、５０μｌのＴＥに溶か
し、この一部をあらかじめＥcoＲＩとＢamＨＩで分解
し、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し
たベクターｐＵＣ１１８の０．２μｇとライゲーション
バッファーを含む反応液２０μｌ中、３００ユニットの
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、３７℃、１時間反応させ
た。この反応液の一部を用いて、大腸菌ＤＨ５を形質転
換した。次に、５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−
寒天培地プレートに生育したコロニーを、５０μｇ／ml
のアンピシリンを含むＬ−ブロスで、培養し、菌体から
プラスミドを抽出した。この抽出されたプラスミドの一
部を用いて、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応
液１０μｌ中でＥcoＲＩとＢamＨＩそれぞれ１２ユニッ
トとＲＮaseＡ０．５μｇを用いて、３７℃、２時間反
応させた。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動に
かけ、約８．５kbp のバンドを検出したプラスミドを選
択し、ｐＵＣ１１８−ＨＧ１と命名した。該プラスミド
の構築図及びその制限酵素の切断部位を示す図を図４に
示す。なお、以下、図中ＥＲはＥcoＲＩ、ＥはＥcoＴ２
２Ｉ、ＢはＢamＨＩをそれぞれ示す。
【００１９】（４）改変ｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔの構築 先に得られたｐＵＣＣＴ１の１７．４μｇを６０．
７５μｌの反応液中ＳmaＩ ７．５ユニットを用いて、
反応を行った。反応は、ＳmaＩを加えることによって開
始し、反応開始後、３０、６０、９０、１５０、２１
０、２７０秒に１０μｌの反応液を抜取り、順次、あら
かじめ用意しておいてＴＥ飽和フェノール６０μｌに加
え、強くかくはんすることを繰返し、反応を停止させ
た。フェノール抽出後の反応液から、エタノール沈殿に
よってＤＮＡを回収し、５０μｌのＴＥに溶かし、１．
２ユニットの大腸菌のアルカリ性ホスファターゼを用い
て、６５℃、１時間反応させ、脱リン酸化した。反応液
をフェノール抽出、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを回収
し５０μｌのＴＥに溶かした。この溶液１０μｌと、先
に調製したＰＯＬＡＰＣＲ １０μｌを用いて、ライゲ
ーションバッファーを含む反応液中で、３００ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、３７℃、１時間反応さ
せ、ｐＵＣＣＴ１のＳmaＩ部位分解物と、ＰＯＬＡＰＣ
Ｒとを結合させた。この反応液の一部を用いて、大腸菌
ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、１５０μｇ／mlの
アンピシリンを含むＬ−寒天培地プレートに生育したコ
ロニーを１５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロ
スで培養し、菌体からプラスミドを抽出した。この抽出
されたプラスミドは、５０μｌのＴＥに溶かし、一部を
用いて、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１
５μｌ中で１２ユニットのＢamＨＩと０．５μｌのＲＮ
ase Ａを用いて、３７℃、２時間反応させた。この反応
液を２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約４５０bpに
バンドを検出したプラスミドを選択し、ｐＵＣＣＴ１・
ＰＯＬＡＰＣＲと命名した。該プラスミドの構築図、及
びその制限酵素の切断部位を示す図を図５に示す。な
お、以下、図中黒逆三角印は配列表の配列番号６のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡが付加された部位、ＳはＳ
maＩをそれぞれ示す。次に、このプラスミドｐＵＣＣＴ
１・ＰＯＬＡＰＣＲ ２０μｌを用い、制限酵素反応用
Ｈ−バッファーを含む反応液３０μｌ中、それぞれ１２
ユニットのＥcoＴ２２ＩとＢamＨＩ及び０．２５μｇの
ＲＮase Ａを用いて、３７℃、２時間反応させた。反応
液を２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２２０bpの
バンドをＤＥＡＥ−ペーパーを用いた電気溶出法にてゲ
ルより溶出させ、得られたＤＮＡ溶液から、フェノール
抽出、エタノール沈殿により、ＤＮＡを回収した。回収
されたＤＮＡは、５０μｌのＴＥに溶解し、後述のライ
ゲーション反応に用いた。次に、先に得られたｐＵＣ１
１８−ＨＧ１の２５μｌを用い、制限酵素反応用Ｈ−バ
ッファー３０μｌ中で、ＥcoＲＩ １２ユニット、Ｅco
Ｔ２２Ｉ １２ユニット、ＲＮase Ａ ０．２５μｇと
３７℃、２時間反応させた。反応液は、１％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約１７５０bpのバンドをＤＥＡＥ
−ペーパーを用いた電気溶出法にて、ゲルより溶出さ
せ、得られたＤＮＡ溶液から、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ
は、５０μｌのＴＥに溶かした。更に、前述ｐＳＶ２−
ＨＧ１ｇｐｔ １１．５μｇを制限酵素反応用Ｈバッフ
ァーを含む３０μｌの反応液中、１２ユニットのＥcoＲ
Ｉと１２ユニットのＢamＨＩと３７℃、２時間反応さ
せ、反応液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
４．６kbp のバンドをＤＥＡＥ−ペーパーを用いた電気
溶出方法にて、ゲルより溶出させた。得られたＤＮＡ溶
液から、フェノール抽出、エタノール沈殿方法により、
ＤＮＡを回収し、回収した約４．６kbp のＤＮＡを、５
０μｌのＴＥに溶かした。上述のｐＵＣＣＴ１・ＰＯＬ
ＡＰＣＲより調製した約２２０bpのＤＮＡ断片、ｐＵＣ
１１８−ＨＧ１より調製した約１７５０bpのＤＮＡ断
片、ｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔより調製した約４．６kbp
のＤＮＡ断片の溶液を、それぞれ４μｌ、５μｌ、５μ
ｌ用い、２０μｌのライゲーションバッファー中、３０
０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼと、３７℃、１時間反
応させた。この反応液の一部を用いて、大腸菌ＨＢ１０
１を形質転換し、１５０μｇ／mlのアンピシリンを含む
Ｌ−寒天培地プレートに生育したコロニーを１５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロス中で培養し、プラ
スミドを抽出した。この抽出したプラスミドは、５０μ
ｌのＴＥに溶かした。まず、このプラスミド溶液３μｌ
を制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１０μｌ
中、６ユニットのＥcoＲＩとＥcoＴ２２Ｉ、０．２５μ
ｇのＲＮase Ａと３７℃、１時間反応させ、反応液を２
％アガロースゲル電気泳動にかけ、約1.７５kbp のバン
ドが、検出されることを確認した。また、先に、ポリ
（Ａ）フラグメントの調製に用いた２種類の合成ＤＮＡ
をプライマーとし、これらの選択されたプラスミドをテ
ンプレートとしてポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ンを行い、約１３０bpのＤＮＡ断片が増幅されることを
確認した。得られたプラスミドをｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇ
ｐｔ・ＣＴ１と命名した。該約６．６kbのプラスミドの
構築図及びその制限酵素の切断部位を示す図を図６に示
す。
７５μｌの反応液中ＳmaＩ ７．５ユニットを用いて、
反応を行った。反応は、ＳmaＩを加えることによって開
始し、反応開始後、３０、６０、９０、１５０、２１
０、２７０秒に１０μｌの反応液を抜取り、順次、あら
かじめ用意しておいてＴＥ飽和フェノール６０μｌに加
え、強くかくはんすることを繰返し、反応を停止させ
た。フェノール抽出後の反応液から、エタノール沈殿に
よってＤＮＡを回収し、５０μｌのＴＥに溶かし、１．
２ユニットの大腸菌のアルカリ性ホスファターゼを用い
て、６５℃、１時間反応させ、脱リン酸化した。反応液
をフェノール抽出、エタノール沈殿の後、ＤＮＡを回収
し５０μｌのＴＥに溶かした。この溶液１０μｌと、先
に調製したＰＯＬＡＰＣＲ １０μｌを用いて、ライゲ
ーションバッファーを含む反応液中で、３００ユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、３７℃、１時間反応さ
せ、ｐＵＣＣＴ１のＳmaＩ部位分解物と、ＰＯＬＡＰＣ
Ｒとを結合させた。この反応液の一部を用いて、大腸菌
ＭＶ１１８４を形質転換した。次に、１５０μｇ／mlの
アンピシリンを含むＬ−寒天培地プレートに生育したコ
ロニーを１５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロ
スで培養し、菌体からプラスミドを抽出した。この抽出
されたプラスミドは、５０μｌのＴＥに溶かし、一部を
用いて、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１
５μｌ中で１２ユニットのＢamＨＩと０．５μｌのＲＮ
ase Ａを用いて、３７℃、２時間反応させた。この反応
液を２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約４５０bpに
バンドを検出したプラスミドを選択し、ｐＵＣＣＴ１・
ＰＯＬＡＰＣＲと命名した。該プラスミドの構築図、及
びその制限酵素の切断部位を示す図を図５に示す。な
お、以下、図中黒逆三角印は配列表の配列番号６のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡが付加された部位、ＳはＳ
maＩをそれぞれ示す。次に、このプラスミドｐＵＣＣＴ
１・ＰＯＬＡＰＣＲ ２０μｌを用い、制限酵素反応用
Ｈ−バッファーを含む反応液３０μｌ中、それぞれ１２
ユニットのＥcoＴ２２ＩとＢamＨＩ及び０．２５μｇの
ＲＮase Ａを用いて、３７℃、２時間反応させた。反応
液を２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２２０bpの
バンドをＤＥＡＥ−ペーパーを用いた電気溶出法にてゲ
ルより溶出させ、得られたＤＮＡ溶液から、フェノール
抽出、エタノール沈殿により、ＤＮＡを回収した。回収
されたＤＮＡは、５０μｌのＴＥに溶解し、後述のライ
ゲーション反応に用いた。次に、先に得られたｐＵＣ１
１８−ＨＧ１の２５μｌを用い、制限酵素反応用Ｈ−バ
ッファー３０μｌ中で、ＥcoＲＩ １２ユニット、Ｅco
Ｔ２２Ｉ １２ユニット、ＲＮase Ａ ０．２５μｇと
３７℃、２時間反応させた。反応液は、１％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約１７５０bpのバンドをＤＥＡＥ
−ペーパーを用いた電気溶出法にて、ゲルより溶出さ
せ、得られたＤＮＡ溶液から、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿法によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ
は、５０μｌのＴＥに溶かした。更に、前述ｐＳＶ２−
ＨＧ１ｇｐｔ １１．５μｇを制限酵素反応用Ｈバッフ
ァーを含む３０μｌの反応液中、１２ユニットのＥcoＲ
Ｉと１２ユニットのＢamＨＩと３７℃、２時間反応さ
せ、反応液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
４．６kbp のバンドをＤＥＡＥ−ペーパーを用いた電気
溶出方法にて、ゲルより溶出させた。得られたＤＮＡ溶
液から、フェノール抽出、エタノール沈殿方法により、
ＤＮＡを回収し、回収した約４．６kbp のＤＮＡを、５
０μｌのＴＥに溶かした。上述のｐＵＣＣＴ１・ＰＯＬ
ＡＰＣＲより調製した約２２０bpのＤＮＡ断片、ｐＵＣ
１１８−ＨＧ１より調製した約１７５０bpのＤＮＡ断
片、ｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔより調製した約４．６kbp
のＤＮＡ断片の溶液を、それぞれ４μｌ、５μｌ、５μ
ｌ用い、２０μｌのライゲーションバッファー中、３０
０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼと、３７℃、１時間反
応させた。この反応液の一部を用いて、大腸菌ＨＢ１０
１を形質転換し、１５０μｇ／mlのアンピシリンを含む
Ｌ−寒天培地プレートに生育したコロニーを１５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロス中で培養し、プラ
スミドを抽出した。この抽出したプラスミドは、５０μ
ｌのＴＥに溶かした。まず、このプラスミド溶液３μｌ
を制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１０μｌ
中、６ユニットのＥcoＲＩとＥcoＴ２２Ｉ、０．２５μ
ｇのＲＮase Ａと３７℃、１時間反応させ、反応液を２
％アガロースゲル電気泳動にかけ、約1.７５kbp のバン
ドが、検出されることを確認した。また、先に、ポリ
（Ａ）フラグメントの調製に用いた２種類の合成ＤＮＡ
をプライマーとし、これらの選択されたプラスミドをテ
ンプレートとしてポリメラーゼ・チェイン・リアクショ
ンを行い、約１３０bpのＤＮＡ断片が増幅されることを
確認した。得られたプラスミドをｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇ
ｐｔ・ＣＴ１と命名した。該約６．６kbのプラスミドの
構築図及びその制限酵素の切断部位を示す図を図６に示
す。
【００２０】 先に得られたｐＵＣＣＴ２の２３．２
μｇを制限酵素反応用Ｔ−バッファーを含む反応液３０
２μｌ中でＳmaＩ ２０ユニットを用いて３７℃、１２
時間分解した。この反応液を８％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、約０．３kbp のＤＮＡ断片を精製し
た。このうちの一部をあらかじめＳmaＩで分解し、大腸
菌のアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化したベクタ
ーｐＵＣ１９の１．５μｇとライゲーションバッファー
を含む反応液６０μｌ中、３００ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い、３７℃、１時間反応させた。この反応
液の一部を用いて、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
次に、５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−寒天培地
プレートに生育したコロニーを、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含むＬ−ブロスで培養し、菌体からプラスミド
を抽出した。この抽出されたプラスミドの一部を用い
て、制限酵素反応用Ｔ−バッファーを含む反応液１５μ
ｌ中でＳmaＩ １０ユニットとＲＮase Ａ ０．５μｇ
を用いて、３７℃、２時間反応させた。この反応液を１
％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．３kbp のバン
ドを検出したプラスミドを選択した。これらのプラスミ
ドの一部を更に制限酵素反応用バッファーを含む反応液
１５μｌ中で、それぞれ６ユニットのＥcoＲＩとＥcoＴ
２２Ｉ、０．５μｇのＲＮase Ａを用いて、３７℃、２
時間反応させた。この反応液を６％アクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、約０．２５kbp のバンドを検出したプ
ラスミドを選択した。このプラスミドを、ｐＵＣ１９−
ＣＴ２と命名した。該プラスミドの構築図及びその制限
酵素の切断部位を示す図を図７に示す。なお、以下図中
▽は配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡが付加された部位を示す。次に、このｐＵＣ１９
−ＣＴ２を２０μｇ用い、制限酵素反応用Ｔ−バッファ
ーを含む反応液５２μｌ中で１μｇのＲＮase Ａと３７
℃、１時間反応させた。この後、同反応液に７．５ユニ
ットのＳmaＩを添加し、添加時より３０、６０、９０、
１５０、２１０秒後に１０μｌずつ反応液を抜き取り、
フェノール処理を行い反応を停止させた。反応停止後の
反応液を集め、エタノール沈殿法によりＳmaＩ部分分解
ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを５０μｌのＴＥ
に溶かし２μｌの大腸菌アルカリ性ホスファターゼを加
え、６５℃で１時間反応させた。この反応液を１％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約２kbp のＤＮＡを電気溶
出法にて回収した。回収されたＤＮＡをフェノール処
理、エタノール沈殿法にて精製し、５０μｌのＴＥに溶
かした。この溶液７μｌを前述のＰＯＬＡＰＣＲの８μ
ｌと、ライゲーションバッファーを含む６０μｌの反応
液中、４５０ユニットのリガーゼを用い、３７℃、１時
間反応させた。この反応液の一部を用い、大腸菌ＨＢ１
０１を形質転換させ、５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ−寒天培地プレートに生育したコロニーを５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロスで培養し、菌体か
らプラスミドを抽出した。この抽出されたプラスミド
は、５０μｌのＴＥに溶かし、１１．５μｌを用い、制
限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１５μｌ中、
６ユニットのＢamＨＩとＥcoＲＩと０．５μｇのＲＮas
e Ａを用いて、３７℃、１時間反応させた。この反応液
を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、約０．
４５kbp のバンドを検出したプラスミドを選択した。こ
れらのプラスミドをそれぞれ、１１．５μｌ用い、制限
酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１５μｌ中、６
ユニットのＢamＨＩと０．２５μｇのＲＮase Ａを用い
て、３７℃、１時間反応させた。この反応液を８％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、３．１kbp のバン
ドのみを検出するプラスミドを選択し、ｐＵＣ１９−Ｃ
Ｔ２・ＰＯＬＡＰＣＲと命名した。該プラスミドの構築
図及びその制限酵素の切断部位を示す図を図８に示す。
次に、２０７μｇのｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔを制限酵素
反応用Ｔ−バッファーを含む１０３μｌの反応液中３０
ユニットのＳmaＩを用いて３７℃、１時間、反応を行っ
た。この反応液を用いて、制限酵素反応用Ｈ−バッファ
ーを含む２０６μｌの反応液中３６ユニットのＢamＨＩ
を用い、３７℃、１時間反応させた。この反応液を０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ約６．１kbp のＤＮ
Ａ断片をＤＥＡＥ−ペーパーを用いて精製した。次に
前述のｐＵＣ１９−ＣＴ２を４５μｌ用いて、制限酵素
反応用Ｔ−バッファーを含む反応液中、２０ユニットの
ＳmaＩと、３７℃、１時間反応させた。この反応液を更
に、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液中、２
４ユニットのＥcoＴ２２Ｉと０．５μｇのＲＮase Ａを
用い、３７℃、１時間反応させた。この反応液を２％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約０．２４kbp のＤＮＡ
断片を精製した。次に、先に作成したプラスミドｐＵ
Ｃ１９−ＣＴ２・ＰＯＬＡＰＣＲを用いて、制限酵素反
応用Ｈ−バッファーを含む５０μｌの反応液中で、２４
ユニットのＢamＨＩ、２４ユニットのＥcoＴ２２Ｉと
０．５μｇのＲＮase Ａを用い、３７℃、１時間反応さ
せた。この反応液を、２％アガロースゲル電気泳動にか
け、約０．２１kbp のＤＮＡ断片を精製した。次にこ
れらＤＮＡ断片、、をライゲーションバッファー
を含む反応液中で、３００ユニットのＴ４ＤＮＡリガー
ゼと、３７℃、１時間反応させた。この反応液の一部を
用い、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。次に５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−寒天培地プレートに生育
したコロニーを５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−
ブロスで培養し、菌体からプラスミドを抽出した。この
抽出されたプラスミドの一部を用いて、制限酵素反応用
Ｈ−バッファーを含む反応液１５μｌ中でそれぞれ６ユ
ニットのＥcoＲＩとＢamＨＩ、０．５μｇのＲＮase Ａ
を用いて３７℃、９０分反応させた。この反応液を０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約４．６kbp と
２．０kbp のバンドを検出したプラスミドをｐＳＶ２・
ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２と命名した。該プラスミドの構
築図、及びその制限酵素の切断部位を示す図を図９に示
す。次に該プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
た。この形質転換された大腸菌は Escherichia coli Ｈ
Ｂ１０１／ＣＴ２と命名、表示され、工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第３３９９号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３９９）として寄託されている。該 Escherich
ia coli ＨＢ１０１／ＣＴ２より調製したｐＳＶ２・Ｈ
Ｇ１・ｇｐｔ・ＣＴ２には、任意のＨ鎖可変部をコード
する領域を含むＤＮＡを組込み、改変Ｈ鎖を作成するこ
とができる。
μｇを制限酵素反応用Ｔ−バッファーを含む反応液３０
２μｌ中でＳmaＩ ２０ユニットを用いて３７℃、１２
時間分解した。この反応液を８％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動にかけ、約０．３kbp のＤＮＡ断片を精製し
た。このうちの一部をあらかじめＳmaＩで分解し、大腸
菌のアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化したベクタ
ーｐＵＣ１９の１．５μｇとライゲーションバッファー
を含む反応液６０μｌ中、３００ユニットのＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い、３７℃、１時間反応させた。この反応
液の一部を用いて、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
次に、５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−寒天培地
プレートに生育したコロニーを、５０μｇ／mlのアンピ
シリンを含むＬ−ブロスで培養し、菌体からプラスミド
を抽出した。この抽出されたプラスミドの一部を用い
て、制限酵素反応用Ｔ−バッファーを含む反応液１５μ
ｌ中でＳmaＩ １０ユニットとＲＮase Ａ ０．５μｇ
を用いて、３７℃、２時間反応させた。この反応液を１
％アガロースゲル電気泳動にかけ、約０．３kbp のバン
ドを検出したプラスミドを選択した。これらのプラスミ
ドの一部を更に制限酵素反応用バッファーを含む反応液
１５μｌ中で、それぞれ６ユニットのＥcoＲＩとＥcoＴ
２２Ｉ、０．５μｇのＲＮase Ａを用いて、３７℃、２
時間反応させた。この反応液を６％アクリルアミドゲル
電気泳動にかけ、約０．２５kbp のバンドを検出したプ
ラスミドを選択した。このプラスミドを、ｐＵＣ１９−
ＣＴ２と命名した。該プラスミドの構築図及びその制限
酵素の切断部位を示す図を図７に示す。なお、以下図中
▽は配列表の配列番号１０のアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡが付加された部位を示す。次に、このｐＵＣ１９
−ＣＴ２を２０μｇ用い、制限酵素反応用Ｔ−バッファ
ーを含む反応液５２μｌ中で１μｇのＲＮase Ａと３７
℃、１時間反応させた。この後、同反応液に７．５ユニ
ットのＳmaＩを添加し、添加時より３０、６０、９０、
１５０、２１０秒後に１０μｌずつ反応液を抜き取り、
フェノール処理を行い反応を停止させた。反応停止後の
反応液を集め、エタノール沈殿法によりＳmaＩ部分分解
ＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡを５０μｌのＴＥ
に溶かし２μｌの大腸菌アルカリ性ホスファターゼを加
え、６５℃で１時間反応させた。この反応液を１％アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、約２kbp のＤＮＡを電気溶
出法にて回収した。回収されたＤＮＡをフェノール処
理、エタノール沈殿法にて精製し、５０μｌのＴＥに溶
かした。この溶液７μｌを前述のＰＯＬＡＰＣＲの８μ
ｌと、ライゲーションバッファーを含む６０μｌの反応
液中、４５０ユニットのリガーゼを用い、３７℃、１時
間反応させた。この反応液の一部を用い、大腸菌ＨＢ１
０１を形質転換させ、５０μｇ／mlのアンピシリンを含
むＬ−寒天培地プレートに生育したコロニーを５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−ブロスで培養し、菌体か
らプラスミドを抽出した。この抽出されたプラスミド
は、５０μｌのＴＥに溶かし、１１．５μｌを用い、制
限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１５μｌ中、
６ユニットのＢamＨＩとＥcoＲＩと０．５μｇのＲＮas
e Ａを用いて、３７℃、１時間反応させた。この反応液
を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、約０．
４５kbp のバンドを検出したプラスミドを選択した。こ
れらのプラスミドをそれぞれ、１１．５μｌ用い、制限
酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液１５μｌ中、６
ユニットのＢamＨＩと０．２５μｇのＲＮase Ａを用い
て、３７℃、１時間反応させた。この反応液を８％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、３．１kbp のバン
ドのみを検出するプラスミドを選択し、ｐＵＣ１９−Ｃ
Ｔ２・ＰＯＬＡＰＣＲと命名した。該プラスミドの構築
図及びその制限酵素の切断部位を示す図を図８に示す。
次に、２０７μｇのｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔを制限酵素
反応用Ｔ−バッファーを含む１０３μｌの反応液中３０
ユニットのＳmaＩを用いて３７℃、１時間、反応を行っ
た。この反応液を用いて、制限酵素反応用Ｈ−バッファ
ーを含む２０６μｌの反応液中３６ユニットのＢamＨＩ
を用い、３７℃、１時間反応させた。この反応液を０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ約６．１kbp のＤＮ
Ａ断片をＤＥＡＥ−ペーパーを用いて精製した。次に
前述のｐＵＣ１９−ＣＴ２を４５μｌ用いて、制限酵素
反応用Ｔ−バッファーを含む反応液中、２０ユニットの
ＳmaＩと、３７℃、１時間反応させた。この反応液を更
に、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む反応液中、２
４ユニットのＥcoＴ２２Ｉと０．５μｇのＲＮase Ａを
用い、３７℃、１時間反応させた。この反応液を２％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約０．２４kbp のＤＮＡ
断片を精製した。次に、先に作成したプラスミドｐＵ
Ｃ１９−ＣＴ２・ＰＯＬＡＰＣＲを用いて、制限酵素反
応用Ｈ−バッファーを含む５０μｌの反応液中で、２４
ユニットのＢamＨＩ、２４ユニットのＥcoＴ２２Ｉと
０．５μｇのＲＮase Ａを用い、３７℃、１時間反応さ
せた。この反応液を、２％アガロースゲル電気泳動にか
け、約０．２１kbp のＤＮＡ断片を精製した。次にこ
れらＤＮＡ断片、、をライゲーションバッファー
を含む反応液中で、３００ユニットのＴ４ＤＮＡリガー
ゼと、３７℃、１時間反応させた。この反応液の一部を
用い、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。次に５０μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬ−寒天培地プレートに生育
したコロニーを５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−
ブロスで培養し、菌体からプラスミドを抽出した。この
抽出されたプラスミドの一部を用いて、制限酵素反応用
Ｈ−バッファーを含む反応液１５μｌ中でそれぞれ６ユ
ニットのＥcoＲＩとＢamＨＩ、０．５μｇのＲＮase Ａ
を用いて３７℃、９０分反応させた。この反応液を０．
８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約４．６kbp と
２．０kbp のバンドを検出したプラスミドをｐＳＶ２・
ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２と命名した。該プラスミドの構
築図、及びその制限酵素の切断部位を示す図を図９に示
す。次に該プラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
た。この形質転換された大腸菌は Escherichia coli Ｈ
Ｂ１０１／ＣＴ２と命名、表示され、工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研条寄第３３９９号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３９９）として寄託されている。該 Escherich
ia coli ＨＢ１０１／ＣＴ２より調製したｐＳＶ２・Ｈ
Ｇ１・ｇｐｔ・ＣＴ２には、任意のＨ鎖可変部をコード
する領域を含むＤＮＡを組込み、改変Ｈ鎖を作成するこ
とができる。
【００２１】（５）改変ＩｇＧ発現ベクターの構築 前述のマウス由来抗ホスホリルコリン抗体のＨ鎖可変部
及びヒトＩｇＧガンマ型Ｈ鎖定常部のＤＮＡ配列を含有
するプラスミドｐＳＶ２ＨＧ１Ｖｐｃを１５μｇ用い、
制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む１００μｌの反応
液中、３６ユニットのＥcoＲＩと３７℃、２時間反応さ
せた。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動にか
け、Ｈ鎖可変部をコードする約７．６kbp のバンドをＤ
ＥＡＥ−ペーパーを用いた電気溶出法にて溶出させ、得
られたＤＮＡ溶液からフェノール抽出、エタノール沈殿
によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡは、５０μｌ
のＴＥに溶かした。次に、前述ｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇｐ
ｔ・ＣＴ１の１３．５μｇを制限酵素反応用Ｈ−バッフ
ァーを含む、５３μｌの反応液中、３６ユニットのＥco
ＲＩと３７℃、２時間反応させた後、大腸菌のアルカリ
性ホスファターゼ１．２ユニットを加え、６５℃、１時
間反応させた。この反応液から、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿によりＤＮＡを回収し、５０μｌのＴＥに溶
かした。前述のｐＳＶ２ＨＧ１Ｖｐｃより調製した約
７．６kbp のＤＮＡ断片溶液５μｌと、このｐＳＶ２・
ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ１をＥcoＲＩで分解し、脱リン酸
化し調製した６．６kbp のＤＮＡ断片溶液３μｌをライ
ゲーションバッファーを含む２０μｌの反応液中３００
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼと３７℃、１時間反応さ
せた。この反応液の一部を用いて、大腸菌ＨＢ１０１を
形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−寒
天培地プレートに生育したコロニーを、５０μｇ／mlの
アンピシリンを含むＬ−ブロス中で培養し、プラスミド
を抽出した。抽出したプラスミドを５０μｌのＴＥに溶
かし、一部を用いて制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含
む１０μｌの反応液中、６ユニットのＥcoＲＩと、０．
２５μｇのＲＮase Ａと３７℃、２時間反応させ、反応
液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約７．６kbp
と約６．６kbp のバンドを検出したプラスミドを選択
し、これについて、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含
む１０μｌの反応液中、１２ユニットのＳtuＩと０．２
５μｇのＲＮase Ａと、３７℃、２時間反応させ、反応
液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６．３kbp
と５．４kbp 、２．５kbp のバンドを検出したプラスミ
ドを選択した。選択したプラスミドをｐＳＶ２・ＨＧ１
・Ｖｐｃ・ＣＴ１と命名した。該プラスミドの構築図及
びその制限酵素の切断部位を示す図を図１０に示す。次
に上記方法に準じ、ｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２
のＥcoＲＩ処理物に、ｐＳＶ２ＨＧ１ＶｐｃのＥcoＲＩ
断片を挿入し、Ｈ鎖可変部及びＲ−Ｓ配列が付加された
Ｈ鎖定常部をコードするＤＮＡが組込まれたプラスミド
を調製し、該プラスミドをｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・
ＣＴ２と命名した。該プラスミドの構築図及びその制限
酵素の切断部位を示す図を図１１に示す。
及びヒトＩｇＧガンマ型Ｈ鎖定常部のＤＮＡ配列を含有
するプラスミドｐＳＶ２ＨＧ１Ｖｐｃを１５μｇ用い、
制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含む１００μｌの反応
液中、３６ユニットのＥcoＲＩと３７℃、２時間反応さ
せた。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動にか
け、Ｈ鎖可変部をコードする約７．６kbp のバンドをＤ
ＥＡＥ−ペーパーを用いた電気溶出法にて溶出させ、得
られたＤＮＡ溶液からフェノール抽出、エタノール沈殿
によりＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡは、５０μｌ
のＴＥに溶かした。次に、前述ｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇｐ
ｔ・ＣＴ１の１３．５μｇを制限酵素反応用Ｈ−バッフ
ァーを含む、５３μｌの反応液中、３６ユニットのＥco
ＲＩと３７℃、２時間反応させた後、大腸菌のアルカリ
性ホスファターゼ１．２ユニットを加え、６５℃、１時
間反応させた。この反応液から、フェノール抽出、エタ
ノール沈殿によりＤＮＡを回収し、５０μｌのＴＥに溶
かした。前述のｐＳＶ２ＨＧ１Ｖｐｃより調製した約
７．６kbp のＤＮＡ断片溶液５μｌと、このｐＳＶ２・
ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ１をＥcoＲＩで分解し、脱リン酸
化し調製した６．６kbp のＤＮＡ断片溶液３μｌをライ
ゲーションバッファーを含む２０μｌの反応液中３００
ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼと３７℃、１時間反応さ
せた。この反応液の一部を用いて、大腸菌ＨＢ１０１を
形質転換し、５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬ−寒
天培地プレートに生育したコロニーを、５０μｇ／mlの
アンピシリンを含むＬ−ブロス中で培養し、プラスミド
を抽出した。抽出したプラスミドを５０μｌのＴＥに溶
かし、一部を用いて制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含
む１０μｌの反応液中、６ユニットのＥcoＲＩと、０．
２５μｇのＲＮase Ａと３７℃、２時間反応させ、反応
液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約７．６kbp
と約６．６kbp のバンドを検出したプラスミドを選択
し、これについて、制限酵素反応用Ｈ−バッファーを含
む１０μｌの反応液中、１２ユニットのＳtuＩと０．２
５μｇのＲＮase Ａと、３７℃、２時間反応させ、反応
液を１％アガロースゲル電気泳動にかけ、約６．３kbp
と５．４kbp 、２．５kbp のバンドを検出したプラスミ
ドを選択した。選択したプラスミドをｐＳＶ２・ＨＧ１
・Ｖｐｃ・ＣＴ１と命名した。該プラスミドの構築図及
びその制限酵素の切断部位を示す図を図１０に示す。次
に上記方法に準じ、ｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２
のＥcoＲＩ処理物に、ｐＳＶ２ＨＧ１ＶｐｃのＥcoＲＩ
断片を挿入し、Ｈ鎖可変部及びＲ−Ｓ配列が付加された
Ｈ鎖定常部をコードするＤＮＡが組込まれたプラスミド
を調製し、該プラスミドをｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・
ＣＴ２と命名した。該プラスミドの構築図及びその制限
酵素の切断部位を示す図を図１１に示す。
【００２２】実施例２ 〔Ｒ−Ｓ配列を含むＩｇＧの生産と精製〕 （１）マウス・ミエローマ細胞ＳＰ２／０の形質転換 １０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン５０単位／
ml、ストレプトマイシン ５０μｇ／mlを含むＲＰＭＩ
１６４０培地（以下、基本培地とする）中で、マウス
・ミエローマ細胞ＳＰ２／０を十分に増殖させた培養液
１００mlを２０℃、１０００rpm 、１０分間遠心し、細
胞を集めた。集めた細胞を１０mlのＰＢＳ（８ｇ／ｌ
ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 、０．２ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ）に懸濁
し、２０℃、１０００rpm 、１０分間遠心し、再び細胞
を集め、１０mlのＰＢＳに懸濁する。これを、２０℃、
１０００rpm 、１０分間遠心し、細胞を集めた。この細
胞に、あらかじめｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・ＣＴ１と
マウス由来抗ホスホリルコリン抗体のＬ鎖可変部領域を
コードするＤＮＡ配列とヒトＩｇＧカッパ型Ｌ鎖の定常
部領域をコードするＤＮＡ配列を含む前述のプラスミド
ｐＳＶ２ＣκＶｐｃをそれぞれ５０μｇずつ１mlのＰＢ
Ｓに溶かし、氷中で冷却しておいてＤＮＡ溶液を加え、
懸濁し、遺伝子導入用セルに移し、氷中で１０分間冷却
した後、４５００Ｖ／cm、５０μsec の電気パルスを３
回かけ細胞中へプラスミドを導入した。この後、氷中で
１０分間冷却し、２０mlの基本培地中へ細胞懸濁液を回
収し、３７℃、３日間培養した。この後、基本培地に２
５０μｇ／mlのキサンチン、１０μｇ／mlのミコフェノ
ール酸を含む選択培地と交換し、９６穴の培養皿に移
し、３７℃で培養した。なお、対照区として、マウス由
来抗ホスホリルコリン抗体のＨ鎖可変部領域をコードす
るＤＮＡ配列とヒトＩｇＧガンマ型Ｈ鎖の定常部領域を
コードするＤＮＡ配列を含む前述のプラスミドｐＳＶ２
ＨＧ１Ｖｐｃ、及び前述プラスミドｐＳＶＣκＶｐｃを
用いて、同様にマウス・ミエローマ細胞ＳＰ２／０を形
質転換した。
ml、ストレプトマイシン ５０μｇ／mlを含むＲＰＭＩ
１６４０培地（以下、基本培地とする）中で、マウス
・ミエローマ細胞ＳＰ２／０を十分に増殖させた培養液
１００mlを２０℃、１０００rpm 、１０分間遠心し、細
胞を集めた。集めた細胞を１０mlのＰＢＳ（８ｇ／ｌ
ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎ
ａ2 ＨＰＯ4 、０．２ｇ／ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 ）に懸濁
し、２０℃、１０００rpm 、１０分間遠心し、再び細胞
を集め、１０mlのＰＢＳに懸濁する。これを、２０℃、
１０００rpm 、１０分間遠心し、細胞を集めた。この細
胞に、あらかじめｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・ＣＴ１と
マウス由来抗ホスホリルコリン抗体のＬ鎖可変部領域を
コードするＤＮＡ配列とヒトＩｇＧカッパ型Ｌ鎖の定常
部領域をコードするＤＮＡ配列を含む前述のプラスミド
ｐＳＶ２ＣκＶｐｃをそれぞれ５０μｇずつ１mlのＰＢ
Ｓに溶かし、氷中で冷却しておいてＤＮＡ溶液を加え、
懸濁し、遺伝子導入用セルに移し、氷中で１０分間冷却
した後、４５００Ｖ／cm、５０μsec の電気パルスを３
回かけ細胞中へプラスミドを導入した。この後、氷中で
１０分間冷却し、２０mlの基本培地中へ細胞懸濁液を回
収し、３７℃、３日間培養した。この後、基本培地に２
５０μｇ／mlのキサンチン、１０μｇ／mlのミコフェノ
ール酸を含む選択培地と交換し、９６穴の培養皿に移
し、３７℃で培養した。なお、対照区として、マウス由
来抗ホスホリルコリン抗体のＨ鎖可変部領域をコードす
るＤＮＡ配列とヒトＩｇＧガンマ型Ｈ鎖の定常部領域を
コードするＤＮＡ配列を含む前述のプラスミドｐＳＶ２
ＨＧ１Ｖｐｃ、及び前述プラスミドｐＳＶＣκＶｐｃを
用いて、同様にマウス・ミエローマ細胞ＳＰ２／０を形
質転換した。
【００２３】（２）陽性クローンの選択 ＥＬＩＳＡ用９６穴プラスチックプレートに１０μｇ／
mlの抗マウスＩｇＧ・Ｆａｂ断片モノクローナル抗体Ｐ
ＢＳ溶液を１穴当り５０μｌ入れ、室温で２時間吸着さ
せた。この後、この液を除き、１％ウシ血清アルブミン
ウシＰＢＳ溶液を、１穴当り、４００μｌ加え、室温で
１時間ブロックする。ブロック後、０．０５％ツィーン
( Tween ) ２０を含むＰＢＳ溶液でプレートを３回洗
い、１穴当り５０μｌの培養上清を入れ、室温で１時間
反応させた。反応液、０．０５％ツィーン２０を含むＰ
ＢＳでプレートを洗い、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ
標識・抗ヒトＩｇＧ／Ｆｃ断片抗体（カペル社製）のＰ
ＢＳ溶液を１穴当り５０μｌ添加し、室温で１時間反応
させた。反応後、プレートを０．０５％ツィーン２０を
含むＰＢＳで洗った。洗浄したプレートに過酸化水素・
ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、室温で２０分間反
応後、１Ｍ硫酸で反応を止め、４９２nmの吸収を測定
し、陽性クローンを選択した。得られた陽性クローン
中、最も抗体産生能の高いクローンをミエローマＳＰ２
−ＰＣＣＴ１と命名し、Myeloma ＳＰ２−ＰＣＣＴ１と
表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１１５４７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１５４７) として寄
託されている。
mlの抗マウスＩｇＧ・Ｆａｂ断片モノクローナル抗体Ｐ
ＢＳ溶液を１穴当り５０μｌ入れ、室温で２時間吸着さ
せた。この後、この液を除き、１％ウシ血清アルブミン
ウシＰＢＳ溶液を、１穴当り、４００μｌ加え、室温で
１時間ブロックする。ブロック後、０．０５％ツィーン
( Tween ) ２０を含むＰＢＳ溶液でプレートを３回洗
い、１穴当り５０μｌの培養上清を入れ、室温で１時間
反応させた。反応液、０．０５％ツィーン２０を含むＰ
ＢＳでプレートを洗い、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ
標識・抗ヒトＩｇＧ／Ｆｃ断片抗体（カペル社製）のＰ
ＢＳ溶液を１穴当り５０μｌ添加し、室温で１時間反応
させた。反応後、プレートを０．０５％ツィーン２０を
含むＰＢＳで洗った。洗浄したプレートに過酸化水素・
ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、室温で２０分間反
応後、１Ｍ硫酸で反応を止め、４９２nmの吸収を測定
し、陽性クローンを選択した。得られた陽性クローン
中、最も抗体産生能の高いクローンをミエローマＳＰ２
−ＰＣＣＴ１と命名し、Myeloma ＳＰ２−ＰＣＣＴ１と
表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１１５４７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１５４７) として寄
託されている。
【００２４】（３）次にｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・Ｃ
Ｔ２を用い、上記実施例２−（１）、（２）に準じ処理
を行い、ミエローマＳＰ２／０にｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖ
ｐｃ・ＣＴ２及びｐＳＶ２ＣκＶｐｃを組込み、最も抗
体産生能の高いクローンをミエローマＳＰ２−ＰＣＣＴ
２と命名した。該ミエローマはMyelome ＳＰ２−ＰＣＣ
Ｔ２と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第３３９０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９０) とし
て寄託されている。
Ｔ２を用い、上記実施例２−（１）、（２）に準じ処理
を行い、ミエローマＳＰ２／０にｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖ
ｐｃ・ＣＴ２及びｐＳＶ２ＣκＶｐｃを組込み、最も抗
体産生能の高いクローンをミエローマＳＰ２−ＰＣＣＴ
２と命名した。該ミエローマはMyelome ＳＰ２−ＰＣＣ
Ｔ２と表示し、工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第３３９０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３９０) とし
て寄託されている。
【００２５】（４）ＩｇＧの精製 ミエローマＳＰ２−ＰＣＣＴ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１５
４７）及びミエローマＳＰ２−ＰＣＣＴ２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３９０）をそれぞれ選択培地中で培養し、各５
００mlの培養上清を得た。この培養上清を、ピアス社イ
ムノピュア( Immuno Pure ) ＩｇＧピュリフィケーショ
ン キット( Purification Kit )を用いて精製し、ミエ
ローマＳＰ２−ＰＣＣＴ１から抗体・ＣＴ１、ミエロー
マＳＰ２−ＰＣＣＴ２から抗体・ＣＴ２各約１００μｇ
を得た。また、対照区のミエローマよりも抗体約１００
μｇを調製した。
４７）及びミエローマＳＰ２−ＰＣＣＴ２（ＦＥＲＭ
ＢＰ−３３９０）をそれぞれ選択培地中で培養し、各５
００mlの培養上清を得た。この培養上清を、ピアス社イ
ムノピュア( Immuno Pure ) ＩｇＧピュリフィケーショ
ン キット( Purification Kit )を用いて精製し、ミエ
ローマＳＰ２−ＰＣＣＴ１から抗体・ＣＴ１、ミエロー
マＳＰ２−ＰＣＣＴ２から抗体・ＣＴ２各約１００μｇ
を得た。また、対照区のミエローマよりも抗体約１００
μｇを調製した。
【００２６】実施例３ 〔細胞接着活性の測定〕前例で得られたＲ−Ｓ配列を含
むヒト・マウス・キメラ抗体、ＣＴ１及びＣＴ２、Ｒ−
Ｓ配列を含まない対照のヒト・マウス・キメラ抗体、血
しょうＦＮを用いて、ＢＨＫ細胞に対する細胞接着活性
を測定した。試料はすべて、ＰＢＳに溶かし、９６穴プ
ラスチックプレートに１穴当り５０μｌを添加し、４℃
で一晩吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ １００μｌを加え、室温で３〜４時間インキュ
ベートした後、ＰＢＳで洗浄し接着活性の測定に用い
た。継代培養中のＢＨＫ細胞を、０．２５％ トリプシ
ン、０．０２％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で３７℃、２
分間インキュベートしてはく離した後、１０mlの氷冷し
たＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水（１：１）に懸濁さ
せた。ここで、ＤＭＥは、ダルベッコの最小培地を表
し、ＨＥＰＥＳ生理的食塩水は、１３７mM ＮａＣｌ、
及び３mM ＫＣｌを含む２０mM ＨＥＰＥＳバッファー
（ｐＨ７．１）を表す。遠心分離で上清を除き、細胞を
１mgの大豆・トリプシン・インヒビターを含む氷冷ＤＭ
Ｅ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水１０mlに懸濁させた。遠心
し、細胞を集め、大豆・トリプシン・インヒビターを含
まない氷冷ＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水で洗浄した
後、細胞を５×１０-5−１×１０-6／mlとなるようにＤ
ＭＥに懸濁した。この細胞懸濁液を試料を吸着させたプ
レートに添加し、３７℃で、１時間インキュベートし
た。３７℃のＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水で洗浄
し、未吸着の細胞を除き、残った細胞を４％ホルマリン
／ＰＢＳで固定し、顕微鏡下に細胞の伸展を観察した。
Ｒ−Ｓ配列が導入された各ＩｇＧは細胞接着活性を示
し、対照のＩｇは細胞接着活性を示さない。
むヒト・マウス・キメラ抗体、ＣＴ１及びＣＴ２、Ｒ−
Ｓ配列を含まない対照のヒト・マウス・キメラ抗体、血
しょうＦＮを用いて、ＢＨＫ細胞に対する細胞接着活性
を測定した。試料はすべて、ＰＢＳに溶かし、９６穴プ
ラスチックプレートに１穴当り５０μｌを添加し、４℃
で一晩吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含む
ＰＢＳ １００μｌを加え、室温で３〜４時間インキュ
ベートした後、ＰＢＳで洗浄し接着活性の測定に用い
た。継代培養中のＢＨＫ細胞を、０．２５％ トリプシ
ン、０．０２％ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で３７℃、２
分間インキュベートしてはく離した後、１０mlの氷冷し
たＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水（１：１）に懸濁さ
せた。ここで、ＤＭＥは、ダルベッコの最小培地を表
し、ＨＥＰＥＳ生理的食塩水は、１３７mM ＮａＣｌ、
及び３mM ＫＣｌを含む２０mM ＨＥＰＥＳバッファー
（ｐＨ７．１）を表す。遠心分離で上清を除き、細胞を
１mgの大豆・トリプシン・インヒビターを含む氷冷ＤＭ
Ｅ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水１０mlに懸濁させた。遠心
し、細胞を集め、大豆・トリプシン・インヒビターを含
まない氷冷ＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水で洗浄した
後、細胞を５×１０-5−１×１０-6／mlとなるようにＤ
ＭＥに懸濁した。この細胞懸濁液を試料を吸着させたプ
レートに添加し、３７℃で、１時間インキュベートし
た。３７℃のＤＭＥ／ＨＥＰＥＳ生理的食塩水で洗浄
し、未吸着の細胞を除き、残った細胞を４％ホルマリン
／ＰＢＳで固定し、顕微鏡下に細胞の伸展を観察した。
Ｒ−Ｓ配列が導入された各ＩｇＧは細胞接着活性を示
し、対照のＩｇは細胞接着活性を示さない。
【００２７】実施例４ 〔抗原結合能の測定〕 （１）抗原の合成 改変ＩｇＧの抗原結合能を測定するため、抗原としてホ
スホリルコリン（ＰＣ）をキーホール・リムペット・ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）に結合させたＰＣ−ＫＬＨを合成
した。以下に、その手順を示す。３０mgのｐ−アミノフ
ェニルホスホリルコリンを１．５mlの０．２Ｎの塩酸に
溶かし、０．２Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液を１時間かけ
て過剰量となるように滴下した。この場合、約５００μ
ｌの0.２Ｍ 亜硝酸ナトリウムを要し、ヨウ素−カリウ
ム・デンプン紙により過剰量であることを確認した。こ
の溶液１．２６mlをあらかじめ５６mgのＫＬＨを５mlの
７０mM ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０、８０mM Ｎａ
Ｃｌに溶かした溶液に、室温で１０分間かけて滴下し
た。この後、４℃で１７時間かくはんしながら反応させ
た。反応後、ＰＢＳに対して透析し、ＰＣ−ＫＬＨ溶液
（８mg／ml）を得た。 （２）抗原結合能の測定 １００μｇ／mlのＰＣ−ＫＬＨを含むＰＢＳを９６穴タ
イタープレートに１穴当り、５０μｌ添加し、室温で１
時間吸着させた。吸着後、余分のＰＣ−ＫＬＨ溶液を除
き、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１穴当り１００μｌ添加
し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート
後、０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、改変
ＩｇＧ、ＣＴ１及びＣＴ２、及び対照のＩｇＧ溶液を１
穴当り５０μｌ添加し、室温で１時間インキュベートし
た。インキュベート後、０．１％ツィーン２０を含むＰ
ＢＳで洗浄し、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識抗ヒ
トＩｇＧ・Ｆｃ断片抗体のＰＢＳ溶液を、１穴当り５０
μｌ添加、室温で１時間インキュベートした。インキュ
ベート後、０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄
し、過酸化水素水・ｏ−フェニレンジアミン溶液を添加
し、室温で２０分間反応させ、１Ｍ硫酸で反応を止め
た。反応液の４９２nmの吸収を測定することにより、Ｉ
ｇＧの抗原に対する結合能を測定した。この結果、改変
ＩｇＧ、ＣＴ１及びＣＴ２、及び対照のＩｇＧは抗原に
対し、同程度の結合能を保持していることが確認でき
た。実施例３、及び実施例４の結果を表１に示す。
スホリルコリン（ＰＣ）をキーホール・リムペット・ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）に結合させたＰＣ−ＫＬＨを合成
した。以下に、その手順を示す。３０mgのｐ−アミノフ
ェニルホスホリルコリンを１．５mlの０．２Ｎの塩酸に
溶かし、０．２Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液を１時間かけ
て過剰量となるように滴下した。この場合、約５００μ
ｌの0.２Ｍ 亜硝酸ナトリウムを要し、ヨウ素−カリウ
ム・デンプン紙により過剰量であることを確認した。こ
の溶液１．２６mlをあらかじめ５６mgのＫＬＨを５mlの
７０mM ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０、８０mM Ｎａ
Ｃｌに溶かした溶液に、室温で１０分間かけて滴下し
た。この後、４℃で１７時間かくはんしながら反応させ
た。反応後、ＰＢＳに対して透析し、ＰＣ−ＫＬＨ溶液
（８mg／ml）を得た。 （２）抗原結合能の測定 １００μｇ／mlのＰＣ−ＫＬＨを含むＰＢＳを９６穴タ
イタープレートに１穴当り、５０μｌ添加し、室温で１
時間吸着させた。吸着後、余分のＰＣ−ＫＬＨ溶液を除
き、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを１穴当り１００μｌ添加
し、室温で１時間インキュベートした。インキュベート
後、０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、改変
ＩｇＧ、ＣＴ１及びＣＴ２、及び対照のＩｇＧ溶液を１
穴当り５０μｌ添加し、室温で１時間インキュベートし
た。インキュベート後、０．１％ツィーン２０を含むＰ
ＢＳで洗浄し、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識抗ヒ
トＩｇＧ・Ｆｃ断片抗体のＰＢＳ溶液を、１穴当り５０
μｌ添加、室温で１時間インキュベートした。インキュ
ベート後、０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳで洗浄
し、過酸化水素水・ｏ−フェニレンジアミン溶液を添加
し、室温で２０分間反応させ、１Ｍ硫酸で反応を止め
た。反応液の４９２nmの吸収を測定することにより、Ｉ
ｇＧの抗原に対する結合能を測定した。この結果、改変
ＩｇＧ、ＣＴ１及びＣＴ２、及び対照のＩｇＧは抗原に
対し、同程度の結合能を保持していることが確認でき
た。実施例３、及び実施例４の結果を表１に示す。
【００２８】
【表１】 表 １ ──────────────────────────────────── 試 料 細胞接着活性 抗原結合能 ──────────────────────────────────── ＦＮ ＋＋＋ Ｒ−Ｓ配列が導入されたＩｇＧ ＣＴ１ ＋ ＋ 〃 ＣＴ２ ＋＋ ＋ Ｒ−Ｓ配列が導入されていないＩｇＧ − ＋ ────────────────────────────────────
【００２９】
【発明の効果】以上述べてきたごとく、本発明により、
抗体の抗原結合活性と新たな細胞接着活性を合せ持つ人
工多機能性抗体が提供される。本多機能性抗体は、マク
ロファージの貪食作用を促進し、他のエフェクター細胞
も活性化して生体防御に寄与する有用な物質である。
抗体の抗原結合活性と新たな細胞接着活性を合せ持つ人
工多機能性抗体が提供される。本多機能性抗体は、マク
ロファージの貪食作用を促進し、他のエフェクター細胞
も活性化して生体防御に寄与する有用な物質である。
配列番号：1 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：2 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：3 配列の長さ：5 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：4 配列の長さ：1980 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴： 1-208 E intron 1 209-502 E CDS 503-890 E intron 2 891-935 E CDS 936-1053 E intron 3 1054-1383 E CDS 1384-1479 E intron 4 1480-1821 E CDS 1923-1929 E poly A signal 配列： AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG GCTAAGGTGA 60 GGCAGGTGGC GCCAGCAGGT GCACACCCAA TGCCCATGAG CCCAGACACT GGACGCTGAA 120 CCTCGCGGAC AGTTAAGAAC CCAGGGGCCT CTGCGCCTGG GCCCAGCTCT GTCCCACACC 180 GCGGTCACAT GGCACCACCT CTCTTGCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC 232 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5 TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG 277 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 10 15 20 GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG 322 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 25 30 35 GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC 367 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 40 45 50 CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 412 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 55 60 65 GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC 457 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 70 75 80 AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT 502 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 85 90 95 GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA GCAGGCTCAG CGCTCCTGCC 562 TGGACGCATC CCGGCTATGC AGCCCCAGTC CAGGGCAGCA AGGCAGGCCC CGTCTGCCTC 622 TTCACCCGGA GCCTCTGCCC GCCCCACTCA TGCTCAGGGA GAGGGTCTTC TGGCTTTTTC 682 CCAGGCTCTG GGCAGGCACA GGCTAGGTGC CCCTAACCCA GGCCCTGCAC ACAAAGGGGC 742 AGGTGCTGGG CTCAGACCTG CCAAGAGCCA TATCCGGGAG GACCCTGCCC CTGACCTAAG 802 CCCACCCCAA AGGCCAAACT CTCCACTCCC TCAGCTCGGA CACCTTCTCT CCTCCCAGAT 862 TCCAGTAACT CCCAATCTTC TCTCTGCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT 914 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 1 5 CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC 965 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10 15 TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC 1025 TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG 1077 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC 1122 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 10 15 20 TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC 1167 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 25 30 35 GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG 1212 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 40 45 50 GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC 1257 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 55 60 65 ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 1302 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 70 75 80 CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC 1347 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 85 90 95 CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGGGACCC 1393 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 GTGGGGTGCG AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG 1453 ACCGCTGTAC CAACCTCTGT CCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC 1506 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 1 5 ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC 1551 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 10 15 20 CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG 1596 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 25 30 35 GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG 1641 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 40 45 50 CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG 1686 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 55 60 65 CTC ACC GTG GAC AAG AGC ACC GGC CGG GGC GAC AGC CCT AGG TGG 1731 Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Arg Trp 70 75 80 CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG 1776 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 85 90 95 CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA 1821 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 110 TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC CGGGCTCTCG CGGTCGCACG AGGATGCTTG 1881 GCACGTACCC CCTGTACATA CTTCCCGGGC GCCCAGCATG GAAATAAAGC ACCCAGCGCT 1941 GCCCTGGGCC CCTGCGAGAC TGTGATGGTT CTTTCCACG 1980 配列番号：5 配列の長さ：2009 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴： 1-208 E intron 1 209-502 E CDS 503-890 E intron 2 891-935 E CDS 936-1053 E intron 3 1054-1383 E CDS 1384-1479 E intron 4 1480-1800 E CDS 1902-1908 E poly A signal 配列： AGCTTTCTGG GGCAGGCCAG GCCTGACCTT GGCTTTGGGG CAGGGAGGGG GCTAAGGTGA 60 GGCAGGTGGC GCCAGCAGGT GCACACCCAA TGCCCATGAG CCCAGACACT GGACGCTGAA 120 CCTCGCGGAC AGTTAAGAAC CCAGGGGCCT CTGCGCCTGG GCCCAGCTCT GTCCCACACC 180 GCGGTCACAT GGCACCACCT CTCTTGCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC 232 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 1 5 TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG 277 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 10 15 20 GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG 322 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 25 30 35 GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC 367 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 40 45 50 CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG 412 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 55 60 65 GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC 457 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 70 75 80 AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT 502 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 85 90 95 GGTGAGAGGC CAGCACAGGG AGGGAGGGTG TCTGCTGGAA GCAGGCTCAG CGCTCCTGCC 562 TGGACGCATC CCGGCTATGC AGCCCCAGTC CAGGGCAGCA AGGCAGGCCC CGTCTGCCTC 622 TTCACCCGGA GCCTCTGCCC GCCCCACTCA TGCTCAGGGA GAGGGTCTTC TGGCTTTTTC 682 CCAGGCTCTG GGCAGGCACA GGCTAGGTGC CCCTAACCCA GGCCCTGCAC ACAAAGGGGC 742 AGGTGCTGGG CTCAGACCTG CCAAGAGCCA TATCCGGGAG GACCCTGCCC CTGACCTAAG 802 CCCACCCCAA AGGCCAAACT CTCCACTCCC TCAGCTCGGA CACCTTCTCT CCTCCCAGAT 862 TCCAGTAACT CCCAATCTTC TCTCTGCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT 914 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 1 5 CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGTAAGCCAG CCCAGGCCTC GCCCTCCAGC 965 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 10 15 TCAAGGCGGG ACAGGTGCCC TAGAGTAGCC TGCATCCAGG GACAGGCCCC AGCCGGGTGC 1025 TGACACGTCC ACCTCCATCT CTTCCTCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG 1077 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC 1122 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 10 15 20 TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC 1167 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 25 30 35 GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG 1212 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 40 45 50 GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC 1257 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 55 60 65 ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG 1302 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 70 75 80 CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC 1347 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 85 90 95 CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGTGGGACCC 1393 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 GTGGGGTGCG AGGGCCACAT GGACAGAGGC CGGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGAGAGTG 1453 ACCGCTGTAC CAACCTCTGT CCTACA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC 1506 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 1 5 ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC 1551 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 10 15 20 CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG 1596 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 25 30 35 GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG ACC ACG 1641 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 40 45 50 CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG 1686 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 55 60 65 CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA 1731 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 70 75 80 TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG 1776 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 85 90 95 AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGAGTGCGAC GGCCGGCAAG CCCCGCTCCC 1830 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 10 0 105 CGGGCTCTCG CGGTCGCACG AGGATGCTTG GCACGTACCC CCTGTACATA CTTCCCGGGC 1890 GCCCAGCATG GAAATAAAGC ACCCAGCGCT GCCCTGGGCC CCTGCGAGAC TGTGATGGTT 1950 CTTTCCACGG GTCAGGCCGA GTCTGAGGCC TGAGTGGCAT GAGGGAGGCA GAGCGGGTC 2009 配列番号：6 配列の長さ：4 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：7 配列の長さ：44 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAAGAGCCTC TCCCTCGGCC GGGGCGACTC TCCGGGTAAA TGAG 44 配列番号：8 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列番号：9 配列の長さ：44 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： G AAG AGC CTC TCC CTC GGC CGG GGC GAC TCT CCG GGT AAA TGAG 44 Lys Ser Leu Ser Leu Gly Arg Gly Asp Ser Pro Gly Lys 1 5 10 配列番号：10 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：11 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACCGTGGACA AGAGCACCGG CCGGGGCGAC AGCCCTAGGT GGCAGCAGGG G 51 配列番号：12 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列番号：13 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ACC GTG GAC AAG AGC ACC GGC CGG GGC GAC AGC CCT AGG TGG CAG 45 Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Arg Trp Gln 1 5 10 15 CAG GGG 51 Gln Gly 配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：NO 配列の特徴： 1-20 E primer 配列： GGGCTCTCGC GGTCGCACGA 20 配列番号：15 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセテイカル配列：NO アンチセンス：YES 配列の特徴： 1-29 E primer 配列： CCCGGATCCG TGGAAAGAAC CATCACAGT 29
【図１】プラスミドｐＳＶ２−ＨＧ１ｇｐｔの構成を示
す図である。
す図である。
【図２】図１のプラスミドの一部の、制限酵素の切断部
位及びヒトＩｇＧＨ鎖の定常部をコードする領域を示す
図である。
位及びヒトＩｇＧＨ鎖の定常部をコードする領域を示す
図である。
【図３】プラスミドｐＵＣ−ＣＨ３の構築工程を示す図
である。
である。
【図４】プラスミドｐＵＣ１１８−ＨＧ１の構築工程及
びその制限酵素の切断部位を示す図である。
びその制限酵素の切断部位を示す図である。
【図５】プラスミドｐＵＣＣＴ１・ＰＯＬＡＰＣＲの構
築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図である。
築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図である。
【図６】プラスミドｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ１
の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
【図７】プラスミドｐＵＣ１９−ＣＴ２の構築工程及び
その制限酵素の切断部位を示す図である。
その制限酵素の切断部位を示す図である。
【図８】プラスミドｐＵＣ１９−ＣＴ２・ＰＯＬＡＰＣ
Ｒの構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
Ｒの構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
【図９】プラスミドｐＳＶ２・ＨＧ１・ｇｐｔ・ＣＴ２
の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
【図１０】プラスミドｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・ＣＴ
１の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
１の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
【図１１】プラスミドｐＳＶ２・ＨＧ１・Ｖｐｃ・ＣＴ
２の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
２の構築工程及びその制限酵素の切断部位を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 黒澤 良和 愛知県名古屋市名東区扇町１丁目39番地 (72)発明者 千谷 晃一 愛知県春日井市岩成台８丁目３番地６ (72)発明者 関口 清俊 愛知県名古屋市緑区篠の風１丁目1114番 地 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 16/46 C07K 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (7)
- 【請求項１】 抗原結合活性と、細胞接着活性とを有
し、配列表の配列番号1で表されるアミノ酸配列を有す
ることを特徴とする人工抗体。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列が、抗体分子に挿入、又は抗体分子のアミノ酸と置
換されていることを特徴とする請求項１記載の人工抗
体。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列が、Ｈ鎖定常部に挿入、又はＨ鎖定常部のアミノ酸
配列と置換されている請求項２記載の人工抗体。 - 【請求項４】 抗原結合活性と、細胞接着活性とを有
し、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有す
ることを特徴とする人工抗体をコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列が、抗体分子に挿入、又は抗体分子のアミノ酸と置
換されていることを特徴とする請求項２記載の人工抗体
をコードする請求項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
配列が、Ｈ鎖定常部に挿入、又はＨ鎖定常部のアミノ酸
配列と置換されている人工抗体のＨ鎖定常部をコードす
るＤＮＡを含む請求項５記載のＤＮＡ。 - 【請求項７】 配列表の配列番号４に示される塩基配列
を有する請求項６記載のＤＮＡ。
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| EP91306351A EP0466505B1 (en) | 1990-07-13 | 1991-07-12 | Artificial antibody |
| US08/109,106 US5475100A (en) | 1990-07-13 | 1993-08-19 | Artificial antibody |
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| JP2-184158 | 1990-07-13 | ||
| JP16252191A JP3283041B2 (ja) | 1990-07-13 | 1991-06-07 | 人工抗体 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP16252191A Expired - Fee Related JP3283041B2 (ja) | 1990-07-13 | 1991-06-07 | 人工抗体 |
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| EP (1) | EP0466505B1 (ja) |
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