[go: up one dir, main page]

EA003900B1 - Усеченные рецепторы фактора некроза опухолей, фармацевтические композиции на их основе и способы применения указанных факторов и композиций - Google Patents

Усеченные рецепторы фактора некроза опухолей, фармацевтические композиции на их основе и способы применения указанных факторов и композиций Download PDF

Info

Publication number
EA003900B1
EA003900B1 EA199900095A EA199900095A EA003900B1 EA 003900 B1 EA003900 B1 EA 003900B1 EA 199900095 A EA199900095 A EA 199900095A EA 199900095 A EA199900095 A EA 199900095A EA 003900 B1 EA003900 B1 EA 003900B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
truncated
suk
group
receptor
amino acid
Prior art date
Application number
EA199900095A
Other languages
English (en)
Other versions
EA199900095A1 (ru
Inventor
Эрик Ф. Фишер
Карл К. Эдвардс
Гэри Л. Кифт
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA199900095A1 publication Critical patent/EA199900095A1/ru
Publication of EA003900B1 publication Critical patent/EA003900B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Описаны новые рецепторы фактора некроза опухолей (sTNFR), фармацевтические композиции на их основе и способы лечения TNF-обусловленных заболеваний с использованием указанных рецепторов и фармацевтических композиций.

Description

Настоящее изобретение относится к области терапии воспаления. Более конкретно настоящее изобретение относится к усеченным рецепторам фактора некроза опухолей (δΤΝΡΚδ).
Предпосылки изобретения
Воспаление - защитная реакция организма в ответ на механические повреждения, инфекцию или антигенную стимуляцию. Воспалительная реакция может протекать по патологическому типу; когда она запущена неадекватным стимулом, таким как аутоантиген, то развивается необычным образом или продолжается после устранения повреждающих агентов.
При том что этиология воспаления изучена слабо, в последнее время получен большой объем информации о молекулярных аспектах воспаления. Эти исследования привели к идентификации отдельных цитокинов, которые активно участвуют в медиации воспаления. Цитокинами называют внеклеточные белки, которые модифицируют поведение клеток, в особенности тех клеток, которые находятся вблизи области синтеза и высвобождения цитокинов. Факторы некроза опухолей (ΤΝΡδ) представляют собой класс цитокинов, продуцируемых клетками различных типов, включая моноциты и макрофаги.
Ранее было описано по меньшей мере два ΤΝΡδ, в частности, ΤΝΡ-альфа (ΤΝΡ-α) и ΤΝΡбета (ΤΝΡ-β или лимфотоксин), каждый из которых активен в виде трехмерной молекулы и инициирует передачу клеточного сигнала, связываясь с перекрестными рецепторами (Епдс1тапп е! а1., (1990) БВю1Сйет, 265:1449714504).
Ряд данных свидетельствует о роли ΤΝΡ-α и ΤΝΡ-β как главных цитокинов воспаления. Эти известные ΤΝΡδ оказывают важное физио логическое воздействие на многочисленные и различные клетки-мишени, участвующие в воспалительном ответе на такие различные стимулы, как инфекция и повреждение. Эти белки стимулируют фибробласты и синовиальные клетки к секреции латентной коллагеназы и простагландина Е2, а также стимулируют остеоцитные клетки к резорбции кости. Эти белки повышают поверхностные адгезивные свойства эндотелиальных клеток по отношению к нейтрофилам. Они также индуцируют генерацию эндотелиальными клетками коагулирующей активности и снижают их способность лизировать тромбы. Кроме того, они перенацеливают активность адипоцитов с запасания липидов посредством подавления экспрессии фермента липопротеинлипазы. ΤΝΡδ индуцируют в гепатоцитах синтез такого класса белков, которые известны как реактанты острой фазы и которые действуют на гипоталамус как пирогены (8е1Ьу е1 а1., (1988), Ьапсе1 1(8583): 483: 8!агпе§,
1г. е! а1., (1988), БС1т. 1пуей, 82:1321; Οΐίίί е! а1., (1987), Се11. 50:555; \\ ааде е! а1., (1987), Байсе!, 1(8529): 355). Результаты доклинических испытаний, проведенных на различных моделях воспаления на животных, включая модель ревматоидного артрита, дают основания рассматривать подавление ΤΝΡ в качестве одного из главных компонентов прогрессии заболевания и его остроты (Эауег е! а1., (1994), Еигореап Су!окте №1\\όγΕ. 5(6): 563-571 и РеИтапп е! а1., (1995), Лппак Οί Τίκ №\ν Уогк Лсабету о! 8с1епсез, 66:272-278). Кроме того, недавние предварительные клинические испытания ингибиторов ΤΝΡ на больных ревматоидным артритом дали обнадеживающие результаты (Рапкш е! а1., (1995), Вгйкй 1оигпа1 о! Кйеита!о1оду, 3(4): 4334-4342: ЕШо! е! а1., (1995), Бапсе!, 344:11051110: Так е! а1., (1996), ΛιΊΐιπΙίδ апб КБеитаШт, 29:1077-1081; Ра1ео1од е! а1., (1996), ΛιΊΐιπΙίδ апб КБеитаШт, 39:1082-1091).
Из уровня техники известны белковые ингибиторы ΤΝΡ. В заявке ЕР 308378 описан белок, полученный из мочи больных с лихорадкой, обладающий ингибиторной по отношению к ΤΝΡ активностью. По-видимому, эффект данного белка обусловлен конкурентным механизмом на уровне рецептора. Описанный в заявке ЕР 308378 белок был выделен в достаточно чистом виде, что давало возможность охарактеризовать его Ν-конец. В данной работе, однако, не приводится какой-либо последовательности ДНК и не описывается ингибитор ΤΝΡ, полученный методами генетической инженерии.
Из уровня техники известны также ингибиторы ΤΝΡ, полученные методами генетической инженерии. Например, в заявках ЕР 393438 и ЕР 422339 приведены аминокислотные и нуклеотидные последовательности зрелого рекомбинантного человеческого 30 кД ингибитора ΤΝΡ (известного также как р55-рецептор и как 8ΤΝΡΡ.-Ι), а также зрелого рекомбинантного человеческого 40 кД ингибитора (известного также как р75-рецептор и как 8ΤΝΡΚ.-ΙΙ), а также его модифицированные формы, в частности, фрагменты, функциональные производные и варианты. В заявках ЕР 393438 и ЕР 422339 описаны также способы выделения генов, кодирующих ингибиторы, клонирование гена в соответствующем векторе и типе клеток и экспрессия гена для получения ингибиторов. Была показана способность зрелого рекомбинантного человеческого 30 кД ингибитора ΤΝΡ и зрелого рекомбинантного человеческого 40 кД ингибитора ΤΝΡ подавлять ΤΝΡ (ЕР 393438, ЕР 422339, публикация РСТ № \О 92/16221 и публикация РСТ № \О 95/34326).
δΤΝΡΡ-Ι и δΤΝΡΡ-ΙΙ являются членами суперсемейства рецепторов фактора роста нервов/фактора некроза опухолей (ΝΟΡ/ΤΝΡ), к которому относятся рецептор фактора роста нервов (ΝΟΡ), антиген В-клеток СЭ40. 4-1ВВ, антиген Т-клеток крысы МКС ОХ40, антиген
Еак и антигены СЭ27 и СЭ30 (8тИй е! а1., (1990), 8аепсе, 248:1019-1023).
Наиболее консервативной чертой, характерной для всей группы этих рецепторов, представленных на клеточной поверхности, является богатый цистеином внеклеточный лигандсвязывающий домен, который может быть разделен на четыре повторяющиеся структуры приблизительно в сорок аминокислот и который содержит 4-6 остатков цистеина в высоко консервативных положениях (§шИй е! а1., (1990), кирга).
В патенте ЕР 393438 описаны 40 кДа ингибитор ΤΝΕ Δ51 и 40 кДа ингибитор ΤΝΕ Δ53, которые представляют собой усеченные версии полноразмерного рекомбинантного белкового 40 кДа ингибитора ΤΝΕ по 51 или 53 аминокислотному остатку соответственно, и карбоксиконец зрелого белка оказывается удаленным. Соответственно, для квалифицированного специалиста становится понятно, что четвертый домен как 30 кДа ингибитора ΤΝΕ, так и 40 кДа ингибитора не является необходимым для ингибирования ΤΝΕ. В действительности, это положение было подтверждено различными группами исследователей. Были получены производные 30 кДа и 40 кДа ингибиторов ΤΝΡ с делениями доменов, при этом производные, лишенные четвертого домена, сохраняли полную ΤΝΡсвязывающую активность, производные без первого, второго или третьего домена соответственно не сохраняли ΤΝΡ-связывающей активности (Согсогап е! а1., (1994) ЕигЭ.Вюсйет., 223:831-840: СЫй-Нкиеп е! а1., (1995), 1Ъе 1оигпа1 о£ В1о1од1са1 СНетШгу. 270(6):2874-2878; 8са11оп е! а1., (1995), Су!окте, 7(8):759-770).
Из-за относительно низкого ингибирования цитотоксичности, проявляемого 30 кДа ингибитором ΤΝΡ и 40 кДа ингибитором ΤΝΡ (Ви!1ег е! а1., (1994), Су!окше, 6(6):616-623), различными группами исследователей были получены димеры белков-ингибиторов ΤΝΡ (ВиНег е! а1., (1994), кирга; и МагИп е! а1., (1995), Ехр.Иеиго1., 131:221-228). Однако димеры могут вызывать антительный ответ (Магйп е! а1., (1995), кирга; Иксйег е! а1., (1996), Τίκ Иете Епд1апй 1оигпа1 о£ Мейкше, 334(26):1697-1702).
Задачей настоящего изобретения является создание функционально активных усеченных κΤΝΡΚ,κ. Эта и другие задачи настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на получение функционально активных усеченных форм κΤΝΡΒ-Ι и κΤΝΡΒ-ΙΙ соответственно, которые обозначаются как усеченные κΤΝΡΒ(κ). Усеченные κΤΝΡΚ,κ представляют собой модифицированные формы κΤΝΡΒ-Ι и κΤΝΡΒ-ΙΙ, которые не содержат четвертого домена (аминокислотные остатки ΤΙη^-Άκο161 κΤΝΡΒ-Ι и аминокислотные остатки Рго141-Тйг179 κΤΝΡΒ-ΙΙ);
части третьего домена (аминокислотные остатки Лкп1П-Сук126 κΤΝΡΒ-Ι и аминокислотные остатки Рго123-Ьук140 κΤΝΡΒ-ΙΙ); и, дополнительно, части первого домена (аминокислотные остатки Лкр'-Сук19' κΤΝΡΒ-Ι и аминокислотные остатки Ьеи1 - Сук32 κΤΝΡΒ-ΙΙ).
Эти новые ингибиторы ΤΝΡ (в частности, ΤΝΕα и ΤΝΡβ) имеют широкую применимость.
Согласно настоящему изобретению к усеченным κΤΝΡΚ,κ относятся белки, представленные формулой В1-[Сук19-Сук103]-В2 и В4-[Сук32Сук115]-В5. Данные белки являются усеченными формами κΤΝΡΒ-Ι и κΤΝΡΒ-ΙΙ соответственно.
Формула В1-[Сук19-Сук103]-В2' обозначает один или более белков, в котором [Сук19-Сук103] представляет остатки от 19 до 103 κΤΝΡΒ-Ι, при этом для облегчения сравнения использована схема нумерации аминокислотных остатков, приведенная на фиг. 1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2), а В! обозначает метионилированную и неметионилиро19 ваную аминогруппу Сук или аминотерминальный аминокислотные остатки, выбранные из группы с
1С
31С
Ν3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:15)
ΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:16)
ΟΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:17)
ΡΟΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:18)
ΗΡΟΝΝ3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:19)
ΙΗΡΟΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:20)
ΥΙΗΡΟΝΝ3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:21)
ΚΥΙΗΡΟΝΝ3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:22)
ΟΚΥΙΗΡ0ΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:23)
ΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:24) ΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:25) ΟΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝΒΙΟ (ЗЕО ГО N0:26) νΟΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝβΙΟ (ЗЕО ГО N0:27) 5νθΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ3ΙΟ (ЗЕО ГО N0:28) ϋ3νθΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:29), а В2 обозначает карбоксигруппу Сук103 или карбоксиконцевой аминокислотный остаток, выбранный из группы г
ΕΝ
ΡΝΟ
ΡΝ08 (ЗЕО ГО N0:30)
ΡΝ08Ε (ЗЕО ГО N0:31)
ΡΝ03Ε0 (ЗЕО ГО N0:32)
ΡΝ08Ε0ί (ЗЕО ГО N0:33), а также их вариантов и производных, полученных, как раскрыто в описании, включенных в объем изобретения, когда В1 обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу в аминокислотной последовательности νί’ΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝδΙί’ или ее Ν-концевого усеченного на 1-15 остатков варианта, при том, что белок К1-[Сук19-Сук103]-К2 не является дополнительным вариантом с формулой Я1-[Су819-Су8103]-ЕМС8ЬСЬ-К3, и где К3 обозначает карбоксильную группу аминокислотной последовательности ЛыС-Лы!161. приведенной на фиг. 1, или ее карбоксиконцевой усеченный вариант.
К примерам усеченных δΤΝΕΚ-Ι, относящихся к настоящему изобретению, относятся следующие молекулы:
\Н;-\11)8\Г1Ч)1№П 114)448((4(^Сук105]-ЕС-СООН (обозначаемого также как δΤΝΡΚ-Ι 2.6П/С105);
4'11;-\11)8\’СР()КХ’П 114)448,(4(8^Су5|05|-ЖСБЬ-СООН (обозначаемого также как δΤΝΡΚ-Ι 2.6О/С106);
4'11;-\11)8\’С14)КХ’П 114)44844()^Сук105] -ΕΝ-СООН (обозначаемого также как δΤΝΕΚ-Ι 2.6Ό/Ν105);
1МН2-М¥ШРр]\1№1С-[Су819-Су8105]Е4С8Е-СООН (обозначаемого также как δΤΝΕΚ-Ι 2.3Ό/68);
1МН2-М-[Су819-Су8105]-Е4С8Р-СООН (обозначаемого также как δΤΝΕΚ-Ι 2.3Ό/618);
NН2-М8I8-[Суκ19-Суκ105]-ΕNС8^-СООН (обозначаемого также как δΤΝΕΚ-Ι 2.3Ό/615), а также их метионилированные и неметионилированные формы, их варианты и производные.
Таким образом, формула К4-[Сук32-Сук115]К5 обозначает один или более белков, в котором [Сук -Сук ] представляет остатки от Сук до Сук115 κΤΝΕΚ-Ι, при этом для облегчения сравнения использована схема нумерации аминокислотных остатков, приведенная на фиг. 8 (8ЕО ΙΌ NО:35), а К4 обозначает метионилированную и неметионилированную аминогруппу Сук32 или аминотерминальные аминокислотные остатки, выбранные из группы с
МС
Оме
АОМС (КЕО ГО N0:36)
ТА0МС (КЕО ГО N0:37)
ОТАОМС (КЕО ГО N0:38)
ООТАОМС (КЕО ГО N0:39)
УООТАОМС (КЕО ГО N0:40)
УУООТАОМС (КЕО ГО N0:41)
ΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (КЕО ГО N0:42) ΚΕΥΥΟΟΤΑΟΜΟ (КЕО ГО N0:43) ЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:44) ВЬКЕУТООТАОМС (КЕО ГО N0:45) СКЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:46) ТСКЬВЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:47) КТСВЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:48)
ОКТСКЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:49)
РОКТСВЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:50)
ЕРОКТСКЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:51)
РЕРОКТСКЬКЕУТООТАОМС (КЕО ГО N0:52)
АРЕРОКТСВЬКЕУУООТАОМС (КЕО ГО N0:53)
УАРЕРОЗТСКЬКЕУТООТЛОМС (8Е0 ГО N0:54) РУАРЕРСЗТСКЬКЕУУООТАОМС (ЗЕЦ ГО N0:55) ТРУАРЕРОЗТСКЬКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:56) ЕТРУАРЕРО5ТСМ.КЕУУОЦТА0МС (5Е0 ГО N0:57) АЕТРУАРЕРОЗТСВЬВЕУУООТАЦМС (5Е0 ГО N0:58) УАЕТРУАРЕРОЗТСКЬКЕУУОЦТАОМС (5Е0 ГО N0:59) 0УАЕТРУАРЕРО5ТСКЬКЕУУО0ТА0МС (ЗЕ<2 ГО N0:60) А0УАЕТРУАРЕРО5ТСКЕКЕУУП<ЗТА<}МС (ЗЕО ГО N0:61) РАОУАЕТРУАРЕРОЗТСКЬВЕГУООТАОМС (ЗЕО ГО N0:62) ЬРАОУАЕТРУАРЕР05ТСК1ЛЕУУП<2ТАОМС (ЗЕО ГО N0:63), а К5 обозначает карбоксигруппу Сук115 или карбокситерминальный аминокислотный остаток (остатки), выбранный из группы
А
АР
АРЬ
АРЬК (КЕО Ш N0:64).
АРЬКК (КЕО ГО N0:65).
АРЬККС (КЕО ГО N0:66).
АРЬККСК (КЕО ГО N0:67), а также их вариантов, включенных в объем изобретения, когда К4 обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу в аминокислотной последовательности
Τ^ΡΡΕΥΥΟΟΤΛΟΙ^.’ или ее Ν-терминального усеченного на 1-15 остатков варианта при том, что белок К4-[Сук32- Сук115]-К5 не является дополнительным вариантом с формулой К4[Сук32- Сук115]-ЛРКЬКСК.-К6, и где Кб обозначает карбоксильную группу аминокислотной последовательности Рго -Τίπ , приведенной на фиг. 8, или ее карбокситерминально усеченный вариант.
Согласно одному из аспектов настоящего изобретения усеченные κΤNΕКκ могут быть получены в гликозилированных или негликозилированных формах. Усеченные κΤNΕКκ получают методами генетической инженерии. При альтернативном варианте осуществления изобретения усеченные ^ΝΕΡκ могут быть получены и методами химического синтеза или сочетанием методов химического синтеза и методов генетической инженерии.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, усеченные κΤNΕК.κ можно дериватизировать путем присоединения к усеченным ^ΝΕΡκ водорастворимого полимера. Например, усеченные ^ΝΕΡκ можно конъюгировать с одной или несколькими молекулами полиэтиленгликоля с тем, чтобы улучшить фармакокинетические показатели путем повышения эффективного молекулярного веса молекулы.
Другим аспектом настоящего изобретения являются различные полинуклеотиды, кодирующие усеченные κΤNΕКκ. К приемлемым нуклеотидным последовательностям относятся последовательности, приведенные на чертежах, а также вырожденные последовательности и природные аллельные варианты. Данные нуклеотидные и аминокислотные последовательности можно использовать для экспрессии усеченных кРЫЕК в эукариотических и прокариотических клетках-хозяевах, и при этом продукт экспрессии или его производное характеризуются способностью модулировать активность ΤΝΡ.
К другому аспекту настоящего изобретения относятся векторы, содержащие кодирующие усеченные δΤΝΡΚδ полинуклеотиды, функционально связанные с последовательностями, обеспечивающими амплификацию и/или контролирующими экспрессию. Для экспрессии усеченных δΤΝΡΚδ такими векторами могут быть трансформированы или трансфицированы как прокариотические, так и эукариотические клетки-хозяева. В объем настоящего изобретения также включены методы рекомбинантного получения усеченных δΤΝΡΚδ при том, что клетки-хозяева, содержащие такие полинуклеотиды, выращивают на приемлемой питательной среде и экспрессируемые клетками усеченные δΤΝΡΚδ выделяют из клеток-хозяев и/или из питательной среды.
Другим аспектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, включающие усеченные δΤΝΡΚδ или их производные. Обычно усеченные δΤΝΡΚδ или их производные вводят в композицию в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями. Для облегчения производства, хранения, обращения, доставки и/или повышения эффективности усеченных δΤΝΡΚδ или их производных в состав композиций могут входить другие разнообразные материалы.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способам модуляции активности ΤΝΡ. В частности, ΤΝΡ-обусловленные заболевания (например, заболевания, обусловленные ΤΝΡ-α и/или ΤΝΡ-β) можно лечить, вводя больному терапевтически эффективные количества усеченных δΤΝΡΚδ или их производных.
Полинуклеотиды, кодирующие усеченные δΤΝΡΚδ, могут также применяться для целей клеточной или генной терапии.
Полученные согласно настоящему изобретению усеченные δΤΝΡΚδ особенно удобны для получения больших количеств белка. Например, δΤΝΡΚ-Ι в аминокислотной последовательности 111-126 (аминокислоты Λδη1Π-Ο^)126 имеет один сайт деаминирования. Считается, что отсутствие этого сайта должно усиливать биохимическую стабильность очищенного белка, снижая количество возможных продуктов деградации и повышая стабильность белков при хранении. Усеченные δΤΝΡΚδ имеют меньше дисульфидных мостиков, чем ранее описанные белки-ингибиторы ΤΝΡ. Например, δΤΝΡΚ-Ι содержит два дисульфидных мостика в аминокислотной последовательности 111-126 и три дисульфидных мостика в аминокислотной последовательности 127-161; δΤΝΡΚ-Ι Ι содержит дисульфидные мостики между Οΐδ121 и Οίδ139, Οΐδ142 и Οΐδ157, Οΐδ163 и Οϊδ178. Сниженное число дисульфидных мостиков важно потому, что большее число таких связей может затруднить процесс переукладки белка. Удивительно, но усеченные δΤΝΡΚδ имеют меньше сайтов антигенных эпитопов, чем ранее описанные белкиингибиторы ΤΝΡ (например, укороченная форма δΤΝΡΚ-Ι, содержащая первые три домена, имеет неоэпитопы, чье появление обусловлено экспонированием отдельных остатков, см. пример ΙΙΙ), что приводит к сравнительно сниженной антигенности, но не уменьшает значительно скорость клиренса при повторных введениях. Сниженная иммуногенность усеченных δΤΝΕΚ,δ, как ожидается, может оказаться положительным свойством при лечении ΤΝΡ-обусловленных заболеваний, в частности хронических воспалительных заболеваний.
Дополнительные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны квалифицированному специалисту при рассмотрении следующего описания, которое детализирует применение настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Многочисленные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны при анализе следующих чертежей.
На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность (8ЕО ΙΌ ΝΟ:1), кодирующая Λδρ'-Λδη161 полноразмерного рекомбинантного δΤΝΡΚ-Ι человека. Приведена также аминокислотная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:2) Λδρ’Λδη161.
На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:3), кодирующая ΝΗ2-ΜΌ8νΕΡΟΚΥΙΗΡΟΝΝ8ΙΕ-|ΕνδΙ9-ΕνδΙυ5|КС-СООН (обозначаемого также как δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/ί.Ί05). Приведена также аминокислотная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:4) ЯН2мп^сррстшррмымс-^19^105]^(ΌΟΙΙ.
На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:5), кодирующая ΝΗ;-ΜΌ8νί:ΡΟΙ<ΥΙΗΡΟΝΝ8Κ:-|ί\δ19-ί\δ1ο5|ΡNС8^-СООН (обозначаемого также как δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ο06). Приведена также аминокислотная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:6) NН2-Μ^8VСΡ^ΚΥIНΡ^NN8IС-[Суδ19-Суδ105]ΡΝ^8Ό<ΟΟΗ.
На фиг. 4 представлена нуклеотидная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:7), кодирующая ΝΗ;-ΜΌ8νί:ΡΟΙ<ΥΙΗΡΟΝΝ8Κ:-|ί\δ19-ί\δ1ο5|ΡΝ^ΟΟΗ (обозначаемого также как δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν105). Приведена также аминокислотная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:8) ЫН2Μ^8VСΡ^ΚΥIΗΡ^NN8IС-[Суδ19-Суδ105]-ΡN(ΌΟΙΙ.
На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:11), кодирующая ΧΙΕ-ΜΥΙΗΡΟΧΝΛΚ'-Ιίλδ-ίλδΊ-ΡΧί'^Ρί,’ΟΟΗ (обозначаемого также как δΤΝΡΚ-Ι 2.3Ό/68). Приведена также аминокислотная последовательность (БЕО ΙΌ ΝΟ:12) ΝΗ2ΜΥΙΗΡΟΧΧΛΚ'-Ιίλδ-ίλδΊ-ΡΧίΧΡ-ί'ΟΟΙΙ.
На фиг. 6 представлена нуклеотидная последовательность (8ЕО ΙΌ N0:9), кодирующая №2-М-[Су819-Су8105]-Е^8Ь-СООН (обозначаемого также как δΤΝΕΕ-Ι 2.3Ό/ά18). Приведена также аминокислотная последовательность (8 НО ΙΌ N0:10) \'Н2-\1-|С\5 -С\Х|-Е\'С8ЕС00Н.
На фиг. 7 представлена нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 13), кодирующая ^2-М818-[Су519-Су8105]-Е^8Е-СООН (обозначаемого также как δΤΝΕΕ-Ι 2.3Ό/615). Приведена также аминокислотная последовательность (8 НО ΙΌ ^^ИНг-МБК-ГСу^-Суз105]ЕНС8Б-С00Н.
На фиг. 8 представлена нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:34), кодирующая Ьеи1-ТЬт179 зрелого рекомбинантного кТНЕВ-Е человека. Приведена также аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:35) Ьеи1-ТЬт179.
На фиг. 9 представлены данные по измерению степени отеков, индуцированных при использовании модели реактивации артрита с помощью продуктов клеточной стенки стрептококка, как описано в примере ΙΙ.
На фиг. 10 представлены плазменные профили хТНЕЕ-! 4Э/С105 у здоровых павианов после двухминутного внутривенного введения 0.2 мг/кг, как описано в примере ΙΙΙ.
На фиг. 11 представлены плазменные профили хТНЕЕ-! 3Э/С105бЬ у здоровых павианов после двухминутного внутривенного введения 0.2 мг/кг, как описано в примере ΙΙΙ.
На фиг. 12 представлены плазменные профили кТОТКН 2.6Э/С105бЬ у здоровых павианов после двухминутного внутривенного введения 0.2 мг/кг, как описано в примере ΙΙΙ.
На фиг. 13 представлены взаимосвязи между дозой и клиренсом для различных димерных конструктов кТОТКН, как описано в примере ΙΙΙ.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном наблюдении, что 5ТНЕЕ-[ и кТ№К.ΙΙ могут быть уменьшены в размере с удалением не только четвертого домена, но и части третьего домена и, дополнительно, части первого домена, сохраняя при этом биологическую активность и обладая пониженной антигенностью. По меньшей мере, по следующим причинам получение указанных биологически активных усеченных кТ№К.к или их производных может представлять определенные преимущества. Вопервых, эти молекулы имеют на один меньше потенциальных дестабилизирующих сайтов деаминирования. Во-вторых, эти молекулы содержат меньше дисульфидных мостиков, что потенциально облегчает переукладку и очистку. В-третьих, эти молекулы имеют сниженное количество сайтов потенциальных антигенных эпитопов.
Термин усеченные кТ№К.(к) объединяет одну или несколько биологически активных синтетических или рекомбинантных молекул с формулой В1-[Сук19-Сук103]-В2 или В4-[Сук32Сук115]-К.5, а также их вариантов (включая инсерционные варианты, варианты с заменами и делециями), как описано далее.
Термин биологически активный означает, что усеченные кТ№К.к обладают сходными Т№-ингибирующими свойствами, но не обязательно теми же самыми свойствами и не обязательно в той же степени, что и кЮТКН и/или кТ№К.-П. Вообще говоря, усеченные кТ№К.к и их производные способны ингибировать ЮТ. Биологические тесты на активность усеченных кТ№К.к описаны далее в примере ΙΙ. Выбор конкретных ЮТ-ингибирующих свойств, которые представляют интерес, зависит от способа применения усеченных кЮТВк.
Согласно одному из аспектов настоящего изобретения усеченные кТ№К.к предпочтительно получать с использованием рекомбинантных технологий в клеточных системах бактерий, клеток млекопитающих или насекомых, при этом усеченные кЮТВк могут представлять собой как гликозилированные, так и негликозилированные формы белка. Альтернативно, усеченные кЮТВк могут быть синтезированы химически. Наиболее предпочтительные в настоящее время способы получения описаны более подробно ниже.
Усеченные кТКЕК.к могут быть выделены и очищены в форме, по существу, свободной от присутствия другого (т.е. не усеченных кТ№К.к) белкового материала. Предпочтительно усеченные кТ№К.к на 80% свободны от других белков, которые могут присутствовать в препаратах в силу способа, используемого для производства усеченных кТ№К.к. Более предпочтительно усеченные кТ№К.к на 90% свободны от других белков, особенно предпочтительно на 95% свободны от других белков и наиболее предпочтительно более чем на 98% свободны от других белков. Однако понятно, что нужный белок можно сочетать с другими активными ингредиентами, химическими композициями и/или приемлемыми фармацевтическими составами перед введением, как описано более подробно ниже.
Усеченные кТ№К.к.
Согласно одному из основных вариантов осуществления настоящего изобретения, к усеченным кЮТВк относятся белки, представленные формулой В1-[Сук19-Сук103]-В2, в которой [Сук19-Сук103] представляет остатки от 19 до 103 кТОТКН, при этом для облегчения сравнения использована схема нумерации аминокислотных остатков, приведенная на фиг. 1 (8Е0 ΙΌ N0:2), а К.1 обозначает метионилированную и неметио19 нилированную аминогруппу Сук или аминотерминальный аминокислотные остатки, выбранные из группы с
1С
ЗЮ
N310 (ЗЕО ГО N0:15)
NN510 (5Е0 ГО N0:16)
0ΝΝ3ΙΟ (5Е<Э ГО N0:17)
Ρ0ΝΝ5Ι0 (5Е<2 №N0:18)
ΗΡ0ΝΝ5ΙΟ (5Е0 ГО N0:19)
ΙΗΡ0ΝΝ5Ι0 (5Е0 ГО N0:20)
ΥΙΗΡ0ΝΝ5ΙΟ (5Е0 ГО N0:21)
Ι<ΥΙΗΡζ)ΝΝ8ΙΟ (ЗЕО ГО N0:22)
ΟΚΥΙΗΡ0ΝΝ5ΙΟ (зео Го N0:23) ΟΟΚΥΙΗΡζ)ΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:24) ΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ8ΙΟ (ЗЕО ГО N0:25)
ΟΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ5ΙΟ (ЗЕО ГО N0:26) νΟΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝΒΙΟ (3Εζ) ГО N0:27)
8νθΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝ5ΙΟ (ЗЕ<Э ГО N0:28) ϋ3ν0Ρ<26ΚΥΙΗΡ0ΝΝ5Ι0 (5Εζ) ГО N0:29), а К2 обозначает карбоксигруппу Суз103 или карбокситерминальные аминокислотные остатки, выбранные из группы
Е
ΡΝ
РЫС
ΡΝ08 (ЗЕО ГО N0:30)
РЫСЗЬ (5Е<3 ГО N0:31)
РЫСЗЬС (ЗЕО ГО N0:32)
ΡΝΟδΙΧΧ (ЗЕО ГО N0:33),
и их варианты и производные, полученные, как раскрыто в описании, включенные в объем изобретения, когда К1 обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу в аминокислотной последовательности νί,’ΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝίίΙί.’ или ее Ν-концевой усеченный на 1-15 остатков вариант при том, что белок К1-[Суз19-Суз103]-К2 не является дополнительным вариантом с формулой К1-[Суз19Суз103]-Р^8ЬСЬ-К3, и где К3 обозначает карбоксильную группу аминокислотной последовательности Азп111-Азп161, приведенной на фиг. 1, или ее карбоксиконцевой усеченный вариант.
Согласно другому основному варианту осуществления настоящего изобретения усеченные з'Т№Кз могут представлять собой белки, обозначаемые следующей формулой: И.-|-|С.’уз32Суз ]-К5, в которой [Суз -Суз ] представляет остатки от Суз32 до Суз115 зТ№К.-П, при этом для облегчения сравнения использована схема нумерации аминокислотных остатков, приведенная на фиг. 8 (8ЕЦ ΙΩ N0:35), а К4 обозначает метионилированную и неметионилированную аминогруппу Суз32 или аминотерминальные аминокислотные остатки, выбранные из группы с
МС <2МС
АфМС (5Εζ) ГО N0:36)
ТАфМС (5Е<2 ГО N0:37)
0ТА0МС (5Е0 ΙΟ N0:38) ЭОТАОМС (5Εζ> ГО N0:39) ΥΟζ>ΤΑζ>ΜΟ (5Е<2 ГО N0:40) УГООТАОМС (ЗЕО ГО N0:41)
ΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (5Εζ) ГО N0:42) ΚΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (5Е0 ГО N0:43) ЬКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:44) М.КЕУУО0ТА0МС (5Εζ) ГО N0:45) СКЬКЕУУООТАОМС (8Е0 ГО N0:46) ТСКЬКЕУУООТАОМС (5Εζ) ГО N0:47) ЗТСКЪКЕУУИОТАОМС (5Е0 ГО N0:48) ОЗТСКЪКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:49) РОЗТСКЬКЕУУООТАОМС (5Е<Э ГО N0:50) ЕРОЗТСКЬЙЕУУООТАОМС (5Εζ> ГО N0:51) РЕРОЗТСКЪКЕУУООТАОМС (5Εζ> ГО N0:52) АРЕРОЗТСКЬКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:53) УАРЕРОЗТСКЬКЕУУПОТАОМС (5Е«Э ГО N0:54) РУАРЕРОЗТСКЪКЕУУПОТАОМС (5Εζ> ГО N0:55) ТРУАРЕРСЗТСКЬКЕУУООТАОМС (5Εζ) ГО N0:56) ГТРУАРЕРСЭТСК1.КЕУУ0<ЭТА0МС (ЗЕО ГО N0:57) АРТРУАРЕРСЭТСКЪКЕУУООТАОМС (5Εζ) ГО N0:58)
УАЕТРУАРЕРОЗТСКЬКЕУУПОТАОМС (8Е<? ГО N0:59) ОУАГТРУАРЕРОЗТСКЬКЕУУПОТАОМС (8Е0 ГО N0:60) АОУАЕТРУАРЕРОЗТСКЪКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:61) РАОУАСТРУАРЕРСЗТСКЬКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:62) ЕРАОУАЕТРУАРЕРОЗТСКЬКЕУУООТАОМС (5Е0 ГО N0:63), а К5 обозначает карбоксигруппу Суз115 или карбокситерминальный аминокислотный остаток (остатки), выбранный из группы
А
АР АРЬ АРЬК (8Εζ) ГО N0:64) АРЬКК (8Е0 ГО N0:65) АРЬККС (5Е0 Ю N0:66) АРЬККСВ (8Е0 ГО N0:67), и их варианты, также включенные в объем изобретения, когда К4 обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу в аминокислотной последовательности
Τ^ΡΡΕΥΥΟΡΤΑΟΙ^'.’ или ее Ν-терминального усеченного на 1-15 остатков варианта при том, что белок К4-[Суз32-Суз115]-К5 не является дополнительным вариантом с формулой К4[Суз32-Суз115]-АРКЬКСК-К6, и где К6 обозначает карбоксильную группу аминокислотной последовательности Рго -ТЬт , приведенной на фиг. 8, или ее карбокситерминально усеченный вариант.
К другому аспекту настоящего изобретения относятся один или несколько вариантов К1-[Суз19-Суз103]-К2 и К4-[Суз32-Суз115]-К5 как в метионилированной, так и неметионилированной форме. Таким образом, термин усеченные зТ№К.(з) включает один или несколько природных аллельных вариантов Кг[Суз19-Суз103]К2 и К4-[Суз32-Суз115]-К5 и один или несколько других вариантов белков, в которых аминокислоты были делегированы (делеционные варианты), вставлены (варианты с дополнениями) или заменены (варианты с заменами) остатками в аминокислотной последовательности К1[Суз19-Суз103]-К,2 или К.4-[Суз32-Суз115]-К_5.
Делеции аминокислотной последовательности обычно варьируют в пределах 20 аминокислотных остатков, более типично - от 1 до 10 аминокислотных остатков и наиболее типично от 1 до 5 остатков с тем, чтобы не нарушалась укладка белка. Рассматриваются Ν-терминальные, С-терминальные и внутренние внутрипоследовательные делеции. Общее количество делеций и/или последовательных делеций выбирают таким образом, чтобы сохранить четвертичную структуру белка в задействованном домене, т. е. поперечные сшивки цистеина.
Делеции в аминокислотной последовательности К1-[Сук19-Сук103]-В2 и в аминокислотной последовательности К4-[Сук32-Сук115]-К5 могут быть произведены в областях низкой гомологии с последовательностями других членов семейства рецепторов ΝΟΡ/ΤΝΡ в группе поверхностных мембранных белков клетки. Делеции в аминокислотной последовательности К1[Сук19-Сук103]-К2 и в аминокислотной последовательности К4-[Сук32-Сук115]-К5 могут быть произведены в областях существенной гомологии с последовательностями других членов семейства рецепторов ΝΟΡ/ΤΝΡ и в этом случае будут более значительно модифицировать биологическую активность. В частности, сходство последовательностей членов семейства рецепторов ΝΟΡ/ΤΝΡ особенно велико в области, соответствующей двум первым дисульфидным петлям домена 1, всему домену 2 и первой дисульфидной петле домена 3 (Ваппег с1 а1., (1993), Се11, 73:431-445). Например, двумя делеционными вариантами К.1-[Сук19-Сук103]-В2 являются К1-[Сук19(АТйг20)-Сук103]-К.2 и К1[Сук19(ЛСук19-Ьук21)-Сук103]-К.2, где Кл и К2 определены выше. Например, тремя делеционными вариантами К4-[Сук32-Сук115]-В5 являются К4[Сук32-(ЛСук115)-Сук115]-К.5; К4-[Сук32-(АСук115Ьук115)-Сук103]-К.5 и К.4-[Сук32-(ЛСук115-Агд113)Сук||5|-К5. где К4 и К5 определены выше.
Добавления к аминокислотной последовательности могут включать амино- и/или карбокситерминальные слияния, варьирующие по длине от одного остатка до сотни и более остатков, а также внутренние внутрипоследовательные вставки единичного или множественных аминокислотных остатков. Внутренние вставки обычно варьируют по размеру от 1 до 10 аминокислотных остатков, более типично - от 1 до 5 аминокислотных остатков и наиболее типично - от 1 до 3 аминокислотных остатков.
К вариантам с аминотерминальными добавлениями относятся добавление метионина (например, для обеспечения непосредственной экспрессии белка в рекомбинантной бактериальной клеточной культуре) или же добавление дополнительного аминокислотного остатка или последовательности. Другим примером аминотерминальной инсерции является слияние с сигнальной последовательностью, а также с други ми пре-пропоследовательностями, для облегчения секреции белка из рекомбинантных клетокхозяев. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не распознают и не процессируют нативные сигнальные последовательности κΤΝΡΒI или κΤΝΡΒ-ΙΙ, эти сигнальные последовательности можно заменить прокариотическими сигнальными последовательностями, выбранными, например, из группы, включающей лидерные последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостабильного энтеротоксина II. Для клеток дрожжей сигнальную последовательность можно выбрать, например, из группы, включающей лидерные последовательности дрожжевой инвертазы, альфа фактора или щелочной фосфатазы. Для экспрессии в клетках млекопитающих нативные сигнальные последовательности κΤΝΡΒ-Ι или κΤΝΡΒ-ΙΙ (ЕР 393 438 и ЕР 422 339) вполне приемлемы, хотя могут оказаться удобны и другие сигнальные последовательности млекопитающих (например, последовательности, полученные от других членов семейства рецепторов ΝΟΡ/ΤΝΡ).
Варианты с карбокситерминальными добавлениями не предусматривают добавления одного или нескольких аминокислотных остатков, что приводило бы к реконструкции κΤΝΡΒΙ или κΤΝΡΒ-ΙΙ соответственно. Понятно, что варианты с карбокситерминальными добавлениями не предусматривают добавления одного или нескольких карбоксикислотных остатков, что приводило бы к реконструкции третьего домена или четвертого домена κΤΝΡΚ-Ι или κΤΝΡΒ-ΙΙ. К примерам вариантов с добавлениями по карбоксиконцу относятся химерные белки, полученные в результате слияния ^-[Сук19Сук103]-К2 или В4-[Сук32-Сук115]-В5 с полным или частичным константным доменом тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека. Такие химерные белки являются предпочтительными, поскольку иммуноглобулиновая часть представляет все домены за исключением первого домена константной области тяжелой цепи иммуноглобулинов человека, таких как Ι§Ο, Ι§Α, Ι§Μ или Ι§Ε, особенно Ι§Ο, т.е. Ι§Ο2 или Ι§Ο3. Для квалифицированного специалиста очевидно, что любую аминокислоту каждой иммуноглобулиновой части можно делетировать или заменить другой или другими аминокислотами, одна или несколько аминокислот могут быть добавлены при том, что ΤΝΡ-связывающая часть сохраняет способность связывать ΤΝΡ, а иммуноглобулиновая часть сохраняет одно или несколько своих характерных свойств.
Другую группу вариантов представляют варианты с заменами аминокислот. В случае этих вариантов по меньшей мере один аминокислотный остаток К1-[Сук19-Сук103]-К. или К2[Сук32-Сук115]-В4 удален и на его место вставлен другой остаток. К вариантам с заменами относятся аллельные варианты, характеризующиеся природными заменами в нуклеотидной после15 довательности в популяции данного вида, которые могут приводить или не приводить к заменам аминокислот. Квалифицированный специалист может использовать любую информацию, доступную о связывающем или активном сайте полипептида, при выборе возможных сайтов мутаций.
Один из методов идентификации аминокислотных остатков или областей для мутагенеза белков назван аланин-сканирующим мутагенезом (Сипшпдйат апб ^е11к (1989), Бс1епсе, 244:1081-1085, работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). При данном подходе идентифицируют аминокислотный остаток или группу целевых остатков (например, такие заряженные остатки, как Агд, Акр, Шк, Ьук, О1и) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для изменения взаимодействия аминокислот с окружающей водной средой внутри или вне клетки. Такие остатки, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем вычищают путем введения дополнительных или альтернативных остатков в места замен. Таким образом, сайт для введения модификации в аминокислотную последовательность оказывается предетерминированным и для оптимизации проведения мутации в данном сайте проводят сканирование аланина или случайный мутагенез, а полученный вариант полипептида скринируют в отношении оптимального сочетания нужной активности и степени этой активности.
К сайтам, представляющим особый интерес для заместительного мутагенеза, относятся те сайты, в которых обнаруживаемые в К.1[Сук19-Сук103]-К.2 и 1Т-|С\к;;-С\к'|-Н, аминокислоты существенно отличаются по наличию боковых цепей, заряду и/или гидрофобности от κΤΝΡΚ-подобных белков, таких как κΤΝΡΚκ других биологических видов или других членов семейства Ν0Ρ/ΤΝΡ рецептора.
Также представляют интерес сайты, в которых конкретные остатки идентичны таковым в κΤΝΡΚ-1-подобных белках и в κΤΝΓΈ-ΙΙподобных белках. Эти положения обычно важны для сохранения биологической активности белка. Например, квалифицированному специалисту понятно, что до настоящего изобретения эффекты усечения κΤΝΡΚ-Ι и κΤΝΕΚ-ΙΙ на их трехмерные структуры были непредсказуемы. Однако с учетом приведенных в настоящем описании результатов, квалифицированный специалист может уяснить, что принципы разработки стратегии для получения вариантов могут отчасти определяться информацией, полученной ранее для полноразмерных κΤΝΓΉ-Ι и κΤΝΡΚ-ΙΙ. Соответственно подобная информация относительно κΤΝΓΉ-Ι была опубликована (Ваппег е! а1., (1993), кирга и Рц е! а1., (1995), Рго!еш Епдтеегшд, 8(12):1233-1241). Остатки Туг9, ΤΡγ19, Ηίκ55 в домене 1, остатки Рйе49, Бег63,
Акр82 в домене 2 и остатки Туг92, Бег63 в домене 3 были идентифицированы как потенциально важные для стабилизации структуры доменов 1, 2 и 3 соответственно. Остатки Рго12 и Ηίκ55 были идентифицированы как потенциально взаимодействующие с Бег86-Туг87 субъединицы С ΤΝΡα. Остатки О1ц45-Рйе49 были идентифицированы как образующие петлю, которая потенциально взаимодействует с остатками Ьеи29-Агд32 субъединицы А ΤΝΡα. Остаток О1у48 был идентифицирован как потенциально взаимодействующий с Акп19-Рго20 субъединицы А ΤΝΡα. Остатки Шк+Ьеи60 были идентифицированы как образующие протяженную конформацию цепи; кроме того, была показана потенциальная возможность взаимодействия боковых цепей остатков Агд31-А1а33 субъединицы А ΤΝΡα с остатком Н1к58 κΤΝΡΡ-Ι. который специфически взаимодействует с остатком Агд31. Остатки Ьук64-Агд66 были идентифицированы как образующие протяженную конформацию цепи; кроме того, была показана потенциальная возможность взаимодействия боковых цепей и основных цепей указанных остатков с остатками А1а145-О1ц146 и остатком 01ц46 субъединицы А ΤΝΡα. Остаток Ме!69 был идентифицирован как потенциально взаимодействующий с остатком Туг115 субъединицы А ΤΝΡα. Остатки Ηίκ94РНе101 были идентифицированы как образующие петлю, которая взаимодействует с остатками Пп^-Реи5 и Акп137 субъединицы А ΤΝΡα; остаток Тгр96 κΤΝΡΚ-Ι специфически взаимодействует с остатками Бе^71-Τй^72 субъединицы С ΤΝΡα; остаток Ьеи100 κΤΝΡΚ-Ι находится в тесной близости с остатком Акп137 субъединицы С ΤΝΡα и остаток О1п102 κΤΝΡΚ-Ι специфически взаимодействует с остатком Рго113 субъединицы А ΤΝΡα. Соответственно для квалифицированного специалиста очевидно, что исходно данные сайты модифицируют путем замен, вводимых относительно консервативным способом.
Такие консервативные замены приведены в табл. 1 под заголовком Предпочтительные замены. Если подобные замены приводят к изменению биологической активности, то далее проводят более существенные замены (Возможные замены). Могут быть также произведены и/или другие добавления или делеции с последующим скринингом полученных полипептидов.
Таблица 1 Замены аминокислот
Исходный остаток Предпочтительные замены Возможные замены
А1а (А) Уа1 Уа1; Ьеи; Не;
Агд® Ьук Ьук; О1п; Акп
Акп (Ν) О1п О1п; Шк; Ьук; Агд
Акр (Э) О1и О1и
Сук © Бег Бег
О1п (0) Акп Акп
О1и (Е) Акр Акр
О1у (О) Рго Рго
Ηίκ(Η) Агд Акп; О1п; Ьук; Агд
11е (I) Ьеи Ьеи; Vаί; Ме!; А1а; Рбе; норлейцин
Ьеи (Ь) 11е норлейцин; 11е; Vаί; Ме!; А1а; Рбе
Ьук(К) Агд Агд; О1п; Акп
Ме! (М) Ьеи Ьеи; Рбе; 11е
Рбе (Г) Ьеи Ьеи; Vаί; 11е; А1а
Рго (Р) О1у О1у
8ег(8) Тбг ТЬг
Тбг (Τ) 8ег 8ег
Тгр (У) Туг Туг
Уа1 (V) Ьеи 11е; Ьеи; Ме!; Рбе; А1а; норлейцин
При осуществлении таких замен на эквивалентные необходимо учитывать гидропатический индекс аминокислот. Для каждой аминокислоты характерен свой гидропатический индекс, определяемый на основе ее гидрофобности и характеристик заряда: изолейцин (+4.5); валин (+4.2); лейцин (+3.8); фенилаланин (+2.8); цистеин/цистин (+2.5); метионин (+1.9); аланин (+1.8); глицин (-0.4); треонин (-0.7); серин (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (-1.3); пролин (-1.6); гистидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3.5); аспарагин (-3.5); лизин (-3.9) и аргинин (-4.5).
Из уровня техники известна важность гидропатического индекса аминокислот в поддержании биологической функции белка, связанной с его взаимодействием с другими молекулами (Ку!е апб ИооШбе (1982), 1. Μοί. Вю1., 157:105131, работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Известно, что отдельные аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами с аналогичным гидропатическим индексом с сохранением биологической активности белка. При осуществлении замен с учетом гидропатического индекса предпочтительными являются замены аминокислот, чьи гидропатические индексы находятся в интервале ±2, особенно предпочтительны - в интервале ±1 и еще более предпочтительны - в интервале ±0,5.
Из уровня техники также известно, что замены подобных аминокислот могут быть эффективно осуществлены на основе гидрофильности, особенно тогда, когда полученный в результате биологически функциональный эквивалентный белок или пептид, как в настоящем случае, предназначен для иммунологического применения.
Как указано в патенте США № 4,554,101, упоминаемого в настоящем описании в качестве ссылки, наивысшая средняя локальная гидрофильность белка, определяемая гидрофильностью прилегающих аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическими свойствами белка.
Как указано в патенте США № 4,554,101, для аминокислотных остатков характерны следующие значения гидрофильности: аргинин (+3.0); лизин (+3.0); аспартат (+3.0±1); глутамат (+3.0±1); серин (+0.3); аспарагин (+0.2); глута мин (+0.2); глицин (0); треонин (-0.4); пролин (-0.5±1); аланин (-0.5); гистидин (-0.5); цистеин (-1.0); метионин (-1.3); валин (-1.5); лейцин (-1.8); изолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенилаланин (-2.5); триптофан (-3.4).
При произведении замен, основанных на сходных значениях гидрофильности, предпочтительны замены аминокислот, чьи значения гидрофильности находятся в пределах ±2, особенно предпочтительны в пределах ±1 и еще более предпочтительны в пределах ±0.5.
В патенте США № 4,554,101 также описаны идентификация и получение эпитопов из первичных аминокислотных последовательностей на основе гидрофильности. С помощью методов, изложенных в патенте США № 4,554,101 квалифицированный специалист способен идентифицировать эпитопы в таких аминокислотных последовательностях, как описываемые здесь последовательности 8ΤΝΡΚ.8. Эти области обозначаются также как ядерные эпитопные области.
Многочисленные научные публикации посвящены предсказанию вторичной структуры и идентификации эпитопов на основе анализа аминокислотных последовательностей (Сбои апб Гактап (1974), Вюсбет18!ту, 13:2 222-245; Сбои апб Гактап (1978), Α6ν. Епхуто1. Ке1а!. Агеак Мо1. Вю1., 47:45-148; Сбои апб Гактап, Апп. Кет. Вюсбет., 47:251-276 и Сбои апб Гактап (1979) Вюрбук. 1., 26:367-384, работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок).
Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы, которые помогают предсказывать антигенные районы и ядерные эпитопные области белков. Примерами могут служить программы, основанные на анализе Джеймсона-Вулфа (1атекоп апб \Уо1Г (1998), Сотри!. Арр1. ВюксЦ 4(1):181-186 и \Уо1Г е! а1., (1988), Сотри!. Арр1. Вюксь, 4(1): 187-191, работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок), программа РерР1о!® (Вги!1ад е! а1., (1990), САВ8, 6:237-245 и АетЬещег е! а1., (1985), 8с1епсе, 228:740-742, работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок), и другие новые программы для предсказания четвертичной структуры белков (Ре!тоте апб Вгуап! (1993), Вю!есбпо1оду, 11:479-483, работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки).
Консервативные модификации аминокислотной последовательности (и соответствующие модификации кодирующей ее нуклеотидной последовательности) К1-[Су819-Сук103]-К2 и Κ.4[Сук32- Сук115]-К5 могут привести к образованию белков с аналогичными функциональными и химическими характеристиками.
Наоборот, существенные модификации функциональных и/или химических свойств Κ1[Су819-Су8103]-К и К2-[Су832-Сук115]-К3 могут быть достигнуты отбором замен, которые зна чительно различаются по эффекту на поддержание (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, сохранение плоской или спиральной структуры; (б) изменяют заряд или гидрофобность белка в сайте замены или (в) добавляют боковую цепь. Встречающиеся в природе остатки подразделяют на несколько групп на основе общих свойств боковой цепи:
1. Гидрофобные: Ме!, А1а, Уа1, Ьей, 11е;
2. Нейтральные гидрофильные: Сук, 8ег, Т11г;
3. Кислые: Акр, С1ц;
4. Основные: Акп, С1п, Ηίκ, Ьук, Агд;
5. Ароматические: Тгр, Туг, Рйе;
6. Остатки, влияющие на ориентацию цепи: С1у, Рго.
К неконсервативным заменам могут относиться замены одного из членов группы на другой. Такие заменяющие остатки могут вводиться в области К1-[Сук19-Сук103]-К2 и К4-[Сук32Сук115]-К.5 гомологичные или не гомологичные с другими представителями семейства рецептора ЫСЕ/тар.
К конкретным мутациям в последовательностях К1-[Сук19-Сук103]-К.2 и К_4-[Сук32-Сук115]К5 относятся замены неприродной аминокислоты на Ν-конце, С-конце или в любом месте белка, который модифицирован добавлением Νсвязанного или О-связанного углевода. Подобные модификации могут оказаться особенно полезны, поскольку добавление аминокислоты (например, цистеина) может создавать преимущество при связывании с водорастворимым полимером с образованием производного, как описано ниже. См., например, фиг. 5, где природный Акп105 в кТ№К-1 заменен на Сук, чтобы облегчить присоединение молекулы полиэтиленгликоля (пример I).
Кроме того, последовательности К1-[Сук19Сук103]-К2 и К4-[Сук32-Сук115]-К5 могут быть модифицированы добавлением или удалением Νсвязанного или О-связанного сайта гликозилирования. Аспарагинсвязанный сайт гликозилирования представляет собой трипептидную последовательность, которая специфически распознается соответствующими клеточными ферментами гликозилирования. Эти трипептидные последовательности имеют структуру Акп-ХааТ11Г или Акп-Хаа-8ег, где Хаа может быть любой аминокислотой кроме Рго. Предсказанные или фактические остатки аспарагина в кТ№К-1 находятся в положениях 14, 105 и 111. Предсказанные или фактические остатки аспарагина в кТ№К-П находятся в положениях 149 и 171.
Разнообразные аминокислотные замены или делеции могут быть произведены для модификации или удаления Ν-связанного или Освязанного сайта гликозилирования, что приведет к изменению гликозилирования белка.
В конкретном варианте осуществления изобретения варианты существенно гомологичны аминокислотной последовательности К1 [Сук19-Сук103]-К2 или К4-[Сук32-Сук115]-К5. Термин существенно гомологичны означает степень гомологии, которая обычно превышает 70%, более предпочтительно превышает 80%, еще более предпочтительно превышает 90% и наиболее предпочтительно составляет 95%. Процент гомологии вычисляют, как процент аминокислотных остатков, обнаруживаемых в меньшей из двух последовательностей при сопоставлении с идентичными аминокислотными остатками в сравниваемой последовательности, при том, что четыре пробела на 100 аминокислот могут быть введены для облегчения такого сопоставления, как описано ЭауйоГГ ш Абак оГ Рго1еш 8ес.|иепсе апб 81гис1иге, 5:124 (1972), №1бопа1 Вюсйетюа1 Кекеагсб Еоипбабоп, \Уак11шд1оп, Э.С.. (работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Существенно гомологичными считаются также усеченные варианты кТ№Кк, которые могут быть выделены посредством перекрестной реактивности с антителами к аминокислотной последовательности 8ЕО ГО N0:2 и 8ЕО ГО N0:35 соответственно, или такие варианты, чьи гены могут быть выделены гибридизацией с ДНК 8Е0 ГО N0:1 или 8Е0 ГО N0:34 или их сегментами.
Примерами кТ№К.к, согласно настоящему изобретению, служат следующие молекулы:
МН2-МП8УСРрСКУ1НРр1\М81С-[Сук19Сук103]-РС-СООН (обозначаемый также как кТ№К-1 2.6Э/С105);
ХН2-МЭ 8УСРОСК¥1НРО\\81С-|С\кСук103]-Е^8Ь-СООН, (обозначаемый также как кТ№К-1 2.6Э/С106);
\Н2-\ГО8\ГРОСКУ11 ^0^816-6^Сук103]-Е№СООН, (обозначаемый также как кТ№К-1 2.6Э/Ю05);
МН2-МУ1НРр1\М81С-[Сук19-Сук103]ЕЖ.’8Е-СООН (обозначаемый также как кТ№К-1 2.3Ό/68);
1МН2-М-[Сук19-Сук103]-Е^8Т-СООН (обозначаемый также, как кТ№К-1 2.3Ό/618) и
1МН2-М818-[Сук19-Сук103]-Е^8Т-СООН (обозначаемый также как кТ№К.-1 2.3Ό/615) как в метионилированной, так и в неметионилированной форме, а также их варианты и производные.
Получение вариантов усеченных кТ№Кк более подробно описано ниже. Подобные варианты могут быть получены введением соответствующих нуклеотидных замен в ДНК, кодирующие усеченные кТ№К.к, или же химическим синтезом 1п νίΙΐΌ нужных усеченных кТ№К.к. Как очевидно квалифицированному специалисту могут быть произведены многочисленные комбинации делеций, инсерций и замен при том, что окончательные варианты усеченных кТ№Кк будут сохранять биологическую активность.
Методы мутагенеза, позволяющие заменить, вставить или делетировать один или несколько нужных аминокислотных остатков, хо рошо известны из уровня техники (например, патент США № 4,518,584, упоминаемый в настоящем описании в качестве ссылки). Имеется две главных переменных при конструировании каждого варианта: локализация сайта мутации и природа мутации. При конструировании каждого варианта локализация каждого сайта мутации и природа каждой мутации определяются биохимическими характеристиками, которые хотят изменить. Каждый мутационный сайт может быть модифицирован индивидуально или серийно, например, (1) первоначальной заменой каких-либо консервативных остатков и затем, в зависимости от полученного результата, введением более радикальной замены; (2) делецией конкретного аминокислотного остатка или (3) инсерцией одного или нескольких аминокислотных остатков вблизи выбранного сайта.
Квалифицированным специалистом с учетом приведенного описания могут быть получены химически модифицированные производные усеченных 5ΤΝΕΚ.5. С использованием гликозилированных, негликозилированных или дегликозилированных усеченных 5ΤΝΕΚ.5 можно получить конъюгаты. Обычно используют негликозилированные усеченные 5ΤΝΕΚ.5. К приемлемым для дериватизации усеченных 5ΤΝΕΚ.5 химическим веществам относятся водорастворимые полимеры.
Водорастворимые полимеры предпочтительны, поскольку связанный с ними белок не будет преципитировать в водной среде, в частности в физиологической среде организма. Предпочтительно полимер должен быть фармацевтически приемлемым для приготовления терапевтического продукта или композиции.
Квалифицированный специалист сможет выбрать нужный полимер с учетом изложенных соображений и в зависимости от того будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически и, если будет, с учетом желаемой дозы, времени циркуляции и устойчивости к протеолизу. К удобным, клинически приемлемым водорастворимым полимерам относятся (но не ограничиваются перечисленными) полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленгликольпропиональдегид, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт (РУА), поливинилпирролидон, поли1,3-диоксолан, поли-1.3.6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, поли-βаминокислоты (в виде гомополимеров или случайных сополимеров), поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля (РРО) и другие полиалкиленовые оксиды, сополимеры полипропиленоксида/ этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (РОС) (например, глицерол) и другие полиоксиэтилированные полиолы, полиоксиэтилированный сорбитол или полиоксиэтилированная глюкоза, колониковые кислоты или другие углевод ные полимеры, фиколл или декстран и смеси указанных соединений.
В понятие полиэтиленгликоль входит любая форма полиэтиленгликоля, использованная для дериватизации других белков, например, моно-(С1-С10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущества для производства из-за его стабильности в воде.
Водорастворимые полимеры могут иметь любой молекулярный вес и быть разветвленными или неразветвленными. Обычно водорастворимые полимеры имеют средний молекулярный вес около 2-100 кД (термин около означает, что в препарате водорастворимого полимера некоторые молекулы будут весить больше, некоторые меньше, в сравнении с указанным молекулярным весом). Средний молекулярный вес каждого водорастворимого полимера находится в пределах от около 5 до 50 кД, более предпочтительно от 12 до 40 кД и наиболее предпочтительно составляет от 20 до 35 кД.
Обычно, чем выше молекулярный вес и чем больше разветвлен полимер, тем выше отношение полимер : белок. В зависимости от желательного терапевтического профиля (например, продолжительности контролируемого высвобождения; возможных эффектов на биологическую активность; простоты обращения; степени (или отсутствия ее) антигенности и других известных эффектов водорастворимого полимера на терапевтический белок) могут применяться полимеры с другим молекулярным весом.
Водорастворимые полимеры должны прикрепляться к белку с учетом возможного влияния на функциональные и антигенные домены белка. В целом, может быть проведена химическая дериватизация в любых приемлемых условиях для реакции белка с молекулой активированного полимера.
Активирующие группы, которые могут быть использованы для превращения полимера в активную молекулу, включают следующие группы: сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, тресилат, азидирин, оксиран и 5пиридил.
Водорастворимые полимеры обычно присоединяются к белку через α- или εаминогруппы аминокислот или реакционноспособную тиоловую группу, но считается также, что водорастворимая группа может быть присоединена к любой реакционноспособной группе белка, которая достаточно реакционна для присоединения водорастворимой группы в приемлемых условиях реакции. Так, водорастворимый полимер может быть ковалентно связан с белком через реакционноспособную группу, например, свободную амино- или карбоксильную группу. К аминокислотным остаткам, имеющим свободную аминогруппу, относятся остатки лизина и Ν-терминальные аминокислотные остатки. Свободную карбоксильную группу имеют остатки аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-терминальные аминокислотные остатки. К остаткам со свободной тиоловой группой относятся остатки цистеина.
Методы получения белков, конъюгированных с водорастворимыми полимерами, обычно предусматривают два этапа: (а) реакцию белка с водорастворимым полимером в условиях, при которых белок оказывается соединенным с одним или более водорастворимым полимером, и (б) выделение продукта реакции. Условия реакции для каждого случая конъюгации могут быть выбраны среди известных из уровня техники и соответственно модифицированы, но обязательно должны исключать или ограничивать такие значения параметров реакции (температуры, присутствия растворителей, значения рН), которые могли бы инактивировать подлежащий модификации белок. В целом, оптимальные условия реакции определяют для каждого конкретного случая, исходя из известных параметров и желаемого результата. Например, чем выше отношение водорастворимый полимер : конъюгат белка, тем выше выход конъюгированного продукта. Оптимальное отношение (в смысле эффективности реакции, когда не имеется избытка не прореагировавших белка или полимера) определяется такими факторами, как желаемая степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярный вес выбранного полимера, разветвленность или неразветвленность полимера, а также условиями реакции. Отношение водорастворимого полимера (например, ПЭГа) к белку обычно колеблется в пределах от 1:1 до 100:1. Один или более очищенный конъюгат может быть получен из каждой смеси стандартными методами очистки, к которым среди прочих относятся диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и электрофорез.
При желании может быть получен химически модифицированный по Ν-концу белок. Выбирают водорастворимый полимер соответствующего молекулярного веса, разветвленности и т. п., определяют соотношение водорастворимого полимера и белка (или пептида) в реакционной смеси, тип осуществляемой реакции и метод выделения выбранного химически модифицированного по Ν-концу белка. Метод получения препарата химически модифицированного по Ν-концу белка (например, разделение, при необходимости, данной формы и других монодериватизированных форм) может представлять собой очистку Ν-терминально химически модифицированного белка из популяции молекул химически модифицированного белка. Избирательная Ν-терминальная химическая модификация может быть проведена путем восстановительного алкилирования, при котором используется различающаяся реакционная способность различных типов первичных аминогрупп (лизина против Ν-терминальных), доступных для дериватизации в конкретном белке. В соответствующих условиях реакции достижима существенная селективная дериватизация белка по Ν-концу с полимером, содержащим карбонильную группу. Например, можно избирательно прикрепить водорастворимый полимер к Νконцу белка проведением реакции при таком значении рН, которое позволяет использовать преимущество в разнице между рКа εаминогруппы остатков лизина и α-аминогруппы Ν-терминального остатка белка. При такой избирательной дериватизации прикрепление водорастворимого полимера к белку контролируемо: конъюгация с полимером происходит преимущественно по Ν-концу белка без существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковых цепей лизина. Для проведения восстановительного алкилирования водорастворимый полимер может принадлежать к одному из описанных выше типов и должен иметь один реакционноспособный альдегид для связывания с белком. Может быть использован полиэтиленгликольпропиональдегид, содержащий единственный реактивный альдегид.
В настоящем изобретении конкретно заявлен химически дериватизированный белок, включая его моно- или поли- (например, 2-4) ПЭГ-производные. Пэгирование может быть проведено с помощью любой известной из уровня техники реакции. Методы получения ПЭГированного белкового продукта обычно предусматривают два этапа: (а) реакцию белкового продукта с полиэтиленгликолем (например, реакционноспособным эфиром или альдегидным производным ПЭГа) в условиях, при которых белок оказывается соединенным с одной или более группами ПЭГа, и (б) выделение продукта (или продуктов) реакции. В целом, оптимальные условия реакции определяют для каждого конкретного случая, исходя из известных параметров и желаемого результата.
Имеется ряд дополнительных методов, доступных квалифицированному специалисту (см., например, заявку ЕР 0401384, упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки; а также Майк е! а1., (1992), Ехр.Нета!о1., 20:10281035; РгапсБ (1992), Еосик оп Сго\\!11 Рас!ог§, 3(2):4-10, (риЫййеб Ьу Мебйспр!, Моип!аш Соиг!, Рпегп Ваше! Ьапе, Бопбоп Ν20 ОБО, ИК); ЕР 0154316; ЕР 0401384; АО 92/16221; АО 95/34326 и другие публикации, упоминаемые в настоящем описании в качестве ссылок).
В частности, пэгирование может быть осуществлено посредством реакций ацилирования или алкилирования с реакционноспособной молекулой полиэтиленгликоля. Таким образом, к заявленным в настоящем изобретении белковым продуктам относятся также и пэгированные белки, в которых группы ПЭГа присоединены через ацильные или алкильные группы. Эти продукты могут быть монопэгированными или полипэгированными (например, содержать 2-6, а предпочтительно 2-5 групп ПЭГа). Группы ПЭГа обычно присоединяются к белку через αили ε-аминогруппы аминокислот, но считается также, что группы ПЭГа могут быть присоединены к любой аминогруппе белка, которая в достаточной степени реакционноспособна для присоединения группы ПЭГ в приемлемых условиях реакции.
При пэгировании ацилированием обычно происходит реакция активных эфирных производных полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белком. Для реакции ацилирования выбранный полимер (или полимеры) должны обладать одной реакционноспособной эфирной группой. Для проведении реакции пэгирования может быть использована любая из известных или обнаруженных впоследствии реакционноспособных молекул ПЭГ. Предпочтительным активированным эфиром ПЭГ является ПЭГ, этерифицированный Νгидроксисукцинимидом (ΝΗ8). Считается, что термин ацилирование включает без ограничений следующие типы связей между терапевтическим белком и таким водорастворимым полимером, как ПЭГ: амидную, карбаматную, уретановую и им подобные (см. С11ато\у (1994), Βίοсоиида!е Сйсш.. 5(2):133-140). Условия реакции могут быть выбраны среди известных из уровня техники условий реакций пэгирования и соответственно модифицированы, но должны исключать такие значения параметров реакции (температуры, присутствия растворителей, значения рН), которые могли бы инактивировать подлежащий модификации белок.
Пэгирование ацилированием обычно приводит к получению пилипэгированного белка. Предпочтительно связующим звеном является амид. Также предпочтительно, чтобы полученный продукт был, по существу, (например, >95%) моно-, ди- или трипэгированным. Однако могут образовываться формы с более высокой степенью пэгирования, число которых зависит от конкретных условий реакции. При желании более очищенные пэгированные формы могут быть отделены от смеси (в частности, не прореагировавшего ПЭГа) стандартными методами очистки, к которым среди прочих относятся диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и электрофорез.
Для пэгирования алкилированием обычно требуется реакция терминального альдегидного производного ПЭГа с белком в присутствии восстанавливающего агента. Для восстановительной реакции алкилирования выбранный полимер (полимеры) должен иметь одну реакционноспособную альдегидную группу. Примером реакционноспособного альдегида ПЭГ служит полиэтиленгликольпропиональдегид, который стабилен в воде, или его моно-С1-С10 алкокси- или арилоксипроизводные (см. патент США 5,252,714, упоминаемый в настоящем описании в качестве ссылки).
Пэгирование алкилированием может также приводить к получению полипэгированного белка. Можно подобрать условия реакции для предпочтительного пэгирования только αаминогрупп на Ν-конце белка (т.е. получения монопэгированного белка). При монопэгировании и полипэгировании группы ПЭГа предпочтительно связываются с белком через -СН2-ЫНгруппы. С учетом роли -СН2-группы такой тип связи обозначается, как алкильная связь.
Восстановительное алкилирование для получения, по существу, гомогенной популяции продукта монополимер/белок обычно включает два этапа: (а) реакцию белка с реакционноспособной молекулой ПЭГа в условиях восстановительного алкилирования при значении рН, обеспечивающем избирательную модификацию αаминогрупп на аминоконце данного белка, и (б) выделение продукта (или продуктов) реакции. Дериватизация путем восстановительного алкилирования использует преимущество в разнице между рКа аминогрупп остатков лизина и αаминогруппы Ν-терминального остатка белка (рКа представляет собой такое значение рН, при котором 50% аминогрупп протонировано, а 50% - нет).
Реакцию проводят при таком значении рН, которое позволяет использовать преимущество в разнице между рКа ε-аминогруппы остатков лизина и α-аминогруппы Ν-терминального остатка белка. Вообще, если значение рН ниже, требуется больший избыток полимера по сравнению с белком (т. е. чем меньше доступных Νтерминальных реакционноспособных α-аминогрупп, тем больше полимера требуется для достижения оптимальных условий). Если значение рН выше, то соотношение полимера и белка не обязательно должно быть таким высоким (т.е. доступно больше реакционноспособных групп, соответственно требуется меньше молекул полимера). Для целей настоящего изобретения значение рН обычно находится в пределах 3-9, предпочтительно 3-6. Для восстановительного алкилирования восстанавливающий агент должен быть стабилен в водном растворе и предпочтительно восстанавливать только Шиффово основание, образовавшееся на начальных этапах восстановительного алкилирования. Подходящие восстанавливающие агенты могут быть выбраны из группы, включающей борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, диметиламин боран, триметиламин боран и пиридин боран. Особенно удобным восстанавливающим агентом является цианоборогидрид. Другие параметры реакции, такие как растворитель, время реакции, температуры и способ очистки продуктов, определяют конкретно для каждого случая, основываясь на опубликованной информации по дериватизации белков водорастворимыми полимерами.
При такой избирательной дериватизации прикрепление водорастворимого полимера (содержащего такую реакционноспособную группу, как альдегид) к белку контролируемо: конъюгация с полимером происходит преимущественно по Ν-концу белка без существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковых цепей лизина. Препарат обычно состоит более чем на 90% из конъюгата монополимер/белок, более типично более чем на 95% из конъюгата монополимер/белок, при этом оставшаяся часть молекул в реакцию не вступила (т.е. белок без полимерных групп).
В конкретном варианте осуществления изобретения неразветвленный монометоксиполиэтиленгликольальдегид со средним молекулярным весом около 20 кД или около 33 кД (т.е. между 30 и 35 кД), или четвертичный бутилполиэтиленгликольальдегид со средним молекулярным весом около 33 кД (т.е. между 30 и 35 кД) конъюгирован посредством восстановительного алкилирования с δΤΝΡΡ-Ι 2.6Ό/Ν105.
Пэгирование может быть также осуществлено при использовании водорастворимых полимеров, имеющих по меньшей мере одну реакционноспособную гидроксигруплу (например, полиэтиленгликоля). При этом водорастворимый полимер вступает в реакцию с реагентом, обладающим карбонильной, нитрильной или сульфоновой группой, для конверсии гидроксильной группы в реакционноспособный акцептор Михаэля, образуя тем самым активированный линкер, пригодный для модифицирования различных белков с получением улучшенных биологически активных конъюгатов. Реакционноспособный карбонил, нитрил или сульфон означает карбонильную, нитрильную или сульфоновую группу, с которой связана вторая карбоновая группа с образованием реакционноспособного сайта для тиолспецифического связывания второго углерода карбонильной, нитрильной или сульфоновой группы (АО 92/16221).
Активированные линкеры могут быть монофункциональными, бифункциональными или многофункциональными. К реагентам, имеющим реакционноспособные сульфоновые группы, которые могут быть использованы при осуществлении указанных методов, относятся (без ограничений перечисленными) хлоросульфон, винилсульфон и дивинилсульфон.
В специфическом варианте осуществления изобретения водорастворимый полимер активирован акцептором Михаэля. В заявке АО 95/13312 описаны, т!ет айа, водорастворимые сульфон-активированные полиэтиленгликоли, которые высоко избирательно связываются с тиоловыми группами вместо аминогрупп на молекулах или поверхностях. Эти производные
ПЭГа устойчивы к гидролизу при нахождении длительное время в водной среде и к рН 11 или ниже, а также образуют связи с молекулами, что приводит к образованию гидролитически стабильных конъюгатов. Соединение ПЭГа и биологически активной молекулы достигается за счет связывания сульфоновой группы и тиоловой группы, что приводит к образованию структуры РЕС-8О2-СН2-СН2-8-А, где А обозначает биологически активную молекулу, и где сульфоновая группа представлена винилсульфоном или активным этилсульфоном. Особенно полезны две гомобифункциональные производные, а именно ПЭГ-бис-хлоросульфон и ПЭГ-бисвинилсульфон.
В опубликованной международной заявке ϋδ 96/19459, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, описаны способы получения сульфон-активированных линкеров путем получения соединения, имеющего реакционноспособную гидроксильную группу, и конверсии гидроксильной группы в реакционноспособный акцептор Михаэля с образованием активированного линкера. При этом в качестве растворителя для конверсии используется тетрагидрофуран (ТНЕ). В опубликованной международной заявке υδ 96/19459, приведенной в настоящем описании в качестве ссылки, описан процесс очистки активированных линкеров с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия для разделения линкеров на основе размера и функции концевой группы.
В частности, в настоящем изобретении рассматриваются следующие экспрессированные в прокариотах молекулы, которые химически дериватизированы с присоединением моноили поли- (т.е. 2-4) групп ПЭГа: δΤΝΡΡ-Ι 2.6Б/С105, δΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С106, δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν105, δΤΝΡΚ-Ι 2.3Ό/68, δΤΝΡΚ-Ι 2.3Ό/618 и 8ΤΝΕΚ.-Ι 2.3Ό/615, в метионилированной или неметионилированной форме, а также их варианты и производные.
Поливалентные формы.
Можно сконструировать поливалентные формы, т.е. молекулы, содержащие более чем одно активное начало. В одном из вариантов осуществления изобретения молекула может обладать множественными сайтами связывания фактора некроза опухолей для лиганда ΤΝΡ (т.е. комбинация усеченных продуктов δΤΝΕΚ.). Дополнительно, молекула может обладать по меньшей мере одним сайтом связывания фактора некроза опухолей и в зависимости от желаемых характеристик поливалентной формы одним сайтом связывания другой молекулы (например, комбинация по меньшей мере одного усеченного продукта δΤΝΡΚ. и по меньшей мере одного антагониста рецептора интерлейкина-1 ДЬ-На), как описано ниже).
В конкретном варианте осуществления изобретения поливалентные формы могут быть сконструированы, например, путем химическо го соединения по меньшей мере одного усеченного продукта δΤΝΕΚ. с любым клинически приемлемым линкером (т.е. водорастворимым полимером, как описано выше). В принципе, линкер не должен вносить новую иммуногенность, или, в силу присутствия новых аминокислотных остатков, изменять гидрофобность или баланс зарядов в структуре, что могло бы отрицательно сказаться на ее биораспределении и клиренсе.
Такие полимеры, при использовании их в качестве линкеров, могут быть гомополимерами, случайными или блоковыми сополимерами и терполимерами, основанными на перечисленных выше мономерах, с неразветвленной или разветвленной цепью, с заменами или без замен. Полимер может иметь любую длину и молекулярный вес, но эти характеристики могут влиять на биологические свойства. Средние молекулярные веса полимеров, особенно полезных для снижения скорости клиренса при фармакологических применениях, лежат в интервале от 2,000 до 35,000 дальтон. Кроме того, для оптимизации или придания нужной биологической активности длина полимера может варьировать.
К активирующим группам, которые можно использовать для привязывания водорастворимого полимера к двум или более белкам, относятся: сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, трезилат, азидирин, оксиран и 5пиридил.
В конкретном варианте осуществления изобретения бифункциональный или мультифункциональный активированный линкер, имеющий по меньшей мере один реакционноспособный акцептор Михаэля, может быть получен в соответствии с заявкой на патент США № 08/473,809 и очищен в соответствии с заявкой на патент США № 08/611,918.
Активные начала могут быть присоединены с использованием обычных методов связывания (см. опубликованные международные заявки АО 92/16221 и АО 95/34326, упоминаемые в настоящем описании в качестве ссылок). Кроме того, в заявке АО 92/16221 описано получение различных димеризованных молекул ингибитора δΤΝΕΒ-Ε т.е. димеризованных с105 δΝΤΈΒ-Ι. Примером могут служить поливалентные белки, связывающие фактор некроза опухолей и имеющие формулу (δΤΝΕΚ-Ι 2.6Ό/Ο106)2(20кЛа РЕО), которые описаны в примере I.
Альтернативно, бивалентная молекула может состоять из двух тандемных повторов усеченных продуктов δΤΝΕΒ, разделенных полипептидным линкером.
Конструкция полипептидных линкеров аналогична конструкции вставки последовательностей короткой петли между доменами конструируемых бе ηονο белков (Мийет (1988), ΤΊΒ8, 13:260-265 и Ведап апб ОеОтабо(1988), 8с1епсе, 241:976-978, работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок). Показано, что линкер, приемлемый для одноцепо чечных антител, эффективен для получения димерных форм рекомбинантного κΤΝΕΒ-ΙΙ человека (Nеνе е1 а1., (1996), Су1окше, 8(5):365-370, работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Было получено несколько различных линкерных конструктов, полезных для применения с антителами; наиболее функционально активные линкеры варьируют по размеру от 12 до 25 аминокислот (аминокислоты с нереакционноспособными боковыми группами, например аланин, серин и глицин), которые вместе составляют гидрофильную последовательность и имеют мало противоположно заряженных остатков, что повышает растворимость молекулы и делает ее гибкой (АЫботе апб Ейри1а (1991), Ме1йоб§: А Сошрашоп 1о Ме1йоб§ ш Еп7ушо1оду, 2:97-105 и Вйд1бо е1 а1., (1993), Ншшипок, 150:469-479, работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок).
В конкретном варианте осуществления изобретения усеченные δΤΝΡΒδ могут быть химически присоединены к биотину, а затем конъюгаты биотин/усеченные δΤΝΤΒδ связывают с авидином, что приводит к образованию тетравалентных молекул авидин/биотин/ усеченные δΤΝΕΚ,δ. Усеченные δΤΝΡΒδ также могут быть ковалентно связаны с динитрофенолом (ΌΝΡ) или тринитрофенолом (ΤΝΡ), а полученные конъюгаты осаждены анти-ΌΝΡ или анти-ΤNΡ-IдМ с образованием декамерных конъюгатов с валентностью 10 в отношении ΤΝΕ-связывающих сайтов.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, можно получить рекомбинантные слитые белки, содержащие усеченный κΤΝΕΒ, при том что в каждой химерной молекуле последовательность κΤΝΕΒ, как описано выше, заменена вариабельными доменами тяжелых или легких цепей и содержит полные пли частичные константные домены (но по меньшей мере один константный домен) тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов человека.
Например, каждый такой химерный слитый белок (усеченный δΤΝΤΒ/^Ο1) может быть получен из двух химерных генов: усеченный δΤΝΕΒ/каппа легкая цепь 1д человека (усеченный δΤΝΕΒ/Ск) и усеченный кЕПЕВ/гаммаН тяжелая цепь 1д человека (усеченный МЛЕВ/Сд-!). После транскрипции и трансляции двух химерных генов, как описано ниже, продукты генов могут быть собраны в единую химерную молекулу, в которой усеченные κΤΝΕΒκ представлены бивалентно. Дополнительные детали конструирования таких химерных молекул описаны в патенте США 5,116,964, опубликованной международной заявке АО 89/09622, опубликованной международной заявке АО 91/16437 и ЕР 315062, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения могут быть получены реком бинантные слитые белки со специфичностью усеченных δΤΝΕΒδ при том, что каждая рекомбинантная химерная молекула содержит последовательность δΤΝΕΚ.. как описано выше, а также по меньшей мере часть области 186-401 остеопротегрина (ОРС), как описано в заявке на Европейский патент № 96309363.8.
Полинуклеотиды.
Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, кодирующим усеченные 5ΤΝΕΚ.5. Основываясь на настоящем описании и используя универсальную таблицу кодонов, любой квалифицированный специалист может легко определить все нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности усеченных 5ΤΝΕΚ.5. К предпочтительным нуклеотидным последовательностям относятся такие полинуклеотиды, которые кодируют δΤΝΕΒ-Ι 2.6Э/С105, δΤΝΕΒ-Ι 2.6О/С106, δΤΝΕΚ-Ι 2.6Ό/Ν105, δΤΝΕΚ-Ι 2.3Ό/68, δΤΝΕΚ-Ι 2.3Ό/618 и δΤΝΕΚ-Ι 2.3Ό/615. Примеры различных полинуклеотидов приведены на фиг. 2, 3, 4, 5, 6 и 7.
Методы рекомбинантной экспрессии, осуществленные в соответствии с приведенным ниже описанием, могут быть применены для получения таких полинуклеотидов и экспрессии кодируемых ими белков. Например, путем введения нуклеотидной последовательности, кодирующей усеченный δΤΝΕΚ. в соответствующий вектор, квалифицированный специалист может легко получить большие количества нужной нуклеотидной последовательности. Затем последовательности могут быть использованы для получения проб для гибридизации или праймеров для амплификации. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий усеченный δΤΝΕΚ., может быть введен в вектор экспрессии. При введении вектора экспрессии в соответствующие хозяйские клетки можно получить большие количества нужного усеченного δΤΝΕΚ..
Как видно из дальнейшего описания, существуют многочисленные системы хозяин/вектор, пригодные для получения нужных нуклеотидных последовательностей и/или продукции нужных белков. К ним относятся, но не ограничиваются перечисленными, плазмидные, вирусные и инсерционные векторы и прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Квалифицированный специалист может адаптировать систему хозяин/вектор для наращивания и экспрессии гетерологичной ДНК с целью получения или экспрессии заявленных в настоящем изобретении последовательностей.
Кроме того, как следует из настоящего описания и что очевидно квалифицированному специалисту, нуклеотидные последовательности включают вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие усеченные 5ΤΝΕΚ.5 и имеющие структуру, приведенную на чертежах, а также нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются (предпочтительно в жестких условиях гибридизации) с данными нуклеотидными последовательностями [МашаДк с1 а1., (1982), Мо1еси1аг С1ошпд (А ЬаЬога1огу Мапиа1), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу, рр. 387389]. Примером гибридизации в жестких условиях служит гибридизация в 4 х 88С при 6267° с последующей отмывкой в 0.1 х 88С при 62-67° в течение часа. Альтернативно жесткую гибридизацию можно провести в 45-55%ном формамиде, 4 х 88С при 40-45°. В объем настоящего изобретения также включены последовательности ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидными последовательностями, приведенными на фиг. 1 и 9, в мягких условиях гибридизации и которые кодируют усеченные 8ΤΝΕΚ.8.
Примерами таких мягких условий гибридизации могут служить гибридизация в 4 х 88С при 45-55°С или гибридизация в 30-40%ном формамиде при 40-45°.
Согласно настоящему изобретению также заявлены рекомбинантные ДНК-конструкты, включая векторную ДНК вместе с последовательностями ДНК, кодирующими усеченные 5ΤΝΕΚ.5. В каждом из таких ДНК-конструктов нуклеотидные последовательности, кодирующие усеченные 5ΤΝΕΚ.5 (с сигнальными пептидами или без них), функционально связаны с приемлемыми регуляторными последовательностями, способными направлять репликацию и или экспрессию усеченных 5ΤΝΕΚ.5 в определенном хозяине.
Рекомбинантная экспрессия.
Получение полинуклеотидов.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие усеченные δΤΝΡΡδ, могут быть получены различными способами, включая (но не ограничиваясь перечисленными) химический синтез, скрининг геномных и кДНКовых библиотек, скрининг экспрессионных библиотек и/или ПЦР-амплификацию кДНК. Данные методы, а также и другие, пригодные для выделения нуклеотидных последовательностей, известны из уровня техники и описаны в следующих руководствах: 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, ΝΥ; (1989); Аи8иЬе1 е1 а1., ебк, Сиггеп! Рго1осок ш Мо1еси1аг Вю1оду, Сиггеп! Рго1осок Ргекк, (1994); и Вегдег апб К1тте1, МеШобк ш Епхуто1оду: Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошпд ΤесЬп^^ие8, Уо1.152, Асабетк Ргекк, Шс., 8ап О1едо, СА, (1987), упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Химический синтез нуклеотидных последовательностей, кодирующих усеченные 8ΤΝΕΚ.8, проводят в соответствии с методами, хорошо известными из уровня техники, описанными, например, в работах Епде1к е1 а1., (1989), Апдете. С1ет. ШД. Еб., 28:716-734 и ^е11к е! а1., (1985), Сепе, 34:315, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок. Указанные методы включают среди прочих фосфотриэфирный, фосфорамидатный и Н-фосфонатный методы синтеза нуклеотидных последовательностей. Большие нуклеотидные последовательности, например, длиннее 100 нуклеотидов, могут быть синтезированы в виде нескольких фрагментов. Затем фрагменты дотируют друг с другом и получают нуклеотидную последовательность, кодирующую усеченные 5ΤΝΡΚ.5. Предпочтительным способом является синтез на полимерной подложке с использованием стандартной химии фосфорамидатов.
Альтернативно искомые нуклеотидные последовательности можно получить при скрининге соответствующих кДНКовых библиотек (например, библиотеки, полученной из одной или нескольких тканей, в которых экспрессируется данный белок) или геномных библиотек (библиотеки, полученной из тотальной геномной ДНК). Источником для получения кДНКовой библиотеки обычно служит ткань любого типа, в которой нужный белок экспрессируется в приемлемых количествах. Обычно источником получения геномной библиотеки служит любая ткань или ткани млекопитающего или животного другого вида, в которой имеется ген, кодирующий усеченный δΤΝΡΚ.
Библиотека может быть проскринирована на наличие ДНК, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ, с применением одного или более нуклеотидных зондов (олигонуклеотиды, кДНК или фрагменты геномной ДНК, обладающие достаточным уровнем гомологии с кДНК или клонируемым геном), которые будут избирательно гибридизоваться с кДНК или геном (генами), присутствующим(и) в библиотеке. Используемые для такого скрининга пробы обычно представляют собой небольшой фрагмент последовательности ДНК того же или сходного биологического вида, что и вид животного, из тканей которого получена библиотека. Альтернативно зонды могут быть вырожденными, что обсуждается далее.
Обычно скрининг библиотеки проводят путем отжига олигонуклеотидного зонда или кДНК с клонами библиотеки в условиях такой жесткости, которая предотвращает неспецифическое связывание, но делает возможным связывание с зондом или праймером тех клонов, которые обладают значительным уровнем гомологии с зондом или праймером. Обычно параметры жесткости гибридизации и последующих отмывок зависят от размера (т.е. числа нуклеотидов) кДНК или олигонуклеотидного зонда, а также от того, является ли зонд вырожденным. При составлении гибридизационной смеси учитывается также вероятность идентификации клона (т.е. скринируется кДНКовая или геномная библиотека).
Когда в качестве зонда используют фрагмент ДНК (такой как кДНК), то условия гибридизации выбирают, как описано АикиЬе! е! а1., ебк. кирга. После гибридизации содержащий библиотеку блот отмывают в условиях подходящей жесткости, которая зависит от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология зонда и клона, характер скринируемой библиотеки, число скринируемых клонов и т.д. Далее приведены примеры жестких отмывочных растворов, которые обычно имеют низкую ионную силу и применяются при сравнительно высоких температурах: 1) 0,015М №С1, 0,005М №1-цитрат и 0,1% 8Ό8 при 55-65°С; 2) 1 мМ №2 ΕΌΤΑ, 40 мМ NаНΡО4, рН 7,2, и 1% 8Ό8 при 40-50°С; 3) 0,2 х 88С, 1% 8Ό8 при 50-65°С.
Известны различные примерные протоколы отмывания в жестких условиях, когда для скрининга кДНКовых или геномных библиотек используют олигонуклеотидные зонды. Например, в одном из протоколов используется 6 х 88С с 0.05% пирофосфата натрия при температуре от 35°С до 63°С, в зависимости от длины зонда. Например, зонд, состоящий из 14 оснований, отмывают при 35-40°С, из 17 - при 4550°С, из 20 - при 52-57°С и из 23 - при 57-63°С. При усиленном неспецифическом (фоновом) связывании температура может быть повышена на 2-3°С. В другом протоколе для отмывания используется хлорид тетраметиламмония (ТМАС). В состав одного из жестких отмывочных растворов входят 3 М ТМАС, 50 мМ ТП8-НС1, рН 8,0, и 0,2% 8Ό8.
Другим удобным методом получения нужной нуклеотидной последовательности является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В этом случае кДНК получают на матрице поли(А)+РНК или тотальной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы. К кДНК добавляют два праймера (олигонуклеотиды), обычно комплементарные двум различным областям кДНК, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ.. а также полимеразу, например Тад полимеразу. При этом полимераза амплифицирует область кДНК между праймерами.
Олигонуклеотидные последовательности, отобранные в качестве зондов или праймеров, должны иметь адекватную длину и быть достаточно недвусмысленными, чтобы минимизировать неспецифическое связывание, которое может иметь место при скрининге библиотек или ПЦР-амплификации. Действительная последовательность зондов или праймеров обычно основывается на консервативных или высоко гомологичных последовательностях или участках. Дополнительно, зонды или праймеры могут быть полностью или частично вырожденными, т. е. представлять собой смесь зондов/ праймеров, в совокупности кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность, но использующих для этого различные кодоны. Альтернатива получению вырожденных зондов состоит во введении инозина в некоторые или во все кодоны, положение которых варьирует в зависимости от биологического вида. Олиго нуклеотидные зонды или праймеры могут быть получены методами химического синтеза ДНК, как описано выше.
Как указывалось выше, вариантные последовательности представляют собой такие природные (например, аллельные вариации) или синтетические последовательности, которые содержат одну или более замен, делеций или инсерций нуклеотидов в сравнении с последовательностью, представленной на фиг. 2, 3, 4, 5, 6 и 7, что приводит к экспрессии вариантов аминокислотных последовательностей по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа. Получение синтетических мутантных последовательностей хорошо известно из уровня техники и описано, например, в работах 8атЬгоок е! а1., (1989), зирга и \Уе11к е! а1., (1985), Сепе, 34:315, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Векторы.
ДНК, кодирующую усеченные δΤΝΕΚδ, встраивают в векторы для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. Могут быть использованы коммерчески доступные векторы или же вектор конструируют специально. Выбор и конструкция соответствующего вектора будут зависеть от следующих факторов: 1) будет ли вектор использован для амплификации ДНК или для экспрессии ДНК; 2) от размера ДНК, предназначенной для встраивания в вектор, и 3) от того, какие клеткихозяева будут трансформированы вектором.
В любом векторе нуклеотидная последовательность, кодирующая нужный белок, функционально связана с одной или более регуляторной последовательностью, которые способны направлять, контролировать и вообще каклибо влиять на экспрессию данного белка в конкретных клетках-хозяевах. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его назначения (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и совместимости с определенными хозяйскими клетками. В состав вектора обычно входят следующие компоненты (без ограничения перечисленными): сигнальная последовательность, начало репликации, один или более селективный(е) или маркерный(е) ген(ы), промотор, энхансер, последовательность терминации транскрипции и подобные указанным. Данные компоненты могут быть получены из природных источников или же синтезированы известными методами.
К подходящим прокариотическим векторам клонирования относятся бактериофаги, в частности производные фага лямбда, плазмиды Е.сой (например, рВК322, со1 Е1, рИС, Е-фактор и производные плазмиды В1ие8спр!® (8!га!адепе, Ьа1о11а, СА)). Могут использоваться другие векторы экспрессии, многочисленные типы которых известны из уровня техники и которые совместимы с описанными ниже клеткамихозяевами.
Сигнальная последовательность.
Нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальную последовательность, может быть встроена в 5'-концевой участок последовательности, кодирующей усеченный δΤΝΕΚ., т.е. она может быть компонентом вектора, или же она может являться частью нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный δΤΝΕΚ., встроенной в вектор. Нуклеиновые кислоты, кодирующие нативные сигнальные последовательности δΤΝΕΚ-Ι и δΤΝΕΚ-ΙΙ, известны из уровня техники (ЕР 393438 и ЕР 422339).
Начало репликации.
Векторы клонирования и экспрессии обычно включают в свой состав нуклеотидные последовательности, обеспечивающие вектору возможность репликации в одном или нескольких типах клеток-хозяев. В случае вектора клонирования такая последовательность позволяет вектору реплицироваться независимо от хозяйской хромосомной ДНК и включает начало репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны. Начало репликации плазмиды рВК322 приемлемо для большинства грамотрицательных бактерий, а различные другие начала репликации (например, вируса 8У40, вирусов полиомы, аденовируса, У8У или ВРУ) пригодны для векторов, предназначенных для клонирования в клетках млекопитающих. Обычно начало репликации не является необходимым для векторов, предназначенных для экспрессии в клетках млекопитающих (например, начало репликации 8У40 часто используют только потому, что оно содержит ранний промотор).
Селективный ген.
Векторы клонирования и экспрессии обычно содержат селективный ген. Данный ген кодирует маркерный белок, необходимый для выживания или роста трансформированной клетки-хозяина при выращивании на селективной культуральной среде. Нетрансформированные вектором клетки не будут содержать селективного гена и потому не выживут в данной культуральной среде. Типичные селективные гены кодируют белки, которые а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину; б) комплементируют ауксотрофные недостаточности или в) предоставляют критически важные питательные вещества, недоступные из культуральной среды.
Другие селективные гены используют для амплификации экспрессируемых генов. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, кодирующие нужный белок, и гены, необходимые для роста клеток, тандемно повторяются снова и снова в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примерами селективных маркеров, подходящих для клеток млекопитающих, служат дигидрофолатредуктаза (ΌΗΕΚ) и тимидинкиназа. Транс формированные клетки млекопитающих выращивают под селективным давлением, при котором, благодаря перенесенному вектором маркеру, выживают только истинные трансформанты. Селективное давление обеспечивается культивированием трансформированных клеток в условиях последовательно повышающейся концентрации селективного агента в среде, что приводит к амплификации селективного гена и ДНК, кодирующей усеченные 5ΤΝΡΚ.5. В результате этого на амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества усеченных 5ΤΝΡΚ.5.
Например, клетки, трансформированные селективным геном ΌΗΡΚ, были впервые выделены путем культивирования всей совокупности трансформантов в культуральной среде с метотрексатом, конкурентным антагонистом ΌΗΡΚ. Подходящими клетками-хозяевами для ΌΗΡΚ дикого типа являются клетки яичника китайского хомячка, дефицитные по активности ΌΗΡΚ (см. например, работу Иг1аиЬ апб Отт (1980), Ргос. Ыа!1. Лсаб. δοΐ. И.8.Л., 77(7):4216-4220, упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки). Трансформированные клетки затем культивируют при повышающихся концентрациях метотрексата. Это приводит к синтезу множественных копий гена ΌΗΡΚ и, сопутствующим образом, многочисленных копий другой ДНК, присутствующей в векторе экспрессии, например ДНК, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ.
Промотор.
Как экспрессионные векторы, так и векторы клонирования обычно содержат промотор, который распознается хозяйским организмом и функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ Промотор представляет собой нетранслируемую последовательность, расположенную выше (5')-стартового кодона структурного гена (обычно в пределах 100-1000 пар оснований), которая контролирует транскрипцию и трансляцию конкретной последовательности нуклеиновой кислоты, в частности, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ. Промоторы обычно подразделяют на два класса: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы индуцируют усиление транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на какие-либо изменения в условиях культивирования, например температурный сдвиг или наличие или отсутствие какого-либо питательного вещества. Известно большое число промоторов, распознаваемых разнообразными клеткамихозяевами. Промотор может быть функционально связан с ДНК, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ, путем рестрикционного удаления существующего промотора из ДНК и вставкой в вектор нужной промоторной последовательности. Нативная промоторная последовательность δΤΝΡΚ-Ι или промоторная последовательность δΤΝΡΚ-ΙΙ могут быть использованы для контроля амплификации и/или экспрессии ДНК, кодирующей усеченный δΤΝΡΚ. Гетерологичный промотор, однако, является более предпочтительным, поскольку он допускает более высокий уровень транскрипции и обеспечивает более высокий уровень выхода экспрессируемого белка в сравнении с нативным промотором при том, что он совместим с выбранной клеточной системой экспрессии. Например, любая из нативных промоторных последовательностей других членов семейства ΝΟΡ/ΤΝΡ может быть использована для контроля амплификации и/или экспрессии ДНК, кодирующей усеченный 8ΤΝΡΚ.
К промоторам, удобным для использования в прокариотических хозяевах, относятся бета-лактамазный и лактозный промотор; промотор щелочной фосфатазы и триптофановая (!рг) промоторная система, система гена бактериальной люминесценции (ΗχΚ) и такие гибридные промоторы, как !ас промотор. Приемлемы также и другие известные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности опубликованы, что позволяет квалифицированному специалисту лигировать их с нужными последовательностями ДНК с применением линкеров или адаптеров, необходимых для создания желаемых сайтов рестрикции.
Из уровня техники известны также удобные промоторные последовательности для использования в клетках дрожжей. Известны промоторы для использования в клетках-хозяевах млекопитающих, включая промоторы, выделенные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус птичьей оспы, аденовирус (например, аденовирус типа 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и наиболее предпочтительно обезьяний вирус 40 (8У40). К другим удобным промоторам млекопитающих относятся гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы теплового шока и промотор актина.
Энхансерный элемент.
В вектор может быть введена энхансерная последовательность для усиления транскрипции в клетках высших эукариот последовательностей ДНК, кодирующих усеченный δΤΝΡΚ. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной 10-300 пар оснований, которые влияют на промотор, усиливая транскрипцию. Энхансеры относительно не зависимы от ориентации и положения. Они могут быть расположены как с 5'-конца, так и с 3'конца транскрипционной единицы. Дрожжевые энхансеры предпочтительно использовать вместе с дрожжевыми промоторами. Известны энхансерные последовательности ряда генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Обычно, однако, используют вирусные энхансе ры. Примерами энхансерных элементов, активирующих эукариотические промоторы, служат энхансер 8ν40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансер аденовируса. При том, что энхансер может быть встроен в вектор как в 5'положении, так и 3'-положении по отношению к фрагменту ДНК, кодирующему усеченный κΊΝΕΚ, обычно он занимает 5'-положение относительно промотора.
Терминация транскрипции.
Экспрессионные векторы, применяемые в эукариотических клетках-хозяевах, обычно содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Подобные последовательности обычно находятся в 5'- (и иногда в 3'-) нетранслируемых областях эукариотических ДНК или кДНК. Данные области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей усеченный κΊΝΕΚ.
Конструирование вектора.
Конструирование приемлемых векторов, содержащих один или более из перечисленных выше компонентов (вместе со смысловыми областями, кодирующими усеченный кТ№К) может быть проведено стандартными методами лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК разрезают, кроят и заново лигируют в нужном порядке для получения необходимого вектора. Чтобы убедиться, что сконструирована правильная последовательность, лигирующей смесью трансформируют Е.соб и трансформантов отбирают известными способами, как описано выше. Затем из трансформантов выделяют вектор, подвергают рестрикционному анализу и/или секвенированию для подтверждения наличия нужного конструкта.
Может быть использован также и вектор, обеспечивающий транзиторную экспрессию ДНК, кодирующей усеченный кТ№К, в клетках млекопитающих. Вообще говоря, транзиторная экспрессия предусматривает использование вектора экспрессии, который способен эффективно реплицироваться в клетках-хозяевах, так что в клетках аккумулируется множество копий экспрессионного вектора и затем синтезируются большие количества нужного белка, кодируемого вектором экспрессии. Каждая система транзиторной экспрессии, состоящая из соответствующего вектора экспрессии и клеток-хозяев, обеспечивает удобную идентификацию белков, кодируемых клонированными ДНК, а также возможность быстрого скрининга данных белков в отношении нужных биологических или физиологических свойств, например, позволяет проводить идентификацию биологическиактивного варианта усеченного кТ№К.
Клетки-хозяева.
В объем настоящего изобретения включены также любые рекомбинантные клетки хозяева, содержащие нуклеотидную последовательность, необходимую для экспрессии нужного белка. Примерами прокариотических и эукариотических клеток-хозяев служат клетки бактерий, млекопитающих, грибов, насекомых, дрожжей или растений.
К прокариотическим клеткам-хозяевам относятся (но не ограничиваются перечисленными) эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы (например, Е.со11 (НВ101, ОН5а, ΌΗ10 и МС1061); ВасШ1, такие как В.киЬ!Шк; Ркеиботопак, такие как Р.аегидтока; 8!гер!отусек крр.; 8а1топе11а !урбутигшт или 8егга!1а тагсексапк. Примером конкретного осуществления изобретения может служить экспрессия нужного белка в Е.со11.
В дополнение к прокариотическим клеткам-хозяевам приемлемыми хозяевами для экспрессии нужного белка могут служить такие эукариотические микроорганизмы, как нитчатые грибы и дрожжи. 8ассбаготусек сеге\зк1ае, или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее широко используемыми низшими эукариотами-хозяевами, однако, хорошо известны и широко доступны представители и других родов, видов и штаммов.
Усеченный кТ№К можно экспрессировать в гликозилированной форме в каких-либо клетках-хозяевах, полученных из многоклеточного организма. Такие клетки-хозяева обеспечивают сложный процессинг и гликозилирование белка. В принципе, можно использовать культуру любых эукариотических клеток позвоночных и беспозвоночных, включая клетки растений и насекомых. Примером конкретного осуществления изобретения может служить экспрессия нужного белка при помощи бакуловирусной системы в клетках насекомых.
Наращивание клеток позвоночных в культуре (культура тканей) является хорошо известным подходом и поэтому в качестве клетокхозяев могут быть использованы клетки позвоночных. Примерами полезных клеточных линий млекопитающих могут служить (но не ограничиваются перечисленными) клетки почки обезьяны линии Ον1, трансформированные 8ν40 (СО8-7), линия клеток почки эмбриона человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре), клетки почки хомячка и клетки яичника китайского хомячка. К другим приемлемым линиям клеток млекопитающих относятся (но не ограничиваются перечисленными) клетки НеБа. мышиные клетки Ь-929, линии клеток 3Т3, полученные из мышей 8^1кк, Ва1Ь-с или ΝΙΗ, а также линии клеток хомячка ВНК или НаК. Примером конкретного осуществления изобретения может служить экспрессия нужного белка в клетках СО8.
Клетки-хозяева могут быть трансфицированы и предпочтительно трансформированы нужной нуклеиновой кислотой в соответствую щих условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеотидной последовательности. Методы отбора нужных клеток-хозяев, а также методы трансформации, культивирования, амплификации, скрининга так же, как и методы получения и очистки продукта, хорошо известны из уровня техники (СеЙипд аиб 8ашЬгоок (1981), №1ите, 292:620-625, или, альтернативно, КаиГшап е1 а1., (1985), Мо1. Се11. Бю1. 5(7):1750-1759, или патент США № 4,419,446; указанные источники информации приведены здесь в качестве ссылок). Например, для клеток млекопитающих, не имеющих клеточной стенки, может быть использован метод кальций-фосфатной преципитации. Могут быть использованы электропорация, микроинъекция и другие известные методы.
Кроме того, имеется возможность получения нужного белка гомологичной рекомбинацией или методами рекомбинантных нуклеиновых кислот с использованием контролирующих элементов, введенных в клетки уже содержащие ДНК, кодирующую усеченный δΤΝΕΚ.. Гомологичная рекомбинация представляет собой метод, первоначально разработанный для таргетинга (нацеливания) генов для индукции или коррекции мутаций в транскрипционно-активных генах (Кисйебараб (1989), Ргод. Ιη Νιιοί. Ас1б Кек. Аиб Мо1. ΒίοΙ., 36:301; работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Первоначальный подход был разработан как метод введения специфических мутаций в конкретные области генома млекопитающих (Шотая е1 а1., (1986), Се11, 44:419-428; Люпт аиб СарессЫ (1987), Се11, 51:503-512 и БоеОсйтап е1 а1., (1988), Ргос. №11. Асаб. δά.υ.δ.Α., 85:85838587; все работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок) или для коррекции специфических мутаций в дефектных генах (БоеЕсйтаи е1 а1., (1987), №11иге, 330: 576-578; работа также упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Примерами могут служить способы, описанные в патенте США № 5,272,071; заявках АО 92/01069; АО 93/03183; АО 94/12650 и АО 94/31560, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Посредством гомологичной рекомбинации, последовательность ДНК, которая должна оказаться встроенной в геном, может быть направлена в специфическую область представляющего интерес гена. Достигается это прикреплением ее к нацеливающей ДНК. Нацеливающая ДНК - это ДНК, комплементарная (гомологичная) некоторой области геномной ДНК. Небольшие фрагменты нацеливающей ДНК, комплементарные конкретной области генома, входят в контакт с родительской нитью ДНК во время процесса репликации ДНК. Общим свойством перенесенной в клетку ДНК является способность гибридизоваться и потому рекомбинировать с другими фрагментами эндогенной ДНК через области общей гомологии. Если такая компле ментарная нить прикреплена к олигонуклеотиду, содержащему мутацию или другую последовательность ДНК, она также встраивается во вновь синтезируемую нить в результате рекомбинации. В результате осуществления функции проверки считывания появляется вероятность того, что новая последовательность ДНК будет служить матрицей. Таким образом, перенесенная ДНК оказывается встроенной в геном.
Если известна последовательность конкретного гена, в частности нуклеотидная последовательность, кодирующая нужный белок, можно синтезировать (или получить другим способом, например, соответствующей рестрикцией нативной ДНК в специфических сайтах, ограничивающих нужную область) последовательность, контролирующую экспрессию (фрагмент ДНК, комплементарный выбранной области гена). Такой фрагмент служит нацеливающей последовательностью при введении в клетку и будет гибридизоваться с гомологичной ему областью генома. Если подобная гибридизация происходит при репликации ДНК, то такой фрагмент ДНК и любые прикрепленные к нему дополнительные последовательности будут работать как фрагменты Оказаки и будут встроены во вновь синтезируемую дочернюю нить ДНК.
Прикрепленными к фрагментам нацеливающей ДНК оказываются такие участки ДНК, которые могут влиять на экспрессию представляющего интерес белка. Например, промотор/энхансер, супрессор или экзогенный элемент, модулирующий транскрипцию, встраиваются в геном клетки-хозяина в такой ориентации и близости, которые достаточны для влияния на транскрипцию ДНК, кодирующей нужный усеченный δΤΝΕΒ. Контролирующие элементы не кодируют усеченный δΤΝΕΚ, но контролируют определенную часть ДНК генома клетки-хозяина. Таким образом, экспрессия усеченного δΤΝΕΚ. может быть достигнута не трансфекцией кодирующей его ДНК, а использованием нацеливающей ДНК (содержащей области гомологии с эндогенным представляющим интерес геном) в сочетании с регуляторными элементами ДНК, обеспечивающими последовательность эндогенного гена узнаваемыми сигналами транскрипции усеченного δΤΝΕΚ
Культивирование клеток-хозяев.
Способы культивирования рекомбинантных клеток-хозяев для продукции нужного белка будут варьировать в зависимости от многих факторов и условий; оптимальная процедура в каждой конкретной ситуации становится понятной квалифицированному специалисту после непродолжительных экспериментов. Рекомбинантные клетки-хозяева культивируют в подходящей среде и экспрессируемый усеченный δΤΝΕΚ. собирают, выделяют и очищают из культуральной среды (или из клеток, если он экс прессируется внутриклеточно) с использованием известных из уровня техники методов.
Конкретно, любые рекомбинантные клетки, используемые для получения усеченного κΤΝΡΚ, могут культивироваться в среде, обеспечивающей индукцию промоторов, селекцию соответствующих клеток-хозяев или амплификацию гена, кодирующего нужный усеченный κΤΝΡΚ. При необходимости в состав среды могут вводиться гормоны и/или другие ростовые факторы (такие как инсулин, трансферрин или эпидермальный ростовой фактор), соли (такие как хлорид натрия, соли кальция, магния и фосфаты), буферы (такие как НЕРЕ8), нуклеозиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как гентамицин), микроэлементы (неорганические соединения, конечная концентрация которых не превышает микромолей), а также глюкоза или другой источник энергии. Могут также вводиться и другие добавки в соответствующих концентрациях, что очевидно для квалифицированного специалиста. Приемлемые для конкретных клеток-хозяев культуральные условия, такие как температура, рН и т.д., также хорошо известны квалифицированному специалисту.
Полученный продукт экспрессии может быть вычищен почти до гомогенности с использованием известных из уровня техники методов. Примеры методов очистки описаны в заявках ЕР 393438 и ЕР 422339, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Фармацевтические композиции.
Фармацевтические композиции обычно включают терапевтически эффективные количества усеченных κΤΝΡΚ и химически модифицированных усеченных κΤΝΡΚ (объединенных понятием продукт(ы) усеченных κΤΝΡΚ) в смеси с носителем. Носитель обычно включает один или несколько фармацевтически и физиологически приемлемых материалов в смеси с усеченным продуктом(продуктами) κΤΝΡΚ и материалом для контролируемого высвобождения.
Первичный растворитель в носителе может быть по своей природе как водным, так и неводным. Кроме того, носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые материалы для модификации или поддержания рН предпочтительно в пределах 5-6,5 и более предпочтительно в пределах 5,5-6,0 (например, такие буферы, как нитратный, фосфатный, и такие аминокислоты, как глицин); наполнители для лиофилизированных форм (например, маннитол или глицин); вещества для поддержания осмолярности (например, маннитол или хлорид натрия); сурфактанты (например, полисорбат 20, полисорбат 80, тритон и Р1игошск); вещества для поддержания вязкости, прозрачности, цвета, стерильности, стабильности (например, сахароза или сорбитол); антиоксиданты (например, сульфит натрия и гидроксисульфит натрия);
консерванты (например, бензоиловую кислоту и салициловую кислоту); вещества для сохранения запаха фармацевтической формы; ароматизаторы и растворители; вещества определяющие скорость растворения (например, такие солюбилизаторы или солюбилизирующие агенты, как спирты, полиэтиленгликоли и хлорид натрия); вещества определяющие скорость высвобождения; эмульгирующие агенты; суспендирующие агенты; растворители; наполнители; векторы доставки; разбавители и/или фармацевтические адъюванты. Рассматриваются также такие эффективные формы введения, как парентеральные составы медленного высвобождения, ингаляционные аэрозоли, составы, активные при оральном применении, или суппозитории. Композиции могут также включать конкретные препараты полимерных соединений, таких как разрушающиеся в массе полимеры (например, сополимеры поли(лактокогликоловой кислоты) (РЬОА), смеси полимеров РЬОА, блоковые сополимеры РЕОа и молочной и гликоловой кислоты, полицианоакрилаты); поверхностноразрушающиеся полимеры (например, полиангидриды полиортоэфиров); гидрогелевые эфиры (например, плуроновые полиолы, поли (виниловый спирт), поли(винилпирролидон), сополимеры малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, целлюлоза, производные гиалуроновой кислоты, альгинат, коллаген, желатин, альбкмин, крахмалы и декстраны) и их композиционные системы или препараты липосом или микросфер. Такие композиции могут оказывать влияние на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ίη νίνο и скорость клиренса ίη νίνο данных белков и их производных. Оптимальная фармацевтическая композиция конкретного белка определяется квалифицированным специалистом в зависимости от способа введения и нужной дозировки. Примеры фармацевтических композиций описаны в Кештдоп'к Р11агтасеибса1 8с1епсек, 18'1' Еб. (1990, Маск РнЫМппд Со., ЕакЮп, РА18042). стр. 1435-1712; ОотЬо1х апб Рейй (1995), Вюсопщда1е Сйет., 6:332-351; ЬеопеВау, е! а1., (1995), 1оигпа1 оГ Меб1сша1 СкетМгу, 38:4263-4269; Наак, е! а1., (1995), С11шса1 Ιιιιιιιιιпо1оду апб Iттипορаίйο1οду, 76(1):93; \УО 94/06457; \\Ό 94/21275; ΡΚ 2706772 и \\Ό 94/21235, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Конкретные композиции для поддерживаемого высвобождения доступны от следующих поставщиков: Оеро1ес11 (ЭероГоат'™, мультивезикулярные липосомы); А1кегтек (РгоЬеаке™ РЬОА микросферы). Как следует из контекста настоящего описания, под гиалуронаном понимаются гиалуронан, гиалуроновая кислота, ее соли (такие как гиалуронат натрия), эфиры, энзиматические производные и поперечно-сшитые гели гиалуроновой кислоты (такие как гилан). Примеры форм гиалуронана описаны Реугоп апб Ва1ахк (1974), РаШ Вю1., 22(8), 731-736; Нба1е е! а1., (1991), ГПгид Веу., 4(2):93-99; Ьагкеп е! а1., (1993), 1опгпа1 оГ Вютеб1са1 Ма!епа1к Кекеагсй, 27:1129-1134; Ыат1к1 е! а1., (1982), Ш!ета!юпа1 Шита1 оГ С11шса1 Рйагтасо1оду, Люгеру апб ^х^^ду, 20(11):501-507; Меуег е! а1., (1995), Шита1 оГ Соп!го11еб Ке1еаке, 35:67-72; К1кисЫ е! а1., (1996), Ок!еоагШгШк апб СагШаде, 4:99-110; Бакак1Ьага е! а1., (1994), С11шса1 ОгШораебкк апб Ке1а!еб Кекеагсй, 299:282-292; Меуегк апб Вгапб! (1995), 22(9): 1732-1739; Ьаигеп! е! а1., (1995), Ас!а Ог11юр. Бсапб., 66(266): 116-120; Саксопе е! а1., (1995), Вюта!епа1к, 16(7):569-574;
УегакйаШп е! а1., (1994), АгсЫуек оГ ВюсЬетМгу апб Вюрйуккк, 313(2):267-273: ВегпаЮЬек е! а1., (1993), 1опгпа1 оГ Вютебка1 Ма!епа1к КекеагсЬ, 27(5):677-681: Τап е! а1., (1990), Аик1гаНап 1оигпа1 оГ Вю!есЬпо1оду, 4(1):38-43; ОотЬо1х апб Ре!Ш (1995), Вюсо)ида1е СЬет., 6:332-351; в патентах США Ыок.
4,636,524, 4,713,448,
4,772,419, 4.851,521,
4,582,865, 4,605,691,
4,716,154, 4,716,224,
4,957,774, 4,863,907,
5,128,326, 5,202,431, 5,336,767, 5,356,883; в заявках на европейский патент Ыок. 0507604 А2, 0718312 А2 и \УО 96/05845, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок. Конкретные композиции гиалуронана доступны от следующих поставщиков: ВюМа!пх, Шс. К1бдейе1б, Ν6 (Бупу1кс™, смесь 90:10 жидкого гилана и геля гилана); ΡΙ6ιπ Б.р.А. АЬапо Τе^те. ИаГу Ηуа1дап™, натриевая соль гиалуроновой кислоты из петушиного гребня (МВ от ~500,000 до ~700,000); Какеп Рйагтасеибса1 Со., Ь!б., ^куо, 1арап Аг1г™, 1% раствор гиалуроновой кислоты из петушиного гребня, (МВ -700,000); Рйагтааа АВ, Б!оскЬо1т, Б\гебеп ^аЦп™, гиалуроновая кислота из петушиного гребня, (МВ ~4х104); Оепхуте Согрогайоп, СатЬпбде, МА (Бигдй соа!™, рекомбинантная гиалуроновая кислота); Ргопоуа В1оро1утег, Шс., РойктоиШ, ΝΗ высокомолекулярная (МВ - 1,5-2,2х106) гиалуроновая кислота ΡΟΗ, полученная из культур Б(гер!ососсик хооер|беткик; гиалуронат натрия МУ (МВ ~ 1,0-1,6х106) и гиалуронат натрия ЬУ (МВ ~ 1,5-2,2х106); Са1Ьюсйет-ЫоуаЬюйет АВ,
Ьаи!епйпдеп, Б\\'Пхег1апб (гиалуроновая кислота, натриевая соль, (каталог компании за 1997, номер 385908), полученная из Б!гер!ососсик кр.); Ш!егдеп Сотрапу, РигсЬаке, ΝΥ гиалуроновая кислота из петушиного гребня, (МВ >1х106); ВюкупШ Шс., СЫсадо, Ш; АтегсЬо1 Согр., еб1коп, Ν6 и Куо^а Ηакко Кодуо Со., Ь!б., %куо, Шрап.
После приготовления фармацевтические композиции могут храниться в стерильных фла конах в виде раствора, суспензии, геля, эмуль сии, твердого или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие композиции могут храниться в виде готовых к применению форм или форм, требующих растворения перед введением (например, лиофилизированных).
Один из конкретных вариантов осуществления изобретения относится к наборам, необходимым для получения единичной дозы введения препарата. В каждый набор может входить первый контейнер с высушенным белком и второй контейнер, содержащий водную композицию. В объем настоящего изобретения включены такие наборы, в состав которых входят одноили многокамерные предзаполненные шприцы; такие предзаполненные шприцы (например, шприцы для жидкостей и лиошприцы, такие как Ьуо-1ес!®, двухкамерный предзаполненный лиошприц) доступны от Уейег ОтЬЦ КауепкЬигд, Оегтапу.
Применение.
Продукты усеченных кТОТЯ могут быть полезны, как исследовательские реагенты, а также как терапевтические и диагностические агенты. Указанные усеченные кЛУКк можно использовать в диагностических тестах Ш У1!го и/или Ш у1уо для определения количества нативного кЯТИ-! или 5ΪΝΡΚ-ΙΙ в образцах тканей и органов или для определения и/или выделения клеток, которые экспрессируют ΤΝΡ (БсаШоп е! а1., (1995), кирга). При тестировании тканей и органов радиоактивность от связанных с ΤΝΡ 'А-усеченных кЛ^Кк будет меньше при сопоставлении со стандартизованной кривой связывания Ά-усеченных ИЖК в силу связывания немеченного нативного ^ΚΡ^-Ι или ^ΝΈΕ-ΙΙ с ΤΝΡ. Аналогично Ά-усеченные можно использовать для обнаружения присутствия ΤΝΡ в клетках различных типов.
Настоящим изобретением также предусмотрено использование продуктов усеченных кЯТИ для получения антител и применение данных антител (в частности, тех, которые связывают нативный кЮТКЯ или 5ΪΝΡΚ-ΙΙ). Можно получить антитела, которые связывают усеченные например, антитела к эпитопам аминокислотной последовательности К[Сук19-Сук103]-К2 или к эпитопам аминокислотной последовательности К4-[Сук32-Сук115]-Я5. Квалифицированный специалист может применить хорошо известные опубликованные методы для получения моноклональных и поликлональных антител или рекомбинантных антител, которые специфически распознают и связывают различные белки, кодируемые аминокислотными последовательностями, заявленными в настоящем изобретении. Подобные антитела можно использовать для очистки и характеристики полноразмерного, зрелого 30 кД ингибитора ΤΝΡ и полноразмерного, зрелого 40 кД ингибитора ΤΝΡ.
Настоящее изобретение относится также к способам лечения конкретных заболеваний и клинических состояний (многие из которых могут быть охарактеризованы как воспалительные заболевания), которые опосредованы ΤΝΡ. За болевание или клиническое состояние считается ΤΝΕ-обусловленным заболеванием, если спонтанное или экспериментальное заболевание ассоциировано с повышенным содержанием ΤΝΕ в жидкостях тела или в тканях, прилегающих к фокусу заболевания. ΤΝΕ-обусловленные заболевания можно также распознать по следующим двум условиям: (1) патологические проявления, ассоциированные с заболеванием, могут быть воспроизведены экспериментально на животных введением ΤΝΕ и (2) патология, индуцируемая на животных моделях заболевания может быть подавлена или отменена лечением агентами, которые ингибируют действие ΤΝΕ. Многие из ΤΝΕ-обусловленных заболеваний удовлетворяют двум из трех приведенных условий, а другие удовлетворяют всем трем условиям. В неполный список ΤΝΕ-обусловленных заболеваний, а также связанных с ними проявлений и симптомов, которые можно лечить согласно способам, заявленным в настоящем изобретении, входят синдром респираторного дистресса у взрослых; кахексия/анорексия; рак (например, лейкозы); синдром хронической усталости; реакция трансплантат против хозяина; гиперальгезия; воспалительное заболевание кишечника; нейровоспалительные заболевания; ишемические/реперфузионные повреждения, включая церебральную ишемию (повреждение мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта, причем каждый из этих факторов может приводить к нейродегенерации); диабет (например, ювенильный сахарный диабет типа 1); рассеянный склероз; заболевания глаз; боль; панкреатит; фиброз легких; ревматические заболевания (например, ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный (ревматоидный) артрит, серонегативный полиартрит, анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера и реактивный артрит, псориатический артрит, энтеропатический артрит, полимиозит, дерматомиозит, склеродерма, системный склероз, васкулит, церебральный васкулит, синдром Шегрена, ревматическая лихорадка, полихондрит и ревматическая полимиалгия и полиартериит гигантских клеток); септический шок; побочные эффекты радиотерапии; системная красная волчанка; временное заболевание мандибулярного сустава; тироидит и пересадка тканей.
Каждый продукт усеченных κΤΝΕΒ может вводиться больным в терапевтически эффективных количествах для лечения ΤΝΕобусловленных заболеваний, как определено выше, включая такие острые и хронические воспаления, как ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококкиндуцированный (септический) артрит). Термин больной наряду с человеком охватывает и животных (например, кошек, собак и лошадей).
Продукт усеченного κΤΝΕΒ можно применять путем местного, энтерального или парентерального введения, включая, без ограничений, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутриоболочечное, внутрикапсулярное, внутриорбитальное, внутрисердечное, внутрикожное, интраперитонеальное, транстрахеальное, подкожное, подоболочечное, внутрисуставное, субкапсулярное, субарахноидальное, внутриспинальное, внутрижелудочковое и внутригрудинное введение или вливание. Продукт усеченного κΤΝΕΒ можно также вводить орально или через слизистую оболочку, например, внутриназально, подъязычно, защечно или ректально для системной доставки.
Предпочтительно вводить продукты усеченного κΤΝΕΒ внутрисуставной, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекцией. Кроме того, продукт усеченного κΤΝΕΒ можно вводить способом постоянного вливания (например, при помощи имплантированных или наружных устройств, обеспечивающих постоянную или прерывистую подачу препарата) с тем, чтобы постоянно обеспечивать нужный уровень продукта усеченного κΤΝΕΒ в крови во время введения. Это достижимо, например, при использовании различных мини-насосов, таких как осмотический мини-насос. При таком способе введения можно быть уверенным, что количество препарата поддерживается на нужном уровне, можно брать пробы крови и контролировать количество препарата в кровотоке. Различные насосы коммерчески доступны от таких поставщиков, как М1шМеб 1пс., 8у1шаг, СА (например, МТ507) и А1ха Согр., Ра1о Айо, СА (например, осмотический насос Айе!, модель 2МЫ).
Считается также, что могут быть применены и другие способы постоянной или почти постоянной доставки. Например, химическая дериватизация может приводить к созданию форм поддерживаемого высвобождения белка, что сказывается на постоянном присутствии препарата в кровотоке в предсказуемых количествах, причем такое предсказание основывается на схеме дозировки.
Способы применения продуктов усеченного κΤΝΕΒ для лечения ΤΝΕ-обусловленных заболеваний, включая воспалительные заболевания суставов (например, остеоартрит, псориатический артрит и ревматоидный артрит), описаны в заявке на европейский патент 567566, упоминаемой в настоящем описании в качестве ссылки. Согласно одному из конкретных вариантов осуществления изобретения, продукты усеченного κΤΝΕΒ можно вводить внутрисуставно для лечения ревматоидного артрита и остеоартрита. Согласно другому конкретному примеру осуществления изобретения продукты усеченного κΤΝΕΒ можно вводить подкожно или внутримышечно для лечения ревматоидного артрита, воспалительного заболевания ки шечника, кахексии/анорексии или рассеянного склероза. Согласно еще одному конкретному примеру осуществления изобретения продукты усеченного δΤΝΓΚ. можно вводить внутривенно для лечения повреждений мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта или вводить внутрижелудочково для лечения повреждений мозга в результате травмы. Предпочтительный способ лечения артрита включает: (1) единичную внутрисуставную инъекцию продукта усеченного δΤΝΕΚ, осуществляемую периодически для предотвращения или лечения приступа артрита, и (2) периодические подкожные инъекции продукта усеченного δΤΝΓΚ.. Лечение септического шока должно начинаться как можно скорее после септицемии или диагностирования возможности септицемии. Например, лечение может начинаться немедленно после хирургической операции или несчастного случая, или же в случае любого события, сопряженного с риском септического шока. Предпочтительные способы лечения синдрома респираторного дистресса у взрослых предусматривают: (1) единичное или многократное интратрахеальное введение продукта усеченного δΤΝΓΚ. и (2) болюсные или постоянные внутривенные вливания продукта усеченного δΤΝΓΚ..
Еще один аспект изобретения относится к клеточной терапии, т.е. имплантации клеток, продуцирующих усеченный δΤΝΓΚ.. Данный вариант осуществления изобретения предусматривает имплантацию больным клеток, способных синтезировать и секретировать биологически активную форму усеченного δΤΝΓΚ.. Такими клетками могут быть клетки, которые в норме не продуцируют усеченный δΤΝΓΚ., но были модифицированы для продукции усеченного δΤΝΡΚ, или же клетки, чья способность продуцировать усеченный δΤΝΓΚ. была улучшена путем трансформации полинуклеотидом, пригодным для экспрессии и секреции усеченного δΤΝΡΚ
Для минимизации возможной иммунологической реакции больного на введение усеченного δΤΝΓΚ. другого вида предпочтительно, чтобы исходные клетки имели человеческое происхождение, или чтобы клетки были инкапсулированы в материал, обеспечивающий защиту от иммунного распознавания, или же чтобы клетки были помещены в иммунологически привилегированные участки, такие как тестикулы, глаз или центральная нервная система.
Больному могут быть имплантированы клетки человека или животных в биосовместимых полупроницаемых полимерных капсулах или мембранах, допускающих высвобождение усеченного δΤΝΡΚ, но предотвращающих разрушение клеток иммунной системой больного или действие других неблагоприятных факторов со стороны окружающих тканей. Альтернативно, собственные клетки больного могут быть трансформированы ех у|уо для продукции усе ченных 5ΤΝΕΚ.5 и затем имплантированы больному без инкапсуляции. Способы мембранной инкапсуляции живых клеток известны квалифицированным специалистам и потому получение инкапсулированных клеток и их имплантация больным вполне могут быть проведены.
В качестве одного из вариантов осуществления изобретения рассматривается генотерапия 1п у|уо, когда нуклеотидная последовательность, кодирующая усеченный δΤΝΕΚ, вводится прямо пациенту. Например, кодирующая усеченный δΤΝΓΚ. нуклеотидная последовательность может быть введена в клетки-мишени путем локальной инъекции нуклеотидного конструкта с соответствующим вектором доставки или без него. Например, кодирующая усеченный δΤΝΓΚ. нуклеотидная последовательность может быть встроена в вектор на основе адено-ассоциированного вируса. К альтернативным вирусным векторам относятся (без ограничения перечисленными) векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, вируса простого герпеса и вируса папилломы. Физический перенос как ш у|уо, так и ех у!уо также приемлем и может быть осуществлен липосомным переносом, прямой инъекцией (голой ДНК), рецептор-опосредованным переносом (комплекс лиганд-ДНК) или бомбардировкой микрочастицами (генное ружье).
Примеры способов клеточной и генной терапии описаны в патенте США № 4,892,538, патенте США № 5,011,472; патенте США № 5,106,627; ΌΕ 4219626, АО 94/20517 и 96/22793, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок.
Независимо от способа введения, для лечения ΤΝΕ-обусловленных заболеваний требуются дозы или схемы дозировок усеченного δΤΝΡΚ, эффективные для уменьшения или устранения симптомов заболевания. К другим факторам, от которых зависит соответствующая дозировка, относятся вид заболевания или клинического состояния, которое нужно вылечить или предотвратить, острота заболевания, способ введения, возраст, пол и клиническое состояние больного. Последующие вычисления, необходимые для уточнения соответствующей дозировки, могут быть легко выполнены квалифицированным специалистом, особенно с учетом специальной информации, приведенной в настоящем описании. Дозировку можно также определить с применением известных дозировочных тестов, используемых в сочетании с соответствующими данными доза-ответ.
Частота введений зависит от фармакокинетических параметров усеченных δΤΝΓΚ. в используемых фармакологических формах. Усеченные δΤΝΓΚ. можно вводить однократно или в случае острых и продолжительных расстройств вводить ежедневно меньшими дозами, или вводить в виде исходной болюсной дозы, за которой следуют постоянная доза или поддерживаемое высвобождение. При парентеральном вве дении единичная парентеральная доза, например, может достигать 10 мг, обычно до 15 мг и более предпочтительно до 20 мг. При введении в полость сустава фармацевтическую композицию предпочтительно назначают в виде единичной инъекции, например, объемом от 3 до 10 мл или от 5 до 10 мг/мл усеченного δΤΝΕΚ, растворенного в изотоническом фосфатном буферном растворе. Препарат можно вводить в полость сустава с частотой, например, один раз в 7-10 дней. При такой схеме введение производят постоянно, например, 4-5 раз, при необходимости изменяя дозу.
В некоторых случаях введение продуктов усеченного δΤΝΕΚ может являться частью сочетанной терапии совместно с другими фармацевтическими композициями, показанными для лечения данного заболевания. Продукт усеченного δΤΝΕΚ и одно или несколько традиционных или новых противовоспалительных лекарств можно назначать раздельно или в комбинации.
Продукты усеченного δΤΝΕΚ (например, белки К1-[Су819-Су§103]-К2) и любое одно или несколько дополнительных противовоспалительных лекарств можно назначать раздельно или в комбинации. Информацию о данных соединениях можно найти в руководстве Τίκ Мегк Мапиа1 о£ О|адпо515 апб Τйе^ару. 81х1ееп1й ЕбШоп, Мегск, 8Нагр & ЭоНше Кезеагсй ЬаЬога1опе5, Мегск & Со., Кайгау, Ν1 (1992) и в РНагтарго)ес15, Р1В РиЬйсабопк Ыб.
Существующее лечение ΤΝΕ-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острые и хронические ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококк-индуцированный (септический) артрит), предусматривает прежде всего применение ряда препаратов для контроля боли и воспаления, классифицируемых как нестероидные противовоспалительные препараты (ΝδΑΙΌδ). Второй эшелон препаратов включает кортикостероиды, медленно действующие притиворевматические препараты (δΑΑΡΌδ) или препараты, модифицирующие заболевание (МИ).
В соответствии с конкретным вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΕΚ (например, белка К1-[Су819-Су§103]-К2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими ΝδΑΙΌδ для лечения ΤΝΕ-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острые и хронические ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококкиндуцированный (септический) артрит) и заболевание трансплантат против хозяина. ΝδΑΙΌδ проявляют свое противовоспалительное действие, по меньшей мере отчасти, подавляя синтез простагландинов (Сообтап апб Обтай т Τίκ Р11агтасо1од1са1 Ваы5 о£ Τйе^аиреиί^с, МсМШап, 7111 ЕбИгоп (1985)). ΝδΑΙΌδ могут быть подразделены на девять групп: (1) производные салициловой кислоты; (2) производные пропионовой кислоты; (3) производные уксусной кислоты; (4) производные фенаминовой кислоты; (5) производные карбоновой кислоты; (6) производные масляной кислоты; (7) оксикамы; (8) пиразолы и (9) пиразолоны.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΕΚ (например, белка К1-[Су819-Су§103]-К2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими производными салициловой кислоты, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К производным салициловой кислоты, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся: ацетаминосалол, алоксиприн, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, ацетилсалицилат кальция, холин магний трисалицилат, дифлузинал, этерсалат, фендосал, гентизиновая кислота, гликолсалицилат, идмидазолсалицилат, лизин ацетилсалицилат, мезаламин, морфолин салицилат, 1-нафтил салицилат, олсалазин, парсалмид, фенил ацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламид Оуксусной кислоты, салсалат и сульфасалазин. Структурно родственные производные салициловой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΕΚ (например, белка К1-[Су819-Су§103]-К2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими производными пропионовой кислоты, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К производным пропионовой кислоты, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся: алминопрофен, беноксапрофен, буклоксиковая кислота, карпрофен, дексиндопрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флурбипрофен, фурклопрофен, ибупрофен, ибупроксам, индопрофен, изопрофен, кетопрофен, локсопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопрофен, пимепрофен, пирпрофен, пранопрофен, протизиновая кислота, пиридоксипрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота и тиоксапрофен. Структурно родственные производные пропионовой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΕΚ (например, белка Κ1-|ί\δ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими производными уксусной кислоты, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К производным уксусной кислоты, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся: ацетамицин, алклофенак, амфенак, буфексамак, цинметацин, клопирак, дельметацин, диклофенак натрия, этодолак, фелбинак, фенклофенак, фенклорак, фенклозиновая кислота, фентиазак, фурофенак, глюкаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксипак, лоназолак, метиазиновая кислота, оксаметацин, окспинак, пиметацин, проглюметацин, сулиндак, талметацин, тиарамид, тиопинак, толметин, зидометацин и зомепирак. Структурно родственные производные уксусной кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ1-|ί\δ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими производными фенаминовой кислоты, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К производным фенаминовой кислоты, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся энфенаминовая кислота, этофенамат, флуфенаминовая кислота, изониксин, меклофенаминовая кислота, меклофенамат натрия, медофенаминовая кислота, мефанаминовая кислота, нифлуминовая кислота, талнифлумат, терофенамат, толфенаминовая кислота и уфенамат. Структурно родственные производные фенаминовой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно другому варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ1-|ί\δ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими производными карбоновой кислоты, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К производным карбоновой кислоты, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся: клиданак, дифлунизал, флуфенизал, иноридин, кеторолак и тиноридин. Структурно родственные производные карбоновой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ1-|ί\δ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обра ботка) с одним или несколькими производными масляной кислоты, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К производным масляной кислоты, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся бумадизон, бутибуфен, фенбуфен и ксенбуцин. Структурно родственные производные масляной кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно другому варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ1-|ί\δ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими оксикамами, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К оксикамам, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся дроксикам, эноликам, изоксикам, пироксикам, судоксикам, теноксикам и 4гидроксил-1,2-бензотиазин 1,1-диоксид 4-(Νфенил)-карбоксамид. Структурно родственные оксикамы, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ-Κνδ19-ί.’νδ1ο3|-Κ; в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими пиразолами, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К пиразолам, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся: дифенамизол и эпиризол. Структурно родственные пиразолы, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ-Ννδ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими пиразолонами, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. К пиразолонам, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся апазон, азапропазон, бензпиперилон, фепразон, мофебутазон, торазон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропилфеназон, рамифеназон, суксибузон и тиазолинобутазон. Структурно родственные пиразолоны, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного δΤΝΡΚ (например, белка Κ-Ννδ19-ί.’νδ1ο3|-Κ;) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурент55 ная обработка) с одним или несколькими следующими К/.АЮк: ε-ацетамидокапроиловая кислота, 8-аденозинметионин, 3-амино-4 гидроксибутириловая кислота, амиксетрин, анитразафен, антрафенин, бендазак, бендазак лизинат, бензидамин, бепрозин, броперамол, буколом, буфезолак, ципроквазон, клоксимат, дазидамин, дебоксамет, детомидин, дифенпайрамид, дифенпирамид, дифисаламин, дитазол, эморфазон, фанетилизол месилат, фенфлумизол, флоктафенин, флумизол, флуниксин, флупроквазон, фопиртолин, фосфозал, кваймезал, квайзолен, изониксирн, лефетамин НС1, лефлуномид, лофемизол, лотифазол, лизин клониксинат, мезеклазон, набуметон, никтиндол, нимесулид, орготеин, опраноксин, оксацепролм, оксападол, паранилин, перизоксаль, перизоксаль цитрат, пифоксим, пипроксен, пиразолак, пирфенидон, проквазон, проксазол, тиелавин В, тифламизол, тимегадин, толектин, толпадол, триптамид и такие препараты, имеющие кодовые обозначения компаний, как 4801568, АА861, ΆΌ1590,
АЕР802, АЕР860, ΑΙ77Β, АР504, АИ8001, ВРРС, В\540С, СНГМ0ГН 127, СМ00, ЕВ382, ЕЬ508, Е1044, ЕК-506, 6У3658, ΠΈ182, КСкТЕК090, КМЕ4, ЬА2851, МВ714, МВ897, ΜΥ309,
0^3144, РВ823, РУ102, РУ108, В830, В82131, 8СВ152, 8Н440, 8ΙΒ133, 8РА8510, 8Р27239, 8Т281, 8Υ6001, ТА60, ТАЕ901, 4-бензоил-1инданкарбоксиловая кислота, ТУХ2707,
И60257, ИВ2301 и Υ41770. Структурно родственные ЖАЮк, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кТ№К. (например, белка В1-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими кортикостероидами, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения Т№-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острые и хронические ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококк-индуцированный (септический) артрит) и рассеянный склероз. К кортикостероидам, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся гидрокортизон и такие соединения, полученные из гидрокортизона, как 21-ацетопрегненолон, алкломеразон, альгестон, амцинонид, беклометазон, бетаметазон, бетаметазон валерат, буденизонид, хлорпреднизолон, клобетазол, клобетазол пропионат, клобетазон, клобетазон бутират, клокортоколон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакон, дезонид, дезоксимеразон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флуметазон пивалат, флунизолид, флуцинолон ацетонид, флуоцинонид, флуороцинолон ацетонид, флуорокортин бутил, флуорокортолон, флуорокортолон гексаноат, дифлукортолон валерат, флуорометолон, флуперолон ацетат, флупредниден ацетат, флупреднизолон, флуранденолид, формокортал, гальцинонид, галометазон, галопредон ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, гидрокортизон ацетат, гидрокортизон бутират, гидрокортизон фосфат, гидрокортизон 21-натрий сукцинат, гидрокортизон тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпредниколон, мометазон фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолон 21-диэдриаминоацетат, преднизолон натрий фосфат, преднизолон натрий сукцинат, преднизолон натрий 21-тсульфобензоат, преднизолон натрий 21стеарогликолат, преднизолон тебутат, преднизолон 21-триметилацетат, преднизон, преднивал, преднилиден, преднилиден 21диэтиламиноацетат, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолон ацетонид, триамцинолон бенетонид и триамцинолон гексацетонид. Структурно родственные кортикостероиды, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кТХЕР (например, белка В1-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими медленно действующими противоревматическими препаратами (8ААКЭк) или противоревматическими препаратами, модифицирующими заболевание (ОМАКЭк), эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения Т№-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острые и хронические ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококкиндуцированный (септический) артрит) и рассеянный склероз. К 8ААКЭк или ОМАКЭк, эфирам предлекарств и их фармацевтически приемлемым солям относятся: аллокупреид натрия, ауранофин, ауротиоглюкоза, ауротиоглюканид, азатиоприн, бреквинар натрия, буцилламин, кальций 3-ауротио-2-пропанол-1-сульфонат, хлорамбуцил, хлороквин, клобузарит, купроксолин, циклофосфамид, циклоспорин, дапзон, 15-дезоксиспергуалин, диацереин, глюкозамин, соли золота (например, золотая соль циклоквина, золотая соль тиомалата, золотая соль тиосульфата), гидроксихлороквин, гидроксимочевина, кебузон, левамизол, лобензарит, меллитин, 6-меркаптопурин, метотрексат, мизорибин, микофенолат мофетил, майорал, горчичный азот, Ό-пенницилламин, такие имидазолы пиридинола, как 8КХЕ86002 и 8В203580, рапа мицин, тиолы, тимопоэтин и винкрестин. Структурно родственные 8ААВЭк или ОМАВЭк, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кЮТК (например, белка В1-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими ингибиторами СОХ2, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения ΤΝΡ-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острое и хроническое воспаление. Примером ингибиторов СОХ2, эфиров предлекарств или их фармацевтически приемлемых солей служит, например, целекоксиб. Структурно родственные ингибиторы СОХ2, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кΤNΡВ (например, белка В1-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими антимикробными препаратами, эфирами предлекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения ΤΝΡ-обусловленных заболеваний, как опеределено выше, включая острое и хроническое воспаление. К антимикробным препаратам относятся, например, ампициллин, амоксициллин, ауреомицин, бацитрацин, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим, цефахлор, цефалексин, цефрадин, ципрофлоксацин, клавулановая кислота, клоксациллин, диклоксациллан, эритромицин, флуклоксациллан, гентамицин, грамицидин, темилциллан, неомицин, оксациллан, пенициллин и ванкомицин. Структурно родственные антимикробные препараты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также включены в эту группу.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кΤNΡВ (например, белка В1-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими следующими препаратами для лечения ΤΝΡобусловленных заболеваний, как определено выше, включая острое и хроническое воспаление: талидомид; ВЫ 50730; тенидап; Е 5531; тиапафант РСА 4248; нимесулид; панавир; ролипрам; РВ 73401; пептид Т; МЭЬ 201; 449А; (1В,38)-С1к-1-[9-(2,6-диаминопуринил)]-3гидрокси-4-циклопентен гидрохлорид; (1В,3В)транс-1-(9-аденил)-3-азидоциклопентан гидрохлорид и (1В,3В)-транс-1-(6-гидроксипурин-9ил)-3-азидоциклопентан.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кЕИЕВ (например, белка В!-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими дополнительными ингибиторами ΤΝΡ для лечения ΤΝΡ-обусловленных заболеваний, как опеределено выше, включая острое и хроническое воспаление. Ингибиторами ΤΝΡ считаются соединения и белки, которые блокируют синтез ΤΝΡ 1п у|уо и высвобождение ΤΝΡ из клетки.
К дополнительным ингибиторам ΤΝΡ относятся анти-ΤΝΡ антитела, например, МАК 195Ρ ΡаЬ антитела (Но11ег е! а1., (1993), 1к! йИегпайопа1 8утрокшт оп Су!окшек ш Вопе Магготе Τ^апкр1апίа!^оп, 147; СОР 571 анти-ΤΝΡ моноклональные антитела (Вапкш е! а1., (1995), Вгй1к11 1оигпа1 оГ ВРеита!о1оду, 34:334-342; работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок); мышиные анти-ΤΝΡ моноклональные антитела ВАΥ X 1351 (Клей е! а1., (1995), 7111 Еигореап Сопдгекк оГ С11шса1 М1сгоЫо1о§у апй ИчГесйоик П1кеакек, 9; работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки); СеηΤNΡ сА2 анти-ΤΝΡ моноклональные антитела (ЕШой е! а1., (1994), Ьапсе!, 344:1125-1127 и ЕШой е! а1., (1994), Ьапсе!, 344:1105-1110; работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок).
В соответствии с определенным вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного ^ΧΡΕ (например, белка В1-[Сук19-Сук103]-В2 в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с растворимым рекомбинантным Ρак антигеном человека или его рекомбинантными вариантами (АО 96/20206 и Мопп1х е! а1., Ыттипо1оду, 155:4829-4837; ЕР 510 681; публикации упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок). В заявке АО 96/20206 описан секретируемый Ρак антиген человека (природный и рекомбинантный, включая ^-слитый белок), способы выделения генов, ответственных за кодирование растворимого рекомбинантного Ρак антигена человека, методы клонирования гена в приемлемых векторах и типах клеток, а также способы экспрессии гена для получения ингибиторов. В заявке ЕР 510691 описаны ДНК, кодирующие Ρак антиген человека, включая растворимый Ρак антиген, векторы для экспрессии указанных ДНК, и клетки-трансформанты, трансфицированные вектором. При парентеральном введении дозы слитого белка Ρак антигена колеблются в пределах от 1 до 100 мкг/кг.
В соответствии с определенным вариантом осуществления изобретения предложен способ применения продукта усеченного кΤNΡВ (например, белка В!-[Сук19-Сук103]-В2) в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими ингибиторами интерлейкина-1 для лечения ΤΝΡ обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острые и хронические ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококк-индуцированный (септический) артрит); повреждений мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта, а также рассеянного склероза. К ингибиторам интерлейкина-1 относятся антагонисты рецептора интерлейкина-1 (любые соединение, способные специфически предотвращать активацию клеточных рецепторов ГС-1), такие как Ш1га, как описано ниже; анти-Ш-Ерецептор антитела (например, ЕР 623674, упоминаемая в настоящем описании в качестве ссылки); БС-1связывающие белки, такие как растворимые Ш1-рецепторы (например, патент США 5,492,88, патент США 5,488,032, патент США 5,464,937, патент США 5,319,071 и патент США 5,180,812, упоминаемые в настоящем описании в качестве ссылок); анти-ШЛ моноклональные антитела (например, \Ο 9501997, \Ο 9402627, \Ο 9006371, патент США 4935343, ЕР 364778, ЕР 267611 и ЕР 220063, упоминаемые в настоящем описании в качестве ссылок); вспомогательные белки К-1-рецептора. например, \О 96/23067 (упоминаемая в настоящем описании в качестве ссылки) и другие соединения и белки, которые блокируют синтез ш у|уо или внеклеточное высвобождение Ш-1.
Антагонист рецептора интерлейкина-1 (Ш1га) - это белок человека, который действует как природный ингибитор Ш-1. Предпочтительные антагонисты рецептора, а также способы их получения и способы их применения описаны в патенте США № 5,075,222 (обозначаемом, как патент 222); \О 91/08285; \О 91/17184; Аи 9173636; \О 92/16221; \О 93/21946; опубликованной международной заявке № и8 97/02131, в которой также описана фармацевтическая композиция, содержащая (а) эффективное количество полимера для контролируемого высвобождения (например, гиалуроновой кислоты) и (б) эффективное количество ΙΌ-1га; \О 94/06457; \О 94/21275; ΡΚ 2706772; \О 94/21235; ΌΕ 4219626, \О 94/20517 и \О 96/22793, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок. К данным белкам относятся как гликозилированные, так и негликозилированные антагонисты рецептора Ш-1.
Конкретно, три предпочтительные формы Ыга (Ш-1гаа Ю-1 τηβ и Ι0-1 гах). полученные на основе одной кодирующей последовательности ДНК, заявлены и описаны в патенте США № 5,075,222, Иашит е! а1., озаглавленном Ингибиторы интерлейкина-1. Данный патент США, обозначаемый как патент 222, специально включен в настоящее описание в качестве ссылки. Все три указанных ингибитора интерлейкина-1 обладают сходными функциональными и иммунологическими активностями.
Способы получения ингибиторов интерлейкина1, в частности ЕЛгах. также описаны в патенте 222. Одним из способов предусмотрено выделение ингибиторов из моноцитов человека (где они в норме продуцируются). Второй из описанных способов предусматривает выделение гена, ответственного за кодирование ΙΌ-1 газ, клонирование гена в удобных векторах и типах клеток, экспрессию гена для получения ШЛгаз и выделение Ш-1 газ. Последний способ, который является частным случаем применения методов рекомбинантных ДНК в целом, наиболее предпочтителен для осуществления настоящего изобретения. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения Ю-1 га содержит Νконцевую метионильную группу в результате экспрессии в Е.сой. В объем настоящего изобретения также входят модифицированные Ш1газ. К модифицированным Ю-1 газ относятся, например, мутеины таких ингибиторов, в которых остатки цистеина заменены другой аминокислотой в одном или нескольких сайтах в аминокислотной последовательности природного ингибитора. Можно обеспечить сайтспецифическую реакцию таких мутеинов с функционализированными единицами полиэтиленгликоля (РЕС) или с другими сульфгидрилсодержащими полиэфирами для получения форм ШЛга-РЕС. В опубликованной заявке \О 92/16221 описан ряд модифицированных форм ЕЛта и способы получения таких РЕСмодифицированных ингибиторов.
К дополнительному классу ингибиторов интерлейкина-1 относятся соединения, способные специфически предотвращать активацию клеточных рецепторов Ш-1. К таким соединениям относятся Ш-1-связывающие белки, такие как растворимые рецепторы и моноклональные антитела. К указанным соединениям также относятся моноклональные антитела к рецепторам.
К другому классу ингибиторов интерлейкина-1 относятся соединения и белки, которые блокируют ш у|уо синтез и/или внеклеточное высвобождение Ш-1. К таким соединениям относятся агенты, которые влияют на транскрипцию генов ЕС-1 или процессинг ΙΕ-1 препротеинов.
Выше приведены примеры, не исключающие других вариантов лечения, которые могут быть применены конкурентно с данными противовоспалительными соединениями, известными квалифицированному специалисту, или могут быть разработаны квалифицированным специалистом с учетом рекомендаций, приведенных в настоящем описании.
Особенно предпочтительно получать композиции дополнительных противовоспалительных соединений в форме единичной дозировки для облегчения введения и постоянства дозировки. Под термином форма единичной дозировки понимаются физически дискретные еди ницы, причем каждая единица содержит предопределенное количество дополнительного противовоспалительного соединения, вычисленное для получения желаемого терапевтического эффекта, в комплексе с необходимым фармацевтическим носителем. Под термином фармацевтически приемлемый носитель понимаются все и любые растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты, обеспечивающие изотоничность, агенты, замедляющие всасывание, и подобные им вещества, которые совместимы с активным ингредиентом, способом введения и другими ингредиентами, а также не являются вредными для реципиента.
Применение таких сред и агентов хорошо известно из уровня техники (см., например, РеттдЮп'к Рбагтасеи!1са1 8аепсек, 18'1' Еб. (1990) Маск РиЬНкЫпд Со., Еак!оп, РА 18042, рр.1435-1712; руководство упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). В композиции могут вводиться дополнительные активные ингредиенты.
Для орального терапевтического применения дополнительное противовоспалительное соединение может быть смешано с наполнителями и применяться в форме перевариваемых таблеток, защечных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и т. д. или же может вводиться непосредственно в пищу. Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и им подобные лекарственные формы могут также содержать такие связующие вещества, как смола трагаканта, гуммиарабик, крахмал или желатина; такие наполнители, как дикальций фосфат; такие дезинтегрирующие агенты, как крахмал, альгиновую кислоту и им подобные; такие любриканты, как стеарат магния; такие осладители, как сахароза, лактоза или сахарин; такие ароматизаторы, как мята, масло грушанки, вишневые или апельсиновые отдушки. Когда формой единичной дозы является капсула, она может содержать в дополнение к перечисленным выше агентам еще и жидкий носитель. Могут присутствовать и другие материалы, которые в виде покрытия или как-либо еще модифицируют физическую форму единичной дозы. Например, таблетки, пилюли или капсулы можно покрывать шеллаком, сахаром или обоими этими веществами. Конечно, любой материал, используемый для получения единичной дозировочной формы, должен быть фармацевтически чистым и, по существу, нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, дополнительное противовоспалительное соединение может быть введено в препарат или композицию для поддерживаемого высвобождения. Количество дополнительного противовоспалительного соединения в таких терапевтически полезных композициях таково, что достигается нужная дозировка.
Для парентерального терапевтического применения каждое дополнительное противовоспалительное соединение может быть введено в стерильный раствор для инъекций. Стерильные инъекционные растворы можно получить введением дополнительного противовоспалительного соединения в требуемом количестве в соответствующий фармацевтически приемлемый носитель с различными другими ингредиентами, перечисленными далее (при необходимости), и после этого простерилизовать фильтрованием. Дисперсии могут быть получены введением дополнительного противовоспалительного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. При необходимости приготовления стерильных инъекционных растворов они могут быть получены введением порошка дополнительного противовоспалительного соединения и дополнительно любого другого желательного ингредиента в предварительно простерилизованный фильтрованием раствор при том, что порошок приготовлен любым удобным способом (например, высушиванием в вакууме или лиофилизацией).
Конкретную дозу дополнительного противовоспалительного препарата вычисляют, исходя из приблизительного веса тела или поверхности тела больного. Среди факторов, определяющих соответствующую дозировку, могут быть конкретная нозологическая форма, которую нужно излечить или предотвратить, острота заболевания, способ введения, а также возраст, пол и клиническое состояние больного. Последующие уточняющие вычисления, необходимые для определения соответствующей дозировки, рутинно проводятся квалифицированными специалистами. Дозировка может также определяться на основе известных дозировочных тестов в сочетании с соответствующими данными доза - ответ.
Так, например, в объем настоящего изобретения входят дозировки дополнительных противовоспалительных соединений лечения конкретных острых и хронических воспалительных заболеваний, таких как ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококк-индуцированный (септический) артрит), которые могут варьировать для достижения желаемого терапевтического эффекта. Если одно из дополнительных противовоспалительных соединений обладает побочными действиями, оно может назначаться пациентам на время перемежающихся периодов сочетанной терапии. Например, хроническое лечение метотрексатом ассоциировано с токсичностью в отношении желудочно-кишечного тракта, печени, костного мозга и легких (8аηбονа1 е! а1., (1995), ВпЕкб 1оита1 оГ Кбеита!о1оду, 34:49-54;
работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки).
Способы контроля над течением заболевания могут включать специфические тесты, направленные, например, на определение системного ответа на воспаление, к которым относятся скорость оседания эритроцитов (Е8К) и наличие реактантов острой фазы (АРК). Отмечают также наличие или отсутствие отеков в задействованных участках тела. Отмечают также повышение подвижности суставов и снижение боли у пациента. Если состояние больного стабильно, ему еженедельно назначают ту же самую дозировку и оценивают его состояние еженедельно. С учетом того, что состояние больного стабильно, лечение может быть продолжено. После шести месяцев лечения определяют наличие анатомических изменений скелета при помощи радиологических методов, например, рентгенографии.
По окончании каждого периода состояние больного оценивают заново. Сравнение радиологических показателей, Е8К и АРК до и после лечения свидетельствует об эффективности лечения. В зависимости от эффективности лечения и от состояния больного дозировка может быть повышена или оставлена прежней на все время лечения.
Предпочтительно настоящее изобретение относится к способу применения одной из следующих комбинаций для лечения или предотвращения острого или хронического воспалительного заболевания, как определено выше, такого как ревматические заболевания (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококкиндуцированный (септический) артрит), продукт усеченного кТ№К (например, белок К1[Сук19-Сук103]-К2) и метотрексат; продукт усеченного кЮТК (например, белок К1-[Сук19Сук103]-К2), метотрексат и ингибитор 1Ь-1, предпочтительно 1Ь-1га; продукт усеченного кЮТК (например, белок К1-[Сук19-Сук103]-К2) и один или несколько следующих компонентов: метотрексат, иммуносупрессор (например, циклоспорин), ципрофлоксацин, антиген Еак и ингибитор ΙΙ-1, предпочтительно 11-1га; продукт усеченного кЮТК (например, белок К1-[Сук19-Сук103]-К2), метотрексат и иммуносупрессор (например, циклоспорин); продукт усеченного кТ№К (например, белок К1-[Сук19-Сук103]-К2), метотрексат и ципрофлоксацин; продукт усеченного кЮТК (например, белок К1-[Сук19-Сук103]-К2) метотрексат и ингибитор Ι1-1, предпочтительно 11-1га; продукт усеченного кТ№К (например, белок К1-[Сук19Сук103]-К2) и один или несколько следующих компонентов: метотрексат, сульфасазин и гидроксихлороквин; продукт усеченного кЮТК (например, белок К1-[Сук19-Сук103]-К2), метотрексат и гидроксихлороквин; продукт усеченного кЮТК (например, белок К1-[Сук19Сук103]-К2), метотрексат сульфасазин.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, внутрисуставное, подкожное или внутримышечное введение) продукта усеченного кЮТК (например, белка К1-[Сук19Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с метотрексатом и/или ингибитором Ι1-1 (например, 11-1га) и/или растворимым рекомбинантным антигеном Еак человека для лечения ревматических заболеваний, как определено выше (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококк-индуцированный (септический) артрит) и ассоциированных с ними симптомов.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, внутривенное или внутрижелудочковое введение) продукта усеченного кТ№К (например, белка К1-[Сук19-Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с тканевым активатором плазминогена и/или ингибитором Ι1-1 (например, 11-1га) для лечения повреждений мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта, причем каждый из этих факторов может приводить к нейродегенерации.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, подкожное или внутримышечное введение) продукта усеченного кТ№К (например, белка К1-[Сук19-Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с одним или несколькими кортикостероидами, циклоспорином, ЕК-506 или интерфероном (например, альфа интерферон, бета интерферон, гамма интерферон или консенсусный интерферон) и/или 11-1га для лечения рассеянного склероза.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, подкожное или внутримышечное введение) продукта усеченного кТ№К (например, белка К1-[Сук19-Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с С-С8Е и/или 11-1га для лечения воспалительного заболевания кишечника.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, подкожное или внутримышечное введение) продукта усеченного κΤΝΡΚ (например, белка К1-[Сук19-Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с лептином, Мапио1™ или Медасе™ для лечения кахексии/анорексии.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, подкожное, внутрижелудочковое или внутриоболочечное введение) продукта усеченного κΤΝΕΚ. (например, белка К1-[Сук19-Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с Ν8ΑΙΌ (например, индометацином) и/или ингибитором Ι1-1 (например, П-1га) для лечения болезни Альцгеймера.
Согласно другому конкретному варианту осуществления изобретения предложен способ применения (например, подкожное, внутрижелудочковое или внутриоболочечное введение) продукта усеченного κΤΝΕΚ. (например, белка К1-[Сук19-Сук103]-К2), введенного в состав для поддерживаемого высвобождения (например, в гиалуронан) дополнительно в сочетании (предобработка, постобработка или конкурентная обработка) с растворимым рекомбинантным Рак антигеном человека для лечения рака (например, лейкоза); диабета (например, ювенильного сахарного диабета типа 1); реакции трансплантат против хозяина; гепатита; ишемических реперфузионных повреждений, включая церебральную ишемию (повреждение мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта, причем каждый из этих факторов может приводить к нейродегенерации); нейровоспалительных заболеваний; ревматических заболеваний, как определено выше (например, болезнь Лайма, ювенильный (ревматоидный) артрит, остеоартрит, псориатический артрит, ревматоидный артрит и стафилококк-индуцированный (септический) артрит), а также при пересадке тканей.
Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут понятны при рассмотрении следующих иллюстративных примеров.
Примеры
Стандартные способы осуществления многих процедур, описанных в следующих примерах, или приемлемые альтернативные методики приведены в широко известных руководствах по молекулярной биологии, таких как, например, 8атЬгоок е! а1., (1989), кирга и АикиЬе1 е! а1., (1990), кирга. Для удобства читателя мл обозначает миллилитры, а л - литры.
Пример Ι.
В следующем примере описано получение различных форм усеченных рекомбинантных растворимых κΤΝΕΚ.
ΝΗ2-ΜΟ8ν0Ρ0ΚΥΙΗΡ0ΝΝ8ΐε-[0ν5'’ -Суз’°5]-РС-СООН «ΓΝΡΚ-Ι 2.6О/С105);
ΝΗΓΜΟ5νεΡ0ΚΥΙΗΡ0ΝΝ5Ι0-[0γ519 -Су5,м]-РЫС5Ь-СООН (δΤΝΡΚ-Ι 2.6П/С106);
ЫН2-МО5УСРуКУ1НР0М№1С-[Су51Э -Суз'^ЬРИ-СООН (ϊΤΝΓΚ-Ι 2.6Ο/Ν105);
ЫН2-МУ1НРОЫ№1С-[Су29 -Су5105]-РЫС8Е-СООН (δΤΝΡΚ-Ι 2.3ϋ/ά8);
МН2-М-[Су5 19 -Су5|05]-РЫС5Е-СООН (δΤΝΡΚ-Ι 2.3ϋ/ά18);
ΝΉ2-Μ5Ι5-[Суз19 -Су5,ю]-РКС8Е-СООН (δΤΝΡΚ-Ι 2.30/615).
Получение ДНК.
1. κΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С106.
Амплификацию ПЦР κΤΝΤΈ-Ι 2.6Б/С106 проводили с использованием в качестве матрицы клонированной кДНК, полученной из клона лямбда-др!107с!пГЬр (ЕР422339), и следующих ПЦР-праймеров:
5’ ОЫСО#1: (8ΕΟ Ю ΝΟ: 68) 5'-ООТТАОССАТАТООАСАССО'ГГТОСССССА-3' 3' ΟΕΙΟΟ#2: (8Εζ) Ю ΝΟ: 69) 5'-СССААОСТТТТАСАОАОАОСААТТОААОСАСТО-3 ’
ОЬЮО#1 и ОЬЮО#2 содержали сайты рестрикции NбеI и НшбШ и гибридизовались с 5' и 3' концами усеченного гена соответственно. Амплификацию ПЦР проводили в течение 25 циклов; каждый цикл состоял из 30 с при 94°С для денатурации, 15 с при 55°С для отжига и 1 мин при 72°С для элонгации [термосайклер модели 2400 (Регкш-Е1тег Се!ик, Ыогтеа1к, СТ)]. Продукт ПЦР очищали в геле с использованием набора для очистки продуктов ПЦР рТАцшск™ (^АСЕН Οι;·ιΙκ\\όγ11ε СА), согласно инструкциям производителя. Очищенный продукт ПЦР рестрицировали NбеI и НшбШ и затем очищали в геле с использованием набора для экстракции из геля ΩΙАцтек™ (ОΙАСЕЫ, Οι;·ιΙκ\\όγ11ε СА), согласно инструкциям производителя. Выделенный из геля продукт ПЦР лигировали в рАМС11 (АО 95/26746) и трансформировали ими клетки Е.сой ЕМ15 (АТСС 55765).
2. κΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С105.
Амплификацию ПЦР κΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С105 проводили с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК κΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С106 и следующих ПЦР-праймеров:
ОЕ1СО#3: (ЗЕО ГО ΝΟ: 70)
5’-АСТССА ООАТССОСООАТАААТААОТААСОАТССООТССА -3’ ОЫОО#4: (ЗЕО ГО ΝΟ: 71) ’ -САООТСОСАТССТАТСАОСАОААОСАСТСОААААС&ТТТТС-З'
ОЬЮО#3 и ОЫСО#4 содержали сайты рестрикции ВатШ и мутацию Ν(105) вслед за стоп-кодоном. Олигонуклеотиды были сконструированы таким образом, чтобы перекрывать всю матрицу, для создания нового сайта рестрикции ВатШ для лигирования. Амплификацию ПЦР проводили в течение 35 циклов; 10 циклов, каждый из которых состоял из 10 с при 92°С для денатурации, 30 с при 55°С для отжига и 4 мин при 68°С для элонгации, за которыми следовали 25 циклов, каждый из которых состоял из 10 с при 92°С для денатурации, 30 с при 55°С для отжига и 4 мин + 20 с для элонгации [термосайклер модели 2400 (Регкш-Е1тег ΟοΙιΐδ, №г\уа1к, СТ)]. Продукт ПЦР очищали в геле с использованием набора для экстракции из геля О1Ас.|шск'|Л| (О1АСЕ№ СНа^уоПН, СА) согласно инструкциям производителя, рестрицировали ВатН1, экстрагировали фенол/хлороформом и осаждали этанолом. Затем его ресуспендировали, лигировали в рАМО11 и трансформировали ими клетки Е.соН ЕМ15.
3. δΤΝΕΒ-Ι 2.6Ό/Ν105.
Амплификацию ПЦР δΤΝΕΒ-Ι 2.6Ό/Ν105 проводили с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК δΤΝΕΒ-Ι 2.6Э/С106 и следующих ПЦР-праймеров: 5’ ОЫОО#5: (5Е<Э ГО ΝΟ: 72)
5’-СхОТТАСССАТАТСОАСАСС&ТТТССССССАА-3’
5’ ОЫСО#6: (5Е<Э Ιϋ ΝΟ: 73) ’-СССССАТСССТАТТААТТОААССАСТСОААААСС-З ’
ОЬЮО#5 и ОЬЮО#6 содержали сайты рестрикции NбеI и ВатШ и гибридизовались с 5' и 3' концами усеченного гена соответственно. Амплификацию ПЦР проводили в течение 30 циклов; каждый цикл состоял из 45 с при 95°С для денатурации, 1 мин при 65°С для отжига и 2 мин при 72°С для элонгации [термосайклер модели 2400 (Регкт-Е1тег Се!и8, №г\уа1к, СТ)]. Продукты ПЦР очищали с использованием системы очистки ДНК А|/агб'|Л| (Рготеда, МабЕоп, ΑΙ), согласно инструкциям производителя. Очищенные продукты ПЦР рестрицировали NбеI и ВатШ, экстрагировали фенол/ хлороформом и осаждали этанолом. Затем их ресуспендировали, лигировали в рАМО11 и трансформировали ими клетки Е.соН ЕМ15.
Основываясь на приведенном описании настоящего изобретения, квалифицированный специалист поймет, что для удобной экспрессии в клетках-хозяевах (например, Е.соН и других бактериях) могут быть использованы или адаптированы различные материалы и методы.
4. δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б18: δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б8 и δΤΝΕΒ-Ι 2.3ϋ/ά15.
Амплификацию ПЦР δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б18; δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б8 и δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б15 проводили с использованием в качестве матрицы плазмидной ДНК δΤΝΕΒ-Ι 2.6Э/С 106 и следующих ПЦР праймеров.
ПЦР праймеры для δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б8:
5’ ОЫОО#7: (8Εζ) ГО ΝΟ: 74)
УССССАТАТОТАТАТССАСССТСААААТААТ-3 ’
5’ ОЫСО#8: (5Е<Э ГО ΝΟ: 75) ’-СССААССТПТАСАОАСАССААТТСААССАСТО-З ’
ПЦР праймеры для δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б15:
5’ О1ЮО#9: (5Е<Э ГО ΝΟ: 76) 5’-ССССАТАТОТСОА1ТАОСТСТАССААОТСССАСАААС&-3’ 5’ О1ЛОО#10: (5Е<2 ГО ΝΟ: 77) 5'-СССААОСТТТТАСАОА6СААТТОААОСАСТС-3'
ПЦР праймеры для δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б18: 5’ О1ЛОО#11: (8Е<Э Го ΝΟ: 78) 5’-ССССАТАТОТОТАССААОТСССАСАААСОА-3' 5’ ОЫОО#12: (8ЕО ГО ΝΟ: 79) 5’-СССААОСТТТТАСАОАОАОСААТТСААССАСТО-3'
Каждый из олигонуклеотидов ОЬЮО#7, ОЬЮО#9 и ОЬЮО#11 содержал сайт рестрикции Цбе^ а олигонуклеотиды ОЬЮО#8, ОЬЮО#10 и ОЬЮО#12 - сайт рестрикции НшбШ. Амплификацию ПЦР проводили в течение 25 циклов; каждый цикл состоял из 45 с при 95°С для денатурации, 1 мин при 65°С для отжига и 2 мин при 72°С для элонгации [термосайклер модели 2400 (Регкш-Е1тег Се!ик, №г\уа1к, СТ)]. Продукты ПЦР очищали с использованием системы очистки ДНК Αί/агб'™ (Рготеда, Маб1коп, ΑΙ), согласно инструкциям производителя. Очищенные продукты ПЦР рестрицировали NбеI и НшбШ, экстрагировали фенол/хлороформом и осаждали этанолом. Затем их ресуспендировали, лигировали в рАМО11 и трансформировали ими клетки Е.соН ЕМ15.
В. Получение продуктов в клетках Е.соН.
Исходно небольшой свежекультивированный инокулят нужного рекомбинантного клона Е.соН, несущего конструкт для экспрессии δΤΝΕΒ-Ι 2.6Ό/Ν105, δΤΝΕΒ-Ι 2.6Ц/С105, δΤΝΕΒΙ 2.6Ц/С106, δΤΝΕΒ-Ι 2.3ϋ/ά18, δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ц/б8 и δΤΝΕΒ-Ι 2.3Ό/615, получали, перенося все содержимое ампулы для заморозки (объемом 1.5 мл) в 2-л колбу, содержащую 500 мл бульона Лурии. Культуру инкубировали на вращающемся шейкере при 37°С и 350 об/мин. Плотность культуры определяли, измеряя поглощение при 660 нм (ОИ660). Посевную культуру выращивали до плотности >2.0 ОИ660, когда 125 мл культуры асептически переносили в 15-литровый промышленный ферментер, содержащий 10 л стерильной ростовой среды.
Использованные для промышленной ферментации бэтч-среда и условия ферментации описаны ΞπίίΤ (1993) в работе А СНет1са11уЭеГтеб Мебшт Тог Ше СТегргобисНоп оТ а ΒесотЫпап! Рго!еш т Е.сой, тезисы Колорадского государственного университета. В данной работе рекомендовано использование сложной среды, содержащей гидролизат казеина, соли, глицерин и антивспениватель, которую стерилизуют в ферментере. После того как ферментер остынет до температуры ниже 40°С, добавляют стерилизованные фильтрованием микроэлементы и тиамин гидрохлорид.
Когда температура среды стабилизировалась на уровне 37°С, в среду инокулировали посевную культуру. За ростом культуры следили, определяя ОИ660. Культуру поддерживали при рН 6,0 автоматическим добавлением 5М гидроокиси натрия и 5М соляной кислоты. Когда значение ΟΌ660 находилось в пределах 9,510,5, культуру индуцировали асептическим добавлением стерильного изопропил β-Ό-тиогалактопиранозида (ΙΓΤΟ) до конечной концентрации 0,50 мМ. Культуру собирали по завершении роста.
Культуральная среда и условия роста соответствовали, описанным 8п1ГГ (1993), кирга, со следующими исключениями: к среде добавляли сульфат аммония (2,0 г/л) и Ь-цистеин гидрохлорид моногидрат (1,0 г/л); в среде отсутствовал тетрациклин гидрохлорид; рН поддерживали при значении 6,0 добавлением гидроокиси натрия и соляной кислоты; ростовую температуру повысили до 37°С; концентрация индуктора была повышена с 0,15 до 0,50 мМ ΙΓΤΟ и время сбора культуры определяли исходя из замедления роста, а не от времени, истекшего с момента индукции.
По завершении ферментации клетки собирали центрифугированием в 500 мл флаконах. Клетки осаждали центрифугированием при 10000 об./мин в течение 30 мин. Полученную клеточную пасту разводили до 15% по твердому веществу в разрушающем буфере, состоящем из 50 мМ Τπδ и 5 мМ ЕДТА с рН 8,0. Суспендированные клетки лизировали, пропуская раствор три раза через гомогенизатор (АУР 6аи1шт Шс., Еуегей, МА) с давлением 55158080 кПа. Гомогенат центрифугировали при 10000 об./мин в течение 30 мин для выделения телецвключений. Тельца-включения отмывали, ресуспендируя в разрушающем буфере и центрифугируя раствор в третий раз при 10000 об./мин в течение 30 мин. Тельца-включения ресуспендировали в деионизированной воде (в соотношении 1:1) и центрифугировали последний раз при 10000 об./мин в течение 30 мин для второй отмывки. Выделенные, отмытые тельцавключения были готовы для солюбилизации, переукладки и очистки. Каждое выделение давало приблизительно 200-250 г телецвключений.
В альтернативном варианте осуществления изобретения ферментацию для получения усеченных κΤΝΡΒ-Ι можно проводить следующим образом.
Исходно небольшой свежекультивированный инокулят нужного рекомбинантного клона Е.сой, несущего конструкт для экспрессии κΤΝΕΚ-Ι 2.6Ό/Ν105 или κΤΝΡΚ-Ι 2.6П/С106, получали, перенося все содержимое ампулы для заморозки (объемом 1,5 мл) в 2-л колбу, содержащую 500 мл ВВЬ дрожжевого экстракта (10 г/л), рН 7,0. Культуру инкубировали на вращающемся шейкере при 33°С и 300 об./мин. Плотность культуры определяли, измеряя поглощение при 660 нм (ΟΌ660). Посевную культуру выращивали до плотности >2,0 ΟΌ660, ко гда 80 мл культуры асептически переносили в 15-литровый промышленный ферментер, содержащий 7 л стерильной ростовой среды.
При промышленной ферментации использовали фид-бэтч процесс. Среда для бэтчферментации представляет собой сложную среду, содержащую дрожжевой экстракт, соли и антивспениватель, которую стерилизуют в ферментере. После того как ферментер остынет до температуры ниже 40°С, добавляют стерилизованные фильтрованием микроэлементы, глюкозу, сульфат магния и гексаметафосфат. Использовали две подкормки, первую, содержащую углерод (глюкоза/сульфат магния), и вторую, содержащую азот, источником которого служил дрожжевой экстракт.
Когда температура бэтч-среды стабилизировалась на уровне 33°С, в нее вносили инокулят посевной культуры. За ростом культуры следили, определяя ΟΌ660. рН культуры поддерживали на значении 7,0 автоматическим добавлением гидроксида аммония и 48,7% лимонной кислоты. Когда значение ΟΌ660 находилось в пределах 8,0-12,0, начинали подкормку Ι с экспоненциально возрастающей скоростью подачи. Когда значение ΟΌ660 находилось в пределах 30-40, начинали подкормку ΙΙ с постоянной скоростью подачи. Когда значение ΟΌ660 достигало 67-83, проводили индукцию культуры асептическим добавлением стерильного автоиндуктора (гомосеринлактон) до конечной концентрации 0,6 мг/л. На стадии индукции скорости подачи подкормки Ι и подкормки ΙΙ делали постоянными. Культуру собирали спустя 16±2 ч после индукции.
По завершении ферментации клетки собирали центрифугированием в 500 мл флаконах. Клетки осаждали центрифугированием при 10000 об./мин в течение 30 мин. Полученную клеточную пасту разводили до 15% по твердому веществу в разрушающем буфере, состоящем из 50 мМ Τπκ и 5 мМ ЕДТА с рН 8,0. Суспендированные клетки лизировали, пропуская раствор три раза через гомогенизатор (АУР 6аи1Ш Шс., Еуегей, МА) с давлением 55158080 кПа. Для выделения телец-включений гомогенат центрифугировали при 10000 об./мин в течение 30 мин. Тельца-включения отмывали, ресуспендировали в разрушающем буфере и центрифугировали раствор в третий раз при 10000 об./мин в течение 30 мин. Тельца-включения ресуспендировали в деионизированной воде (в соотношении 1:1) и центрифугировали последний раз при 10000 об./мин в течение 30 мин для второй отмывки. Выделенные, отмытые тельцавключения были готовы для солюбилизации, переукладки и очистки.
С. Солюбилизация/переукладка.
Отмытые тельца-включения, полученные при 10-литровой ферментации, солюбилизировали в 800 мл солюбилизационного буфера (50 мМ Τγϊκ, 8 М мочевина, 160 мМ цистеина, рН
9,5). Значение рН солюбилизационной смеси доводили до рН 9,5 добавлением 10Ν Ν;·ιϋΗ и смесь перемешивали при комнатной температуре 2-3 ч. При каждой постановке выделяли приблизительно 200-250 г телец-включений.
Каждую солюбилизационную смесь разводили 1:20 холодным ренатурационным буфером (50 мМ Ττίκ, 1.1 М мочевина). Конечный объем составлял около 16 л. Затем значение рН каждой смеси доводили до рН 9,7 добавлением 6Ν НС1, и смесь медленно перемешивали при 4°С 2-3 дня.
Затем значение рН каждой смеси доводили до рН 5,0 добавлением ледяной уксусной кислоты и 6Ν НС1. В каждой смеси образовывался преципитат, который удаляли центрифугированием при 10000 д на центрифуге Весктап 12Н8. Затем каждый образец фильтровали через фильтры 5 мкм и 0,22 мкм.
Ό. Очистка.
Материал, полученный в результате переукладки, был готов для очистки на колонке ΙΧ-1 8Р-8ерБагоке В1д Веаб™ (РБаттааа В1о1есН, Шс., Р1кса1а^ау, Ν1).
Колонка ΙΧ-1 8Р-8ер11агоке В1д Веаб™ (4.4 см х 20 см).
Буфер А Буфер В
25 мМ ацетат 25 мМ ацетат
50 мМ ЫаС1 375 мМ ЫаС1
рН 5,0 рН 5,0
Колонку уравновешивали буфером А в объеме, равном 4-5 объемам колонки, перед раздельным нанесением каждого образца материала после переукладки. Каждый образец материала наносили на колонку раздельно. При каждом нанесении на колонку наносили не более двенадцати граммов белка на литр смолы. При каждом нанесении колонку промывали 3-4 объемами буфера А (пока УФ-поглощение не возвращалось к исходному значению). При каждом нанесении белок элюировали с колонки линейным градиентом (8 объемов колонки) возрастающей концентрации от 50 до 375 мМ ЫаС1. Весь белковый пик с каждого нанесения объединяли в один пул. Каждый белковый пик начинали собирать, когда УФ-поглощение достигало 20% от максимального значения. Сбор прекращали, когда поглощение достигало 50% от максимального значения или поглощение переставало снижаться.
Скорость тока
- 7,5 пост. об./ч для уравновешивания и промывки,
- 15 пост. об./ч для нанесения,
- 6 пост. об./ч для элюции.
Все этапы очистки на колонках проводили при 4°С.
Каждый ΙΧ-1 пул был готов для очистки на колонке Шуо Реаг1™ Ви!у1 650М ШС (%ко Наак, РЫ1абе1рЫа, РА).
300-мл колонка Шуо Реаг1™ Ви!у1 650М ШС (4,4 см х 20 см).
Буфер А Буфер для разведений Буфер В
20 мМ \аР()| 40 мМ ^РО4 М1Ш (,) Н2О
1,8 М \аС1 рН 6,0 4М \аС1 рН 6,0
Колонку уравновешивали буфером А в объеме, равном 4-5 объемам колонки перед раздельным нанесением каждого ΙΧ-1 пула. Каждый ΙΧ-1 пул разводили 1:1 буфером для разведений и доводили рН до 6,0. При каждом нанесении на колонку наносили один разведенный ΙΧ-1 пул. При каждом нанесении на колонку наносили не более десяти граммов белка на литр смолы. При каждом нанесении колонку промывали тремя объемами буфера. Белок элюировали с колонки линейным градиентом (8 объемов колонки) убывающей концентрации от 1.8 М №1С1 до Н2О. Каждый белковый пик начинали собирать, когда УФ-поглощение достигало 15-20% от максимального значения. Сбор прекращали, когда поглощение достигало 50% от максимального значения или поглощение переставало снижаться.
Скорость тока - 6 пост. об./ч для уравновешивания, нанесения и промывки, 3 пост. об./ч для элюции.
Каждый ШС пул был готов для концентрации/диафильтрации.
Концентрация/диафильтрация (С/Ό).
Для каждого С/ϋ этапа каждого ШС пула использовали 1 квадратный фут регенерированной целлюлозной мембраны РЬСС™ с отсечением МВ 5000 (М1Ш-Роге, ВебГогб, МА). Каждый ШС пул концентрировали до объема около 200 мл и затем подвергали диафильтрации против 6-7 объемов 20 мМ ЫаРО4, рН 6,0 до тех пор, пока проводимость не достигала значений <4 мм в час.
Каждый этап концентрации/диафильтрации проводили при комнатной температуре.
Каждый С/ϋ пул был готов для очистки на колонке ΙΧ-2 - 365 8Р-8ерНагоке НР™ (РНагтас1а В|о1ес11, Шс., Р1кса1а^ау, Ν1).
Колонка ΙΧ-2 - 365 8Р-Сефароза НР™ (5 см х 18,5 см).
Уравновешивающий буфер Буфер А Буфер В
20 мМ ^РО4 20 мМ ^РО4 20 мМ ХаРО^
рН 6,0 рН 6,3 50 мМ \аС1 рН 6,8
Колонку уравновешивали уравновешивающим буфером А в объеме, равном 4 объемам колонки перед разделением каждого С/ϋ пула. Каждый С/ϋ пул наносили на колонку из расчета не более восьми грамм белка на литр смолы. При каждом нанесении белок элюировали с колонки линейным градиентом (8 объемов колонки) рН от 6,3 до 6,8 и соли 1М - 0М ЫаС1 (буфер Б). Сбор фракций начинали при 1,0 ΟΌ в начале пика и заканчивали при значении, равном 50% максимального.
При альтернативном варианте осуществления изобретения усеченный кТ№К-1 может быть солюбилизирован, подвергнут переукладке и очищен следующим образом.
С. 1. Солюбилизация/переукладка.
Отмытые тельца-включения солюбилизировали 8 М мочевиной, 60 мМ Тпк, 100 мМ цистеина до получения конечной концентрации 6,5 М мочевины, 50 мМ Тпк и 80 мМ цистеина, рН 9,4 и 5-10 мг/мл усеченного кТ№К-1. Материал перемешивали при комнатной температуре 90 мин, а затем подвергали переукладке, разводя 1:10 холодным (4-8°С) раствором 0,85 М мочевины, 50 мМ Тпк рН 9,8 (измерения рН проводили при 4-8°С).
Раствор для переукладки перемешивали 24-72 ч при 4-8°С. К концу данного периода добавляли ледяную уксусную кислоту (~20 мМ) и рН доводили до 5,0. Образовавшийся преципитат удаляли центрифугированием, а супернатант сохраняли для нанесения на первую колонку.
Ό.1, Очистка.
Осветленный пул после кислотной преципитации наносили на колонку 8Р-Сефароза В1д Веаб™ (Рбагташа Вю!есб, 1пс., Р1кса!а^ау, ΝΡ), уравновешенную 20 мМ ацетата натрия, 75 мМ №С1, рН 5,0. На колонку наносили не более чем 15 г усеченного кТ№К на литр смолы. После нанесения колонку промывали 20 мМ ацетата натрия, 75 мМ №С1, рН 5,0, в объеме, равном 3 объемам колонки, и элюировали линейным градиентом (9 объемов колонки) от 75 мМ до 450 мМ №1С1 в 20 мМ ацетата, рН 5,0. Весь этап на колонке 8Р-Сефароза В1д Веаб™ (8Р-ВВ) проводили при 4-8°С.
Пул 8Р-ВВ разводили в соотношении 1:1 2М №С1, 60 мМ ацетата, рН 4,5, и при необходимости доводили рН до 4,5. Разведенный пул 8Р-ВВ наносили на колонку Тоуореаг1™ Ви1у 1 650М (Токо Наак, Рб11абе1рб1а, РА), которая была уравновешена 1М №С1, 60 мМ ацетата, рН 4,5. На колонку наносили - 10-13 г усеченного кΤNΕΚ-I на литр смолы. После нанесения колонку промывали (3 объемами колонки) 1М №С1, 30 мМ ацетата, рН 4,5 и элюировали линейным градиентом (8 объемов колонки) 1М 0М №1С1 в 30 мМ ацетате, рН 4,5.
Фракции очищенного усеченного кΤNΕΚ-I с колонки Ви1у 1 650М объединяли, разводили 1:5 водой и наносили на колонку 8Р-Сефароза Н1дб РегГогтапсе™ (8Р-НР) (Рбагташа Вю!есб, 1пс., Р1кса!а^ау, ΝΡ), уравновешенную 30 мМ ацетатом, рН 4,5 (нагрузка не более - 15 г/л смолы). Затем колонку промывали 30 мМ ацетата натрия, рН 4,5, в объеме, равном 3 объемам колонки, и элюировали линейным градиентом (12 объемов колонки) от 100 до 400 мМ №1С1 в 30 мМ ацетата, рН 4,5. Фракции очищенного усе ченного кΤNΕΚ-I объединяли и рН доводили до 5,0 добавлением №ОН.
С. ПЭГирование.
1. Получение кТ№К-1 2.6О/М05-!-ВцРЕС (33 кД).
К охлажденному (4°С) перемешиваемому раствору кТ№К-2.6О/М05 (3,5 мг/мл) в 50 мМ ацетате натрия, рН 4, добавляли 3-кратный молярный избыток !-ВиРЕО (моно-!-бутоксиполиэтиленгликоль, средний молекулярный вес = 33 кД, 8беагоа!ег Ро1утегк, 1пс.). Затем добавляли NаСNΒΗз до конечной концентрации 20 мМ и реакционную смесь перемешивали при 7°С 18-24 ч.
Степень модификации белка в ходе реакции контролировали 8ЕС НРЬС с использованием колонки Т8КС30008УХЬ(Токо Наак, Моп!дошег^Ше, РА), проводя элюцию 0,1 М натрийфосфатным буфером, рН 6,9, 0,5 М №1С1 и 10% этанолом со скоростью 0,7 мл/мин (Токо Наак, Моп!доте^111е, РА).
РН реакционной смеси доводили до 3,5 1М НС1, а затем реакционную смесь разводили водой до конечной концентрации белка 1,5 мг/мл. 8Т№К-1 2.6О/М05-!-ВцРЕС (33 кОа) отделяли от избытка !-ВиРЕО и других побочных продуктов реакции при использовании ионобменной хроматографической колонки 8Р Сефароза НР 16/10™(Рбагтас1а Вю!есб, 1пс., Р1кса!а^ау, Νί). Реакционную смесь наносили на колонку и непрореагировавший !-ВиРЕО элюировали тремя объемами колонки начального буфера А (20 мМ ацетат натрия, рН 4,0). 8Т№К-1 2.6Ό/Ν105-!ВцРЕО (33 КОа) элюировали (20 объемов) линейным градиентом 0-30% буфера В (1М №1С1 в 20 мМ ацетате, рН 4,0). Поглощение элюата контролировали при 280 нм. Каждую фракцию, содержащую кТ№К-1 2.6О/М05-!-ВцРЕС (33 КОа), анализировали 8Э8-РАСЕ с использованием готовых 4-20% градиентных гелей (Nονеx, 8ап О1едо, СА). Исходя из результатов анализа 808-РАСЕ, фракции объединяли, концентрировали и стерилизовали фильтрованием. Каждый окончательный пул очищенного кТ№К-1 2.6Ω/Ν 105-1-ВиРЕС (33 КОа) опять анализировали 8О8-РАОЕ и 8ЕС-НРШ Данный белок растворяли в 10 мМ фосфате натрия, рН 6,5 и 20 мМ N801.
2. Получение кТ№К-1 2.6Ώ/Ν105-33 кД (МеРЕС).
К охлажденному (7°С) перемешанному раствору кТ№К-1 2.6Ώ/Ν105 (4 мг/мл) добавляли 10%-ную уксусную кислоту до достижения рН 5,0. К данному раствору добавляли 15 мМ NаСNΒΗз и двукратный молярный избыток !бутокси РЕС (!-бутоксиполиэтиленгликоль, средний молекулярный вес = 33 кД, 8беагоа!ег Ро1утегк, 1пс.). Реакционную смесь непродолжительно перемешивали и затем инкубировали при той же температуре ~18 ч.
Ί5
Ί6
После 18 ч инкубации значение рН в реакционной смеси доводили до 3,ο добавлением лимонной кислоты.
δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν1ο5-Μ€ΡΒ6 (33 кД) отделяли от избытка МеРЕС и других побочных продуктов реакции при помощи ионообменной хроматографии на колонке 8Р-Сефароза НР™ (Рйагтас1а Βίοίοοίι, Шс., ΡίδοαΡηναν, Ν1).
Реакционную смесь наносили на колонку (не более 8 мг/мл смолы) и непрореагировавший МеРЕС элюировали тремя объемами колонки стартового буфера А (2ο мМ цитрат натрия, рН 3,ο). δΤΝΡΚ-Ι 2.6ШХ 1 (Е-МеРЕС (33 кД) элюировали линейным градиентом (16 объемов колонки) ο,1 - ο,5 М ЫаС1 в 2ο мМ цитрате, рН 3,ο. Мониторинг элюата вели при 28ο нм. Каждую фракцию, содержащую δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν1ο5МеРВО (33 кОа), анализировали 8Э8-РАСЕ с использованием готовых 4-2ο% градиентных гелей (Ыоуех, 8ап О1едо, СА). Исходя из результатов анализа 808-РАСЕ, фракции объединяли, концентрировали и стерилизовали фильтрованием. Каждый окончательный пул очищенного δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν1ο5- МеРЕС (33 кД) опять анализировали 808-РАСЕ. Очищенный δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ω/Ν 1()5-МеРЕС (33 кД) концентрировали до 5-2ο мг/мл и растворяли или в РВ8, рН 6,5 (1ο мМ фосфат натрия, 35-1οο мМ ЫаС1), или в 2ο мМ ацетате, 1οο мМ ЫаС1, рН 5,ο.
3. Получение δΤΝΡΚ-Ι 2.6О/Х1()5-МеРЕС (2ο кД).
Процедура этапа А для получения δΤΝΡΚ-Ι 2.6О/Х1()5-МеРЕС (33 кД), по существу, повторяла вышеописанную, с той лишь разницей, что МеРЕС (монометоксиполиэтиленгликоль, средний молекулярный вес = 2ο кД, 811еаг\\'а1ег Ро1утега, Шс.) был заменен МеРЕСом (монометоксиполиэтиленгликоль, средний молекулярный вес = 33 кД, 811еаг\\'а1ег Ро1утега, Шс.). Данный белок растворяли в 1ο мМ фосфате натрия, рН 6,5, и 2ο мМ ЫаС1.
Получение дополнительных конъюгатов.
Дополнительные конъюгаты δΤΝΡΚ-Ι 2.6О/Х1()5-МеРЕС получали практически так же, как и δΤΝΡΚ-Ι 2.6^/N105-МеРΒС (33 кД), с той разницей, что были использованы следующие типы альдегидов РЕСа (811еаг\\'а1ег Ро1утега, Шс.):
линейный монофункциональный - МВ 5 кД, 6 кД и 57 кД;
разветвленный монофункциональный - МВ 1ο кД, 2ο кД и 4ο кД;
линейный дифункциональный - МВ 8 кД и 2ο кД;
разветвленный трифункциональный - МВ
Ю кД.
Данные белки растворяли в 1ο мМ фосфате натрия, рН 6,5, и 2ο мМ ЫаС1.
5. Альтернативный метод ПЭГирования.
В альтернативном варианте осуществления изобретения молекулы усеченного δΤΝΡΚ-Ι могут быть пэгированы и очищены следующим образом.
Элюат 8Р-НР (3-5 мг/мл, рН доведен до 5,ο) вводили в реакцию с двумя молями полиэтиленгликоля (например, МеРЕС или 1-ВиРЕС) на моль δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ο/Ν1()5 (~5 г 1-ВиРЕС на грамм δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ο/Ν1()5). После растворения полиэтиленгликоля добавляли 1ο-2ο мМ цианоборогидрида натрия и раствор инкубировали в течение ночи при 7-15°С. По окончании реакции РЕСирования (~18 ч) реакцию останавливали добавлением 1ο мМ глицина. Смесь для ПЭГирования разводили четырьмя объемами 5ο мМ ацетата, рН 4.ο, при необходимости доводили рН до 4,ο и наносили на колонку 8Р-НР, уравновешенную 5ο мМ ацетатом, рН 4,ο. На колонку наносили не более ~8 г δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν1ο5 на литр смолы. После нанесения колонку промывали (3 объема колонки) уравновешивающего буфера, рН 4,5 и элюировали линейным градиентом 0М - ο,3 М ЫаС1 в 5ο мМ ацетате, рН 4,ο. Фракции монопэгированного δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν1ο5-3ο кОа собирали, доводили рН до 5,ο, концентрировали и подвергали диафильтрации в окончательный изотонический буфер. Все этапы очистки проводили при комнатной температуре. Данный белок растворяли или в РВ8, рН 6,5 (1ο мМ фосфат натрия, 35-1οο мМ №1С1), или в 2ο мМ ацетате, 1οο мМ ЫаС1, рН 5,ο.
6. Получение димеризованных (йЬ) δΤΝΡΚ-Ι 2.6И/СЮ5 и димеризованных δΤΝΡΚ-Ι 2.6О/С1()6.
Сульфон-активированный полиэтиленгликоль (полученный и очищенный в соответствии с заявкой на патент США № ο8/473,8ο9, поданной 7 июня 1995 г., и заявкой на патент США № ο8/611,918, поданной 6 марта 1996 г.) |РЕС20,000-бис-винилсульфон], использовали для димеризации белков в соответствии с методом, описанным в опубликованной заявке XV Ο 95/34326, за исключением процедуры восстановления и условий реакции. Перед присоединением полиэтиленгликоля белки восстанавливали, добавляя 4 моля ΏΤΤ на 1 моль белка при 5-6°С, рН 7,6. Все реакции проводили в присутствии 3ο% глицерина. Димеризованные белки были обозначены δΤΝΡΚ-Ι 2.6И/СЮ5йЬ и δΤΝΡΚ-Ι 2.6О/С1()6йЬ. Данные белки растворяли или в РВ8, рН 6,5 (1ο мМ фосфат натрия, 35-1οο мМ №1С1), или в 2ο мМ ацетате, 1οο мМ ЫаС1, рН 5,ο.
7. Получение компаративных молекул δΤΝΡΚ-Ι.
(ί) δΤΝΡΚ-Ι 4Ω/Ν1ο5 получали, как описано в ЕР 422339. 8ΤΝΡΚ-Ι 4^/N105-ΐ-ВиРΒС (33 кД) получали РЕСированием δΤΝΡΚ-Ι 4Ω/Ν1ο5 в соответствии с приведенной выше процедурой пэгирования δΤΝΡΚ-Ι 2.6^/N105-ΐ-ВиРΒС (33 кД). 8ΤΝΡΚ-Ι 4Ι2/Ν1 (ЕХ-ОМеРЕС (33 кД) получали пэгированием δΤΝΡΚ-Ι 4Ο/ΝΚΙ5 в соответствии с приведенной выше процедурой пэгиро77 вания δΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν 105-!-МеРЕС (33 кД). 8ΤΝΡΚ-Ι 4И/С105 и δΤΝΡΚ-Ι 4П/С105бЬ получали, как описано в опубликованной заявке АО 95/34326. Данный белок растворяли в 10 мМ фосфате натрия, рН 6,5 и 20 мМ №1С1.
(ίί) δΤΝΡΚ-Ι 4И/С105-33 кД (МеРЕС) получали пэгированием 4И/С105 в соответствии с приведенной выше процедурой пэгирования δΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105-33 кД (МеРЕС) с той разницей, что реакцию проводили при рН 7,5 с 1,3 молями ΌΤΤ на моль δΤΝΡΚ-Ι в течение 5-6 ч, после чего следовало удаление ΌΤΤ на колонке 8Р-Сефароза™ РР и пэгирование с 1,5-3 молями РЕСа на моль белка в течение по меньшей мере 15 ч при комнатной температуре. Данный белок растворяли или в РВ8, рН 6,5 (10 мМ фосфат натрия, 35-100 мМ №1С1), или в 20 мМ ацетате, 100 мМ ЫаС1, рН 5,0.
(ΐϊϊ) δΤΝΡΚ-Ι 3Ό/Ν105 (усеченный на 34 аминокислоты по С-концу δΤΝΡΚ-Ι 4Ό/Ν105) получали следующим образом. Амплификацию ПЦР проводили с использованием в качестве матрицы δΤΝΡΚ-Ι 4Ό/Ν105 и ОЬЮО#13 и ОЬЮО#14, которые кодируют сайты рестрикции Νώ;Ι и НшбШ соответственно, и гибридизуются с 5' и 3' концами усеченного гена соответственно. Амплификацию ПЦР проводили в течение 25 циклов; каждый цикл состоял из 30 с при 94°С для денатурации, 15 с при 60°С для отжига и 1 мин при 72°С для элонгации [термосайклер модели 2400 (Регкт-Е1шег Се1и5, Ыогоа1к, СТ)]. Продукт ПЦР очищали с использованием набора для очистки продуктов ПЦР Р^цшск™ ОАСЕН С11а15\\'ог111, сА).
Выделенный из геля продукт ПЦР лигировали в рАМС11 и трансформировали им клетки Е.сой РМ15.
5’ ОЫСО#13: (8Е<Э ГО ΝΟ: 80)
5'-ООТТАОССАТАТООАСАССОТТТОСССССАА-3'
3' ОЫОО#14: (5Εζ> ГО ΝΟ: 81) 5’-СССААОСТТТТАООТОСАСАССОТСТТСТОТТТ-3'
Данный белок растворяли в 10 мМ фосфате натрия, рН 6,5, и 20 мМ №1С1.
(ίν) δΤΝΡΚ-Ι 3И/С105 (усеченный на 34 аминокислоты по С-концу δΤΝΡΚ-Ι 4И/С105) получали практически так же, как и 8ΤΝΡΚΙ3Ό/Ν105, с той разницей, что матрицей служил δΤΝΡΚ-Ι 4Ό005.8ΤΝΡΚ-Ι3Ό/α05 растворяли или в РВ8, рН 6,5 (10 мМ фосфат натрия, 35-100 мМ №1С1), или в 20 мМ ацетате, 100 мМ ЫаС1, рН 5,0.
(ν) δΤΝΡΚ-Ι 3И/С105бЬ получали практически так же, как и 5ΤΝΕΕ-Ι4Ό/Ο056Κ с той разницей, что в качестве исходного материала служил δΤΝΡΚ-Ι 3И/С105 вместо δΤΝΡΚ-Ι 4И/С105. δΤΝΡΚ-Ι 3И/С105бЬ растворяли или в РВ8, рН 6,5 (10 мМ фосфат натрия, 35 - 100 мМ №1С1), или в 20 мМ ацетате, 100 мМ ЫаС1, рН 5.0.
Пример ΙΙ.
Различные формы усеченных, рекомбинантных растворимых ΤΝΡΚ-Ι исследовали на способность подавлять активность ТИР.
А. Цитотоксический тест на клетках АЕШ.
Тест на клетках АЕШ является тестом на пролиферацию клеток ш νίΙΐΌ (Еб^агбк е! а1., (1991) Епбосгто1о§у. 128:989-996). Данная клеточная линия чувствительна к ΤΝΡ-α (т.е. ΤΝΡα является цитотоксичным). В присутствии ингибитора ΤΝΡ-α клетки защищены от цитотоксического действия и способны пролиферировать.
Протокол.
ΤΝΡ-чувствительные клетки АЕШ 164 клона 13 (АТСС, ЕосктШе, МИ) суспендировали в концентрации 20х104 клеток/мл в среде ΚРМI (С1Ьсо, Сагиб Шапб, ΝΥ) с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Нус1опе, Одбеп, ϋΤ) и пенициллина 50Е/мл: стрептомицина 50мг/мл. По сто микролитров клеточной суспензии вносили в каждую лунку 96луночных плоскодонных микротитровальных планшетов и клеткам давали прикрепиться в течение 4-6 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. В каждую лунку вносили 10 мкл 0,0060 мг/мл актиномицина-Ό (8фта Сйеш1са1 Со., 8!.Ьош5, МО). Затем в каждую лунку вносили 10 мкл рекомбинантного ΤΝΡ-α человека в концентрации 50 нг/мл (конечная концентрация 5 нг/мл). После добавления рекомбинантного ΤΝΡ-α человека в лунки добавляли (10 мкл/лунку) серийные двукратные разведения различных форм δΤΝΡΚ, приготовленные на РВ8 (δΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С106, δΤΝΡΚ-Ι 41)/С10 и δΤΝΡΚ-Ι 4И/С105бЬ). Клетки АЕШ 164 клона 13 инкубировали 18 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. После инкубации добавляли 10 мкл (2 мг/мл) раствора органического красителя тетразолия МТТ (3-[4,5-диметилтиозол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолиум бромид; 8щша Сйеш1са1 Со.,
8!.Ьош5, МО) и клетки инкубировали еще 4-6 ч. Клетки солюбилизировали добавлением 50 мкл раствора 1)\11;/81)8 (20% 8Ό8 и 50% Ν,Νдиметилформамида, рН 4,7). Раствор ПМР/δΌδ пипетировали несколько раз до полного растворения кристаллов МТТ и клетки инкубировали еще 2-22 ч. Значения поглощения (аЬк) определяли на ридере Ушах при длине волны 570 нм. Процент специфической цитотоксичности вычисляли, исходя из оптической плотности, по формуле: % специфической цитотоксичности = [аЬк (клетки + среда) - аЬк (клетки + образец)]/[аЬк (клетки + среда) - аЬк (клетки + ТХ-100)]. Количество единиц ΤΝΡ в каждом образце определяли с использованием процента специфической цитотоксичности мышиного стандарта, как описано ранее.
Результаты цитотоксического теста на клетках АЕШ приведены ниже в табл. 2.
Таблица 2
Активность 1п уйго в тесте на клетках №ЕШ
Соединение ΙΟ50, нг/мл
δΤΝΕΚ-1 2.6Б/С106 208
δΤΝΕΚ-1 4Б/С105 238
δΤΝΕΚ-1 4Б/С105бЬ Ν/А
Судя по результатам цитотоксического теста на клетках νΞΗΙ, не обнаруживается значительных различий между 8ΤΝΕΚ-1 2.6Э/С 106 и 8ΤΝΕΚ-1 4Э/С105 в отношении биоэффективности 1п уйго.
В. Цитотоксический тест на клетках Ь929.
Цитотоксический тест на клетках Ь929 является тестом на пролиферацию клеток ш уйго (Рагте1у е! а1., (1993), I. Iттипο1., 151:389-396), который также позволяет оценить ΤΝΕ-αзависимую цитотоксичность. Клеточные линии чувствительны к ΤΝΕ-α (т.е. ΤΝΕ-α является цитотоксичным). В присутствии растворимого ингибитора ΤΝΕ-α клетки защищены от цитотоксического действия и способны пролиферировать.
Протокол.
Клеточную линию Ь929 получали из Американской коллекции культур клеток (каталожный номер СЬЬ 1, NСΤС клон 929, клон штамма Ь, соединительная ткань, мышь). Для поддержания клеток использовали среду КРМI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% раствора Ь-глутамина и 1% раствора пенициллин-стрептомицина.
В опыте использовали 96-луночные планшеты для микротитрования (Согшпд), при этом клетки засевали только в 60 внутренних лунок. Каждый стандартный и тестируемый образец вносили в три лунки на одном планшете.
Использованный в опыте ΤΝΕ-α был получен от Κ&Ό 8у8!ет8 (М^ииеарο1^8, МЫ). Конечная концентрация использованного в опыте ΤΝΕ-α была 1 нг/мл во всех опытных лунках.
Растворителем во всех опытах была ростовая среда для клеток Ь929, 10 нг/мл ΤΝΕ-α и 10 мкг/мл актиномицина Ό (81дта СНет1са1 Со., 8!.Ьош8, МО).
Материал из плашек собирали с помощью раствора XΤΤ/МЕN (1,5 мг/мл ХТТ + 75 мМ МЕ^.
В день 1 клетки засевали в планшеты. Клеточную суспензию готовили, трипсинизируя и ресуспендируя клетки до конечной концентрации 3,33х104 клеток/мл. 180 мкл этой суспензии засевали в 60 внутренних лунок титровального планшета. 200 мкл ростовой среды распределяли по 36 внешним лункам, чтобы избежать обусловленных испарением артефактов. Плашкам давали постоять при комнатной температуре, покрывали фольгой и оставляли неподвижно приблизительно на 1 ч. Опытные плашки помещали в атмосферу 5±1% СО2 с высокой влажно стью и температурой 37±2°С. Перед добавлением серийных разведений 8ΤΝΕΚ-Ι плашки инкубировали приблизительно 20-22 ч.
В день 2 готовили опытные образцы и стандарт 8ΤΝΕΚ-Ι 4Ό/Ν105:
разводили стандарт 8ΤΝΕΚ-Ι 4Ό/Ν105 и опытные образцы до концентрации приблизительно 2,0 мг/мл (или другой приемлемой концентрации). Готовили серийные разведения данной концентрации с тем, чтобы получить кривую десятикратных разведений в пределах от 1,0х106 нг/мл до 1,0х10-3 нг/мл, включая точку 0 нг/мл (только растворитель). Если другие концентрации оказывались приемлемыми, то использовали эти концентрации. В три опытные лунки распределяли 1000 мкл каждого разведения. После добавления серийных разведений планшеты инкубировали 20±1 ч в атмосфере 5±1% СО2 с высокой влажностью и температурой 37°С±2°С.
В день 3 в 60 внутренних лунок опытных планшетов добавляли по 50 мкл/лунку раствора ΧΤΤ/МЕК Планшеты инкубировали в атмосфере 5±1% СО2 с высокой влажностью и температурой 37°С±2°С в термостате (Еа1соп, №\ν Уогк, №\ν Уогк) 24±0,5 ч.
В день 4 определяли оптическую плотность (ΟΌ) опытных планшетов при длине волны 490 нм минус 650 нм при помощи ЕЫ8Асканера (8рес!гаМАХ, Весктап ЕъйитепК Шс., Еи11епоп, СА). Если при этих длинах волн для лунок получали значения 4.000 ΟΌ, то планшет немедленно сканировали заново при 490 нм минус 650 нм и для вычислений использовали значения 490 нм минус 650 нм.
Стандартную логарифмическую кривую доза-ответ строили с использованием четырехпараметрической логистической кривой. Первоначальные концентрации неизвестных образцов вычисляли по стандартной кривой, вычисляли ЕЭ50 для стандарта и коэффициент корреляции для стандартной кривой.
Результаты.
Результаты цитотоксического теста на клетках Ь929 приведены ниже в табл. 3.
Таблица 3
Активность т уйго в цитотоксическом тесте на клетках Ь929
Соединение Концентрация, мг/мл ЕЭ50, нг/мл
8ΤΝΕΚ-Ι 4Э/С105бЬ 7,8 1,0±0,1
8ΤΝΕΚ-Ι 2.6 1)С105бЬ 2,6 1,1±0,0
8ΤΝΕΚ-Ι 2.6 Э/С106бЬ 2,2 1,0±0,1
8ΤΝΕΚ-Ι 4Ώ/Ν105-1- 2,0 229,2±8
ВиРЕС (33 кД)
8ΤΝΕΚ-Ι 2.6Э/С105-1- 1,7 210,2±9
ВиРЕС (33 кД)
8ΤΝΕΚ-Ι 4Э/С105-1- 1,1 325,5±147
ВиРЕС (33 кД)
Внутренний стандарт: 3,5 314,8±
8ΤΝΕΚ-Ι 4Э/С105 188,1
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что 8ΤΝΕΚ-Ι 8ΤΝΕΚ-Ι 4Э/С105бЬ, 8ΤΝΕΚΙ 8ΤΝΕΚ-Ι 2.61)/'С‘105с1Ь и 8ΤΝΕΚ-Ι 8ΤΝΕΚ-Ι
2.6Э/С106бЬ активны и для них характерны сходные параметры доза-ответ при сравнении со стандартом. Данные также указывают на то, что кТХЕВ-Ι 4В/Х105-1-ВнРЕС (33 кД) и кТХЕР-Ι 2.60/С105 -1-ВиРЕС (33 кД) почти на 2 1одк менее активны, но тем не менее, все-таки активны в данном тесте при сравнении с кТХЕР-Ι 4И/С105бЬ.
Прогон #2
кТИНЫ 3Б/С105бЬ 0,2 2,27±0,3
кТХЖВ 3Б/С105бЬ 0,2 2,0*
кТХЖВ 3Б/С105бЬ 1,9 1,8*
кТИНЫ 3Б/Ш05 2,4 413,3*
Внутренний стандарт: 3,5 115,9±42,1
кТИНЫ 4Б/С105
* Данные для одной точки
Приведенные результаты свидетельствуют о том, что кТДЕЕД 3Э/С105бЬ активен и его значения ЕИ50 варьируют в пределах, характерных для кТДЕЕД 4Э/С105бЬ (прогон #1), кТХЕИД 2.6И/С105бЬ (прогон #1) и кИЧЕРЛ 2.6О/С106бЬ (прогон #1). Данные также указывают на то, что кТДЕЕД 3Ό/Χ105 менее активен, чем внутренний стандарт кТДЕЕД 4Э/С105.
С. Модель реактивации артрита, индуцированной клеточной стенкой стрептококка.
Тесты на модели реактивации артрита у крыс, индуцированной клеточной стенкой стрептококка, проводили с использованием известных протоколов (Еккег е1 а1., (1985), АтШпбк Апб Кйеитабкт, 28:1402-1411 и Макагоу е1 а1., (1996), Ргос. Асаб. 8сЕ И8А, 93:402-406).
Протокол.
Самкам крыс Льюис весом 175-185 г (Сйат1ек Ктует ЕаЬогаЮпек, Шс., ХУПттЦоп, МА) вводили внутрисуставно в правый голеностопный сустав стерильную суспензию продуктов клеточной стенки стрептококка, содержащую пептидогликан-полисахарид (8СХУ) (Ьее ЕаЬогаЮгу, Сгаукоп, СА) в дозе 1.5 мг/10 мг на сустав.
В качестве контроля в такой же сустав на другой конечности вводили физраствор. Внутрисуставная инъекция 8С\ вызывает острый артрит относительно короткой продолжительности с опуханием сустава, достигающим пика через день или два после инъекции. Через 20 дней, в течение которых воспалительная реакция угасала, опять вводили 8С\ внутривенной инъекцией в дозе 200 мг/200 мл на крысу. Вторая доза 8С\ достаточна для реактивации воспаления в голеностопном суставе, в который 8С\ вводили ранее, и практически не оказывает воздействия на сустав, в который вводили контрольный раствор. Для оценки степени воспаления в течение 72-часового периода после внутривенной инъекции 8СУ при помощи штангенциркуля определяли размеры голеностопного сустава спустя 0, 24, 36, 48 и 72 ч после реактивации артрита и затем забирали другую конечность для гистологического исследо вания (например, воспаление, образование паннуса, повреждение хряща и повреждение костей).
Результаты.
Эффект введения кТДЕЕД 2.6Э/С106бЬ оценивали по развитию отеков суставов при реактивации артрита. Ингибиторы и носители вводили одной внутривенной инъекцией за 24 ч до реактивации артрита посредством 8С\.
кТИЕКЧ 2.6Э/С106бЬ показал статистически значимую эффективность при снижении отеков суставов при анализе отклонений (ΑNОУΑ) при помощи теста Фишера (81а1у|е\\·®) во всех четырех дозах на второй и третий дни после реактивации артрита, и в первый день - во всех дозах кроме одной (1,5 мг/кг). Это снижение отека было сопоставимо с полученным с положительным контролем кТИЕКЧ 4Э/С105бЬ, вводимым ежедневно в дозе 0,5 мг/кг (т.е. 8 нМ), начиная с одного дня до реактивации и кончая третьим днем после реактивации.
кТДЕК. также проявили значительную эффективность в том случае, когда величина отека за три дня рассматривалась как один показатель. Площадь под кривой (АИС) отражает зависимость доза-ответ для всех доз (см. фиг. 9, где кТИЕКЧ 2.6Э/С106бЬ обозначен как кТДЕКЧ 2.6Ό, а кТИЕКЧ 4И/С105бЬ обозначен как кТИЕКЧ 4Ό).
В данной модельной системе введение кТИЕКЧ 2.6Э/Д 105-1-ВнРЕС (33 кД) привело к значительному снижению ширины голеностопа и гистологических показателей при сравнении с контрольной группой.
Ό. Модель с Ό-галактозамином/липополисахаридом.
Модель с Ό-галактозамином (И-Са1ИН2)/ липополисахаридом (ЬР8) (Рагте1у е1 а1., (1993), кирга) является высоко ТИЕ-а-зависимой моделью летальности на животных ίη у1уо. Кроме того, показано, что аутоиммунные мыши МКЕ1рг/1рг крайне чувствительны к ЬР8- или 8ЕВиндуцированному ТДЕ-а (МошИх е1 а1., (1995), 1. ^типок, 155:4829-4837).
Протокол.
После голодания в течение ночи 6-8 недельным самкам мышей МКЕ-1рг/1рг (1асккоп ЬаЬотаГогу, Ваг НагЬог, МЕ) внутривенно вводили следующие фармакологические реагенты: 25 мг И-Са1ИН2 (81дта Сйетюа1 Со., 8ΐ. Ьошк, МО), суспендированного в сбалансированном солевом растворе Хэнка (С1Ьсо ЕаЬогаЮпек, Шс., Сгапб И1апб, NΥ) (50 мг/мл), липополисахарид (ЬР8) из Е.со11 серотипа 0127:В8 (81дта Сйетюа1 Со., 8ΐ. Ьошк, МО) в стерильном, свободном от эндотоксинов фосфатном буферном растворе (РВ8) (50 мг/мышь) или 8ЕВ (ТохШ ТесНпокщек, 8агако!а, ЕБ) в физиологическом растворе (50 мг/мышь). Различные формы кТДЕИ вводили в двукратных серийных разве дениях (дозировку выражали в мг/кг) для получения кривых ЕБ50. которые строили с помощью статистической программы для МасИ'Иозй (81аМе^®), Моип!ат У1е\\'. СА. Летальность оценивали в срок +48 ч после заражения.
Результаты.
Как видно из приведенной ниже табл. 4, когда 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С106бЬ вводили как описано выше, за 1 ч до введения БРЗ/О-СаШШ. ЕО50 (т.е. доза 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С106бЬ, необходимая для 50%-ной защиты) спустя 48 ч составляла ~50 мкг/кг (Ν=8 индивидуальных мышей). В сравнении с 3ΤΝΡΚ-Ι 4Б/С105бЬ не отмечено существенной (Р>0,05) отличимой разницы в способности данной формы снижать летальность (ЕБ50 = ~50 мкг/кг; Ν=8 индивидуальных мышей).
Таблица 4
Сравнение 8ΤΝΡΚ и оптимизированных усеченных форм 8ΤΝΡΚ на модели БРЗ/Р-СаГЫЛ;
Агент ЕО100 Εϋ50
8ΤΝΡΚ-Ι 41)С105с1Ь ~100 мкг/кг ~50 мкг/кг
8ΤΝΡΚ-Ι 2.61)С106с1Ь ~100 мкг/кг ~50 мкг/кг
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105-!ВиРЕС (33 кД) ~2 мг/кг ~400 мкг/кг
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105-!- МеРЕС (20 кД) ~800-1000 мкг/кг ~1 мг/кг
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105-!- МеРЕС (20 кД разветвленный) 2 мг/кг ~1-1.5 мг/кг
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105-!- МеРЕС (40 кД разветвленный) 1.5 мг/кг ~1 мг/кг
Приведенные данные свидетельствуют о том, что 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6Б/С106бЬ имеет сходную активность с 3ΤΝΡΚ-Ι 4Б/С105бЬ, но 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6П/Ш05-!-ВиРЕС (33 кД) был менее активен в данной модельной системе со значением ЕБ50 ~400 мкг/кг; Ν=8 индивидуальных мышей. Кроме того, активность 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν105-!МеРЕС (20 кД разветвленный) и 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν 105-1-МеРЕС (40 кД разветвленный) была ниже в данной модельной системе.
Е. Модель адъювант-индуцированного артрита.
Ревматоидный артрит у крыс, индуцированный адъювантом, имеет много общего с ревматоидным артритом у человека. Цель настоящего эксперимента заключалась в том, чтобы показать, что систематическое введение усеченных 3ΤΝΡΚ3 оказывает положительный эффект на патогенез артрита, индуцированного адъювантом у мышей.
Протокол.
Самцам крыс Льюис (5-7 в группе) (Сйаг1е8 Р|уег БаЬога!ог1ез, Ес, \11ш1пд!оп, МА), весящим не менее 200 г, вживляли подкожные катетеры и давали к ним привыкнуть в течение нескольких дней. Затем животных помещали в специальные клетки для инфузий и давали привыкнуть в течение недели прежде, чем начать инфузии.
В день 0 всем крысам вводили 100 мкл полного адъюванта Фрейнда (81дта Сйет1са1 Со., 81. Бошз, МО), к которому был добавлен синтетический адъювант, Ν,Ν-диоктилдецилдецил-Ы',М-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин, 50 мг/мл. В день 8 различным группам крыс вводили постоянной подкожной инфузией 3ΤΝΡΚ-Ι 4ΙΜΊ05 и 8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν105.
Результаты приведены в табл. 5.
Таблица 5
Артрит, вызванный адъювантом
Соединение Доза, мг/кг/день АиС% (% подавления) Вес лап (% подавления) Воспаление (% подавления) Резорбция кости (% подавления)
Опыт #1
8ΤΝΡΚ-Ι 4Б/С105 5 61 46 37 89
1 49 45 26 855
0.2 33 40 14 34
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105 1 55 53 33 51
Опыт #2
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105 5 42 ΝΏ 19 67
1 38 ΝΏ 13 49
Опыт #3
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105- МеРЕС (33 кД) 9 50 40 13 27
3 35 34 9 22
1 36 30 0 0
8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ώ/Ν105- МеРЕС (33 кД) 9 43 37
3 38 33
1 24 20
Удивительно, но 3ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν105ВиРЕС (33 кД) и 3ΤΝΡΚ-Ι 4Б/С105бЬ проявили сходную противоартритную активность при тестировании на модели адъювант индуцированного артрита у крыс Льюис, при том, что 3ΤΝΡΚ-Ι 4Б/С105бЬ оказался более действенным в исследованиях на цитотоксичность ш уйго на клетках \ЕШ-164 и Б929, а также при тестировании на ЬР8/СаШ модельной системе.
Е. Модель коллаген-индуцированного артрита.
Артрит у крыс, индуцированный коллагеном типа ΙΙ, имеет много общего с ревматоидным артритом у человека. Цель настоящего эксперимента заключалась в том, чтобы показать, что систематическое введение усеченных кТ№Кк оказывает положительный эффект на патогенез индуцированного коллагеном типа ΙΙ артрита у крыс и мышей.
Опыт на крысах.
Самкам крыс Льюис (Сйаг1ек К1ует ЬаЬога1опек, 1пс., ^11тшд1оп, МА) имплантировали подкожные канюли, к которым животные привыкали, что давало возможность проводить постоянные вливания. Затем животных иммунизи ровали бычьим коллагеном типа ΙΙ (81дта С11еписа1 Со., 81. Ьошк, МО) в неполном адъюванте Фрейнда. В дни 13, 14 или 15 после иммунизации животных, у которых развился артрит, случайным образом разделяли на группы по 8 животных в каждой. Животным экспериментальных групп дважды в день интраперитонеально вводили или буфер, или различные дозы кТОТКИ в течение 7 дней, как описано в табл. 6. Воспаление лап оценивали ежедневно, определяя с помощью штангенциркуля диаметр голеностопных суставов. В день + 7 животных подвергали эвтаназии и определяли вес лап, который служил индикатором воспаления. Голеностопные и коленные суставы собирали для гистопатологической оценки параметров артрита.
Результаты приведены в табл. 6А.
Таблица 6А
Артрит, вызванный коллагеном
Соединение Доза, мг/кг/день АиС% (% подавления) Вес лап (% подавления) Воспаление (% подавления) Резорбция кости (% подавления)
Опыт #1
кТИЕКЛ 4Б/С105 5 65 81 N0 N0
1 35 34 N0 N0
0.2 19 22 N0 N0
кТИЕКЛ 2.6| >/N10« 1 39 41 N0 N0
Опыт #2 (мг/кг/день)
кТИЕК-Ι 2.6В/№05МеРЕС (33 кИа) 3 50 60 76 46
кТИЕКЛ -^/N105- МеРЕС (33 кИа) 3 47 50 N0 N0
Опыт #3
(мг/кг/день)
кТИЕК-Ι 2.6В/№05МеРЕС (33 кВа) 9 25 44 N0 N0
кТИЕКЛ 2.6В/№05МеРЕС (33 кВа) 3 25 37 N0 N0
кТИЕК-Ι 2.6В/№05МеРЕС (33 кВа) 9 35 52 N0 N0
кТИЕК-Ι 2.6В/№05МеРЕС (33 кВа) 3 35 37 N0 N0
Примечательно, что в данной модели артрита на крысах для всех опытных групп были получены сходные результаты, например, форма кривой, процент (%) подавления, определяемый площадью под кривой (АИС), варьировал в пределах 30-59% и процент (%) подавления, определяемый по весу лап, варьировал в пределах 40-64%. Значения для группы, не получавшей препаратов, статистически отличались в данной модельной системе от значений, полученных для других групп.
Опыт на мышах.
Самцов мышей ИВА/Ι Цасккоп ЬаЬогаФпек, Шс., Ваг НагЬог, МЕ) иммунизировали бычьим коллагеном типа ΙΙ (81дта С11еппса1 Со., 81. Ьошк, МО) в неполном адъюванте Фрейнда. В дни 24, 25 и 26 после иммунизации животных, у которых развился артрит, случайным образом разделяли на группы по 8 животных в каждой.
Животным экспериментальных групп дважды в день интраперитонеально вводили или буфер, или кТ№К-[ 2.6И/М05-ВиРЕС (33 кД) в течение трех последовательных дней (дни +27, +28, +29). Воспаление лап оценивали ежедневно, определяя с помощью штангенциркуля диаметр голеностопных суставов. В день +34 животных подвергали эвтаназии и определяли вес лап, который служил индикатором воспаления. Голеностопные и коленные суставы собирали для гистопатологической оценки параметров артрита.
Результаты приведены в табл. 6В.
Таблица 6В
Артрит, вызванный коллагеном
Соединение Доза, мг/кг 2Ώ АиС % (% подавления) Общая гистопатология (% подавления)
Опыт #1
к'ТНЕК.Л 4Э/С105бЬ 3 49 39
кТОТИ-Т 4Ώ/Ν105ВиРЕС (33 кД) 3 63 55
Опыт #2
кТNΕК-I 2.6Ώ/Ν105МеРЕС (33 кД) 9 73 ΝΏ
кТNΕК-I 2.6Ώ/Ν105МеРЕС (33 кД) 3 75 ΝΏ
С. Постоянная инфузия на крысиной модели с ЬР8-индуцированной продукцией ΤΝΡ-α.
^ΗΡΗ-Ι 2.6ШС105с1Ь и кΤNΡВ-I 2.6Э/С106йЬ, ^ΗΡΗ-Ι 2.6Ό/Ν105 и кΤNΡВ-I 4Ό/Ν105 вводили внутривенно с помощью имплантированных в яремную вену мини-насосов Аке!™ (А1ха Согр., Ра1о А1!о,СА) в соответствии с инструкциями производителя в течение 48 ч (1 мг/кг). Уровни ΤΝΡ-α в сыворотке, определяемые с помощью ЕЫ8А (Сепхуте, СатЬпйде, МА), были значительно снижены по сравнению с контролем спустя 2 ч после введения высокой дозы ЕР8.
Пример ΙΙΙ. Исследования иммуногенности.
Различные формы усеченных рекомбинантных растворимых кΤNΡВ-I исследовали на иммуногенность на нескольких модельных системах на животных.
А. Грызуны.
^ΗΡΗ-Ι 2.6П/М05-!-ВцРЕС (33 кД) и кΤNΡВ-I 4Э/С105йЬ (контроль) вводили подкожно (4 мг/кг) в 1 и 5 дни эксперимента самкам крыс Спраг-Доули (СРаг1ек Вйегк ЬаЬк, А11ттЦоп, МА) (п=6-8/группа). Еженедельно до 21 дня отбирали образцы крови из ретроорбитального синуса. В образцах определяли присутствие антитител ЦМ и ЦС.
Таблица 7
Иммуногенность для грызунов
Время, дни 0.01 7 14 21
Группа+# животного Титр Ι§ω: Титр Ι§ω: Титр Ι«\Ι Титр Ι«\Ι
иТОГВ^ 2.6Ώ/Ν105- 33 кД
РЕС
1 отриц. 0 0 0
2 отриц. 0 0 0
3 отриц. 0 0 0
4 отриц. 0 0 0
6 отриц. 0 0 0
иТОГВ^ 2.6Ώ/Ν105!-ВиРЕС (33 кД) 0 0.00 0.00 0.00
Стандартное отклонение 0 0.00 0.00 0.00
Контроль
7 0 0 50 0
8 0 0 50 0
3 0 0 100 0
9 0 0 0 0
10 0 0 100 50
11 0 0 100 0
12 0 0 100 0
13 0 0 0 0
Контроль 0 0 62.5 6.3
Стандартное отклонение 0 0 15.7 6.3
Время, дни 0.01 7 14 21
Группа+# животного Титр ^С Титр ^С Титр ^С Титр ^С
кТNΕК-I 2.6Ώ/Ν105!-ВиРЕС (33 кД)
1 отриц. отриц. 0 0
2 отриц. отриц. 0 0
3 отриц. отриц. 0 0
4 отриц. отриц. 0 0
6 отриц. отриц. 0 0
кТNΕК-I 2.6Ώ/Ν105!-ВиРЕС (33 кД) 0.00 0.00 0.00 0.00
Стандартное отклонение 0.00 0.00 0.00 0.00
Контроль
7 отриц. отриц. 0 200
8 отриц. отриц. 0 200
9 отриц. отриц. 0 0
10 отриц. отриц. 0
11 отриц. отриц. 200 400
12 отриц. отриц. 0 200
13 отриц. отриц. 200 800
14 отриц. отриц. 0 50
Контроль 0 0 50 231.3
Стандартное отклонение 0 0 32.7 94.0
Как видно из табл. 7, при подкожном введении (8С) кΤNΡВ-I 4О/С105йЬ в дни +1 и +5 отмечены более высокие титры анти-кΤNΡВ-Iантител к дню +21 по сравнению с очень низкими титрами антител к кΤNΡВ-I 2.6Ό/Ν105-!ВиРЕС (33 кД). Аналогичная тенденция иммуногенности наблюдалась также у крыс, у которых к дню +21 появились анти-кΤNΡВ-I ЦМ антитела. Инъекции кΤNΡВ-I 2.6Ό/Ν105-!ВиРЕС (33 кД) не приводили у крыс к выработке анти-кΤNΡВ-I ЦМ антител к дню +21.
В. Рарю апиЫк.
Задачей части А фазы Ι исследования было определение фармакокинетики и иммуногенности кΤNΡВ-I 4Э/С105йЬ (0,2 мг/кг веса тела [ВТ]), кΤNΡВ-I 3О/С105йЬ (0,2 мг/кг ВТ) или кΤNΡВ-I 2.6Э/С105йЬ (0,2 мг/кг ВТ) соответственно, при двукратном внутривенном введении здоровым павианам с интервалом в 21 день.
Часть Ι исследования была разделена на две фазы. Задачей фазы А части Ι являлось определение фармакокинетики и иммуногенности различных конструктов кΤNΡВ-I на здоровых павианах в ответ на две инъекции. Двенадцать павианов разделили на три группы. Под анестезией животные каждой группы получали 0,2 мг/кг ВТ ^ΗΡΗ-Ι 4О/С105йЬ, кΤNΡВ-I 3Э/С105йЬ или кΤNΡВ-I 2.6П/С105йЬ. В каждом опыте использовали трех павианов. Спустя 21 день животным проводили вторую идентичную внутривенную инъекцию белка и животных на блюдали еще 21 день. Фармакокинетические параметры и иммуногенность определяли в перечисленные ниже интервалы времени.
Задачей фазы В части Ι данного исследования являлась оценка эффективности данных препаратов при тестировании на хорошо разработанной модели ΤΝΕα-обусловленной летальности (Екра! е! а1., 1. 8игд. Век., 59:153-158, 1995). Летальную бактериемию Е.сой индуцировали у 16 животных, разделенных на группы по четыре животных в каждой, введением 5-10 х 1010 КОЕ/кг живых клеток Е.сой.
Группа, получавшая плацебо, служила контролем для тех групп павианов, которым внутривенно вводили κΤΝΕΒ-Ι 4Э/С105бЬ (0,2 мг/кг веса тела [ВТ]), κΤΝΕΒ-Ι 3П/С105бЬ (0,2 мг/кг ВТ) или κΤΝΕΒ-Ι 2.6П/С105бЬ (0,2 мг/кг ВТ) или κΤΝΕΒ-Ι 2.6ШС105 бЬ (1 мг/кг ВТ).
При осуществлении обеих фаз части Ι использовали молодых самцов и самок Рарю апиЬ1к (6-11 кг) (В1отеб1са1 Векеагсй Еоипбайоп, 8ап АпЮшо, ΤΧ), которым не давали пищи в течение ночи перед опытом. Животных анестезировали кетамином (10 мг/кг, внутримышечно) и вводили канюлю в краниальную вену. Анестезию поддерживали исходным введением пентобарбитала натрия в дозе до 35 мг/кг и последующими повторными инъекциями пентобарбитала натрия в дозе 3-5 мг/кг/ч. Проходимость верхних дыхательных путей обеспечивали введением эндотрахеальной трубки, что позволяло животным сохранять непроизвольное дыхание. В бедренную артерию вводили катетер, что давало возможность получать повторные образцы артериальной крови, а также постоянно следить за частотой сердечных сокращений и средними значениями артериального давления при помощи сердечного монитора для анестезии Эа!аксоре 2000 ЩИаксоре, 8аи АпЮшо, ΤΧ). К образцам артериальной крови, собираемым через определенные интервалы времени, добавляли Е^ΤА или гепарин для предотвращения свертывания и немедленно охлаждали на льду. Плазматическую фракцию получали центрифугированием при 4°С и хранили затем при -70°С. Температуру контролировали с помощью ректального термометра. Для контроля отделения мочи и клиренса креатинина устанавливали катетер Фоули. Гемодинамические параметры контролировали каждые пятнадцать минут. Всем животным вводили 0,9%-ный хлорид натрия (4 мг/кг) через внутривенную капельницу. В опытах фазы В животные получали дополнительную жидкость (10 мл/кг каждые 15 мин), если совпадали два из перечисленных ниже физиологических параметров: 1) среднее артериальное давление падало более чем на 30%; 2) частота сердечных сокращений повышалась более чем на 30%, и 3) отделение мочи снижалось до <1мл/кг/ч. После забора исходного образца крови и выжидания около 1 ч, необходи мого для установления равновесия, начинали введение белков.
В фазе А части Ι исследования рекомбинантные белки вводили через катетер в краниальную вену и животных наблюдали в течение 8 ч, после чего все катетеры удаляли и животных возвращали в клетки на 21 день. Спустя 24 и 48 ч, а также в дни 3, 5, 8, 11, 16 и 21 животных быстро анестезировали внутримышечной инъекцией кетамина (10 мг/кг) и брали образцы венозной крови. В день 21 животных опять анестезировали, делали вторую инъекцию белка и всю процедуру повторяли по тому же графику еще 21 день, когда животных подвергали эвтаназии.
В фазе В части Ι исследования за один час до введения клеток Е.сой четырем случайно отобранным животным вводили или плацебо, или один из упомянутых выше конструктов. Животных наблюдали в течение 8 ч, после чего все катетеры удаляли и животных возвращали в клетки. У обезьян развивалась бактериемия. Животных с избыточным дискомфортом подвергали эвтаназии. Избыточный дискомфорт определяли согласно М.СИС как: 1) неспособность поддерживать положение сидя или стоя в течение 12 ч; 2) неспособность принимать воду или пищу в течение 12 ч; 3) неконтролируемое кровотечение из мест введения катетеров или 4) отсутствие ответа на внешние стимулы. Образцы венозной крови получали на сроках -1, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24, 48 ч и 3, 5, 8, 11, 16 и 21 день. В день 21 выживших животных подвергали эвтаназии.
Наличие антител к введенным рекомбинантным белкам у Рарю определяли при помощи сэндвич-ЕЫ8А. Коротко говоря, конструкты κΤΝΕΒ-Ι адсорбировали на планшетах для ЕЫ8А (1 мкг/мл), а затем добавляли разведенную (от 1:50 до 1:100,00) плазму павианов (100 мкл). После отмывки проб добавляли конъюгат пероксидазы хрена (№Β) с белком А (0,5 мкг/мл) и тест визуализировали с помощью ТМВ.
Результаты (часть Ι).
У трех конструктов срок полужизни в плазме значительно различался. С использованием независящего от модели метода были определены кривые выведения, и очевидный срок полужизни в плазме был определен между 8 и 172 ч. Среди интактных животных наибольший срок полужизни в плазме был у павианов, обработанных конструктом с 4.0 доменами (29 ч), и последовательно снижался у павианов, обработанных κΤΝΕΒ-Ι 3П/С105бЬ (24,7 ч) и κΤΝΕΒ-Ι 2.6О/С105бЬ (21,5 ч). Разница, хотя и статистически достоверная, составляла только 26%.
Неожиданно, после второго введения павианам соответствующих белков срок полужизни в плазме становился значительно короче, что указывало на более быстрый клиренс. Это снижение срока полужизни было наиболее выра женным у павианов, обработанных κΤΝΡΚ-Ι 4Э/С105бЬ, когда этот срок сокращался на 48% (р<0,01) [фиг. 10]. Снижение срока полужизни было промежуточным у павианов, обработанных κΤΝΡΚ-Ι 3И/С105бЬ (31%) [фиг. 11], и наименьшим у животных, получавших κΤΝΡΚ-Ι 2.6О/С105бЬ (14%) [фиг. 12]. Снижение срока полужизни не было статистически различимым у павианов, обработанных κΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105бЬ.
Все препараты оказались иммуногенны для павианов. Однако частота иммуногенности оказалась наибольшей у павианов, обработанных κΤΝΡΚ-Ι 4Э/С105бЬ, промежуточной у животных, обработанных κΤΝΡΚ-Ι 3О/С105бЬ и наинизшей у животных, получавших κΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105бЬ (табл. 8).
Таблица 8
Пиковые значения антительных ответов1
Первые 21 сутки Вторые 21 сутки
Среднее 25%- 75% Среднее 25%- 75%
κΤΝΡΚ-Ι 4Э/С105бЬ (п=4) 3.20 3.20 3.20 3.95 3.50 4.40
κΤΝΡΚ-Ι 3Э/С105бЬ (п=4) 1.60 0.00 3.65 3.50 1.30 4.75
κΤΝΡΚ-Ι 2.6Э/С105 бЬ (п=4) 0.00* 0.00 1.75 1.45 0.00 3.50
/Логарифмическая шкала (обратные значения разведения плазмы, необходимого для получения полумаксимального поглощения в сэндвич-ЕЫКА; см. Экспериментальные методы) *р=0.056, по двухпараметрическому тесту ΑNΟVΑ Кгивка1-\\'а11ικ (значения трансформированного 1од не отвечают критериям нормальности).
Антительный ответ обычно развивался к восьмому дню после введения конструктов и сохранялся в течение 21 дня исследования. Кроме того, антительный ответ становился сильнее как результат второй инъекции белковых конструктов.
У всех четырех павианов, получавших κΤΝΡΚ-Ι 4И/С105бЬ, были обнаружены антитела. Кроме того, антитела были выявлены у двух из четырех животных, обработанных κΤΝΡΚ-Ι 3И/С105бЬ, и у одного из четырех павианов, получавших κΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105бЬ, также были выявлены антитела. Анализ при помощи программы ΑNΟVΑ по Ι<Γΐ.ικ1<;·ι1-\ν;·ι11ίκ показал, что усиление антительного ответа (трансформированный 1од) значительно варьирует в трех группах в зависимости от времени (р<0,05). Анализ роМ-Нос позволил предположить, что существенное различие в антительных ответах является принципиальным между животными, получавшими κΤΝΡΚ-Ι 4О/С105бЬ и κΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105бЬ, с промежуточными (и несущественными) ответами у животных, получавших κΤΝΡΚ-Ι 3И/С105бЬ.
В двух исследованиях, проведенных на 21 день (р<0,01), наблюдалась зависимость между появлением антител и изменением клиренса. Не удивительно, что у тех животных, у которых после первого введения развился сильный антительный ответ, после второго введения белок выводился быстрее. Изменения в клиренсе между первым и вторым введениями сопоставляли на животных, у которых развился антительный ответ (п=7), и на тех, у которых он не развился (п=5) (фиг. 13).
Антитела, обнаруживаемые в плазме отдельных павианов, исследовали на прямую цитотоксичность при помощи клеток линии МЕ180 и на нейтрализующую способность в тесте на клетках Ь-929. Ни одни из антител, образовавшиеся в ответ на введение трех указанных конструктов, не были ни цитотоксичными, ни нейтрализующими.
В фазе 1 части А исследования на павианах те животные, которые продемонстрировали наивысший антительный ответ, показали и наиболее быстрое повышение клиренса конструктов после второго введения. Таким образом, результаты показывают, что антительный ответ может снижать срок биологической полужизни и, тем самым, терапевтическую эффективность конструктов и потому могут потребоваться корректировки доз. Однако не отмечалось какихлибо побочных клинических реакций на присутствие антител, когда конструкты вводили второй раз. Так, терапевтические усилия, направленные на модификацию таких конструктов с целью снижения их иммуногенности без существенного влияния на срок полужизни или эффективность, должны прежде всего иметь целью уменьшение необходимости в повышении дозы, а не риска побочных реакций.
Результаты. Часть 1. Фаза В.
Наконец, на интактных павианах все три конструкта были примерно одинаково эффективны в предотвращении цитокин-обусловленных повреждений после бактериемии Е.со11 при введении в дозе 1,0 мг/кг Ε\ν. Один из 4 павианов, получавших плацебо, выжил; выжили 4 из 4 павианов, получавших κΤΝΡΚ-Ι 4И/С105бЬ или κΤΝΡΚ-Ι 3И/С105бЬ; и соответственно выжили 3 из 4 павианов, получавших конструкт κΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105бЬ. Все три конструкта предотвращали проявление биологической активности ΤΝΡα и обладали повышенной нейтрализующей способностью.
Часть ΙΙ.
Конкретной задачей части ΙΙ настоящего исследования на павианах было получение ответа на вопрос о том, приводит ли повторяющаяся обработка животных (например, 3 раздельные инъекции) различными конструктами κΤΝΡΚ-Ι к последующей иммуногенности и снижению срока полужизни. Дополнительно данное исследование было направлено на сравнение иммуногенности и фармакокинетики нескольких конструктов κΤΝΡΚ-Ι, включая κΤΝΡΚ-Ι 2.6И/С105бЬ, κΤΝΡΚ-Ι 4И/С105бЬ, κΤΝΡΚ-Ι 2.6Ω/Ν 105-1-ВнРЕО (33 кД) и κΤΝΡΚ-Ι
4Ω/Ν 105-1-ВиРЕС (33 кД). Наконец, данное исследование было направлено на оценку клинической значимости антительного ответа и измененного клиренса при последующем ответе на ΤΝΕα-обусловленные повреждения (бактериемия Е.сой).
В дни 0, 21 и 42 павианам вводили внутривенно 0,2 мг/кг различных конструктов κΤNΕΡ-I 4Э/С 105бЬ, к'1'ΝΕΡ-Ι 2.60/С 105бЬ, кУМЕРЛ 2.6Β/Ν'1 (В-вВпРРС (33 кД) или ^ΝΕΡ-Ι 4Ό/Ν 105-1-ВиРЕС (33 кД) соответственно). В день +63 павианам вводили 2 мг/кг В\У соответствующего конструкта. В день +65 (т.е. 48 ч спустя) павианам вводили летальную дозу Е.сой, как описано выше в части Ι. Основные наблюдения, полученные в части ΙΙ, сводятся к следующему.
Результаты (часть ΙΙ).
В целом, кЕкЕК^ 4Ό/Ν 105-1-ВиРЕС (33 кД) и ^ΝΕΡ-Ι 2.61)/\105-1-ВиРЕС1 (33 кД) имели более продолжительный срок полужизни по сравнению с ΜΝΕ^-Ι 4Э/С105бЬ и κΤNΕΡ-I 2.6Э/С105бЬ у интактных животных, независимо от числа доменов. Срок полужизни варьировал от 30-35 ч для моноРЕСированных форм κΤNΕΡ-I до 10-20 ч для димерных РЕСированных форм. Кроме того, κΤNΕΡ-I 4Ό/Ν105-1
ВиРЕС (33 кД) и ^ΝΕΡ-Ι 4П/С105бй обладали более продолжительным сроком полужизни по сравнению с κΤNΕΡ-I 2.6Ό/Ν 105-1-ВиРЕС (33 кД) и κΤNΕΡ-I 2.6Э/С105бЬ у интактных животных.
κΤNΕΡ-I 412/С'105с1Ь и κΤNΕΡ-I
2.6Э/С105бЬ также оказались иммуногенны со слабой тенденцией к снижению иммуногенности у ^ΝΕΡ-Ι 2.6Э/С105бЬ. Однако только ^ΝΕΡ-Ι 4Э/С105бЬ проявлял пониженный клиренс при повторных введениях. Ни ^ΝΕΡ-Ι 4Ό/Ν 105-1-ВиРЕС (33 кД), ни 2.6Ό/Ν105-1ВиРЕС (33 кД) не оказались антигенными, и скорости их клиренса существенно не менялись при повторном введении.
Сыворотки, полученные от каждого из павианов (Ν=3), которым вводили различные соединения, в дни +21, +42 и +61, были исследованы ίη νίίτο на иммунореактивность (сэндвич ЕЫ8А) с использованием различных конструктов в качестве адсорбированного антигена. Например, сыворотка, полученная в день +21 (табл. 9) от павиана, которому вводили 2.6Ό/Ν105-1ВиРЕС (33 кЭа), не реагировала ни с ^ΝΕΡ-Ι 4О/С105бЬ, ни с κΤNΕΡ-I 4Ό/Ν105, когда данные соединения использовали в качестве адсорбированного антигена в ЕЫ8А.
Таблица 9
Антительный ответ у павианов Ι§Ο (с титром >1:400), день 21
Количество животных η=3 к'ГМГМ 2.6Э/С105аЬ кТОТЕ^ 2.6Ώ/Ν105ΐ-ВиРЕС (33 кД) кТХТ'Р-Ι 4Ώ/Ν105ΐ-ВиРЕС (33 кД) κТNΕΡ-I 4Э/С105ΐ-ВиРЕС (33кД) 8ΤΝΕΡ-Ι 4Э/С105аЬ к'ГХПМ 4Ώ/Ν105
^ΕΡ-Ι 2.6Ώ/Ν105-1- ВиРЕС(33кД) 3/3 отр 3/3 отр 3/3 отр
^ΕΡ-Ι 2.6Э/С1050Ь 3/3 отр 3/3 отр 3/3 отр
^ΕΡ-Ι 41)\ 105-1-ВиРЕС (33 кД) 3/3 отр 3/3 отр 3/3 отр
^ΕΡ-Ι 4Э/С105-1- ВиРЕС (33 кД)
^ΕΡ-Ι 4Э/С105 аЬ 1/3 реакт. (400) 3/3 отр
Положительной реакцией считался антительный ответ с титром >1:400. Данные для дней +42 и +61 приведены в табл. 10 и 11. Важно, что наблюдалась положительная реакция ίη νίΐΓΟ с сывороткой, полученной от одного из павианов, ранее обработанного 2.6Ό/Ν105-1ВиРЕС (33 кД) при ее тестировании с ^ΝΕΡ-Ι 4Э/С105бЬ в качестве адсорбирующего антигена (табл. 11).
Таблица 10
Антительный ответ у павианов ЦС (с титром 1:400), день 42
Количество животных η=3 8ΤΝΕΡ-Ι 2.6Э/С105аЬ кТХТ'Р-Ι 2.6Ώ/Ν105ΐ-ВиРЕС (33 кД) ^ΕΡ-Ι 4Ώ/Ν105ΐ-ВиРЕС (33 кД) ^ΕΡ-Ι 4Э/С105ΐ- ВиРЕС (33 кД) 8ΤΝΕΡ-Ι 4Э/С105аЬ ^ΕΡ-Ι 4Ώ/Ν105
^ΕΡ-Ι 2.6Ώ/Ν105-1- ВиРЕС (33 кД) 3/3 отр 3/3 отр 3/3 отр
^ΕΡ-Ι 2.6Э/С105аЬ 1/3 реакт. (1600) 3/3 отр 3/3 отр
^ΕΡ-Ι 4Ώ/Ν105-1- ВиРЕС (33 кД) 3/3 отр 3/3 отр 3/3 отр
к'ГМГМ 4Э/С105-1-ВиРЕС (33 к1)а)
^ΕΡ-Ι 4Э/С105аЬ 2/3 реакт. (3200) 2/3 реакт. (800)
Таблица 11
Антительный ответ у павианов 1дС (с титром >1:400 ), день 61
Количество животных п=3 8ΊΝΓΚ-Ι 2.6Э/С1050Ь зЮТКЛ 2.6Ώ/Ν105- 1-ВиРЕС (33кЭа) зЮТКМ 4Ώ/Ν105- 1-ВиРЕС (33кЭа) зЮТКМ 4Э/С105- 1-ВиРЕС (33кЭа) δΙΝΓΚ-Ι 4Э/С1050Ь зЮТКЛ 4Ώ/Ν105
зЮТК-1 2.6Ώ/Ν105-1- ВиРЕС (33 кД) 3/3 отр 1/3 реакт. (1600) 3/3 отр
зЮТК-1 2.6Э/С1050Ь 2/3 реакт. (204800) 1/3 реакт. (1600) 1/3 реакт. (3200)
зЮТК-1 4Ώ/Ν105-1- ВиРЕС (33 кД) 3/3 отр 1/3 реакт. (6400) 1/3 реакт. (6400)
зТ\ГР-14ПС105-1- ВиРЕС (33кЭа)
зЮТКЛ 4Э/С1050Ь 1/3 реакт. (6400) 3/3 реакт. (12800)
У павианов, ранее получавших конструкты три раза, эффективность ответа на ΤΝΕопосредованные нарушения была наибольшей при введении (1) зТ№К-1 4Э/С105бЬ. (2) зТМРК-Ι 2.6О/С105бЬ, (3) δΙΝΓΚ-Ι 4Ό/Ν105-1ВиРЕС (33 кД) и (4) 2.6Ό/Ν105-ΐ-ΒυΡΕ6 (33 кД) (что определяли по выживанию, мультисистемным нарушениям органов (М80Р), уровню 1Ь-6 в сыворотке и количеству белых клеток крови). Необходимо иметь в виду, что данный опыт не учитывал различий в ТЛР-нейтрализующей активности различных конструктов.
С. Шимпанзе.
Целью настоящего эксперимента была оценка иммуногенности различных форм зТ№В-1, повторно вводимых шимпанзе внутривенно в течение 1 месяца. Формами зЮТКП, исследованными в данном эксперименте, были зЮТКП 2.6б/С105бЬ, зТ\£К-1 4П/С105бЬ, зЮТКП 41)/С‘105-1-ВиРЕС (33 кД), зТ\ЕК-1 ЗАО^НЕМ-ВиРЕС (33 кД), зТ\ЕК-1 4Ό/Ν105-1ВиРЕС (33 кД). В каждую группу входило 3 шимпанзе. Дозировка и параметры эксперимента были следующими: каждому шимпанзе вводили тестируемое вещество в виде внутривенной болюсной инъекции в дозе 0,1 мг/кг (всего 8 доз). Объем дозы варьировал в зависимости от концентрации тестируемого вещества. В день 0 до начала обработки от каждого животного брали образец сыворотки объемом 5 мл. Дополнительные образцы сыворотки брали непосредственно перед введением препаратов в дни 7, 14, 21 и 28.
Предварительные данные иммуногенности у шимпанзе представлены в табл. 12.
Таблица 12
Титр антител 1дС (количество шимпанзе)
День 0 () День 7 (2 дозы) День 14 (4 дозы) День 21 (6 доз) День 28 (8 доз)
зЮТКЛ 2.6Э/С1060Ь 100(1) 400(1) 1600(1) 3200(1) 800(1) 3200(1)
зЮТКЛ 41)С105с1Ь 3200(1) 400(1) 1600(1) 800(2) 12800(1)
зЮТКЛ 4П/М05-1-ВиРЕС (33 кД)
зЮТКЛ 2.61 Т^ЮЗЧ-ВиРЕС ί (33 кД)
зЮТКЛ 4П/М05-1-ВиРЕС (33 кД) 200(1)* 1600(1) 100(1)* 400(1)
* Примечание: титры определяли, используя в качестве адсорбированного антигена зТ\ТР-1 4Э/С105йЬ
К дню +28 все животные (N=3), обработанные зЮТВ-1 4Э/С105бЬ или зЮТВП 2.6О/С105бЬ, дали положительную реакцию (о которой судили по результатам ЕЫ8А) с наивысшим титром 1:12,800 или 1:3200 соответственно (табл. 12). (Примечание: в этой части эксперимента использованы все иммунизирующие антигены, соответствующие адсорбированным на планшетах для ЕЬ18А антигенам). Одно из животных, обработанных зЮТВП 4Ω/Ν105-1-ВиРЕС (33 кД) имело положительную антительную реакцию по состоянию на дни +21 и +28 (табл. 12). Важно, что ни одно из животных, обработанных зЮТКП 4Э/С105-1ВиРЕС (33 кД) или зТ\1Л-1 2.61)/\105-1-ВиРЕС, (33 кД) не ответило выработкой анти-зЮТКП антител за все время эксперимента (табл. 12).
Как описано выше в разделе, посвященном экспериментам на павианах, сыворотки, полученные в день +28 от каждого шимпанзе (N=3), обработанного различными формами зЮТКП, исследовали ίη νίίτο на иммунореактивность (ЕЫ8А) с другими конструктами с использованием форм зЮТК-1 в качестве адсорбирующего антигена. Положительной реакцией считался антительный ответ с титром >1:400. Важно, что сыворотки, полученные от шимпанзе, которым вводили зЮТКП 2.6П/М05-1-ВиРЕС (33 кД) не реагировали ни с зТ№В-1 4О/С105бЬ, ни с зЮТКП 4Ό/Ν105, когда эти соединения использовали в качестве адсорбирующего антигена в ЕЫ8А (табл. 13).
Таблица 13
Антительный ответ у шимпанзе (ГдО с титром >1:400)
Количество животных п=3 кТМ'К-Г 2.6Б/С105бЬ кЮТК.-1 2.6Ώ/Ν105!-ВиРЕО (33 кД) 8ЮТК.-1 4Ώ/Ν105- !-ВиРЕО (33 кД) кТМ'К-Г 4Б/С105-!ВиРЕО (33 кД) 8ΤΝΡΡ-Ι 4Б/С105бЬ 8ΤΝΡΡ-Ι 4Ώ/Ν105
κΤΝΡΡ-Ι 2.6Ώ/Ν105-!- ВиРЕО (33 кД) 3/3 отр 3/3 отр 3/3 отр
κΤΝΡΈ-Ι 2.6Б/С105бЬ 3/3 реакт. (3200) 2/3 реакт. (3200) 1/3 реакт. (400)
κΤΝΡΈ-Ι 4Ώ/Ν105-!ВиРЕО (33 кД) 2/3 реакт. (1600) 2/3 реакт. (3200)
κΤΝΡΡ-Ι 4Б/С105-!- ВиРЕО (33 кД) 3/3 отр 1/3 реакт. (400) 3/3 отр
κΤΝΡΈ-Ι 4Б/С105бЬ 3/3 реакт. (12800) 3/3 реакт. (6400)
Аналогичные данные получены для животных, обработанных ΚΤΝΡΡ.-Ι 4Э/С105бЬ, κΤΝΡΡ-Ι 4П/С105-!-ВиРЕО (33 кД) или κΤΝΡΡ-Ι 4П7Ы105-!-ВиРЕО (33 кД) (табл. 13).
Пример ГУ.
ЕАЕ представляет собой острое или хроническое возобновляющееся воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), возникающее в результате сенсибилизации генетически чувствительных животных нейроантигенами, такими как основный белок миелина (МВР). ЕАЕ хорошо известно из уровня техники и часто используется в качестве животной модели острого рассеянного склероза человека.
Самок крыс Льюис Цасккоп ЬаЬога!опек, Ваг Ш-пЕог, МЕ) в день 0 подвергали анестезии и иммунизировали в подушечки лап левой задней конечности 0,1 мл эмульсии, содержащей основный белок миелина (МВР) в полном адъюванте Фрейнда, разбавленном фосфатным буферным раствором (РВБ) и смешанным с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (СΡА), содержащего 5 мг/мл МусоЬас!егшт !иЬегси1ок1к Η37Κ- (ЭГГсо ЬаЬ МГ). Контрольным крысам вводили в подушечки лап левой задней конечности 0,1 мл эмульсии РВБ/СΡА без МВР.
Клиническая оценка заболевания основывалась на обычной системе счета 0-5. Разброс показателей был следующим: 0, норма; 0, 5, частичная утрата тонуса хвоста; 1, полная утрата тонуса хвоста; 2, дрожание одной задней конечности; 3 паралич обеих задних конечностей; 4, болезнь; 5, гибель. Все инъекции конструктов κΤΝΡΡ-Ι или носителя проводили в дозе 1 мг/кг подкожно каждый второй день, начиная с 9 дня после иммунизации. Всех животных забивали на 21 день. Результаты представляли в двух формах: острота клинических проявлений в зависимости от времени и интегральная клиническая оценка каждой крысы в ходе всего заболевания, вычисленная как площадь под кривой зависимости ежедневной клинической оценки от времени. Значения интегральной клинической оценки для экспериментальных групп обрабатывали статистически по сравнению с таковыми для контрольной группы с использованием теста Манна-Уитли.
У животных, получавших только носитель, вспышка заболевания наблюдалась около десятого дня, заболевание достигало пика ко дню 16 и затем ослабевало. κΤΝΡΡ-Ι 4Ь/С106бЬ ослаблял клинические симптомы приблизительно на 73% при сравнении с животными, получавшими только носитель. бЮТК.-! 4Ь/С106-1-ВиРЕС (33 кД) также ослаблял клинические симптомы приблизительно на 85%. κΤΝΡΈ-Ι 4Ь/С105-!ВиРЕО (33 кД) и κΤΝΡΡ-Ι 2.6Ό/Ν 105-!-ВиРЕО (33 кД) обладали примерно одинаковой способностью ослаблять клинические симптомы (64 и 57% соответственно).
В заключение следует отметить, что усеченные κΤΝΡΒκ эффективны при ослаблении отдельных клинических проявлений при тестировании на данной животной модели рассеянного склероза.
Объем настоящего изобретения не ограничивается описанными вариантами его осуществления, которые иллюстрируют отдельные аспекты изобретения. Различные модификации изобретения, в дополнение к приведенным, будут очевидны для квалифицированного специалиста из предшествующего описания.
100
Список последовательностей (1) бЗДБЯАЬ ΙΝΓΟΒΜΑΤΧΟΝ:
(ί)
ΑΡΡΠεΛΝΤ: АМСЕЛ 124С.
(2) ΧΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 3X0 ХО N0:2:
(1) ЗЕОРЕНСБ СМЛЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(А) ьгмвТЯ: 161 ад1по ас1дз (В) ΤΥΓ8: ’адйао ас!й (Б) ТОРОЬОСТ: Ппеаг
Ιϋ)
ТХТЬЕ ΟΓ ΧΝνΕΝΤΧΟΝ: ΤΑϋΝΟΑΤΕΟ ЗОРОВРЕ ТОМОЯ ЫЕСТОЗХЗ ΤΥΡΕ-1 ΑΝΒ Τ»8-ΧΧ ЯЕСЕРТОЯ5
ЕАСТОЯ (Их)
ХПМВЕЯ ОГ ЗЕОЦЕЛСЕЗ: 81 (11) МСЬЕСиЪЕ ΤΥΡΕ: ρΕΟΕβΙη (х!) ЗЕОиЕЯСЕ ОЕЗСХХРТХОЫ: ЗЕО ГО N0:2 (1ν)
СОЯЯЕЗРСЫОЕЯСБ АООЯЕЗЗ:
(A) (B) (C) (О) (Б) (Г)
АООЯЕЗЗБЕ: ΑΜ6ΕΝ ХЫС.
ЗТЯББТ: 1340 Р« Ηβνίΐΐιηά Οτίνβ СХТТ: ТЛоизапб Оакз
ЗТАТБ: СаХхЕогаха
ССРНТЯТ: из
ΖΧΡ: 91320-1789 (ν)
ССМРОТЕЯ ЯБАОАВЬБ ГОЯМ:
(A) (B) (C) (О)
МЕРХРМ ΤΥΡΕ: Είορργ Охзк ССМРОТЕЯ: ХВМ РС сслрасхЫе ОРЕЯАТИПЗ 3Υ3ΤΕΜ: РС-РОЗ/МЗ-РО5
ЗОГТНАЯБ: РасвпЕХп КеХеазе »1.0, Уегзхоп »1.30 (νχ)
ОТКЯЕЛТ АРРРХСАТ1ОЫ ΟΑΤΑ: (Α) ΑΡΡΡΙΟΑΤΙΟΝ ЫЦМВЕЯ: <з) гхыяс πάτε: (ο ορα55:γχοατιον;
(νϋ)
РЯХОЯ АРРЬХСАТХОЫ САХА:
(A) ΑΡΡΡΙΟΑΤΙΟΝ {ПЛОДЯ: СЗ 60/021, 443 (B) ГХЬХ№ ОАТЕ: 09-ΛΊ.-Χ996 (νίί)
РЯХОЯ АРРРХСАТХОМ РАТА:
(A) АРРЫСАТХОИ КЦМВЕЯ: 03 60/032, 534 (B) ГХЫМО ОАТЕ: 06-ОЕС-1996 (νϋ) РЯХОЯ АРРЫСАТХОЫ РАТА:
(A) АРРЫСАТ10Ы (ПЛОДЯ: ОЗ 60/037,737 (B) ГХЬХНС РАТЕ: 23-1ΑΝ-1997
Авр ЗвЕ Уа1 Суз Рео С1а С1у Ьуз Туг ХХв Н1з Рео 31а Азп Азп ЗвЕ
1 5 10 15
11· Суз Суз ТЬг Ьуз Суз Н13 Ьуз 61у ТЬе Туг Ьеи Туг Азп Азр Суз
20 25 30
Рго <ЗХу Рео <31у 61п лар ТЬг Азр Суз Агд О1и Суз 31и ЗвЕ СХу Зег
35 40 45
РПв ТЬг АХа Зав 01и Азп Нхз Ьеи АЕд Н13 Суз Ьеи ЗвЕ Суз Зег Ьуз
50 55 60
Суз Агд ьуз вХи Иве вХу С1п УаХ ЗХи XX· Зое ЗвЕ Суз ТЬг УаХ АЗР
65 70 75 80
Агд Аар ТЫ νβΐ Суз вХу Суз Азд Ьуз Азп ЗХп Туг Агд Нхз Туг Тгр
85 90 95
8«е 01ц Азп Ьви РЬв <51п Суз РЬв Азп Суз ЗвЕ Ьеи Суз Ьви Азп СХу
100 105 ПО
ТЫ Уа1 Нхз Ьви ЗвЕ Суз О1п (ЗХи Ьуз ОХп Азп ТЬе УаХ Суз ТЬе Суз
115 120 Х25
Нхз А1а <31у РЬе РЬе Ьви Ахд ЗХи Азп <31и Суз УаХ Зег Суз ЗвЕ Азп
130 135 140
Суз Ьуз Ьуз ЗвЕ Ьви вХи суз ТЬг Ьуз Ьеи Суз Ьеи Рео (ЗХп 11е СХи
ΙνϊίΙ РЯХОЯ ΑΡΡΙΧΟΑΤΙΟΝ РАТА:
(A) АРРЬХСАТХСИ {ПЛОДЯ: ОЗ 60/039,314 (B) ΓΙΡΧΝΟ ОАТЕ: 07-ГЕЗ-1997 (νϋ) РЯХОЯ АРРХ.ХСАТХСН РАТА:
(Л) АРР1ХСАТХОЫ НРМВБЯ: РЗ 60/039,792 (В) ГХЬХМв РАТЕ: 04-МАЯ-1997
145 150 153 160
Азп
(2) ΧΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 5£0 ΙΟ N0:3:
(νίϋ> ΑΤΤΟΒΝΕΥ/ΑβΕΝΤ ΙΝΕΟΡΜΑΤΣΟΝ:
(A) (B) ЯБ8Х5ТЯАТХ0Н (ПЛОДЯ:
(C)
НАМБ: ΖίηύΓίοΧ, Тботаз 0.
32,185 ЯБТЕЯЕКСБ/ОССКБТ МЦМВЕЯ: А-415Е
(1) 5Е0РЕМСЕ СНАИЛСТЕЯХЗТ1С5: (Α) 1ΕΝ6ΤΗ: 332 Ьазв раХгз (B) ΤΥΡΕ: пие1«1с ас!<± (C) 3ΤΒΑΝ0ε&ΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΙΛβΥ: ипкпомп (11) МОЬЕОТЪЕ ΤΥΡΕ: сОИА (1х) ГЕАТиЯЕ:
(Α) ΝΑΜΧ/ΚΕΥ: СОЗ (В) ЬОСАТХОЫ: 4..324 (χί) ЗЕОСЕЯСЕ РЕЗСХХРТГОЯ: ЗЕО ΙΟ N0:3
САТ АТС САС лес ОТТ тсс ССС САА ССА ААА ТАС АТС САС СОТ САЛ ААТ 48
Мес ЛЗр ЗвЕ Уа1 Суз Рео ЗХп 31у Руз ТуЕ Не а±з РЕО СХп АЗП
1 5 10 15
ЛАТ ТСС АТТ тсс ТОТ АСС ААС ТСС САС ААА ОСА лее ТАС ТТЗ ТАС ЛАТ »6
Азп Зег Не Суз Суз ТЬе Руз Суз Нхз Руз СХу Тбг Туг Рви Туг Азп
25 30
САС ТОТ ССА ОСС ССС ОСС САС <5АТ АСО САС ТСС АСС САС ТОТ САЗ АСС144
Азр Суз Рео С1у Рго С1у СХп Азр ТЬе Азр Суз Агд С1и Суз С1и Зег
4045
ССС ТСС ТТС АСС ССТ ТСА САА ААС САС СТС АСА САС ТСС СТС АСС ТСС192
С1у Зег Рбе ТЬг А1а Зег СХи Азп Нхз Реи АЕд Нхз Суз Рви ЗегСуз
5560
ТСС АЛА ТСС ССА ААС САА АТС ССТ САС СТС (ЗАО АТС ТОТ ТОТ ТСС АСА240
ЗвЕ Руз Суз Ахд Руз СХи Мес С1у С1п УаХ СХи Не Зег Зег СузТЬг
7075
СТС САС ССС САС АСС СТС ТОТ ССС ТСС АСС ААС ААС САС ТАС ССС САТ 288
УаХ Азр АЕд Азр ТЬе УаХ Суз С1у Суз Асд Руз Азп С1п Тут Агд Нхз
80 85 90 95
ТАТ ТСС ЛОТ САА ЛАС СТТ ТТС САС ТСС ТТС ТСС ТСА ТАСЗАТСС
Туг Тгр ЗвЕ ЗХи Азп Реи Рбе 81п Суз Рбе Суз *
100 105
(2) ΣΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ΙΟ N0:4:
(х) згаиздсЕ СЯАЯАСТЕЯ13ТХСЗ:
(Л) ΡΕΝ3ΤΗ: 107 атХпо асИз
(9) ΤΥΡΕ: аяйпо асХб
(0) Τ0Ρ0Ρ03Υ: ХХпеаг
(И) МОРЕОТРЕ ΤΥΡΕ: рЕОСехп
(XX) ЗЕОСЕНСЕ ОЕЗСЯХРТХСИ: ЗЕО ΣΟ N0:4:
Мес Азр Зег УаХ Суз Рео 81п ЗХу Руз Туг Не Н1з Рго СХл Азп Азп
1 5 10 15
Зсе Не Суд Суз ТЬг Руз Суз Нхз Руз С1у Тбг Туг Реи Туг Азп Лзр
20 25 30
Суз Рео С1у Рео ЗХу ЗХп Азр Тбг Лзр Суз Агд 61и Суз СХи Зег С1у
35 40 45
Зег Рбе Тбг АХа Зег ЗХи Азп НХз Реи Агд Нхз Суз Реи Зег Суз ЗвЕ
50 55 60
Руз Суз Агд Руд ЗХи Мее С1у СХп УаХ С1и Не Зег Зег Суз ТбЕ УаХ
65 70 75 80
101
102
Азр Ахд Азр ТНе ν·1 Суз С1у Суз Ахд Вуз Азп ЗХп Туг Ахд Н1з Туг
85 90 95
ТЕр Зег СХи Аза Веи РН· СХп Суз РН· Суз ·
100 105
(2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ХВ N0:5:
(1) ЗЕОЦЕКСВ СНАЯАСТВЯХЗТ1СЗ:
(A) ΒΕΝΒΤΗ: 339 Ьазе ра1хз (B) ΤΥΡΕ: писХ«1с ас14 (C) 8ΤΑΑΗΟΕΟΝΪ53: шкпомп (В) Τ0Ρ0Β03Υ: ипкпоеп <ίί) МОЬгСШЕ ΤΥΡΕ: СОМА (1х> геатояе:
(Λ) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СЭЗ (В) ΙΛΟΑΤΙΟΝ: 4..333 (χί) δΒΟυΕΝεε ОЕЗСВХРТХОИ: 5ЕО 10 N0:5:
САТ АТС САС м«е Азр 1 АСС СТТ ТСС ССС САА ССА ААА ТАТ АТС САС ССТ САА ААТ
ЗвЕ УаХ Суз 5 РЕО СХп 31у Вуз Туг 10 XX· Нхз Рго ЗХп Азп 15
ЛАТ тез АТТ ТСС ТСТ АСС ААС ТСС САС ААА ССА АСС ТАС ТТС ТАС ААТ
АЗП 8«Е XI· Суз Суз ТНе Вуз Суз Н13 Вуз СХу ТНг Туг Веи Туг Азп
20 25 30
САС ТСТ ССА ссс ССб сев САС САТ АСЗ ВАС ТСС АЗС ЗАЗ тзт ЗАЗ АСС
Азр Суз Рео СХу Рго СХу 61п Азр ТНг Азр Суз Агд СХи Суз ЗХи Зег
35 40 45
ССС тсс ТТС АСС ССТ ТСА САА ААС САС СТС АЗА САС ТСС СТС АЗС ТСС
СХу Зег РЬе Тле АХа ЗвЕ СХи Азп И13 Ьеи Агд Наз Суз Веи Зег Суз
50 55 60
ТСС ААА ТСС С6А ААС САА АТС ССТ САЗ СТС САС АТС ТСТ ТСТ ТСС АСА
Зег Вуз Суз Ахд Вуз СХи Мен СХу СХп Уа1 31-4 IX· 5·: Зег Суз ТНГ
65 70 75
СТС САС ССС САС АСС СТС ТСТ ссс ТСС лес АЛЗ ЛАС САЗ ТАС ССС САТ
Уа1 Азр Ахд Азр ТЬг уах Суз СХу Суз Агд Вуз Азп ЗХп Туг Агд Н13
80 85 90 95
ТАТ ТОО АСТ САА ААС СТТ ТТС САО ТСС ТТС ААТ ТСС ТСТ СТО ТАЛ Туг Тгр Зег С1и Азп Ьеи РНе СХп Суз РН· Азп Суз Зег Ьеи *
100 103 110
АЛЗСТТ (2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ХО N0:6:
(1} 5Е0ЦЕНС5 СНАВАСТЕЯ15ТХС8:
(A) ВИЮТН: 110 ааХпо ас14з (B) ΤΥΡΕ: ав1по ас!Н (В) Τ0Γ0Β06Υ: Х1пеаг
144
192
240
288
333
339
ВАС Азр ТСТ ССА ССС ССВ ВВС САВ САТ АСВ ВАС ТСС АСС ВАС ТСТ ВАС АВС
Суз Рго С1у 35 РЕО СХу СХп Азр ТЬе Азр 40 Суз Ахд СХи Суз СХи 45 Зег
93С ТСС ТТС АСС ССТ ТСА САА ААС САС СТС АСА САС ТСС СТС АВС ТСС
ЗХу Зег РЬе ТНе АХа Зев СХи Азп Нхз Веи Агд Н1з Суз Веи Зег Суз
50 55 60
ТСС ААА ТСС ССА ААС ВАЛ АТС ВОТ САВ СТС ЗАВ АТС ТСТ тст тсс АСА
Зег Вуз Суз Ахд Вуз СХи Мен С1у СХп УаХ СХи Х1е Зев Зег Суз ТНе
65 70 75
СТС САС СОЗ САС АСС СТС ТСТ ССТ ТСС АВС ААС ААС САЗ ТАС СВЗ САТ
7*1 Азр Ахд Азр ТЬг УаХ Суз ЗХу Суз Агд Вуз Азп ВХп Туг Ахд Н13
80 85 90 95
ТАТ ТСС АСТ ЗАД ЛАС СТТ ТТС САС ТСС ТТС ААТ ТАД ТА66ВАТСС
Туг Тгр Зег 81и Азп Ьеи РЬе ЗХп Суз РЬе Азп
100 105
(2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 5Е0 ГО N0:8;
(1) ЗЕОПЕЫСВ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(А) ΒΕΝ3ΤΗ: 107 ао!по ас!4з
(В) ΤΥΡΕ: ая!по ас1С
(О) ΤΟΡΟΒΟΟΥ: Нпеаг
(11) МОВЕСТВЕ ΤΥΡΕ: ргосехп.
(χίΐ βεοϋΕΝΟΒ ввзсяхртхоы : 8Е0 ГО N0:8:
мен Азр Зег У*1 Суз Рео СХп С1у Вуз Туг XI· Нхз Рго ЗХп Азп Азп
1 5 10 15
Зег Не Суз Суз ТЬх Вуз Суз Нхз Вуз ВХу ТНе Туг Ьеи Туг Азп Азр
20 25 30
Суз Рго С1у Рго 81у СХп Азр ТНе Азр Суз Авд СХи Суз 81и Зев ВХу
35 40 45
Зег РЬе ТНе АХа Зег СХи Азп Нхз Веи Ахд Н1з Суз Веи . Зев Суз Зег
50 55 60
Вуз Суз Ахд Вуз СХи мен 31 у СХп 7а1 СХи IX· 3«е Зев Суз ТНе : УаХ
65 70 75 80
Азр Ахд Азр ТНе УаХ Суз ЗХу Суз ; Ахд Вуз Азп 31п Туг Ахд Нх: ( Туг
85 90 95
Тгр Зег ЗХи Азп Веи РЬе ЗХп ί Суз ί рне Азп 1 ·
100 105
(2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:9:
(ί) ΪΕΟϋΒΝΟΞ СЯАЙАСТЕЯ15Т1СЗ: (Λ) ВЕЯЗТЯ: 289 Ьазе раххз (B) ΤΥΡΕ: писХе1с ас!й (C) 3ΤΒΛΝΒΕΒΝΒ53: ипкпоип (В) ΤΟΡΟΒ03Υ: ипкпомп (Н) МОВЕСТВЕ ΤΥΡΪ: сОМА (1х) ГЕЛИИ:
(А) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СВЗ (В> ЬОСАТЮН: 4..279
144
192
240
288
333 (11) МОВЕСТВЕ ΤΥΡΒ: ргонеХп (χί) ЗЕОЦЕЫСЕ 0Ε3Ο<ΧΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:6:
мае Азр Зег 7*1 Суз Рго ЗХп ЗХу Ьуз Туг XI· Н13 гхо ЗХп Азп Азп
1 5 10 15
8«г XX· Суз Суз тнг Вуз Суз Нхз Ьуз СХу ТНе Туг Веи Туг Азп Азр
20 25 30
Суз Рго ЗХу РЕО ЗХу СХп Азр ТНЕ Азр Суз Агд СХи Суз СХи Зег ЗХу
35 40 45
ЗОЕ РН· ТНг АХа Зег СХи АЗП Нхз Ьеи Агд Нхз Суз Веи 8ег Суз 5ег
50 55 60
Ьуз Суз Агд ьуз СХи мен СХу СХп ν*ι СХи XX· Зег Зег Суз ТНг 7а X
65 70 75 80
Азр Ахд Азр ТНе УаХ Суз ЗХу Суз Лсд Вуз Азп ЗХп Тус Ахд Н1з Туг 85 90 95
Тхр Зег С1и Азп Веи РЬе ЗХп Суз РЬе Азп Суз 3«е Ьеи * 100 105 110 (2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 5Е0 ΣΒ N0:7:
(ί) ЗЕООТХСЕ СНАЯАСТЕК18ТХСЗ:
(A) ΒΕΝ3ΤΗ: 333 Ьазе раХгз (B) ΤΥΡΕ: пис!е1с асхС (C) ЗТЯАЫОБВЫСЗЗ: ипкпеип (В) Τ0Ρ0Β03Υ: ипкпоип
Ιίί) МОВЕСТВЕ ΤΥΡΕ: сОИА (χί) ЗБОиВКСВ ΟΕδΟΒΧΡΤΧΟΝ: 8Е0 10 N0:9:
САТ АТС ТСТ АСС ААС ТСС САС ААА СЗА АСС ТАС ТТС ТАС ААТ ВАС ТСТ
мен X Суз ТЬг Вуз Суз К1з 5 Вуз СХу ТНе Тув 10 Веи Туг Азп Азр Суз 15
ССА ВВС ССВ 633 САЗ ВАТ АСЗ ВАС тзс АЗС САС ТЗТ САВ АЗС ОСС ТСС
Рго ЗХу Рео ВХу ВХп АЗР ТНе Азр Суз Ахд ЗХи Суз ЗХи Зег СХу Зег
20 25 30
ТТС АСС ест ТСА ЗЛА ААС САС СТС АВА САС ТЗС СТС АЗС ТЗС ТСС ААА
РЬе ТЬе АХа Зев СХи АЗП Н1з Веи Ахд К1з Суз Веи Зег Суз Зев Ьуз
35 40 45
ТСС СОА АЛЗ ВАЛ АТС 63Т САЗ отз ЗАЗ АТС ТСТ ТСТ ТЗС АСА зтз ВАС
Суз Ахд Вуз ЗХи Мен ЗХу ЗХп УаХ ЗХи ХХе Зев Зег Суз ТНх УаХ Азр
50 55 60
СВЗ ВАС АСС СТС ТЗТ ВВС ТСС АЗС ААС ААС САЗ ТАС СВЗ САТ ТАТ тез
Ахд Азр ТНе ν*1 Суз 31у Суз Авд Вуз Азп ЗХп Туг Агд Н13 Тув Тгр
65 70 75
АВТ САА ААС СТТ ТТС САЗ ТСС ТТС ААТ ТСС ТСТ СТЗ ТАА ААССТТ
Зег СХи Азп Ьеи РНе СХп Суз РЬе Азп. Суз Зег Веи
80 85 90
144
192
240
285 (ίχ) ΓΕΛΤϋΗΕ:
ΙΑ) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СОЗ (3) ВССАТХОЫ: 4..324 (х!) ЗЕОСЕИСЕ ВЕЗСЯХРТХОМ: ЗЕ<2 ΣΒ N0:7:
САТ АТС ВАС АВС СТТ ТСС ССС САА ССА ААА ТАТ АТС САС ССТ САА ААТ
Мен Азр Зег Уах Суз РЕО ЗХп СХу Вуз Туг IX· Н13 р£0 СХп Азп
X 5 10 15
ЛАТ тсс АТТ ТСС ТСТ АСС ААС ТСС САС ААЛ ССА лее ТАС ТТС ТАС ААТ
Азп Зег XX· Суз Суз ТЬе Вуз Суз Н1з Вуз СХу ТНг Туг Веи Τντ Азп
20 25 30
(2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:10:
(1) ЗЕОВЕЯСЕ СНАЯАСТЕЯ15ТХСЗ:
(A) ΒΕΝ3ΤΗ: 92 ат!по асьйз (B) ΤΥΡΕ: аш1по ас14 (О) ΤΟΡΟΒΟΟΥ: Нпеав (11) МОВЕСТВЕ ΤΥΡΕ: ргонеХп (х!) ЗЕОУЕЫСЕ ОЕЗСЯХРТЮЫ: ЗЕЭ ХО N0:10:
Мес Суз ТНе Вуз Суз М1а Вуз ЗХу ТНг Туг Веи Туг Азп Азр Суз Рго 15 10 15
61у РЕО 31у ЗХп Азр ТНе Азр Суз Агд СХи Суз ЗХи Зе: ЗХу Зег РН· 20 25 30
103
104
ТЬх АХа Зег СХи Азп Нхз Ьеи Агд Н1з Суз Ьеи Зег Суз Зег Ьуз Суз
33 40 45
Агд Ьуз С1и мее СХу СХп УаХ СХи Х1е Зег Зег Суз ТЬх УаХ Азр Агд
50 55 60
Азр тьг V»! Суз СХу Суз Агд Ьуз Азп СХп Туг Агд Нхз Туг Тгр Зег
65 70 75 80
С1и АЗП Ьеи РЬе СХп Суз РЬе Азп Суз Зег Ьеи •
90 (2) ΧΝΓΟΗΜΑΤΧΟΝ РОЯ ЗЕО Ιϋ N0:11:
(1) 5ΕΟϋΕΝΟΣ СХАЯАСТЕЯХЗТХСЗ: (Λ) ЬЕМЭТ.Ч: 315 Ьазе ра±гз (B) ΤΥΡΕ: писЬехс ас1й (C) 3ΤΑΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпомп (О) ТОРОЬОСТ: ипкпомп (11) МСЬЕССЬЕ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ . . (1х) ГЕАТСЯЕ:
(А> ΝΑΜΕ/ΧΕΥ: СОЗ (В) ЬОСАТХОИ: 4..309 (хх) ЗЕОТЕИСЕ ОЕЗСНХРТХОЫ: ЗЕО Ю N0:11;
САТ АТС ТАТ АТС САС ССТ САА ААТ ААТ ТСС АТТ ТСС ТСТ АСС ААС ТСС 48
Мес Туг Х1е Нхз Рго СХп Азп АЗП Зег ХХе Суз Суз ТЬх Ьуз Суз
1 5 10 15
САС ААА ОСА АСС ТАС ТТС ТАС ААТ САС ТОТ ССА ССС ССС ССС САС САТ 96
Нхз Ьуз С1у ТЬг Ту; Ьеи Ту; Азп Азр Суз Рго С1у Рго С1у С1п Азр
25 30
АСС САС ТСС АСС САС ТОТ САС АСС ССС ТСС ТТС АСС ССТ ТСА САА ААС144
ТЬх Азр Суз Лхд СХи Суз СХи Зег СХу Зег РЬе ТЬх АХа Зег С1и Азп
4045
САС СТС АСА САС ТСС СТС АСС ТСС ТСС ААА ТСС ССА ААС САА АТС СОТ192
Н1з Ьеи Ахд Н1з Суз Ьеи Зег Суз Зег Ьуз Суз Агд Ьуз С1и Мес СХу
5560
САЗ СТС САС АТС ТСТ ТСТ ТСС АСА СТС САС ССС САС АСС СТС ТСТ ССС240
С1п УаХ СХи Не Зег Зег Суз ТЬг V·! Азр Агд Азр ТЬг V*! Суз СХу
7075
ТСС АСС ААС ААС САС ТАС ССС САТ ТАТ ТСС АСТ САА ААС СТТ ТТС САС288
Суз Агд Ьуз Азп С1п Туг Агд Н1з Тут Тгр Зег С1и Азп Ьеи РЬе С1п
85 9095
ТСС ТТС ААТ ТСС ТСТ СТС ТАА ААССТТ315
Суз РЬе Азп Суз бег Ьеи *
100 (2) ΧΝΤΟΡΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ХО N0:12:
(1) ЗЕООЕМСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(А) ЬЕМОТЯ: 102 аяйпо ас1йз (8) ΤΥΡΕ: аах1па ас!4 (О) ТОРОЬООТ: 11пеах (11) НОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп (х1) ЗЕСОЕгГСЕ ОЕЗСЯХРТХОЯ: ЗЕО ХО N0:12:
АСС ССС ТСС ТТС АСС ССТ ТСА САА ААС САС СТС АСА САС ТСС СТС лес
Зег СХу Зег РЬе ТЬг А1а Зег СХи Азп Нхз Ьеи Ахд Н13 Суз Ьеи Зег
35 40 45
ТСС ТСС ААА ТСС ССА ААС САА АТС ССТ САС СТС САС АТС ТСТ ТСТ тсс
Суз Зег Ьуз Суз Агд Ьуз С1и Мес С1у С1п УаХ СХи ХХе Зег зег Суз
50 55 60
АСА СТС САС ССС САС АСС СТС ТСТ ССС ТСС АСС ААС ААС САС ТАС ССС
ТЬГ Уа1 Авр Ахд Азр ТЬг 7а1 Суз С1у Суз Агд Ьуз Азп СХп Туг Агд
65 70 75
САТ ТАТ ТСС АСТ САА ААС СТТ ТТС САС ТСС ТТС ААТ ТСС ТСТ СТС ТАА
Н1з Туг Тгр Зег СХи Азп Ьеи РЬе СХп Суз РЬе Азп Суз Зег Ьеи •
80 85 90 95
ААССТТ
144
192
240
288
294
(2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ΙΟ N0:14:
(1) ЗЕОЦЕНСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(А) ЬЕЫЭТН: 95 атхпо асХйз
(В) ΤΥΡΕ: атхпо асх4
(О) ТОРОЬООТ: Ипеаг
(11) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп
(XX) ЗЕОСЕЛСЕ ОЕЗСНХРТХОИ: ЗЕО ХО N0:14:
Мее Зег Не Зег Суз ТЫ Ьуз Суз Нхз Ьуз С1у ТЫ Туг Ьеи Туг Азп
1 5 10 15
АЗр Суз Рго С1у Рго СХу С1п Азр ТЬг Азр Суз Ахд СХи Суз С1и Зег
20 25 30
СХу Зег РЬе ТЬг АХа Зег СХи Азп Нхз Ьеи Агд Н13 Суз Ьеи Зег Суз
35 40 45
Зег Ьуз Суз Агд Ьуз СХи Мее С1у СХп УаХ СХи Не Зег Зег Суз ТЫ
50 ' ч55 60
Уа1 Азр Агд Азр ТЫ Уа1 Суз С1у Суз Ахд Ьуз Азп СХп Тух Ахд Нхз
65 70 75 80
Туг Тгр 5ег СХи Азп Ьеи РЬе С1п Суз РЬе Азп Суз Зег (ли *
90 95 (2) ΧΝΓΟΗΜΑΤΧΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:15:
(I) ЗЕООБЫСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) ЬЕЫСТН: 4 ап!по асхбз (B) ΤΥΡΕ: ав1по асхб (C) ЗТЯАЫОЕОЫЕЗЗ: ипкпомп (О) ТОРОЬООТ: ипкпомп (II) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргоСехп (х!) εεαυΕΝΟΕ ОЕЗСКТРТХОМ: 5ЕО ХО N0:15:
Аза Зег Не Суз
нее Туг Х1е Н1з Рго С1п Азп Азп Зег ХХе Суз Суз ТЫ Ьуз суз Нхз
1 5 10 15
Ьуз СХу ТЬх Туг Ьеи Туг Азп Азр Суз РЕО С1у Рго С1у С1п Азр ТЫ
20 25 30
Азр Суз Агд СХи Суз С1и Зег С1у Зег РЬе ТЬг АХа Зег СХи Азп Н13
33 40 45
Ьеи Агд нхз Суз Ьеи Зег Суз Зег Ьуз Суз Агд Ьуз СХи Мег С1у С1п
50 55 60
УаХ С1и ХХе Зег Зег Суз ТЬг Уа1 Азр Агд АЗр ТЬг УаХ Суз СХу Суз
65 70 75 80
Агд Ьуз Азп С1п Туг Агд Н13 Туг Тгр Зег С1и Азп Ьеи РЬе СХп Суз
85 90 95
(2) ΣΝΤΟΒΜΑΤΙΟΜ ГОЯ ЗЕО ХО N0:16:
(1) ЗЕОПЕКСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) ЬЕКОТН: 5 ашхпо асхОз (B) ΤΥΡΕ: аохпо ас!С (C) 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ53: ипкпомп (О) ТОРОЬООТ: ипкпомп (И) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп (Х1) ЗЕОиЕИСЕ ОЕЗСЯХРТЮИ: ЗЕО Ιϋ N0:16:
Азп Азп Зег Х1е Суз
5
РЬе Азп Суз Зег Ьеи
100 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО Ю N0:13:
(ί) ЗЕОЦЕМСЕ СЯАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) ЬБКСТК: 294 Ьазе раххз (8) ΤΥΡΕ: пис1е1с асх<5 (С) ЗТРАКОЕСДЕЗЗ: ипкпомп (О) ТОРОЬООТ: ипкпомп (11) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: СОМА (хх) ГЕАТОЯЕ:
(А> ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СОЗ (B) ЬОСАТХОЫ: 4..288 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΧΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:17:
(1) ЗЕОЦЕНСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ: (А) ЬЕКСТН: б атхпо асШз (8) ΤΥΡΕ: ажхпо асШ (С) 5ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпомп (О) ТОРОЬООТ: ипкпомп (11) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп (Х1) ЗЕОСЕМСЕ ОЕЗСЯХРТХОЫ: ЗЕС ΙΟ N0:13
САТ АТС меь 1 ТСС Зег АТТ АСС ТОТ Суз 5 АСС ААС ТСС САС ААА ССА АСС ТАС ТТС ТАС 48
ХХе Зег ТЬг Ьуз Суз Нхз Ьуз 10 С1у ТЬг Тух Ьеи Туг 15
ААТ САС ТСТ ССА вес ССС ССС САС САТ АСС САС ТСС АСС ОАО ТЭТ САС 96
Азп Азр Суз Рго СХу Рго СХу С1п Азр ТЬг Азр Суз Ахд СХи Суз СХи
20 25 30
(х!) ЗЕООБЫСЕ ОЕЗСЯ1РТ1ОЫ: ЗЕО ГО N0:17:
С1п Азп Азп Зег Х1е Суз ч5 · (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:18:
(х) ЗЕОЦЕЫСЕ СЯАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) ЬЕЫСТН: 7 агахпо асхСз (B) ΤΥΡΕ: ат1по ас!4 (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпомп (О) ТОРОЬООТ: ипкпомп .
(ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп (хх) ЗЕОЦЕЯСЕ ОЕЗСЯХРТХОЫ: ЗЕО 10 N0:18:
Рго С1п Азп Азп Зег Х1е Суз
5
105
106 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОВ 5Ε<5 ΙΌ N0:19:
(ί) 3ΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯХЗТ1С5: (Λ) ΕΕΝ6ΤΗ: 8 атхпо асхйз (В) ΤΥΡΕ: аа!по ас1й {С) 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоип (IX) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: ргоЕехп (χί) ЗЕООЕЫСЕ 0Е5СК1РТЮМ: 5Е0 10 N0:19
Нхз Рго 61п Азп Азп Зег Не Суз
5 (2) ΧΝΓΟΒΜΑΤΧΟΝ РОХ ЗЕО ГО ΝΟ:2£:
(ί) ЗЕОиЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТ1СЗ: (Λ) ΙΛΝ6ΤΗ: 15 апхао ас£0з (B) ΤΥΡΕ: атхпо ас£4 (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33; ипкпоип (О) Τ0Ρ0ΙΛ0Υ: ипкпоип (хх) МОЬЕСиЕЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) ЗЕОЦЕЫСЕ 0Е5СЯ1РТХ0Ы: ЗЕО 10 N0:26:
Суз Рго 01п (51у Ьуз Туг Не Ηίβ Рго 61п Азп Азп Зег 11е Суз 15 10 15 (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОК 5Е0 10 N0:20:
(х) ЗЕООЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯ13ТХСЗ: (Α) ΕΕΝΟΤΗ: 9 атхпо асхс!з (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхс1 (C) 5ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ТОРОЬОСТ: ипкпоип (XX) МСЬЕОТЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп (хХ) ЗЕОЦЕЫСЕ ОЕЗСЯХРТЮЫ: ЗЕО Ю N0:20
11е Нхз Рго С1п Азп Азп Зег 11е Суз
5 (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЙ ЗЕО 10 N0:27:
(1) ЗЕОСЕИСЕ СНАЙАСТЕЙ13ТХСЗ: (Α) 1ΕΝ6ΤΗ: 16 атхпо асхПз (31 ΤΥΡΕ: атхпо асх4 (С) 5ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ55: ипкпоип (О) Τ0Ρ01Λ6Υ: ипкпоип (хх) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (χί) δεουΕΝΟΕ ОЕЗСЯХРТХОЫ: ЗЕО ГО N0:27:
Уа1 Суз Ρεο О1п С1у Ьуз Тус Не Нхз Рго 61п Азп Азп Зег Х1е Суз 15 10 15 (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО Ю N0:21:
(1) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯ15ТХС5: (Α) 1ΕΝ6ΤΗ: 10 атхпо асХйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ35: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоип (XX) МОЬЕСЦЬЕ ТУРЕ:чргосеХп (χί) ЗЕОЦЕИСЕ ОЕЗСЯХРТЮЫ: ЗЕО Ю N0:21:
Туг 11е НХз Рго <31п Азп Азп Зег 11е Суз 15 10 (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:28:
(х) ЗЕООЕЯСЕ СНАЯАСТЕЯ13Т1С5:
(A) ЬЕЫСТН: 17 атхпо асхвз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхЗ (C) 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ35: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоип (χί) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) 5Ε0υΕΝΟΕ ϋΕδΟΕΙΡΤΙΟΝ: 5Е0 10 N0:28:
Зег Уа1 Суз Рго С1г. <31у Ьуз Туе Х1е Нхз Рео С1п Азп Азп Зег 11е 15 Ю 15
Суз (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:29: (ί) ЗЕОСЕИСЕ СЯАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) ЬЕЖТН: 18 атхпо асхПз (B) ΤΥΡΕ: атХпо ас!3 (C) 3ΤΒΑΝ0Ε0ΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΙΟβΥ: ипкпоип (хх) МОЬЕССЕЕ ΤΥΡΕ: ргос»1П (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΧΟΝ ГОЯ ЗЕО ХО N0:22:
(X) ЗЕОСЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯ13ТХСЗ:
(A) ЬЕИОТН: 11 атхпо асХаз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асШ (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΜΟΥ: ипкпоип (XX) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (хХ) ЗЕОТЕИСЕ ΟΕ5σΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ХО N0:22:
Ьуз Тух Х1е НХз Рго С1п Азп Азп Зег Не Суз 13 10 (хх) ЗЕОСЕКСЕ ОЕЗСЯХРТХОН: ЗЕО ХО N0:29:
Азр Зег ν>1 Суз Ρεο 61п <31у Ьуз Тух Не Н1з Рго С1п Азп Азп Зее 15 10 15
Не Суз (2) ΧΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:23:
(X) ЗЕООЕКСЕ СНАЯАСТЕЯ15Т1СЗ: (Α) ΕΕΝΟΤΗ: 12 атхло ас!4з (В) ΤΥΡΕ: атХпо ас!й (С> 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟβΥ: ипкпоип (XX) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОВ ЗЕО ХО N0:30:
(х) ЗЕОЦЕИСЕ СНАВАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) ЬЕИСТН: 4 атхпо ас13з (B) ΤΥΡΕ: атхпо асх<4 (C) 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΙΟΟΥ: ипкпоип (1х) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) 3ΕΟϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΕΙΡΤΣΟΝ: ЗЕО 10 N0:30
Ρίιβ АзпСуз Зег (XX) ЗгаиЕЫСЕ ОЕЗСВХРТЮЫ: ЗЕО 10 N0:23:
С1у Ьуз Туг 11е НХз Рго С1п Азп Азп Зег 11е Суз
10 (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:31:
(х) ЗЕОССЫСЕ СНАЯАСТЕЯ13Т1С5: (Α) ΙΕΝΟΤΗ: 5 атхпо асхОз (B) ΤΥΡΕ: ат1по асЮ (C) 5ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ35: ипкпоип (О) ТОРОЬООУ? ипкпоип (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:24:
(ί) ЗЕООЕЫСЕ СНАЙАСТЕЯ15Т1СЗ:
(A) ЬЕЫОТН: 13 атХпо асхОз (B) ΤΥΡΕ: атХпо асхС (C) 3ΤΒΛΝ0ε0ΝΕ55: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоип (хх) МОЬЕСиЕЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (χί) ЗЕОСЕИСЕ ОЕЗСЙХРТХОЫ: ЗЕО 10 N0:31
РЬе Азп Суз Зег Ьеи
5 (хх) ЗЕОЦЕЖГЕ 0Ε30ΒΙΡΤΣ0Ν: ЗЕО 10 N0:24:
<31п О1у Буз Тус Не Нхз Рго С1п Азп Азп Зег Х1е Суз
10 (2) ΙΝΕΟΒΜΑΤΙΟΝ ЕОЯ ЗЕО 10 N0:23:
(х) ЗЕООЕКСЕ СЯАЙАСТЕЯ13ТХСЗ: (А) ЬЕНОТН: 14 атхпо асХАз (8) ΤΥΡΕ: ат!по асхО (С) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоип (XX) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хХ) ЗЕООЕКСЕ 0ЕЗСЯ1РТ10Ы: ЗЕО ХО N0:25:
Рго <31п 61у Еуз Туе 11е Н1з Ρεο 61п Азп Азп 5ег Не Суз 15 10
107
108 (2)
ΙΝΓΟΒΗΑΤΙΟΝ ГОЯ 5Ε0 Ш N0:32:
(ί)
ЗЕООЕЫСЕ СЯАЯЛСТЕЯ15Т1СЗ:
(A) (B) {С) <П>
ЬЕКОТН: 6 апХпо ас1йз ТУРЕ: ааХпо ас!й ЗТЯАМОЕПЫЕЗЗ: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСХТЪЕ ТУРЕ: ргосехп (2) ΙΝΓΟΚΗΑΤΧΟΝ гоя ЗЕ<2 ТО N0:35:
(1) 5Ε0ϋΕΝθε СНАЯАСТЕЯ13ТТСЗ:
(λ) ΧΕΝΟΤΗ: 235 атХпо асхйз (В) ΤΥΡΕ: аш±по ас1б (О) ТОРОЬССТ: Нпеаг (11) МОХЕСЦХЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (2) (2) (х!)
РЬе
ЗЕОСЕМСЕ 0Е5СЯ1РТ10Ы: ЗЕО 10 N0:32:
Азп Суз 5*г Ьеи Суз
ΧΝΓΟΑΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 5Е0 10 N0:33:
(1) (11)
ЗЕОСЕНСЕ СНАЯАСТЕЯ15Т1СЗ:
(A) (B) (C) (О)
ЬЕЫСТН: 7 атапо ас16з ТУРЕ: аохпо ас1й ЗТЯАИОЕОЫЕЗЗ: ипкпоип ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСиЬЕ ТУРЕ: ргосехп δΕΟϋΕΝΟΕ 0ЕЗСЯ1РТ10Ы: ЗЕО Ю N0:33:
РЬе
Азпсуз Зег Ьеи Суз Ьеи
ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:34:
(1)
ЬЕЫСТН: 705 базе раХхз ТУРЕ: пис1е!с ас!д 5ΤΗΑΝΟΕΕΝΕ33: ипкпоып ТОРОЬООУ: ипкпоып
МСЬЕСиЬЕ ΤΥ?Ε:'ςβΝΑ <1х)
ГЕАТОЕЕ:
(A) ΝΑΜΕ/КЕУ: СОЗ (B) ΙΧΧΑΤΙΟΝ: 1..705
1.
(ХА)
ЗЕОиЕМСЕ ΟΕδΟΑΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:34:
АХа 61п УаХ АХа РЬе ТЬ:
01у
АСС
Зег
АСА ТСС ССС ТЬг Суз Агд
СТС Ьеи
ТСС Суз
(Х1) ЗЕООЕМСЕ ОЕЗСЯХРТТСЫ: : ЗЕО 10 N0:35:
Хеи Рхо АХа 61п УаХ А1а РЬе ТЬг Рго Туг А1а Рго СХи Рго 61у Зег
1 5 10 15
ТЬг Суз Агд Хеи Ахд СХи Туг Туг Азр 51п ТЬг А1а СХп мес Суз Суз
20 25 30
Зег Хуз Суз Зег Рго С1у СХп НХз А1а Ьуз УаХ РЬе Суз ТЬг Хуз ТЬг
35 40 45
Зег Азр ТЬг Уа! Суз Азр Зег Суз (Пи Азр Зег ТЬг Туг ТЫ С1п Хеи
50 55 60
Тгр Азп тхр V»! Рго С1и Суз Хеи Зег Суз С1у Зег Агд Суз Зег Зег
65 70 75 80
Азр 01п УаХ С1и ТЬг С1п А1а Суз ТЬг Агд СХи С1п Азп Агд Не Суз
85 90 95
ТЬг Суз Ахд Рго С1у Тгр Туг Суз А1а Хеи Зег Ьуз <31п С1и С1у Суз
100 105 110
Ахд Хеи Суз АХа Рго Хеи Агд Хуз Суз Агд Рго СХу РЬе С1у УаХ АХа
115 120 125
Агд Рго СХу ТЬг С1и ТЬг Зег Азр Уа1 Уа! Суз Ьуз Рго Суз А1а Рго
130 135 140
С1у ТЬг РЬе Зех Азп ТЬг ТЬг Зег Зег ТЬг Азр Не Суз Агд Рго Нхз
145 Х50 155 160
СХп Не Суз Азп УаХ Уа1 А1а Не Рго <31у АЗП А1а Зег Агд Азр А1а
165 170 175
Уа1 Суз ТЬг Зег ТЬг Зег Рго ТЬг Агд Зег Мей АХа Рго С1у АХа Уа1
130 185 190
НХз Хеи Рго С1п Рго Уа1 Зег ТЬг Агд Зех С1п М1з ТЬг С1п Рго ТЬг
195 200 205
Рго 01и Рхо Зег ТЬг А1а Рго Зег ТЬг Зег РЬе Хеи Хеи Рго Меь С1у
210 215 220
Рго Зег Рго Рхо АХа 61и <31у Зег ТЬг С1у Азр
225 230 235
(2) ΧΝΓ0ΡΜΑΤΙ0Ν РОК ЗЕО ТО N0:36:
(ί) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕК13Т1С5:
(A) ЬЕЯСТН: 4 атхпо асх^з (B) ΤΥΡΕ: аа1по асхй (C) 5ΤΒΑΝ0Ε0ΝΕ35: ипкпоып (О) ΤΟΓΟΧΟΟΥ: ипкпоып (11) МСХЕСПХЕ ΤΥΓΕ: ргосехп (Х1) ЗЕОЦЕКСЕ 0Е5СК1РТ1СИ: ЗЕО ТО N0:36
А1а 31л Мек Суз (2) ΙΝΓΟΡΜΑΤΙΟΝ ГОК 5Е<2 ТО N0:37:
(х) ЗЕООЕЫСЕ СНАВАСТЕВ15Т1СЗ:
(A) ХЕМСТН: 5 апйпо асхсАз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхО (C) 5ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ25: ипкпоып (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоып (11) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (ха) ЗЕОЦЕИСЕ ОЕЗСКХРТЮЫ: ЗЕО ТО N0:37
ТЬх АХа С1п мео Суз
5 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 5Е0 10 N0:39:
(ί) 3ΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕЯ15Т1С5:
(A) ЬЕЫСТН: б ашхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: агьхпо асх<1 (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ53: ипкпоып (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: ипкпоып (11) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ': ргосехп (х!) 3ΕαϋΕΝ0Ε 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: 5Е0 ТО N0:38
СХп ТЬх АХа СХп Мек Суз
5 (2) ΙΝΓΟΡΜΑΤΙΟΝ ГОЯ 5Е0 ТО N0:39:
(1) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕК15Т1СЗ: (Α) ΧΕΝΟΤΗ: 7 ат1по ас!(3з (B) ΤΥΡΕ: ат1по ас!<1 (C) 5ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ55: ипкпоып (О) ТОРОЬОСТ: ипкпоып
109
110 (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) ЗЕОЦЕЫСЕ 0Ε3ΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗБО ΙΟ N0:39
Азр 61η ΤΪ1Γ А1а 61о Мае Суз
5 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО 10 N0:43:
(1) ЗЕООЕМСЕ СЯАНАСТЕЯХЗТ1СЗ:
(A) ЬЕМСТЯ: 11 ашХло асхДз (B) ΤΥΡΕ: аахпо асхс!
(C) 3ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: ипкпоип (О) Τ0Ρ0106Υ: ипкпоип (11) МСЬЕСОЪЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (2) ΙΝΪΌΗΜΑΤΣΟΝ ГОН ЗБО Ю N0:40:
(1) ЗЕООЕЫСЕ СНАКАСТЕЯ15Т1СЗ: (Α) 1ΕΝ6ΤΗ: 8 ашхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: ашхпо ас1й (C) 3ΤΒΛΝ0Ε0ΝΕ53: ипкпоип (О) Τ0Ρ0ΙΧΧ3Υ: ипкпоип (ϋ) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) ЗЕСиЕКСЕ 0ЕЗСН1РТ10Ы: ЗЕО 10 N0:40
Туг Азр 61п ТЬг А1а С1п Мее Суз
5 (хх) 5Е0ОЕЫСЕ 0Ε3ΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:43:
Ах? <31и Туе Туг Азр <31п ТЬг А1а С1п Мес Суз
10 (2) ΙΝΓΟΡΜΑΤΖΟΝ ГОК ЗЕО Σ0 N0:44:
(1) ЗЕОЦЕКСБ СНЛНЛСТЕЯ15ТХСЗ: (Α) 1ΕΝ0ΤΗ: 12 ашхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: аахпо ас14 (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ53: ипкпоип (О) ΤΟΡΟίΟΟΥ: ипкпоип (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗБО 10 N0:41:
(х) ЗЕОЦЕЫСЕ СНЛНАСТЕН13Т1СЗ: (Α) ΙΕΝ6ΤΗ: 9 аш±по ас!с1з (B) ΤΥΡΕ: аахпо ас!4 (C) 5ΤΒΛΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) Τ0Ρ0106Υ: ипкпоип (11) МОЬЕСиЪЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) ЗЕОиЕИСЕ ОЕЗСНХРТЮЫ: ЗБО 10 N0:41
Туе Туе Азр 6Хп ТЬг А1а С1п Мес Суз
5 (Х1) ЗЕОиЕЫСЕ 0Ε30ΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:44:
Ьей Аг? 01и Туг Туг Азр С1п ТНг А1а 01п Мес Суз $ 10 (2) ΙΝΕ0ΚΜΑΤΙ0Ν ГОН ЗБО 10 N0:45:
(ί) ЗЕООЕКСЕ СНАЯАСТЕВХЗТ1С5:
(A) ЬЕМЗТЯ: 13 ашхпо асхс!з (B) ΤΥΡΕ: аахпо ас!д (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (ϋ) Τ0Ρ0ΙΛ0Υ:чипкпоип (11) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ ЗБО ГО N0:42:
(ί) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАНАСТЕН13Т1С8: (Α) &ΕΝ6ΤΗ: 10 ат1по ас1<1з (B) ΤΥΡΕ: аа!по ас!4 (C) 5ΤΗΛΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) Τ0Ρ0Έ06Υ: ипкпоип (хх) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргоее1п (х±) ЗЕСиЕКСЕ 0ЕЗСН1РТ10Ы: ЗЕО 10 N0:42:
61и Туе Туе Азр 61п ТЬг А1а 61п Мес Суз 15 10 (х!) 8Ε0υΕΝΟΕ 0Ε30ΗΣΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:45:
Аг? Ьей Ах? 01и Туг Туг Азр 01п ТЬх А1а 61п Мес Суз 15 10 (2) ΙΝΕ0ΒΜΑΤΙ0Ν ГОН ЗБО 10 N0:46:
(1) ЗЕООБМСЕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) ЬЕИОТЯ: 14 ашхпо ас1с1з (B) ΤΥΡΕ: ашхпо ас14 (C) 3ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΙΌΟΥ: ипкпоип (11) МОСЕСПСЕ ΤΥΡΕ; ргосехп - .
(х1) ЗЕОТЕКСЕ 0Ε3ΟΗΖΡΤΧΟΝ: ЗЕО ГО N0:46:
Суз Аг? Саи Аг? С1и Туг Туг Азр <31п тйе А1а 31п Мае Суз 15 10 (2) ΙΝΤΟΚΜΑΤΣΟΝ РОК ЗЕО ГО N0:47:
(1) ЗЕОСЕИСЕ СЯАЯАСТЕКХЗТХСЗ:
(A) СЕИСТН: 15 ашхпо асхсХз (B) ΤΥΡΕ: ашхпо асхО (C) 3ΤΚΑΝΟΕΒΝΕ83: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ипкпоип (XX) МОСЕСТСЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) ЗЕОЪХМСЕ ΟΕδΟΒΙΡΤΧΟΝ: ЗЕО 10 N0:47:
ТЪг Суз Ле? Саи Ае? С1и Туг Туг Азр <31п ТНг А1а 01п Мес Суз 15 10 15 (2) ΙΝΕΟΚΜΑΤΧΟΝ ΕΟΚ ЗЕО ГО N0:48:
(1) 3£<3ϋΕΝΟΕ СНАНАСГЕКХЗТХСЗ: (Α) ΙΧΝΟΤΗ: 16 ашхпо асхОз (B) ΤΥΡΕ: ашхпо асхй (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (й) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: ипкпоип (ϋ) моЬЕСисЕ τυρέ: ргосехп (хх) 3ΕΟϋΕΝΟΕ ОЕЗСКХРТГОК: ЗЕО ГО N0:48:
Зег ТЪе Суз Ае? Ьей Аг? <Э1и Туг Туг Азр С1п ТЛг А1а 01п Мес Суз 1 5. 10 15 (2) ΙΝΕΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗБО 10 N0:49:
(х) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАНАСТБЯХЗТХСЗ:
(A) СЕКСТН: 17 аш1по асхОз (B) ΤΥΡΕ: ашхпо асхй (C) 8ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоип (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: ипкпоип (ϋ) МОСЕСТСЕ ΤΥΡΕ: ргосехп
111
112 (2) (2) (2) (χχ) ЗЕЦЦЕЫСЕ 0ЕЗСКХРТ10Ы: ЗЕС ГО N0:49:
С1у Вех ТЬх Суз Агд Ьеи Ахд С1и Тух Туг 15 10
Суз
ΙΝΓ0ΗΜΑΤΙ0Ν ГОК ЗЕО £0 N0:50:
(ί) (хх)
Рго
Мес
Азр С1п
ТЬг
А1а
С1п мес (2) (ί) (ϋ) δΕΟϋΕΝΟΕ СЯАЯАСТЕК13ТХСЗ:
(A) (B) (C) (О)
ЬЕИСТН: 19 апхпо асхйз ΤΥΡΕ: апхпо асхй δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε50ΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО ГО N0:50:
С1у Зег ТЬг Суз Ахд Ьеи Ахд 01и Туг
10
Туг Азр
31п
ТЬг
А1а С1л (2) (хх)
Рго
Суз
ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:51:
(ί) (ϋ) (XX)
ЬЕЫСТН: 19 апхпо асхйз ΤΥΡΕ: атхпо асхО δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ососехп δΕΟϋΕΝΟΕ ОЕЗСЯХРТХОЫ: ЗЕО ГО N0:51:
(2)
С1и
С1п
Рго С1у Зег ТЬг Суз Ахд Ьеи Агд С1и
5Туг Туг
Азр
С1п
ТЬх А1а
Мей Суз
ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:52:
(1) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕН13Т1СЗ:
(A) (B) (C) (ϋ)
ЬЕИСТЯ: 20 ап±по ас±4з ΤΥΡΕ: аш1по ас£0 3ΤΚΑΝϋΕϋΝΕ33: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып (хх) (ϋ) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:52:
Рго 01и Рго 01у Зег ТЬг Суз Ахд Ьеи 1 5
Ахд С1и Туг Туг Азр С1п ТЬг
15 (2)
А1а С1п Мес Суз (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:53:
(ί) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯХЗТ1С5:
(A) (B) (C) (ϋ)
ЬЕЖЗТН: 21 апхпо ас!4з ΤΥΡΕ: ап±по ас40 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып (хх)
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (хх) δΕΟϋΕΝΟΕ 0Ε50ΗΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО ГО N0:53:
А1а
Рго С1и Рхо С1у Зех ТЬг Суз Ахд Ьеи Агд С1и Туг Туг Азр С1п ' 5 10 15 (2)
ТЬг
А1а С1п Мес Суз (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:54:
(х) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕК13Т1СЗ:
(A) (B) (C) (О)
ЬЕМбТЯ: 22 атхпо асхйз ΤΥΡΕ: ааЬпо асхй 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып (хх)
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (х!)
ЗЕОЦЕЯСЕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:54:
(2)
С1п ТЬг АХа С1п Мес Суз δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯЛСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) (B) (C) (О)
Ьагатк: 23 атхпо ас±4з ΤΥΡΕ: ат!по ас!4 3ΤΚΛΝ0Ε0ΝΕ53: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСИЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп
ЗЕООЕЯСЕ ОЕЗСЯХРТЮЯ: ЗЕО ГО N0:55:
Туг А1а Рго С1и Рго С1у Зег ТЬх Суз Ахд Ьеи Агд С1и Туг Туг 5 10 15
Азр
С1п ТЬг А1а С1п Мес Суз
ΙΝΕ0ΚΜΑΤ10Ν ГОЯ ЗЕО 10 N0:56:
(I) (ϋ) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) (B) (C)
Ю)
ЬЕЫСТН: 24 атхпо ас!<1з ТУРЕ: атхпо асхй δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСИЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп
ЗЕОЦЕМСЕ 0ЕЗСК1РТ10Ы: ЗЕО 10 N0:56:
ТЬг
Туг
Азр С1п ТЬг А1а 01л Мес Суз
ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ'ЗЕО ГО N0:57:
(х) (ϋ) (хх) δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) ЬЕЫСТН: 25 апхпо асхЛз (B) ΤΥΡΕ: апхпо асх4 (C) δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ипкпоып (ϋ) ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосе1п δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:57:
РЬе
Туг (1) (11) (хх)
А1а
С1и
ТЬг Рго Туг А1а Рго С1и Рхо С1у Зег ТЬг Суз Агд 5 10
Туг Азр С1п ТЬг А1а С1п Мес Суз
25 δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) · (B) (C) (О)
ЬЕМСТН: 26 аШпо ас!4з ΤΥΡΕ: апхпо ас!й 3ΤΚΑΝ0Ε0ΝΕ33: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп
ЗЕООЕНСЕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:59:
Ьеи Агд С1и
РЬе ТЬг Рго Туг А1а Рго С1и Рхо С1у Зег ТЬг Суз Ахд Ьеи Агд
10 15
Туг Туг Азр С1п ТЬх А1а С1п Мес Суз ' 20 23
ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ГО N0:59:
(ί) (ϋ) (XX) νβΐ δΕΟϋΕΝΟΕ СНАЯЛСТЕЯ13Т1СЗ:
(A) (B) (C) (О)
ЬЕИСТМ: 27 апхпо асЬЛз ΤΥΡΕ: апхпо ас!<1 δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп δΕΟϋΕΝΟΕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:59:
А1а РЬе ТЫ
Агд
С1и Туг Туг
Азр С1п ТЬг А1а С1п Мес Суз
ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО ГО N0:60:
(X)
ЗЕОиЕМСЕ СНАЯАСТЕК13Т1С5:
(A) (B) (C) (О)
ЬЕМСТН: 2В апхпо асх4з ΤΥΡΕ: алйао асх<1 δΤΚΑΝϋΕϋΝΕδδ: ипкпоып ТОРОЬОСУ: ипкпоып (ϋ)
МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (х!)
ЗЕОиВКСЕ ϋΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:60:
С1п Уа1 А1а РЬе ТЬх Рго Туг А1а Рго С1и Рго С1у Зег ТЬг Суз Агд 15 ю 15
Ьеи Ахд С1и Тус Туг Азр С1п ТЬг А1а С1л Мес Суз 20 25
113
114 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 1° N0:61:
(1) 5Ε0ϋΕΝ€Ε СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) 1ΕΝ6ΤΗ: 29 аш£ао асХ4з (B) ΤΥΡΕ: авОао асХй (C) ЗТЯАГГОЕОИЕЗЗ: ипкпоып (О) ТОРОЮСУ: ипкпоып (Ϊ1) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (2) ΣΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО ГО N0:67:
и) ЗЕОиЕЫСЕ СЯАЙАСТЕК13Т1С5: (Л) ЬЕЖ5ТН: 7 ввило зсайз (B) ΤΥΡΕ: атХпо асхй (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпоып (В) ΤΟΡΟΙΛΟΥ: ипкпоып (ϋ) МОЬЕСОЪЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (χΧ) 5ΕΟϋΕΝΟΕ ОЕЗСЯХРТХОЫ: ЗЕО 10 N0:61:
А1а С1п Уа1 АХа РЬе ТЬг Рго Туг АХа Рго <ЗХи Рго С1у Зег ТЬг Суз 15 1015
Агд Ьеи Агд С1и Тус Τνε Азр 6Хп ТЬг АХа С1п Мес Суз ’25 (хх) ЗЕОЦЕЪ'СЕ 0ЕЗСВ1РТ10Ы: ЗЕО ГО N0:67
АХа Рго Ьеи Агд Ьуз Суз Агд (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:62:
(X) ЗЕОЦЕМСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) ЬЕМСТН: 30 атХпо асХ4з (B) ΤΥΡΕ: ааХпо асХО (C) 5ΤΑΑΝΟΕΟΝΕ53: ипкпоып (О) ΤΟΡΟΙΟΟΥ: ипкпаип (XX) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргогеХп (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО ГО N0:68:
(X) ЗЕООЕМСЕ СНАКАСТЕК13Т1С8: (Α) ЬЕИСТН: 31 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1еХс асХ4 (C) 5ΤΚΑΝΒΕΒΝΕ33: ипкпоып (В) ТОРОЬОСТ: ипкпоып (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΟϋΝΑ (хХ> ЗЕОСЕМСЕ ОЕЗСЯХРТЮЫ: ЗЕО ΙΏ N0:62:
Рго АХа (ЗХп УаХ АХа РЬе ТЬг Рго Туг А1а ₽ео СХи Ρεο СХу Зег ТЬг 15 Ю 15
Суз Агд Хеи Агд С1и Туг Туг Азр С1п ТЬг АХа СХп Мес Суз
25 30 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:63:
(ί) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯ13Т1С5:
(A) ЬБЯСТН: 31 атХпо асХ03 (B) ΤΥΡΕ: атХпо асхй (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ35: ипкпоып (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: ипкпоып (XX) МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (хХ) ЗЕООЕХСЕ ОЕЗСЯХРТЮЫ: ЗЕО Ю N0:63:
Хаи рго АХа С1п Уа1 АХа РЬе ТЬг Рго Туг АХа Рго СХи Рго С1у Зег 15 10 15
ТЬг Суз Агд Ьеи Агд СХи Туг Туг Азр С1п ТЬг АХа СХп Мес Суз
25 30 (2) ΙΝΤΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:64:
(1) ЗЕОЦЕИСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ: (λ) ΧΕΝΟΤΗ: 4 атХпо асХбз (B) ΤΥΡΕ: атХпо асХО (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ55: ипкпоып (О) ТОРОЬОСТ: ипкпоып (XX) М0ХЕСХ1ХЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (хХ) ЗЕОЦЕМСЕ ОЕЗСЯХРТХОЫ: ЗЕО 10 N0:64
АХа Рго Хеи Агд (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:65:
(X) 3Ε0ν£Ν0Ε СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) ХЕЫСТН: 5 атХпо асХдз (B) ΤΥΡΕ: атХпо асХО (C) ЗТЯАЫОЕОЫЕЗЗ: ипкпоып (□) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: ипкпоып (XX) МОХЕСиХЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (XX) ЗЕОЦЕЫСЕ 0Ε3ΟΚΙ?ΤΙΟΝ: ЗЕО ΙΒ N0:68
ССТТАСССАТ АТССАСАССС ТТТССССССА А (2) ΣΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ ГОК 5Е0 10 N0:69:
(х) ЗЕОЦЕМСЕ СНАКАСТЕЯ15Т1СЗ: (Α) ЬЕКОТН: 33 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асх<1 (C) 3ΤΚΑΝΒΕΒΝΕ33: ипкпоып (ϋ) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: ипкпоып (ίί) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: οΒΝΑ (XX) ЗЕОСЕИСЕ ΟΕ3ΟΚΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:69
СССААССТТТ ТАСАСАСАСС ААТТСААОСА СТС (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО Σ0 N0:70:
(ί) ЗЕОЦЕМСЕ СНАКАСТЕВ15Т1С5:
(λ) ЬЕЫСТН: 40 Ьазе рахгз {ЭХ ΤΥΡΕ: писХеХс асхй (С) 3ΤΗΑΝΒΕΟΝΕ35: ипкпоып (О) ТОРОЬОСТ: ипкпоып
I (ϋ) моьЕсти: τυρέ: οβνα (хх) ЗЕОиЕМСЕ ВЕЗСАХРТЮЫ: ЗЕО ΙΟ N0:70;
АСТС5АОСАТ ССССбСАТАА АТЛАСТААСС АТССССТССА (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО 10 N0:71:
(ί) ЗЕОЦЕМСЕ СНАКАСТЕК13Т1СЗ: (Α) ΙΕΝΟΤΗ: 41 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: писХехс асхй (C) 3ΤΚΑΝΒΕΒΝΕ33: ипкпоып (О) ТОРОЬОСУ: ипкпоып (хх) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΒΝΑ (хХ) ЗЕОиЕЫСЕ ОЕЗСЯХРТЮИ: ЗЕО ХО N0:65
АХа Рго Хеи Агд Хуэ
5 (χί) ЗЕОиЕЫСЕ ОЕЗСКХРТХОИ: ЗЕО Σ0 N0:71:
САССТСССАТ ССТАТСАССА СААССАСТСС ААААССТТТТ С (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО ХИ N0:66:
(X) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯХЗТХСЗ:
(A) ΧΕΝΟΤΗ: 6 атХпо асХбз (B) ΤΥΡΕ: атХпо асХС (C) ЗТЯАЫОЕОЫЕЗЗ: ипкпоып (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: ипкпоып (XX) МОХЕСОХЕ ΤΥΡΕ: ргосеХп (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК 5Е0 10 N0:72:
(х) ЗЕОВЕЫСЕ СЯАЯАСТЕК13Т1С5: (Α) ΕΕΝ6ΤΗ: 31 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асХй (C) 3ΤΒΑΝΟΕΒΝΕ33: ипкпоып (В) ТОРОЬОСТ: ипкпоып (хх) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: сОЫА (хХ) ЗЕООЕЫСЕ ОЕЗСЯХРТЮЫ: ЗЕО ХО N0:66
АХа Ргс Хеи Агд Хуз Суз
5 (хх) ЗЕОВЕЫСЕ ΒΕ30ΚΙΡΤΣ0Ν: ЗЕО 10 N0:72
ССТТАОССАТ АТССАСАССС ТТТССССССА А (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО ΙΒ N0:73:
(£) ЗЕООЕХСЕ СНАЯАСТЕК15ТХСЗ: (Α) ЬЕЫСТН: 34 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асх<3 (C) 3ΤΚΛΝΟΕΒΝΕ55: ипкпоып (О) ТОРОЬОСУ: ипкпоып (ϋ) МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: сОЫА
115
116 (χί) ЗЕйОШСЕ ©Е5С&ХРТ10Н: ЗЕО 10 N0:73: СССССАТССС ТАТТААТТСА АССАСТССАА ЛАОС (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΗ ГОЯ ЗЕО X© N0:74:
(х) ЗЕОЦЕКСЕ СНАЯАСТЕН13Т1СЗ:
(A) ОЕЫСТН: 30 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: писХеХс асхй (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ83: ипкпошп (О) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: ипкпошп (ϋ) МОЬЕСиГЕ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ (хх) 3Ε0ϋΕΝΟΕ ОЕЗСЯГРТЮЫ: ЗЕО I© N0:74:
ССССАТАТОТ АТАТССАССС ТСААААТААТ (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟ» ГОЯ ЗЕО ГО N0:75:
(1) ЗЕООТИСЕ СНАЯАСТЕН13Т1СЗ:
(А) ЪЕЫСТН: 33 Ьазе рахгз * (8) ΤΥΡΕ: писХехс асхй (С) 5ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: ипкпошп (О) ΤΟΡΟΙΛΟΥ: ипкпошп (хх) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ (хх) δΕΟϋΕΝΟΕ ΟΕ308Ι?ΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:75:
СССААССТТТ ТАСАСАОАСС ААТТОААССА СТС (2) ΙΝΓΟΡΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:76:
(х) ЗЕООЕЫСЕ СНАЯАСТЕЯХ5Т1СЗ:
(А) ЬЕНОТН: 38 Ьазе ра!сз (8) ΤΥΡΕ: пис1ехс асхй.
(С) 5Τ8ΑΝ0Ε0ΝΕ35: ипкпошп (О) ΤΟΡΟΟΟΟΥτ- ипкпошп (XX) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ (χΐ) ЗЕООЕМСЕ 0ЕЗСК1₽ТХ0М: ЗЕО 10 N0:76:
ССССАТАТОТ СОАТТАССТО ТАССААОТСС САСАААСО (2) ΧΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО 10 N0:77: .
(1) вЕООТНСЕ СМЛКАСТЕК13Т1С5:
(A) ЬЕМСТН: 33 Ьазе рахгз ' (B) ΤΥΡΕ: пис1е!с ас!4 (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ55: ипкпошп (О) Τ0Ρ01Λ6Υ: ипкпошп <хх) МОЬЕСЦХЕ ΤΥΡΕ: СОЫА (хх) ЗЕОЦЕНСЕ ВЕЗСВХРТХОЫ: 5Е0 Ю N0:77:
СССААССТТТ ТАСАСАСАСС ААТТЗААССА СТО 33 (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК 5Е0 ГО N0:78:
(ί) ЗЕОЦЕИСЕ СНАЯАСТЕКХЗТ1С5:
(A) ΕΕΝΟΤΗ: 30 Ьазе рахгз - (B) ΤΥΡΕ: писХахс асхР (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпошп (ϋ) ΤΟ?ΟΙ.Ο<3Υ: ипкпошп . . (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ (хх) 3ΕΟΟΕΝΟΕ 0ЕЗСК1РТ10Ы: ЗЕО ΙΟ N0:79:
ССССАТАТОТ СТАССААСТС ССАСАААССА 30 (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕО 10 N0:79:
(х) 3Ε0ϋΕΝΟΕ С.ЧАЯЛСТЕК13Т1СЗ:
(A) ΙΕΝΟΤΗ: 33 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1ехс асхб (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпошп (О) Τ0Ρ0100Υ: ипкпошп (ϋ) МОЬЕОНХ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ (хХ) ЗЕООЕМСЕ 0Е5СК1РТЮЫ: ЗЕО 10 N0:79:
СССААССТТТ ТАСАСАСАСС ААТТОААОСА СТС 32 (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕО 10 N0:80:
(х) ЗЕОСЕЯСЕ СНАЯАСТЕК15Т1С5:
(A) Χ.ΕΝ6ΤΗ: 31 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: писХехс асхб (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: ипкпошп (ϋ) ΤΟΡΟΙΌΟΥ: ипкпошп (хх) МООЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ΟΟΝΑ (Χί) ЗЕССЕНСЕ ОЕЗСЯХРТХОМ: 5Е0 10 N0:80:
6СТТАСССАТ АТССАСАССС ТТТОСССССА А 31 (2) ΧΝΓ0ΗΜΑΤΙ0Ν ГОК 8ЕС ГО N0:81:
(х) ЗЕООЕМСЕ СНАЯАСТЕЯХ5ТХСЗ:
(A) ΙΧΝ0ΤΗ: 33 Ьазе рахгз (B) ΤΥΡΕ: пис1«1с асЮ (C) 2ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ53: ипкпошп (О) ТОРОЬОСТ: ипкпошп (Х1) МОЬЕСПХЕ ΤΥΡΕ: οΟΝΑ (хх) ЗЕОиЕМСЕ ΟΕΕΟΚΙΡΤΙΟΝ: 5Е0 ΙΟ N0:81:
СССААССТТТ ТАССТССАСА СССТСТТСТС ТТТ 33

Claims (47)

1. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей (κΤΝΡΈ), имеющий следующую формулу: К1-[Сук19-Сук103]-К2, где [Сук19-Сук103] представляет собой аминокислотные остатки с 19 по 103 κΤΝΡΗ-Ι последовательности БЕЦ ΙΌ ЫО:2, приведенной на фиг. 1, К обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу Сук19, или аминоконцевой аминокислотный остаток, или последовательность, выбранные из группы, включающей
С
1С
81С
N810 (ЗЕО ΙΌ N0:15)
ΝΝ8ΙΟ (8Εζ) Ιϋ N0:16) 0ΝΝ8ΙΟ (8Εζ) Ю N0:17) ΡΟΝΝδΙΟ (8Εζ) Ιϋ N0:18) ΗρςΝΝδίο (ЗЕО Ю N0:19) ΙΗΡ0ΝΝ8ΙΟ (8Εζ) Ιϋ N0:20) ΥΙΗΡζ)ΝΝ8Ι0 (8Εζ) Ιϋ N0:21) ΚΥΙΗΡςΝΝδΙΟ (8Εζ) Ю N0:22) ΟΚΥΙΗΡζ)ΝΝ8ΙΟ (8Εζ) ΙΌ N0:23) ςΟΚΥΙΗΡΟΝΝδΙΟ (8Εζ) Ιϋ N0:24) ΡςΟΚΥΙΗΡΟΝΝδΙΟ (8Εζ) ΙΌ N0:25) ΟΡΟΟΚΥΙΗΡΟΝΝδΙΟ (8Εζ) ΙΌ N0:26) νΟΡςΟΚΥΙΗΡΟΝΝδΙΟ (8Εζ) Ιϋ N0:27) ενορςοκγΐΗΡΟΝΝδίο (8Εζ) Ю N0:28) ϋδνΟΡςΟΚΥΙΗΡΟΝΝδΙΟ (8Ε<2 Ю N0:29),
а К2 обозначает карбоксигруппу Сук103, или карбоксиконцевой аминокислотный остаток, или последовательность, выбранные из группы
Г
ΡΝ ΡΝΟ ЕЫС5 (8Εζ) Ιϋ N0:30) ΡΝ08Ι. (8Ε0 Ю N0:31) ТОСЗЬС (8Ε<2 Ю N0:32) ΡΝΟδΕΟί (8Εζ) Ιϋ N0:33),
или его варианты и производные, полученные, как раскрыто в описании, причем когда К1 обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу аминокислотной последовательности УСРрОКУШРрМЫБГС или ее Νконцевого усеченного на 1-15 остатков варианта, то Я1-[Сук19-Сук103]-Я2 не является дополнительным вариантом с формулой К1-[Сук19Суκ103]-ΡССБ^С^-Яз, где К3 обозначает карбок117
118 сильную группу аминокислотной последовательности Акпш-Акп161, приведенной на фиг. 1, или усеченного по карбоксиконцевому участку варианта последовательности Акп111-Акп161, приведенной на фиг. 1.
2. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей по п.1, выбранный из группы, включающей
3ΤΝΓΚ-Ι
2.6О/СЮ5 рИ2-МПЗУСР<ЗаКУ1НР0Ж31С-(Су3 15-Су51°’>-РС-СООН], 3ΤΝΈΒ.-Ί 2.6О/СЮ6 [МН2-М03УСРЦСК¥1НРС№С31С-[Суз'Э-Суз^З]ЕУСЗЬСООИ], 5ΤΝΡΚ.-Ι2.6Ο/Ν103 [ΝΗ2-Μη5νθΡΟΟΚ¥ΙΗΡΰΝΝ5ΙΟ[Суз’З-Суз'ОЗ^Ш-СООН],5ΊΝΕΚ-Ι2.3П/48 [ИН2-МУШР(2М№1С-[Су519. Суз103]-™сХЬ-СООН], зТМКК-12.30/415 [МН2-М313-[Суз19-Су5103].
НГСЗЬ-СООН] та 5ΤΝΡΚ-12.30/018 [ИНг-МЧСуз^-Суз!031-ЕН'СЗЬ СООН].
3. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей (кТЯЕК), имеющий следующую формулу: К.4-[Сук32-Сук115]-К_5, где [Сук32-Сук115] представляет собой аминокислотные остатки от Сук32 до Сук115 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:35, приведенной на фиг. 8, К4 обозначает метионилированную и неметионилированную аминогруппу Сук32 или аминоконцевой аминокислотный остаток или последовательность, выбранные из группы, включающей с
мс
ОМС
А<ЭМС (8Εζ) ГО N0:36).
ТАОМС (8Е0 ГО N0:37).
ОТАС)МС /5Е0 ГО N0:38).
ООТАОМС (5Е<? ГО N0:39).
УООТАОМС (8Εζ> ГО N0:40). ΥΥΌΟΤΛΟΜΟ (5Е0 Ю N0:41). ЕУУОрТЛОМС (8Е<2 ГО N0:42). ЕГОУУГЮТЛОМС (8Εζ> ГО N0:43). ΕΚΕΥΥΟΟΤΛΟΜΟ (8Е0 ГО N0:44). КЬКЕУУООТАОМС (8Е0 ГО N0:45). СКЬКЕУУООТАОМС (8Εζ) ГО N0:46). ТСКЬКЕУУООТАОМС (8Е0 ГО N0:47). ЗТСКЬКЕУУООТАОМС <8 ЕС) ГО N0:48).
ΟδΤΟΚΕΚΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (ЗЕО ГО N0:49).
ΡΟΧΤΟΚΕΚΕΥΥΙΧ,ιΤΛΟΜΟ (8Е<_) ГО N0:50). ЕРОЗТСКЬКЕУУООТАОМС (8Εζ> ГО N0:51). РЕРО8ТСКЬКЕУУО0ТА<2МС (8Е<2 ГО N0:52).
АРЕР08ТСКЕКЕУУО<2ТА<ЭМС (8Е<Э ГО N0:53).
ΥΑΡΕΡΟδΤΟΚΕΚΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (8Εζ> ГО N0:54).
РУАРЕРС8ТСКЬКЕУУО<2ТАОМС (8Е<2 ГО N0:55).
ТРУАРЕРСЗТСКЬКЕУУООТАОМС (8Εζ) ГО N0:56).
ЕТРУАРЕРО8ТСКЬКЕУУО0ТА0МС (8Е0 ГО N0:57).
ΑΕΤΡΥΑΡΕΡΟδΤΟΚΕΚΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (8Е<2 ГО N0:58). \/ΑΡΤΡΥΑΡΕΡ08ΤΟΚΕΚΕΥΥΌΟΤΑΟΜΟ (5Е<? ГО N0:59). ОУАЕТРУАРЕРОЗТСКЬКЕУУООТАОМС (8Е0 ГО N0:60).
А0УАЕТРУАРЕР<Э8ТСШ.КЕУУО0ТА<ЭМС (8Е<2 ГО N0:61).
ΡΑςνΑΕΤΡΥΑΡΕΡΟδΤΟΚΕΚΕΥΥϋΟΤΑΟΜΟ (8Е<2 ГО N0:62). ΕΡΑΟνΑΕΤΡΥΑΡΕΡσδΤΟΚΣΚΕΥΥΟΟΤΑςΜΟ (8Εζ) ГО N0:63). а К5 обозначает карбоксигруппу Сук115, или карбоксиконцевой аминокислотный остаток, или последовательность, выбранные из группы, включающей
А
АР
АРЬ
АРЬЕ (5Εζ) ГО N0:64)
ΑΡ1ΉΚ (5Е<2 ГО N0:65)
АРЬККС (5Е0 ГО N0:66)
АРЬККСК (8Εζ) ГО N0:67) или его варианты и производные, полученные, как раскрыто в описании, причем когда К4 обозначает метионилированную или неметионилированную аминогруппу аминокислотной последовательности ΤСК^КЕΥΥ^^ΤΑ^ΜС или ее ^концевого усеченного на 1-15 остатков варианта, то К4-[Сук32-Сук115]-К5 не является дополнительным вариантом с формулой К4-[Сук32Сук115]-АРКЬКСК-К6, где К·, обозначает карбоксильную группу аминокислотной последовательности Рго123-Тйг179, приведенной на фиг. 8, или усеченного по карбоксиконцевому участку варианта последовательности Рго -Тйг , приведенной на фиг. 8.
4. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что имеет негликозилированную аминокислотную последовательность.
5. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что имеет гликозилированную аминокислотную последовательность.
6. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он конъюгирован с водорастворимым полимером.
7. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей по п.6, отличающийся тем, что водорастворимый полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
8. Поливалентный рецептор фактора некроза опухолей, содержащий по меньшей мере один из рецепторов, по любому из пп.1-7.
9. Поливалентный рецептор фактора некроза опухолей по п.8, отличающийся тем, что он содержит димер усеченного рецептора по п.3.
10. Поливалентный рецептор фактора некроза опухолей по п.8, имеющий формулу К.1-ХК2, где Х обозначает линкер, причем указанный линкер является водорастворимым полимером, и К и К2 являются биологически активными молекулами, ковалентно связанными с указанным водорастворимым полимером, при том, что по меньшей мере один из компонентов К и К2 представляет собой усеченный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-5.
11. Поливалентный рецептор по п.10, отличающийся тем, что водорастворимый полимер является полиэтиленгликолем.
12. Поливалентный рецептор по п.11, отличающийся тем, что усеченный рецептор выбран из группы, включающей кЮТКЛ 2.6 О/С105бЬ и кТХЕКД 2.6 П/С106бЬ.
13. Полинуклеотид, кодирующий рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-3, выбранный из группы, включающей
119
120 полинуклеотид с последовательностью, представленной на фиг. 2 (8Е0 ΙΌ ЫО:3);
полинуклеотид с последовательностью, представленной на фиг. 3 (8Е0 ΙΌ ЫО:5);
полинуклеотид с последовательностью, представленной на фиг. 4 (8Е0 ΙΌ ЫО:7);
полинуклеотид с последовательностью, представленной на фиг. 5 (8Е0 ΙΌ ЫО:11);
полинуклеотид с последовательностью, представленной на фиг. 6 (8Е0 ΙΌ ЫО:9);
полинуклеотид с последовательностью, представленной на фиг. 7 (8Е0 ΙΌ ЫО:13);
полинуклеотид с последовательностью, которая вырождена по отношению к кодирующим областям указанных последовательностей.
14. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.13, функционально связанный с последовательностью, контролирующей экспрессию.
15. Штамм прокариотической клеткихозяина, содержащий полинуклеотид по п.13 или вектор по п.14.
16. Штамм эукариотической клеткихозяина, содержащий полинуклеотид по п.13 или вектор по п.14.
17. Способ получения усеченного рецептора фактора некроза опухолей, предусматривающий выращивание штаммов клеток-хозяев по п.15 или 16 в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного усеченного рецептора фактора некроза опухолей (δΤΝΡΚ) клеткамихозяевами, и выделение его.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанные клетки-хозяева являются клетками Е.сой.
19. Способ по п.17, отличающийся тем, что указанные клетки-хозяева являются клетками яичника китайского хомячка.
20. Усеченный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он получен рекомбинантным методом.
21. Способ получения фармацевтической композиции, заключающийся в том, что терапевтически эффективное количество рецептора фактора некроза опухолей по любому из пп.1-7 или 20 или поливалентный рецептор фактора некроза опухолей по пп.8-12, смешивают с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая усеченный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.1-7 или 20, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
23. Фармацевтическая композиция, содержащая поливалентный рецептор фактора некроза опухолей по любому из пп.8-12, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
24. Фармацевтическая композиция по п.22 или 23, отличающаяся тем, что она является композицией непрерывного высвобождения.
25. Фармацевтическая композиция по любому из пп.22-24, отличающаяся тем, что она лиофилизирована.
26. Способ лечения ΤΝΡ-обусловленных заболеваний, предусматривающий введение больному усеченного рецептора фактора некроза опухолей по любому из пп.1-7 или 20 или поливалентного рецептора по любому из пп.8-
12.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что ΤΝΡ-обусловленное заболевание представляет собой диабет, гиперальгезию, воспалительное заболевание кишечника, ишемическое и реперфузионное повреждение или ревматические заболевания.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что ревматическое заболевание выбрано из группы, включающей ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный артрит, анкилозирующий спондилит, дерматомиозит, псориатический артрит, склеродермию, синдром Шегрена и васкулит.
29. Способ по любому из пп.26-28, отличающийся тем, что усеченный или поливалентный рецептор фактора некроза опухолей вводятся внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, внутрисуставно или вливанием.
30. Способ по любому из пп.26-29, отличающийся тем, что усеченный или поливалентный рецептор фактора некроза опухолей вводится до, совместно или после введения противовоспалительного средства.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что противовоспалительное средство выбирают из группы, включающей нестероидные противовоспалительные средства, кортикостероиды, медленнодействующие противоревматические препараты и препараты, модифицирующие заболевание.
32. Способ по п.30, отличающийся тем, что противовоспалительным средством является ингибитор интерлейкина-1 (ΙΣ-1), выбранный из антагониста рецептора интерлейкина-1 (ГБ-1га) или растворимого ΙΠ-1 рецептора.
33. Применение усеченного рецептора фактора некроза опухолей по пп.1-7 или 20 или поливалентного рецептора по пп.8-12 для приготовления препарата для лечения ΤΝΡобусловленных заболеваний.
34. Применение усеченного рецептора фактора некроза опухолей по пп.1-7 или 20 или поливалентного рецептора по пп.8-12 для приготовления препарата для лечения диабета, гиперальгезии, воспалительного заболевания кишечника, ишемических и реперфузионных повреждений и ревматических заболеваний.
35. Применение по п.34, отличающееся тем, что ревматическое заболевание выбрано из группы, включающей ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенильный артрит, анкилозирующий спондилит, дерматомиозит, псориатический артрит, склеродермию, синдром Шегрена и васкулит.
121
122
36. Применение по любому из пп.33-35, при котором указанный препарат вводится внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, внутрисуставно или вливанием.
37. Применение по любому из пп.33-36, при котором указанный препарат вводится до, совместно или после введения противовоспалительного средства.
38. Применение по п.37, при котором противовоспалительное средство выбирается из группы, включающей нестероидные противовоспалительные средства кортикостероиды, медленнодействующие противоревматические препараты и препараты, модифицирующие заболевание.
39. Применение по п.37, при котором противовоспалительное средство является ингибитором интерлейкина-1 (ГЕ-1), выбранным из антагониста рецептора интерлейкина-1 (ΙΕ-1 га) или растворимого ΙΕ-1 рецептора.
40. Набор для получения водных белковых композиций, содержащий первый контейнер с рецептором фактора некроза опухолей по любому из пп.1-7 и второй контейнер с физиологически приемлемым растворителем.
41. Способ по п.31, отличающийся тем, что противовоспалительным средством является метотрексат.
42. Применение по п.38, отличающееся тем, что противовоспалительным средством является метотрексат.
43. Фармацевтическая композиция по любому из пп.22-25, отличающаяся тем, что дополнительно включает противовоспалительное средство.
44. Фармацевтическая композиция по п.43, отличающаяся тем, что противовоспалительное средство выбрано из нестероидных противовоспалительных средств, кортикостероидов, медленно действующих противоревматических препаратов и препаратов, модифицирующих заболевание.
45. Фармацевтическая композиция по п.44, отличающаяся тем, что противовоспалительным средством является метотрексат.
46. Фармацевтическая композиция по п.43, отличающаяся тем, что противовоспалительным средством является ингибитор интерлейкина-1 (ΙΕ-1), выбранный из антагониста рецептора интерлейкина-1 ДЬ-1га) или растворимого ΙΕ-1 рецептора.
47. Фармацевтическая композиция по п.46, отличающаяся тем, что антагонист рецептора интерлейкина-1 ДЬ-1га) содержит последовательность человеческого белка ЙИта.
EA199900095A 1996-07-09 1997-07-09 Усеченные рецепторы фактора некроза опухолей, фармацевтические композиции на их основе и способы применения указанных факторов и композиций EA003900B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2144396P 1996-07-09 1996-07-09
US3253496P 1996-12-06 1996-12-06
US3773797P 1997-01-23 1997-01-23
US3931497P 1997-02-07 1997-02-07
US3979297P 1997-03-04 1997-03-04
PCT/US1997/012244 WO1998001555A2 (en) 1996-07-09 1997-07-09 Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA199900095A1 EA199900095A1 (ru) 2000-02-28
EA003900B1 true EA003900B1 (ru) 2003-10-30

Family

ID=27533913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA199900095A EA003900B1 (ru) 1996-07-09 1997-07-09 Усеченные рецепторы фактора некроза опухолей, фармацевтические композиции на их основе и способы применения указанных факторов и композиций

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6989147B2 (ru)
EP (1) EP0914431B1 (ru)
JP (2) JP2002514048A (ru)
KR (1) KR20000023695A (ru)
AT (1) ATE364695T1 (ru)
AU (2) AU3601397A (ru)
BG (1) BG64910B1 (ru)
BR (1) BR9710350A (ru)
CA (1) CA2259156C (ru)
CZ (1) CZ296835B6 (ru)
DE (1) DE69737814T2 (ru)
EA (1) EA003900B1 (ru)
ES (1) ES2288304T3 (ru)
IL (1) IL127874A0 (ru)
NO (1) NO990086L (ru)
NZ (1) NZ333647A (ru)
PL (1) PL189309B1 (ru)
SK (1) SK1599A3 (ru)
TR (1) TR199700610A3 (ru)
TW (1) TW555765B (ru)
WO (1) WO1998001555A2 (ru)
YU (1) YU299A (ru)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005413B1 (en) * 1995-12-22 2006-02-28 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
WO1998024477A1 (en) 1996-12-06 1998-06-11 Amgen Inc. Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
EP1717315A3 (en) 1997-04-16 2007-06-20 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins and receptors
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US20040220103A1 (en) * 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
DE60024636T2 (de) * 1999-06-21 2006-08-17 Santen Pharmaceutical Co., Ltd Arzneimittel für die rheumatoide arthritis
WO2001058953A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of a domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
PL365316A1 (en) * 2000-12-06 2004-12-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of sarp-1 for the treatment and/or prevention of scleroderma
CN103232539B (zh) 2001-06-26 2015-06-03 安姆根弗里蒙特公司 抗opgl抗体
JP4761710B2 (ja) 2002-04-05 2011-08-31 アムジェン インコーポレイテッド 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
US20040002451A1 (en) 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
WO2004098595A1 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag COMPOSITION COMPRISING ROFLUMILAST AND A TNFα ANTAGONIST
WO2005079796A1 (en) * 2004-02-20 2005-09-01 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and pegsunercept
AU2005267722B2 (en) 2004-08-04 2009-10-08 Amgen Inc. Antibodies to Dkk-1
ES2776657T3 (es) 2005-06-14 2020-07-31 Amgen Inc Formulaciones de proteínas autotamponantes
AR056806A1 (es) 2005-11-14 2007-10-24 Amgen Inc Moleculas quimericas de anticuerpo rankl- pth/ pthrp
US7767206B2 (en) 2006-10-02 2010-08-03 Amgen Inc. Neutralizing determinants of IL-17 Receptor A and antibodies that bind thereto
WO2009009186A2 (en) * 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
EP3330292A1 (en) 2007-08-21 2018-06-06 Amgen, Inc Human c-fms antigen binding proteins
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
ES2523043T3 (es) 2008-07-23 2014-11-20 Hanmi Science Co., Ltd. Un complejo polipeptídico que comprende un polímero no peptidílico que tiene tres extremos funcionales
US9068019B2 (en) * 2009-10-19 2015-06-30 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified human tumor necrosis factor receptor-1 polypeptide or fragment thereof, and method for preparing same
PL3295957T3 (pl) 2010-01-15 2020-03-31 Kirin-Amgen, Inc. Formulacja przeciwciała przeciwko IL-17RA i reżimy terapeutyczne do leczenia łuszczycy
KR101273893B1 (ko) 2010-09-13 2013-06-14 한올바이오파마주식회사 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드 또는 그의 절편 및 그의 제조방법
CN103370334B (zh) * 2010-12-23 2016-06-22 韩诺生物制药株式会社 修饰的人肿瘤坏死因子受体-i多肽或其片段及其制备方法
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
WO2016122806A1 (en) * 2015-01-28 2016-08-04 Dnx Biotech, Llc Compositions and methods of using a soluble tnf-alpha receptor modified for increased half-life
SG11201807596YA (en) 2016-03-08 2018-10-30 Janssen Biotech Inc Gitr antibodies, methods, and uses
CA3040899A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
CN113845583B (zh) * 2020-06-28 2023-08-11 江苏中新医药有限公司 一种修饰的重组人神经生长因子及其制备方法

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IN150740B (ru) 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4760067A (en) 1979-08-15 1988-07-26 Merck & Co., Inc. Allylsulfoxide enzyme inhibitors
EP0040506B1 (en) 1980-05-21 1986-08-20 Teijin Limited Reactive polymer and process for the preparation thereof
US4560649A (en) 1981-10-15 1985-12-24 Cornell Research Foundation Assaying for hLH or hCG with immobilized hormone receptors
JPH0751511B2 (ja) 1982-03-15 1995-06-05 味の素株式会社 インターロイキン２を含有してなる癌治療剤
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4587046A (en) 1982-05-18 1986-05-06 The Regents Of The University Of California Drug-carrier conjugates
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4966888A (en) 1985-07-08 1990-10-30 Cornell Research Foundation, Inc. hCG-hLH receptor and hCG-hLH receptor-hCG complex as antigens, antibodies thereto and contraceptive vaccine
US4522750A (en) 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
SE470099B (sv) 1984-05-17 1993-11-08 Jerker Porath Sulfonaktiverade tioeteradsorbenter för separation av t ex protein
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
CA1283661C (en) 1984-06-20 1991-04-30 Franz Jansen Imidazolides, process for their preparation and application as intermediates for the synthesis of cytotoxic conjugates
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
SE454885B (sv) 1984-10-19 1988-06-06 Exploaterings Ab Tbf Polymerbelagda partiklar med immobiliserade metalljoner pa sin yta jemte forfarande for framstellning derav
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS62185029A (ja) 1986-02-07 1987-08-13 Ajinomoto Co Inc 修飾インタ−ロイキン−２
CA1283046C (en) 1986-05-29 1991-04-16 Nandini Katre Tumor necrosis factor formulation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IN165717B (ru) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4931544A (en) 1986-09-04 1990-06-05 Cetus Corporation Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
IL80005A (en) 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US4965271A (en) 1986-12-31 1990-10-23 Hoechst Roussel Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the activity of leukocyte derived cytokines
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
IL90339A (en) 1989-05-18 1996-10-16 Yeda Res & Dev Anti-cytotoxic protein and its purification
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8806339D0 (en) 1988-03-17 1988-04-13 Hoffmann La Roche Monoclonal antibodies
GB8807803D0 (en) 1988-03-31 1988-05-05 Glaxo Group Ltd Biochemical product
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
IL89790A (en) 1988-04-01 2002-05-23 Johns Hopking University Nucleic acid sequences that encode and cells that produce cr1 protein and methods of production and purification
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
KR0148009B1 (ko) 1988-05-27 1998-08-01 그래고리 비. 아보트 인터루킨-1 억제제
JPH0240399A (ja) 1988-07-27 1990-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 線維芽細胞増殖因子ムテインの複合体あるいは組成物
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
IL95064A0 (en) * 1990-07-12 1991-06-10 Yeda Res & Dev Molecular cloning of tnf binding protein
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
GB8824592D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Purification process
GB8824869D0 (en) 1988-10-24 1988-11-30 Stevenson G T Synthetic antibody
US5681566A (en) 1988-10-24 1997-10-28 3I Research Exploitation Limited Antibody conjugates with two or more covalently linked FC regions
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
AU4660789A (en) 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
WO1990006774A1 (en) 1988-12-22 1990-06-28 Xoma Corporation Hindered linking agents and methods
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
EP0386289A1 (en) 1989-03-07 1990-09-12 Taniguchi, Tadatsugu, Dr. Recombinant interleukin-2 receptor
CA2011450C (en) 1989-03-07 2002-06-04 Tadatsugu Taniguchi Recombinant b-chain of the il-2 receptor
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
ATE289350T1 (de) * 1989-04-21 2005-03-15 Amgen Inc Tnf-rezeptor, tnf bindende proteine und dafür kodierende dnas
US7264944B1 (en) * 1989-04-21 2007-09-04 Amgen Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3922089A1 (de) 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
ATE119942T1 (de) * 1989-05-18 1995-04-15 Yeda Res & Dev Tumor-nekrosefaktor-bindungsprotein ii, seine reinigung und spezifische antikörper.
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc Method for the production of a human recombinant tumor necrosis factor inhibitor
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
CA2485553A1 (en) 1989-09-05 1991-03-21 Immunex Corporation Tumor necrosis factor - .alpha. and - .beta. receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
EP0417563B1 (de) 1989-09-12 2000-07-05 F. Hoffmann-La Roche Ag TNF-bindende Proteine
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5234903A (en) 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
EP0502956B1 (en) 1989-11-29 1997-04-23 Amgen Boulder Inc. Production of recombinant human interleukin-1 inhibitor
CA2032191C (en) * 1989-12-13 1999-05-18 David Wallach Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein i (tbp-i)
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US6458360B1 (en) 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
WO1992001002A1 (en) 1990-07-11 1992-01-23 Teijin Limited Tumor necrosis factor activity inhibitor and production thereof
GB9015908D0 (en) 1990-07-19 1990-09-05 Celltech Ltd Multivalent immunoglobulin
WO1992001474A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Kabi Pharmacia Ab Heterobifunctional reagents and conjugates with oxaalkylene units for amphiphilic bridge structures
EP0546055B1 (en) 1990-08-31 1996-07-10 Regents Of The University Of Minnesota Polyethylene glycol derivatives for solid-phase applications
GB9022648D0 (en) * 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
GEP20002142B (en) 1991-01-18 2000-06-25 Amgen Inc Method for Treatment and Prevention of TNF Mediated Diseases
DK0573551T3 (da) 1991-02-27 2003-08-04 Micromet Ag Serinrige peptidlinkere
DE69233069T2 (de) * 1991-03-15 2003-11-27 Amgen Inc., Thousand Oaks Pegylation von polypeptiden
AU1676992A (en) 1991-03-18 1992-10-21 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
ES2094920T3 (es) 1991-07-04 1997-02-01 Immunodex K S Reactivos y conjugados solubles en agua a base de polimeros que comprenden restos derivados de divinil sulfona.
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5569779A (en) 1991-12-23 1996-10-29 Albemarle Corporation Polyfunctional michael addition products
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH08502082A (ja) 1992-07-02 1996-03-05 コラーゲン コーポレイション 生体適合性ポリマー結合体
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
DE4230297C1 (de) 1992-09-10 1994-03-17 Kernforschungsz Karlsruhe Verwendung eines Gießharzes und Verfahren zu dessen Herstellung
CA2123593C (en) 1992-09-15 2000-03-14 Craig A. Smith Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
EP0622394A1 (en) 1993-04-30 1994-11-02 S.A. Laboratoires S.M.B. Reversible modification of sulfur-containing molecules with polyalkylene glycol derivatives and their use
DK0710121T3 (da) 1993-07-30 2001-02-05 Kennedy Inst Of Rheumatology Fremgangsmåde til behandling af dissemineret sklerose
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
WO1996003141A1 (en) * 1994-07-22 1996-02-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical compositions comprising a chimaeric tnf binding protein
DE4441446A1 (de) * 1994-11-22 1996-05-23 Ulrich Theis Verfahren zur Übergabe von Wäschestücken und vorzugsweise zur Durchführung des Verfahrens dienende Muldenmangel
TW313568B (ru) 1994-12-20 1997-08-21 Hoffmann La Roche
US7429646B1 (en) * 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols

Also Published As

Publication number Publication date
BG103091A (en) 2000-05-31
AU1112101A (en) 2001-04-05
BR9710350A (pt) 1999-08-17
WO1998001555A3 (en) 1998-05-22
NZ333647A (en) 2000-09-29
IL127874A0 (en) 1999-10-28
EA199900095A1 (ru) 2000-02-28
TR199700610A2 (xx) 1998-01-21
SK1599A3 (en) 2001-02-12
ATE364695T1 (de) 2007-07-15
DE69737814D1 (de) 2007-07-26
AU3601397A (en) 1998-02-02
US20030054439A1 (en) 2003-03-20
TW555765B (en) 2003-10-01
PL331240A1 (en) 1999-07-05
EP0914431B1 (en) 2007-06-13
NO990086L (no) 1999-03-09
AU774307B2 (en) 2004-06-24
CZ296835B6 (cs) 2006-06-14
US7732587B2 (en) 2010-06-08
PL189309B1 (pl) 2005-07-29
TR199700610A3 (tr) 1998-01-21
ES2288304T3 (es) 2008-01-01
CA2259156C (en) 2010-09-07
YU299A (en) 1999-11-22
BG64910B1 (bg) 2006-08-31
DE69737814T2 (de) 2008-03-06
JP2009280612A (ja) 2009-12-03
WO1998001555A2 (en) 1998-01-15
EP0914431A2 (en) 1999-05-12
NO990086D0 (no) 1999-01-08
KR20000023695A (ko) 2000-04-25
JP2002514048A (ja) 2002-05-14
US6989147B2 (en) 2006-01-24
CZ499A3 (cs) 2000-01-12
CA2259156A1 (en) 1998-01-15
US20050250696A1 (en) 2005-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA003900B1 (ru) Усеченные рецепторы фактора некроза опухолей, фармацевтические композиции на их основе и способы применения указанных факторов и композиций
JP4332163B2 (ja) Ｍｐｌ受容体に結合し血小板生成活性を有する二量体トロンボポエチンペプチド模倣体
CN106573966B (zh) 用于治疗代谢异常的组合物和方法
EA001792B1 (ru) Композиция, включающая ингибитор il-1 и гидрогелевый эфир, и способы ее применения
EA005005B1 (ru) ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
JP2004502417A (ja) Ｂ７様分子およびその使用
EA009026B1 (ru) Антитела против il-22ra, их партнеры по связыванию и способы их применения при воспалениях
JP2008289487A (ja) Ｏｂ融合タンパク質組成物および方法
EA011583B1 (ru) Миметические антитела glp-1 человека, композиции, способы и применения
JP2008167750A (ja) Ｂ７関連タンパク質−２分子およびその使用
CA2272854C (en) Keratinocyte growth factors and their use in combination with glucagon-like peptide derivatives
JP2004522410A (ja) Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ補体レセプター様分子およびその使用
ES2216134T3 (es) Utilizaciones del factor de crecimiento de los queratinocitos 2)(kgf-2).
JP2006176528A (ja) Ｖｇｆポリペプチドおよびｖｇｆ関連障害の治療方法
RS20050255A (sr) Terapije za hroničnu inflamatornu demijelinizujuću polineuropatiju uz korišćenje interferona beta
MXPA02009523A (es) Moleculas similares a cd20/receptor de ige y usos de las mismas.
JP2004506425A (ja) ロイシンリッチ反復含有ｇタンパク質共役レセプター８分子およびその使用
JP2008001708A (ja) 腫瘍内皮マーカー７α分子およびその使用
JP2004520083A (ja) Ａｔｐ結合カセットトランスポーター様分子およびそれらの使用
AU775027B2 (en) Keratinocyte growth factor-2 products
JP2004504831A (ja) Ｃ３ｂ／ｃ４ｂ補体レセプター様分子およびその使用
MXPA99003528A (en) Uses of keratinocyte growth factor-2

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU