DE928401C - Verfahren zur Reindarstellung von Cozymase - Google Patents

Description

• Verfahren zur Reindarstellung von Cozymase Hinsichtlich der Gewinnung von Cozymase (Diphosphopyridinnucleotid) sind in neuerer Zeit verschiedene Vorschläge zur Verbesserung der bis dahin üblichen Verfahren (vgl. »Biochemical Preparations«, Vol. I, S. 28, 1949) gemacht worden. Durch Anwendung moderner Methoden, wie die der Gegenstromverteilung und des Ionenaustausches, ist es gelungen, wesentliche Vereinfachungen bezüglich der technischen Darstellung .dieses immer wichtiger werdenden enzymatischen Wirkstoffes zu erzielen (vgl. unter anderem Ne i 1 a n d s und Akeson in.»The Journal of Biological Chemistry«, Vol. 188, S. 307, 195z). Die Patentschrift 913 4o6 beschreibt ein Verfahren, nach dem es unter stufenweiser Anwendung besonderer lonenaustauschcr erstmals möglich ist, die Cozymase in reinem Zustande zu isolieren. Allerdings hat diese Methode noch den Nachteil, daß eine restlose Erfassung des im Ausgangsmaterial enthaltenen Diphosphopyridinnucleotids (DPN) nur durch eine etwas umständliche Aufarbeitung von Fraktionen niederen Wirkstoffgehaltes möglich ist.
• Der Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren, mit dessen Hilfe es gelingt, die in dem betreffenden Ausgangsmaterial enthaltene Cozymase nahezu quantitativ in einfacher Weise, gewissermaßen in einem Arbeitsgang, zu isolieren. Wie nämlich gefunden wurde, bildet die Cozymase mit Basen von Chinaalkaloiden gut kristallisierende Salze, die auf Grund ihrer Löslichkeitseigenschaften leicht abgetrennt und gegebenenfalls umkristallisiert werden können. Die Salze lassen sich in üblicher Weise in ihre Komponenten spalten, und nach Abtrennung der Base erhält man aus ihnen das DPN in reiner Form.
• Als zweckmäßig hat sich für die Zerlegung der Salze und Abtrennung des freien Nucleotids auch hier wieder die Methode des Ionenaustausches erwiesen. Schickt man die wäßrige Salzlösung durch eine Säule eines schwach basischen Austauschers, z. B. basische Ionenaustauscher auf Kunstharzbasis in ihrer Acetatform, so erfolgt unter Zerlegung der Salze einAustausch des DPN gegen dieAcetationen, während das Acetat des betreffenden Alkaloids die Säule passiert. Anschließend läßt sich das DPN in Gegenwart einer geeigneten stärkeren Säure glatt und quantitativ eluieren und durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in welchem es unlöslich ist, aus dem Eluat ausfällen.
• Man kann die erfindungsgemäß vorzunehmende Isolierung des Diphosphopyridinnucleotids als Salz eines Chinaalkaloids aber auch durch doppelte Umsetzung geeigneter Salzpaare bewirken. So können Lösungen, in denen das DPN in Anwendung der üblichen Methode als Ba-Salz angereichert vorliegt, mit ausreichenden Mengen von z. B. Chininsulfat versetzt werden, worauf nach Abtrennung des Bariumsulfats eine Ausfällung der Nucleotid-Chinin-Verbindung durch Zugabe von z. B. Benzol erfolgen kann. Eine derartige doppelte Umsetzung kann natürlich auch unter Anwendung von geeigneten Ionenaustauschern vorgenommen werden. Beispiel 2 g eines Blut- oder Hefekonzentrats, in welchem das Diphosphopyridinnucleotid unter Anwendung bekannter Methoden zu 75 % angereichert ist, werden in 20 ccm Wasser gelöst; falls die Lösung getrübt bleibt, wird zentrifugiert. Man fügt nun eine Lösung von 2,2 g Chininbase in 17 ccm Alkohol hinzu, und unter kräftigem Schütteln der Mischung wird so lange eine 3oo/oige Lösung von absolutem Alkohol in Benzol zugegeben, bis alles klar gelöst ist. Man läßt die Lösung (etwa 400 ccm) bei Zimmertemperatur zum Kristallisieren stehen; nach etwa 40 Stunden ist die Kristallisation beendet. Die Kristalle werden abzentrifugiert, mit einer Alkohol-Benzol-Mischung gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute an. Chininsalz 2,2 g.
• Zur Freilegung des DPN löst man 4oo mg Chininsalz in 2o ccm ro n-Essigsäure. Die Lösung wird durch eine Säule von ro ccm eines basischen Ionenaustaus,chers auf Kurnstharzbmis in seiner Acetatform geschickt, wobei das Chininsalz unter Zurückhaltung der Nucleotidkomponente gespalten wird; es wird bis" zur Chininfreiheit nachgewaschen. Nun wird die Säule so lange mit etwa 8,5°/aiger Ameisensäure durchspült, bis in einer Probe des Eluates kein DPN mehr nachweisbar ist. Aus den gegebenenfalls eingeengten Eluaten wird der Wirkstoff durch Zugabe von Aceton ausgefällt. Man erhält nach dem Trocknen 240 mg freies Diphosphopyrindinnucleotid.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: r. Verfahren zur Reindarstellung von Cozymase, dadurch gekennzeichnet, daß man sie aus ihren Lösungen über ihre Salze mit Chinaalkaloiden abtrennt, worauf die gewonnenen Salze in ihre Komponenten zerlegt werden.
2. 2. Verfahren gemäß Anspruch z, dadurch gekennzeichnet, daß die Zerlegung der Salze unter Verwendung von geeigneten Ionenaustauschern vorgenommen wird.