DE1025571B

DE1025571B - Herstellung und Gewinnung neuer Antibiotika

Info

Publication number: DE1025571B
Application number: DEC14537A
Authority: DE
Inventors: Dr Ernst Gaeumann; Dr Vladimir Prelog; Dr Albert Wettstein
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1956-03-23
Filing date: 1957-03-16
Publication date: 1958-03-06
Also published as: CH347608A; US3039924A

Description

Herstellung und Gewinnung neuer Antibiotika Die Erfindung betrifft die Herstellung und Gewinnung von zwei neuenAntibiotika, die im folgenden » Cinerubin A« und »Cinerubin B" genannt werden, ihren Derivaten und Salzen.
Die Cinerubine entstehen bei der Kultur einer neuen Aktinomycetenart der Gattung Streptomyces, die mit keiner der in Bergeys »Manual of Determinative Bacteriology«, 6. Auflage, oder in »Actinomycetes and their Antibiotics" von Waksman und Lechevalier, 1953, aufgeführten Arten identisch ist und im folgenden als Streptomyces cinereoruber Corbaz et a1. var. fructofermentans beschrieben wird. Sie wurde aus einer im Zürcher Zoo gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in den Laboratorien der Erfinder und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, Zürich, unter der Bezeichnung A 6143 aufbewahrt.
Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans bildet ein spärliches Luftmycel, das anfänglich weiß, dann weißgrau und schließlich aschgrau gefärbt ist. Es hat Konidienketten, die ein typisches Merkmal der Gattung Streptomyces sind. Die Sporen sind glatt. Das Substratmycel ist rot und bildet ein lösliches Pigment. Das Wachstum ist relativ wenig abhängig von der Temperatur, sowohl bei 18' als auch bei 40° entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32°.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgenden das Wachstum von Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf verschiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nährmedien 1 bis 7 und 11 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol., 17, S. 361 (1952), hergestellt.
Synthetischer Agar: Wachstum dünn, schleierartig, farblos nach 3 Tagen, später rosa; Luftmycel staubig, nach 8 Tagen milchweiß oder blaßkarmin, nach 14 Tagen aschgrau; ein rosarotes lösliches Pigment wird nach 4 Tagen gebildet.
Synthetische Lösung: Flocken weißgrau bis rosa; Pellikel mit spärlichem weißgrauem Luftmycel; Pigment blaßkarmin.
Glukose-Agar: Punktförmiges Wachstum, farblos oder stellenweise korallenrot nach 3 Tagen, fleischrot nach 8 Tagen; Luftmycel spärlich, weißgrau nach 8 Tagen, aschgrau nach 14 Tagen; Substrat fleischrot gefärbt nach 8 Tagen.
Glukose-Asparagin-Agar : Wachstum wie auf Glukose-Agar ; Luftmycel staubig, kreideweiß nach 4 Tagen, später weißgrau; blaßkarminrotes lösliches Pigment.
Calciummalat-Agar: Wie Glukose-Asparagin-Agar. Gelatinestich 18°C: Oberflächliches Wachstum weißgelb bis hellgelbrot; Luftmycel spärlich, weißgrau; löslichesPigmentintensivkastanienbraun bis r ötlichbraun ; Verflüssigung sehr langsam, beginnend nach 34 Tagen, 0,4 cm nach 42 Tagen.
Stärkeplatte: Wachstum punktförmig, farblos; Luftmycel mehlig bestäubt, weißgrau; Stärkehydrolysierung Spuren nach 4 Tagen.
Nähragar : Spärliches Wachstum, hellgelb; kein Luftmycel; Pigment schwach, rötlichbraun.
Kartoffeln: Flechtenartiges Wachstum, kupferrot nach 4 Tagen, bräunlich bis pechschwarz nach 8 Tagen, kein Luftmycel; Substrat blauschwarz gefärbt.
Karotten: Flechtenartiges Wachstum, graublau und blaßkarmin; Luftmycel nach 8 Tagen sammetig, weißgrau bis aschgrau; Pigment blauschwarz.
Lackmusmilch: Ringwachstum, Pellikel hellbraun; Luftmycel spärlich weißgrau; Peptonisierung nach 7 Tagen; keine Gerinnung.

Streptomyces cinereoruber var. fructoferrr entanswächst, nach der Methodik von T. G. PridhamundD.Gottlieb, J. Bacteriology, 56, S.107 (1948), untersucht, bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen wie folgt:

z-Xylose . . . + Inulin . . . . . . . . . (-)

r.-Arabinose -@- n-Mannit ....

r. Rhamnose (-f-) n-Sorbit ....... +

i)-Fruktose Dulcit . . . . . . . . . (-)

v-Galaktose -I- Mesoinosit ...

Saccharose (+) Salicin . . . . . . . . .

Maltose . . . + Natriumacetat. . (-)

Lactose ... -!- Natriumcitrat .. (-)

Raffirrose Natriumsuccinat (-)

Dabei bedeutet: gutes Wachstum, sichere Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle, (-i-) schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle fraglich, (-) sehr schwaches Wachstum, Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle unwahrscheinlich, - kein Wachstum, keine Verwendung der betreffenden Kohlenstoffquelle.

Streptomyces cinereorubervar.fructofermentans stimmt morphologisch gut mit Streptomyces cinereoruber (R. Corbaz, L. Ettlinger, W. Keller-Schierlein und H. Zähner, Arch. Mikrob., im Druck) überein, unterscheidet sich aber biologisch von dieser Art durch seine Fähigkeit, verschiedene Kohlenstoffquellen auszuwerten.
Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans zeigt weiter gewisse Ähnlichkeiten mit S. purpurascens Lindenbein, welcher aber stachelige Sporen bildet und ein völlig abweichendes Kohlenstoffquellenspektrum zeigt. Letzteres gilt ebenfalls für S. Bobiliae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.
Die Erfindung ist, was die Herstellung der Antibiotika Cinerubin A und Cinerubin B oder ihrer Gemische anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.
Zur Erzeugung der Cinerubine wird ein die Eigenschaften von Streptomyces cineroeruber var. fructofermentans aufweisender Streptomycetenstamm, z. B. in wäßriger, anorganische Salze, stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls Kohlenhydrate enthaltender Nährlösung aerob gezüchtet, bis diese eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt, und hierauf Cinerubin A und/oder Cinerubin B oder Gemische davon aus dem Kulturfiltrat isoliert.
Die Nährlösung enthält als anorganische Salze beispielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan. Als stickstoffhaltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende Kohlehydrate und wachstumsfördernde Stoffe seien z. B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Proteine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destillationsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, ferner Glukose, Saccharose, Lactose, Stärke usw.
Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 20 und 40°. Eine wesentliche antibakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 11/z bis 5 Tagen.
Je nach der Zusammensetzung der verwendeten Nährlösung wird entweder ein Gemisch von Cinerubin A und B oder vorwiegend Cinerubin A oder vorwiegend Cinerubin B produziert. Beispielsweise kann Streptomyces cinereoruber var. fructofermentans auf Nährlösungen gezüchtet werden, die auf 1 1 Wasser folgende Substanzen enthalten Nährlösung Nr. 12/41: Glycerin 20 g, Sojamehl 10 g, Natriumchlorid 5 g, Calciumcarbonat 10 g und Natriumnitrat 1 g.
Nährlösung Nr. 22: Mannit 20 g, -Distillers solubles.: 20 g, Natriumchlorid 3 g und Natriumnitrit 1 g. Nährlösung Nr. 19: Mannit 20 g und Sojamehl 20 g. Dabei wird bei der Verwendung von Nährlösung Nr. 19 vorwiegend Cinerubin A gebildet und mit Nährlösung Nr. 12/41 hauptsächlich Cinerubin B. Mit Nährlösung Nr. 22 wird ein Gemisch von Cinerubin A und B produziert.
Zur Isolierung der Cinerubine können z. B. folgende Verfahren dienen: Man trennt das Mycel vom Kulturfiltrat ab, wonach die Hauptmenge der Antibiotika im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotzdem namhafte Mengen der Antibiotika am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders organische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungsmittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol und Butanole, oder Ketone, z. B. Aceton und Methyläthylketon, oder aber organische oder anorganische Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Gemisch vorteilhaft bei einem pu über 7 mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, beispielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlenwasserstoffen, z. B. Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, z. B. Methylpropylketon, Methylamylketon oder Diisobutylketon, Alkohlen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopropyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern und dergleichen. An Stelle einer Lösungsmittelextraktion der Kulturen oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation kann man die Antibiotika auch durch Adsorption gewinnen, beispielsweise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschließende Extraktion des Adsorbates z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.
,Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vorgängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung läßt sich dadurch erzielen, daß man die antibiotikahaltigen organischen Extrakte mit einer sauren wäßrigen Lösung mit einem pA unter 5 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in die wäßrige Phase übergeht. Eine geringe Menge Aktivität bleibt in der organischen Phase zurück. Die vereinigten sauren wäßrigen Lösungen werden dann bei einem px über 7 in der beschriebenen Weise wieder mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert. Diese Prozedur kann mehrere Male wiederholt werden. Als saure wäßrige Lösungen eigner. sich verdünnte Säuren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphatpuffer.
Ein gutes Reinigungs- und gegebenenfalls Trennungsverfahren für die neuen Antibiotika stellt die Verteilung zwischen einer sauren oder einer alkoholischen wäßrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel dar. Zweckmäßig erfolgt die Verteilung nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten. Auch Chromatographie ist zur Reinigung und gegebenenfalls Trennung geeignet. Die Gewinnung der reinen Antibiotika in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Chloroform, Aceton-i@lethanol-(@emischen, Aceton-Äther-Gemischen, Aceton-Petroläther-Gemischen oder Benzol-Methanol-Gemischen, vor. Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wäßrig-organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, verdünntes Aceton USW.
Das Antibiotikum Cinerubin A kristalliierte in stark lösungsmittelhaltigen Plättchen, die beim Trocknen an der Luft oder im Vakuum zu einem dunkelroten Pulver zerfallen. F. = 155 bis 157°. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 61,12 0/a, H = 7,03 °/a, N = 1,910/0, O C H3 = 4,08 °/o. Sein UV-Absorptionsspektrum zeigt Banden bei folgenden Wellenlängen: 234mp. (log E = 2,28), 258 m#t (log E = 2,36), 292 m@a, (log E = 1,92), 4,75 m#L (log E = 2,05), 495 m#t (log E = 2,11) und 530 m#t (log E = 1,94). Im Infrarotspektrum sind Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,9 p., 3,4 #t, 3,5 N., 5,77 #t, 6,06 It, 6,21 p,, 6,81 7,02 @., 7,06 7,21 7,55 #t, 7,68 #t, 7,88 #t, 8,14 #t, 8,56,, 8,88 9,05 9,56 9,84 #t, 10,37 &,, 10,78 V., 11,19 #L, 11,31 11,79 #t" 12,32 V., 12,71 V. (Bande mit dreifacher Spitze), 13,10 #t" 13,49 V., 13,75 #t und 14,21 Bei der Hydrolyse mit verdünnten Mineralsäuren zerfällt das Antibiotikum Cinerubin A in zwei reduzierende Zuckerkomponenten und in ein neutrales, antibiotisch wirksames Aglykon, das Cinerubinon. Dieses bildet leuchtendrote Kristalle vom F. 217 bis 220°. Die Elementaranalyse ergibt die folgenden Werte: C = 63,70°/o, H = 5,380/0, (C)CH, = 3,420/" O C H3 = 7,27"/, und aktiver Wasserstoff = 1,26'/,. Im UV-Spektrum sind Banden bei den folgenden Wellenlängen sichtbar: 234m, (log E = 3,01), 258 m#t (log E = 2,68), 294 m#L (log E = 2,25), 470 m#L (log E = 2,30), 495 mV. (log E = 2,34), 515 mp, (log E = 2,28) und 530 mp, (log E = 2,20).
Cinerubin B bildet leuchtendorangegefärbte Kristalle, die bei 180 bis 181' schmelzen. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 59,76 °/a, H --- 6,50 °/, 0 = 30,44°/0,N = 1,78°/o, OCHS = 4,54°i, C-CH3 -= 6,38 °/o. Sein UV-Spektrum zeigt Banden bei folgenden Wellenlängen: 235 mp, (log = 2,77), 258 m#t (log E = 2,46), 291 m#L (log E = 2,03), 297 m#L (Inflexion), 394 mp, (Inflexion), 415 mV, (Inflexion), 471 m&, (Inflexion), 488 m#t (log E = 2,24), 497 m#L (log E = 2,27), 519 mp. (log E = 2,16) und 533 m#t (log E = 2,10). Im Infrarotspektrum sind Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,83 ta, 3,38 p., 3,58 u" 5,71 6,16 6,78 @" 7,02 V,, 7,47 #t, 7,60 #t, 8,06 #t" 8,48 8,75 9,41 9,72 V., 9,90 g,, 10,18 #t, 10,62 &,, 11,62 12,15 #t, 12,43 #t und 12,85 Bei der Hydrolyse von Cinerubin B mit verdünnten Mineralsäuren wird das gleiche Aglykon Cinerubinon gebildet, das auch bei der Hydrolyse von Cinerubin A entsteht.
Die Cinerubine zeigen eine gewisse Ähnlichkeit mit Rhodomycin A und B (H. Brockmann und Mitarbeiter, Chem. Berichte, 88, S. 1792 [1955], und frühere, dort zitierte Mitteilungen), doch verhalten sie sich bei der Papierchromatographie verschieden. Weiter unterscheidet sich das aus Cinerubin A und B erhaltene Aglykon Cinerubinon von a-Rhodomycinon durch seinen Schmelzpunkt, seine analytische Zusammensetzung und vor allem durch sein Infrarot-Absorptionsspektrum.
Die Salze von Cinerubin A und Cinerubin B leiten sich von den bekannten anorganischen und organischen Säuren ab, beispielsweise von der Salzsäure, den Schwefelsäuren, der Essig-, Propion-, Valerian-, Palmitin- oder Ölsäure, der Bernsteinsäure, Zitronensäure, Mandelsäure, Glutaminsäure oder Pantothensäure. Sie stellen neutrale oder saure Salze dar. Ihre Herstellung erfolgt durch Einwirkung der entsprechenden Säuren auf die freie Base oder durch doppelte Umsetzung von Salzen, beispielsweise von Cinerubinsulfat mit pantothensaurem Calcium.

Die Antibiotika Cinerubin A und B besitzen eine antibiotische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Testorganismen. Verwendet man als Testmethode in vitro Verdünnungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37° bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentrationen

Hemmende Konzentration

Testorganismen #tg/cm3

Cinerubin A Cinerubin B

Micrococcus pyogenes, var.

aureus.................. 0,1 10

Micrococcus pyogenes, var.

aurens, penicillinresistent . . 1 10

Streptococcus pyogenes .... 0,01 1

Streptococcus viridans...... 0,01 I 0,01

Streptococcus faecalis ...... 1 10

Corynebacterium diphtheriae 0,001 0,1

Bacillus megatherium ...... 0,01 1

Candida vulgaris . . . . . . . . . . . 0,1 1

Endomyces albicans . . . . . . . . 0,01 1

Mycobacterium tuberculosis* 1 10

Entamoeba histolytica" * ... < 33 I < 100

In Kirchners synthetischem Medium mit 500u bovinem Albumin kultiviert; Ablesung des Wachstums nach 2 Wochen.

@°y° Kultur in Bacto-Entamoeba .'Medium: Ablesung der amoebiciden Wirkung nach 24 Stunden.
Die Entwicklung von Influenzavirus auf isolierten Membranen der Hühner-Chorioallantois von 14tägigen Bruteiern wird von Cinerubin A und B noch in einer Konzentration von weniger als 1 #tg/cm3 gehemmt, während das Chorioallantoisgewebe selbst durch 100 #tg/cm3 nicht toxisch geschädigt wird.
Ferner sind die Cinerubine stark tumorhemmend wirksam, so wird z. B. das Wachstum des Mäusetumors Adenocarcinom E0 771 stark gehemmt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung bilden außer den Herstellungsverfahren für die kristallinen Antibiotika Cinerubin A und B und für ihre neutralen und sauren Salze auch die genannten Verbindungen selbst, insbesondere die Cinerubinsulfate, die Cinerubir_hydrochloride, -acetate und -pantothenate, weiter die mittels Hydrierung oder Oxydation erhaltenen Umwandlungsprodukte sowie die Spaltprodukte, wie sie z. B. bei der Hydrolyse von Cinerubin A und B erhalten werden.
Die Antibiotika Cinerubin A und B, ihre Salze und Derivate, die obengenannten Umwandlungs- und Spaltprodukte oder entsprechende Gemische können als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannten Verbindungen in :Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. als Tabletten, Dragees, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, ohne daß damit eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes beabsichtigt ist. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 Man bereitet eine Nährlösung der Zusammensetzung: 20 g Sojamehl, 20 g Mannit und 1 1 Leitungswasser und stellt sie auf PH 7,8 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500-cm3-Erlenmeyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500-1-Fermentern (mit je 3001 Nährlösung) abgefüllt und 20 bis 30 Minuten bei 1 atü sterilisiert. Dann impft man mit bis zu 10 0%0 einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Streptomyces cinereoruber war. fructofermentans an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Volumen steriler Luft pro Volumen Nährlösung pro Minute) bei 27°. Nach 70 bis 120 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die antibiotisch wirksame wäßrige Lösung, die hauptsächlich Cinerubin A enthält, vom My cel und anderen festen Bestandteilen. Beispiel 2 Verwendet man an Stelle des im Beispiel 1 angegebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen a), b), c), d) oder e), so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit Streptomyces cinereoruber war. fructofermentans, Inkubation bei 27° und Filtration wäßrige antibiotisch wirksame Lösungen, wobei mit den Nährlösungen a), b), c) und e) ein Gemisch von Cinerubin A und B und mit Nährlösung d) vorwiegend Cinerubin B erhalten wird.
a) 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt (Oxo Lab Lemco), 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; p$ vor der Sterilisation 7,5.
b) 10 g Rohglukose, 10 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 11 Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
c) 10 g Rohglukose, 20 cm3 Maisquellwasser (corn steep liquor), 2 g sek. Kaliumhydrophosphat und 1 1 Leitungswasser; p$ von der Sterilisation 7,5.
d) 20 g Glycerin, 10 g Sojamehl, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat, 1 g Natriumnitrat und 11 Leitungswasser; p$ vor der Sterilisation 7,5.
e) 20 g Mannit, 20 g -Distillers solubles", 3 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat und 1 1 Leitungswasser; PH vor der Sterilisation 7,8. Beispiel 3 Der Filterrückstand eines gemäß Beispiell oder 2 erhaltenen 150-1-Ansatzes wird mit 251 Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikumhaltigen Acetonlösungen vereinigt im Vakuum auf 5 1 einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird nun bei pH 8,5 mit 701 Äthylacetat im Westfalia-Extraktor ausgezogen, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase übergeht. Der Extrakt wird nun mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 51 eingedampft und dann mehrere Male mit 0,5 n-Essigsäure ausgeschüttelt. Die Äthylacetatlösung zeigt nun eine geringe antibakterielle Aktivität, während der Hauptteil der Aktivität in den essigsauren Lösungen gefunden wird. Diese orangerotgefärbten Lösungen werden vereinigt, mit 2 n-Sodalösung auf ph 8,5 gebracht, wobei die Farbe nach Violett umschlägt, und erneut mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird erneut mit 0,5 n-Essigsäure ausgezogen, worauf diese, wie beschrieben, alkalisiert und extrahiert wird. Schließlich trocknet man die Äthylacetatlösurg über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Man erhält so die dunkelrotgefärbten, antibakteriell hochwirksamen Rohbasen.
Der Äthylacetatextrakt, der nach der beschriebenen Behandlung mit verdünnter Essigsäure noch eine relativ geringe antibakterielle Aktivität zeigt, wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält ein dünnflüssiges, rotes. Öl. Dieses wird mit Petroläther behandelt, wobei ein rotes Pulver erhalten wird, das je nach der venvendeten Nährlösung aus Cinerubin A, Cinerubin B oder Gemischen davon besteht.
Beispiel 4 2,95 g der gemäß Beispiel 1 und 3 erhaltenen Rohbasen werden einer 120stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet: 5 V olumteileTetrachlot kohlenstoff, 4,5 Volumteile Methanol und 0,7 Volumteile Wasser. Nach dem Eindampfen des Inhaltes der einzelnen Verteilungsgefäße im Vakuum bei 30' findet man bei den Stufen 7, 51, 63, 88 und 115 kleine Substanz- und Aktivitätsmaxima, während die Hauptmenge der Substanz und der Aktivität bei Stufe 22 angereichert ist. Die Fraktionen 14 bis 35 werden vereinigt, und man erhält 1,61 g papierchromatographisch einheitliches Cinerubin A. Es wird aus einem Aceton-11ethanol-Gemisch umkristallisiert und bildet stark lösungsmittelhaltige Plättchen, die beim Trocknen zu einem dunkelroten Pulver zerfallen. F. = 155 bis 157°. Analyse: C 61,12°;'0, H 7,03°;0, N 1,910;0, 0 CH34,08010. UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 234 mp, (log E = 2,28), 258 mu. (log E = 2,36), 292 mu, (log E = 1,92), 475 mu. (log E = 2,05), 495 mu, (log E = 2,11) und 530 mu, (log E = 1,94). IR.-Absorptionsspektrum in Nujol: Banden unter anderem bei folgenden Wellenlängen: 2,9 li., 3,4 #t, 3,5 ;u, 5,77 #t, 6,06 #L, 6,21 #t" 6,81 u" 7,02 &t" 7,06 u, 7,21 #t1 7,55 u" 7,68 u, 7,88 8,14 ,1" 8,56 ta, 8,88 #L, 9,05 #t, 9,56 t-, 9,84 p#, 10,37 10,78 #t" 11,19 #t" 11,31 u,11,79 Ei" 12,32 #t" 12,71 #t (Bande mit dreifacher Spitze), 13,10 Er, 13,49 [L" 13,75 #t und 14,21 #t.
Im Rundfilter-Papierchromatogramm mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid zeigt Cinetubin A einen R,-Wert von 0,55. Unter den gleichen Bedingungen bleiben Rhodomycin A und B an der Auftropfstelle. Beispiel 5 Eine Lösung von 50 mg Cinerubin A in 10 cm3 1 n-Schwefelsäure wird 20 Minuten auf 100 erhitzt. Dabei scheiden sich rote Flocken aus. Nach dem Abkühlen wird die rote Lösung mit Äthylacetat ausgeschüttelt, wobei die Farbe in die organische Phase übergeht.
Die wäßrige Phase wird nun mit 2 n-Bariumhydroxyd neutralisiert, filtriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand enthält mindestens zwei reduzierende Zucker, die im Papierchromatogramm mit einem mit Wasser gesättigten Gemisch von Butanol-Eisessig (9: 1) R,--Werte von 0,13 bzw. 0,38 zeigen.
Die rotgefärbten Äthylacetatextrakte werden mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. -Man erhält das Cinerubinon aus einem Benzol-Methanol-Gemisch in leuchtendroten Kristallen; F. = 217 bis 220°. Analyse: C 63,700f0, H 5,38 0;'0, (C) C H3 3,42 0; 0, 0 C H;3 7,27 0j 0, akt. H 1,26 07, UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: Banden bei 234 mu, (log E = 3,01), 258 mu, (log E = 2,68), 294 mu. (log E = 2,25), 470 mu. (log E = 2,30), 495 mu, (log E = 2,34), 515 mu. (log E = 2,28) und 530 mu. (1o;; E = 2,20). IR-Absorptionsspektrum in Kaliumbromid: Banden unter anderem bei 2,87 u,, 3,00 u., 3,25 u,, 3,43 u., 3,52 u" 5,78 6,06 u., 6,24 u, 6,88 u., 7,07 u,, 7,55 u., 7,69 u., 8,13 @i" 8,30 u,, 8,54 u., 8,84 u., 9,06 u 9,34 u" 9,56u., 9,75 u" 9,98 u" 10,07 u., 10,28u" 10,47 u" 11,01u" 11,59 u., 11,87 u,, 12,02 u" 12,72 u" 13,31 u,, 13,88 14,10 u, und 14,49 u,. Im Papierchromatogramm mit dem Lösungsmittelsystem Benzol-Formamid zeigt Cinerubinon einen R,-Wert von 0,8. Mit konzentrierter Schwefelsäure gibt es eine reinblaue Färbung.
Das Cinerubinon ist gegenüber verschiedenen Testorganismen antibiotisch wirksam.
Beispiel 6 16 g der gemäß Beispiel 2 (Nährlösung d) und Beispie13 erhaltenen Rohbasen werden einer 300stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei das folgende Lösungsmittelgemisch verwendet wird: 7,5 Volumteile Tetrachlorkohlenstoff, 6,375 Volumteile Methanol und 1,125 Volumteile Wasser. Der Inhalt der einzelnen Verteilungsgefäße wird im Vakuum bei 30° eingedampft. Neben kleineren Aktivitäts- und Substanzmaxima, z. B. bei den Stufen 260 bis 295, findet sich das Cinerubin A in den Stufen 54 bis 70 und das Cinerubin B in den Gefäßen 17 bis 37. Die Lösungen aus diesen Gefäßen werden vereinigt und mit 500 cm3 Wasser versetzt. Darauf trennt man die untere Phase ab und extrahiert die obere Phase noch zweimal mit je 200 cm3 Tetrachlorkohlenstoff. Die Extrakte werden vereinigt, mit etwas Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man löst den Rückstand in 50 cm' Benzol und gibt in der Wärme etwas Methanol zu. Beim Stehen scheidet sich das Cinerubin B in Form von orangegefärbten Kristallen ab. Sie werden aus dem gleichen Lösungsmittelgemisch umkristallisiert und schmelzen bei 180 bis 181°. Analyse: C 59,76 %, H6,50 0/("0 30,440/0, N 1,78 0%, O C H3 4,54 %, C - C H3 6,38 %. Das UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit zeigt folgende Banden:

A, maxf'#1l 235 258 291 297 394 415

log Ei',1ro 2,77 2,46 2,03 2,025 1,56 1,67

Amax('@) 471 488 497 519 533

log EK,m 2,17 2,24 2,27 2,16 2,10

IR-Spektrum (in Kaliumbromid) : Banden unter anderem bei 2,83 #t, 3,38 V. 3,58 #t, 5,71 V,, 6,16 #t, 6,78 #t, 7,02 7,47 #t, 7,60 #t, 8,06 V., 8,48 #t8,75 #L9,41 #t, 9,72 a,9,90 10,18 #t" 10,62 #t, 11,62 #t, 12,15 #t, 12,43 #t, und 12,85 @Z. Beispiel 7 Eine Lösung von 50 mg Cinerubin B in 10 cm3 1 n-Schwefelsäure wird 20 Minuten auf 100° erhitzt und, wie im Beispiel 5 beschrieben, aufgearbeitet. Die aus den Äthylacetatextrakten gewonnene Substanz ist identisch mit dem im Beispiel s beschriebenen Cinerubinon.

Claims

PATfi1TA\SPRUCFI: Die Verwendung von Streptomyces cinereoruber Corbaz et a1. var. fructofermentans oder eines dessen Eigenschaften aufweisenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces zur Herstellung von Cinerubin A und/oder Cinerubin B oder Gemischen davon durch übliche biologische Züchtung, Gewinnung der antibiotisch wirksamen Stoffe aus dem Kulturfiltrat, deren Reindarstellung und Herstellung von deren Salzen.