DE69326100T2

DE69326100T2 - Aktive Komponente auf der Basis von Avermectinen, verwandter Stamm und Verfahren zu seiner Herstellung sowie diese Komponente enthaltende veterinärmedizinische Zusammensetzung

Info

Publication number: DE69326100T2
Application number: DE69326100T
Authority: DE
Inventors: M. Leonardo Cappelletti; Giacomo Lucarelli; Giuseppe Mearelli
Original assignee: Euroresearch SRL; Gnosis Srl
Current assignee: Euroresearch SRL; Gnosis Srl
Priority date: 1992-05-05
Filing date: 1993-05-01
Publication date: 1999-12-09
Anticipated expiration: 2013-05-02
Also published as: EP0572056A1; NZ247550A; EP0572056B1; ES2136111T3; US5376678A; CN1082898A; DE69326100D1; ITMI921074A0; AU674001B2; AU3836593A; ITMI921074A1; CA2095505A1; ATE183646T1; IT1255135B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf antiparasitäre Produkte zur zootechnisch-veterinärmedizinischen Verwendung und insbesondere auf eine aktive Komponente auf der Basis von Avermectin, auf das Verfahren zur Herstellung davon, auf den entsprechenden Stamm sowie auf die diese Komponente enthaltende Zusammensetzung zur veterinärmedizinischen Anwendung.
Die Avermectine bilden eine Familie aus 8 Macrolid- Antibiotika mit 16 Kohlenstoffatomen und der folgenden Strukturformel:
worin:
Die Avermectine werden erhalten durch Fermentation ausgehend von Streptomyces avermitilis (ATCC 31271) und werden in gereinigter Form durch ein im US-Patent Nr. 4,310,519 offenbartes Verfahren erhalten. Jedoch besitzen die einzelnen Avermectine, selbst wenn sie voneinander getrennt werden, eine ungewöhnliche Instabilität. Praktische Anwendung gefunden hat daher nur ein Avermectin B&sub1;-Derivat, das nach Reinigung von den anderen sieben Homologen mit Hilfe einer katalytischen Reduktion der Bindung zwischen den Positionen 22-23 des vorgenannten Avermectins erhalten wurde, das Ivermectin genannt wird und dessen chemischer Name 22,23- Dihydroavermectin B&sub1; ist.
Das Ivermectin ist gegenwärtig die Hauptform, die im zootechnisch-veterinärmedizinischen Gebiet dieser Macrolid- Antibiotika verwendet wird und zur veterinärmedizinischen Prophylaxe ausschließlich in Form einer injizierbaren Spezialität verabreicht wird.
Bekannt ist eine seiner Anwendungen in Form einer Magensäure geschützten Tablette gegen Hunde-Filariose (Fadenwurm- Befall).
Natürlich machen die Komplexität der Aufreinigung zur alleinigen Isolierung von Avermectin B&sub1; sowie die erheblichen Kosten für die katalytische Reduktion in Gegenwart von Rhodiumchlorid und Triphenylphosphin und schließlich die Probleme bei der Herstellung und Verwendung steriler injizierbarer Formen diese Spezialität ungewöhnlich teuer.
Außerdem ist die Notwendigkeit einer Injektionsverabreichung für sich gesehen ein nicht unbedeutender Nachteil.
Andererseits hat die außergewöhnliche Instabilität der Avermectine in saurer Umgebung von Anfang an ihre therapeutische Verwendung in solchen Formen ausgeschlossen, die nicht injizierbar oder geeignet geschützt waren.
Wenn auch berücksichtigt wird, daß der ursprünglich zur Erzeugung verwendete Mikroorganismus, Streptomyces avermitilis ATCC 31271, der gemäß der Lehre des US-Patent Nr. 4,310,519 kultiviert und fermentiert wird, eine sehr geringe Ausbeute an Avermectin liefert, werden die objektiven Grenzen einer breiteren und allgemeineren Verwendung von Ivermectin selbst offensichtlich.
Es wurde jetzt überraschend gefunden und es ist der hauptsächliche Gegenstand der vorliegenden Erfindung, daß das Myzel, das durch Fermentation und einfache Trocknung ohne jedes Reinigungsverfahren und/oder Trennung der Avermectine und/oder chemische Modifikation derselben erhalten wird, bei oraler Verabreichung an Tiere, z. B. Ovine, in Bezug auf die veterinärmedizinische Aktivität exzellente Ergebnisse liefert, weil in den behandelten Tieren das völlige Verschwinden der gastrointestinalen Strongyloides (Zwergfadenwürmer) und eine nicht unbedeutende Verminderung anderer Parasiten beobachtet wurde.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß es möglich ist, die Produktivität der gesamten Avermectine zu erhöhen durch Verwendung eines Stammes, der verglichen mit dem im bisherigen Stand der Technik verwendeten ATCC 31271 verändert wurde, wobei der erfindungsgemäße Stamm die Streptomyces avermitilis-Mutante GRL 1926 (ATCC 55278) ist, die aus dem oben erwähnten Stamm auf bekannte Weise erhalten wurde durch eine Reihe von genetischen Mutations-Tätigkeiten, die durch chemische und physikalische Agenzien herbeigeführt wurden.
In einer weiteren Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung mit einer Zusammensetzung verwirklicht, die antiparasitäre Aktivität besitzt, im zootechnischveterinärmedizinischen Bereich und insbesondere bei der Behandlung von Ovinen nützlich ist und zur oralen Verabreichung geeignet ist, wobei die Zusammensetzung dadurch charakterisiert ist, daß sie als aktive Komponente das getrocknete Myzel enthält, das als solches durch die Fermentation des vorgenannten Stammes erhalten wurde, und daß die Menge des getrockneten Myzels eine Dosis von mindestens 0,00001%, bevorzugt zwischen 0,00001% und 0,00008% gesamtem Avermectin pro kg Lebensgewicht des Tieres bereitstellt.
Das folgende Beispiel illustriert die Herstellung der Avermectine mit dem erfindungsgemäßen Stamm und den Erhalt des entsprechenden Myzels. In diesem Beispiel wird der Stamm erwähnt, der bei der American Type Culture Collection unter der Nr. 55278 registriert und dort gemäß dem Bestimmungen des Budapester Vertrags gelagert wird.

Beispiel

Der Stamm ATCC 55278 wird in fünf 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit 50 ml Kulturmedium A für 2 Tage bei 28ºC auf einem Schütteltisch bei 200 UPM (2,5 cm Exzentrik) inkubiert.
Am Ende dieser Zeitspanne wird ein 6 l Fermenter mit 4 l Kulturmedium B unter den folgenden Betriebsbedingungen mit dem Inhalt der 4 Kolben angeimpft:
Temperatur 22-30ºC
Rühren 200-1.200 UPM
Luft 0,1-1,3 l/l/Min.
Zeit 80-220 Std.
Am Ende dieser Zeitspanne wird die Kultur abgekühlt und zentrifugiert, um das Myzel zu ernten. Das Myzel wird in 3 l kaltem Wasser suspendiert und wieder zentrifugiert.
Der feuchte Myzel-Kuchen wird dann bei 30-75ºC für 16-48 Stunden vakuumgetrocknet.
Am Ende der Trockenzeit wird das Myzel in einer Mühle auf 100-500 Mesh Granulometrie gemahlen, woraufhin sich die folgenden analytischen Daten der Zusammensetzung ergeben (als Mikrogram/Gramm trockenes Myzel):
Avermectin A1: 1.000-2.000
Avermectin A2: 8.000-4.550
Avermectin B1: 8.500-5.000
Avermectin B2: 3.000-6.000
Der mittlere Gehalt der gesamten Avermectine pro Gramm getrockneten Myzels beträgt daher 19.000 ug.
Die Zusammensetzungen der oben erwähnten zwei Kulturmedien A und B sind im folgenden angegeben:
Mit dem erfindungsgemäßen, getrockneten Myzel wurden experimentelle in vivo Tests durchgeführt, um die antiparasitäre Aktivität zu überprüfen:

Test Nr. 1

12 Schafen mit einem Gewicht von ungefähr 50 kg und einem Alter von 7-12 Monaten wurde 1 g trockenes Myzel (entspricht 19 mg der gesamten Avermectine) verabreicht, das wie im obigen Beispiel erhalten wurde.
Nach 9 und 16 Tagen ab der Verabreichung wurde der Kot von den behandelten Schafen und von 10 unbehandelten Schafen analysiert, um die Gegenwart von gastrointestinalen Strongyloides (SGI), Taenia (Bandwürmern) und Trichinen zu untersuchen. Die Gegenwart der SGI wird gemessen als UPG (Eier pro Gramm Kot).
Die folgenden Tabellen 1, 2 und 3 zeigen die Testergebnisse, wobei (-) die Abwesenheit und (+) die Gegenwart des Parasiten bedeutet. Tabelle 1 Gegenwart von Parasiten vor der Verabreichung Behandelte Tiere Unbehandelte Kontrollen Tabelle 2 Gegenwart von Parasiten nach 9 Tagen ab der Verabreichung Behandelte Tiere Unbehandelte Kontrollen Tabelle 3 Gegenwart von Parasiten nach 16 Tagen ab der Verabreichung Behandelte Tiere Unbehandelte Kontrollen

Test Nr. 2

In diesem Test wurde die Dosis des Wirkstoffs halbiert durch orale Verabreichung von 0,5 g trockenem Myzel, das durch das Verfahren des obigen Beispiels erhalten wurde, an 12 Schafe mit einem Gewicht von ca. 60 kg und einem Alter von 12-24 Monaten.
In diesem Fall wurde der Kot sowohl von den behandelten Schafen als auch von 10 Kontrollschafen nach 15 und 30 Tagen ab der Verabreichung analysiert, um die tötende Wirkung auf die Adultform zu untersuchen, d. h. wenn die antiparasitäre Wirkung auch auf die Adultformen der Parasiten und nicht nur auf die Eier ausgedehnt wird.
Die analytischen Daten sind in den folgenden Tabellen 4, 5 und 6 dargestellt. Tabelle 4 Gegenwart von Parasiten vor der Verabreichung Tabelle 5 Gegenwart von Parasiten nach 15 Tagen ab der Verabreichung Tabelle 6 Gegenwart von Parasiten nach 30 Tagen ab der Verabreichung
Die Untersuchung der kultivierten Larven ergab die folgenden Prozentsätze an Nematoden:
Haemonchus 39%
Trichostrongylus 36%
Strongyloides 9%
Ostertagia 10%
Oesophagostonum 3%
nicht identifiziert 3%
Aus den oben beschriebenen experimentellen Daten ergibt sich eindeutig die Wirksamkeit des trockenen Myzels als Parasitizid, wobei die Vorteile der vorliegenden Erfindung in der Reihenfolge ihrer Wichtigkeit folgendermaßen zusammengefaßt werden können:
a) Die Avermectine, die, wie bereits erwähnt, in saurer Umgebung instabil sind und daher der Wirkung der Magensäure nicht standhalten, erreichen in der erfindungsgemäßen Form, d. h. gebunden an das Myzel, welches durch Fermentation direkt erhalten wurde, den Darm des Tieres unverändert, wo sie freigesetzt werden und so eine außergewöhnliche antiparasitäre Wirkung ausüben;
b) die langen und teuren Isolierungsverfahren von nur einem Avermectin aus dem Myzel und seine anschließende katalytische Umwandlung in Ivermectin werden vermieden;
c) Dank des neuen Stammes Streptomyces avermitilis ATCC 55278 ist die Gesamtausbeute an Avermectinen aus dem durch Fermentation erhaltenen Myzel größer;
d) ein an Tiere oral verabreichbarer Wirkstoff wird bereitgestellt.
Es versteht sich, daß die vorliegende Erfindung nicht als auf Ovine begrenzt betrachtet werden sollte, sondern daß sie ähnliche Anwendung bei anderen Tieren finden, insbesondere bei Zuchttieren, die von der gleichen Art von Parasiten befallen werden, die gegen die Wirkung von Avermectin empfindlich sind. In Bezug auf die Herstellung der Zusammensetzung zur zootechnisch-veterinärmedizinischen Verwendung kommen die üblichen veterinärmedizinischen Techniken unter Verwendung der üblichen Verabreichungsvehikel zur Anwendung.

Claims

1. Oraler Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er als solcher das Myzel, erhältlich aus der Zubereitung von Avermectinen durch Fermentation von Streptomyces avermitilis ATCC 55278, umfaßt.

2. Wirkstoff nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Tatsache, daß das Myzel in getrockneter Form vorliegt.

3. Streptomyces avermitilis ATCC 55278.

4. Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffs nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fermentation von Streptomyces avermitilis ATCC 55278 durchführt, und das erhaltene Myzel sammelt und trocknet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation des besagten Stammes in einem Kulturmedium mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt wird:

Saccharose 90 g/l

lösliche Destillate 5 g/l

Erdnußmehl 17 g/l

Hefeextrakt 15 g/l

Calciumcarbonat 3 g/l

Specköl 22 g/l

Burkholder-Lösung 4 g/l

Quellwasser bis auf 1 Liter

und daß die Fermentation unter folgenden Bedingungen stattfindet:

Temperatur 22-30ºC

Rühren 200-1.200 UPM

Luft 0,1-1,3 l/Min.

Zeit 80-220 Std.

6. Verfahren nach Anspruch 4 und/oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das aus der Fermentation erhaltene Myzel bei einer Temperatur zwischen 30 und 75ºC für 16- 48 Stunden vakuumgetrocknet wird.

7. Zusammensetzung für die orale Verabreichung und für die zootechnisch-veterinärmedizinische Verwendung, enthaltend einen Wirkstoff nach Anspruch 1 und/oder 2.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung als antiparasitäres Mittel.