ES2295292T3 - Anticuerpo monoclonal anti-nucleo de vhc. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal anti-nucleo de vhc. Download PDFInfo
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Abstract
Una línea celular de hibridoma correspondiente al número de la ATCC, PTA-3799.
Description
Anticuerpo monoclonal
anti-núcleo de VHC.
Aproximadamente 170 millones de personas en todo
el mundo se han infectado por el virus de la hepatitis C (VHC). En
los próximos años, el número de muertes en los EE.UU. por cáncer y
enfermedad hepática producida por el VHC puede superar las muertes
producidas por el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
(SIDA).
La transmisión del VHC parece requerir un
contacto sanguíneo. Portando una única hebra de ácido ribonucleico
(ARN), el VHC sólo contiene un gen, que codifica un poliproteína que
se rompe posteriormente dando al menos 10 proteínas funcionales.
Claramente, la capacidad para someter a prueba el aporte de sangre
para detectar VHC es de gran importancia. Un ensayo sensible que
puede detectar la infección en una fase temprana. Por tanto sería
ventajosa la detección tanto de anticuerpos como de antígenos de VHC
en un único ensayo.
Los ensayos de detección del núcleo de VHC
capturan el antígeno de VHC de las muestras infectadas por VHC
sobre una fase sólida revestida con anticuerpos monoclonales
anti-núcleo. La proteína del núcleo capturada se
detecta mediante una reacción de unión con un anticuerpo monoclonal
anti-núcleo marcado con una enzima usando
tecnología de inmunoensayo convencional. La disponibilidad de buenos
anticuerpos monoclonales frente a múltiples epítopos de antígeno
del núcleo de VHC aumentará la sensibilidad de los ensayos de
detección del antígeno de VHC. En primer lugar, múltiples
anticuerpos aumentan la eficacia de la captura del antígeno de VHC
de las muestras sobre la fase sólida. En segundo lugar, el uso de
múltiples anticuerpos para la detección aumenta la sensibilidad del
sistema proporcionando una señal acumulativa superior. Otra ventaja
es que el uso de anticuerpos que reconocen múltiples epítopos en
los ensayos permite a los ensayos detectar muestras infectadas con
diferentes genotipos del virus VCH.
El documento FR 2 775 690 describe anticuerpos
monoclonales específicos para la proteína del núcleo de virus de la
hepatitis C (VHC) que se unen a un epítopo que comprende uno de los
siguientes aminoácidos de la proteína del núcleo;
18-25, 29-36 ó
57-64.
El documento WO 00/63444 describe un
procedimiento para detectar directamente el virus de la hepatitis C
en un suero fraccionado o no fraccionado de un paciente, que
comprende detectar el virus con cebadores correspondientes al ARN
viral que codifica proteína del núcleo.
El documento EP 0 388 232 describe la
identificación de un nuevo virus, el virus de la hepatitis C (VHC),
que ha demostrado ser el principal agente etiológico de la NANBH de
transmisión hemática. La invención incluye la aplicación de las
secuencias y polipéptidos en inmunoensayos y la producción de
anticuerpos anti-VHC.
La presente solicitud describe una biblioteca de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra diversas regiones de la
proteína del núcleo de VHC. Estos anticuerpos reconocen diez (10)
epítopos diferentes en la región del núcleo de VHC y se extienden
por toda la proteína del núcleo. Los epítopos reconocidos por estos
anticuerpos monoclonales tienen de cinco a ocho
(5-8) aminoácidos ("aa") de longitud. Estos
anticuerpos en parejas individuales o parejas múltiples son útiles
para detectar la proteína del núcleo de VHC en pacientes infectados
por VHC. Específicamente, estos anticuerpos son ventajosos para
detectar el VHC en la sangre de seres humanos infectados.
Finalmente, estos anticuerpos junto con proteínas recombinantes
confeccionadas de manera apropiada pueden usarse para la detección
simultánea de la proteína del núcleo de VHC y anticuerpos
anti-VHC.
Se han desarrollado varios anticuerpos
monoclonales anti-núcleo de VHC. Estos anticuerpos
tienen propiedades únicas porque reconocen secuencias cortas, en la
región del núcleo de VHC que no tiene epítopos principales
reconocidos por los anticuerpos humanos anti-VHC.
Estos anticuerpos pueden ser reactivos útiles para detectar
antígeno del núcleo de VHC en muestras de sangre de individuos
infectados con el VHC. El reconocimiento de epítopos cortos por
estos anticuerpos monoclonales y la ubicación de estas secuencias en
la región del núcleo de VHC hace a estos anticuerpos monoclonales
muy útiles para el desarrollo de un ensayo de combinación
antígeno/anticuerpo de VHC. Para el ensayo de combinación se usan
estos anticuerpos monoclonales en combinación con el antígeno del
núcleo que se ha modificado para eliminar la capacidad de estos
antígenos para unirse a estos anticuerpos monoclonales pero que
conservan su capacidad para unirse a anticuerpos humanos
anti-VHC. Por tanto, las proteínas del núcleo de
VHC usadas para capturar los anticuerpos presentes en el suero
infectado no reaccionarán con los anticuerpos monoclonales frente
al núcleo de VHC utilizados en la prueba para capturar
simultáneamente los antígenos presentes en el suero infectado. Un
ensayo de combinación puede detectar una infección por VHC antes
que el ensayo de anticuerpos frente a VHC empleado actualmente.
La presente invención se refiere a una línea
celular de hibridoma correspondiente al número de la ATCC,
PTA-3799, anticuerpos secretados por este
hibridoma, al uso de esos anticuerpos para detectar la proteína del
núcleo de VHC y a kits que contienen esos anticuerpos.
La eficacia y las ventajas de la invención se
ilustran de manera adicional mediante los siguientes ejemplos.
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Los inmunógenos utilizados para producir los
anticuerpos fueron una proteína recombinante del núcleo de longitud
completa ("FLC") (aminoácidos (aa) 1-191);
proteína del núcleo de VHC, c22-3, expresada en
levadura como un proteína de fusión SOD (aa 1-120);
y péptidos sintéticos grandes, tales como ODS243 (aa
70-110); y péptidos de 15 unidades monoméricas
conjugados con hemocianina de lapa californiana (KLH) que contienen
secuencias de antígeno del núcleo de VHC.
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Se generaron los anticuerpos usando
procedimientos convencionales. Véase, por ejemplo, Ed Harlow y David
Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor,
Capítulo 6. Se inmunizaron ratones con los inmunógenos descritos en
el presente documento. Se extrajo la sangre de los ratones y se
examinó con varias proteínas recombinantes y péptidos de la
secuencia del núcleo de VHC. Se prepararon anticuerpos monoclonales
puros mediante cromatografía de afinidad por proteína A. Se
determinó la especificidad precisa de los anticuerpos monoclonales
uniendo los octapéptidos solapantes contenidos en cada uno de los
correspondientes péptidos de 15 unidades monoméricas. Se mapearon
la mayor parte de los anticuerpos en una región de
6-8 aminoácidos en la secuencia de proteína del
núcleo de VHC.
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Se caracterizaron los anticuerpos monoclonales
mediante ELISA usando péptidos sintéticos solapantes de
aproximadamente 15 aa de longitud. Los anticuerpos se
caracterizaron adicionalmente para determinar su especificidad
precisa mediante ELISA peptídico usando octapéptidos solapantes
incluidos en el péptido reactivo de 15 unidades monoméricas. En la
tabla siguiente se incluye un resumen de los anticuerpos generados.
La invención se refiere al anticuerpo secretado a partir del
hibridoma con número de acceso de la ATCC, PTA-3799.
Los 14 anticuerpos restantes se incluyen sólo por referencia.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La tabla a continuación identifica 15
anticuerpos novedosos. La invención se refiere al anticuerpo
secretado a partir del hibridoma con número de acceso de la ATCC,
PTA-3799. Los 14 anticuerpos restantes se incluyen
sólo por referencia. Se examinaron los anticuerpos en cada fase de
desarrollo del anticuerpo con placas de microtitulación de pocillos
recubiertas con inmunógeno. El inmunógeno utilizado para inmunizar
los ratones que producían cada cepa de anticuerpo monoclonal se
identifica como uno de los siguientes: péptido ODS 243, un péptido
grande definido adicionalmente en el ejemplo 1; "FLC" significa
antígeno del núcleo de longitud completa, definido en el ejemplo 1;
o péptido nº 8 del núcleo conjugado con KLH, un péptido corto,
definido adicionalmente en el presente documento. Se muestra la
especificidad de cada uno para un péptido enumerado, y se
identifican en el presente documento las secuencias de aminoácidos
de cada péptido enumerado. Además, en la última columna está
incluido el epítopo al que se une específicamente el anticuerpo,
definido por los aminoácidos que codifican el epítopo.
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TABLA 1 de
referencia
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La tabla a continuación muestra péptidos
sintéticos del núcleo de VHC.
\newpage
TABLA 2 de
referencia
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La tabla a continuación muestra la selección del
anticuerpo identificado como PTA-3811 con placas de
ELISA revestidas con péptidos del núcleo de VHC.
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TABLA 3 de
referencia
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Mapeo de epítopos del anticuerpo monoclonal
PTA-3811 usando octapéptidos solapantes.
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El anticuerpo monoclonal 7B4F11 reaccionó con
los octapéptidos 8.2, 8.3, 8.4, 8.5 en un ELISA de
quimioluminiscencia medido en unidades luminosas arbitrarias (ALU).
Basándose en la reactividad de los octapéptidos, el epítopo
monoclonal está centrado alrededor de la secuencia PWPL.
<110> Ortho-Clinical
Diagnostics, Inc.
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<120> Anticuerpos monoclonales
anti-núcleo de VHC
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Claims (4)
1. Una línea celular de hibridoma
correspondiente al número de la ATCC, PTA-3799.
2. Un anticuerpo monoclonal secretado por la
línea celular de hibridoma según la reivindicación 1.
3. El uso del anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 2 para detectar antígeno del núcleo de VHC.
4. Kits de ensayo que contienen el anticuerpo
monoclonal según la reivindicación 2.
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