[go: up one dir, main page]

EE05721B1 - Isoleeritud mikroorganismi tüvi L. plantarum MCC1 DSM 23881 ja selle kasutamine - Google Patents

Isoleeritud mikroorganismi tüvi L. plantarum MCC1 DSM 23881 ja selle kasutamine

Info

Publication number
EE05721B1
EE05721B1 EEP201100012A EEP201100012A EE05721B1 EE 05721 B1 EE05721 B1 EE 05721B1 EE P201100012 A EEP201100012 A EE P201100012A EE P201100012 A EEP201100012 A EE P201100012A EE 05721 B1 EE05721 B1 EE 05721B1
Authority
EE
Estonia
Prior art keywords
milk
microorganism
dsm
plantarum mcc1
cfu
Prior art date
Application number
EEP201100012A
Other languages
English (en)
Inventor
Tiiu Kullisaar
Mihkel Zilmer
Ene Tammsaar
Andre Veskioja
Epp Songisepp
Kersti Zilmer
Lauri Bobrovski
Kersti Ehrlich
Merle Rätsep
Margus Punab
Maire Vasar
Marika Mikelsaar
Original Assignee
OÜ Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OÜ Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus filed Critical OÜ Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus
Priority to EEP201500006A priority Critical patent/EE05750B1/et
Priority to EEP201100012A priority patent/EE05721B1/et
Priority to KR1020137025333A priority patent/KR101586778B1/ko
Priority to EP12709275.7A priority patent/EP2678419B1/en
Priority to JP2013554795A priority patent/JP5785275B2/ja
Priority to CN201610114800.5A priority patent/CN105733983B/zh
Priority to US14/001,005 priority patent/US20140037792A1/en
Priority to RS20150862A priority patent/RS54478B1/sr
Priority to PCT/EE2012/000001 priority patent/WO2012126481A1/en
Priority to RU2013143134/10A priority patent/RU2603059C2/ru
Priority to EP15002155.8A priority patent/EP2966164B1/en
Priority to CN201280020352.2A priority patent/CN103649304B/zh
Publication of EE201100012A publication Critical patent/EE201100012A/et
Publication of EE05721B1 publication Critical patent/EE05721B1/et

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C21/00—Whey; Whey preparations
    • A23C21/02—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes
    • A23C21/026—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes containing, or treated only with, lactic acid producing bacteria, bifidobacteria or propionic acid bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/04—Animal proteins
    • A23J3/08—Dairy proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
    • A23J3/22—Working-up of proteins for foodstuffs by texturising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Preparation or treatment thereof
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/66—Proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C2220/00—Biochemical treatment
    • A23C2220/20—Treatment with microorganisms
    • A23C2220/208—Fermentation of skim milk or milk and its addition in a small quantity to unfermented skim milk or milk, e.g. cheese milk; Addition of yoghurt to cheese milk
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/145—Gasseri
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/169—Plantarum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Dairy Products (AREA)

Abstract

Leiutis käsitleb mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum MCC1 DSM 23881 ning selle kasutamist eraldi või kombinatsioonis Lactobacillus gasseri tüvega MMC2 DSM 23882 antioksüdantse proteolüütilise koostisosana toidutoote või toidulisandi valmistamiseks. Nimetatud mikroorganisme sisaldavad toidutooted ja toidulisandid on hüpoallergilised, nende tarbimine vähendab piimaallergiat ja eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid, nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku.

Description

Leiutis kuulub biotehnoloogia valdkonda ja leiab kasutamist toidutoodetetööstuses. Täpsemalt käsitleb leiutis mikroorganismi tüve L.plantarum MCC1 ja selle kasutamist piimaallergia ja eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevate alumiste kuseteede ärritussümptomite ning nendega seotud oksüdatiivse stressi ja põletiku vähendamiseks.
Laktobatsille on laialdaselt kasutatud tervislike toidutoodete valmistamiseks juba kaua aega, näiteks juuretistena.
Levinuim võte on laktobatsiilide kasutamine funktsionaalses toidus. Funktsionaalne toit on toidutoode, mis peale tavaliste toiteliste väärtuste omab looduslikke lisakomponente, mis kasulikult mõjustavad organismi mingeid funktsioone või vähendavad haiguste riski.
Vähem on kasutusel aga võtteid, kus toidutoote valmistamisel on kasutatud eesmärgipäraselt bioselekteeritud elusaid laktobatsille, mis järgmises tehnoloogilises etapis pastoriseerimisega surmatakse. See tähendab, et lõpptoode ei sisalda elavaid piimhappebaktereid, kuid eeltöötluse, sobiva tehnoloogilise skeemi ja vajalike lisandite abil loodud tootel on eesmärgipärane biotoime.
Piimaallergia, selle leevendamine
Infektsioonid, põletiku-, allergia- ja oksüdatiivse stress1-seoselised probleemid näiteks toiduallergiad, kuseteede vaevused (nt eesnäärmevaevustega seotud kusemishäired) muutuvad ühiskonnale majanduslikult üha koormavamaks. Näiteks kuni 4% inimestest kannatab toiduallergiate all ja 100...200 surmajuhtu on USAs otseselt toiduallergiast tingitud. Toiduallergiad (sh allergiline reaktsioon lehmapiimale) on eriti tõsine probleem väikelaste puhul. On ju piimatoodete kasutamine väikelastel hädavajalik nende normaalse kasvu ja arengu tagamiseks. Toidu allergilisuse probleemi lahendamine on äärmiselt komplitseeritud, sest absoluutselt allergiliste reaktsioonide vaba aga samas väga kõrge hea biokvaliteediga toodete loomine pole võimalik. Viimased diskussioonid ÜRO-s, FAO-s ja WHO-s on deklareerinud järgmist - allergen-free: time to clarity; statement: there is no actual legislation to declare free from all allergens. Seega: igasuguseid tehnoloogilisi ideid/lahendusi, mille tulemiks on hüpoallergilisemad tooted, mis vähendaksid vähemalt mõne protsendi võrra allergiliste vastustega väikelaste arvu, hinnatakse kõrgelt. Allergiliste vastuste vähenemise iga protsent on lõppkokkuvõttes/pikemas perspektiivis väga tähtis, sest mistahes edu allergia valdkonnas toidutoodete allergeensuse vähendamiseks omab olulist sotsiaalmajanduslikku väljundit (sh elukvaliteedi paranemine lastel ja täiskasvanutel ning ravikulutuste vähenemist).
Piimatoodete allergilisuse määravad valgud, kuid raske on esile tuua ühte nn põhi-allergeeni (Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (EFSN) AP, 2 003, Wal, J. M. (2 004) Bovine milk allergenicity. Ann.Allergy Asthma Immunol., 93, S2-11). Siiski kutsuvad nii kaseiin kui ka beeta-laktoglobuliin võrdses proportsioonis esile allergilisi reaktsioone. Lehmapiima allergia on seotud valdavalt a-kaseiini ja b-laktoglobuliiniga (Host A. (2002). Frequency of cow's milk allergy in childhood. Ann Allergy Immunol 89(Suppi 1):33-7; EFSN, 2003. Paljudel piimaallergiaga lastel on reaktsioon alfa-kaseiini suhtes (Hill D.J, Firer M.A, Shelton M.J et ai. (1986) Manifestation of milk allergy in infancy: clinical and immunologic findings. J Pediatr 109: 270-6; EFSN, 2003, Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2 007) Guidelines for the diagnosis and management of cow!s milk protein allergy in infants. Arch Dis Child. 92:902-908).
Kaseiin koosneb järgmistest subühikutest: a-S1 (peamine allergeen), a-S2, b- ja k-kaseiin, sealjuures ülekaalus on a-S1 ja b-kaseiin. Piimavalkude ensümaatiline hüdrolüüs vähendab nende allergeensust. Piimavalkude osalisel hüdrolüüsil tekivad suured peptiidid, põhjalikum hüdrolüüs annab suurte ja väikeste peptiidide ning aminohapete segu. Isegi põhjalik pepsiin-trüpsiin hüdrolüüs ei anna allergiavaba tulemust, sest natiivse valgu immunoreaktiivsete osiste tühised hulgad võivad anda allergilise reaktsiooni. Seega ainult põhjaliku hüdrolüüsi-põhine lähenemine on tekitanud teatud võimalusi, ei paku aga lõplikku lahendust, ka vadakuvalkude hüdrolüsaatide puhul (Businco L, Cantani A, Longhi MA, Giampietro PG. (1989) Anaphylactic reactions to a cow's milk whey protein hydrolysate (Alfa-Re, Nestle) in infants with cow' s milk allergy. Ann Allergy. 62(4):333-5.; Sämpson HA, James MJ, Bernhisel-Broadbent J. (1992) Safety of an amino-derived infant formula in children allergic to cow milk. Pediatrics. 90,463-465). Nii vajatakse uusi lähenemisi lehmapiima allergia vähendamiseks, mistõttu allergiat põhjustavate piimavalkude suunatud hüdrolüüs mikroorganismi(de) tüve(de)ga, mis annavad toodetele ka lisaväärtusi, on perspektiivne suund allergiaprobleemide oluliseks vähendamiseks.
Piimavalkude hüdrolüüsi piimhappebakterite ja lisaainete abil on varem kirjeldatud. Patendis EE03424 (patenditaotlus WO9700078, Valio Oy) kirjeldatakse L.rhamnosus ATCC 53103 (LGG) tüve kasutamist allergiavastase valguhüdrolüsaadipreparaadi valmistamiseks, kus valgud hüdrolüüsitakse pepsiini ja trüpsiiniga. LGG kasutamist allergiariski vähendamiseks käsitletakse mitmes Nestec SA leiutises. Patendis EP1296694 kirjeldatakse LGG kasutamist laste atoopiliste haiguste riski vähendamiseks. Patenditaotluses WO2008116907 on näidatud bifidobakterite ja LGG, L.rhamnosus CGMCC 1.3724, L.reuteri ATCC 55730 ja L. paracasei CNCM I-2116 kasutamist keisrilõikega sündinud imikutel allergiariski vähendamiseks, sh ka koos osaliselt (2-20%) hüdrolüüsitud proteiinidega. Nestec SA patenditaotluses WO03099037 on kirjeldatud piimhappebakterite proteolüütilist süsteemi ja Bifidobacterium laetis ATCC 27536 jt sisaldavat toidutoodet kasutamiseks mh ka toiduallergia vähendamiseks, kusjuures nimetatud bakterid võivad olla inaktiveeritud või surnud (inaetivated or dead). Patendis EE04724 (patenditaotlus W09929833, Arla Foods) kirjeldatakse L.paracasei subsp. paracasei kasutamist, sh lastel atoopiliste probleemide leevendamiseks. Patendis EP1175156 (Bioferme OY) kirjeldatakse mikroorganisme sisaldavat pastöriseeritud teraviljajooki. Patenditaotluses CN101427782 (Min Zhao) kirjeldatakse bifidobakterit sisaldavat maisijooki, mis valmistatakse fermenteerimise abil ja kus bakterid fermenteeritud tootes inaktiveeritakse. Vadakuproteiinikontsentraadis (WPC, whey protein concentrate) on maksimaalseks [b-laktoglobuliini hüdrolüüsiks saavutatud 21% (M. Pescuma et ai (2007) , Hydrolysis of whey proteins by L. acidophilus, Streptococcus thermophilus and L. delbrueckii ssp. bulgaricus grown in a chemically defined medium, Journal of Appi Microbiol, 103,5,1738-1746). Piimavalkude hüdrolüüsi (2-32%) kahe mikroorganismi toimel eesmärgiga saada heade maitseomadustega toodet on kirjeldatud Euroopa patendis EP1383394 (New Zealand Dairy Board), kus üheks mikroorganismiks on pakutud Macrococcus, Micrococcus, Entercoccus, Staphylococcus, Brevibacterium, Anthrobacter või Corynebacterium, eelistatult Macrococcus caseolyticus, teiseks mikroorganismiks piimhappebakter Lactococcus, Lactobacillus, Pediococcus või Leuconostoc, ja fermentatsioon lõpetatakse mikroorganismide eemaldamise või surmamise teel. Jaapani patenditaotluses JP7203844 (Morinaga Milk Industry Co) kirj eIdatakse piimavadaku osalist hüdrolüüsi (30%) mikroorganismist Bacillus subtilis saadud ensüümi, trüpsiini ja papaiini abil.
Eesnäärmevaevused, nende leevendamine
Eesnääre võib põhjustada mitmeid vaevusi: urineerimistakistust ja ärritust ning valu või ebamugavustunnet väikevaagna piirkonnas. Eesnäärmevaevused, just urineerimisega seotud probleemid on väga levinud, ning halvendavad paljude meeste elukvaliteeti. Hinnanguliselt esineb prostata hüperplaasiat (eesnäärme liigkasv, Benign prostatic hyperplasia (BPH)) umbes pooltel 50-aastastest ning umbes 70% üle 70-aastastest meestest. Eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevad alumiste kuseteede sümptomid (Lower urinary tract symptoms (LUTS)) hõlmavad ärritavaid ja obstruktiivseid (tühjendamise) sümptomeid, mille hindamisel on kasutusel rahvusvaheline eesnäärme sümptomite skoor, International Prostate Symptom Score - IPSS). Iga mitte-medikamentoosne võimalus, mis leevendaks meeste urineerimisraskusi oleks igati hinnatud ja parim on, kui sellist toimet omaks mõni uudne toidutoode.
Mitmetes patenditaotlustes on kirjeldatud piimhappebakterite kasutamist terapeutilistes kompositsioonides urogenitaalsete infektsioonide, sh eesnäärmepõletiku ravimiseks ja leevendamiseks, kusjuures kompositsioonid sisaldavad üht või mitut liiki piimhappebakterit (US2008274162, Nessa Jeffrey Bryan et ah, 2007) .
Piimahappebakterite kombinatsiooni, mille üks komponent sisaldab L.crispatus, L.salivarius ja L.casei ja teine komponent sisaldab L.brevis, L. gasseri ja L.fermentum saab kasutada toidulisandina või farmatseutilise kompositsioonina infektsioonide ja põletike, sealhulgas uretriidi raviks või ärahoidmiseks (EE04620, Actial Farmaceutica Lda, 2000). Piimahappebakterit L.coprophilus PL9001 (KCCM-10245) on kasutatud urogenitaalsete infektsioonide ärahoidmiseks ja ravimiseks (KR20040067161, PL BIO Co Ltd., 2003). Uroloogias lokaalraviks mõeldud farmatseutilised kompositsioonid võivad aktiivse toimeainena sisaldada piimhappebaktereid L.casei, L.gasseri (EP353581, Silvana Tosi et ai., 1993).
Eeltoodust nähtub, et piimaallergia ja eesnäärmevaevuste leevendamist, sh piimvalgu osalise hüdrolüüsi ja piimhappebakterite abil on uuritud pikka aega.
Sellest hoolimata ei ole piimaallergiat ja eesnäärmevaevusi vähendavaid toidutooteid ja toidulisandeid kaubanduses piisavalt saada. Seega on olemas vajadus usaldusväärsete, katsetega tõendatud tervislike omadustega toidutoodete ja toidulisandite valmistamiseks ja kasutamiseks.
Leiutis käsitleb mikroorganismide valimise meetodit, milles valitakse antioksüdantsed mikroorganismid, mis on võimelised piimavalku osaliselt hüdrolüüsima, tootma konjugeeritud linoolhapet, NO ja H2O2. Valitud tüvesid kasutatakse piimaallergiat ning eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.
Leiutis käsitleb nimetatud meetodi kohaselt valitud uusi isoleeritud antioksüdantseid mikroorganismi tüvesid L.plantarum MCC1 DSM 23881 ja L.gasseri MCC2 DSM 23882, üht või mõlemat tüve sisaldavaid kompositsioone, nimetatud mikroorganismide kasutamist antioksüdantse proteolüütilise koostisosana (ingrediendina) toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks, mikroorganismide kasutamist piima allergiat ja eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks ning meetodit eeltoodud vaevusi vähendava toidutoote ja toidulisandi saamiseks.
Leiutise objektideks olevad piimavaIke osaliselt hüdrolüüsivad piimhappebakterid leiti astmelise bioselektsiooni abil. Eesmärgiks oli leida multivalentsed biopotentsiaaliga tüved, mille multivalentsus võimaldaks tüvede kasulikke biotoimeid (hüpoallergilisem, vähem allergilisi vastuseid, põletikku, oksüdatiivset stressi vähendav mõju) sünergiliselt kasutada soovitud omadustega toidutoodete saamiseks. Leiutise lähenemisideoloogia pole piimavalkude täieliku hüdrolüüsi saavutamine. Täielikku hüdrolüüsi on proovitud, see tekitab uusi probleeme, sh ka produkti ülitugeva organoleptilise ebameeldivuse. Leiutise ideoloogiaks valiti multibiopotentsete tüvede kasutamine koos vajalike tehniliste protseduuridega ning sobiva tervisliku lisatoorme kasutamisega. L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 on multibiopotentsed ja sünergilise toimega - nad on võimelised piimavaIke (kaseiine) suunitletult (osaliselt) hüdrolüüsima, nad omavad olulist oksüresistentsust, tekitavad konjugeeritud linoolhapet, NO jt komponente. Seega võimaldab leiutis biotehnoloogilise terviklahenduse abil luua toidutooteid, mis omaksid potentsiaali vähendada piimaallergiat ning kuseteede vaevusi.
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 kirjeldus
Leiutise objektiks olevad L.plantarum MCC1 DSM 23881 ja L. gasseri MCC2 DSM 238 82 isoleeriti terve lapse roojast Eesti-Rootsi laste mikrofloora võrdleva uuringu käigus. Tüvi L.plantarum MCC1 ja tüvi L. gasseri MCC2 isoleeriti, külvates terve 1 a. vanuse lapse rooja lahjendusi (10-2-10-7 fosfaatpuhvris 0,04% tioglükoolhappega, pH 7,2). Lahjendused külvati värskelt valmistatud MRS agarsöötmele (Oxoid, Ühendkuningriik) ja kultiveeriti 37°C juures mikroaeroobses keskkonnas. Leiutise objektideks olevad tüved isoleeriti Lactobacillus ssp iseloomuliku pesa- ja rakumorfoloogia alusel. Järgnes provisoorne ja seejärel täpsem identifikatsioon, mida järgnevalt kirjeldatakse.
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 deponeeriti kultuuri-kollektsioonis Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH vastavalt numbrite DSM 23881 ja DSM 23882 all 05. augustil 2010.
Kultuur-morfoloogilised tunnused
Kultuur-morfoloogilised tunnused määrati MRS agar- ja puljongsöötmes (Oxoid) kasvatamise järgselt.
L.plantarum MCC1 kultiveerimiseks sobis MRS puljong 24-48 t mikroaeroobses keskkonnas, mille järel ilmnes puljongis ühtlaselt hägune kasv. 48 t MRS agarsöötmel kultiveerimise järel 37°C juures mikroaeroobses keskkonnas (CO2/O2/N2:10/5/85) on L.plantarum MCC1 pesad 2-2,5 mm läbimõõduga, valged, kumerad, läikivad ja korrapärase äärisega. Rakud on lühikesed ahelas osaliselt paralleelse asetusega pulgad. Optimaalne kasvutemperatuur on 37°C; tüvi paljuneb ka 15°C ja 45°C juures. Optimaalse kasvukeskkonna pH on 6,5. L.plantarum MCC1 on katalaas- ja oksüdaasnegatiivne, fakultatiivselt hetero-fermentatiivne, ei hüdrolüüsi arginiini ja ei produtseeri glükoosi fermentnatsioonil gaasi. L.plantarum MCC1 identifitseeriti API 50CHL System (bioMerieux, Prantsusmaa) test-kiti alusel kui L.plantarum (kattuvus tüüptüvega: excellent, ID %-99.9/ T index -0.83).
L.plantarum MCC1 molekulaarne identifikatsioon 16S rRNA järjestuse alusel andis homoloogia tüüptüvega L.plantarum Lp-01 (BLAST http://www.ncbi.nim.nih.gov/guide/sequence-analysis/). L.plantarum MCC1 süsivesikute fermentatsiooni-profiil API CHL 50 alusel on alljärgnev. Tüvi fermenteerib: riboosi, galaktoosi, D-glükoosi, D-fruktoosi, D-mannoosi, N atsetüül-glükoosamiini, amügdaliini, arbutiini, eskuluni, salitsiini, tsellobioosi, maltoosi, laktoosi, sahharoosi, trehhaloosi, meletsitoosi, D-raffinoosi, L-arabinoosi, metüül-aD-mannopüranosiidi, D-turanoosi, melibioosi, sorbitooli ja mannitooli.
API ZYM (bioMerieux, Prantsusmaa) test-kiti alusel omab L. plantarum MCC1 leutsiin arüülamidaasi, valiin arüülamidaasi, a-glükosidaas, b-glükosidaas aktiivsust.
L.gasseri MCC2 kultiveerimiseks sobis MRS puljong 24-48 anaeroobses keskkonnas, mille järel ilmnes puljongis ühtlaselt hägune kasv. 48 t MRS agarsöötmel kultiveerimise järel 37°C juures anaeroobses keskkonnas (CO2/H2/N2:5/5/90) olid L.gasseri MCC2 pesad 1,5-2 mm läbimõõduga, hallikasvalged, tuhmid ja ebakorrapärase äärisega. Rakud on keskmise jämedusega lühikesed kuni kokoidsed pulgad. Optimaalne kasvutemperatuur on 37°C; tüvi paljuneb ka 45°C juures. Optimaalse kasvukeskkonna pH on 6,5. L.gasseri MCC2 on katalaas- ja oksüdaasnegatiivne, obligaatselt homofermentatiivne (OHOL), ei hüdrolüüsi arginiini ja ei produtseeri glükoosi fermentnatsioonil gaasi.
L.gasseri MCC2 identifitseeriti API 50CHL System (bioMerieux, Prantsusmaa) test-kiti alusel kui L. delbrueckii ssp. delbrueckii (kattuvus tüüptüvega: good, ID %-94.6, T index -0.35) . L.gasseri MCC2 molekulaarne identifikatsioon 16S rRNA järjestuse alusel andis homoloogia tüüptüvega L. gasseri IDCC 3102 (BLAST http://www.ncbi.nim.nih.gov/guide/sequence-analysis/).
L.gasseri MCC2 süsivesikute fermentatsiooniprofiil API CHL 50 alusel on alljärgnev. Tüvi fermenteerib: laktoosi, sahharoosi, trehhaloosi ja eskuluni . API ZYM (bioMerieux, Prantsusmaa) test-kiti alusel omab L.gasseri MCC2 leutsiin arüülamidaasi, valiin arüülamidaasi, a-glükosidaas ja (b-glükosidaasi aktiivsust.
Ohutus
Mikroobitüvede pärinemine terve lapse seedetraktist tõestab selle GRAS (generally recognised as safe) staatust ehk mikroobitüved on inimesele ohutud ja sobivad suukaudselt manustamiseks. Samuti on laktobatsillide liigid L. plantarum ja L. gasseri kantud EFSA poolt QPS (Qualified Presumption of Safety) staatusega taksonoomiliste ühikute nimekirja (EFSA. Introduction of a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for assessment of seleeted microorganisms referred to EFSA. EFSA J 2007; 587, 1-16).
Hemolüütiline aktiivsus
Metoodika: L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 hemolüütilist
aktiivsust määrati tüvede 4t inkubeerimise järel mikroaeroobses keskkonnas veriagarplaatidel (Blood Agar Base nr 2, Oxoid +7% inimese või hobuseverd).
Tulemus. Tüvedel MCC1 ja L.gasseri MCC2 ei esinenud hemolüütilist aktiivsust.
Resistentsus antibiootikumidele
Metoodika: L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 tundlikkust antibiootikumidele testiti E-testi abil (AB Biodisk, Solna) . Minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon määrati vastavalt Euroopa Komisjoni soovitatud epidemioloogiustele murdepunktidele.
Tabel 1. L.plantarum MCC1 DSM 23881 ja L.gasseri MCC2 DSM 23882 antibakteriaalne tundlikkus (MIK, mg/1)
L.plantarum MCC1 osutus Euroopa Komisjoni poolt laktobatsillidele sätestatud näitajate alusel resistentseks tsefoksitiini ja vankomütsiini suhtes (EC, 2 002. Opinion of the Scientific Committee on Animal Nutrition on the criteria for assessing the safety of micro-organisms resistant to antibiotics of human clinical and veterinary importance. European Commission, Health and Consumer Protection Directorate General, Directorate C, Scientific Opinions, Brussels,Belgium.
http://ee.europa.eu/food/fs/sc/scan/out64 en.pdf).
On teada, et mitmed laktobatsiilide liigid/tüved omavad loomulikku resistentsust nimetatud anitbiootikumide suhtes ja seega ei ole antud mikroobi kasutamisel eeldatav antibiootikumresistentsuse geenide horisontaalne levik teistele mikroobidele. Teiste uuritud antibiootikumide suhtes resistentsust ei esinenud.
Tüvel L.gasseri MCC2 ei esinenud resistentsust testitud antibiootikumide suhtes.
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 funktsionaalsed omadused Metaboliitide profiil
Metoodika: Metaboliitide profiil on kindlaks tehtud gaaskromatograafiliselt (HP 68 90) mikroaeroobses kasvukeskkonnas inkubeerimisel 24t ja 48t järel (Tabel 2). Laktobatsille kasvatati 48 t MRS agarsöötmel 10% CO2 keskkonnas, tehti suspensioon 0,9% NaCl lahusesse tihedusega 109 mikroobi/ml McFarlandi järgi, saadud suspensioonist 1,0 ml külvati 9,0 ml MRS vedelsöötmesse. Määrati metaboliitide hulk mmol/1, kasutati kapillaarkolonni HP-INNOWax (15 m x0,25 mm; 0,15 mm) . Kolonni temperatuuri programm 60°C 1 min, 20°C/min 120°C 10 min; detektor (FID) 350°C.
Tabel 2. Äädikhappe, piimhappe ja merivaikhappe kontsentratsioon (mmol/1) MRS söötmes L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 mikroaeroobsel kultiveerimisel 24t ja 48t järel MRS söötmes
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 agregatsiooni ja piima kalgendamise võime selgitamine
Metoodika: Piima kalgendamise võime. Võimet piima kalgendada hinnati peale tüvede inkubeerimist 48t jooksul mikroaeroobselt UHT rasvatus piimas 37°C juures. Kalgendamisvõimet hinnati järgneva skeemi alusel:
1. Tugev ( + ) - piim kalgendunud 24 t jooksul,
2. Aeglane (+/-)- piim kalgendunud 48 t jooksul,
3. Puudub (-)- piim ei kalgendu.
Autoagregatsioon. Autoagregatsiooni võime hindamiseks suspendeeriti eelnevalt 24t jooksul MRS agarsöötmel ette kasvatatud tüvesid füsioloogilises lahuses. Tekkinud suspensiooni jäeti 15 minutiks toatemperatuuril seisma. Agregatsioonivõimet hinnati järgneva skeemi alusel: 0 - puudub, suspensioon ühtlaselt hägune; 1 - lahuses üksikud helbed; 2 - suspensioonis rohkesti helbeid, katsuti põhjas mõningane sade; 3 - tugev, suspensiooni ei teki, katsuti põhjas sade, lahus peaaegu läbipaistev.
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 kalgendasid piima 24t jooksul, omasid tugevaid autoagregatiivseid omadusi (Tabel 3) .
Tabel 3. Tüvede agregatsiooni, üldproteolüüsi ja piima kalgendamisvõime
Prebiootikurnide fermentatsioonivõime
Tagatoosi (Arla Food Ingredients), Raftiloos P95 (Beneo Orafti), Raftiloos Synergy 1 (Beneo Orafti) ja Raftiloos L60/75 (Orafti) fermentatsiooni hindamiseks külvati 0,05 ml uuritava laktobatsilli 48t vanust kultuuri MRS söötmesse, mis sisaldas glükoosi asemel 0,5% kas sorbiiti, tagatoosi või meletsitoosi. Indikaatorina lisati söötmesse kloorfenoolpunast (0,004%). Fermentatsiooni hinnati värvuse muutuse alusel (punasest kollaseks) 48t möödumisel.
Tabel 4. L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 prebiootikurnide kasutamise võime
Antimikroobne aktiivsus patogeenidele
Metoodika: Antimikroobsete omaduste hindamiseks kasutati joonkülvitehnikat (Hütt P, Shchepetova J, Loivukene K, Kullisaar T, Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appi Microbiol. 2006; 100 (6) :1324-32) . Patogeenide inhibitsiooni määramiseks mõõdeti kasvuvaba tsoon millimeetrites. Analoogselt Hütt jt. (2006) järgi arvutati kasutatud valimi tulemuste põhjal aritmeetiline keskmine ning standardviga ja sellest lähtuvalt hinnati tüvede antagonistlikku aktiivsust (mm) inkubeerimisel 37°C juures järgnevalt: - nõrk 12,2. Kõiki katseid korrati paralleelselt vähemalt kolm korda.
Tabel 5. L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 antimikroobne aktiivsus patogeenide suhtes joonkülvi meetodil anaeroobses ja mikroaeroobses keskkonnas kultiveerimisel (patogeeni kasvupidurdus mm)
L.plantarum MCC1 antimikroobne aktiivsus oli in vitro triip-katses (surmatud rakud ja nende eritatud metaboliitide toime) tugev enamuse testitud patogeenide (v.a L.monocytogenes ja S. enteritidis) suhtes mõlemas keskkonnas. L.gasseri MCC2 osutus mõlemas keskkonnas nõrgaks antagonistiks.
Üldproteolüütilised omadused
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 üldproteolüütilisi omadusi uuriti SMA söötmel (lõssi agarsöötmel) ja Ca-kaseinaadi agaril, külvates eelnevalt MRS puljongis 48t jooksul ettekasvatatud tüved testsöötmele. Külve inkubeeriti 7 päeva jooksul mikroaeroobses keskkonnas 37°C juures. Hinnati tekkinud proteolüüsijälje tugevust (6 katset, aritmeetiline keskmine) pallisüsteemi alusel: 4 - tugev, 3 - keskmine, 2 -nõrk, 1 - väga nõrk, 0 - puudub.
Tulemused: L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 on piisavalt hea üldproteolüütilise toimega (4 palli süsteemis oli L.plantarum MCC1 kolm palli ja L.gasseri MCC2 kaks palli).
Bioselektsioon spetsiifilisema proteolüütilise võime alusel (mass-spektromeetrilised ja RP-HPLC tehnoloogilised uuringud a-S1-kaseiini ja b-kaseiini proteolüüsi ulatuse tuvastamiseks)
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 puhul polnud teada, kuidas nad erinevaid piimavaIke hüdrolüüsivad. Nii tehti esmalt kindlaks hüdrolüüsi käigus tekkivad muutused molekulmassi
spektrites, kasutades üksikuid puhtaid piimaproteiine (b-laktoglobuliin, a-S1 kaseiin, b-kaseiin), et hiljem analüüsida täispiima valkude spektri muutusi. Piimavalkude hüdrolüüsi produktide molekulmassid määrati MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass-spektromeetril (Marsilio, R. Catinella, S. Seraglia R. Traldi P. (1995) Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization Mass-Spectrometry for the Rapid Evaluation of Thermal-Damage in Milk. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 9, 550-552). Kultuuridest tehti KCl füsioloogilisse lahusesse suspensioon tihedusega 109 PMÜ/ml vastavalt McFarland 4 standardile, Saadud suspensiooni lisati 10 ml piimavalgu fraktsiooni. Tüvede elulemust neis fraktsioonide lahustes määrati väljakülvidega lahjenduste rea meetodil katse eel ja lõpus. Tüvesid inkubeeriti vastavas valgufraktsiooni keskkonnas 2...6 päeva jooksul 37°C juures. Seejärel proovid tsentrifuugiti ning valkude profiil määrati mass-spektromeetril (Voyager DE Pro, Applied Biosystems) Joonis fig 1 ja joonis fig 2). .Leiti, et leiutise objektideks olevad tüved on võimelised kohandama ainevahetust toitainetevaese keskkonnaga. Näiteks olid katses ainsaks toitaine allikaks kas a-S1 kaseiin, b-laktoglobuliin, b-kaseiin või tüve enese rakkudest saadavad ained. Tüved olid katse lõpus leitavad kõigis kolmes proteiinifraktsiooni keskkonnas (a-S1 kaseiin, p-laktoglobuliin, p-kaseiin).
Järgnevalt uuriti tüvede proteolüütilisi omadusi 2,5% rasvasisaldusega kaubanduslikus piimas RP-HPLC {Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography) meetodi abil.
Mõõdeti a-S1 kaseiini ja b-kaseiini proteolüüsi ulatust inkubatsiooni 2. ja 4. päeval (Joonis fig 3). Selleks võrreldi uuritavale piimaproteiinile vastava RP-HPLC kromatogrammi piigi pindala suurust stardimomendiga (kontroll, st piim enne laktobatsiilide lisamist, võrdustati 100%-ga) ja leiti allesjäänud piimaproteiini hulk protsentides. Lisaks katsetati pikemate kuni 21 päevaste inkubatsiooniaegadega. Uuriti ka leiutise objektideks olevate tüvede kombinatsioone parandamaks proteolüütlist efektiivsust ning proteolüütilisust ka vadakuga (vähendamaks allergeensete kaseiinide hulka) eellahjendatud piima puhul. Piimaproovide ettevalmistamine RP-HPLC analüüsiks ja kromatografeerimise tingimused on välja töötatud Bobe et.al poolt kirjeldatud metoodika eeskujul (Bobe G, Beitz DC, Freeman AE, Lindberg GL. (1998) Separation and Quantification of Bovine Milk Proteins By reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography. J. Agric. Food Chem., 46, 458-463). Võrreldi omavahel 2,5% rasvasisaldusega kaubanduslikku piima, kuhu lisati 107 PMÜ/ml uuritavat tüve ja inkubeeriti 37°C juures, ning ilma tüveta piima. Piimaproteiinide eraldamiseks kasutati kõrgefektiivset vedelikkromatograafi (HPLC) (Hewlett Packard 1100) ning poorse ränidioksiidiga täidetud pöördfaasi kolonni Zorbax 300SB-C18. Liikuvaks faasiks oli muutuva gradiendiga elueeriv süsteem, mille komponedid olid: lahus A - atseetonitriil, vesi, TFA suhtes 900:100:1 (v/v/v); Lahus B - atseetonitriil, vesi TFA suhtes 100:900:1 (v/v/v). Gradient algab lahus B-ga ja lahus A osakaal hakkab suurenema kohe peale proovi süstimist süsteemi. Lahutusfaasis, mille jooksul toimub piimaproteiinide eraldumine, suureneb lahus A sisaldus 0,47% minutis. Saadud fraktsioonid samastati võrreldes retensiooniaegu peamiste piimaproteiinide standardite retensiooniaegadega ja molekulmassi määramise kaudu MALDI-TOF mass-spektromeetril. Piimaproteiinid elueeruvad järjekorras: k-CN, aS2-CN, aS1-CN, b-CN, a-LA ja b- LG. L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 andsid a-S1 kaseiini ja b-kaseiini puhul sobivad toimed (vt koondandmed joonis fig 1 ja joonis fig 2), laste lehmapiima allergiavastuses domineerivate valkude a-S1 kaseiin ja b-kaseiin hulk vähenes teiseks toimepäevaks. Tuginedes RP-HPLC analüüsile oli parim suunatud osaline proteolüüsija L.gasseri MCC2 (joonis fig 3). Kombineerides eelnimetatud laktobatsille omavahel, proteolüütiline efekt piimas pisut vähenes võrreldes samade tüvede kasutamisega üksinda. L.plantarum MCC1 inkubeeriti ka 4 päeva 40% piimast ja 60% vadakust koosnevas segus: a-kaseiini sisaldus oli neljandaks päevaks 81% ja b-kaseiini sisaldus 83% võrreldes stardimomendiga.
Jõuti püstitatud eesmärgini: tüved L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 ning nende kombinatsioon vähendasid a-S1 kaseiini ja/või (b-kaseiini hulka 20...40% (st toimus suunatud mõõdukas hüdrolüüs).
L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 hüdrolüüsivad piimaallergiat põhjustavaid valke ja on hea üldproteolüütilise aktiivsusega. Nende eraldi või koos kasutamine vähendab piimaallergiat ja seetõttu saab neid kasutada piimaallergiat vähendava toidutoote ja tervislike omadustega toidulisandi valmistamiseks -
Bioselektsioon konjugeeritud linoolhappe (CLA) produktsiooni alusel
CLA tähistab 18-süsinikulise rasvhappe, linoolhappe (LA, cis-9, cis-12-18:2) isomeeride rühma, kus kaksiksidemed on konjugeeritud. CLA moodustub looduslikult biohüdrogeenimise ja oksüdatsiooni protsesside käigus. CLA-1 arvatakse olevat anti-adipogeenne, antikantserogeenne, anti-diabetogeenne ja põletikuvastane toime, regulatoorne toime immuunsüsteemile, tsütokiinide ja immuunglobuliinide produktsioonile ning võime mõduleerida teatud geenide ekspressiooni kas otseselt või kaudselt läbi spetsiifiliste transkriptsiooni faktorite (Wahle, K. W. J., Heys, S. D. and Rotondo, D. (2004). Conjugated linoleic acids: are they beneficial or detrimental to health? Prog. Lipid Res. 43: 553-587). Kuna mitmed piimhappebakterid on võimelised muutma linoolhapet konjugeeritud linoolhappeks, siis oleks võimalik tõsta fermenteeritud piimaproduktides CLA sisaldust (Sieber, R. , Collomb, M., Aeschlimann, A., Jelen, P. and Eyer, H. (2004). Impact of microbial cultures on conjugated linoleic acid in dairy products- a review. Int. Dairy J. 14: 1-15). Sel eesmärgil on vajalik testida, millised piimhappebakteritest on CLA tootjad. On teada, et mikroobide kasvukeskkonnas esinevad vabad rasvhapped on bakteriostaatilise toimega, mõjutades mikroobide kasvu ja rakumembraani permeaablust. Toime tugevus sõltub konkreetsest rasvhappest. Kõrgema küllastamatuse astmega pikaahelalised rasvhapped omavad tugevamat antimikroobset toimet. Kaksiksidemete stereokeemia
mõjutab samuti antimikroobset aktiivsust: cis-konfiguratsiooniga rasvhape on tugevam inhibiitor kui trans-vorm (Kankaanpää, P. E. , Salminen, S. J. , Isolauri, E. , Lee, Y. K. (2001). The influence of polyunsaturated fatty acids on probiotic growth and adhesion. FEMS Microbiol. Lett. 194: 14 9-153) . Mikroobidel on väljakujunenud kaitsemehhanism elutegevust pärssiva ühendi kahjutustamiseks: polüküllastarnata rasvhapped isõmeriseeritakse vähem inhibeerivateks variantideks, näiteks tugevama bakteriostaatilise toimega linoolhape (LA) konverteeritakse CLA-ks (Sieber, R., Collomb, M., Aeschlimann, A. , Jelen, P. and Eyer, H. (2004). Impact of microbial cultures on conjugated linoleic acid in dairy products- a review. Int. Dairy J. 14: 1-15) . Suurem osa tekkinud CLA-st jääb keskkonda; üks osa liidetakse rakumembraani lipiidide koosseisu. On leitud, et CLA võib vähesel määral paikneda ka mikroobiraku sees. LA ja teiste rasvhapete (oleiinhape, ritsinoolhape) konjugeerimise võimet on leitud mitmete mikroobiperekondade esindajatel, sealhulgas LaetobaciIlus sp.
Kasutatades meie poolt välja arendatud CLA määramismeetodit hinnati kvantitatiivselt tüvede võimet toota CLA kasvukeskkonda (MRS, lõss) lisatud linoolhappe baasil. Selgus, et L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2, millel olid nii vajalik suunitletud proteolüütiline toime, tekitasid CLA-d märkimisväärselt (Tabel 7) . Samas polnud need tüved sisuliselt tundlikud LA bakteriostaatilisele toimele.
Bioselektsioon oksüresistentsuse (antioksüdantsuse) baasil Uuriti, kas tüvedel L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2, millel on spetsiifiline piiratud proteolüütilisus, ka CLA-produktiivsus, on olemas füsioloogiliselt oluline oksüresistentsus. Oksüresistentsust peaks määrama vähemalt kahe meetodiga.
Esimese meetodina kasutati linoleenhappe-testi (LA-test), millega on võimalik määrata laktobatsiilide rakususpensioonide võimet inhibeerida linoleenhappe peroksüdatsiooni.
Teise meetodina kasutati kommertsiaalset testi (Totaalne antioksüdantne staatus-TAS, Randox Laboratories Ltd., UK) , mis põhineb vesinikperoksiidi poolt genereerituc ferrüülmetmüoglobiin-radikaali tekke allasurumises laktobatsiilide rakkude suspensiooni poolt (Riee-Evans anc Miller 1994). TAS väärtus avaldati trolox (vitamiin E lahustuv vorm) ühikutes (mmol/L). Mõlemad meetodid or publitseeritud (Kullisaar T, Zilmer M, Mikelsaar M, Vihalemn T, Annuk H, Kairane C, Kilk A. (2002). Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics. Int. J. Fooc Microbiol. 72, 215-224; Kullisaar, T. , Songisepp, E. , Mikelsaar, M. , Zilmer, K. , Vihalemm, T. , Zilmer, M. (2003) Antioxidative probiotic fermented goats milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human subjects. British Journal of Nutrition 90, 449-456).
TAA ja TAS määramiseks inkubeeriti tüvesid MRS puljongis (Oxoid) 24t 37°C juures. Mikroobirakke tsentrifuugita temperatuuril 4°C 1500 pööret/min 10 minuti jooksul, pesti isotoonilise soolalahusega (4°C) ja suspendeeriti 1,15% KCl (Sigma, USA). Suspensiooni tiheduseks oli OD260 1-1 juures 109 mikroobirakku/ml. L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 on füsioloogiliselt olulise totaalse antioksüdatiivsusega (Tabe] 6) .
Bioselektsioon lämmastikoksiidi ja vesinikperoksiidi produtseerimisvõime alusel
Eesmärgipärase informatsiooni saamiseks uuriti preselekteeritud tüvesid (spetsiifiline piiratud proteolüütilisus, CLA-produktsioon, antioksüdantsus) ka NO ja H2O2 produtseerimise suhtes. Kirjanduse andmetel pole eelnevaid uuringuid mikroobitüvede NO ja H2O2 samaaegse produktsiooni kohta. Mõõtmised viidi läbi elusrakkudega kasutades elektrokeemilist mõõtmist (Apollo 4 000 vabade radikaalide anlüsaator WPI, Berlin, Saksamaa, kasutades ISO-HPO2 ja ISO-NOP tüüpi elektroode. Elektroodid viidi MRS puljongis (Oxoid) kasvanud kultuuri, signaalid registreeriti samaaegselt 5-7 minuti kestel ning arvutati keskmine signaalitugevus mõõtmise aja jooksul. Iga eksperimendipunktj mõõdeti 4 sõltumatu paralleelina ja iga paralleeli mõõdeti kaks korda. Uuritava proovi NO ja H2O2 kontsentratsioonid tehti kindlaks proovi signaali võrdlemisel standardgraafikuga.
L.plantarum MCC1 on NO ja vesinikperoksiidi märkimisväärse produtseerimisvõimega, mõlemaid ühendeid produtseerib ka L.gasseri MCC2 (Joonis fig 4 ja 5) .
Seega sobivad tüved L. plantarum MCC1 ja L. gasseri MCC2 kasutamiseks antioksüdantse lisandina toidutoote jq toidulisandi valmistamiseks.
Tabelis 7 on toodud eelnimetatud tüvede ning nende kombinatsiooni funktsionaalsete omaduste kokkuvõte.
Tabel 7. Tüvede L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 ning nende kombinatsiooni funktsionaalsete omaduste kokkuvõte
Ülaltoodu kirjeldas leiutise objektideks olevaid mikroorganismide tüvesid.
Järgmisteks leiutise objektideks on kompositsioonid, mis sisaldavad üht või mõlemat tüve L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2.
Kui kompositsioon sisaldab ainult üht tüve, siis on tüve sisaldus vahemikus 0,8-1,2 mahuprotsenti, kusjuures tüve L.plantarum MCC1 iduarv on 0,25x108-4x108 pmü/ml ja tüve L.gasseri MCC2 iduarv on 0,5x107-1x108 pmü/ml.
Eelistatult on ühe tüve kasutamise puhul tüve sisaldus vähemalt 1,0 mahuprotsenti, kusjuures iduarv L.plantarum MCC1 sisalduse korral on vahemikus 0,4x108-4, 8x108 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 sisalduse korral 0,8x107-1,2x108 pmü/ml.
Kui kompositsioon sisaldab mõlemat tüve L.plantarum MCC1 ja L. gasseri MCC2 , siis on kummagi sisaldus kummalgi vahemikus 0,4-0,6 mahuprotsenti, kusjuures L.plantarum MCC1 iduarv on vahemikus 0,2x108-2,4x108 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 0,4x107-0,6x108 pmü/ml.
Mõlema tüve esinemise korral on eelistatult mõlema sisaldus vähemalt 0,5 mahuprotsenti, kusjuures tüve L.plantarum MCC1 iduarv on vahemikus 0,25x108-2x108 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 0,5x107-0,5x108 pmü/ml.
Eelnimetatud tüved võivad olla elusad või surmatud.
Leiutise järgmisteks objektideks on nimetatud tüvede eraldi või koos kasutamine
- antioksüdantse proteolüütilise koostisosana (ingrediendina) toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks,
- hüpoallergilise, piimaallergiat vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks,
- eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.
Leiutise järgmiseks objektiks on meetod piimaallergiat ja kuseteede vaevusi ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.
Leiutisekohane meetod hõlmab järgmisi etappe:
A) piimavaIku sisaldavat lähtesegu soojendatakse 37+2°C;
B) lisatakse L.plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 või mõlemad koos. L.plantarum MCC1 üksinda kasutamisel lisatakse seda kuni 1,2 mahuprotsenti, eelistatult 1 mahuprotsent iduarvuga 0,4x108-4,8x108 pmü/ml. L.gasseri MCC2 üksinda kasutamisel lisatakse seda kuni 1,2 mahuprotsenti,
eelistatult 1 mahuprotsent iduarvuga 0,8x107-1,2x108 pmü/ml.
Mõlema eelnimetatud mikroorganismi kooskasutamisel lisatakse neid kokku kuni 1,2 mahuprotsenti, eelistatult 1 mahuprotsent, kusjuures L.plantarum MCC1 lisatakse 0,25x 108-2x 108 pmü/ml ja L.gasseri MCC2 0,5x 107-0,5x 108 pmü/ml. Fermenteerimise lõpp pH on 4, 2_+0,25 .
C) segu fermenteeritakse L.plantarum MCC1 või L.gasseri MCC2 toimel või L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2 toimel temperatuuril 37+2°C vähemalt 18-26 tundi.
D) segu pastoriseeritakse vahemikus 80-85°C (eelistatult 82°C±2) 30-35 minutit (eelistatult 30 minutit) ning jahutatakse temperatuurile 20-30°C;
E) saadud segu maitsestatakse lisanditega ja jahutatakse temperatuurini 2-6°C.
F) saadud segu kasutatakse toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks. Toidutoote korral saadud segu villitakse, pulbrilisel (kapslid, pastillid, tabletid, pulbrikotikesed jmt) või vedeliku kujul (ampullid) turustatava toidulisandi valmistamiseks.
Pulbrilise toidulisandi valmistamisel eemaldatakse saadud segust vesi, näiteks lüofiliseerimise (külmkuivatuse), pihustuskuivatuse, valtskuivatuse vm tuntud meetodi abil (kuni soovitud pulbrilise konsistentsi saamiseni). Vedela toidulisandi valmistamise korral eemaldatakse saadud produktist vesi osaliselt kuni soovitud konsistentsi saamiseni. Toidulisandi võib valmistada sobiva lisaainega (nt antioksüdandid, magusained, prebiootikumid) või ilma selleta. Eelkirjeldatud meetodis on piimavalgu allikaks piim, piimapulber, piimavalgu kontsentraat, vadak vm piimavalgu allikas. Sobivaks lisandiks on puuvilja- või marjamahl, kontsentraat, siirup või mahlajook, või puuvilja või marjamoos, eelistatult astelpaju, mustika või vaarika mahl, vm mahl, siirup, kontsentraat.
Joonis fig 1 - MALDI-TOF mass-spektromeetriline analüüs (illustratiivne tüüp-eksperiment). Beeta-kaseiin pärast 30-minutilist segamist tüvega L.gasseri MCC2;
Joonis fig 2 - MALDI-TOF mass-spektromeetriline analüüs (illustratiivne tüüp-eksperiment). Pärast 48-tunnilist inkubatsiooni tüvega L.gasseri MCC2 oli beeta-kaseiini 24,0 kDa massispektri piik oluliselt elimineerunud.
Joonis fig 3 - Tüvede L.plantarum MCC1 (tulp 10) ja L.gasseri MCC2 (tulp 32) toime 48 ja 96-tunnilise inkubatsiooni puhul beeta-kaseiini tasemele (basaaltasemeks võeti 100%, MALDI-TOF mass-spektromeetrilise ja RP-HPLC analüüsi andmete põhjal).
Joonis fig 4 - NO produtseerimine tüvede L.plantarum MCC1 (tulp 10) ja L.gasseri MCC2 (tulp 32) poolt.
Joonis fig 5 - H2O2 produtseerimine tüvede L.plantarum MCC1 (tulp 10) ja L.gasseri MCC2 (tulp 32) poolt.
Joonis fig 5 - H2O2 produtseerimine tüvede L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 poolt.
Joonis fig 6 - Toidutoote ja toidulisandi valmistamise skeem.
Näide 1. Meetod piima allergiavastuseid ning kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivse stressi ja põletikku vähendava, mikroorganisme L.plantarum MCC1 või L.gasseri MCC2 või nende kombinatsiooni sisaldava toidutoote ja eelnimetatud tervislike omadustega toidulisandi valmistamiseks.
Alljärgnevalt on esitatud eelistatud teostusnäide. Piima allergiavastuseid ning kuseteede vaevusi vähendava toidutoote ja/või -lisandi valmistamiseks kasutati 24 t jooksul fermenteris ettekasvatatud ja seejärel lüofiiiseeritud mikroobikultuure.
Toidutoote valmistamiseks aktiveeriti lüofiiiseeritud mikroobikultuurid L.plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 väheses soojas (vähemalt 20°C) vadakus, piimas või piimapulbrist/piimavalgu kontsentraadist vm piimavalgu allikast valmistatud lahuses vähemalt 4 tunni jooksul.
Meetod tervislike omadustega toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks hõlmas järgmisi etappe (vt skeem joonisel 6):
a) Piimavalku sisaldav lähtesegu, juustutööstusest saadud vadak (keemilis-füüsikalised omadused tabelis 8) , millest separeerimise teel oli vähendatud rasvafaasi ning eemaldatud juustutolm, soojendati fermentatsiooni-temperatuurini 37±2°C;
b) Lisati 1 mahuprotsent tüve L. plantarum MCC1 (iduarvuga 0,5 x 108-4x 108 pmü/ml) või tüve L.gasseri MCC2 (iduarvuga 1x 107-1x 108 pmü/ml) või mõlemat koos (kumbagi 0,5 mahuprotsenti, mis sisaldas tüve L.plantarum MCC1 elusrakke tihedusega vahemikus 0,25-2x 108 pmü/ml ja tüve L.gasseri MCC2 elusrakke tihedusega vahemikus 0,5x 107-0,5x 108 pmü/ml.
Tabel 8. Vadaku keemilis-füüsikalised omadused
c) Segu fermenteeriti 18...26 t temperatuuril 37±2 °C, mille jooksul toimus tüve(de) L. plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 toimel piimavalgu osaline hüdrolüüs. Fermentatsioon kestis happesuse jõudmiseni väärtusele pH 4,20 ± 0,25;
d) Tüve(de) L. plantarum MCC1 ja/või L.gasseri MCC2 inaktiveerimiseks (surmamiseks) segu pastoriseeriti 82±2° C juures 30-35 min ning jahutati temperatuurile 20-30°C;
e) Saadud segu maitsestati selekteeritud lisanditega, milleks oli puuvilja- või marjamahl, -kontsentraat, -siirup, mahlajook või puuvilja või marjamoos. Näiteks kasutati 16 17 mahuprotsenti astelpaju moosi või 4,7 ... 5 mahuprotsenti kirsi kontsentreeritud mahlajooki ja astelpaju mahla ning 9,8...10,2 mahuprotsenti vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajooki.
f) Saadud segu jahutati 2-6°C, toidutoode villiti, tehti organoleptiline ja oksüresistentsuse analüüs ja säilitati (2-6°C) ning viidi läbi kliinilised uuringud (vt allpool).
Pulbrilise toidulisandi valmistamiseks eemaldati saadud segust vesi, kasutades selleks toiduainete tehnoloogias tuntud meetodeid (näiteks lüofiliseerimise või kuivatamise (pihustus-, valtskuivatamise jne teel). Eelistatult kasutati pulbrilise toidulisandi valmistamiseks üheastmelist pihustuskuivatit (õhu sisenemise temperatuur 160°C ja väljuva õhu temperatuur 80°C).
Eelpool kirjeldatud viisil valmistatud segule lisati sobivat täiteainet, mille sulamispunkt on laktoosi sulamispunktist kõrgem, näiteks maltodekstriini (vahekorras 1:1 vadaku kuivainega).
Teise variandina kasutati vee, suhkru (laktoosi) ja soolade eraldamist ultrafiltratsiooniga, millele järgnes kontsentreerimine vaakumaparaadiga ja kuivatamine (pihustuskuivatamine), saades niiviisi väikselaktoosisisaldusega ja suure valgusisaldusega pulbrilise toidulisandi.
Kolmanda variandina kasutati vee eemaldamiseks kontsentreerimist vaakumaparaadiga, millele järgnes pihustuskuivatamine. Lõpptulemuseks oli laktoosi sisaldav pulbriline toidulisand.
Tabel 9. Toidutoote (vadakujoogi), mis sisaldas tüvesid MCC1+MCC2, ning mis oli maitsestatud astelpajumoosiga, ja toidulisandi, mis sisaldas tüvesid MCC1+MCC2, ning mis oli maitsestatud astelpajumoosiga, keemilis-füüsikalised omadused
Ülaltoodud viisil valmistati toidutooted TT-I - TT-V, mis sisaldasid leiutise objektideks olevaid mikroorganisme ja lisandeid alljärgnevalt:
Toidutoode I (ehk TT-I): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2; lisand astelpaju mahl (AP) ;
Toidutoode II (ehk TT-II): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajook (VM).
Toidutoode III (ehk TT-III): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2; lisand mustasõstra-vaarika kontsentreeritud mahlajook (MV).
Toidutoode IV (ehk TT-IV): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand mustika kontsentraat (M)
Toidutoode V (ehk TT-V): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand pohla kontsentreeritud mahlajook (P)
Toidulisand I (ehk TL/FP-I): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1 + L.gasseri MCC2; lisand astelpaju mahl (AP) ;
Toidulisand II (ehk TL/FP-II): Piimavalku sisaldav segu + L.plantarum MCC1; lisand vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajook (VM).
Toidulisand III (ehk TL/FP-III): Piimavalku sisaldav segu + L.gasseri MCC2; lisand.
Tabel 10.
Toidutoote organoleptilise tüüptesti näide.
Degustaatorid (n = 15). Paluti hinnata järgmisi parameetreid: konsistents, värvus, lõhn, maitse ja happesus alljärgneva skoori alusel: 1 - vastik, 2 - mitte eriti vastuvõetav, 3 -vastuvõetav, 4 - hea, 5 - suurepärane/ahvatlev
Näide 2. Lisandid piima allergiavastuseid ning kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivse stressi ja põletikku vähendava, mikroorganisme L.plantarum MCC1 või L.gasseri MCC2 või nende kombinatsiooni sisaldava toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks.
Toodete lisanditeks kasutati astelpaju mahla (AP) (valmistatud astelpaju marjadest, säilitusaineteta, külmpressitud ja pastöriseeritud) , vaarika-mustika kontsentreeritud mahlajooki (koostis: kontsentreeritud vaarika-mustika mahl (VM), suhkur, happesuse regulaator sidrunhape, säilitusaine kaaliumsorbaat, lahjendati 10 korda), pohla kontsentreeritud mahlajooki (P) ja mustika kontsentraati (M) (vt tabel 10) . Lisanditel määrati antioksüdantsus (TAA ja DPPH testid) ning bioelementide sisaldused aatomabsorptsioonspektrofoto-meetrilisel (AAS) meetodil Spektra AAFS ja 220Z. (Varian, Austraalia), Cu, Zn, Fe, Mn sisaldused määrati AAS-leekmeetodil, K sisaldused emmisioonmeetodil-õhk-atsetüleen segus. Lõpptoote organoleptilised testid viidi läbi vastavalt kehtivatele nõuetele spetsiaalsete küsitluslehtedega. Tulemused on toodud Tabelis 10.
Näide 3. Kliiniline uuring nr. 1.
Toodete ohutus ja kasulikud toimed, biokeemilised-kliinilised ja organoleptilised testid
Mitmekülgse bioselektsiooniga saadud multibiopotentsete tüvede ja lisandite kasutamise ning sobiva tehnoloogise skeemi rakendamisega (vt näide 1) saadi toidutooted TT-I (MCC1+ L.gasseri MCC2, AP) ja TT-II (MCC1, VM) . Järgnevalt teostati kliinilisi uuringuid (kooskõlas Tartu Ülikooli Inimuuringute Eetikakomitee poolt heakskiidetud Maailma Arstide Liidu Heisinki Deklaratsiooniga (Declaration of Helsinki of the World Medical Association, approved by the Ethics Committee, UT)) selgitamaks toidutoodete TT-I ja TT-II ohutust ja tervislikke toimeid.
Kiiinise katsetuse üldskeem oli järgmine: 2 5 vabatahtlikku (11 naist, 14 meest) vanuses 40-65 eluaastat jagati juhuslikult kahte gruppi järgmiste uuringusse kaasamise kriteeriumide alusel: isikud ilma kliiniliste probleemideta, krooniliste haigusteta, spetsdieetideta, vitamiinide, mineraalainete preparaatide tarbimiseta, osalejad ei pea muutma oma füüsilist aktiivsust, alkoholi tavatarbimist, suitsetarnisharjumusi ega söömisharjumusi. Enne ja pärast kahenädalast igapäevast 200g toidutoote TT-I (n=10) või TT-II (n=15) tarbimist määrati järgmised biokeemilis-kliinilised parameetrid: põletikumarkerid (hsCRP, MPO, IL-6, IL-10), lipiidide ja lipoproteiinide markerid (TG, kolesterool, LDL-kolesterool, HDL-kolesterool, sdLDL), immuunglobuliinid (IgM, IgA, IgG, IgE), oksüdatiivse stressi (OxS) markerid (isoprostaanid, oxLDL, LDL-b2GPI) , vere glükoos, vererõhk ja uriini kreatiniin.
Tulemused
1) Ohutus
Igapäevase küsitlusankeedi teadusanalüüs näitas, et kahenädalasel tarbimisel ükski katsealune ei kaevanud ebamugavustunnet ega seedekulglaprobleeme ega esinenud mingeid negatiivseid nähte. TT-I või TT-II tarbimine ei omanud toimeid, mis oleksid viinud nende biokeemilisi ja kliinilisi näitajaid väljapoole endeemiliste referentsväärtuste piire. Nad ei tõstnud IgE antikehade kui ühe olulise allergiamarkeri hulka võrreldes katse-eelse perioodiga, ei tekitanud põletikureaktsiooni (hsCRP oxLDL, MPO, IL-6) ega muutnud ka vere lipiidide, lipoproteiinide (TG, LDL, HDL) ja glükoosi väärtusi ega suurendanud OxS taset organismis (isoprostaanid, oxLDL, MPO, sdLDL, LDL b2GPI)
(Tabel 10) ja ei kahjustanud neeru-funktsioone (uriini kreatiniin) . Seega: leiutise ideoloogia põhjal saadud TT-I ja TT-II ei kutsu tervetel isikutel esile ei põletikureaktsioone, üldist allergilist sensibilisatsiooni, OxS ega kahjusta seega organismi.
2) Tervist soodustavad toimed
Esimese kliinilise uuringu tulemuste analüüs näitas, et TT-I või TT-II tarbimine indutseeris mõningaid statistiliselt tõeseid ja mõnevõrra erinevaid positiivseid toimeid (Tabel 1 10) . TT-I avaldas kogu organismi süsteemse OxS koormust vähendavat toimet (uriini isoprostaanide ja vere MPO taseme langus) ja põletikuvastast toimet (vere MPO langus). TT-II vähendas kogu organismi süsteemse OxS koormust (uriini isoprostaanide taseme langus), ja avaldas süsteemset põletikuvastasttoimet (hc-CRP langus ja IL-10 tõus). Samas ei muutnud mõlema toidutoote tarbimine immuunglobuliinide IgM, IgA ja IgM arvulisi väärtusi.
Seega: esimene kliiniline uuring näitas, et leiutise ideoloogia (tüvede multivariantne suunitletud bioselektsioon, lisandite bioselektsioon ja tehnoloogiline lahendus) andsid toidutooted, mis on ohutud ning omades mitmeid põletik- ja oksüdatiivne stress-seotud toimeid on hüpallergilisemad (annavad vähem allergiavastuseid võrreldes lehmapiimaga) ning omavad positiivset efekti biokeemilistele ja kliinilistele parameetritele ka eesnäärmevaevustega (sh kusemishäiretega) isikute puhul.
Tabel 11. Biokeemilised ja kliinilised parameetrid (kliiniline uuring nr. 1; M± SD)
Näide 4. Kliiniline uuring nr 2. Lehmapiimavalgu allergia uuringud lastel
Lehmapiimavalgust tingitud reaktsioone esineb 5-15% imikutest (Host A. (2002) . Frequency of cow's milk allergy in childhood. Ann Allergy Immunol 8 9 (Suppl 1):33-7), kuid lehmapiimavalguallergiat (LPVA) esineb 2-7,5% (Hill DJ, Firer MA, Shelton MJ et ai. (1986) Manifestation of milk allergy in infancy: clinical and immunologic finclings. J Pediatr 109: 270-6). LPVA võib olla IgE või mitte lgE vahendatud. Varasteks reaktsioonideks on reeglina urtikaaria, angioödeem, oksendamine või atoopilise dermatiidi ägenemine. Hilisreaktsioonina esinevad atoopilise dermatiidi ägenemine või gastrointestinaalsed vaevused (Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2007) Guidelines for the diagnosis and management of cowr s milk protein allergy in infants. Arch Dis ChiId. 92:902-908). Ükski eksisteerivatest diagnostilistest testidest ei tõesta ega lükka ümber, kas lapsel on LPVA või ei (Vanto T, Juntunen-Backman K, Kalimo K et ai. (1999) The patch test, skin prick test, and serum milk-specific IgE as diagnostic tools in cows' milk allergy in infants. Allergy 54:837-42). Seetõttu on LPVA diagnostiliseks kuldstandardiks eiiminatsioonidieet sellele järgneva provokatsiooniga (Vandenplas Y, Brueton M, Dupont C, Hill D, Isolauri E, Koletzko S, Oranje AP, Staiano A. (2007) Guidelines for the diagnosis and management of cow's milk protein allergy in infants. Arch Dis Child. 92:902-908). Provokatsioonitesti protokollina kasutati Isolauri et ai poolt kirjeldatud ja rahvusvaheliselt tunnustatud skeemi taoliste uuringute jaoks (Isolauri E, Turjanmaa K. (1996) Combined skin prick and patch testing enhances identification of food allergy in infants with atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol;97:9-15; Sütas Y, Kekki O-M, Isolauri E. (2000) Late onset reactions to oral food challenge are linked to low serum interleukin-10 concentrations in patients with atopic dermatitis and food allergy. Clin Exp Allergy 30:1121-8).
Metoodika
Avatud provokatsioon toidutoodetega TT-II ja TT-I-ga viidi läbi SA Tartu Ülikooli Kliinikumi (TÜK) Lastekliiniku Allergiahaiguste keskuses (kooskõlas Tartu Ülikooli Inimuuringute Eetikakomitee poolt heakskiidetud Maailma Arstide Liidu Heisinki Deklaratsiooniga (Declaration of Heisinki of the World Medical Association, approved by the Ethics Committee, UT) ). Testimine viidi läbi 20 korda (osa katsealuseid osales mõlema toidutoode uuringus) lastega vanuses 9 kuud - 4 aastat 8 kuud (keskmine vanus 25,1 kuud). Uuringueelne taust oli järgmine: kõigil lastel oli diagnoositud lehmapiimaallergia ja/või talumatus TÜK Lastekliiniku Allergiahaiguste keskuse arsti poolt (IgE test piimale, NTT piimale), toetudes anamneesile ja abiuuringutele. Kõik uuringugrupi lapsed olid piimavabal eliminatsioonidieedil. Piima tarbimise järgselt tekkis 9-1 lapsel nahalööve, enamasti atoopilise dermatiidi ägenemine, ühel lapsel äge nõgeslööve, ühel lapsel kõhulahtisus. Ühel lapsel tekkis hingamisraskus ja nahalööve ainult töödeldud piimaproduktide söömise järgselt. 3-1 lapsel oli kaasuvana diagnoositud astma, neist ühel ka allergiline riniit ja ühel õietolmuallergia (pollinoos). Ühel lapsel esines kaasuvate haigustena astma ja õietolmuallergia. Lastest keegi ei saanud antihistarniinset ega kortikosteroidravi . Kolmel lapsel oli kaasuva haigusena astma remissioonis, mistõttu nad ei saanud astma püsiravi provokatsioonitesti tegemise ajal. Avatud suukaudne provokatsioon viidi läbi esimesel uuringupäeval TÜK Lastekliiniku Allergiahaiguste keskuses. Lapsele anti suurenevas koguses (tilk alahuulele, 2ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) uuritavat toodet (TT-II või TT-I). Iga koguse järgselt hinnati lapse seisundit ja allergilise reaktsiooni teket 20 minuti jooksul. Lööbe, köha, hingamisraskuse või kõhuvalu/kõhulahtisuse tekkimisel katkestati toote edasine manustamine koheselt. Kui lapsel esimesel uuringupäeval kuni 100 ml toote järgselt reaktsiooni ei tekkinud, sai laps teisel, kolmandal ja neljandal päeval uuritavat toodet 100 ml/päevas kodus. Lapsevanematel paluti hinnata hilisreaktsioonide teket. Test loeti positiivseks, kui tekkis: a) varajane reaktsioon esimesel provokatsioonipäeval väikese koguse toote andmise j argselt tekkis sügelus, lööve, nõgeslööve või oksendamine; b) hilisreaktsioon - dermatiidi ägenemine, oksendamine, kõhuvalu, kõhulahtisus tekkis >24 tundi hiljem uuritava toote provokatsiooni alustamist. Avatud provokatsioonitest oli negatiivne, kui provokatsiooni ajal (neljal päeval) ega ka selle järgsel nädalal reaktsiooni ei tekkinud. Seega uuritav talus seda uuritavat toodet.
Tulemuste kokkuvõte
Toidu allergilisuse probleemi lahendamine on äärmiselt komplitseeritud ja absoluutselt allergiliste reaktsioonide vaba aga kõrge biokvaliteediga toodete loomine pole võimalik. Probleemi teeb veelgi keerulisemaks see, et nüüdisajal võib lapsel esineda allergiline reaktsioon mitmete toidutoodete (aga ka muude olmefaktorite suhtes) korraga. Viimane asjaolu ilmnes ka meie uuringutes (vt Tabel 5) , mistõttu on raske välistada, et antud hetkel ei avaldunud positiivne vastuslööve hoopis muude põhjuste poolt initseerituna. Seetõttu oli leiutise fookus suunatud sellele, et tulemuseks oleks vähem allergilisi vastuseid, st saadud toidutooted oleksid hüpoallergilisemad kui lehmapiim. Suurendaks ju iga protsent antud toidutoodetele allergiavabu või vähem allergilisi lapsi nende laste hulka, kes saaksid oma bioloogilise arengu tähtsamal perioodil täisväärtuslikuks arenguks piisavalt bioloogiliselt kõrgväärtuslikku toitu. Provokatsioonitest näitas, et nii toidutoode TT-II kui ka TT-I olid hüpoallergilisemad kui lehmapiim (Tabel 5). Vähemalt 3...4 lapsel 12-st ei tekkinud TT-I tarbimisel provokatsioonitesti alusel mingit allergilist reaktsiooni. Kolmel testitaval kaheksast ei tekkinud TT-II tarbimisel mingit allergilist reaktsiooni. Viiest testitavast, kellel toidutoode TT-I tingis siiski teatud reaktsiooni, talusid kolm aga TT-II (60%). TT-II on seega juhtude mõttes veelgi hüpoallergilisem kui TT-I. TT-II eelistasid enamik lapsi ka maitseliste omaduste tõttu.
Tabel 12. Lehmapiima allergilise vastuse uurimine (hüpoallergilisuse uuring)
Näide 5. Kliiniline uuring nr 3. Toidutoodete TT-I ja TT-II mõju eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevate alumiste kuseteede ärritussümptomitele ning oksüdatiivse stressile ja
põletiku näitajatele.
Eespoolsed kliinilised uuringud näitasid, et leiutise ideoloogia (tüvede multivariantne suunitletud bioselektsioon, lisandite bioselektsioon ja tehnoloogiline lahendus andsid toidutooted TT-I ja TT-II, mis on kasutamisel ohutud ning omades mitmeid põletik- ja oksüdatiivne stress-seotud toimeid, on hüpollergilisemad ning omavad positiivset efekti kuseteede ärritussümptomitele ning OxS ja põletiku
näitajatele.
Metoodika
Osales 55 meest (manustasid TT-I) ja 5 meest (manustasid TT-II), kellel esines kerge või mõõdukas IPSS (International Prostate Symptom Score, rahvusvaheline eesnäärme sümptomite skoor) väiksem kui 8. IPPS küsimustik hõlmab 3 küsimust, mis hindavad alumiste kuseteede ärritussümptomeid ja 4 küsimust, mis hindavad kusemistakistust (obstruktiivseid sümptomeid)). Tehti ka vajalikud eeluuringud (PSA eesnäärme sekreet) uuringugrupi täpseks selektsiooniks. See tähendab, et eesnäärme sekreedi uuringute ja NIH-CPSI küsimustikuga oli välistatud aktiivne prostatiit (eesnäärme põletik) ning PSA testi ja digitaalse palpatsiooni abil kliiniliselt eesnäärmevähi võimalus. Uuringugruppi kaasasime seega väheste või keskmise raskusastme kusemishäiretega mehed, kellel olid välistatud teised kaebuste põhjused (prostatiit, eesnäärmevähk). Patsiendid (kerge ja keskmise kusemishäirega, ilma põletikureaktsioonita) tarbisid toidutoodet TT-I või TT-II kahe nädala jooksul 200 g päevas.
Tulemused
TT-I. Viidi läbi kaks katseseeriat. Esimeses oli 2 3 patsienti ja teises (mille puhul tehti ka platseebo kontroll) oli 32 patsienti (Tabel 13) . Mõlemal korral ilmnes põletikumarkeri hsCRP ja OxS markeri isoprostaanide statistiliselt tõene langus. Teine katseseeria tõi välja ka anti-inflammatoorse IL-10 ning põletiku/OxS marker oxLDL statistiliselt positiivsed muutused. Esimeses katseseerias (n=23) ilmnes samuti nende markerite positiivse muutuse trend. Teises katseseerias määrati ka glükosüülitud hemoglobiini tase, mille langus oli statistiline.
Kui summeerida mõlema katseseeria tulemused (Tabel 13), siis alanenesid statistiliselt hsCRP, isoprostaanid ja oxLDL, positiivne languse trend oli ka IgE puhul ning statistiliselt tõusis IL-10. Esines korrelatsioon hsCRP ja oxLDL vahel pärast TT-I tarbimist. Kontrollrühmas (platseebo) ei ilmnenud statistiliselt tõenäolisi muutusi ühegi nimetatud parameetri puhul.
TT-II. Viidi läbi üks katseseeria ja määrati järgmised näitajad: IgE kU/L, oxLDL, IL-10, 8-isoprostaanid, hsCRP ja MPO. Leiti, et TT-II kasutajate grupil toimus põletiku- ja OxS markeri MPO taseme statistiliselt oluline vähenemine (enne 77±13 ja pärast 53±9 ng/ml, p=0,0056 ja kusemishäirete sageduse vähenemine üle 4 0%-l tarbijatel.
Tulemuste kokkuvõte
Nii TT-I kui ka TT-II manustamine langetasid OxS ja põletiku taset katsealustel, kel esinesid mõõdukad alumiste kuseteede vaevused (IPSS väiksem kui 8 palli) ja olid juhtival kohal ärritussümptomid. TT-I puhul 66%-l uurimisrühma meestest (55), kel esinesid mõõdukad alumiste kuseteede vaevused (IPSS väiksem kui 8 palli) ja olid juhtival kohal ärritussümptomid, toimus vaevuste vähenemine keskmiselt 20% ulatuses ning 30%-l uurimisrühmast toimus vaevuste vähenemine keskmiselt 40% ulatuses. Patsientide kliinilised ja biokeemilised näitajad (hs-CRP, IL-10, oxLD, 8-isoprostaanid) paranesid statistiliselt tõenäoliselt. Kontrollgrupil muutusi ei esinenud.
Tabel 13. TT-I uuringute katseseeriad (M±SD)
Näide 6. Toidulisandi (TL/FP-I) mõju eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevate alumiste kuseteede ärritus-sümptomitele ning oksüdatiivse stressile ja põletiku näitajatele.
Uuringusse kaasati 10 meest, kellel esines kerge või mõõdukas kusemishäire - IPSS (rahvusvaheliste eesnäärme-vaevuste skoor), kusjuures eelnevate eesnäärmesekreedi uuringute põhjal: N1H-CPSI küsimustik, oli välistatud aktiivne eesnäärme põletik ning PSA testi ja digitaalse palpatsiooni abil kliiniliselt olulise eesnäärmevähi võimalus. Toidulisandit tarbiti 45 g päevas 14 päeva jooksul. Kõigil 10-l väheste (IPSS 2-7 palli) ja keskmise (IPSS 8-19 palli) kusemishäirega patsiendil, vastavalt 3/7, paranesid kusemishäired pärast toidulisandi tarvitamist (p=0,003) vastavalt "Rahvusvahelise prostata sümptomite küsimustikule" 50-66% ulatuses, kusjuures eriti märgatav positiivne muutus toimus vajaduse vähenemisel öösel urineerida (keskmiselt 87,5%).
Koondkokkuvõte kõigist kliinilistest uuringutest L.plantarum MCC1 ja L.gasseri MCC2 sisaldavad toidutooted, toidulisandid on hüpoallergilised, OxS taset langetavad ja omavad statistiliselt tõest mõju eesnäärmevaevustele neil, kel esinevad mõõdukad alumiste kuseteede vaevused ja kellel on juhtival kohal ärritussümptomid.

Claims (12)

1. Isoleeritud mikroorganismi tüvi L.plantarum MCC1 DSM 23881.
2. Punktile 1 vastav mikroorganism surmatud kujul.
3. Kompositsioon, mis sisaldab punktidele 1 või 2 vastavat mikroorganismi.
4.Kompositsioon vastavalt punktile 3, mis sisaldab täiendavalt mikroorganismi tüve L. gasseri MCC2 DSM 23882.
5. Kompositsioon vastavalt punktile 3, milles mikroorganismi tüvi L. gasseri MCC2 DSM 23882 on surmatud kujul.
6. Kompositsioon vastavalt punktidele 3, 4 või 5, kus mikroorganismi L.plantarum MCC1 DSM 23881 esinemise korral on mikroorganismi sisaldus vahemikus 0,8-1,2 mahuprotsenti, kusjuures iduarv on 0,25x 108-4x108 pmü/ml ja mõlema mikroorganismi L.plantarum MCC1 DSM 23881 ja L. gasseri MCC2 DSM 23882 esinemise korral on kummagi sisaldus vahemikus 0,4-0,6 mahuprotsenti, kusjuures L. plantarum MCC1 iduarv on vahemikus 0,2x 108-2,4x 108 pmü/ml ja 1. gasseri MCC2 iduarv on vahemikus 0, 4x 107-0, 6x 108 pmü/ml
7. Punktidele 1 ja/või 2 vastava mikroorganismi kasutamine antioksüdantse proteolüütilise koostisosana, ingrediendina toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.
8. Punktidele 1 ja/või 2 vastava mikroorganismi kasutamine hüpoallergilise, piimaallergiat vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.
9. Punktidele 1 ja/või 2 vastava mikroorganismi kasutamine eesnäärme healoomulise suurenemisega kaasnevaid alumiste kuseteede ärritussümptomeid ning nendega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja/või toidulisandi valmistamiseks.
10. Meetod piimaallergiat ja kuseteede vaevusi ning sellega seotud oksüdatiivset stressi ja põletikku vähendava toidutoote ja toidulisandi valmistamiseks, mis hõlmab järgmisi etappe: A) piimavalku sisaldav lähtesegu soojendatakse 37±2°C ; B) lisatakse 1 mahuprotsent punktile 1 vastavat mikroorganismi iduarvuga 0,4x 108-4, 8x 108 pmü/ml või punktile 1 vastavat mikroorganismi ja mikroorganismi L. gasseri MCC2 DSM 23882 koos iduarvudega vastavalt 0,25x 108-2x 108 pmü/ml ja 0,5x 107-0, 5x 108 pmü/ml; C) saadud segu fermenteeritakse temperatuuril 37±2°C 18 26 tundi; D) segu pastöriseeritakse temperatuuril 82±2°C 30-35 minutit ja jahutatakse temperatuurile 20-30°C; E) segu maitsestatakse lisandiga, saadud toidutoode jahutatakse 2-6°C; F) pulbrilise toidulisandi valmistamise korral eemaldatakse segust vesi kuni pulbrilise konsistentsi saamiseni ning vedela toidulisandi valmistamise korral eemaldatakse segust vesi osaliselt kuni soovitud konsistentsi saamiseni.
11. Meetod vastavalt punktile 10, kus lisandiks on puuvilja- või marjamahl, kontsentraat, siirup või mahlajook või puuviija või marjamoos, eelistatult astelpaju, mustika või vaarika mahl.
12. Meetod vastavalt punktile 10, kus piimavalgu allikaks on vadak, kontsentreeritud vadak, vadakupulber, piim, piimapulber või piimavalgu kontsentraat.
EEP201100012A 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi L. plantarum MCC1 DSM 23881 ja selle kasutamine EE05721B1 (et)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP201500006A EE05750B1 (et) 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi Lactobacillus gasseri MCC2 DSM 23882 ning selle kasutamine
EEP201100012A EE05721B1 (et) 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi L. plantarum MCC1 DSM 23881 ja selle kasutamine
KR1020137025333A KR101586778B1 (ko) 2011-02-25 2012-02-23 분리된 미생물 균주 락토바실러스 플란타룸 mcc1 dsm 23881 및 락토바실러스 가서리 mcc2 dsm 23882와 그의 용도
EP12709275.7A EP2678419B1 (en) 2011-02-25 2012-02-23 Isolated microorganism strain lactobacillus plantarum mcc1 dsm 23881 and its use
JP2013554795A JP5785275B2 (ja) 2011-02-25 2012-02-23 単離された微生物菌株、ラクトバチルスプランタルム（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）ｍｃｃ１ｄｓｍ２３８８１およびラクトバチルスガセリ（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ｍｃｃ２ｄｓｍ２３８８２ならびにそれらの使用
CN201610114800.5A CN105733983B (zh) 2011-02-25 2012-02-23 分离的微生物菌株格氏乳杆菌mcc2 dsm 23882及其用途
US14/001,005 US20140037792A1 (en) 2011-02-25 2012-02-23 Isolated microorganism strains Lactobacillus plantarum MCC1 DSM 23881 and Lactobacillus gasseri MCC2 DSM 23882 and their use
RS20150862A RS54478B1 (sr) 2011-02-25 2012-02-23 Izolovani soj mikroorganizma lactobacillus plantarum mcc1 dsm 23881 i njegova upotreba
PCT/EE2012/000001 WO2012126481A1 (en) 2011-02-25 2012-02-23 Isolated microorganism strains lactobacillus plantarum mcc1 dsm 23881 and lactobacillus gasseri mcc2 dsm 23882 and their use
RU2013143134/10A RU2603059C2 (ru) 2011-02-25 2012-02-23 Изолированные штаммы микроорганизмов lactobacillus plantarum mcc1 dsm 23881 и lactobacillus gasseri mcc2 dsm 23882 и их применение
EP15002155.8A EP2966164B1 (en) 2011-02-25 2012-02-23 Isolated microorganism strain lactobacillus gasseri mcc2 dsm23882 and its use
CN201280020352.2A CN103649304B (zh) 2011-02-25 2012-02-23 分离的微生物菌株植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）mcc1 dsm 23881及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP201100012A EE05721B1 (et) 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi L. plantarum MCC1 DSM 23881 ja selle kasutamine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EE201100012A EE201100012A (et) 2012-10-15
EE05721B1 true EE05721B1 (et) 2014-08-15

Family

ID=57759915

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP201100012A EE05721B1 (et) 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi L. plantarum MCC1 DSM 23881 ja selle kasutamine
EEP201500006A EE05750B1 (et) 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi Lactobacillus gasseri MCC2 DSM 23882 ning selle kasutamine

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP201500006A EE05750B1 (et) 2011-02-25 2011-02-25 Isoleeritud mikroorganismi tüvi Lactobacillus gasseri MCC2 DSM 23882 ning selle kasutamine

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20140037792A1 (et)
EP (2) EP2966164B1 (et)
JP (1) JP5785275B2 (et)
KR (1) KR101586778B1 (et)
CN (2) CN105733983B (et)
EE (2) EE05721B1 (et)
RS (1) RS54478B1 (et)
RU (1) RU2603059C2 (et)
WO (1) WO2012126481A1 (et)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101664310B1 (ko) * 2015-02-16 2016-10-10 (주)케비젠 공액리놀레산을 생산하는 락토바실러스 가세리 cbg-c20 균주 및 이의 용도
CN105018379B (zh) * 2015-07-16 2018-12-28 山东凤凰生物有限公司 一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌及其应用
MA45334A (fr) 2016-03-24 2019-01-30 Probiotical Spa Composition bactérienne d'acide lactique pour le traitement d'infections vaginales bactériennes par gardnerella vaginalis et, éventuellement, d'infections fongiques concurrentes
IT201700068000A1 (it) * 2017-06-19 2018-12-19 Probiotical Spa Composizione di batteri e/o loro derivati la cui attività biologica è stata specificatamente studiata per il miglioramento dello stato di salute differenziato per maschi e femmine
WO2019119261A1 (en) * 2017-12-19 2019-06-27 Dupont Nutrition Biosciences Aps Probiotics for cognitive and mental health
EP3798298A4 (en) 2018-05-23 2022-05-11 Kobiolabs, Inc. LACTOBACILLUS GASSERI KBL697 STRAIN AND ITS USE
RU2715565C1 (ru) * 2019-03-12 2020-03-02 Денис Геннадьевич Почерников Способ диагностики нарушений гормонального фона у мужчин
CN110577912B (zh) * 2019-09-24 2022-03-29 华南理工大学 一种格氏乳杆菌及其在制备发酵乳中的应用
CN116004558B (zh) * 2020-11-02 2024-05-07 武汉大学 乙酰转移酶OsG2基因及其编码的蛋白质在调节水稻植株高度方面的应用
CN112402465B (zh) * 2020-12-18 2022-12-30 四川大学华西医院 一种植物乳杆菌n-1在制备预防和/或改善良性前列腺增生的产品及用途
CN113637609A (zh) * 2021-08-17 2021-11-12 大连工业大学 一种降低乳蛋白抗原性的植物乳杆菌
CN115029260B (zh) * 2022-05-09 2023-08-25 江南大学 一种具有抗炎及抗氧化特性的格氏乳杆菌及应用
CN116035187B (zh) * 2022-12-30 2025-02-07 江南大学 一种使用植物乳杆菌发酵降低苦杏仁蛋白致敏性的方法
CN116536201B (zh) * 2023-05-06 2023-09-22 山东奈思健康科技有限责任公司 一种用于修复盆底肌的后生元制剂及其制备方法和应用
KR102766074B1 (ko) * 2023-07-26 2025-02-13 (주) 락토메이슨 단백질 분해능이 우수한 김치유래 락티플란티바실러스 플란타룸 lm1001 균주를 유효성분으로 포함하는 조성물
CN116925980A (zh) * 2023-08-31 2023-10-24 江南大学 一株缓解鼠伤寒沙门氏菌感染的格氏乳杆菌及其应用
KR102857860B1 (ko) * 2023-09-11 2025-09-10 주식회사 에이치이엠파마 단백질 분해능이 우수한 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) HEM20701 또는 이의 배양물, 파쇄물, 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물
WO2025121694A1 (ko) * 2023-12-06 2025-06-12 주식회사 에이치이엠파마 단백질 분해능이 우수한 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum) hem20865 또는 이의 배양물, 파쇄물, 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물
CN119040202B (zh) * 2024-09-20 2025-04-25 山东奈思健康科技有限责任公司 一种改善尿频、尿痛、小便淋沥、养护前列腺的后生元制剂及其制备方法和应用
KR102796381B1 (ko) * 2024-10-22 2025-04-21 주식회사 그린스토어 스트렙토코커스 살리바리우스 g7 및 락토바실러스 플란타럼 gspe05 배양액을 포함하는 병원성 세균에 대한 항균 조성물

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US100200A (en) 1870-02-22 skinnek
IT1227154B (it) 1988-08-05 1991-03-19 A Tosi Farmaceutici S R L Nova Composizioni farmaceutiche per uso ginecologico a base di lattobacilli
JP3226695B2 (ja) 1994-01-12 2001-11-05 森永乳業株式会社 乳化性及び熱安定性に優れた乳清蛋白質分解物の製造法、並びに該乳清蛋白質分解物を使用した抗アレルギー性調製乳
FI104465B (fi) 1995-06-14 2000-02-15 Valio Oy Proteiinihydrolysaatteja allergioiden hoitamiseksi tai estämiseksi, niiden valmistus ja käyttö
SE510813C2 (sv) 1997-12-08 1999-06-28 Arla Ekonomisk Foerening Bakteriestam av arten Lactobacillus Paracasei subsp. paracasei, sammansättning därav för användning i livsmedel, samt produkt innehållande stammen
US6830750B1 (en) * 1998-10-01 2004-12-14 Probi Ab Reduction of oxidative stress factors with Lactobacillus plantarum
ATE290391T1 (de) * 1998-12-11 2005-03-15 Urex Biotech Inc Orale verabreichung von laktobacillus zur behandlung und prävention von urogenitalen infektionen
FI991008A0 (fi) 1999-05-03 1999-05-03 Bioferme Oy Runsaskuituinen viljaemulsio ja menetelmä sen valmistamiseksi
FI110668B (fi) 2000-06-20 2003-03-14 Aboatech Ab Oy Probioottien käyttö atooppisten sairauksien primaariseen ehkäisyyn
NZ511202A (en) 2001-04-19 2002-11-26 New Zealand Dairy Board Savoury-flavoured food product produced in a short time by fermentation of a protein-based medium by at least two different strains of food-grade bacteria
JP4119656B2 (ja) * 2002-02-28 2008-07-16 雪印乳業株式会社 抗酸化剤
PT1485463E (pt) * 2002-03-21 2008-12-30 Bifodan As Estirpes de lactobacillus
EP1364586A1 (en) 2002-05-24 2003-11-26 Nestec S.A. Probiotics and oral tolerance
KR20040067161A (ko) 2003-01-21 2004-07-30 (주) 피엘바이오 비뇨기 감염 질환을 예방하거나 억제할 수 있는 유산균과이를 포함하는 기능제품
WO2004069156A2 (en) * 2003-01-30 2004-08-19 The Regents Of The University Of California Inactivated probiotic bacteria and methods of use thereof
US20090257993A1 (en) * 2003-12-17 2009-10-15 M Rabet Laura Lactic Acid Producing Bacteria and Lung Function
US20060093592A1 (en) * 2004-10-04 2006-05-04 Nutracea Synbiotics
CA2599909C (en) * 2005-03-03 2014-12-02 Meiji Dairies Corporation Immune function modulating agents
KR100801556B1 (ko) * 2005-04-04 2008-02-11 대한민국 항산화 활성을 갖는 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ ＮＬＲＩ 312
WO2007054989A1 (en) * 2005-10-11 2007-05-18 Anidral S.R.L. Method for the preparation of anallergic probiotic bacterial cultures and related use
JP5081242B2 (ja) * 2006-08-04 2012-11-28 バイオニア コーポレイション 人間母乳から分離したプロバイオティック活性、及び体重増加抑制活性を有する乳酸菌
EP1974743A1 (en) 2007-03-28 2008-10-01 Nestec S.A. Probiotics to Improve Gut Microbiota
US20080274162A1 (en) 2007-05-04 2008-11-06 Jeffrey Nessa Method, composition, and delivery mode for treatment of prostatitis and other urogenital infections using a probiotic rectal suppository
PL210465B1 (pl) * 2007-06-04 2012-01-31 Inst Biotechnologii Surowic I Szczepionek Biomed Społka Akcyjna Zastosowanie kompozycji szczepów z rodzaju Lactobacillus
JP2010095465A (ja) * 2008-10-16 2010-04-30 House Wellness Foods Kk 乳酸菌含有免疫賦活用組成物
CN101427782B (zh) 2008-11-27 2012-05-30 赵敏 玉米双歧益生菌饮料及其制作方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2678419A1 (en) 2014-01-01
RS54478B1 (sr) 2016-06-30
RU2013143134A (ru) 2015-03-27
KR101586778B1 (ko) 2016-02-02
JP2014506475A (ja) 2014-03-17
CN105733983B (zh) 2019-09-06
EP2966164B1 (en) 2017-04-19
JP5785275B2 (ja) 2015-09-24
WO2012126481A1 (en) 2012-09-27
CN103649304A (zh) 2014-03-19
EE201500006A (et) 2015-03-16
CN105733983A (zh) 2016-07-06
EP2678419B1 (en) 2015-09-23
EE201100012A (et) 2012-10-15
KR20140020939A (ko) 2014-02-19
EP2966164A1 (en) 2016-01-13
RU2603059C2 (ru) 2016-11-20
US20140037792A1 (en) 2014-02-06
CN103649304B (zh) 2016-03-23
EE05750B1 (et) 2015-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105733983B (zh) 分离的微生物菌株格氏乳杆菌mcc2 dsm 23882及其用途
EP2309870B1 (en) Isolated microorganism strain lactobacillus plantarum tensia dsm 21380 as antimicrobial and antihypertensive probiotic, food product and composition comprising said microorganism and use of said microorganism for preparation of antihypertensive medicine and method for suppressing pathogens and non-starter lactobacilli in food product
Bansal et al. Optimization of process conditions for developing yoghurt like probiotic product from peanut
KR102431335B1 (ko) 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 락토바실러스 퍼멘툼 efel6800 발효 종균
JP6039638B2 (ja) アディポネクチン分泌促進及び／又は減少抑制剤
Syiemlieh et al. Dairy and non-dairy based probiotics: a review
US20140328814A1 (en) Antimicrobial and antihypertensive probiotic composition, food product and dietary supplement comprising microorganism strain lactobacillus plantarum tensia dsm 21380 and method for suppressing contaminating microbes in a food product
Misra et al. Food-based probiotics: Functional dietary ingredients
Irkin Natural fermented beverages
WO2017047777A1 (ja) ストレス負荷解放後のセロトニン欠乏改善剤
Maity et al. Development of healthy whey drink with Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii
Zielińska et al. Development of tofu production method with probiotic bacteria addition.
WO2021261423A1 (ja) インターロイキン－１０の産生促進用組成物
WO2012081650A1 (ja) 遅延型過敏症軽減剤
WO2017047776A1 (ja) 血中トリプトファン濃度上昇抑制剤
Szabo-Fodor et al. Physiological effects of whey-and milk-based probiotic yogurt in rats
Ibeagha‐Awemu et al. Bioactive components in yogurt products
RU2712568C2 (ru) Композиции и способы повышения или поддержания численности faecalibacterium prausnitzii
JP2015050993A (ja) 消化管内および糞便由来乳酸菌培養用乳もしくは豆乳由来組成物、培養用又は発酵用原料及び乳酸発酵物
JP2009082127A (ja) 新規な乳酸菌、それを用いた乳酸発酵物及び乳酸発酵物含有飲食品
Singh et al. Traditional foods and beverages as delivery vehicles for probiotics
Orhan et al. Kephir (Kefir): Fermented Dairy Product
Anusha et al. Formulation of peptides rich fermented dairy beverage with multiple targets against diabetes using a proteolytic Lacticaseibacillus rhamnosus NCDC 24
Salma et al. EFFECT OF CASEIN HYDROLYSATE ON THE QUALITY OF LOW FAT YOGURT
JP2025077629A (ja) チューリップの花から分離したラクチプランチバチルス・プランタルムに属する新規乳酸菌及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
HC1A Change of owner name
GB1A Change in the ownership or in the address of the owner