EE201500006A - Isoleeritud mikroorganismi tüvi Lactobacillus gasseri MCC2 DSM 23882 ning selle kasutamine - Google Patents

Abstract

Leiutis käsitleb mikroorganismi tüve Lactobacillus gasseri MMC2 DSM23882 ning selle kasutamist antioksüdantse proteolüütilise koostisosana toidutoote või toidulisandi valmistamiseks. Nimetatud mikroorganismi sisaldavad toidutooted ja toidulisandid on hüpoallergeensed, nende tarbimine vähendab piimaallergiat ja eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid, nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku.

Description

TEHNIKAVALDKOND

Leiutis kuulub biotehnoloogia valdkonda ja leiab kasutamist toidutoodetetööstuses. Täpsemalt käsitleb leiutis mikroorganismi tüve L.gasseri MCC2 ning selle kasutamist piimaallergia ja eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevate alumiste kuseteede ärritussümptomite ning nendega seotud oksüdatiivse stressi ja põletiku vähendamiseks.

TEHNIKA TASE

Laktobatsille on laialdaselt kasutatud tervislike toidutoodete valmistamiseks juba kaua aega, näiteks juuretistena. Levinuim võte on laktobatsillide kasutamine funktsionaalses toidus. Funktsionaalne toit on toidutoode, mis peale tavaliste toiteliste väärtuste omab looduslikke lisakomponente, mis kasulikult mõjustavad organismi mingeid funktsioone või vähendavad haiguste riski.

Vähem on kasutusel aga võtteid, kus toidutoote valmistamisel on kasutatud eesmärgipäraselt bioselekteeritud elusaid laktobatsille, mis järgmises tehnoloogilises etapis pastöriseerimisega surmatakse. See tähendab, et lõpptoode ei sisalda elavaid piimhappebaktereid, kuid eeltöötluse, sobiva tehnoloogilise skeemi ja vajalike lisandite abil loodud tootel on eesmärgipärane biotoime.

Piimaallergia, selle leevendamine

Infektsioonid, põletiku-, allergia- ja oksüdatiivse stressi-seoselised probleemid näiteks toiduallergiad, kuseteede vaevused (nt eesnäärmevaevustega seotud kusemishäired) muutuvad ühiskonnale majanduslikult üha koormavamaks. Näiteks kuni 4% inimestest kannatab toiduallergiate all ja 100...200 surmajuhtu on USAs otseselt toiduallergiast tingitud. Toiduallergiad (sh allergiline reaktsioon lehmapiimale) on eriti tõsine probleem väikelaste puhul. On ju piimatoodete kasutamine väikelastel hädavajalik nende normaalse kasvu ja arengu tagamiseks. Toidu allergilisuse probleemi lahendamine on äärmiselt komplitseeritud, sest absoluutselt allergiliste reaktsioonide vaba, aga samas väga kõrge hea biokvaliteediga toodete loomine pole võimalik. Viimased diskussioonid ÜRO-s, FAO-s ja WHO-s on deklareerinud järgmist - allergen-free: time to clarity; statement: there is no actual legislation to declare free from all allergens. Seega: igasuguseid tehnoloogilisi ideid/lahendusi, mille tulemiks on hüpoallergilisemad tooted, mis vähendaksid vähemalt mõne protsendi võrra allergiliste vastustega väikelaste arvu, hinnatakse kõrgelt. Allergiliste vastuste vähenemise iga protsent on lõppkokkuvõttes/pikemas perspektiivis väga tähtis, sest mistahes edu allergia valdkonnas toidutoodete allergeensuse vähendamiseks omab olulist sotsiaalmajanduslikku väljundit (sh elukvaliteedi paranemine lastel ja täiskasvanutel ning ravikulutuste vähenemist).

Piimatoodete allergilisuse määravad valgud, kuid raske on esile tuua ühte nn põhi-allergeeni (Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (EFSN) AP, 2003, Wal, J. M. (2004) Bovine milk allergenicity. Ann.Allergy Asthma Immunol., 93, S2-11). Siiski kutsuvad nii kaseiin kui ka beeta-laktoglobuliin võrdses proportsioonis esile allergilisi reaktsioone. Lehmapiima-allergia on seotud valdavalt alfa-kaseiini ja beeta-laktoglobuliiniga (Host A. (2002). Frequency of cow's milk allergy in childhood. Ann Allergy Immunol 89(Suppl 1):33-7; EFSN, 2003. Paljudel piimaallergiaga lastel on reaktsioon alfa-kaseiini suhtes (Hill D.J, Firer M.A, Shelton M.J et al. (1986) Manifestation of milk allergy in infancy: clinical and immunologic findings. J Pediatr 109: 270-6; EFSN, 2003, Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2007) Guidelines for the diagnosis and management of cow's milk protein allergy in infants. Arch Dis Child. 92:902-908).

Kaseiin koosneb järgmistest subühikutest: alfa-S1 (peamine allergeen), alfa-S2, beeta- ja kapa-kaseiin, sealjuures ülekaalus on alfa-S1 ja beeta-kaseiin. Piimavalkude ensümaatiline hüdrolüüs vähendab nende allergeensust. Piimavalkude osalisel hüdrolüüsil tekivad suured peptiidid, põhjalikum hüdrolüüs annab suurte ja väikeste peptiidide ning aminohapete segu. Isegi põhjalik pepsiin-trüpsiin hüdrolüüs ei anna allergiavaba tulemust, sest natiivse valgu immunoreaktiivsete osiste tühised hulgad võivad anda allergilise reaktsiooni. Seega ainult põhjaliku hüdrolüüsipõhine lähenemine on tekitanud teatud võimalusi, ei paku aga lõplikku lahendust, ka vadakuvalkude hüdrolüsaatide puhul (Businco L, Cantani A, Longhi MA, Giampietro PG. (1989) Anaphylactic reactions to a cow's milk whey protein hydrolysate (Alfa-Re, Nestle) in infants with cow's milk allergy. Ann Allergy. 62(4):333-5.; Sampson HA, James MJ, Bernhisel-Broadbent J. (1992) Safety of an amino-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics. 90,463-465). Nii vajatakse uusi lähenemisi lehmapiima-allergia vähendamiseks, mistõttu allergiat põhjustavate piimavalkude suunatud hüdrolüüs mikroorganismi(de) tüve(de)ga, mis annavad toodetele ka lisaväärtusi, on perspektiivne suund allergiaprobleemide oluliseks vähendamiseks.

Piimavalkude hüdrolüüsi piimhappebakterite ja lisaainete abil on varem kirjeldatud. Patendis EE03424 (patenditaotlus WO9700078, Valio Oy) kirjeldatakse L.rhamnosus ATCC 53103 (LGG) tüve kasutamist allergiavastase valguhüdrolüsaadi-preparaadi valmistamiseks, kus valgud hüdrolüüsitakse pepsiini ja trüpsiiniga. LGG kasutamist allergiariski vähendamiseks käsitletakse mitmes Nestec SA leiutises. Patendis EP1296694 kirjeldatakse LGG kasutamist laste atoopiliste haiguste riski vähendamiseks. Patenditaotluses WO2008116907 on näidatud bifidobakterite ja LGG, L.rhamnosus CGMCC 1.3724, L.reuteri ATCC 55730 ja L.paracasei CNCM 1-2116 kasutamist keisrilõikega sündinud imikutel allergiariski vähendamiseks, sh ka koos osaliselt (2-20%) hüdrolüüsitud proteiinidega. Nestec SA patenditaotluses WO03099037 on kirjeldatud piimhappebakterite proteolüütilist süsteemi ja Bifidobacterium lactis ATCC 27536 jt sisaldavat toidutoodet kasutamiseks mh ka toiduallergia vähendamiseks, kusjuures nimetatud bakterid võivad olla inaktiveeritud või surnud (inactivated or dead). Patendis EE04724 (patenditaotlus W09929833, Arla Foods) kirjeldatakse L. paracasei subsp. paracasei kasutamist, sh lastel atoopiliste probleemide leevendamiseks. Patendis EP1175156 (Bioferme OY) kirjeldatakse mikroorganisme sisaldavat pastöriseeritud teraviljajooki. Patenditaotluses CN101427782 (Min Zhao) kirjeldatakse bifidobakterit sisaldavat maisijooki, mis valmistatakse fermenteerimise abil ja kus bakterid fermenteeritud tootes inaktiveeritakse. Vadakuproteiini-kontsentraadis (WPC, whey protein concentrate) on maksimaalseks beeta-laktoglobuliini hüdrolüüsiks saavutatud 21% (M. Pescuma et ai (2007), Hydrolysis of whey proteins by L.acidophilus, Streptococcus thermophilus and L.delbrueckii ssp. bulgaricus grown in a chemically defined medium, Journal of Appi Microbiol, 103,5,1738-1746). Piimavalkude hüdrolüüsi (2-32%) kahe mikroorganismi toimel eesmärgiga saada heade maitseomadustega toodet on kirjeldatud Euroopa patendis EP1383394 (New Zealand Dairy Board), kus üheks mikroorganismiks on pakutud Macrococcus, Micrococcus, Entercoccus, Staphylococcus, Brevibacterium, Anthrobacter või Corynebacterium, eelistatult Macrococcus caseolyticus, teiseks mikroorganismiks piimhappebakter Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus või Leuconostoc, ja fermentatsioon lõpetatakse mikroorganismide eemaldamise või surmamise teel. Jaapani patenditaotluses JP7203844 (Morinaga Milk Industry Co) kirjeldatakse piimavadaku osalist hüdrolüüsi (30%) mikroorganismist Bacillus subtilis saadud ensüümi, trüpsiini ja papaiini abil.

Eesnäärmevaevused, nende leevendamine

Eesnääre võib põhjustada mitmeid vaevusi: urineerimistakistust ja ärritust ning valu või ebamugavustunnet väikevaagna piirkonnas. Eesnäärmevaevused, just urineerimisega seotud probleemid on väga levinud, ning halvendavad paljude meeste elukvaliteeti. Hinnanguliselt esineb prostata hüperplaasiat (eesnäärme liigkasv, Benign prostatic hyperplasia (BPH)) umbes pooltel 50-aastastest ning umbes 70% üle 70-aastastest meestest. Eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevad alumiste kuseteede sümptomid (Lower urinary tract symptoms (LUTS)) hõlmavad ärritavaid ja obstruktiivseid (tühjendamise) sümptomeid, mille hindamisel on kasutusel rahvusvaheline eesnäärmesümptomite skoor, International Prostate Symptom Score - IPSS). Iga mitte-medikamentoosne võimalus, mis leevendaks meeste urineerimisraskusi oleks igati hinnatud ja parim on, kui sellist toimet omaks mõni uudne toidutoode.

Mitmetes patenditaotlustes on kirjeldatud piimhappebakterite kasutamist terapeutilistes kompositsioonides urogenitaalsete infektsioonide, sh eesnäärmepõletiku ravimiseks ja leevendamiseks, kusjuures kompositsioonid sisaldavad üht või mitut liiki piimhappebakterit (ÜS2008274162, Nessa Jeffrey Bryan et al., 2007).

Piimahappebakterite kombinatsiooni, mille üks komponent sisaldab L.crispatus, L.salivarius ja L.casei ja teine komponent sisaldab L.brevis, L.gasseri ja L.fermentum, saab kasutada toidulisandina või farmatseutilise kompositsioonina infektsioonide ja põletike, sealhulgas uretriidi raviks või ärahoidmiseks (EE04620, Actial Farmaceutica Lda, 2000). Piimahappebakterit L.coprophilus PL9001 (KCCM-10245) on kasutatud urogenitaalsete infektsioonide ärahoidmiseks ja ravimiseks (KR20040067161, PL BIO Co Ltd., 2003). Uroloogias lokaalraviks mõeldud farmatseutilised kompositsioonid võivad aktiivse toimeainena sisaldada piimhappebaktereid L.casei, L.gasseri (EP353581, Silvana Tõsi et ai., 1993).

Eeltoodust nähtub, et piimaallergia ja eesnäärmevaevuste leevendamist, sh piimvalgu osalise hüdrolüüsi ja piimhappebakterite abil on uuritud pikka aega.

Sellest hoolimata ei ole piimaallergiat ja eesnäärmevaevusi vähendavaid toidutooteid ja toidulisandeid kaubanduses piisavalt saada. Seega on olemas vajadus usaldusväärsete, katsetega tõendatud tervislike omadustega toidutoodete ja toidulisandite valmistamiseks ja kasutamiseks.

LEIUTISE OLEMUS

Leiutis käsitleb uut isoleeritud antioksüdantset mikroorganismi tüve L.gasseri MCC2 DSM 23882, seda sisaldavat kompositsiooni, nimetatud mikroorganismi kasutamist antioksüdantse proteolüütilise koostisosana (ingrediendina) toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks, mikroorganismi kasutamist piimaallergiat ja eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks ning meetodit eeltoodud vaevusi vähendava toidutoote ja toidulisandi saamiseks.

Leiutise objektiks olev piimavalke osaliselt hüdrolüüsiv piimhappebakter leiti astmelise bioselektsiooni abil. Eesmärgiks oli leida multivalentsed biopotentsiaaliga tüved, mille multivalentsus võimaldaks tüvede kasulikke biotoimeid (hüpoallergilisem, vähem allergilisi vastuseid, põletikku, oksüdatiivset stressi vähendav mõju) sünergiliselt kasutada soovitud omadustega toidutoodete saamiseks. Leiutise lähenemisideoloogia pole piimavalkude täieliku hüdrolüüsi saavutamine. Täielikku hüdrolüüsi on proovitud, see tekitab uusi probleeme, sh ka produkti ülitugeva organoleptilise ebameeldivuse. Leiutise ideoloogiaks valiti multibiopotentsete tüvede kasutamine koos vajalike tehniliste protseduuridega ning sobiva tervisliku lisatoorme kasutamisega. L.gasseri MCC2 on multibiopotentne ja sünergilise toimega - ta on võimeline piimavalke (kaseiine) suunitletult (osaliselt) hüdrolüüsima, ning omab olulist oksüresistentsust, tekitab konjugeeritud linoolhapet, NO jt komponente. Seega võimaldab leiutis biotehnoloogilise terviklahenduse abil luua toidutooteid, mis omaksid potentsiaali vähendada piimaallergiat ning kuseteede vaevusi.

L.plantarum L.gasseri MCC2 kirjeldus

Leiutise objektiks olev L. gasseri MCC2 DSM 23882 isoleeriti terve lapse roojast Eesti-Rootsi laste mikrofloora võrdleva uuringu käigus. Tüvi L. gasseri MCC2 isoleeriti, külvates terve 1 a. vanuse lapse rooja lahjendusi (10-2-10-7 fosfaatpuhvris 0,04% tioglükoolhappega, pH 7,2). Lahjendused külvati värskelt valmistatud MRS agarsöötmele (Oxoid, Ühendkuningriik) ja kultiveeriti 37°C juures mikroaeroobses keskkonnas. Leiutise objektiks olev tüvi isoleeriti Lactobacillus ssp iseloomuliku pesa- ja rakumorfoloogia alusel. Järgnes provisoorne ja seejärel täpsem identifikatsioon, mida järgnevalt kirjeldatakse.

L.gasseri MCC2 deponeeriti kultuurikollektsioonis Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH numbri DSM 23882 all 05. augustil 2010.

Kultuur-morfoloogilised tunnused

Kultuur-morfoloogilised tunnused määrati MRS-agar- ja puljongsöötmes (Oxoid) kasvatamise järgselt.

L.gasseri MCC2 kultiveerimiseks sobis MRS-puljong 24-48 t jooksul anaeroobses keskkonnas, mille järel ilmnes puljongis ühtlaselt hägune kasv. 48 t MRS-agarsöötmel kultiveerimise järel 37°C juures anaeroobses keskkonnas (CO2/H2/N2:5/5/90) olid L.gasseri MCC2 pesad 1,5-2 mm läbimõõduga, hallikasvalged, tuhmid ja ebakorrapärase äärisega. Rakud on keskmise jämedusega lühikesed kuni kokoidsed pulgad. Optimaalne kasvutemperatuur on 37°C; tüvi paljuneb ka 45°C juures. Optimaalse kasvukeskkonna pH on 6,5. L.gasseri MCC2 on katalaas- ja oksüdaasnegatiivne, obligaatselt homofermentatiivne (OHOL), ei hüdrolüüsi arginiini ja ei produtseeri glükoosi fermentnatsioonil gaasi.

L.gasseri MCC2 identifitseeriti API 50CHL System (bioMerieux, Prantsusmaa) test-kiti alusel kui L. delbrueckii ssp. delbrueckii (kattuvus tüüptüvega: good, ID %-94.6, T index -0.35). L.gasseri MCC2 molekulaarne identifikatsioon 16S rRNA järjestuse alusel andis homoloogia tüüptüvega L. gasseri IDCC 3102 (BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/seguence-analysis/).

L.gasseri MCC2 süsivesikute fermentatsiooniprofiil API CHL 50 alusel on alljärgnev. Tüvi fermenteerib: laktoosi, sahharoosi, trehhaloosi ja eskuliini.

API ZYM (bioMerieux, Prantsusmaa) test-kiti alusel omab L.gasseri MCC2 leutsiin arüülamidaasi, valiin arüülamidaasi, alfa-glükosidaas ja beeta-glükosidaasi aktiivsust.

Ohutus

Mikroobitüvede pärinemine terve lapse seedetraktist tõestab selle GRAS (generally recognised as safe) staatust ehk mikroobitüved on inimesele ohutud ja sobivad suukaudselt manustamiseks. Samuti on laktobatsilli liik L.gasseri kantud EFSA poolt QPS (Qualified Presumption of Safety) staatusega taksonoomiliste ühikute nimekirja (EFSA. Introduction of a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for assessment of selected microorganisms referred to EFSA. EFSA J 2007; 587, 1-16).

Hemolüütiline aktiivsus

Metoodika: L.gasseri MCC2 hemolüütilist aktiivsust määrati tüve 4t inkubeerimise järel mikroaeroobses keskkonnas veriagarplaatidel (Blood Agar Base nr 2, Oxoid +7% inimese- või hobuseverd).

Tulemus. Tüvel L.gasseri MCC2 ei esinenud hemolüütilist aktiivsust.

Resistentsus antibiootikumidele

Metoodika: L.gasseri MCC2 tundlikkust antibiootikumidele testiti E-testi abil (AB Biodisk, Solna). Minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon määrati vastavalt Euroopa Komisjoni soovitatud epidemioloogilistele murdepunktidele.

Tabel 1. L.gasseri MCC2 DSM 23882 antibakteriaalne tundlikkus (MIK, mg/l)

*MIK - minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon, murdepunkt resistentsusele, OHOL - Obligaatselt homohermentatiivsed laktobatsillid, n.r. - pole nõutud# ;* European Commission (EC), 2002. Opinion of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the criteria for assessing the safety of micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. European Commission, Health and Consumer Protection Directorate General, Directorate C, Scientific Opinions, Brussels, Belgium. http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scan/out64 en.pdf

# FEEDAP Panel EFSA Technical guidance prepared by the Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP) on the update of the criteria used in the assessment of bacterial resistance to antibiotics of human or veterinary importance. The EFSA Journal (2008) 732, 1-15

Tüvel L.gasseri MCC2 ei esinenud resistentsust testitud antibiootikumide suhtes.

L.gasseri MCC2 funktsionaalsed omadused

Metaboliitide profiil

Metoodika: Metaboliitide profiil on kindlaks tehtud gaaskromatograafiliselt (HP 6890) mikroaeroobses kasvukeskkonnas inkubeerimisel 24t ja 48t järel (Tabel 2). Laktobatsille kasvatati 48 t MRS-agarsöötmel 10% CO2 keskkonnas, tehti suspensioon 0,9% NaCl lahusesse tihedusega 109 mikroobi/ml McFarlandi järgi, saadud suspensioonist 1,0 ml külvati 9,0 ml MRS-vedelsöötmesse. Määrati metaboliitide hulk mmol/l, kasutati kapillaarkolonni HP-INNOWax (15 m x0,25 mm; 0,15 mikro m). Kolonni temperatuuri programm 60°C 1 min, 20°C/min 120°C 10 min; detektor (FID) 350°C.

Tabel 2. Äädikhappe, piimhappe ja merivaikhappe kontsentratsioon (mmol/1) MRS-söötmes L.gasseri MCC2 mikroaeroobsel kultiveerimisel 24t ja 48t järel MRS-söötmes L.gasseri MCC2 agregatsiooni ja piima kalgendamise võime selgitamine.

Metoodika: Piima kalgendamise võime. Võimet piima kalgendada hinnati peale tüvede inkubeerimist 48t jooksul mikroaeroobselt UHT rasvatus piimas 37°C juures. Kalgendamisvõimet hinnati järgneva skeemi alusel:

1. Tugev (+) - piim kalgendunud 24 t jooksul,

2. Aeglane (+/-)- piim kalgendunud 48 t jooksul,

3. Puudub (-)- piim ei kalgendu.

Autoagregatsioon. Autoagregatsiooni võime hindamiseks suspendeeriti eelnevalt 24t jooksul MRS-agarsöötmel ette kasvatatud tüvesid füsioloogilises lahuses. Tekkinud suspensioon jäeti 15 minutiks toatemperatuuril seisma. Agregatsioonivõimet hinnati järgneva skeemi alusel: 0 - puudub, suspensioon ühtlaselt hägune; 1 - lahuses üksikud helbed; 2 - suspensioonis rohkesti helbeid, katsuti põhjas mõningane sade; 3 - tugev, suspensiooni ei teki, katsuti põhjas sade, lahus peaaegu läbipaistev.

L.gasseri MCC2 kalgendas piima 24t jooksul, omas tugevaid autoagregatiivseid omadusi (Tabel 3).

Tabel 3. Tüvede agregatsiooni, üldproteolüüsi ja piima kalgendamisvõime

Prebiootikumide fermentatsioonivõime

Tagatoosi (Arla Food Ingredients), Raftiloos P95 (Beneo Orafti), Raftiloos Synergy 1 (Beneo Orafti) ja Raftiloos L60/75 (Orafti) fermentatsiooni hindamiseks külvati 0,05 ml uuritava laktobatsilli 48t vanust kultuuri MRS-söötmesse, mis sisaldas glükoosi asemel 0,5% kas sorbiiti, tagatoosi või meletsitoosi. Indikaatorina lisati söötmesse kloorfenoolpunast (0,004%). Fermentatsiooni hinnati värvuse muutuse alusel (punasest kollaseks) 48t möödumisel.

Tabel 4. L.gasseri MCC2 prebiootikumide kasutamise võime

Antimikroobne aktiivsus patogeenidele

Metoodika: Antimikroobsete omaduste hindamiseks kasutati joonkülvitehnikat (Hütt P, Shchepetova J, Loivukene K, Kullisaar T, Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appi Microbiol. 2006; 100(6):1324-32). Patogeenide inhibitsiooni määramiseks mõõdeti kasvuvaba tsoon millimeetrites. Analoogselt Hütt jt. (2006) järgi arvutati kasutatud valimi tulemuste põhjal aritmeetiline keskmine ning standardviga ja sellest lähtuvalt hinnati tüvede antagonistlikku aktiivsust (mm) inkubeerimisel 37°C juures järgnevalt: - nõrk väiksem kui 9,7; keskmine 9,7-12,2; tugev suurem kui 12,2. Kõiki katseid korrati paralleelselt vähemalt kolm korda.

Tabel 5. L.gasseri MCC2 antimikroobne aktiivsus patogeenide suhtes joonkülvi meetodil anaeroobses ja mikroaeroobses keskkonnas kultiveerimisel (patogeeni kasvupidurdus mm)

L.gasseri MCC2 osutus mõlemas keskkonnas nõrgaks antagonistiks.

Üldproteolüütilised omadused

L.gasseri MCC2 üldproteolüütilisi omadusi uuriti SMA-söötmel (lõssi agarsöötmel) ja Ca-kaseinaadi agaril, külvates eelnevalt MRS-puljongis 48t jooksul ettekasvatatud tüved testsöötmele. Külve inkubeeriti 7 päeva jooksul mikroaeroobses keskkonnas 37°C juures. Hinnati tekkinud proteolüüsijälje tugevust (6 katset, aritmeetiline keskmine) pallisüsteemi alusel: 4 - tugev, 3 - keskmine, 2 - nõrk, 1 - väga nõrk, 0 - puudub.

Tulemused: L.gasseri MCC2 on piisavalt hea üldproteolüütilise toimega (4 palli süsteemis oli L.gasseri MCC2 kaks palli).

Bioselektsioon spetsiifilisema proteolüütilise võime alusel (mass-spektromeetrilised ja RP-HPLC tehnoloogilised uuringud alfa-S1-kaseiini ja beeta-kaseiini proteolüüsi ulatuse tuvastamiseks).

L.gasseri MCC2 puhul polnud teada, kuidas ta erinevaid piimavalke hüdrolüüsib. Nii tehti esmalt kindlaks hüdrolüüsi käigus tekkivad muutused molekulmassi spektrites, kasutades üksikuid puhtaid piimaproteiine (beeta-laktoglobuliin, alfa-S1 kaseiin, beeta-kaseiin), et hiljem analüüsida täispiima valkude spektri muutusi. Piimavalkude hüdrolüüsi produktide molekulmassid määrati MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass-spektromeetril (Marsilio, R. Catinella, S. Seraglia R. Traldi P. (1995) Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization Mass-Spectrometry for the Rapid Evaluation of Thermal-Damage in Milk. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 9, 550-552). Kultuuridest tehti KC1 füsioloogilisse lahusesse suspensioon tihedusega 109 PMÜ/ml vastavalt McFarland 4 standardile. Saadud suspensiooni lisati 10 mikro l piimavalgu fraktsiooni. Tüvede elulemust neis fraktsioonide lahustes määrati väljakülvidega lahjenduste rea meetodil katse eel ja lõpus. Tüvesid inkubeeriti vastavas valgufraktsiooni keskkonnas 2...6 päeva jooksul 37°C juures. Seejärel proovid tsentrifuugiti ning valkude profiil määrati mass-spektromeetril (Voyager DE Pro, Applied Biosystems) (Joonis fig 1 ja joonis fig 2). Leiti, et leiutise objektiks olev tüvi on võimeline kohandama ainevahetust toitainetevaese keskkonnaga. Näiteks olid katses ainsaks toitaine allikaks kas alfa-S1 kaseiin, beeta-laktoglobuliin, beeta-kaseiin või tüve enese rakkudest saadavad ained. Tüvi oli katse lõpus leitav kõigis kolmes proteiinifraktsiooni keskkonnas (alfa-S1 kaseiin, beeta-laktoglobuliin, beeta-kaseiin).

Järgnevalt uuriti tüve proteolüütilisi omadusi 2,5% rasvasisaldusega kaubanduslikus piimas RP-HPLC (Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography) meetodi abil. Mõõdeti alfa-S1 kaseiini ja beeta-kaseiini proteolüüsi ulatust inkubatsiooni 2. ja 4. päeval (Joonis fig 3). Selleks võrreldi uuritavale piimaproteiinile vastava RP-HPLC-kromatogrammi piigi pindala suurust stardimomendiga (kontroll, st piim enne laktobatsillide lisamist, võrdustati 100%-ga) ja leiti allesjäänud piimaproteiini hulk protsentides. Lisaks katsetati pikemate kuni 21 päevaste inkubatsiooniaegadega. Uuriti ka leiutise objektiks oleva tüve kombinatsioone parandamaks proteolüütlist efektiivsust ning proteolüütilisust ka vadakuga (vähendamaks allergeensete kaseiinide hulka) eellahjendatud piima puhul. Piimaproovide ettevalmistamine RP-HPLC-analüüsiks ja kromatografeerimise tingimused on välja töötatud Bobe et.ai poolt kirjeldatud metoodika eeskujul (Bobe G, Beitz DC, Freeman AE, Lindberg GL. (1998) Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins By reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. J. Agric. Food Chem., 46, 458-463). Võrreldi omavahel 2,5% rasvasisaldusega kaubanduslikku piima, kuhu lisati 10 PMÜ/ml uuritavat tüve ja inkubeeriti 37°C juures, ning ilma tüveta piima. Piimaproteiinide eraldamiseks kasutati kõrgefektiivset vedelikkromatograafi (HPLC) (Hewlett Packard 1100) ning poorse ränidioksiidiga täidetud pöördfaasi kolonni Zorbax 300SB-C18. Liikuvaks faasiks oli muutuva gradiendiga elueeriv süsteem, mille komponedid olid: lahus A - atseetonitriil, vesi, TFA suhtes 900:100:1 (v/v/v); Lahus B - atseetonitriil, vesi TFA suhtes 100:900:1 (v/v/v). Gradient algab lahus B-ga ja lahus A osakaal hakkab suurenema kohe peale proovi süstimist süsteemi. Lahutusfaasis, mille jooksul toimub piimaproteiinide eraldumine, suureneb lahus A sisaldus 0,47% minutis. Saadud fraktsioonid samastati võrreldes retensiooniaegu peamiste piimaproteiinide standardite retensiooniaegadega ja molekulmassi määramise kaudu MALDI-TOF mass-spektromeetril. Piimaproteiinid elueeruvad järjekorras: kapa-CN, alfas2-CN, alfaS1-CN, beeta-CN, alfa-LA ja beeta-LG. L.gasseri MCC2 andis alfa-S1 kaseiini ja beeta-kaseiini puhul sobivad toimed (vt koondandmed joonis fig 1 ja joonis fig 2), laste lehmapiima-allergia vastuses domineerivate valkude alfa-S1 kaseiini ja beeta-kaseiini hulk vähenes teiseks toimepäevaks. Tuginedes RP-HPLC analüüsile oli parim suunatud osaline proteolüüsija L.gasseri MCC2 (joonis fig 3). Kombineerides laktobatsille L.plantarum MCC1 L.gasseri MCC2 omavahel, proteolüütiline efekt piimas pisut vähenes võrreldes samade tüvede kasutamisega üksinda. L.plantarum MCC1 inkubeeriti ka 4 päeva 40% piimast ja 60% vadakust koosnevas segus: alfa-kaseiini sisaldus oli neljandaks päevaks 81% ja beeta-kaseiini sisaldus 83% võrreldes stardimomendiga.

Jõuti püstitatud eesmärgini: tüvi L.gasseri MCC2 ja selle kombinatsioon tüvega L.plantarum MCC1 vähendas alfa-S1 kaseiini ja/või beeta-kaseiini hulka 20...40% (st toimus suunatud mõõdukas hüdrolüüs).

L.gasseri MCC2 hüdrolüüsib piimaallergiat põhjustavaid valke ja on hea üldproteolüütilise aktiivsusega. L.gasseri MCC2 eraldi või koos tüvega L.plantarum MCC1 kasutamine vähendab piimaallergiat ja seetõttu saab teda kasutada piimaallergiat vähendava toidutoote ja tervislike omadustega toidulisandi valmistamiseks.

Bioselektsioon konjugeeritud linoolhappe (CLA) produktsiooni alusel

CLA tähistab 18-süsinikulise rasvhappe, linoolhappe (LA, cis-9, cis-12-18:2) isomeeride rühma, kus kaksiksidemed on konjugeeritud. CLA moodustub looduslikult biohüdrogeenimise ja oksüdatsiooni protsesside käigus. CLA-l arvatakse olevat anti-adipogeenne, antikantserogeenne, anti-diabetogeenne ja põletikuvastane toime, regulatoorne toime immuunsüsteemile, tsütokiinide ja immuunglobuliinide produktsioonile ning võime moduleerida teatud geenide ekspressiooni kas otseselt või kaudselt läbi spetsiifiliste transkriptsiooni-faktorite (Wahle, K. W. J., Heys, S. D. and Rotondo, D. (2004). Conjugated linoleic acids: are they beneficial or detrimental to health? Prog. Lipid Res. 43: 553-587). Kuna mitmed piimhappebakterid on võimelised muutma linoolhapet konjugeeritud linoolhappeks, siis oleks võimalik tõsta fermenteeritud piimaproduktides CLA sisaldust (Sieber, R., Collomb, M., Aeschlimann, A., Jelen, P. and Eyer, H. (2004). Impact of microbial cultures on conjugated linoleic acid in dairy products - a review. Int. Dairy J. 14: 1-15).

Sel eesmärgil on vajalik testida, millised piimhappebakteritest on CLA tootjad. On teada, et mikroobide kasvukeskkonnas esinevad vabad rasvhapped on bakteriostaatilise toimega, mõjutades mikroobide kasvu ja rakumembraani permeaablust. Toime tugevus sõltub konkreetsest rasvhappest. Kõrgema küllastamatuse astmega pikaahelalised rasvhapped omavad tugevamat antimikroobset toimet. Kaksiksidemete stereokeemia mõjutab samuti antimikroobset aktiivsust: cis-konfiguratsiooniga rasvhape on tugevam inhibiitor kui trans-vorm (Kankaanpää, P. E., Salminen, S. J., Isolauri, E., Lee, Y. K. (2001). The influence of polyunsaturated fatty acids on probiotic growth and adhesion. FEMS Microbiol. Lett. 194: 149-153). Mikroobidel on väljakujunenud kaitsemehhanism elutegevust pärssiva ühendi kahjutustamiseks: polüküllastamata rasvhapped isomeriseeritakse vähem inhibeerivateks variantideks, näiteks tugevama bakteriostaatilise toimega linoolhape (LA) konverteeritakse CLA-ks (Sieber, R., Collomb, M., Aeschlimann, A., Jelen, P. and Eyer, H. (2004). Impact of microbial cultures on conjugated linoleic acid in dairy products - a review. Int. Dairy J. 14: 1-15). Suurem osa tekkinud CLA-st jääb keskkonda; üks osa liidetakse rakumembraani lipiidide koosseisu. On leitud, et CLA võib vähesel määral paikneda ka mikroobiraku sees. LA ja teiste rasvhapete (oleiinhape, ritsinoolhape) konjugeerimise võimet on leitud mitmete mikroobiperekondade esindajatel, sealhulgas Lactobacillus sp. Kasutatades meie poolt välja arendatud CLA-määramismeetodit hinnati kvantitatiivselt tüve võimet toota CLA kasvukeskkonda (MRS, lõss) lisatud linoolhappe baasil. Selgus, et L.gasseri MCC2, millel oli nii vajalik suunitletud proteolüütiline toime, tekitas CLA-d märkimisväärselt (Tabel 7). Samas polnud see tüvi sisuliselt tundlik LA bakteriostaatilisele toimele.

Bioselektsioon oksüresistentsuse (antioksüdantsuse) baasil.

Uuriti, kas tüvel L.gasseri MCC2, millel on spetsiifiline piiratud proteolüütilisus ja ka CLA-produktiivsus, on olemas füsioloogiliselt oluline oksüresistentsus. Oksüresistentsust peaks määrama vähemalt kahe meetodiga.

Esimese meetodina kasutati linoleenhappe-testi (LA-test), millega on võimalik määrata laktobatsillide rakususpensioonide võimet inhibeerida linoleenhappe peroksüdatsiooni.

Teise meetodina kasutati kommertsiaalset testi (Totaalne antioksüdantne staatus - TAS, Randox Laboratories Ltd., UK) , mis põhineb vesinikperoksiidi poolt genereeritud ferrüülmetmüoglobiin-radikaali tekke allasurumises laktobatsillide rakkude suspensiooni poolt (Rice-Evans and Miller 1994). TAS väärtus avaldati trolox (vitamiin E lahustuv vorm) ühikutes (mmol/L). Mõlemad meetodid on publitseeritud (Kullisaar T, Zilmer M, Mikelsaar M, Vihalemm T, Annuk H, Kairane C, Kilk A. (2002). Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics. Int. J. Food Microbiol. 72, 215-224; Kullisaar, T., Songisepp, E., Mikelsaar, M. , Zilmer, K. , Vihalemm, T., Zilmer, M. (2003) Antioxidative probiotic fermented goats milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human subjects. British Journal of Nutrition 90, 449-456).

TAA ja TAS-i määramiseks inkubeeriti tüvesid MRS-puljongis (Oxoid) 24t 37°C juures. Mikroobirakke tsentrifuugiti temperatuuril 4°C 1500 pööret/min 10 minuti jooksul, pesti isotoonilise soolalahusega (4°C) ja suspendeeriti 1,15% KCl (Sigma, USA). Suspensiooni tiheduseks oli OD260 1-1 juures 109 mikroobirakku/ml. L.gasseri MCC2 on füsioloogiliselt olulise totaalse antioksüdatiivsusega (Tabel 6).

Tabel 6. Oksüresistentsus TAA- ja TAS-meetoditel (n=7-9); M±SD)

Bioselektsioon lämmastikoksiidi ja vesinikperoksiidi produtseerimisvõime alusel

Eesmärgipärase informatsiooni saamiseks uuriti preselekteeritud tüvesid (spetsiifiline piiratud proteolüütilisus, CLA-produktsioon, antioksüdantsus) ka NO ja H2O2 produtseerimise suhtes. Kirjanduse andmetel pole eelnevaid uuringuid mikroobitüvede NO ja H2O2 samaaegse produktsiooni kohta. Mõõtmised viidi läbi elusrakkudega kasutades elektrokeemilist mõõtmist (Apollo 4000 vabade radikaalide anlüsaator WPI, Berlin, Saksamaa, kasutades ISO-HP02 ja ISO-NOP tüüpi elektroode. Elektroodid viidi MRS puljongis (Oxoid) kasvanud kultuuri,signaalid registreeriti samaaegselt 5-7 minuti kestel ning arvutati keskmine signaalitugevus mõõtmise aja jooksul. Iga eksperimendipunkti mõõdeti 4 sõltumatu paralleelina ja iga paralleeli mõõdeti kaks korda. Uuritava proovi NO ja H2O2 kontsentratsioonid tehti kindlaks proovi signaali võrdlemisel standardgraafikuga.

L.gasseri MCC2 on NO ja vesinikperoksiidi märkimisväärse produtseerimisvõimega (Joonis fig 4 ja 5).

Seega sobib tüvi L. gasseri MCC2 kasutamiseks antioksüdantse lisandina toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks.

Tabelis 7 on toodud tüvede L.plantarum MCC1, L.gasseri MCC2 ning nende kombinatsiooni funktsionaalsete omaduste kokkuvõte.

Tabel 7. Tüvede L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 ning nende kombinatsiooni funktsionaalsete omaduste kokkuvõte

Ülaltoodu kirjeldas leiutise objektiks olevat mikroorganismi tüve L.gasseri MCC2.

Järgmiseks leiutise objektiks on kompositsioon, mis sisaldab tüve L.plantarum MCC2.

Kompositsioonis on tüve L.gasseri MCC2 sisaldus vahemikus 0,8-1,2 mahuprotsenti ja iduarv 0,5x107-1x108 pmü/ml. Eelistatult on tüve sisaldus vähemalt 1,0 mahuprotsenti, kusjuures iduarv on 0,8x107-1,2x108 pmü/ml.

Kui kompositsioon sisaldab tüvesid L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2, siis on kummagi sisaldus vahemikus 0,4-0,6 mahuprotsenti, kusjuures L.plantarum MCC1 iduarv on vahemikus 0,2xl08-2,4xl08 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 iduarv vahemikus 0,4xl07-0, 6xl08 pmü/ml.

Mõlema tüve esinemise korral on eelistatult mõlema sisaldus vähemalt 0,5 mahuprotsenti, kusjuures tüve L.plantarum MCC1 iduarv on vahemikus 0,25xl08-2xl08 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 0,5xl07-0,5xl08 pmü/ml.

Eelnimetatud tüved võivad olla elusad või surmatud.

Leiutise järgmisteks objektideks on tüve L.gasseri MCC2 kasutamine

- antioksüdantse proteolüütilise koostisosana (ingrediendina) toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks,

- hüpoallergilise, piimaallergiat vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks,

- eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.

Leiutise järgmiseks objektiks on meetod piimaallergiat ja kuseteede vaevusi ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.

Leiutisekohane meetod hõlmab järgmisi etappe:

A) piimavalku sisaldavat lähtesegu soojendatakse 37+2°C;

B) lisatakse L.gasseri MCC2 kuni 1,2 mahuprotsenti, eelistatult 1 mahuprotsent iduarvuga 0,8x107-l, 2x108 pmü/ml. L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 kooskasutamisel lisatakse neid kokku kuni 1,2 mahuprotsenti, eelistatult 1 mahuprotsent, kusjuures L.plantarum MCC1 lisatakse 0,25x108-2x108 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 0,5x107-0,5x108 pmü/ml. Fermenteerimise lõpp-pH on 4,2+-0,25.

C) segu fermenteeritakse L.gasseri MCC2 toimel või L.gasseri MCC2 + L.plantarum MCC1 toimel temperatuuril 37+2°C vähemalt 18-26 tundi.

D) segu pastöriseeritakse vahemikus 80-85°C (eelistatult 82°C+2) 30-35 minutit (eelistatult 30 minutit) ning jahutatakse temperatuurile 20-30°C;

E) saadud segu maitsestatakse lisanditega ja jahutatakse temperatuurini 2-6°C.

F) saadud segu kasutatakse toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks. Toidutoote korral saadud segu villitakse, säilitatakse (2-6°C) ja tehakse vajalikud analüüsid (oksüresistentsuse määramine jt). Saadud segu saab kasutada pulbrilisel (kapslid, pastillid, tabletid, pulbrikotikesed jmt) või vedeliku kujul (ampullid) turustatava toidulisandi valmistamiseks.

Pulbrilise toidulisandi valmistamisel eemaldatakse saadud segust vesi, näiteks lüofiliseerimise (külmkuivatuse), pihustuskuivatuse, valtskuivatuse vm tuntud meetodi abil (kuni soovitud pulbrilise konsistentsi saamiseni). Vedela toidulisandi valmistamise korral eemaldatakse saadud produktist vesi osaliselt kuni soovitud konsistentsi saamiseni. Toidulisandi võib valmistada sobiva lisaainega (nt antioksüdandid, magusained, prebiootikumid) või ilma selleta.

Eelkirjeldatud meetodis on piimavalgu allikaks piim, piimapulber, piimavalgu kontsentraat, vadak vm piimavalgu allikas. Sobivaks lisandiks on puuvilja- või marjamahl, -kontsentraat, siirup või mahlajook, või puuvilja- või marjamoos, eelistatult astelpaju-, mustika- või vaarikamahl, vm mahl, siirup, kontsentraat.

JOONISTE LOETELU

Joonis fig 1 - MALDI-TOF mass-spektromeetriline analüüs (illustratiivne tüüp-eksperiment). Beeta-kaseiin pärast 30-minutilist segamist tüvega L.gasseri MCC2;

Joonis fig 2 - MALDI-TOF mass-spektromeetriline analüüs (illustratiivne tüüp-eksperiment). Pärast 48-tunnilist inkubatsiooni tüvega L.gasseri MCC2 oli beeta-kaseiini 24,0 kDa massispektri piik oluliselt elimineerunud. Joonis fig 3 - Tüvede L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 toime 48 ja 96-tunnilise inkubatsiooni puhul beeta-kaseiini tasemele (basaaltasemeks võeti 100%, MALDI-TOF mass-spektromeetrilise ja RP-HPLC analüüsi andmete põhjal).

Joonis fig 4 - NO produtseerimine tüvede L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 poolt.

Joonis fig 5 - H202 produtseerimine tüvede L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 poolt.

Joonis fig 6 - Toidutoote ja toidulisandi valmistamise skeem.

LEIUTISE TEOSTUSNÄITED

Näide 1. Meetod piima allergiavastuseid ning kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivse stressi ja põletikku vähendava, mikroorganisme L.plantarum MCC1 või L.gasseri MCC2 või nende kombinatsiooni sisaldava toidutoote ja eelnimetatud tervislike omadustega toidulisandi valmistamiseks.

Alljärgnevalt on esitatud eelistatud teostusnäide.

Piima allergiavastuseid ning kuseteede vaevusi vähendava toidutoote ja/või -lisandi valmistamiseks kasutati 24 t jooksul fermenteris ettekasvatatud ja seejärel lüofiliseeritud mikroobikultuure.

Toidutoote valmistamiseks aktiveeriti lüofiliseeritud mikroobikultuurid L.plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 väheses soojas (vähemalt 20°C) vadakus, piimas või piimapulbrist/piimavalgu kontsentraadist vm piimavalgu allikast valmistatud lahuses vähemalt 4 tunni jooksul.

Meetod tervislike omadustega toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks hõlmas järgmisi etappe (vt skeem joonisel fig 6):

a) Piimavalku sisaldav lähtesegu, juustutööstusest saadud vadak (keemilis-füüsikalised omadused tabelis 8), millest separeerimise teel oli vähendatud rasvafaasi ning eemaldatud juustutolm, soojendati fermentatsiooni-temperatuurini 37+2°C;

b) Lisati 1 mahuprotsent tüve L.plantarum MCC1 (iduarvuga 0,5x108-4x108 pmü/ml) või tüve L.gasseri MCC2 (iduarvuga 1x107-1x108 pmü/ml) või mõlemat koos (kumbagi 0,5 mahuprotsenti, mis sisaldas tüve L.plantarum MCC1 elusrakke tihedusega vahemikus 0,25-2x108 pmü/ml ja tüve L.gasseri MCC2 elusrakke tihedusega vahemikus 0,5x107-0,5x108 pmü/ml.

Tabel 8. Vadaku keemilis-füüsikalised omadused

c) Segu fermenteeriti 18...26 t temperatuuril 37+2 °C, mille jooksul toimus tüve(de) L.plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 toimel piimavalgu osaline hüdrolüüs. Fermentatsioon kestis happesuse jõudmiseni väärtusele pH 4,20 ± 0,25;

d) Tüve(de) L.plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 inaktiveerimiseks (surmamiseks) segu pastoriseeriti 82±2° C juures 30-35 min ning jahutati temperatuurile 20-30°C;

e) Saadud segu maitsestati selekteeritud lisanditega, milleks oli puuvilja- või marjamahl, -kontsentraat, siirup, mahlajook või puuvilja- või marjamoos. Näiteks kasutati 16...17 mahuprotsenti astelpajumoosi või 4,7...5 mahuprotsenti kirsi kontsentreeritud mahlajooki ja astelpajumahla ning 9,8...10,2 mahuprotsenti vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajooki.

f) Saadud segu jahutati 2-6°C, toidutoode villiti, tehti organoleptiline ja oksüresistentsuse analüüs ja säilitati (2-6°C) ning viidi läbi kliinilised uuringud (vt allpool).

Pulbrilise toidulisandi valmistamiseks eemaldati saadud segust vesi, kasutades selleks toiduainete tehnoloogias tuntud meetodeid (näiteks lüofiliseerimise või kuivatamise (pihustus-, valtskuivatamise jne) teel). Eelistatult kasutati pulbrilise toidulisandi valmistamiseks üheastmelist pihustuskuivatit (õhu sisenemise temperatuur 160°C ja väljuva õhu temperatuur 80°C).

Eelpool kirjeldatud viisil valmistatud segule lisati sobivat täiteainet, mille sulamispunkt on laktoosi sulamispunktist kõrgem, näiteks maltodekstriini (vahekorras 1:1 vadaku kuivainega).

Teise variandina kasutati vee, suhkru (laktoosi) ja soolade eraldamist ultrafiltratsiooniga, millele järgnes kontsentreerimine vaakumaparaadiga ja kuivatamine (pihustuskuivatamine), saades niiviisi väikse laktoosisisaldusega ja suure valgusisaldusega pulbrilise toidulisandi.

Kolmanda variandina kasutati vee eemaldamiseks kontsentreerimist vaakumaparaadiga, millele järgnes pihustuskuivatamine. Lõpptulemuseks oli laktoosi sisaldav pulbriline toidulisand.

Tabel 9. Toidutoote (vadakujoogi), mis sisaldas tüvesid MCC1+MCC2, ning mis oli maitsestatud astelpajumoosiga, ja toidulisandi, mis sisaldas tüvesid MCC1+MCC2, ning mis oli maitsestatud astelpajumoosiga, keemilis-füüsikalised omadused

Ülaltoodud viisil valmistati toidutooted TT-I - TT-V, mis sisaldasid leiutise objektideks olevaid mikroorganisme ja lisandeid alljärgnevalt:

Toidutoode I (ehk TT-I): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2; lisand astelpajumahl (AP) ;

Toidutoode II (ehk TT-II): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajook (VM).

Toidutoode III (ehk TT-III): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2; lisand mustasõstra-vaarika kontsentreeritud mahlajook (MV).

Toidutoode IV (ehk TT-IV): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand mustikakontsentraat (M).

Toidutoode V (ehk TT-V): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand pohla kontsentreeritud mahlajook (P).

Toidulisand I (ehk TL/FP-I): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2; lisand astelpajumahl (AP).

Toidulisand II (ehk TL/FP-II): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajook (VM).

Toidulisand III (ehk TL/FP-III): Piimavalku sisaldav segu + L.gasseri MCC2; lisand.

Tabel 10.

Toidutoote organoleptilise tüüptesti näide.

Degustaatorid (n = 15). Paluti hinnata järgmisi parameetreid: konsistents, värvus, lõhn, maitse ja happesus alljärgneva skoori alusel: 1 - vastik, 2 - mitte eriti vastuvõetav, 3 - vastuvõetav, 4 - hea, 5 suurepärane/ahvatlev

Näide 2. Lisandid piima allergiavastuseid ning kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivse stressi ja põletikku vähendava, mikroorganisme L.plantarum MCC1 või L.gasseri MCC2 või nende kombinatsiooni sisaldava toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks.

Toodete lisanditeks kasutati astelpaju mahla (AP) (valmistatud astelpaju marjadest, säilitusaineteta, külmpressitud ja pastöriseeritud), vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajooki (koostis: kontsentreeritud vaarika-mustikamahl (VM), suhkur, happesuse regulaator sidrunhape, säilitusaine kaaliumsorbaat, lahjendati 10 korda), pohla kontsentreeritud mahlajooki (P) ja mustikakontsentraati (M) (vt tabel 10). Lisanditel määrati antioksüdantsus (TAA ja DPPH testid) ning bioelementide sisaldused aatomabsorptsioonspektrofoto-meetrilisel (AAS) meetodil Spektra AAFS ja 220Z. (Varian, Austraalia), Cu, Zn, Fe, Mn sisaldused määrati AAS-leekmeetodil, K sisaldused emmisioonmeetodil-õhk-atsetüleen segus. Lõpptoote organoleptilised testid viidi läbi vastavalt kehtivatele nõuetele spetsiaalsete küsitluslehtedega. Tulemused on toodud Tabelis 10.

Näide 3. Kliiniline uuring nr. 1.

Toodete ohutus ja kasulikud toimed, biokeemilised-kliinilised ja organoleptilised testid

Mitmekülgse bioselektsiooniga saadud multibiopotentsete tüvede ja lisandite kasutamise ning sobiva tehnoloogise skeemi rakendamisega (vt näide 1) saadi toidutooted TT-I (MCC1+ L.gasseri MCC2, AP) ja TT-II (MCC1, VM). Järgnevalt teostati kliinilisi uuringuid (kooskõlas Tartu Ülikooli Inimuuringute Eetikakomitee poolt heakskiidetud Maailma Arstide Liidu Helsinki Deklaratsiooniga (Declaration of Helsinki of the World Medical Association, approved by the Ethics Committee, UT)) selgitamaks toidutoodete TT-I ja TT-II ohutust ja tervislikke toimeid.

Kliinise katsetuse üldskeem oli järgmine: 25 vabatahtlikku (11 naist, 14 meest) vanuses 40-65 eluaastat jagati juhuslikult kahte gruppi järgmiste uuringusse kaasamise kriteeriumide alusel: isikud ilma kliiniliste probleemideta, krooniliste haigusteta, spetsdieetideta, vitamiinide, mineraalainete preparaatide tarbimiseta, osalejad ei pea muutma oma füüsilist aktiivsust, alkoholi tavatarbimist, suitsetamisharjumusi ega söömisharjumusi. Enne ja pärast kahenädalast igapäevast 200g toidutoote TT-I (n=10) või TT-II (n=15) tarbimist määrati järgmised biokeemilis-kliinilised parameetrid: põletikumarkerid (hsCRP, MPO, IL-6, IL-10), lipiidide ja lipoproteiinide markerid (TG, kolesterool, LDL-kolesterool, HDL-kolesterool, sdLDL), immuunglobuliinid (IgM, IgA, IgG, IgE), oksüdatiivse stressi (OxS) markerid (isoprostaanid, oxLDL, LDL-b2GPI), vere glükoos, vererõhk ja uriini kreatiniin. Tulemused

1) Ohutus

Igapäevase küsitlusankeedi teadusanalüüs näitas, et kahenädalasel tarbimisel ükski katsealune ei kaevanud ebamugavustunnet ega seedekulglaprobleeme ega esinenud mingeid negatiivseid nähte. TT-I või TT-II tarbimine ei omanud toimeid, mis oleksid viinud nende biokeemilisi ja kliinilisi näitajaid väljapoole endeemiliste referentsväärtuste piire. Nad ei tõstnud IgE antikehade kui ühe olulise allergiamarkeri hulka võrreldes katse-eelse perioodiga, ei tekitanud põletikureaktsiooni (hsCRP oxLDL, MPO, IL-6) ega muutnud ka vere lipiidide, lipoproteiinide (TG, LDL, HDL) ja glükoosi väärtusi ega suurendanud OxS taset organismis (isoprostaanid, oxLDL, MPO, sdLDL, LDL b2GPI) (Tabel 10) ja ei kahjustanud neeru-funktsioone (uriini kreatiniin). Seega: leiutise ideoloogia põhjal saadud TT-I ja TT-II ei kutsu tervetel isikutel esile ei põletikureaktsioone, üldist allergilist sensibilisatsiooni, OxS ega kahjusta seega organismi.

2) Tervist soodustavad toimed

Esimese kliinilise uuringu tulemuste analüüs näitas, et TT-I või TT-II tarbimine indutseeris mõningaid statistiliselt tõeseid ja mõnevõrra erinevaid positiivseid toimeid (Tabel 10). TT-I avaldas kogu organismi süsteemse OxS koormust vähendavat toimet (uriini isoprostaanide ja vere MPO taseme langus) ja põletikuvastast toimet (vere MPO langus). TT-II vähendas kogu organismi süsteemse OxS koormust (uriini isoprostaanide taseme langus), ja avaldas süsteemset põletikuvastast toimet (hc-CRP langus ja IL-10 tõus). Samas ei muutnud mõlema toidutoote tarbimine immuunglobuliinide IgM, IgA ja IgM arvulisi väärtusi.

Seega: esimene kliiniline uuring näitas, et leiutise ideoloogia (tüvede multivariantne suunitletud bioselektsioon, lisandite bioselektsioon ja tehnoloogiline lahendus) andsid toidutooted, mis on ohutud ning omades mitmeid põletik- ja oksüdatiivne stress-seotud toimeid on hüpallergilisemad (annavad vähem allergiavastuseid võrreldes lehmapiimaga) ning omavad positiivset efekti biokeemilistele ja kliinilistele parameetritele ka eesnäärmevaevustega (sh kusemishäiretega) isikute puhul.

Tabel 11. Biokeemilised ja kliinilised parameetrid (kliiniline uuring nr. 1; M± SD)

Näide 4. Kliiniline uuring nr 2. Lehmapiimavalguallergia uuringud lastel

Lehmapiimavalgust tingitud reaktsioone esineb 5-15% imikutest (Host A. (2002). Frequency of cow's milk allergy in childhood. Ann Allergy Immunol 89 (Suppl l):33-7), kuid lehmapiimavalguallergiat (LPVA) esineb 2-7,5% (Hill DJ, Firer MA, Shelton MJ et al. (1986) Manifestation of milk allergy in infancy: clinical and immunologic findings. J Pediatr 109: 270-6). LPVA võib olla IgE või mitteIgE vahendatud. Varasteks reaktsioonideks on reeglina urtikaaria, angioödeem, oksendamine või atoopilise dermatiidi ägenemine. Hilisreaktsioonina esinevad atoopilise dermatiidi ägenemine või gastrointestinaalsed vaevused (Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2007) Guidelines for the diagnosis and management of cow's milk protein allergy in infants. Arch Dis Child. 92:902-908). Ükski eksisteerivatest diagnostilistest testidest ei tõesta ega lükka ümber, kas lapsel on LPVA või ei (Vanto T, Juntunen-Backman K, Kalimo K et al. (1999) The patch test, skin prick test, and serum milk-specific IgE as diagnostic tools in cows' milk allergy in infants. Allergy 54:837-42). Seetõttu on LPVA diagnostiliseks kuldstandardiks eliminatsioonidieet sellele järgneva provokatsiooniga (Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2007) Guidelines for the diagnosis and management of cow's milk protein allergy in infants. Arch Dis Child. 92:902-908). Provokatsioonitesti protokollina kasutati Isolauri et ai poolt kirjeldatud ja rahvusvaheliselt tunnustatud skeemi taoliste uuringute jaoks (Isolauri E, Turjanmaa K. (1996) Combined skin prick and patch testing enhances identification of food allergy in infants with atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol;97:9-15; Sütas Y, Kekki O-M, Isolauri E. (2000) Late onset reactions to oral food challenge are linked to low serum interleukin-10 concentrations in patients with atopic dermatitis and food allergy. Clin Exp Allergy 30:1121-8).

Metoodika

Avatud provokatsioon toidutoodetega TT-II ja TT-I-ga viidi läbi SA Tartu Ülikooli Kliinikumi (TÜK) Lastekliiniku Allergiahaiguste keskuses (kooskõlas Tartu Ülikooli Inimuuringute Eetikakomitee poolt heakskiidetud Maailma Arstide Liidu Helsinki Deklaratsiooniga (Declaration of Helsinki of the World Medical Association, approved by the Ethics Committee, UT)). Testimine viidi läbi 20 korda (osa katsealuseid osales mõlema toidutoode uuringus) lastega vanuses 9 kuud - 4 aastat 8 kuud (keskmine vanus 25,1 kuud). Uuringueelne taust oli järgmine: kõigil lastel oli diagnoositud lehmapiimaallergia ja/või talumatus TÜK Lastekliiniku Allergiahaiguste keskuse arsti poolt (IgE test piimale, NTT piimale), toetudes anamneesile ja abiuuringutele. Kõik uuringugrupi lapsed olid piimavabal eliminatsioonidieedil. Piima tarbimise järgselt tekkis 9-1 lapsel nahalööve, enamasti atoopilise dermatiidi ägenemine, ühel lapsel äge nõgeslööve, ühel lapsel kõhulahtisus. Ühel lapsel tekkis hingamisraskus ja nahalööve ainult töödeldud piimaproduktide söömise järgselt. 3-l lapsel oli kaasuvana diagnoositud astma, neist ühel ka allergiline riniit ja ühel õietolmuallergia (pollinoos). Ühel lapsel esinesid kaasuvate haigustena astma ja õietolmuallergia. Lastest keegi ei saanud antihistamiinset ega kortikosteroidravi. Kolmel lapsel oli kaasuva haigusena astma remissioonis, mistõttu nad ei saanud astma püsiravi provokatsioonitesti tegemise ajal.

Avatud suukaudne provokatsioon viidi läbi esimesel uuringupäeval TÜK Lastekliiniku Allergiahaiguste keskuses. Lapsele anti suurenevas koguses (tilk alahuulele, 2ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) uuritavat toodet (TT-II või TT-I). Iga koguse järgselt hinnati lapse seisundit ja allergilise reaktsiooni teket 20 minuti jooksul. Lööbe, köha, hingamisraskuse või kõhuvalu/kõhulahtisuse tekkimisel katkestati toote edasine manustamine koheselt. Kui lapsel esimesel uuringupäeval kuni 100 ml toote järgselt reaktsiooni ei tekkinud, sai laps teisel, kolmandal ja neljandal päeval uuritavat toodet 100 ml/päevas kodus. Lapsevanematel paluti hinnata hilisreaktsioonide teket. Test loeti positiivseks, kui tekkis: a) varajane reaktsioon - esimesel provokatsioonipäeval väikese koguse toote andmise järgselt tekkis sügelus, lööve, nõgeslööve või oksendamine; b) hilisreaktsioon - dermatiidi ägenemine, oksendamine, kõhuvalu, kõhulahtisus tekkis rohkem kui 24 tundi hiljem uuritava toote provokatsiooni alustamist. Avatud provokatsioonitest oli negatiivne, kui provokatsiooni ajal (neljal päeval) ega ka selle järgsel nädalal reaktsiooni ei tekkinud. Seega uuritav talus seda uuritavat toodet.

Tulemuste kokkuvõte

Toidu allergilisuse probleemi lahendamine on äärmiselt komplitseeritud ja absoluutselt allergiliste reaktsioonide vaba, aga kõrge biokvaliteediga toodete loomine pole võimalik. Probleemi teeb veelgi keerulisemaks see, et nüüdisajal võib lapsel esineda allergiline reaktsioon mitmete toidutoodete (aga ka muude olmefaktorite suhtes) korraga. Viimane asjaolu ilmnes ka meie uuringutes (vt Tabel 5) , mistõttu on raske välistada, et antud hetkel ei avaldunud positiivne vastuslööve hoopis muude põhjuste poolt initseerituna. Seetõttu oli leiutise fookus suunatud sellele, et tulemuseks oleks vähem allergilisi vastuseid, st saadud toidutooted oleksid hüpoallergilisemad kui lehmapiim. Suurendaks ju iga protsent antud toidutoodetele allergiavabu või vähem allergilisi lapsi nende laste hulka, kes saaksid oma bioloogilise arengu tähtsamal perioodil täisväärtuslikuks arenguks piisavalt bioloogiliselt kõrgväärtuslikku toitu. Provokatsioonitest näitas, et nii toidutoode TT-II kui ka TT-I olid hüpoallergilisemad kui lehmapiim (Tabel 5). Vähemalt 3...4 lapsel 12-st ei tekkinud TT-I tarbimisel provokatsioonitesti alusel mingit allergilist reaktsiooni. Kolmel testitaval kaheksast ei tekkinud TT-II tarbimisel mingit allergilist reaktsiooni. Viiest testitavast, kellel toidutoode TT-I tingis siiski teatud reaktsiooni, talusid kolm aga TT-II (60%). TT-II on seega juhtude mõttes veelgi hüpoallergilisem kui TT-I. TT-II eelistasid enamik lapsi ka maitseliste omaduste tõttu.

Tabel 12. Lehmapiimaallergilise vastuse uurimine (hüpoallergilisuse uuring)

Näide 5. Kliiniline uuring nr 3. Toidutoodete TT-I ja TT-II mõju eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevate alumiste kuseteede ärritussümptomitele ning oksüdatiivsele stressile ja põletikunäitajatele.

Eespoolsed kliinilised uuringud näitasid, et leiutise ideoloogia (tüvede multivariantne suunitletud bioselektsioon, lisandite bioselektsioon ja tehnoloogiline lahendus andsid toidutooted TT-I ja TT-II, mis on kasutamisel ohutud ning omades mitmeid põletik- ja oksüdatiivne stress-seotud toimeid, on hüpollergilisemad ning omavad positiivset efekti kuseteede ärritussümptomitele ning OxS ja põletiku näitajatele.

Metoodika

Osales 55 meest (manustasid TT-I) ja 5 meest (manustasid TT-II), kellel esines kerge või mõõdukas IPSS (International Prostate Symptom Score, rahvusvaheline eesnäärme sümptomite skoor) - väiksem kui 8. IPPS küsimustik hõlmab 3 küsimust, mis hindavad alumiste kuseteede ärritussümptomeid ja 4 küsimust, mis hindavad kusemistakistust (obstruktiivseid sümptomeid). Tehti ka vajalikud eeluuringud (PSA eesnäärme sekreet) uuringugrupi täpseks selektsiooniks. See tähendab, et eesnäärmesekreedi uuringute ja NIH-CPSI küsimustikuga oli välistatud aktiivne prostatiit (eesnäärmepõletik) ning PSA-testi ja digitaalse palpatsiooni abil kliiniliselt eesnäärmevähi võimalus. Uuringugruppi kaasasime seega väheste või keskmise raskusastme kusemishäiretega mehed, kellel olid välistatud teised kaebuste põhjused (prostatiit, eesnäärmevähk). Patsiendid (kerge ja keskmise kusemishäirega, ilma põletikureaktsioonita) tarbisid toidutoodet TT-I või TT-II kahe nädala jooksul 200 g päevas.

Tulemused

TT-I. Viidi läbi kaks katseseeriat. Esimeses oli 23 patsienti ja teises (mille puhul tehti ka platseebokontroll) oli 32 patsienti (Tabel 13). Mõlemal korral ilmnes põletikumarkeri hsCRP ja OxS markeri isoprostaanide statistiliselt tõene langus. Teine katseseeria tõi välja ka anti-inflammatoorse IL-10 ning põletiku/OxS marker oxLDL statistiliselt positiivsed muutused. Esimeses katseseerias (n=23) ilmnes samuti nende markerite positiivse muutuse trend. Teises katseseerias määrati ka glükosüülitud hemoglobiini tase, mille langus oli statistiline.

Kui summeerida mõlema katseseeria tulemused (Tabel 13), siis alanenesid statistiliselt hsCRP, isoprostaanid ja oxLDL, positiivne langusetrend oli ka IgE puhul ning statistiliselt tõusis IL-10. Esines korrelatsioon hsCRP ja oxLDL vahel pärast TT-I tarbimist. Kontrollrühmas (platseebo) ei ilmnenud statistiliselt tõenäolisi muutusi ühegi nimetatud parameetri puhul.

TT-II. Viidi läbi üks katseseeria ja määrati järgmised näitajad: IgE kU/L, oxLDL, IL-10, 8-isoprostaanid, hsCRP ja MPO. Leiti, et TT-II kasutajate grupil toimus põletiku- ja OxS-markeri MPO-taseme statistiliselt oluline vähenemine (enne 77+13 ja pärast 53±9 ng/ml, p=0,0056) ja kusemishäirete sageduse vähenemine üle 40%-l tarbijatest.

Tulemuste kokkuvõte

Nii TT-I kui ka TT-II manustamine langetasid OxS-i ja põletiku taset katsealustel, kel esinesid mõõdukad alumiste kuseteede vaevused (IPSS väiksem kui 8 palli) ja olid juhtival kohal ärritussümptomid. TT-I puhul 66%-l uurimisrühma meestest (55), kel esinesid mõõdukad alumiste kuseteede vaevused (IPSS väiksem kui 8 palli) ja olid juhtival kohal ärritussümptomid, toimus vaevuste vähenemine keskmiselt 20% ulatuses ning 30%-l uurimisrühmast toimus vaevuste vähenemine keskmiselt 40% ulatuses. Patsientide kliinilised ja biokeemilised näitajad (hs-CRP, IL-10, oxLD, 8-isoprostaanid) paranesid statistiliselt tõenäoliselt. Kontrollgrupil muutusi ei esinenud.

Tabel 13. TT-I uuringute katseseeriad (M±SD)

Näide 6. Toidulisandi (TL/FP-I) mõju eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevate alumiste kuseteede ärritus-sümptomitele ning oksüdatiivsele stressile ja põletikunäitajatele.

Uuringusse kaasati 10 meest, kellel esines kerge või mõõdukas kusemishäire - IPSS (rahvusvaheliste eesnäärmevaevuste skoor), kusjuures eelnevate eesnäärmesekreedi uuringute põhjal - NIH-CPSI-küsimustik - oli välistatud aktiivne eesnäärmepõletik ning PSA-testi ja digitaalse palpatsiooni abil kliiniliselt olulise eesnäärmevähi võimalus. Toidulisandit tarbiti 45 g päevas 14 päeva jooksul. Kõigil 10-l vähese (IPSS 2-7 palli) ja keskmise (IPSS 8-19 palli) kusemishäirega patsiendil, vastavalt 3/7, paranesid kusemishäired pärast toidulisandi tarvitamist (p=0,003) vastavalt "Rahvusvahelise prostata sümptomite küsimustikule" 50-66% ulatuses, kusjuures eriti märgatav positiivne muutus toimus vajaduse vähenemisel öösel urineerida (keskmiselt 87,5%).

Koondkokkuvõte kõigist kliinilistest uuringutest

L.gasseri MCC2 sisaldavad toidutooted ja toidulisandid on hüpoallergilised, OxS taset langetavad ja omavad statistiliselt tõest mõju eesnäärmevaevustele neil, kel esinevad mõõdukad alumiste kuseteede vaevused ja kellel on juhtival kohal ärritussümptomid.

Claims (9)

1. Isoleeritud mikroorganismi tüvi L.gasseri MCC2 DSM 23882.

2. Punktile 1 vastav mikroorganism surmatud kujul.

3. Kompositsioon, mis sisaldab punktidele 1-2 vastavat mikroorganismi.

4. Punktidele 1 ja 2 vastava mikroorganismi kasutamine antioksüdantse proteolüütilise koostisosana, ingrediendina toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.

5. Punktidele 1 ja 2 vastava mikroorganismi kasutamine hüpoallergilise, piimaallergiat vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.

6. Punktidele 1 ja 2 vastava mikroorganismi kasutamine eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.

7. Meetod piimaallergiat ja kuseteede vaevusi ning sellega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks, mis hõlmab järgmisi etappe: A) piimavalku sisaldav lähtesegu soojendatakse (37±2°C); B) lisatakse 1 mahuprotsent punktile 1 vastavat mikroorganismi iduarvuga 0,5x107-0,5x108 pmü/ml; C) saadud segu fermenteeritakse temperatuuril 37±2°C 18...26 tundi; D) segu pastoriseeritakse temperatuuril 82±2°C 30-35 minutit ja jahutatakse temperatuurile 20-30°C; E) segu maitsestatakse lisandiga, saadud toidutoode jahutatakse 2-6°C; F) pulbrilise toidulisandi valmistamise korral eemaldatakse segust vesi kuni pulbrilise konsistentsi saamiseni ning vedela toidulisandi valmistamise korral eemaldatakse segust vesi osaliselt kuni soovitud konsistentsi saamiseni.

8. Meetod vastavalt punktile 7, kus lisandiks on puuvilja- või marjamahl, kontsentraat, siirup või mahlajook või puuvilja- või marjamoos, eelistatult astelpaju-, mustika- või vaarikamahl.

9. Meetod vastavalt punktile 8, kus piimavalgu allikaks on vadak, kontsentreeritud vadak, vadakupulber, piim, piimapulber või piimavalgu kontsentraat.