DE1037069B

DE1037069B - Herstellung des Antibiotikums E-129

Info

Publication number: DE1037069B
Application number: DEG21290A
Authority: DE
Inventors: Kenneth Arthur Lees; Salt Hill; Jean Whitfield; Stanley Ball; Betty Margaret Dyer; Wooburn Moor; Aileen Marion Mortimer; Winston Kennay Anslow; George Desmond Wilkin
Original assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Current assignee: Glaxo Laboratories Ltd
Priority date: 1956-01-13
Filing date: 1957-01-14
Publication date: 1958-08-21
Also published as: DK91561C; SE171554C1

Description

Herstellung des Antibiotikums E-129 Die vorliegend beschriebene Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Antibiotikums, insbesondere einer neuen antibiotischen Verbindung oder eines Gemisches von Verbindungen, die bzw. das vorläufig als E-129 bezeichnet wird. E-129 kann unter anderem durch submerse aerobe Gärung eines geeigneten Organismus hergestellt werden.
Das neue Antibiotikum E-129 wurde durch aerobe Züchtung eines neuerdings entdeckten Organismus erhalten, der als zum Genus Streptomyces gehörig identifiziert wurde. Dieser Organismus, der aus einer nahe bei Jericho in Transjordanien gefundenen Bodenprobe isoliert wurde, wird vorläufig als Streptomyces E-129 bezeichnet. Kulturen des Organismus Streptomyces E-129 wurden bei der National of Collection of Industrial Bacteria (N.C.I.B.) beim Department of Scientific and Industrial Research, Teddington, England, zur Aufnahme in diese Sammlung hinterlegt, und der Organismus erhielt die Nr. N.C.I.B. 8792. Der Organismus wurde ferner unter dem Namen Streptomyces ostreogriseus in der Culture Collection der Northern Regional Research Laboratories (N.R.R.L.) in Peoria, I11., USA., hinterlegt und erhielt die Nr. N.R.R.L. 2558.
Die Erfindung soll nun an Hand der folgenden vier Hauptmerkmale beschrieben werden 1. Die Eigenschaften des neuen Antibiotikums E-129, 2. die Eigenschaften des Organismus Streptomyces E-129, 3. Züchtung von Streptomyces E-129 zur Erzeugung von rohem E-129, 4. Isolierung und Reinigung von E-129.
Es sei besonders darauf hingewiesen, daß zwar die im folgenden angegebenen Daten die neuesten und zuverlässigsten der zur Zeit zur Verfügung stehenden darstellen, daß sie jedoch im Verlaufe weiterer Entwicklungen Abweichungen erfahren können.
1. Die Eigenschaften von E-129 Das neue Antibiotikum E-129 ist eine neutrale Substanz, die unter normalen Temperaturen und in Abwesenheit von hellem Licht innerhalb eines weiten pg-Wertbereichs vergleichsweise stabil ist. Sie ist in vielen organischen Lösungsmitteln ziemlich löslich, in Wasser und Kohlenwasserstofflösungsmitteln jedoch weniger löslich. E-129 weist im ultravioletten Bereich keine bedeutenden Absorptionen auf und zeigt nur eine Endabsorption, besitzt jedoch ein wohldefiniertes und eindeutiges Absorptionsspektrum im Ultrarot. E-129 weist ein weites Spektrum antibakterieller Aktivität auf. Es wirkt hauptsächlich gegen grampositive Organismen, zeigt jedoch auch eine gewisse Wirksamkeit gegen einige gramnegative Organismen. Es besitzt eine sehr geringe Toxizität, und seine Aktivität in vivo stimmt mit seiner Aktivität in vitro gut überein. Beim Vergleich des neuen Antibiotikums mit bekannten Antibiotika wurde eine gewisse allgemeine Ähnlichkeit mit Erythromycin festgestellt, von dem es jedoch leicht, hauptsächlich durch seine neutrale Reaktion und durch sein Infrarotspektrum, unterschieden werden kann.
E-129 besitzt jedoch eine deutliche Ähnlichkeit mit dem Antibiotikum Streptogramin, das von Charney und Mitarbeitern in Antibiotics Annual,1953/54, S. 171 bis 173, und in der südafrikanischen Patentanmeldung Nr. 3927/54 beschrieben ist. Es erscheint möglich, daß E-129 ein komplexes Gemisch von Substanzen darstellt, von denen einige, jedoch nicht alle und nicht in den gleichen Mengenverhältnissen, auch im Streptogramin vorliegen. Insbesondere wird angenommen, daß E-129 einen Faktor enthält, der im Streptogramin, wie es von Charney und Mitarbeitern beschrieben wurde, nicht vorhanden ist und dem wesentliche Eigenschaften zuzuschreiben sind.
E-129 kann von Streptogramin durch eine Reihe physikalischer Kennzahlen, einschließlich und besonders durch sein Infrarotspektrum und seine Wasserlöslichkeit unterschieden «erden. E-129 ist als Antibiotikum wirksamer als Streptogramin, was durch physiologische Teste, z. B. durch Versuche an Mäusen gezeigt wird.
Im folgenden soll auf die obenerwähnten Eigenschaften näher eingegangen werden: a) Eines der am stärksten charakteristischen Merkmale von E-129 ist seine chemische Neutralität, die überdies nicht darauf zurückzuführen ist, daß es amphoterer Natur ist. Soweit bisher bekannt, bildet E-129 weder mit Säuren noch mit Alkalien Salze, wodurch sich auch gewisse Schwierigkeiten bei der Extraktion und Reinigung des Antibiotikums aus Lösungen, die es in roher Form enthalten, ergeben. Streptogramin ist jedoch ebenfalls ein neutrales Material.
b) E-129 erwies sich als bei Zimmertemperatur innerhalb eines pH-Bereichs von 2 bis 10 vergleichsweise stabil; im Verlauf von 45 Minuten verliert es bei Zimmertemperatur nicht mehr als die Hälfte seiner Aktivität bei extremen pH-Werten. Seine Stabilität nimmt mit steigender Temperatur ab, und im allgemeinen ist es wohl bei p$ 7 am stabilsten. Es ist gewöhnlich unter alkalischen Bedingungen am wenigsten stabil. Diese Eigenschaften werden durch die in der folgendenTabelle wiedergegebenen Ergebnisse erläutert, die dadurch erhalten wurden, daß man Anteile filtrierter, E-129 enthaltender Nährflüssigkeit mit einem Gehalt von 100 Einh./ml verschieden lange Zeitspannen bei verschiedenen pH-Werten und Temperaturen hielt. Die »Einheit.. von E-129 ist auf die Aktivität einer willkürlich ausgewählten Zubereitung bezogen. Die Ergebnisse werden in den gleichen willkürlichen Einheiten/ml angegeben.

Tabelle I

Temperatur Zeit PH

° C

Minuten

2 7 10

20

45 95 88 52

60 30 74 105 Spur

Es sei darauf hingewiesen, daß Streptogramin bekanntlich bei der Behandlung mit Alkali bei einem pH-Wert von etwa 9,5 in Lösung geht und danach rasch inaktiviert wird.
c) Das Antibiotikum E-129 ist in Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton, Methylisobutylketon, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, Essigsäureamylester, Chloroform und Benzol stark löslich. Es ist weniger löslich in Äther und Wasser und unlöslich in Petroläther. Außerdem ist es in Wasser wenigstens doppelt so löslich wie Streptogramin (d. h., es hat eine Löslichkeit in Wasser von wenigstens 0,2 mg/ml bei 20° C). Bisher isolierte Festsubstanzen zeigen variierende Schmelzpunkte zwischen 121 und 134'C und ergeben bei der Elementaranalyse etwa folgende Werte: C 640/0, H 71)/0, Stickstoff 80/,. Streptogramin hat einen Schmelzpunkt von etwa 155°C und liefert bei der Elementaranalyse folgende Werte: Kohlenstoff 62,250/(), Wasserstoff 6,620/0, Stickstoff 8,42 d) Lösungen von E-129 in Äthanol zeigen kein charakteristisches Ultraviolettabsorptionsspektrum, sondern 1ediglich eine Ultraviolettendabsorption. E-129 besitzt jedoch ein charakteristisches Infrarotspektrum, wie dies aus den Zeichnungen ersichtlich ist.
Wie der Fig. 1 entnommen werden kann, besitzt eine 1,0°/jge Chloroformlösung von E-129 charakteristische Absorptionsbanden bei 1728 cm-' (2,99#L), 1670 cm-' (5,99 #t), 1623 cm -1 (6,16 #t), 1595 cm -1 (6,27 u,), 1420 cm-' (7,04 u.), 1360 cm-' (7,35 u.), 1340 cm-1 (7,46 u), 1306 cm-' (7,66 u.), 1148 cm-' (8,71 u.), 1104 cm-' (9,06u,) und 958 cm-' (10,44u.). Außerdem zeigt es charakteristische Banden bei 3350 cm-' (2,99 u.), 996 cm-1 (10,04 u,) und 880 cm-' (11,36 u,). Nach der Beschreibung in Antibiotics Annual (a. a. O.) und in der genannten südafrikanischen Patentanmeldung weist Streptogramin Absorptionsbanden bei folgenden Werten auf: 3,05, 3,43, 3,54, 5,80, 6,02, 6,17, 6,23, 6,35, 6,46, 6,58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, 7,64, 7,72, 7,96, 8,09, 8,20, 8,44, 8,61, 8,94, 9,45, 9,65, 9,78,10,15,10,26,10,60,10,80,10,98,11,29,11,50, 11,78, 12,28, 12,68, 13,0, 13,23, 13,40 und 14,35 #t. Eine Überprüfung des der genannten südafrikanischen Patentanmeldung beigefügten Absorptionsdiagramms ergibt jedoch, daß die obige Aufzählung zu ausführlich ist, da viele dieser Banden tatsächlich kaum erkennbar sind. In der Praxis scheinen die charakteristischen Absorptionsbanden für Streptogramin bei folgenden Werten zu liegen 3,05, 3,43, 3,54, 5,80, 6,02, 6,17 6,23, 6,35, 6,46, 6,58, 6,94, 7,03, 7,32, 7,46, 7,64, 7,72, 7,96, 8,20, 8,44, 8,61, 8,91, 9,45, 9,65, 9,78, 10,15, 10,26, 11,29, 13,25, 13,40 und 14,35 u..
Wie ersichtlich, entsprechen diese Absorptionsbanden in ihrer Lage etwa denjenigen von E-129, unterscheiden sich jedoch in einigen Fällen ausgeprägt und deutlich in der Intensität. So unterscheidet sich das Spektrum von E-129 in Nujolaufschlämmung (schweres Mineralöl) von dem des Streptogramins dadurch, daß es eine stärkere Absorption bei 810 cm-' (12,35 u.) und 1058 cm-' (9,45 #t) aufweist, während andererseits Streptogramin eine beträchtlich stärkere Absorption bei 1022 cm-' (9,78 u.) und 1575 cm -1 (6,35 u.) zeigt. Diese Unterschiede im Infrarotspektrum sind, obzwar auffallend, verhältnismäßig klein, was eine große Ähnlichkeit in der chemischen Struktur zwischen E-129 und Streptogramin vermuten läßt. Diese Unterschiede weisen jedoch auf einige strukturelle Verschiedenheiten zwischen E-129 und Streptogramin hin, die sich auch in den anderen zwischen diesen beiden Substanzen festgestellten physikalischen und physiologischen Unterschieden wiederspiegeln. Es ist beispielsweise auffallend, daß die relativen Intensitäten der verschiedenen Banden im Infrarotspektrum von E-129 von den relativen Intensitäten der Banden im Infrarotspektrum des Streptogramins verschieden sind.

Das in der genannten südafrikanischen Patentanmeldung beschriebene Infrarotspektrum des Streptogramins wurde mit einer Nujolaufschlämmung des Materials ausgemessen. Diese Methode ist zwar nicht so gut wie mit echten Lösungen durchgeführte Messungen, da es jedoch von Bedeutung ist, E-129 und Streptogramin voneinander zu unterscheiden, wurde das Infrarotspektrum von E-129 ebenfalls unter Verwendung einer NujolaufschIämmung des Antibiotikums ermittelt. Dieses Spektrum ist in Fig. 2 wiedergegeben. Wie oben erwähnt, liegen die hauptsächlichen Unterscheidungsmerkmale zwischen dem Infrarotspektrum von E-129 und dem von Streptogramin in den relativen Intensitäten der verschiedenen Absorptionsbanden; diese Unterschiede werden am besten an Hand der folgenden Tabelle erläutert, in der die angegebenen Zahlen diejenigen eines Spektrums sind, das mit einer Nujolaufschlämmung des jeweiligen Materials erhalten wurde.

Relative Intensitäten E-129 Strepto-

gramin

1 810/1 1022 . . . . . . . . . . . . . . . . > 0,5 etwa 0,4

I 8101 1575 . . . . . . . . . . . . . . . . > 0,4 etwa 0,3

1 1058!I 1022 . . . . . . . . . . . . . . . > 0,95 etwa 0,9

I 1058/I 1575 . . . . . . . . . . . . . . . > 0,7 etwa 0,6

e) E-129 zeigt eine in gewisser Hinsicht enge Verwandtschaft in der antibiotischen Wirkung mit Erythromycin. Es kann jedoch auf verschiedenen Wegen leicht von Erythromycin unterschieden werden. Erstens, Erythromycin ist in chemischer Hinsicht eine basische Substanz, während E-129 neutral ist. Zweitens, sein Infrarotspektrum, wie es beschrieben wurde, unterscheidet sich grundsätzlich von dem des Erythromycins. Drittens, das antibakterielle Spektrum von E-129 unterscheidet sich deutlich von dem des Erythromycins. Ferner ist bekannt, daß beim Vermischen von Erythromycin in wäßriger Lösung mit 2 n-Schwefelsäure und 30minütigem Stehenlassen die erhaltene Lösung ein scharfes Absorptionsmaximum bei 485 m#t aufweist (vgl. Ford und Mitarbeiter, Analytical Chemistry, 1953, Bd.25 (8), S. 1195). Unter diesen Bedingungen tritt bei E-129 bei 485 m#t kein scharfes Absorptionsmaximum auf.

Die qualitativen Unterschiede in den mikrobiologischen Spektren sind zum Teil auffallend, jedoch weniger aufschlußreich als der quantitative Vergleich. Die quantitative Unterscheidung kann an Hand der Schwankung zwischen den relativen antibakteriellen Aktivitäten von E-129 und Erythromycin gegenüber mehreren verschiedenen Organismen gezeigt werden. Diese Schwankung in der relativen Aktivität wird unten erläutert, wobei die Ergebnisse folgendermaßen erhalten wurden: Nähragarplatten wurden mit drei verschiedenen Organismen beimpft, und Lösungen von E-129 und Erythromycin wurden im gleichen Konzentrationsverhältnis auf jede Platte aufgebracht (im Fall eines der Testorganismen, nämlich Sarcina lutea, wurden jedoch die absoluten Konzentrationen auf Grund seiner größeren Empfindlichkeit herabgesetzt). Die Aktivität der Lösungen jedes der beiden Antibiotika gegenüber dem Testorganismus wird als Durchmesser der entstandenen Inhibitionszone angegeben. Aus diesen Ergebnissen werden angenäherte Werte für die Aktivität von E-129 gegenüber dem jeweiligen Testorganismus als Aktivität von Erythromycin gegenüber diesem Organismus berechnet und als p,g/ml Erythromycin angegeben.

Tabelle II

Durchmesser der

Inhibitionszone Aktivität von

Testorganismus in mm E-129 (angege-

ben als #tg/ml

Erythro- E-129 Erythromycin)

mycin

Sarcina Lutea. . (a) 19,0 15,9 20

(b) 16,7 12,8

Staphylococcus.. (a) 20,5 20,2 40

aureus .........(b) 18,6 17,7

Micrococcus .... (a) 21,6 25,9 150

flavus . . . . . . . . . . (b) 18,9 23,1

Es ist offensichtlich, daß die in der obigen Tabelle für die E-129-Aktivität als Erythromycin angegebenen absoluten Werte nicht von Bedeutung sind. Das aus der Tabelle zu entnehmende auffallende Ergebnis ist die 7fache Steigerung der Aktivität von E-129 im Verhältnis zu Erythromycin zwischen Sarcina lutea und Mikrococcus flavus, die eine Unterscheidung zwischen den beiden Antibiotika ergibt.

f) In der folgenden Tabelle wird das mikrobiologische Spektrum des Antibiotikums E-129 wiedergegeben:

Tabelle III

Mikrobiologisches Spektrum des Antibiotikums E-129

Minimum der In-

hibitionskonzen-

tration einer teil-

weise gereinigten

Festsubstanz in

#tg/ml

Corynebacterium diphtheriae gravis . . 0,01 a. d.

Sarcina lutea ..................... 0,01 aal.

Mikrococcus flavus ................ 0,03 aal.

Staphylococcus aureus (C. 186) ...... 0,3 a. d.

" " (663) . . . . . . . . 0,5 b. d.

Staphylococcus pyogenes (3010) ..... 0,2 a. d.

" (3030) ..... 0,2 a. d.

" (3102) ..... 0,2 a. d.

" (3035) ..... 0,2 a. d.

" (3099) ..... 0,4 a. d.

" (3106) ..... 0,4 a. d.

Staphylococcus aureus (Terramycin-re-

sistent) ......................... 0,4 aal.

Staphylococcus aureus (Streptomycin-

resistent) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3 a. 1.

Staphylococcus aureus27144 (Penicillin-

resistent) ..... ................. 0,5 b. d.

Staphylococcus aureus27156 (Penicillin-

resistent) ....................... 0,25 b. d.

Staphylococcusaureus27024 (Penicillin-

resistent) ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 b. d.

Staphylococcus aureus20424 (Penicillin-

resistent)........................ 1,0 b. d.

Staphylococcus aureus 18232 (Penicillin-

resistent) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 b. d.

Staphylococcus aureus 18233 (Penicillin-

resistent) ............. ......... 0,5 b. d.

Staphylococcusaureus17512(Penicillin-

resistent) ....................... 0,5 b. d.

Staphylococcus aureus20413 (Penicillin-

resistent) ....................... 0,25 b. d.

Staphylococcus aureus 3010 (Erythro-

mycin-resistent) . . . . . . . . . . . . . . 185,0 a. d.

Streptococcus haemolyticus (GruppeA) 0,4 a. d.

" (GruppeD) 4,0 2. d.

Staphylococcus albus............... 0,9 aal.

Streptococcus Faecalis ............. 0,9 aal.

Shigella dysenteriae (Flexner) ....... 110 a. d.

Escherichia coli ................... 320 aal.

Salmonella typi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 320 a. d.

Salmonella typhimurium . . . . . . . . . . . . > 30,0 a. d.

Pseudomonas pyocyanea . . . . . . . . . . . > 30,0 a. d.

Proteus vulgaris................... > 30,0 aal.

Clostridium welchii................. > 30,0 a. d.

In der obigen Tabelle bedeuten: a. d. Agarverdünnungsteste, die in 10 °/o Blut enthaltendem Nähragar, der 24 Stunden bei 37° C bebrütet wurde, durchgeführt wurden.

b. d. Nährflüssigkeitsverdünnungsteste, 24 Stunden bei 37° C bebrütet.
g) Die Aktivität von E-129 gegenüber verschiedenen Organismen, insbesondere S. aureus, in vitro wird durch die Gegenwart von Gesamtblut in dem Testmedium nicht merkbar beeinträchtigt; eine etwas geringere Aktivität kann möglicherweise durch das kräftigere Wachstum des Testorganismus in dem bluthaltigen, in höherem Maße nährenden Medium erklärt werden, obzwar E-129 in Gegenwart von Gesamtblut etwas weniger stabil ist als in einfachen bakteriologischen Medien.

Die Wirksamkeit von E-129 in vivo wird aus mit Mäusen durchgeführten Versuchen ersichtlich, bei denen folgende Ergebnisse erhalten wurden:

Tabelle IVa

Behandlung mit

E-129 Zahl der nach der

Testorganismus Infektion bis zum

Art Dosis 7. Tag überleben-

der An- (Ein- den Mäuse

Wendung heiten)

4 I

Staphylococcus Isubcutan 4 200 4/4

aureus (Stamm 663)

2100 4/4

Infektionsdosis 1050 3/4

1000.106 525 0/4

Organismen 260 0/4

oral 8400 4/4

" 4200 14

" I 2100 0/4

" 1050 0/4

" 525 0/4

unbehandelte

Kontrollen 0/4

Streptococcus subcutan; 4200 4/4

haemolyticus 2100 414

(Stamm 618) 1050 4/4

Infektionsdosis 525 4;'4

25. 10s Organismen 260 1/4

oral 8400 6/6

" 4200 5/6

" 2100 4/6

" 1050 3/6

" 525 06

260 0/6

unbehandelte

Kontrollen 0!4

Pneumococcus Typ 1 subcutan; 3 000 4/4

(Stamm 245 E) 1500 4/4

Infektionsdosis 750 3/4

10.10s Organismen 375 0/4

" 180 0/4

unbehandelte

Kontrollen 0/4

MitE-129behandelte, subcutan! 4 200 4/4

nicht infizierte " . j 2 100 4/4

Kontrollen oral 4 200 4/4

" 2100 4/4

Bt r den vorstehend beschriebenen Versuchen wurde die Lifektionsdosis durch intraperitoneale Injektion verabreicht, und die Behandlung erfolgte mit einer wäßrigen Suspension des Antibiotikums, wobei jede Dosis 0,2 ml betrug. Die erste Dosis wurde 30 Minuten nach der Infektionsdosis gegeben, woran sich dann drc i weitere Dosen nach 8, 24 und 32 Stunden anschlossen (insgesamt vier Dosen). Feste Präparate mit gleicher Wirkungsstärke (3000 Einheiten; mg) wie das oben verwendete wiesen folgende Toxizität auf:

Tabelle IVb

Mäuse (Stamm A 2G, Geschlecht - männlich,

Körpergewicht 16 bis 22 g)

Art der Anwendung Beobachtungs- LD;o

zeit in mg/kg

Intravenös ........... 48 Stunden 83

Intraperitoneal . . . . . . . 7 Tage 460

Subcutan ............ 7 Tage 3500

Oral................. 7 Tage 5000

Es sei erwähnt, da die durchgeführten Versuche gezeigt haben, daß E-129 vom Darm absorbiert wird und daß es unter Erzielung eines therapeutischen Spiegels in dem Versuchstier oral verabreicht werden kann.

h) Bei der Anwendung chromatographischer Arbeitsweisen auf E-129 wurden folgende Ergebnisse erhalten Eine papierchromatographische Trennung wurde mit filtrierter Nährflüssigkeit und teilweise gereinigten Konzentraten von E-129 unter Anwendung absteigender Entwicklung mit Whatman-Papier Nr. 1 bei 28° C durchgeführt. Dabei wurden folgende Rf-Werte beobachtet: mit 1 °/oigem Eisessig als Entwicklungslösungsmittel R j, = 0,64 mit 3 °!siger Ammoniumchloridlösung als Entwicklungslösungsmittel Rf = 0,65 mit Methanol: Aceton: Wasser (19: 6 : 75 Volumen/ Volumen) als Entwicklungslösungsmittel R f = 0,78 2. Die Eigenschaften von Streptomyces E-129 Streptomyces E-129 wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die in etwa 120 m Höhe über dem Meer in der Nähe von Jericho (Transjordanien) genommen wurde. Eine gewisse Bodenmenge wurde mit sterilem Wasser beträchtlich verdünnt und aliquote Anteile wurden in Petrischalen mit Bennets-Agar vermischt. Nach 5tägiger Bebrütung bei 28°C wurden die Aktinomyceten-Kolonien entnommen, und ihre antibiotische Aktivität wurde durch weitere 5tägige Züchtung auf der Oberfläche eines Kartoffel-Pepton-Agars und Ausschneiden von Agarscheiben aus der Kolonie, die dann auf ihre Aktivität gegen Staphylococcus aureus geprüft wurden, nachgewiesen.
Bei der submersen Gärung von 50-ml-Volumina verschiedener Medien in konischen Flaschen von 250 ml Fassungsvermögen wurden innerhalb einer Zeitspanne von 1 bis 4 Tagen Antibiotikaausbeuten erzielt, wobei der Spitzentiter sehr rasch in etwa 24 bis 36 Stunden erreicht wurde. Diese verhältnismäßig rasche Entwicklung ist eines der charakteristischen Merkmale des Streptomyces E-1.29.

Streptomyces E-129 kann durch Untersuchung des Wachstums auf verschiedenen organischen Medien und seiner Fähigkeit verschiedenartige Kohlenstoffverbindungen, unter den von Pridham, T. G., und Gottlieb, D. (J. Bact. 1948, Bd. 56 [l], S.107 bis l14), beschriebenen Bedingungen, zu verwerten, charakterisiert werden. Diese Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen wiedergegeben.

- Tabelle V a

- - - Wg;@hstumseigenschaften,xön-Streptomyces E-129

Vegetativ-Luftmycel Lösliches

Medium - - Wachstum und Sporen - Pigment Bemerkungen

Hafermehlagar - gut White bis Pale Mouse Gray Strontian Oberfläche faltig Sporu-

(Weiß bis Mattmausgrau) Yellow Tation gut nach 3 Tagen

(Strontian-

gelb)

Czapek-Dox mäßig Vegetatives Mycel (gelblich- blaßbräun- Sporulation mäßig nach

cremefarben) Luftmycel lichgelb 3 Tagen

Pale Mouse Gray (Mattmaus-

grau)

Glucose-Nähragar mäßig Pale Mouse Gray (Mattmaus- blaßbraun Oberfläche faltig, Sporu-

bis gut (grau) Tation mäßig

Stärkenitrat ausgezeichnet White bis Pallid Mouse Gray blaß- Oberfläche glatt, Unter-

(Weiß bis Blaßmausgrau) grünlichgelb seitenfärbung. Pale

Ochraceous Buff to Pin kish

- Buff (Mattockerartigleder-

farben bis Rosalederfarben)

Synthetischer Agar schlecht rehfarbenes Mucoid keins

Asparaginglucose mäßig Myceldurchsichtiges Mucoid keins Sporulation geringfügig,

bis gut Unterseite cremefarben

Kartoffelschnitzel mäßig Pale bis Pallid Mouse Gray schwach- Sporulation dürftig

bis gut (Matt- bis Blaßmausgrau) braun -

Gelatine schlecht bis schmutzig weiß (Dirty ausgeprägtes starke Verflüssigung

mäßig, nur auf white) Maßbraunes

- .der Oberfläche - Pigment

Nähragar gut Mucoidrehfarben tiefbraun Oberfläche faltig

Nitratbrühe mäßig Pallid Mouse Gray (Blaß- Old Gold Sporulation gut, Nitrat-

' mausgrau) - (Altgold) reduktion vernachlässigbar

Lakmusmilch schlecht - schwach- geringe Peptonisafion oder

dunkel pA-Veränderung

werdend

Natriumsuccinatagar gut Pallid Mouse Gray (Blaß- keines Oberfläche glatt, Unterseite

mausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt-

- ockerartiglederfarben)

Natriumcitratagar mäßig Pallid Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite

(Blaßmausgrau) Pale Ochraceous-Buff (Matt-

-- ockerartiglederfarben)

Calciummalatagar kein Wachs- Pallid Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite

tnm nach (Blaßmausgrau) weiß

3 Tagen, . -

Wachstum

gut bis mäßig '

' -nach

6 Tagen. -

Maltoseagar ausgezeichnet Pallid bis Pale 14louse Gray keines Oberfläche faltig, Unterseite

oder Pale Smoke Gray (Blaß- Pale Ochraceoüs Buff (Matt-

bis Mattmausgrau oder Matt- ockerartiglederfarben)

rauchgrau

Arabinoseagar ausgezeichnet Pallid Mouse Gray bis Pale keines Oberfläche glatt, Unterseite

Olive Gray (Blaßmausgrau Pale Ochraceous Buff (Matt-

bis Mattolivengrau) ockerartiglederfarben)

Lactoseagar sehr schlecht Pallid Mouse Gray keines nahezu kein Wachstum in

(Blaßmausgrau) 6 Tagen

Rhamnoseagar mäßig nach Pale Mouse Gray - keines Oberfläche glatt, Unterseite

3 Tagen; (Mattmausgrau) Pale Ochraceous Buff

ausgezeichnet (Mattockerartiglederfarben)

nach

6 Tagen.

Saccharoseagar gut bis Mucoid nach 3 Tagen Pallid keines Oberfläche glatt, Unterseite

mäßig- bis Pale-Mouse Gray (Blaß- Pale Ochraceous Buff (Matt-

bis Mattmausgrau) nach ockerartiglederfarben)

6 Tagen

Laevuloseagar mäßig Pallid Olive bis Pallid Mouse keines Oberfläche glatt. Unterseite

Grat' (Blaßoliven- bis Blaß- Pale Ochraceous Buff (Matt-

- mausgrau) ockerartiglederfarben)

ß09 548/519

Medium Wachstum Vegetativ-Luftmycel Lösliches Bemerkungen

und Sporen Pigment

Inulinagar mäßig Pallid bis Pale Mouse Gray keines Oberfläche faltig, Unterseite

(Blaß- bis Mattmausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt-

ockerartiglederfarben)

Mannitagar keines

Galactoseagar ausgezeichnet Smoke Gray bis Pale Mouse keines Oberfläche glatt, Unterseite

Gray (Rauchgrau bis Matt- Pale Ochraceous Buff (Matt-

mausgrau) ockerartiglederfarben)

Nyloseagar gut Pallid Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite

(Blaßmausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt-

ockerartiglederfarben)

Sorbitagar sehr schlecht keines sehr dürftiges Wachstum

Raffinoseagar ausgezeichnet Pallid bis Pale Mouse Gray keines Oberfläche glatt, Unterseite

(Blaß- bis Mattmausgrau) Pale Ochraceous Buff (Matt-

ockerartiglederfarben)

Dulcitagar keines

Salicinagar sehr schlecht Pallid Mouse Gray keines

nach (Blaßmausgrau)

6 Tagen

Inositagar sehr schlecht Pallid Mouse Giay keines

nach (Blaßmausgrau)

6 Tagen

Stärke ausgeprägte Hydrolyse

Alle Farbangaben unter Verwendung großer Anfangsbuchstaben entsprechen denen von Rigdeway, Colour Standards z Nomen-

klature, Washington, 1912.

Alle Angaben wurden nach 3tägiger Bebrütung bei 28°C gemacht, außer in den besonders bezeichneten Fällen.

Es sei darauf hingewiesen, daß die vorstehenden Versuche bezüglich der Verwertung von Energiequellen unter besonderen Wachstumsbedingungen durchgeführt wurden und daß die Tatsache, daß der Aktinomycet bestimmte Energiequellen unter den Versuchsbedingungen nicht verwertet, nicht ausschließt, daß unter anderen Bedingungen eine Verwertung beobachtet werden kann.

Die mikroskopische Untersuchung von auf Gelatinefilm gewachsenem Streptomyces E-129 läßt folgende Eigenschaften erkennen: Das primäre Mycel zeigt sehr feine monopodische verzweigte Hyphen ; es besteht ein beträchtlicher Größenunterschied in den Ausmaßen der Hyphen im primären und im sekundären Mycel. Die Conidien werden in langen geraden und hauptsächlich unverzweigten Ketten erzeugt, sind gewöhnlich ellipsoid und haben eine Größe von etwa 0,7 mal 0,5 #t. Der Durchmesser des primären Mycels von Streptomyces E-129 liegt beträchtlich unter 0,5 #t ,während der des sekundären Mycels etwa 0,5 #t beträgt.
Nach der in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 6th Edition, angegebenen Determination ähnelt Streptomyces E-129 in gewisser Weise dem Streptomycesgriseolus, kann von dieser Species jedoch durch einen Vergleich der Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen unterschieden werden, wie in der folgenden Tabelle gezeigt wird.

Unter Zugrundelegung des Schemas für die Erkennung von Species von Antibiotika erzeugenden Isolaten auf der Basis der Verwertung von Kohlenstoffverbindungen in einem chemisch definierten Medium nach Pridham, T. G., und Gottlieb, D. (a. a. O.), S. 113, ergibt sich für Streptomyces E-129, daß er eine Species des Nocardia ist, was offensichtlich nicht logisch ist, da die Wachstumseigenschaften zeigen, daß der Aktinomycet dem Genus Streptomyces der Ordo Aktinomycetales gemäß der Klassifizierung in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology (6th Edition), S.938, angehört. Streptomyces E-129 stellt demnach eine neue Species dar.

Tabelle Vb

S.griseolus*)

Verbindung NRRL S. E-129

B-1062

Saccharose ................ - ++

Raffinose ................. -

Inulin ........ . ........... - -

Calciumsuccinat ........... - ++

....+ ausgezeichnetes Wachstum,

-+--+- gutes Wachstum,

mäßiges Wachstum,

- kein Wachstum.

*j Benedict, R. G., Lindenfelser, L. A., Stodola, F. H.,

und Traufler, D. H. (J. Bact., 1951, Bd. 62 [4], S. 487 bis

497).

3. Züchtung von Streptomyces E-129 unter Bildung von rohem E-129 Das Antibiotikum E-129 wird durch aerobe Züchtung geeigneter Stämme des Organismus Streptomyces E-129 auf oder in sein Wachstum fördernden Medien erzeugt. Diese Medien sind gewöhnlich von der Art, wie sie für die Züchtung von Pilzen des Genus Streptomyces geeignet sind, und sollten eine oder mehrere Quellen assimilierbaren Stickstoffs, eine Kohlenstoff- und Energiequelle und Nährsalze enthalten. Die Züchtung wird vorzugsweise unter aeroben submersen Bedingungen geführt.

Vorzugsweise werden Medien verwendet, in denen die Stickstoffquelle in Form eines komplexen organischen Materials vorliegt. Das Mehl von Bohnen, z. B. Sojabohnen, ist zufriedenstellend, doch hat sich Hafermehl im besonderen als für diesen Zweck, besonders wenn es durch Fischmehl oder Maisquellwasser vervollständigt wird, als hervorragend geeignet erwiesen. Die Kohlenstoff- und Energiequelle kann ein Zucker wie Dextrose, Maltose, Saccharose (z. B. brauner Zucker) oder vorzugsweise Glucose oder in einigen Fällen vorteilhaft Stärke sein, die entweder in der als Stickstoffquelle dienenden organischen Substanz bereits vorliegt oder dieser zugesetzt wird. Nährsalze sollen in dem Maße, wie sie erforderlich sind, zugegeben werden, und die Verwendung der folgenden Stoffe entweder allein oder in Kombination hat sich als vorteilhaft erwiesen: Natrium- und Magnesiumchlorid, Kaliumhydrogenphosphat (K2 H P O4 und K H2 P 04), Calciumcarbonat und Magnesium-, Zink-, Ammonium- und Ferrosulfat.

Lediglich zur Erläuterung werden weiter unten Beispiele für eine Anzahl von Medien angegeben, die sich als das Wachstum von Streptomyces E-129 unter Bildung des Antibiotikums E-129 fördernd erwiesen haben. Wie für den Fachmann offensichtlich, eignen sich viele Medien für die Züchtung vonIE-129, und geeignete Medien können durch Versuchsfermentationen leicht ermittelt werden.

Medium I

Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 30/0

Distillers Solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,750/0

Natriumchlorid p$ 7,6 ± 0,1 . . . . . . . . 0,250/0

Medium II

Maltose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/0

Bacto-pepton ..................... 0,5%

Distillers Solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,50/0

Natriumchlorid pH 6,4 :E 0,1 . . . . . . . . 0,50/0

Medium III

Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 20/0

Distillers Solubles . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10/0

Säurehydrolysiertes Kasein . . . . . . . . . . 0,070/0

Bengers enzymatisches Casein ....... 0,070/0

Marmite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,070/,

Hafermehl ........................ 0,5 0/0

Malzextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 0,250/0

Natriumchlorid .................... 1,125%

Kaliumhydrogenphosphat . . . . . . . . . . . 0,1250/0

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0

Dextrose ......................... 0,5 0/0

Maltose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,250/0

Brauner Zucker (40 Stück) p$ bis 7,3

i 0,1.......................... 0,25o/0

1stündiges Rühren und erneute pH-Einstellung auf

7,3 -j- 0,1.

Medium IV

Hafermehl ........................ 2,5 0/0

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 0/0

Dextrose pH 6,8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0

Medium V

Gelbes Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,0 0/0

Tyrosin........................... 0,2 0/0

Ammoniumphosphat ............... 0,4 0/0

Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0

Kaliumhydrogenphosphat . . . . . . . . . . . 0,2 0/0

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,350/0

Magnesiumsulfat (Mg S04 # 7H20) .... 0,1 0/0

Ferrosulfat (Fe S 04 . 7 H20) ...... . . 0,0020/0

Zinksulfat (Zn S 04 . 7 H2 0) . . . . . . . . . . 0,0010/0

Manganchlorid (MnC12) p. 6,8 ....... 0,0002%

Medium VI

Maismehl ......................... 4,0 0/0

Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 4,0 0/0

Ammoniumsulfat .................. 0,1 0/0

Calciumcarbonat p$ 7,0 . . . . . . . . . . . . 1,0 0/0

Medium VII

Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 4,0 0/0

Stärke............................ 0,5 0/0

Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0

Calciumlactat p. 7,6. . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0

Medium VIII

Gewalztes Sojabohnenmehl . . . . . . . . . 1,5 0/0

Maisquellwasserfeststoffe . . . . . . . . . . . . 0,5 0/0

Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,251)/,

Kalk (leicht gefällt) . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 0/0

lösliche Stärke pH 6,5 . . . . . . . . . . . . . . . 1,5 0/0

Unter Verwendung der oben angegebenen Medien IV und VIII wurden gute Ausbeuten an E-129 sowohl bei kleinen Ansätzen als auch bei Ansätzen im technischen Maßstab erhalten. Vorzugsweise wird das Medium IV verwendet, das, wie sich gezeigt hat, ausgezeichnete Ergebnisse bei 150-1-Gärtanks liefert, obwohl dieses Medium wahrscheinlich unzureichend (vermutlich bezüglich des Stickstoffs) ist, da ein Zusatz von Maisquellwasser und Fischmehl Steigerungen der Ausbeute in der E-129-Aktivität in Schüttelkolbenfermentationen ergeben hat.

Ferner wurde gefunden, daß bei der Erzeugung von E-129 durch Züchtung eines E-129 erzeugenden Organismus, insbesondere von Streptomyces E-129, auf oder in einem geeigneten Medium verbesserte Ergebnisse, insbesondere erhöhte Titer erzielt werden, wenn das Medium verfügbares Eisen in einer Konzentration im Bereich von 30 bis 135 Teile/Million und zweckmäßigerweise von 35 bis 55 Teile/Million enthält. Bei einer Eisenkonzentration von über 135 Teile/Million beginnt sich ein beträchtlicher Inhibierungseffekt auf den Organismus einzustellen.
E-129 wird, wie bereits erwähnt, vorzugsweise durch submerse Gärung eines E-129 erzeugenden Organismus in einem Nährmedium gebildet, das eine komplexe organische Stickstoffquelle, wie Hafermehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser u. dgl., ein Kohlenhydrat und Mineralsalze enthält. Bekanntlich enthalten organische Materialien, wie die obengenannten Stickstoffquellen, häufig Spurenmengen von Eisen, und diese sollen bei der Berechnung der dem Medium für die erfindungsgemäßen Zwecke zuzusetzenden Eisenmengen berücksichtigt werden. Viele der wichtigeren komplexen organischen Stickstoffquellen, die zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden, enthalten praktisch die gleiche Eisenmenge, d. h. 10 bis 20 Teile/Million, so daß eine zusätzliche Eisenmenge von wenigstens 20 Teilen/Million und nicht mehr als 115 Teilen/Million gewöhnlich zufriedenstellend ist. Bei Verwendung eines organischen Materials mit einem davon stark verschiedenen Eisengehalt muß selbstverständlich die Menge zugesetzten Eisens entsprechend berichtigt werden.
Die Art der das zugesetzte Eisen liefernden Substanz scheint nicht von Bedeutung zu sein, solange sie in dem Gärmedium löslich und für den Organismus praktisch nicht toxisch sowie mit dem gebildeten Antibiotikum verträglich ist. Eisen sowohl im Ferro- als auch im Ferrizustand kann verwendet werden.
Als geeignete Eisenquellen haben sich Ferricitrat, Ferrichlorid und Ferroammoniumsulfat erwiesen.
Bekanntlich bildet Kalk mit Eisen Chelate. Bei manchen der für die Erzeugung von E-129 eingesetzten Medien wurde Kalk als Bestandteil neben Eisen verwendet, und trotz der bekannten chelatbildenden Eigenschaften des Kalks mit Eisen wurde eine Zunahme im Titer erzielt.
Ferner wurde gefunden, daß bei Verwendung von Maisquellwasser in einem eine Kohlenhydratquelle enthaltenden Medium ein verbesserter Titer erhalten wird. Eine Maisquellwassermenge von 0,4 bis 0,9 °./s (bezogen auf das Gewicht der Feststoffe) des Gewichts des Mediums, vorzugsweise eine Menge von 0,7 Gewichtsprozent Feststoffe, ist besonders geeignet. Das Maisquellwasser wird vorzugsweise gemeinsam mit einer anderen Stickstoffquelle, insbesondere Hafermehl, verwendet, wobei die bevorzugten Mengen von Hafermehl im Bereich zwischen 1 und 5 °!°, vorteilhafterweise bei 2,5 °/°, liegen.
Das Verhältnis von Maisquellwasser zu löslichen Kohlenhydraten ist zur Erzielung guter Titer ebenfalls von Bedeutung. Bei Verwendung zweier Medien, die unter anderem 0,5 bzw. 1,5 Gewichtsprozent Glucose enthalten, wird zwar in Abwesenheit von Maisquellwasser kein merklicher Titerunterschied erhalten; wenn jedoch Maisquellwasser, beispielsweise 0,7 Gewichtsprozent Feststoffe, jedem Medium zugesetzt wird, wird nicht nur eine Titersteigerung in jedem Medium erzielt, sondern es wird auch bei einem Medium, das 1,5 °/° Glucose enthält, gegenüber einem nur 0,50/, Glucose enthaltenden Medium ein erhöhter Titer erreicht. Die Wirkung des Maisquellwassers und der Kohlenhydratquelle sind- daher offensichtlich synergistisch.
Bei Verwendung von Maisquellwasser hat es sich als vorteilhäft erwiesen, wenn 1,50/, lösliches Kohlenhydrat, insbesondere Glucose, vorhanden sind.
Ein Medium, das, wie sich gezeigt hat, zur Verwendung bei, der Erzeugung von E-129 sehr geeignet ist, enthält vorzugsweise 2,5 °/° Hafermehl, vorzugsweise 2,0 °° Kalk und vorzugsweise 1,50/, Glucose und wird mit beispielsweise Salzsäure auf ein pH von 6,8 bis 7,0 eingestellt. Außerdem wird diesem Medium Maisquellwasser in den wie oben angegebenen Mengen zugesetzt, und es enthält ferner vorzugsweise von außen zugeführtes Eisen in der oben angegebenen Menge (vorzugsweise 30 Teile/Million).
Die Gärung wird zweckmäßigerweise als Vielstufenverfahren in der üblichen Weise durchgeführt. So kann zweckmäßig eine Abschabung von Sporen oder Mycelfilz von Streptomyces E-129, die man aus einem geeigneten Schrägnähragar erhalten hat, zur Einleitung einer Impfstufe im kleinen Maßstab verwendet werden. Eine aus dieser Impfungsstufe erhaltene Submerssporensuspension kann, falls erwünscht, direkt zum Beimpfen des Produktionsmediums im großen Maßstab verwendet werden, doch wird statt dessen vorzugsweise das Produkt der Impfstufe zur- Beimpfung einer Entwicklungsstufe verwendet. Als Entwicklungsmedium kann das gleiche Medium, wie in der nachfolgenden Großerzeugungsstufe verwendet werden, öder es kann beispielsweise durch Erhöhung seiner Nährkraft modifiziert werden. Die in der Entwicklungsstufe gebildete frei wachsende und sporenbildende Vegetativkultur kann dann als Impfstoff für das Großerzeugungsmedium verwendet werden. Es hat sich gezeigt, daß durch Verwendung einer vergleichsweise geringen Menge dieses vegetativen Impfstoffs, beispielsweise 2 °; `°, bezogen auf das gesamte Erzeugungsmedium, zufriedenstellende Ergebnisse erreichbar sind.
Ein Charakteristikum von Streptomyces-E-129-Gärungen ist das frühe Auftreten des Spitzentiters. Bei 5-1- und 150-1-Fermentationen unter Verwendung der oben angegebenen Medien IV und VIII tritt diese Spitze zwischen 16 it;id 28 Stunden auf.
B(i diesen 150-1-Gärungen war, obgleich nur 2 °/° vegetatiN-` s Inokulum verwendet wurde, das Wachstum ausgezeichnet, wobei der Spitzentiter innerhalb von 16- bis 20stündiger Gärzeit erreicht wurde. Ein guter Titer ist z. B. der einer Gesamtbrühe, die bei einer Verdünnung von 1:135 bis 1:250 im Nährbrüheverdünnungsversuch nach 18 Stunden Bebrüten bei 37°C Staphylococcus aureus zu inhibieren vermag. Während der 16- bis 24stündigen Gärung in den 150-1-Gefäßen tritt keine bemerkenswerte Veränderung in dem pH-Wert-des Gärmediums ein; in 5-1-Gärungen unter Verwendung des obengenannten Mediums VIII erfolgt jedoch ein schwacher Anstieg des pH-Werts der Maische nach etwa 40 bis 48 Stunden, d. h., der pH-Wert steigt auf etwa 7,7 an.
Die Fermentation in dem Hafermehlmedium zeichnet sich durch die Bildung eines ausgeprägten gelben Pigments aus.
Das Antibiotikum E-129 kann in zufriedenstellender Weise durch die üblichen Plattenversuche unter Verwendung eines geeigneten grampositiven Testorganismus bestimmt werden. Sarcina lutea ist sehr geeignet, da er äußerst empfindlich und nicht pathogen ist. Verdünnungen des Antibiotikums E-129 und der Bezugsstandard (eine teilweise gereinigte Zubereitung von E-129 mit einem willkürlich festgesetzten Einheitenwert) werden mit einem m/20 Phosphatpuffer von pH 7,5 vor der Aufbringung auf die Versuchsplatte verdünnt, da bei einigen Organismen die Aktivität des Antibiotikums mit der Abnahme des BH-Werts innerhalb des für den Testorganismus verträglichen Bereichs zunimmt.

4. Die Isolierung und Reinigung von E-129 Die bei vier submersen Gärung erzeugte antibiotische Aktivität von E-129 scheint hauptsächlich in der Lösung und nicht sb sehr im Mycel enthalten zu sein. Bei mit den Medien IV und VIII erhaltenen Nährflüssigkeiten wurden folgende Ergebnisse erzielt

Tabelle VI

Probe Aktivität Aktivität

Medium IV

Medium VIII

Gesamtnährflüssigkeit ...... 100 100

Filtrierte Nährflüssigkeit und

Waschwässer ............ 95,1 <71,5

Vereinigte Äthyl- und Butyl-

acetatextrakte des Mycels . 1,0 <2,0

Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß diese Beobachtungen durch Verwendung anderer Fermentationsmedien Abweichungen erfahren können.

Im Hinblick auf diese Gegebenheiten wurde eine Anzahl von Extraktionsarbeitsweisen entwickelt, die zur Gewinnung der antibiotischen Aktivität aus filtrierter Flüssigkeit bestimmt sind, wodurch das Antibiotikum von verunreinigenden Stoffen, vom Mycel und von den hauptsächlichen wasserunlöslichen Produkten der Gärung befreit wird.
Bei einer Gewinnungsmethode, die sich als zufriedenstellend erwiesen hat, wird die filtrierte Flüssigkeit bei pH-Werten zwischen 7 und 9,5 mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel für E-129, z. B. Benzol, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, Chloroform oder n-Butanol, extrahiert. Das Antibiotikum E-129 geht in die organische Lösungsmittelphase, die dann in beliebiger zweckmäßiger Weise von der wäßrigen Phase abgetrennt wird, über. Das für eine wirksame Extraktion erforderliche Lösungsmittelvolumen hängt von dem jeweils verwendeten Lösungsmittel ab, doch reicht gewöhnlich eine Extraktion mit einem Lösungsmittelvolunien, das dem der filtrierten Nährflüssigkeit gleich ist, aus, um nahezu die gesamte antibiotische Aktivität aus der wäßrigen Phase zu entfernen.
Nach einem anderen Verfahren wird das Antibiotikum E-129 an säuregewaschener Aktivkohle adsorbiert, dass Aktivkohleadsorbat von der verbrauchten Flüssigkeit abgetrennt und die Aktivität mit Hilfe von Lösungsmitteln, z. B. von 80 %igem Aceton., saurem wäßrigem Aceton, n-Butanol u. dgl., eluiert.
Die E-129-Aktivität kann aber auch an Magnesiumtrisilikat adsorbiert werden, wonach dann das Adsorbat aus der verbrauchten wäßrigen Nährflüssigkeit abgetrennt und mit 80 bis 100 %igem Aceton eluiert wird.
Es hat sich gezeigt, daß rohe Festsubstanzen zweckmäßigerweise aus den so erhaltenen Rohlösungen durch einfaches Abdampfen der Lösungsmittel bis zur Trockne; vorzugsweise im Vakuum, hergestellt werden können. Es ist jedoch wünschenswert, das Lösungsmittel vor der Durchführung dieser Maßnahme über einem Entwässerungsmittel, beispielsweise Natriumsulfat, zu trocknen. Die auf diese Weise erhaltene feste Substanz ist gewöhnlich braungelbgefärbt und in Äthanol oder Aceton ziemlich löslich, nicht jedoch in merklichem Ausmaß in Wasser. Eine stärker gereinigte feste Substanz kann durch Waschen dieser trockenen Feststoffe mit einem Kohlenwasserstofflösungsmittel, in dem E-129 selbst praktisch unlöslich ist, z. B. Petroläther, das einige der nicht aktiven Verunreinigungen entfernt, erhalten werden.
Wenn das Antibiotikum in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Essigsäureäthylester, vorliegt, kann entweder vor oder nach der Abtrennung der rohen Feststoffe eine weitere Reinigungsstufe eingeschaltet werden. Diese Stufe besteht im Waschen des Lösungsmittels mit n/10-Natriumbicarbonat und n/100-Salzsäure und Wasser entweder einzeln oder in dieser Reihenfolge. Die aus in dieser Weise gewaschenen Lösungen erhaltenen Feststoffe sind heller gefärbt und wirksamer als ohne derartige Waschungen erhaltene entsprechende Festsubstanzen.
In den folgenden, lediglich der Erläuterung der Erfindung dienenden Beispielen wird die Erzeugung und Isolierung von E-129 in wenigstens teilweise gereinigter Form beschrieben.
Beispiel 1 Züchtung von Streptomy ces E-129 zur Bildung von E-129 im Laboratoriumsmaßstab 50-ml-Anteile des oben beschriebenen Mediums III wurden in 250-ml-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden die Kolben mit 2 ml eines 24stündigen vegetativen Wachstums von Streptomyces E-129 beimpft.

Dieser Impfstoff war vorher in 50-ml-Anteilen des unten angegebenen sterilen Mediums auf einer Schüttelvorrichtung mit Hin- und Herbewegung (170 Schwingungen/Minute, Ausschlag 6,5 cm) bei 28° C gezüchtet worden.

Impfstoffmedium

Glycerin .......................... 5,00,1o

Lab-Lemco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 0/0

Peptön (Evans) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/,

Natrnumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 0(o

Destilliertes Wasser auf

p$ 7,2 ......................... 100 0/0

Dieses Impfstoffmedium wurde mit- Sporen von Streptornyces E-129 beimpft, die von der Oberfläche von Hafermehl/ Kalk/Dextrose-Schrägagar erhalten wurden.

Die das Fermentationsmedium enthaltenden Kolben wurden durch Schütteln bei 28° C 48 Stunden bebrütet, wonach die Flüssigkeit einen Titer von 135 Einheiten/ml aufwies. Beispiel 2 Züchtung von. Streptomyces E-129 zur Erzeugung von F_-129 in kleinem Maßstab Sporen von Streptomyces E-129 wurden aus einem Hafermehl/Kalk/Dextrose-Schrägagar in 50-ml-Anteile eines sterilen Impfstoffentwicklungsmediums der folgenden Zusammensetzung übergeführt:

Medium IX

Glycerin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5,0010

Lab-Lemco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00/0

Pepton (Evans) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,00j,

Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5%

Destilliertes Wasser auf

pH 7,2 ......................... 100 0/0

Die Sporen wurden dann durch submerse Gärung durch 48stündiges Bebrüten bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung mit einem Ausschlag von 6,5 cm und 175 Schwingungen/Minute gezüchtet.

Impfstoffe aus mehreren dieser Schüttelkolben wurden aseptisch vereinigt, und 75 ml wurden aseptisch unter Rühren in 5-1-Gärgefäße übergeführt, deren jedes 3 1 des oben beschriebenen Mediums VIII enthielt;, dann wurde auf 1000/0 mit Leitungswasser aufgefüllt, der pH-Wert mit Natronlauge auf 6,4 bis 6,6 eingestellt und das Ganze 75 Minuten bei etwa 1 Atmosphäre sterilisiert.
Nach dem Abkühlen und Beimpfen wurden die 5-1-Gärgefäße bei 28° C gehalten, und es wurde mit einer Geschwindigkeit von 550 Umdrehungen/Minute gerührt. Die Belüftung erfolgte bei einer Geschwindigkeit von 3 1 steriler Luft in der Minute. Während der Gärung, insbesondere in den ersten 8 bis 20 Stunden, w=ar es erforderlich, Entschäumer zuzusetzen, um die gewünschte Geschwrindigkeit des Luftstroms aufrechtzuerhalten. Der pH-Wert des Gärmediums war nach der Sterilisation 6,52 und stieg während der Gärung (48 Stunden) allmählich auf 7,75 an.
Die Ausbeute an Antibiotikum E-129 war nach etwa 20 Stunden maximal (etwa 200 bis 300 Einheiten/ml) und fiel nach 48 Stunden auf etwa 20 bis 50 Einheitenlml. Beispiel 3 Halbtechnische Züchtung von Streptomyces E-129 zur-Erzeugung von E-129 Ein vegetativer Impfstoff von Streptomyces E-129 wurde wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben erzeugt. Dieser vegetative Impfstoff wurde aus Schüttelkolben aseptisch in 5-1-Gärgefäße übergeführt, die jeweils 31 des oben beschriebenen Mediums IX enthielten. Dann wurde 25 Stunden bei 28° C, einer Rührgeschwindigkeit von 550 Umdrehungen/Minute und einem Luftstrom von 31/Minute fermentiert.
1501 des folgenden Mediums

Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/0

Kalk (roher Kalkstein)

pH 6,80 .................. - ... 2,0%

enthaltende Gefäße wurden 45 Minuten bei 120` C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde dem Fermentationsgefäß eine sterile Dextroselösung in der Weise zugesetzt, daß die Endkonzentration an Dextrose 0,5 % betrug (obenerwähntes Medium IV).
Diese Gefäße wurden dann mit 3 1 des in den oben beschriebenen 5-1-Gefäßen erzeugten Impfstoffs beimpft. Die Fermentationen in diesen Gefäßen wurden bei 28c C, einer Rührgeschwindigkeit von 350 Umdrehungen/Minute und einem Luftstrom von etwa 113 1/Minute während der ersten 8 Stunden und von 226 1/Minute danach geführt. Die Fermentation zeichnete sich durch die Bildung eines ausgeprägten gelben Pigments aus.
Der Spitzentiter wurde nach 16- bis 24-stündiger Gärung erhalten, was von dem Wachstum in dem jeweiligen Gefäß abhing; die Titer in den einzelnen vier Gefäßen betrug 252, 192, 270 bzw. 258 Einheiten/ml.
Beispiel 4 Lösungsmittelextraktion von E-129 aus der Maische 550 ml E-129-Gärmaische wurden mit Kieselgur als Filterhilfe filtriert, und das erhaltene Filtrat wurde nach Einstellung des p11-Werts auf 7,1 3mal mit je I/5 Volumen n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde im Vakuum azeotrop unter Zugabe von Wasser bis zur Entfernung des Butanols auf ein kleines Volumen eingeengt. Die erhaltene wäßrige Suspension enthielt 73 °/o der Aktivität der Ausgangsmaische, und die verbrauchte Maische war von E-129-Aktivität frei.

Beispiel 5 Lösungsmittelextraktion und Isolierung von E-129 aus der Maische 10 1 einer filtrierten E-129-Maische wurden mit der Hälfte des Volumens an Essigsäureäthylester extrahiert. Der Essigsäureäthylesterextrakt wurde im Vakuum auf etwa 200 ml eingeengt und 5mal mit je 25 ml n/10-Natriumbicarbonat, 2mal mit je 25 ml n/100-Salzsäure und 2mal mit je 25 ml Wasser gewaschen. Der Extrakt wurde dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Man erhielt 350 mg orangebraungefärbter fester Substanz, die 92 % der Aktivität der ursprünglichen filtrierten Maische enthielt. An Hand der folgenden in °/o angegebenen Ausbeuten wird das Extraktionsschema erläutert.

Untersuchte Fraktionen "/o Aktivität

Filtrierte Maische (als Bezug) ......... 100

Verbrauchte Maische ................. keine

n/10-Natriumbicarbonatwaschflüssigkeit 3,5

n/100-Salzsäurewaschflüssigkeit ........ 1,2

Waschwasser ........................ 0,4

Äthanollösung der schließlich erhaltenen

Festsubstanz....................... 92,0

Beispiel 6

Extraktion von E-129 aus der Maische durch Adsorption

an Aktivkohle

2,45 1 filtrierter E-129-Gärmaische wurden mit 12,5 g

säuregewaschener Aktivkohle (Sorte Sutcliffe Speakman

127 W) und 6 g Kieselgur 1 Stunde lang aufgeschlämmt.

Die Aktivkohle wurde abgetrennt und nacheinander mit

250 ml und 200 ml 80°/jgem wäßrigem Aceton eluiert.

Bei der Gehaltsprüfung der Proben gegenüber der filtrier-

ten Ausgangsmaische wurden folgende Ergebnisse er-

halten.

Untersuchte Fraktion 0/,-Aktivität_

Filtrierte Maische (als Bezug) ......... 100

Verbrauchte Maische ................. keine

Aktivkohleeluat 1 ... .. . . . ... ... . ... . . 31

Aktivkohleeluat 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Konzentrat aus den vereinigten Aktiv-

kohleeluaten ....................... 27

Beispiel ? Extraktion von E-129 durch Adsorption an Magnesium-- trisilikat 10 1 filtrierte Maische wurden lj2 Stunde mit 100 g Magnesiumtrisilikat aufgeschlämmt. Das erhaltene Gemisch wurde durch ein Kieselgurbett filtriert und die feste Substanz mit Wasser gewaschen. Die Aktivität wurde dann nacheinander mit 1,5 1 reinem Aceton und 11 80°/jgem wäßrigem Aceton aus dem Adsorbat eluiert. Die vereinigten Eluate wurden im Vakuum zu einer feinen wäßrigen Suspension des Antibiotikums eingeengt.

Untersuchte Fraktion 1 °/o-Aktivität

Filtrierte Maische (als Bezug) ......... 100

Verbrauchte Maische ................. keine

Waschwasser ........................ keine

1. Acetoneluat ....................... 48,8

2. Acetoneluat ....................... 13,8

Wäßrige Suspension .................. 58,3

A. Beispiele für die Wirkung des Eisens Beispiel 8 Zwei Reihen von je vier 5-1-Fermentationen wurden mit dem Hafermehlgrundmedium mit 1,5 °/o Glucose und 0,70/, Maisquellwasser zubereitet.

Hafermehl ....... **********'** .... 2,50/,

Kalkstein . . . . . . . . . ****'***** ...... 2,00/0

Maisquellwasserfeststoffe . . . . . . . . . . . 0,70/0

Glucose (getrennt sterilisiert) ....... 1,50/0

(der p11-Wert wurde mit Natriumhydroxyd auf 6,8 bis 7,0 eingestellt).

Eine Reihe der Fermentationen wurde mit 60 Teilen/ Million Eisen in Form von Ferricitrat versetzt. jedes Fermentationsgefäß wurde mit 20/0 einer vegetativen Kultur von Streptomyces E-129 beimpft, die auf dem oben beschriebenen Hafermehlmedium, dem kein Maisquellwasser zugesetzt worden war und das nur 0,501, Glucose enthielt, gezüchtet worden war. Dann wurde bei 27° C und einem Luftstrom von 3 1/Mirute fermentiert. Bei der Gehaltsprüfung gegen Sarcina lutea wurden folgende Ergebnisse in Einheiten/ml erhalten.

Stunden Kontrollen Mit 60 Teilen/Million

(ohne Eisen) Eisen

20 315 495

28 385 510

36 355 395

Beispiel 9 Die Wirkung des Eisens wurde ferner durch Verwendung des gleichen Mediums und unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 8 beschrieben, jedoch mit einem Gehalt von 30, 60 bzw. 120 Teilen/Million Eisen in Form von Ferricitrat untersucht. Es wurden folgende durchschnittliche Titer erhalten, wobei drei Fermentationsgefäße in jeder Reihe verwendet worden waren:

Kon- mt 30 Teilen/ Mit 60 Teilen/ Mit120Teilen/

Stunden trollen

ohneEisen Million Eisen Million Eisen Million Eisen

20 410 465 445 500

28 480 620 525 455

36 415 465 375 345

Beispiel 10 Die im Beispiel 9 beschriebene Arbeitsweise wurde wiederholt, wobei jedoch geringere Eisenmengen, nämlich 15, 30 bzw. 45 Teile/Million eingesetzt wurden. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten, die den Durchschnitt von drei Fermentationen darstellen

Kon- Mit 15 Teilen/ Mit 30 Teilen/ Mit 45 Teilen/

Stunden trollen Million Eisen Million Eisen Million Eisen

ohneEisen

20 155 130 110 120

28 400 360 410 405

36 375 545 495 485

Beispiel 11 Zur Erhärtung der Tatsache, daß verschiedenartige Eisenquellen die gleiche günstige Wirkung ausüben, wurden drei Reihen von je vier Fermentationen angesetzt, wie dies in den Beispielen 8 bis 10 beschrieben wurde, wobei jedoch in allen Fällen 30 Teile/Million Eisen zugesetzt wurden. Bei einer Reihe wurde, wie oben beschrieben, Ferricitrat verwendet, bei einer anderen Ferrichlorid und bei der dritten Ferroammoniumsulfat. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt, wobei die angegebenen Zahlen den Durchschnitt jeder Reihe darstellen:

30 Teile/Million 30 Teile/Million 30 Teile/Million

Stunden als Ferricitrat als Ferrichlorid als Ferroammo-

niumsulfat

28 520 490 510

36

445 485 475

Es ist offensichtlich, daß beliebige dieser Salze verwendet werden können.
B. Beispiele für den Nachweis der Wirkung von Maisquellwasser Beispiel 12 Drei 5-1-Fermentationsgefäße wurden mit jeweils 3 1 des folgenden Mediums beschickt, wobei der Glucoseanteil getrennt sterilisiert wurde:

Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/0

Kalkstein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/1

Glucose .......................... 0,50/0

Zusätzlich hierzu enthielt ein Fermentationsgefäß 0,23 % Maisquellwasserfeststoffe, das zweite 0,46 und das dritte 0,70°j1. Der ph-Wert in jedem Fermentationsgefäß wurde mit Natriumhydroxyd auf 6,8 bis 7;0 eingestellt.
,Jede Fermentation wurde bei 27 bis 28° C geführt, und folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Stunden Maisquellwasserfeststoffe

0,230/0 I 0,460/, I 0,700/,

30 195 350 375

28

210

390

450

Daraus geht hervor, daß mit dem niedrigsten Gehalt an Maisquellwasser keine Steigerung über den üblichen Titer von 200 bis 300 Einheiten/ml, der erfahrungsgemäß mit dem Grundmedium erzielt wird, hinaus erfolgt, wohingegen 0,461J1 und 0,700/1 Maisquellwasser beträchtliche Steigerungen ergeben.
Beispiel 13 Zur Ermittlung des besten Gehalts an Maisquellwasser wurden vier Reihen von je drei 5-1-Fermentationen angesetzt, wobei das Hafermehlgrundmedium mit 1,50/0 Glucose verwendet wurde. Zu einer Reihe wurden 0,45 % Maisquellwasserfeststoffe, zu der zweiten 0,7 0/1, zu der dritten 0,90/0 und zur vierten 1,10/0 gegeben. Die Fermentationsgefäße wurden, wie oben beschrieben, beimpft und fermentiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben, wobei jede Zahl den Durchschnitt der drei Fermentationsgefäße darstellt.

Stunden Maisquellwasserfeststoffe

0,450/. 1 0,701/o i 0,901/o 1 1,10/,

18 486 400 400 165

26 375 410 375 345

36 420 410 415 180

Daraus ist ersichtlich, daß 1,1% Maisquellwasserfeststoffe einen schädlichen Einfluß auf den Titer ausüben und daß 0,9 0/1 etwa die obere Grenze darstellen.

C. Beispiel für die Wirkung von Glucose Beispiel 14 Ferner wurde die Wirkung von zugesetzter Glucose bestimmt. 5-1-Fermentationen mit dem Hafermehlgrundmedium und Glucosegehalten von 0,5 und 1,50/0 und Fermentationen mit dem Hafermehlgrundmedium und 0,70/1 Maisquellwasserfeststoffe mit Glucosegehalten von 0,5 und 1,5 0/1 wurden angesetzt, beimpft und fermentiert, wie dies im Beispiel 12 beschrieben wurde. Dabei wurden folgende Ergebnisse in Einheiten/ml erhalten.

Hafermehlmedium Hafermehlmedium und 0,7 °/o Maisquellwasserfeststoffe

Stunden Glucose 0,5 o/' Glucose 1,5 Glucose 0,5 °/o Glucose 1,5 0%

a I b I a I b a I b I c I a I b I c

20 198 304 214 125 374 486 326 368 346 374

28

192 300 210 132 512 456 428 864 448 515

Daraus geht hervor, daß die Verwendung von 1,5% Glucose in dem Hafermehlgrundmedium gegenüber 0,5 0/0 keine günstige Wirkung aufweist, während eine beträchtliche Titererhöhung durch Verwendung von 1,50/0 Glucose erzielt wird, wenn 0,70/0 Maisquellwasserfeststoffe mitverwendet werden. Beispiel 15 Herstellung von E-129 454 1 folgenden Mediums wurden mit 800 ml einer kräftig wachsenden Kultur von Streptomyces E-129, die in Schüttelkolben zubereitet worden war, beimpft.

Glycerin .......................... 5 0/0

Fleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 / 0

Kaseinabbauprodukt . . . . . . . . . . . . . . . 1 0t0

N atriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 °o

(das pH wurde auf 7,0 eingestellt; 30minütige Sterilisation bei 120 C).

Das Medium wurde gerührt und der Tank 28 Stunden bei 27` C gehalten. Ein Strom steriler Luft wurde während der ersten 8 Stunden mit 170 1/Minute und danach mit 283 l; Minute aufrechterhalten.
91 bis 113 1 der Kultur wurden zum Beimpfen eines Tanks verwendet, der 2250 1 des folgenden Mediums enthielt

Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5010

Kalk ... . ......................... 2,00;o

Glucose (gesondert zugesetzt) ....... 0,501/0

(pH-Einstellung mit Salzsäure auf 7,0; 45minütige Sterilisation bei 120° C).
Das Medium wurde gerührt und der Tank 20 Stunden bei 27° C gehalten. Ein Luftstrom wurde während der ersten 8 Stunden mit 1130 1/Minute, während der nächsten 4 Stunden mit 17001 ;Minute und danach mit 19801/ Minute aufrechterhalten.

910 bis 1130 1 .dieser Kultur wurden zur Beimpfung eines Tanks verwendet, der 22 700 1 des folgenden Mediums enthielt

Hafermehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/()

Kalk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,00/0

Maisquellwasserfeststoffe ........... 0,70/0

Glucose (gesondert zugesetzt) ....... 1,50,10

(pH-Einstellung mit NaOH auf 6,8; 30minütige Sterilisation bei 120° C).

Das Medium wurde gerührt und der Tank 22 Stunden bei 27` C gehalten. Ein Luftstrom wurde während der ersten 8 Stunden mit 5660 1/Minute und danach mit 12 740 ljMinute aufrechterhalten. Die Maische wurde mit. Kieselgur versetzt und das Mycel durch Filtration auf einem vorbedeckten Vakuumfilter entfernt. Das Filtrat wurde dann im Gegenstrom mit Essigsäureäthylester extrahiert, wobei das Verhältnis von :Maische zu Lösungsmittel etwa 10: 1 betrug. Es wurden insgesamt 3314 1 Essigsäureäthylesterextrakt erhalten, die im Vakuum bei etwa 25° C auf 354 1 eingedampft wurden. Das Konzentrat wurde abfiltriert, mit Wasser gesättigt, mit 0,01 n-Salzsäure, dann mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das gewaschene und getrocknete Konzentrat wurde im Vakuum weiter eingeengt, bis ein Volumen von 32 1 erreicht war. Während des Verdampfens schied sich E-129 ab, und beim Filtrieren erhielt man zwei Anteile:

Anteil A..... 1000 g, Gehalt 1305 Einheiten mg

Anteil B..... 520 g, Gehalt 1815 Einheiten !mg

Durch Zugabe von 3 Volumina Petroläther (Siedebereich 100 bis 120° C) zu dem Filtrat erhielt man

Anteil C..... 1540 g, Gehalt 2565 Einheiten/mg

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verwendung des Streptomycesstammes E-129 oder eines E-129 erzeugenden Mutanten desselben zur Herstellung des Antibiotikums E-129 bzw. eines E-129 enthaltenden Antibiotikumgemisches durch submerse Züchtung oder durch Oberflächengärung in Nährlösungen unter Zusatz von wachstumsfördernden Stoffen und Gewinnung des Antibiotikums durch Extraktion und/oder Adsorption und Reinigung in bekannter Weise.
2. Verwendung von Maisquellwasser als Stickstoffquelle in Nährlösungen zur biologischen Herstellung des Antibiotikums E-129.
3. Verwendung eines zwei- oder dreiwertigen Eisensalzes in Nährlösungen zur biologischen Herstellung des Antibiotikums E-129.