ES2260570T3

ES2260570T3 - Pirrolobenziodiazepinas dimericas.

Info

Publication number: ES2260570T3
Application number: ES03028817T
Authority: ES
Inventors: David Edwin Thurston; Philip Wilson Howard
Original assignee: ADC Products UK Ltd
Current assignee: ADC Products UK Ltd
Priority date: 1998-08-27
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2019-08-27
Also published as: ATE320436T1; DE69930328T2; ATE294803T1; WO2000012508A3; DE69930328D1; EP1109812B1; DE69907977T2; EP1109812A2; AU757510C; PT1413582E; US7049311B1; AU757510B2; NZ510493A; DE69907977D1; EP1193270A3; US7067511B2; PT1193270E; EP1413582A1; JP2002525285A; EP1413582B1

Abstract

Compuesto de **fórmula**. El compuesto es 1,1¿-[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(11aS)-7-metoxi-2-metilideno-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona]. La presente invención es el uso de un compuesto para ser utilizado en un procedimiento de tratamiento por terapia. Las condiciones que se pueden tratar son las afecciones genéticas, tales como las afecciones neoplásicas y la enfermedad de Alzheimer, así como infecciones bacterianas, parasíticas y virales. Toda condición que pueda tratarse mediante regulación de la expresión genética podrá tratarse mediante los compuestos de la invención. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, los compuestos contemplados pueden ser administrados a individuos. La administración se realiza preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz".

Description

Pirrolobenziodiazepinas diméricas.

La presente invención se refiere a pirrolobenzodiazepinas (PBD).

Antecedentes de la invención

Algunas pirrolobenzodiazepinas (PBD) tienen la capacidad de reconocer y unirse a secuencias específicas de ADN; la secuencia preferida es PuGPu. El primer antibiótico antitumoral de PBD, antramicina, se descubrió en 1965 (Leimgruber et al., 1965 J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795; Leimgruber et al., 1965 J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793). Desde entonces, han salido a la luz varias PBD que se encuentran en estado natural y se han desarrollado más de 10 vías sintéticas para conseguir distintos análogos (Thurston et al., 1994 Chem. Rev. 1994, 433-465). Son miembros de la misma familia la abeimicina (Hochlowski et al., 1987 J. Antibiotics, 40, 145-148), la quicamicina (Konishi et al., 1984 J. Antibiotics, 37, 200-206), el DC81 (patente japonesa 58-180 487; Thurston et al., 1990, Chem. Brit., 26, 767-772; Bose et al., 1992 Tetrahedron, 48, 751-758), la macetramicina (Kuminoto et al., 1980 J. Antibiotics, 33, 665-667), las neotramicinas A y B (Takeuchi et al., 1976 J. Antibiotics, 29, 93-96), la porotramicina (Tsunakawa et al., 1988 J. Antibiotics, 41, 1366-1373), la protracarcina (Shimizu et al., 1982 J. Antibiotics, 29, 2492-2503; Langley y Thurston, 1987 J. Org. Chem., 52, 91-97), la sibanomicina (DC-102) (Hara et al., 1988 J. Antibiotics, 41, 702-704; Itoh et al., 1988 J. Antibiotics, 41, 1281-1284), la sibiromicina (Leber et al., 1988 J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993) y la tomamicina (Arima et al., 1972 J. Antibiotics, 25, 437-444). Las PBD tienen la estructura
general:

1

Se distinguen por el número, tipo y posición de los sustituyentes, tanto en los anillos A aromáticos como en los anillos C de pirrol, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B hay una imina (N=C), una carbinolamina (NH-CH(OH)) o un metil éter de carbinolamina (NH-CH(OMe)) en la posición N10-C11, que es el centro electrofílico responsable de la alquilación del ADN. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuración en (S) en la posición C11a quiral, lo que les confiere un giro hacia la derecha cuando se visualizan desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les confiere la forma tridimensional adecuada para la isohelicidad con el surco menor del ADN de forma B, lo que comporta un encaje perfecto en la zona de unión (Kohn, 1975 en Antibiotics III. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 3-11; Hurley y Needham-VanDevanter, 1986 Acc. Chem. Res., 19, 230-237). Su capacidad para formar un complejo de inclusión en el surco menor les permite interferir en el procesamiento del ADN, de donde se deriva su uso como agentes antitumorales.

La síntesis y actividad biológica de la PBD 80 insaturada C2/C2'-exo (UP2001) ha sido descrita por Gregson y colegas (Gregson et al., 1999 Chem. Commun., 797-798).

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Descripción resumida de la invención

Un primer aspecto de la presente invención hace referencia a un compuesto de fórmula:

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El compuesto según el primer aspecto es 1,1'-[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(11aS)-7-metoxi-2-metilideno-1,2,3,
11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-ona].

Un segundo aspecto de la presente invención es el uso de un compuesto tal y como se ha descrito en el primer aspecto de la invención para ser utilizado en un procedimiento de tratamiento por terapia. Las condiciones que se pueden tratar son las afecciones genéticas, tales como las afecciones neoplásicas y la enfermedad de Alzheimer, así como infecciones bacterianas, parasíticas y virales. Toda condición que pueda tratarse mediante regulación de la expresión genética podrá tratarse mediante los compuestos de la invención. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, los compuestos contemplados pueden ser administrados a individuos. La administración se realiza preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo esta suficiente para presentar ventajas para el paciente. Estas ventajas pueden ser al menos la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, así como la frecuencia y el periodo de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se trate. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, son responsabilidad del facultativo y demás doctores en
medicina.

Los compuestos pueden administrarse por separado o junto con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o secuencialmente en función de la condición a tratar.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención, y para ser utilizadas según la presente invención, pueden comprender, además del principio activo, es decir, un compuesto según el primer aspecto, un excipiente farmacéuticamente aceptable, un portador, un tampón, un estabilizador u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Estos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral o por inyección, por ejemplo, cutánea, subcutánea o intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden adoptar la forma de comprimido, cápsula, polvos o líquido. Los comprimidos pueden incluir un portador sólido o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Las cápsulas pueden incluir un portador sólido tal como gelatina.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en la zona afectada, el principio activo adoptará la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que esté exenta de pirógeno y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. El experto en la materia estará capacitado para preparar soluciones adecuadas mediante, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer o inyección de lactato de Ringer. Pueden incluirse, según sea necesario, conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes u otros
aditivos.

Un tercer aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que contiene un compuesto del primer aspecto y un portador farmacéuticamente aceptable o diluyente. La preparación de composiciones farmacéuticas se describe en relación con el segundo aspecto de la invención anterior.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto del primer aspecto para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad genética, preferiblemente una enfermedad proliferativa. El compuesto de la fórmula puede prepararse junto con un portador farmacéuticamente aceptable o diluyente. Los compuestos pueden utilizarse para la eliminación selectiva de células tumorales óxicas e hipóxicas en métodos para el tratamiento de cánceres, por ejemplo, leucemias y, en particular, cánceres sólidos tales como tumores de colon, del SNC, renales y pulmonares, incluidos el carcinoma pulmonar microcítico y los melanomas. Los compuestos del primer aspecto pueden utilizarse especialmente para la eliminación selectiva de tumores pulmonares, de colon y del SNC y melanomas.

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Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un compuesto del primer aspecto para preparar un medicamento para el tratamiento de una infección viral, parasítica o bacteriana. La preparación de medicamentos se describe en relación con al quinto aspecto de la invención anterior.

En otros aspectos, la invención proporciona procedimientos para preparar compuestos según el primer aspecto de la presente invención.

Los distintos aspectos de la invención se describirán a continuación con mayor detalle y haciendo referencia a las figuras adjuntas, donde:

La figura 1 es una vía de síntesis para el compuesto de la presente invención.

Estrategias sintéticas generales preferidas

Una etapa clave de una vía preferida para conseguir un compuesto de la presente invención es una ciclización para producir el anillo B, que conlleva la generación de un aldehído (o un equivalente funcional del mismo) en lo que será la posición 11, y un ataque en el mismo por el nitrógeno Pro-N10.

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En esta estructura no se muestra sustitución del anillo C. R_{8} representa O(CH_{2})_{n}CH_{2}COR'_{8} en compuestos de formula IV. R_{10} es un grupo protector de nitrógeno, preferiblemente con una funcionalidad de carbamato, enlazado con el nitrógeno de la PBD. El "aldehído enmascarado" -CPQ puede ser un acetal o tioacetal (posiblemente cíclico), en cuyo caso la ciclización conlleva enmascaramiento. Alternativamente, el aldehído enmascarado puede ser un precursor de aldehído, tal como alcohol -CHOH, en cuyo caso la reacción conlleva oxidación, por ejemplo, por medio de TPAP o DMSO (oxidación de Swern).

El compuesto de aldehído enmascarado puede producirse mediante la condensación de una pirrolidona correspondiente sustituida en la posición 2 con un ácido 2-nitrobenzoico.

5

A continuación, el grupo nitro puede reducirse a -NH_{2} y protegerse mediante la reacción con un reactivo adecuado, por ejemplo, un cloroformato, lo que proporciona el grupo protector de nitrógeno eliminable en la vía de
síntesis.

En el esquema 1 se muestra un procedimiento que comprende el procedimiento de oxidación-ciclización (más adelante se describirá una ciclización alternativa en relación con el esquema 2).

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Esquema 1

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El enlace de imina/carbinolamina en la PBD (A) puede desprotegerse mediante métodos estándar para dar el compuesto deseado, por ejemplo, si R_{10} es aliloxicarbonilo, la desprotección se lleva a cabo con paladio para eliminar el grupo protector N10, seguido de la eliminación de agua para dar la imina.

La exposición del alcohol (B) (en el que el nitrógeno Pro-N10 generalmente está protegido como carbamato) a tetrapropilamonio perrutenato (TPAP)/N-metilmorfolina N-oxido (NMO) en tamices A4 produce oxidación acompañada de cierre espontáneo del anillo B para conseguir el producto deseado. El procedimiento de oxidación con TPAP/NMO resulta especialmente adecuado para las reacciones a pequeña escala, mientras que los métodos de oxidación a base de DMSO, especialmente la oxidación de Swern, son más adecuados para los trabajos a gran escala (por ejemplo > 1 g).

El alcohol no ciclizado (B) puede prepararse mediante la reacción de un reactivo protector de nitrógeno de fórmula D, que es preferiblemente un cloroformato o cloruro de ácido, en una solución del aminoalcohol C, generalmente en solución, generalmente en presencia de una base tal como piridina (preferiblemente 2 equivalentes), a una temperatura moderada (por ejemplo a 0ºC). En estas condiciones generalmente se observa poca o ninguna O-acilación.

El aminoalcohol clave C puede prepararse reduciendo el compuesto nitro E correspondiente mediante un procedimiento que deje el resto de la molécula intacta. El tratamiento de E con cloruro de estaño (II) en un disolvente adecuado, por ejemplo, metanol bajo reflujo, generalmente da, después de retirar las sales de estaño, el producto deseado con un gran rendimiento.

La exposición de E a hidracina/níquel Raney evita la producción de sales de estaño y puede dar un mayor rendimiento de C, aunque este procedimiento es menos compatible con la gama de posibles sustituyentes de los anillos C y A. Por ejemplo, si existe insaturación del anillo C (ya sea en el propio anillo o en R_{2} o R_{3}), esta técnica puede ser inadecuada.

El compuesto nitro de fórmula E puede prepararse por acoplamiento del cloruro de o-nitrobenzoílo adecuado a un compuesto de fórmula F, por ejemplo en presencia de K_{2}CO_{3} a -25ºC en una atmósfera de N_{2}. Los compuestos de fórmula F pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, mediante olefinación de la cetona derivada de L-transhidroxiprolina. El producto intermedio de cetona también puede emplearse mediante conversión al triflato de enol en las reacciones de acoplamiento por medio de paladio.

El cloruro de o-nitrobenzoílo se sintetiza a partir del ácido o-nitrobenzoico (o alquil éster después de hidrólisis) de fórmula G, que a su vez se prepara a partir del derivado H de ácido vanílico (o alquil éster). Muchos de estos compuestos están comercialmente disponibles y algunos de ellos se describen en Althuis, T.H. y Hess, H.J., J. Medicinal Chem., 20(1), 146-266 (1977).

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Esquema 2

Ciclización alternativa (esquema 2)

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En el esquema 1, la última o penúltima etapa era una ciclización oxidativa. En el esquema 2 se muestra una alternativa mediante acoplamiento de tioacetal. El enmascaramiento por medio de mercurio provoca la ciclización del compuesto de PBD protegido (A).

El compuesto de tioacetal puede prepararse como se indica en el esquema 2: el anillo C protegido de tioacetal [preparado según un procedimiento de la literatura: Langley, D.R. y Thurston, D.E., J. Organic Chemistry, 52, 91-97 (1987)] se acopla al ácido o-nitrobenzoico (o alquil éster después de hidrólisis) (G) según un procedimiento de la literatura. El compuesto nitro resultante no puede ser reducido por hidrogenación debido al grupo tioacetal, de manera que se utiliza el procedimiento del cloruro de estaño (II) para obtener la amina. A continuación, esta se protege con N, por ejemplo, mediante reacción con un cloroformato o un cloruro de ácido, tal como 2,2,2-tricloroetilcloro-
formato.

En esta vía pueden utilizarse como alternativa anillos C que contienen acetal con desprotección por otros procedimientos, tales como el uso de condiciones acídicas.

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(Esquema pasa a página siguiente)

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Esquema 3

Síntesis de dímeros (esquema 3)

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Los dímeros de PBD de la invención pueden sintetizarse mediante la estrategia desarrollada para la síntesis de los monómeros de PBD protegidos. Las vías de síntesis ilustradas en el esquema 3 muestran compuestos cuando el enlace del dímero tiene la fórmula -O-(CH_{2})_{n}-O- La etapa de formación del dímero generalmente se realiza para formar un bis(ácido nitro) G'. A continuación, este compuesto puede tratarse como compuesto G en los esquemas 1 ó 2 anteriores.

El bis(ácido nitro) G' puede obtenerse por nitración (por ejemplo, con 70% de ácido nítrico) de bis(ácido carboxílico). Este puede sintetizarse mediante alquilación de dos equivalentes del ácido benzoico relevante con el diyodoalcano adecuado en condiciones básicas. Muchos ácidos benzoicos están comercialmente disponibles y otros pueden sintetizarse mediante procedimientos convencionales. Alternativamente, los ésteres del ácido benzoico relevante pueden juntarse mediante una eterificación de Mitsunobo con un alcanodiol adecuado, seguido de nitración y posteriormente de hidrólisis (no ilustrado).

Una síntesis alternativa del bis(ácido nitro) comprende la oxidación del bis(aldehído nitro), por ejemplo, con permanganato de potasio. A su vez, este puede obtenerse por nitración directa del bis(aldehído), por ejemplo, con 70% de HNO_{3}. Finalmente, el bis(aldehído) puede obtenerse mediante la eterificación de Mitsunobu de dos equivalentes del aldehído benzoico con el alcanodiol adecuado.

Una vía de síntesis alternativa a las descritas anteriormente consiste en proteger la posición Pro-N10 del componente que formará el anillo A antes de juntar el componente que formará el anillo C.

Estrategias preferidas de síntesis de los compuestos

La vía de síntesis del esquema 1 generalmente se puede aplicar a los compuestos de la presente invención.

Las PBD insaturadas C2 pueden sintetizarse a partir de sus precursores protegidos de carbamato N10. Generalmente, puede utilizarse la eliminación catalizada por paladio de un alilcarbamato para generar la imina N10-C11 sin que ello afecte a la insaturación C2 clave. Alternativamente, puede utilizarse un par cadmio-plomo para escindir un N10-2,2,2-tricloroetilcarbamato de la PBD protegida.

La reducción del compuesto nitro E tal y como se muestra en el esquema 1 con cloruro de estaño (II) mantiene la insaturación C2, aunque el aislamiento de la anilina C de las sales de estaño puede ser problemático.

El compuesto de fórmula F puede utilizarse en su forma protegida con TBDMS y, en consecuencia, debe incluirse una etapa de desprotección para producir el compuesto de aminoalcohol E.

El éter TBDMS de tipo E, que es el producto del acoplamiento del compuesto protegido con TBDMS con el cloruro de o-nitrobenzoílo adecuado, puede tratarse con AcOH:THF:H_{2}O (3:1:1). TBAF resultó ser inadecuado para esta transformación debido a la rápida degradación de los productos de reacción.

Los compuestos F(II) que proporcionan el anillo C pueden obtenerse como se muestra en el esquema 4.

Esquema 4

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La trans-4-hidroxi-L-prolina F8 comercialmente disponible puede protegerse con N-aliloxicarbonilo para dar el alilcarbamato F7 que posteriormente puede esterificarse mediante condiciones estándar. La reducción con hidruro del éster F6 da el diol F5. La protección selectiva con TBDMS del diol da un silil éter F4 que posteriormente puede oxidarse mediante la oxidación de Swern o TPAP para dar la cetona F3.

La función olefínica C2 presente en F2 puede introducirse mediante la reacción de Wittig en la cetona F3. La escisión por paladio del grupo protector de N-aliloxicarbonilo (Dangles, O.; Guibé, F.; Balavoine, G.; Lavielle, S.; Marquet, A.; J. Org. Chem. 1987, 52, 4984) da el compuesto F(II).

Vía alternativa para obtener el compuesto C

Esquema 5

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Se ha desarrollado una vía alternativa para obtener el compuesto C (esquema 5). La amida de fórmula C1 puede sintetizarse formando el cloruro de ácido de un ácido antranílico de tipo C2 protegido con N-tricloroetiloxicarbonilo. Cabe destacar que los ácidos antranílicos de N-tricloroetiloxicarbonilo no generan anhídridos isatoicos, lo que permite las reacciones de formación de amidas con aminas de tipo F(II). La escisión simultánea por TBAF de los grupos 2,2,2-tricloroetil carbamato y TBDMS de C1 puede proporcionar el aminoalcohol C clave.

Vía alternativa

Esquema 6

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Se ha desarrollado una vía sintética más lineal para obtener el compuesto B del esquema 1 que permite una producción a mayor escala de las PBD insaturadas C2, la cual se muestra en el esquema 6. Puede utilizarse la escisión por TBAF del grupo TBDMS para producir B(II) a partir de B1(II). La insaturación C2 clave presente en B1(II) puede introducirse mediante la reacción de olefinación de Wittig en una cetona de tipo B2. La oxidación de Swern del alcohol secundario B3 puede utilizarse para dar la cetona B2. La anilina B3 protegida con carbamato puede prepararse a partir del compuesto nitro B5 en dos etapas. En primer lugar, el grupo nitro puede reducirse a anilina mediante el método níquel Raney/hidracina porque un compuesto de tipo B5 carece de insaturación C2. Este método es más ventajoso que el procedimiento de cloruro de estaño (II) ya que el producto resulta más fácil de aislar. A continuación, la anilina B4 puede protegerse con N-carbamato a gran escala sin formación significativa de carbonato en el oxígeno C2.

Puede sintetizarse una amida de tipo B5 acoplando un cloruro de ácido de tipo G a la amina KEC5 clave
(esquema 7).

Esquema 7

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En líneas generales, esta vía presenta varias ventajas respecto a la vía anterior, lo que conduce a una producción a mayor escala de las PBD endo-insaturadas C2/C3. En primer lugar, la hidrogenación catalítica de KEC4 permite la preparación a gran escala del producto intermedio KEC5 clave. En segundo lugar, esta etapa de reducción de nitro más eficaz puede llevarse a cabo en un producto intermedio desprovisto de insaturación C2. Hay que recalcar que la migración de doble enlace observada en la reacción de Horner-Emmons es espontánea, por lo que no es necesario un exceso de hidruro de sodio. Esta migración del doble enlace también ha sido apuntada por otros autores (Leimgruber, W.; Batcho, A.D.; Czajkowski, R.C. J. Am. Chem. Soc. 1968, 90, 5641).

La hidrogenación Parr de KEC4, con el fin de escindir el grupo protector Cbz, permitió la síntesis a gran escala del producto intermedio amino KEC5 clave. El éter TBDMS KEC4 se preparó por sililación selectiva del alcohol primario KEC3, que se consiguió utilizando DBU como agente de transferencia de sililo. El diol KEC3 se obtuvo por reducción con hidruro del éster KEC2 que a su vez se sintetizó del ácido carboxílico KEC1. La protección con N-Cbz de la trans-4-hidroxi-L-prolina (F4) se consiguió adoptando un procedimiento mencionado en la literatura (Bridges, R.J.; Stanley, M.S.; Anderson, M.W; Cotman, C.W; Chamberlain, R.A. J. Med. Chem. 1991, 34, 717).

En la síntesis de dímeros, las vías especificadas más arriba pueden utilizarse de forma preferente a las especificadas en las estrategias sintéticas generales. En particular, el grupo protector de nitrógeno puede ser ventajosamente un carbamato, ya que los grupos protectores de este tipo pueden eliminarse en la etapa final por distintos procedimientos que, por lo general, no afectan a la insaturación C2 clave.

Procedimientos experimentales generales

Los puntos de fusión (mp) se determinaron en un aparato digital Gallenkamp P1384 para puntos de fusión y no están rectificados. Los espectros de infrarrojos (IR) se registraron con un espectrofotómetro Perkin-Elmer 297. Los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C se registraron en un espectrómetro de RMN JEOL GSX FT de 270 MHz que funcionaba a 20ºC \pm 1ºC. Los desplazamientos químicos se dan en partes por millón (\delta) en campos menores al del tetrametilsilano (TMS). La multiplicidad de spin se describe de la siguiente manera: s (singlete), bs (singlete ancho), d (doblete), dd (doblete de dobletes), t (triplete), q (cuadruplete), p (quintuplete) o m (multiplete). El espectro de masas (MS) se registró con un espectrómetro de masas JEOL JMS-DX 303 GC (modo EI: 70 eV, fuente 117-147ºC). Las masas moleculares precisas (HRMS) se determinaron por comparación de picos utilizando perfluorokeroseno (PFK) como marcador interno de masas, y se obtuvieron espectros de masas FAB a partir de una matriz de glicerol/tioglicerol/ácido trifluoroacético (1:1:0,1) con una temperatura fuente de 180ºC. Las rotaciones ópticas en la línea Na-D se obtuvieron a temperatura ambiente con un polarímetro Perkin-Elmer 141. Los resultados analíticos se encontraban por regla general dentro de \pm 0,2% de los valores teóricos. Se realizó cromatografía flash con "Silica Gel-60" de Aldrich (E. Merck, 230-400 mallas). Se realizó cromatografía en capa fina (TLC) mediante gel de sílice GF254 (con indicador fluorescente) en placas de vidrio. Todos los disolventes y reactivos, a menos que se indique lo contrario, fueron suministrados por Aldrich Chemical Company Ltd. y se utilizaron tal cual sin purificación adicional. Se prepararon disolventes anhidros por destilación en atmósfera de nitrógeno seco en presencia de un agente secante adecuado, y se almacenaron en tamices moleculares de 4 \ring{A} o hilo de sodio. El éter de petróleo se refiere a la fracción que hierve a 40-60ºC.

Ejemplos

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Ejemplo 1 Síntesis de 1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(11aS)-7-metoxi-2-metilideno-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c] [1,4]benzodiazepin-5-ona] (218) (Véase Figura 1a/b)

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Preparación del dímero nitro 1',5'-bis[2-metoxi-4(metoxicarbonil)fenoxi]pentano (208)

Se añadió gota a gota dietil azidodicarboxilato sólo (19.02 ml, 21.04 g, 120.8 mmol) durante 30 minutos a una solución agitada de vanilato de metilo (207) (20 g, 109.8 mmol) y trifenilfosfina (43.2 g, 164.7 mmol) en THF anhidro (400 ml) y la mezcla de reacción se dejó agitar a 0ºC durante 1 hora. La mezcla de reacción fría se trató gota a gota durante 20 minutos con una solución de 1,5-pentanodiol (206) (3.83 ml, 4.03 g, 53.0 mmol) en THF (4 ml). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante toda la noche a temperatura ambiente y el producto precipitado (208) se recogió por filtración al vacío. Precipitó la dilución del filtrado con metanol además del producto (208). El precipitado combinado (12.3 g, 52% basado en pentanodiol) se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional: ^{1}H NMR (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.65 (dd, 2H, J = 2.01, 8.42 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 2.01 Hz), 6.87 (d, 2H, J = 8.42 Hz), 4.10 (t, 4H, J = 6.59 Hz), 3.90 (s, 6H), 3.89 (s, 6H), 2,10-1.90 (m, 4H), 1.85-1.26 (m, 2H).

1',5'-bis[2-metoxi-4(metoxicarbonil)-5-nitrofenoxi]pentano (209)

Se añadió lentamente nitrato de cobre (II) sólido trihidratado (16,79 g, 69,5 mmol) a una solución agitada del bis-éster (208) (12 g, 27,8 mmol) en anhídrido acético (73 ml) a 0ºC. La mezcla de reacción se dejó en agitación durante 1 hora a 0ºC, el hielo se eliminó y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente a una exotérmica suave, c. 40ºC, acompañada de la formación de NO_{2} que tiene lugar en esta etapa. Se continuó durante 2 horas después de que la exotérmica hubiera disminuido con agitación a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se vertió en agua helada y la suspensión acuosa se dejó en agitación durante 1 hora. El precipitado amarillo resultante se recogió mediante filtración al vacío y se secó al aire hasta obtener el compuesto bis-nitro deseado (209) (14.23 g, 98%): ^{1}H NMR (400 MHz, CDCl_{3}+ DMSO) \delta 7.45 (s, 2H), 7.09 (s, 2H), 4.14 (t, 4H, J = 6.31 Hz), 3.97 (s, 6H), 3.90 (s, 6H), 2.20-1.94 (m, 4H), 1.75-1.70 (m, 2H).

1',5'-bis(4-carboxi-2-metoxi-5-nitrofenoxi)pentano (210)

Se agitó una suspensión del éster 209 (9,0 g, 17,2 mmol) en hidróxido sódico acuoso (1 M, 180 ml) y THF (180 ml) hasta que se obtuvo una solución homogénea (2 días). El THF se evaporó a presión reducida y la suspensión acuosa resultante se filtró para eliminar el material de partida no reaccionado. El filtrado se ajustó a pH 1, el producto precipitado se recogió por filtración y se secó con aire para dar el bis-ácido deseado (210) (8,88 g). Se obtuvo un rendimiento superior al teórico debido a la inclusión de la sal sódica de ácido. La sal puede extraerse disolviendo todo el material en THF y extrayendo el material insoluble por filtración: RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 07.39 (s, 2H), 7.16 (s, 2H), 4.12 (t, 4H, J = 6.59 Hz), 3.95 (s, 6H), 2.00-1.85 (m, 4H), 1.75-1.67 (m, 2H).

Ensamblaje del producto intermedio bis-cetona 1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(2-nitro-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]-bis[(2S,4R)-2-t-butildimetilsililoximetil-4-hidroxipirrolidina] (211)

Se añadió una cantidad catalítica de DMF (5 gotas) a una suspensión agitada del ácido 210 (5,39 g, 10,9 mmol) y cloruro de oxalilo (3,47g, 2.38 ml, 27,3 mmol) en THF anhidro (50 ml). Se observó una efervescencia inicial seguida de la formación de una solución homogénea; sin embargo, después de agitación durante toda la noche, se formó una suspensión del cloruro de ácido recién formado. Se eliminó el exceso de THF y el cloruro de oxalilo por evaporación rotativa a presión reducida y se formó una nueva suspensión con el cloruro de ácido en THF nuevo (49 ml). La solución de cloruro de ácido se añadió gota a gota a una solución de la (2S,4R)-2-t-butildimetilsililoximetil-4-hidroxipirrolidina (2) (6,3 g, 27,3 mmol), trietilamina (4,42 g, 6,09 ml, 43,7 mmol) y agua (1,47 ml) en THF (33 ml) a 0ºC en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se continuó la agitación durante 3 horas. El exceso de THF se eliminó por evaporación rotativa a presión reducida y el residuo resultante se dividió entre agua (300 ml) y acetato de etilo (300 ml).

Se dejó que las capas se separaran y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml). A continuación, las capas orgánicas combinadas se lavaron con cloruro de amonio (150 ml), bicarbonato sódico saturado (150 ml), salmuera (150 ml) y se secaron sobre sulfato de magnesio. La filtración seguida de evaporación rotativa a presión reducida dio el producto crudo en forma de aceite oscuro. El producto crudo se sometió a cromatografía de columnas flash (3% metanol, 97% cloroformo) y se aisló el exceso de eluyente (211) (3,70 g, 37% rendimiento): RMN ^{1}H (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.65 (s, 2H), 6.77 (s, 2H), 4.52 (bs, 2H), 4.40 (bs, 2H), 4.17-4.10 (m, 6H), 3.92 (s, 6H), 3.77 (d, 2H, J = 10.26 Hz), 3.32 (td, 2H, J = 4.40, 11.35 Hz), 3.08 (d, 2H, J = 11.35 Hz), 2.37-2.27 (m, 2H), 2.10-2.00 (m, 6H), 1.75-1.60 (m, 2H), 0.91 (s, 18H), 0.10 (s, 12H).

1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(2-amino-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]-bis[(2S,4R)-2-t-butildimetilsililoxi- metil-4-hidroxipirrolidina] (212)

Se añadió gota a gota una solución metanólica de hidrato de hidracina (1,25 ml, 1,29 g, 40,2 mmol de hidracina, 20 ml de metanol) a una solución del compuesto bis-nitro 211 (3,6 g, 3,91 mmol) en metanol (68 ml) bajo reflujo suave sobre níquel Raney (510 mg de una suspensión espesa). Al cabo de 5 minutos bajo reflujo, la TLC (10% MeOH, 90% cloroformo) mostró el consumo incompleto del material de partida. La mezcla de reacción se trató con níquel Raney adicional (aproximadamente 510 mg) e hidracina (1,25 ml) en metanol (20 ml), de manera que el material de partida se consumió por completo. Se añadió exceso de níquel Raney a la mezcla de reacción para descomponer el hidrato de hidracina no reaccionado y, a continuación, la mezcla de reacción se dejó enfriar. La mezcla de reacción se filtró con celita para eliminar el exceso de níquel Raney y el tampón de filtro se lavó con metanol adicional (atención: el níquel Raney es pirofórico; no dejar que el tampón de filtro se seque; utilícese HCl concentrado para destruir el níquel). El filtrado combinado se evaporó por evaporación rotativa a presión reducida y el residuo se redisolvió en diclorometano. La solución de diclorometano se secó sobre sulfato de magnesio (para eliminar el agua asociada a la hidracina), se filtró y se evaporó para dar el producto (212) en forma de espuma (3,37 g, 91%): RMN ^{1}H (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 6.69 (s, 2H), 6.24 (s, 2H), 4.40-3.40 (m, 28H), 2.40-1.60 (m, 10H), 0.88 (s, 18H), 0.03 (s, 12H).

1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[2-amino-N-aliloxicarbonil-5-metoxi-1,4-fenilen)-carbonil]]-bis[(2S,4R)-2-t-butildimetilsililoximetil-4-hidroxipirrolidina] (213)

Se añadió gota a gota una solución de cloroformato de alilo (0,806 ml, 0,916 g, 7,6 mmol) en diclorometano seco (63 ml) a una solución de la bis-amina 212 (3,27 g, 3,8 mmol) y piridina (1,26 g, 1,29 ml, 15,9 mmol) en diclorometano (128 ml) a 0ºC en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 16 horas, en cuyo momento la TLC (10% MeOH, 90% cloroformo) mostró que la reacción había finalizado. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con sulfato de cobre II saturado (2 x 140 ml), agua (120 ml) y cloruro sódico saturado (120 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y se evaporó a presión reducida para dar 213 en forma de espuma (3,60 g, 92%): RMN ^{1}H (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.87 (bs, 2H), 7.66 (s, 2H), 6.77 (s, 2H), 6.05-5.80 (m, 2H), 5.40-5.15 (m, 4H), 4.70-4.50 (m, 6H), 4.38 (bs, 2H), 4.20-4.00 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.70-3.40 (m, 8H), 2.40-2.20 (m, 2H), 2.10-1.80 (m, 6H), 1.75-1.55 (m, 2H), 0.89 (s, 18H), 0.04 (s, 12H).

1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[2-amino-N-aliloxicarbonil-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]-bis[(2S)-2-t-butil- dimetilsililoximetil-4-oxo-pirrolidina] (214)

Se añadió una solución de sulfóxido de dimetilo (1,47 ml, 1,62 g, 20,7 mmol) en diclorometano seco (32 ml) gota a gota durante 45 minutos a una solución agitada de cloruro de oxalilo (5,18 ml de una solución 2M en diclorometano, 10,35 mmol) a -60ºC en atmósfera de nitrógeno. Después de agitación a -50ºC durante 30 minutos, se añadió gota a gota una solución del bis-alcohol 213 (3,55 g, 3,45 mmol) en diclorometano (53 ml) durante un periodo de 50 minutos. La mezcla de reacción se agitó a -60ºC durante 30 minutos antes de la adición gota a gota de una solución de trietilamina (4,75 g, 6,54 ml, 46,9 mmol) en diclorometano (27 ml). La agitación prosiguió a -60ºC durante 45 minutos y, a continuación, se dejó calentar hasta 0ºC. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (20 ml), se lavó con HCl 1M frío (2 x 100 ml), cloruro sódico saturado (100 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. La extracción del exceso de disolvente dio la bis-cetona cruda que se purificó por cromatografía de columnas flash (50% acetato de etilo, 50% éter de petróleo 40-60º) para dar la bis-cetona pura (214) en forma de espuma de color amarillo claro (2,54 g, 72%): RMN ^{1}H (270 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.69 (bs, 2H), 7.78 (s, 2H), 6.75 (s, 2H), 6.05-5.80 (m, 2H), 5.40-5.20 (m, 4H), 4.65-4.60 (m, 4H), 4.20-3.60 (m, 20H), 2.74 (dd, 2H, J = 9.25, 18.1 Hz), 2.51 (d, 2H, J = 17.4 Hz), 2.00-1.90 (m, 4H), 1.75-1.65 (m, 2H), 0.87 (s, 18H), 0.05 (s, 12H).

Elaboración de bis-cetona y preparación de la molécula buscada 1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[2-amino-N-aliloxicarbonil-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]-bis[(2S)-2-t-bu- tildimetilsililoximetil-4-metiliden-2,3-dihidropirrol] (215)

Se añadió una solución de t-butóxido de potasio en THF seco (0,5 M, 25,2 ml, 12,6 mmol) gota a gota a una suspensión de bromuro de metiltrifenilfosfonio (4,50 g, 12,6 mmol) en THF seco (15 ml). La suspensión de iluro amarilla resultante se agitó a 0ºC durante 2 horas antes de la adición de una solución de bis-cetona 214 (2,48 g, 2,42 mmol) en THF (10 ml) a 10ºC. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se prosiguió la agitación durante una hora más. La mezcla de reacción se dividió en acetato de etilo (100 ml) y agua (100 ml) y la capa orgánica se lavó con cloruro sódico saturado (200 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. La eliminación del exceso de disolvente dio un aceite marrón que se sometió a cromatografía de columnas flash (50% acetato de etilo, 50% éter de petróleo 40-60º) para dar el producto (215) en forma de vidrio amarillo (865 mg, 35%). RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.90 (bs, 2H), 7.83 (s, 2H), 6.82 (s, 2H), 6.05-5.90 (m, 2H), 5.40-5.20 (m, 4H), 4.99 (bs, 2H), 4.91 (bs, 2H), 4.65-4.60 (m, 4H), 4.20-3.60 (m, 20H), 2.70 (bs, 4H), 2.00-1.90 (m, 4H), 1.75-1.63 (m, 2H), 0.88 (s, 18H), 0.03 (s, 12H).

1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[2-amino-N-aliloxicarbonil-5-metoxi-1,4-fenilen)carbonil]]-bis[(2S)-2-hidroximetil-4-metiliden-2,3-dihidropirrol] (216)

Se añadió una solución de TBAF (3,02 ml de una solución 1M en THF, 3,02 mmol) al bis-silil éter (215) (1,23 g, 1,21 mmol) en THF (30 ml) a 0ºC (hielo/acetona). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante toda la noche; al día siguiente, la TLC (50:50 EtOAc/éter de petróleo 40º-60º) mostró que el material de partida había desaparecido por completo. Se añadió NH_{4}Cl saturado (150 ml) y la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (3 x 60 ml), se lavó con cloruro sódico saturado (150 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se evaporó al vacío para dar un aceite amarillo. La purificación por cromatografía flash (97% CHCl_{3}, 3% MeOH) dio el alcohol puro (216) (916 mg, 96%): RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.61 (bs, 2H), 7.58 (s, 2H), 6.79 (s, 2H), 6.05-5.90 (m, 2H), 5.40-5.20 (m, 4H), 5.01 (bs, 2H), 4.93 (bs, 2H), 4.65-4.60 (m, 4H), 4.20-3.60 (m, 20H), 2.76 (dd, 2H, J = 8.42, 15.74 Hz), 2.47 (d, 2H, J = 15.93 Hz), 2.00-1.90 (m, 4H), 1.80-1.63 (m, 2H).

1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(11S,11aS)-10-(aliloxicarbonil)-11-hidroxi-7-metoxi-2-metiliden-1,2,3,10,11, 11a-hexahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4-benzodiacepin-5-ona] (217)

Se añadió una solución de sulfóxido de dimetilo (0,57 ml, 0,63 g, 8,07 mmol) en diclorometano seco (17 ml) gota a gota durante 40 minutos a una solución agitada de cloruro de oxalilo (2,02 ml de una solución 2M, 4,04 mmol) a 45ºC en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 40 minutos a -45ºC, seguido de adición del diol 216 (0,89 g, 1,12 mmol) en diclorometano (17 ml), a la misma temperatura, durante 15 minutos.

Al cabo de 60 minutos más, se añadió una solución de trietilamina (1,31 ml, 9,42 mmol) en diclorometano (9 ml) durante un periodo de 40 minutos. La mezcla de reacción se agitó a -45ºC durante 40 minutos antes de dejar que se calentara hasta temperatura ambiente durante 45 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se dejó que las fases se separaran. La fase orgánica se lavó con HCl 1M (2 x 40 ml), agua (40 ml), cloruro sódico saturado (40 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. La eliminación del exceso de disolvente dio el producto crudo, que se purificó por cromatografía de columnas flash (1% metanol, 99% cloroformo) para dar el producto 217 (0,175 g, 20%). RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.22 (s, 2H), 6.65 (s, 2H), 5.82-5.70 (m, 2H), 5.58 (d, 2H, J = 9.70 Hz), 5.25-5.00 (m, 8H), 5.75-4.35 (m, 4H), 4.30 (d, 2H, J = 16.10 Hz), 4.15 (d, 2H, J = 17.03 Hz), 4.01 (t, 4H, J = 6.32 Hz), 3.90 (s, 6H), 3.64 (t, 2H, J = 8.70 Hz), 3.00-2.85 (m, 2H), 2.71 (d, 2H, J = 16.29 Hz), 2.00-1.85 (m, 4H), 1.70-1.60 (m, 2H).

1,1'-[[(Pentano-1,5-diil)dioxi]bis[(11aS)-7-metoxi-2-metiliden-1,2,3,11a-tetrahidro-5H-pirrolo[2,1-c][1,4]-ben- zodiacepin-5-ona] (218)

Se añadió una cantidad catalítica de tetrakis(trifenilfosfina)paladio (13 mg, 11,2 mmol) a una solución agitada de la bis-aliloxicarbonil-carbinolamina (217) (170 mg, 0,22 mmol), trifenilfosfina (5,7 mg, 21,6 mmol) y pirrolidina (31 mg, 37,3 ml, 0,45 mmol) en DCM (13 ml) a 0ºC (hielo/acetona) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se monitorizó su evolución por TLC (95% CHCl_{3}/MeOH). Al cabo de 2 horas, la TLC mostró que la reacción había finalizado para dar un punto que presentó una fluorescencia brillante bajo UV. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo resultante se sometió a cromatografía flash (99% a 98 CHCl_{3}/MeOH) para dar la molécula buscada de bis-imina 218 en forma de vidrio amarillo claro (84,5 mg, 75%) que se evaporó repetidamente al vacío con CHCl_{3} para dar la forma de imina: RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,68 (d, 2H, J = 4.39 Hz), 7.49 (s, 2H), 6.80 (s, 2H), 5.19 (bs, 2H), 5.16 (bs, 2H), 4.28 (bs, 4H), 4.15-4.00 (m, 4H), 3.92 (s, 6H), 3.90-3.80 (m, 2H), 3.12 (dd, 2H, J = 8.97, 15.93 Hz), 2.95 (d, 2H, J = 15.93 Hz), 2.00-1.85 (m, 4H), 1.72-1.67 (m, 2H).

Datos de citotoxicidad

A continuación se incluyen datos de citotoxicidad con fines ilustrativos para (UP2001)80.

Estudios de citotoxicidad in vitro del NCI

El National Cancer Institute (NCI), Bethesda, Maryland, EE.UU., dispone de una criba de citotoxicidad in vitro que consta de aproximadamente 60 líneas celulares tumorales humanas en las que se prueban los compuestos con un mínimo de cinco concentraciones, que variaban en potencias de 10. Se utiliza un protocolo de exposición continua de 48 horas en el que se estima la viabilidad o el crecimiento celular en un ensayo de proteínas con SRB.

Procedimiento

Los compuestos del ensayo se evaluaron con aproximadamente 60 líneas celulares tumorales humanas. Los procedimientos de cribado del NCI los describen detalladamente Monks y sus colaboradores (Monks, A. et al., Journal of the National Cancer Institute, 1991, 83, 757). Resumiendo, las suspensiones celulares se diluyeron según el tipo de célula en particular y la densidad celular esperada (5.000-40.000 células por pocillo según las características de crecimiento celular) y se añadieron mediante pipeta (100 \mul) en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se dejó un periodo de preincubación de las células de 24 horas a 37ºC para estabilización. Las diluciones al doble de la concentración buscada en el ensayo se añadieron a los pocillos en el momento 0 en partes alícuotas de 100 \mul. Los compuestos del ensayo se evaluaron con cinco diluciones, que aumentaban en potencias de 10 (10^{-4}, 10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8} \muM). Los compuestos del ensayo se incubaron durante 48 horas en una atmósfera de 5% de CO_{2} y 100% de humedad. A continuación, las células se sometieron al ensayo con sulforodamina B. Se utilizó un lector de placas para tomar las densidades ópticas y un ordenador pasó las lecturas a valores LC_{50}, que es la dosis necesaria para matar la mitad de las células.

Los resultados mostrados en los ejemplos 5 a 8 son valores LC_{50} que se encuentran por debajo de 10 \muM, que se considera la línea divisoria entre citotoxicidad y ausencia de citotoxicidad.

Ensayo de fibra hueca del NCI para pruebas in vivo preliminares

La sección de ensayos biológicos del Programa de Terapéutica del Desarrollo del NCI ha adoptado una herramienta de cribado preliminar in vivo para determinar la actividad anticancerígena potencial de los compuestos identificados por la criba celular in vitro a gran escala. Para estos ensayos, las células tumorales humanas se cultivan en fibras huecas de polivinilideno (PVDF) y se implanta una muestra de cada línea celular en cada uno de los dos compartimentos fisiológicos (intraperitoneal y subcutáneo) de los ratones. Cada ratón del ensayo recibió un total de 6 fibras (3 intraperitonealmente y 3 subcutáneamente) que representan 3 líneas celulares cancerosas distintas. Estos ratones se tratan con compuestos antitumorales potenciales en cada una de las dos dosis del ensayo por vía intraperitoneal según un tratamiento diario durante 4 días. Los controles del vehículo consisten en 6 ratones que reciben solo el diluyente del compuesto. Los cultivos de las fibras se recogen el día después del último día de tratamiento. Para valorar los efectos anticancerígenos, se determina la masa celular viable de cada una de las líneas celulares mediante un ensayo de conversión con colorante formacina (MTT). A continuación, se puede calcular el %T/C a partir de la densidad óptica media de las muestras tratadas de compuesto dividida por la densidad óptica media de los controles del vehículo. Además, se puede determinar el aumento neto de masa celular de cada muestra, ya que el día de implantación en los ratones se calcula la masa celular viable de una muestra de los cultivos de fibras. Así pues, se puede valorar la capacidad citostática y citocida del compuesto del ensayo.

Por regla general, cada compuesto se prueba con un mínimo de 12 líneas celulares cancerosas humanas. Esto representa un total de 4 experimentos, puesto que cada experimento contiene 3 líneas celulares. Los datos se expresan en %T/C y corresponden a cada una de las 2 dosis del compuesto utilizadas en cada línea celular con valores separados calculados para las muestras intraperitoneales (IP) y subcutáneas (SC). Los compuestos se seleccionaron para ensayos in vivo adicionales en modelos estándar de xenoinjertos subcutáneos según distintos criterios de ensayos con fibras huecas. Se incluyen: (1) un %T/C de 50 o menos en 10 de las 48 combinaciones posibles del ensayo (12 líneas celulares x 2 zonas x 2 dosis de compuesto); (2) actividad a una distancia (fármaco intraperitoneal/cultivo subcutáneo) en un mínimo de 4 de las 24 combinaciones posibles; y/o (3) una mortalidad celular neta de 1 o más de las líneas celulares en una zona de implante. Para simplificar la evaluación, se ha adoptado un sistema de puntos que permite valorar rápidamente la actividad de un compuesto determinado. Para ello, se asigna un valor de 2 a cada dosis de compuesto que da una reducción del 50% o superior de la masa celular viable. Las muestras intraperitoneales y subcutáneas se valoran por separado de manera que puedan evaluarse los criterios (1) y (2). Los compuestos con una puntuación combinada IP + SC igual a 20, una puntuación SC igual a 8 o una mortalidad celular neta de una o más líneas celulares, se remiten a los ensayos de xenoinjerto. Esta comparativa indicó que existía una probabilidad muy baja de omisión de un compuesto activo si se utiliza el ensayo de fibra hueca como sistema inicial de cribado in vivo. Además de estos criterios, existen otros factores (por ejemplo, estructura única, mecanismo de acción) que pueden hacer que se remita un compuesto a los ensayos de xenoinjerto sin que el compuesto cumpla estos criterios.

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Estudios de xenoinjertos humanos del NCI

Se llevan a cabo en ratones atímicos con un sistema inmunitario deficiente. El tejido tumoral humano del ensayo se les implanta en la ijada y, mientras que los ratones de control no reciben ningún tratamiento, los demás se someten a diferentes dosis del compuesto, el cual se administra intraperitonealmente. Los resultados expresan la toxicidad del compuesto, la cantidad de crecimiento tumoral y la inhibición del crecimiento.

Ejemplo 3(a) Citotoxicidad in vitro

El compuesto 80 se sometió al estudio de citotoxicidad in vitro del NCI. Los resultados (LC_{50};\muM) se indican a continuación:

Tipo de tumor	Designación de línea celular	UP2001 (80)
		LC_{50} (\muM)
Pulmón	NCI-H460	2,7
Colon	HCC-2998	0,099
SNC	SNB-75	7,5
Melanoma	MALME-3M	0,073
	UACC-62	0,077

El dímero de PBD UP2001 (80) presentó una actividad de citotoxicidad potente y selectiva contra la línea celular NCI-H460 de cáncer pulmonar, la línea celular HCC-2998 de colon, la línea celular SNB-75 de cáncer del SNC y las líneas celulares MALME-3M (muy potente, 0,08 \muM) y UACC-62 (muy potente, 0,07 \muM) de melanoma, que podría atribuirse a su capacidad para reticular ADN.

Ejemplo 3(b) Ensayo de fibra hueca

Los compuestos 80 se sometieron al ensayo de fibra hueca del NCI y los resultados se presentan a continuación.

	UP2001 (80)
Puntuación IP	40
Puntuación SC	14
Puntuación total	54
Mortalidad celular	Y

UP2001 ha sido seleccionado para los estudios de xenoinjertos por su puntuación IP + SC combinada (54), que superó con creces el valor de 20, y su puntuación SC, que fue superior a 8.

Ejemplo 3(c) Estudios de xenoinjertos humanos

Se realizaron estudios de xenoinjertos tumorales humanos en UP2001 por parte de la sección de ensayos biológicos del NCI, tal y como se ha descrito anteriormente.

Se trataron ratones atímicos con xenoinjertos MDA-MB-435 (tumor mamario humano), Ovcar-3 (tumor ovárico humano), UACC-62 (melanoma humano) u OVCAR-5 (tumor ovárico humano) a dosis de 0,67 (alta), 0,45 (media) y 0,3 (baja) mg/kg/inyección administradas cada 4 días y con un total de 3 dosis (6 ratones por nivel de dosis y 20 controles).

UP2001 (80) se evaluó midiendo la toxicidad del fármaco y su capacidad para retrasar el crecimiento tumoral.

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Tumor	Toxicidad	%T/C	% retraso crecim.
	Alta	Media	Baja	Alto	Medio	Bajo	Alto	Medio	Bajo
MDA-MB-435	3/6	1/6	2/6	Tóxico	3	3	41	41	41
OVCAR-3	0/6	0/6	0/6	7	20	46	73	73	9
UACC-62	0/6	0/6	0/6	22	28	67	43	43	43
OVCAR-5	0/6	0/6	0/6	52	45	38	16	28	32

La toxicidad representa el número de ratones que murieron como resultado del tratamiento. %T/C representa la anchura de los tumores en los ratones "tratados" (T) (medida con un calibrador) comparada con la de los ratones de control (C) no tratados y expresada como porcentaje. % de retraso de crecimiento representa el aumento del periodo de tiempo necesario para que los tumores alcancen un tamaño arbitrario de 250 mg.

En los xenoinjertos MDA-MB-435, UP2001 redujo el crecimiento tumoral en los ratones tratados solo un 3% del crecimiento tumoral observado en la población de control. Además, también se observó un retraso del 41% en el periodo de tiempo necesario para alcanzar la masa tumoral de 250 mg. Se observó cierta toxicidad hacia los huéspedes incluso a dosis pequeñas.

Se observó una buena respuesta a las dosis de UP2001 (80) en los xenoinjertos de Ovcar-3. A dosis elevadas, el crecimiento tumoral en los sujetos tratados fue tan solo del 7% del observado en la población de control. A dosis medias, el valor fue del 20% y, a dosis bajas, el tamaño de los tumores en los ratones tratados era el 46% del tamaño de los tumores de control. A dosis elevadas, se observó un retraso del crecimiento del 73% para alcanzar una masa tumoral de 250 mg. No murió ningún ratón como resultado de la exposición a UP2001 (80).

Se observó una respuesta similar a las dosis de UP2001 (80) en el crecimiento tumoral de los xenoinjertos UACC-62. A dosis elevadas, los tumores tratados fueron un 22% del tamaño de los tumores de control. A dosis medias, los tumores tratados fueron un 28% del tamaño de los tumores de control y, a dosis bajas, los tumores tratados fueron un 67% del tamaño de los tumores de control. De nuevo, no murió ningún ratón como resultado de la exposición a UP2001 (80).

Los resultados del tumor ovárico humano OVCAR-5 no eran tan evidentes; se observó una reducción del tamaño del tumor de aproximadamente el 50%, así como cierto retraso de su crecimiento, pero aparentemente la actividad era mayor a concentraciones menores. Sin embargo, murieron ratones como resultado de la exposición a UP2001
(80).

El compuesto UP2001 (80) también se evaluó en el tumor SF-295 del SNC humano. Se trataron ratones atímicos que llevaban el SF-295 a dosis de 0,40, 0,27 y 0,18 mg/kg por inyección intravenosa administrada una vez al día con un total de 5 dosis.

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Toxicidad	%T/C	Sin tumor
Alta	Media	Baja	Alto	Medio	Bajo	Alto	Medio	Bajo
2/6	1/6	2/6	0%	0%	0%	4/4	5/5	3/4

El compuesto UP2001 (80) mostró propiedades curativas en los xenoinjertos SF-295. A dosis elevadas y medias, todos los ratones que sobrevivieron no tenían el tumor el día 27 del experimento. A dosis pequeñas, 3 de cada 4 ratones no tenían el tumor el día 27. Se asoció cierta toxicidad al tratamiento, muriendo 2 ratones a dosis elevada, 1 a dosis media y 2 a dosis pequeña. Las mayores intensidades del programa de inyecciones quedaron reflejadas en la mayor mortalidad observada.

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Ejemplo 4 Resultados adicionales del dímero de PBD SJG-136 (UP2001, 80)

El compuesto 80 se sometió a ensayos adicionales.

El primer ensayo, descrito en G.B. Jones, et al., Anti-Cancer Drug Dic., 1990, 5, 249, incorporado a título de referencia, determina el efecto del compuesto del ensayo en la temperatura de fusión de la hélice de ADN. Este ensayo está diseñado para dar una indicación de la fuerza y la extensión de la reticulación de las hebras de ADN conferida por el compuesto del ensayo (es decir, una medida de la estabilización del ADN al realizarse la unión de ligandos).

La temperatura de fusión se determinó para una relación molar 1:5 de [ligando]:[ADN], donde la concentración de ADN de timo de ternera es 100 mM en tampón de fosfato sódico acuoso (fosfato sódico 10 mM + EDTA 1 mM, pH 7,00\pm0,01). Para ADN de timo de ternera a pH 7,00\pm0,01, la temperatura de fusión es de 67,83\pm0,06ºC (valor medio de 30 determinaciones distintas).

Para una relación molar 1:5 de [PBD]:[ADN], el dímero de PBD 80 eleva la temperatura de fusión de la hélice (\DeltaT_{m}) del ADN de timo de ternera un valor inesperado de 33,6ºC después de incubación durante 18 horas a 37ºC. En condiciones idénticas, el dímero DSB-120 no sustituido en el anillo C:

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Proporciona un \DeltaT_{m} de 15,1ºC, lo que demuestra el efecto extraordinario de la introducción de insaturación C2/C2'. Al igual que otros dímeros de PBD, 80 ejerce la mayor parte de su efecto en las regiones ricas en uniones GC o de temperatura elevada de las curvas de fusión del ADN. De forma similar al DSB-120, proporciona un 60-80% de su efecto estabilizador sin incubación previa, lo que sugiere un efecto cinético en el perfil de reactividad de la PBD. Sin embargo, las curvas comparativas de \DeltaT_{m} indican que, considerando únicamente la concentración, el SJG-136 es \geq 10 veces más eficaz que el DSB-120. Incluso a una relación molar 1:100 de [PBD]:[ADN], el SJG-136 sigue presentando una afinidad con la unión de ADN significativamente mejor que el monómero tomamicina a una relación molar 1:5 de [PBD]:[ADN].

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Los resultados de una relación molar 1:5 de [PBD]:[ADN] se resumen en la tabla siguiente (todos los valores de \DeltaT_{m} \pm 0,1-0,2ºC).

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Compuesto	\DeltaT_{m} inducido (ºC) después de incubación a 37ºC durante
	0 h	4 h	18 h
SJG-136 (80)	25,7	31,9	33,6
DSB-120	10,2	13,1	15,1
Tomamicina	0,97	2,38	2,56

Los datos mostrados en la tabla anterior indican que el SJG-136 (80) es el agente estabilizador de ADN más potente conocido hasta la fecha según este ensayo en particular.

En el segundo ensayo se determinó la citotoxicidad del SJG-136 (80) en la línea celular A2780 del carcinoma ovárico humano y su sublínea A2780cisR resistente a la cisplatina, y se compararon estos datos con la citotoxicidad del dímero relacionado DSB-120 (véase más arriba) y la cisplatina. En relación con la línea parental, se sabe que la sublínea A2780cisR tiene niveles de GSH elevados, un nivel elevado de reparación de complejos de inclusión de ADN-cisplatina, y una capacidad reducida para absorber cisplatina (M. Smellie, et al., Br. J. Cancer, 1994,
70, 48).

Los resultados, que se obtuvieron incubando las células con los compuestos durante 96 horas a 37ºC y valorando el número de células con sulforodamina B, se presentan en la tabla siguiente:

	IC_{50}^{a} (\muM) para
	A2780	A2780cis^{R}	RF^{b}
SJG-136 (80)	0,000023	0,000024	1,1
DSB-120	0,0072	0,21	29,2
Cisplatina	0,265	8,4	32
^{a} Dosis de compuestos necesaria para inhibir el crecimiento celular un 50% en comparación con el control.
^{b} RF es el factor de resistencia (IC_{50} resistente/padre).

El valor de IC_{50} para 80 en la línea celular A2780 es solo de 23 pM, lo que representa un aumento de 320 veces la citotoxicidad en comparación con el DSB-120 (IC_{50} = 7,2 nM). Resulta más interesante el hecho de que, mientras que el DSB-120 tiene una potencia reducida en la sublínea A2780cisR resistente a la cisplatina (IC_{50} = 0,21 mM), el SJG-136 es casi 9.000 veces más potente en esta línea celular con un valor IC_{50} similar (24 pM) al de la línea A2780 normal, lo que da un factor de resistencia de 1,1. El hecho de que tanto el DSB-120 como la cisplatina den factores de resistencia de 29,2 y 32, respectivamente, en este par de líneas celulares, sugiere que el SJG-136 puede ser útil para el tratamiento de una enfermedad refractaria a la cisplatina.

Ejemplo 5 Ensayo de citotoxicidad en carcinoma ovárico

Se evaluó la actividad citotóxica del compuesto 80 (y la antramicina como comparación) en líneas celulares ováricas por parte del grupo del Dr. Lloyd R. Kelland del Institute of Cancer Research, Sutton, R.U. Las cinco líneas celulares que se investigaron fueron SKOV-3, A2780/A2780cisR y CH1/CH1cisR (cisR indica que la línea celular es resistente a la cisplatina).

Se sembraron células viables individuales en medio de cultivo (160 \mul) en placas de microtitulación de 96 pocillos y se dejó que se unieran durante toda la noche. A continuación, se disolvieron las PBD en DMSO (para dar concentraciones del fármaco de 20 mM) inmediatamente antes de añadirlas a las células en pocillos cuadruplicados. La concentración final del fármaco en los pocillos se encontraba entre 100 \muM y 2,5 nM, como se indica a continuación: 100, 25, 10, 2,5, 1 \muM, 250, 100, 25, 10, 2,5 nM (los fármacos se diluyeron en medio de cultivo y se añadieron 40 \mul al volumen de pocillos existente de 160 \mul para dar las concentraciones finales indicadas más arriba). Al cabo de 96 horas, se extrajo el medio y el resto de células se fijaron por exposición a ácido tricloroacético al 10% en hielo durante 30 minutos. A continuación, se lavaron los pocillos 3 ó 4 veces con agua de grifo, se secaron con aire durante toda la noche y se trataron con 100 \mul de sulforodamina B (0,4%) disuelta en ácido acético al 1%. Se dejó que la tinción continuara durante 10-15 minutos, se lavaron los pocillos 3 ó 4 veces con ácido acético al 1%, secaron con aire y se añadieron a una base Tris (100 \mul de 10 mM). Se agitaron las placas y se tomaron las lecturas de absorbancia a 540 nm mediante un lector de placas. Mediante el paquete de software Quattro-Pro, se calcularon los valores de IC_{50} a partir de gráficas de concentración en función del porcentaje de absorbancia (en comparación con 8 pocillos no tratados).

	IC_{50}/\muM
Nº UP	A2780	A2780cis	CH1	CH1cisR	Skov3
Antramicina	0,155	0,16	0,062	0,05	0,16
UP2001 (80)	0,000023	0,000024	0,00012	0,0006	0,0091

UP2001 (80) presenta citotoxicidad a niveles picomolares/subnanomolares en el panel de líneas celulares ováricas. La potencia de la molécula probablemente es debida a sus propiedades de reticulación junto con el efecto de exosaturación.

Claims

1. Compuesto de fórmula:

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2. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. Compuesto según la reivindicación 1 para ser utilizado en un procedimiento de tratamiento terapéutico.

4. Utilización de un compuesto según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad proliferativa.

5. Utilización de un compuesto según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una infección viral, parasítica o bacteriana.

6. Procedimiento para preparar un compuesto según la reivindicación 1.