DE3509949C2

DE3509949C2 - Verbindungen und deren Verwendung zur Behandlung von Protozoeninfektionen

Info

Publication number: DE3509949C2
Application number: DE3509949A
Authority: DE
Inventors: Taikwang Michael Lee; Donald Burce Borders; Joseph Jacob Goodman; Raymond Thomas Testa; William Michael Maiese; David Paul Labeda; Sidney Kantor; Jun Robert Lee Kennett; Guy Thomas Carter
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1984-03-26
Filing date: 1985-03-19
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2005-03-20
Also published as: JPH08112091A; IE58238B1; HU193087B; DK122185D0; DK122185A; NZ211376A; EP0156193A3; ES8602945A1; DE3509949A1; JPH06263764A; HUT40170A; EP0156193A2; AU584073B2; PT80123A; AU4031885A; PT80123B; JPH0798750B2; ES541375A0; EP0156193B1; JP2540292B2

Description

Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche.

Für die fleischerzeugende Industrie stellt die Kokzidiose als eine durch Protozoen ausgelösten, parasitären Erkrankungen eine bedeutende Plage dar. Bei der Geflügelindustrie ist die Kokzidiose für bedeutend größere Verluste verantwortlich als irgendeine andere durch Protozoen ausgelöste Erkrankung. Die Kokzidiose ist gleichfalls verantwortlich für wesentliche wirtschaftliche Verluste bei einer großen Vielzahl von landwirtschaftlichen Nutzieren, Haustieren und wildlebenden Tieren.

Die Erkrankung wird verursacht durch Protozoenparasiten, welche die Wirt-Tiere infizieren. Die infizierten Tiere verlieren an Gewicht, vermindern ihre Futterverwertung und in vielen Fällen führt die Krankheit zum Tod. Beim Geflügel sind diese Protozoenparasiten im allgemeinen von der Gattung Eimeria. Bisher hat man sechs Species als Hauptverursacher für die Erkrankung bei Geflügel festgestellt. Bei diesen sechs Species handelt es sich um Eimeria tenella, Eimeria necatrix, Eimeria mivati, Eimeria maxima, Eimeria brunetti und Eimeria acervulina.

Kokzidiose ist zwar bereits seit vielen Jahren als eine der wichtigsten Erkrankungen bekannt, mit denen die fleischerzeugende Industrie konfrontiert ist. Dennoch steht bisher kein vollständig zufriedenstellendes Verfahren zur Bekämpfung der Erkrankung zur Verfügung.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verbindungen für die Bekämpfung von Protozoeninfektionen bei warmblütigen Tieren, insbesondere fleischerzeugenden Tieren, wie Geflügel, Schweinen, Rindern, Kaninchen und Schafen, zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die in den Patenansprüchen gekennzeichneten Verbindungen LL-D42067α und LL-D42067β, NRRL 15734.

Die Verbindungen eignen sich für die wirksame Bekämpfung, Behandlung, Verminderung, Verhinderung, Besserung oder Heilung von Protozoeninfektionen bei landwirtschaftlichen Nutztieren, Haus- oder Streicheltieren sowie jagdbaren Wildtieren, insbesondere bei fleischerzeugenden Tieren, wie Geflügel, Rindern, Schafen, Schweinen und Kaninchen, sowie Haustieren, wie Kaninchen, Hunden und Katzen.

Das mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichnete Antibiotikum hat folgende Strukturformel:

Das mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichnete Antibiotikum hat folgende Strukturformel:

Im folgenden werden die Zeichnungen kurz erläutert; es zeigen:

Fig. I charakteristische UV-Absorptionsspektren der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung;

Fig. II ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung;

Fig. III ein charakteristisches ¹H-NMR-Spektrum der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung in CDCl₃-Lösung;

Fig. IV ein charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung in DMSO-Lösung;

Fig. V eine charakteristische Zuordnung der chemischen Verschiebung von ¹H zu ¹³C bei der mit LL-D42067α, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung in DMSO-Lösung;

Fig. VI charakteristische UV-Absorptionsspektren der mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung;

Fig. VII ein charakteristisches IR-Absorptionsspektrum der mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung;

Fig. VIII ein charakteristisches ¹H-NMR-Spektrum der mit LL-D42067β, NRRL 15743, bezeichneten Verbindung in CDCl₃-Lösung;

Fig. IX ein charakteristisches ¹³C-NMR-Spektrum der mit LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten Verbindung in CD₃OD/CDCl₃-Lösung.

Es wurde festgestellt, daß die oben erwähnten Antibiotika besonders wirksam sind bei der Bekämpfung von Kokzidiose, verursacht durch Eimeria-Species bei fleischerzeugenden Tieren, und zwar insbesondere bei Geflügel, wie Hühnchen, Truthähnen, Enten, Gänsen, Wachteln und Fasanen, sowie bei Rindern, Schafen, Schweinen und Kaninchen.

Man kann ferner davon ausgehen, daß die erfindungsgemäßen antibiotischen Mittel wirksam sind bei der Bekämpfung von Malaria, Toxoplasmose und Sarcosporidiosis bei warmblütigen Tieren, da die Verursacher dieser Erkrankungen ebenfalls Protozoeninfektionen sind und mit Eimeria biologisch verwandt sind.

Die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung umfaßt das Verfahren der Verhinderung, Bekämpfung oder Behandlung von Protozoeninfektionen, wie Kokzidiose, bei warmblütigen Tieren durch die Verabreichung einer prophylaktisch, pharmazeutisch oder therapeutisch wirksamen Menge der mit LL-D42067α oder LL-D42067β, NRRL 15734, bezeichneten antibiotischen Verbindung oder eines pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salzes derselben.

Die Verabreichung der Verbindung zur Behandlung von Kokzidiose erfolgt im allgemeinen aus Praktikabilitätsgründen im oder zusammen mit dem Futter oder im Trinkwasser. Die oben erwähnte Verbindung oder ein pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptables Salz derselben kann jedoch auch den einzelnen zu behandelnden Tieren in Form von Tabletten, Mitteln zum Einflößen, Gelen, Kapseln oder dergl. oder durch Injektion in Form einer Paste, eines Gels, einer Kapsel oder Lösung verabreicht werden. Selbstverständlich sind die zuletzt genannten Verfahren der Verabreichung für die Behandlung großer Gruppen von Tieren weniger praktikabel. Sie sind jedoch für die Anwendung bei einer geringen Anzahl oder bei einzelnen Tieren durchaus praktisch anwendbar.

Falls die Antibiotika LL-D42067α oder LL-D42067β als prophylaktische oder therapeutische Behandlungsmittel gegen Kokzidiose bei Geflügel angewendet werden, so sind im allgemeinen Mengen von etwa 0,1 TpM bis 10,0 TpM, vorzugsweise 0,5 bis 3,0 TpM, der Antibiotika LL-D42067α oder LL-D42067β, verabreicht in der Nahrung oder im Trinkwasser des Geflügels, wirksam zur Verhinderung, Bekämpfung oder Inhibierung von Kokzidiose bei den Tieren.

Wie bereits zuvor angedeutet, können die Antibiotika LL-D42067α oder LL-D42067β oder ein pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptables Salz derselben auch als ein prophylaktisches, pharmazeutisches oder therapeutisches Behandlungsmittel verwendet werden zur Bekämpfung, Verhinderung oder Inhibierung von Protozoeninfektionen bei anderen warmblütigen Tieren, wie Rindern, Schafen und Schweinen. Im allgemeinen sind Mengen von etwa 1,0 bis 100 TpM und vorzugsweise 5 bis 50 TpM des Antibiotikums wirksam zur Bekämpfung von Protozoeninfektionen, wie Kokzidiose, bei diesen größeren Tieren.

Mit Medikamenten versehene Geflügelfuttermittel, die für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbar sind, werden im allgemeinen hergestellt, indem man etwa 0,0001 Gew.-% bis etwa 0,0005 Gew.-% des Antibiotikums LL-D42067α oder LL- D42067β zusammen mit einem nährstoffmäßig ausgewogenen Geflügelfutter vermischt, z. B. mit dem in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Kükenfutter.

Mit Medikamenten versetzte Futtermittel für Rinder, Schafe oder Schweine können auf die gleiche Weise hergestellt werden, wie es oben für das Geflügelfutter beschrieben wurde. In diesem Falle werden jedoch 0,0001 bis 0,01 Gew.-% der antibiotischen Substanz mit dem Rinder-, Schaf- oder Schweinefutter vermischt.

Falls man die erfindungsgemäße Verbindung zur Verhinderung oder Bekämpfung von Kokzidiose verwendet, wird das wirksame Anti-Kokzidiosemittel im allgemeinen zunächst als Tierfutter-Premix hergestellt. Das Premix enthält im allgemeinen das Anti-Kokzidiosemittel in einem relativ hohen Prozentanteil und wird im allgemeinen mit dem Tierfutter erst unmittelbar vor der Verabreichung vermischt. Das Futter-Premix kann gewünschtenfalls auch als Lockfutterüberzug auf die Tagesration der Tiere aufgestreut werden.

Futter-Premixe oder -Konzentrate, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können hergestellt werden, indem man etwa 0,1 bis 5,0 Gew.-% des oben identifizierten Antibiotikums oder eines pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salzes desselben mit etwa 99,9 bis 95 Gew.-% eines geeigneten Trägermaterials oder Verdünnungsmittels vermischt. Geeignete Trägermaterialien, die zur Herstellung von Futterzusatzmitteln Anwendung finden, umfassen beispielsweise die folgenden:
Alfalmehl, Sojabohnenöl, Baumwollsaatölmehl, Leinsaatölmehl, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Calciumsulfat, Maismehl, Zuckerrohrmelasse, Harnstoff, Knochenmehl, Maiskolbenmehl, Reisspelzenmehl und dergl. Das Trägermaterial fördert eine im wesentlichen einheitliche Verteilung des Wirkstoffs in dem fertigen Futter, dem das Zusatzmittel zugemischt wird. Es übt somit eine wichtige Funktion aus, indem es eine zweckentsprechende Verteilung des Wirkstoffs, d. h. etwa 0,1 bis 100 TpM desselben, über das gesamte Futter gewährleistet. Diese Menge entspricht 0,00001 bis 0,01 Gew.-% des Wirkstoffs in dem fertigen Futter. In der Praxis werden im allgemeinen ein oder mehrere Pfund Premix/t Futtermittel zugesetzt, um das gewünschte Niveau des Antibiotikums im fertigen Futter zu erhalten.

Falls das Zusatzmittel oder Premix als Lockfutter auf das eigentliche Futter aufgestreut wird, so wird auf diese Weise gleichfalls eine einförmige Verteilung des Wirkstoffs über das bestreute Futter gewährleistet.

Da die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze in Wasser relativ schwer löslich sind, ist es im allgemeinen erwünscht, die Wirkstoffe in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton, DMSO, Ölsäure, Linolsäure, Propylenglykol oder dergl., aufzulösen, falls die Verbindungen über das Trinkwasser der Tiere verabreicht werden sollen. Die Lösung wird zweckentsprechenderweise mit einer geringen Menge eines oberflächenaktiven Mittels und/oder eines Dispersionsmittels vermischt, um eine Auflösung und/oder Dispersion des Wirkstoffs im Trinkwasser der Tiere zu gewährleisten.

Falls die Behandlung einer kleinen Zahl von größeren fleischerzeugenden Tieren zur Bekämpfung von Protozoeninfektionen erforderlich ist, kann man das Antibiotikum LL-D42067α oder LL-D42067β oder ein pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptables Salz davon vorteilhafterweise den Tieren oral verabreichen, z. B. täglich in Form eines medikamentierten Gels.

Das medikamentierte Gel kann hergestellt werden, indem man eine medikamentierte Geliermittelphase mit einer wäßrigen Pufferphase unter vermindertem Druck von 25 bis 50 mmHg bei Umgebungstemperatur von 20 bis 60°C vermischt. Das Geliermittel wird hergestellt, indem man etwa 0,004 bis etwa 4,5 Gew.-%, bezogen auf die Endzusammensetzung, des Antibiotikums LL-D42067α oder LL- D42067β oder eines pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptablen Salzes davon in 14 bis 31 Gew.-% Propylenglykol, bezogen auf die Endzusammensetzung, und etwa 15 bis 50 Gew.-% des Geliermittels bei 60 bis 80°C auflöst oder dispergiert. Alternativ kann die Geliermittelphase auch vollständig bei Umgebungstemperatur hergestellt werden, wie nachfolgend beschrieben.

Die Geliermittelphase kann hergestellt werden, indem man 0,004 bis etwa 4,5 Gew.-% des Antibiotikums LL-D42067α oder LL-D42067β oder ein pharmazeutisch oder pharmakologisch akzeptables Salz davon zusammen mit dem Geliermittel (15 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 15 bis 35 Gew.-% der Formulierung) in Propylenglykol (14 bis 30 Gew.-% der Formulierung) während 15 min bis 1 h unter vermindertem Druck von 25 bis 50 mmHg bei Zimmertemperatur aufschlämmt. Bei dem gewählten Geliermittel handelt es sich um ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel mit der Struktur eines α-Hydro-Ω-hydroxy-poly(oxyethylen)-poly(oxypropylen)- poly-(oxyethylen)-Blockcopolymeren, durchschnittliches Molekulargewicht 12 500; Fp. 56°C; Brookfield- Viskosität 3100 bei 77°C; Oberflächenspannung einer 0,1%igen wäßrigen Lösung 40,6 dyn/cm (gemessen mit einem du Nouy-Tensiometer).

Eine wäßrige Pufferlösung kann hergestellt werden, indem man 1,5 Gew.-% Citronensäure und 1,0 Gew.-% Trinatriumcitrat in etwa 3 bis etwa 25 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 12 Gew.-%, bezogen auf die Endzusammensetzung, entsalztem oder destilliertem Wasser auflöst, das in Mengen von etwa 15 bis etwa 50 Gew.-% und vorzugsweise 35 bis 45 Gew.-% der Formulierung verwendet wird. Mit dieser gepufferten Lösung wird ein pH-Bereich geschaffen, in dem die chemische Stabilität der Komponenten der Gelformulierung während einer langen Zeit erreicht wird, d. h. ein pH von 3 bis 3,5.

Fakultative Komponenten, die der obigen Lösung in dieser Stufe einverleibt werden können, umfassen:

(a) Benzylalkohol, den man in Mengen von etwa 0,5 bis etwa 1,5 Gew.-% und vorzugsweise 1,5 Gew.-%, bezogen auf die Formulierung, als antimikrobiellen Konservierungsstoff zusetzen kann;
(b) den gelben Farbstoff C. I. Acid yellow Nr. 23 [Tartrazin; F. D und C yellow Nr. 5; 4,5-Dihydro-5-oxo- 1-(4-sulfophenyl)-4-[(sulfophenyl)-azo]-1H-pyrazol-3- carbonsäure-trinatriumsalz], der als Farbstoff in Mengen von etwa 0,01 bis etwa 0,03 Gew.-% und vorzugsweise 0,01 Gew.-% der Formulierung verwendet wird;
(c) ein Antischäummittel, umfassend ein Gemisch von Dimethylpolysiloxanen der Struktur: und Silikagel, wobei der berechnete Durchschnittswert von m 200 bis 350 beträgt. Bei dem Gemisch handelt es sich um eine wasser-weiße, viskose, ölartige Flüssigkeit; d = 0,965 bis 0,970; nD²⁵ etwa 1,404; Viskosität etwa 60 000 cSt. Das Mittel wird in Mengen von 0,001 bis 0,02 Gew.-% und vorzugsweise 0,2 Gew.-% der Formulierung verwendet.

Das medikamentierte Gel wird hergestellt, indem man eine der oben erwähnten Geliermittelphasen und die wäßrige Lösung eine halbe bis zwei Stunden unter vermindertem Druck von 10 bis 100 mmHg, vorzugsweise 25 bis 50 mmHg, bei Umgebungstemperaturen von 20 bis 60°C vermischt. Es ist dabei nicht erforderlich zu erhitzen oder abzukühlen. Bei dieser Verfahrensweise erhält man ein luftfreies Gel, mit dem genaue Dosismengen des Antikokzidiums nach dem Volumen verabreicht werden können. Falls eine genaue Steuerung der Dosismenge des zu verabreichenden Wirkstoffs nach Volumen nicht erforderlich ist und falls die Gegenwart von Luft in dem Gel bei der Endzusammensetzung akzeptierbar ist, kann man die Herstellung auch bei einem Druck bis einschließlich atmosphärischem Druck durchführen.

Nach der obigen Verfahrensweise kann ein typisches erfindungsgemäßes Gel hergestellt werden, indem man 4,5 g des Antibiotikums LL-D42067α (oder 4,5 g des Antibiotikums LL-D42067β), 1,5 g Citronensäure-monohydrat, 1,0 g Natriumcitrat- dihydrat, 1,5 g Benzylakohol und 0,01 g des gelben Farbstoffs C. I. Acid yellow Nr. 23 in 42 g Wasser auflöst. Dann wird eine Lösung des obigen Geliermittels (28 g) in 21,99 g Propylenglykol hergestellt durch Vermischen bei 60°C. Die Lösungen werden anschließend miteinander vermischt, und zwar bei 25 bis 50 mmHg, bis eine homogene Mischung erhalten wird. Das Vermischen erfolgt bei 20 bis 60°C ohne zusäztliches Erhitzen oder Kühlen. Das gebildete Gel hat einen Geliertemperaturbereich von -15 bis -18°C. Die Viskosität des Gels ist 0,51 × 10⁶ cSt. und das Wasser/Geliermittel-Verhältnis beträgt 1,5/1,0.

Wenn man 6,3 g dieses medikamentierten Gels einem 200 Pfund (90,8 kg)-Maststier täglich verabreicht, so erhält der Stier ungefähr 3 mg/kg Körpergewicht/Tag des protozoacidisch-wirksamen Antibiotikums LL-D42067α oder des Antibiotikums LL-D42067β.

In der Praxis haben sich im allgemeinen etwa 0,03 mg/kg/ Tag bis etwa 3,0 mg/kg/Tag als wirksam erwiesen zur Bekämpfung von Protozoeninfektionen bei Rindern, Schafen und Schweinen. Für kleinere Haustiere können Mengen bis hinab zu 0,003 mg/kg Körpergewicht/Tag angewendet werden.

Die Struktur von LL-D42067α wurde durch Röntgenstrahl- Kristallographie aufgeklärt. Die relative Stereochemie dieser Verbindung ist nachstehend dargestellt.

Die Struktur von LL-D42067β wurde ebenfalls durch Röntgenstrahl- Kristallographie aufgeklärt. Die relative Stereochemie dieser Verbindung ist folgendermaßen.

Die physico-chemischen Eigenschaften von LL-D42067α werden nachstehend angegeben.

(1) Molekulargewicht: 535 (FAB-MS);
(2) Summenformel: C₂₈H₂₅NO₁₀;
(3) spezifische optische Drehung; [α] = +836 ± 40° (c = 0,3, DMF);
(4) UV-Absorptionsspektren: gemäß Fig. I
(5) IR-Absorptionsspektrum: gemäß Fig. II, (KBr-Scheibe): 1650, 1598, 1543, 1470, 1440, 1260, 1195, 1020 cm^-1;
(6) ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. III gezeigt und in Tabelle I beschrieben;
(7) ¹³C-NMR-Spektrum (DMSO): wie in Fig. IV gezeigt und in Tabelle II beschrieben; und
(8) Zuordnung der chemischen Verschiebung von ¹H zu ¹³C (DMSO) gemäß Fig. V.

Die physico-chemischen Eigenschaften von LL-42067β sind wie folgt:

(1) Molekulargewicht: 521 (FAB-MS);
(2) Summenformel: C₂₇H₂₃NO₁₀;
(3) spezifische optische Drehung: [α] = +770 ± 10° (c = 0,165, DMF);
(4) UV-Absorptionsspektren: gemäß Fig. VI
(5) IR-Absorptionsspektrum: gemäß Fig. VII, (KBr-Scheibe: 3400, 1646, 1620, 1545, 1463, 1252, 1195, 1020 cm^-1;
(6) ¹H-NMR-Spektrum (CDCl₃): wie in Fig. VIII gezeigt und in Tabelle III beschrieben;
(7) ¹³C-NMR-Spektrum (CD₃OD/CDCl₃): wie in Fig. IX gezeigt und in Tabelle IV beschrieben.
Tabelle I

Tabelle II

Tabelle III

Tabelle IV

Die gegen Protozoen wirksamen Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bezeichnet als LL-D42067α und LL-D42067β, werden gebildet, wenn man unter kontrollierten Bedingungen einen neuen Stamm einer neuen Subspecies von Actinomadura madurae kultiviert. Die neuen Stämme werden in einer Kultursammlung der Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, als Kultur Nr. LL-D42067α und LL-D42067β gehalten. Lebensfähige Kulturen dieses neuen Mikroorganismus wurden hinterlegt bei Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, und wurden deren permanenter Sammlung einverleibt. Die Stämme sind der Öffentlichkeit bei dieser Hinterlegungsstelle unbeschränkt zugänglich unter ihrer Hinterlegungsnummer NRRL 15734.

Die Kulturen LL-D42067α und LL-D42067β wurden aus einer Bodenprobe von San Simao, Brasilien, isoliert. Die Kulturen wurden taxonomisch charakterisiert und als eine neue Subspecies von Actinomadura madurae identifiziert. Sie werden als Actinomadura madurae Subspecies simaoensis bezeichnet.

Die kulturellen, physiologischen und morphologischen Merkmale der Kultur wurden nach Standardverfahren untersucht, wie sie beschrieben sind von Shirling und Gottlieb [Intern. J. System. Bacteriol., 16, 313-340 (1966)] und Gordon et al. [Intern J. System. Bacteriol., 24, 54-63 (1974)]. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände dieser Kulturen wurde bestimmt nach einem Verfahren von Lechevalier et al. [Adv. Appl. Microbiol., 14, 47-72 (1971)]. In den nachfolgenden Tabellen V bis VII sind die Einzelheiten angegeben. Eine allgemeine Beschreibung der Kulturen erfolgt nachstehend. Die unterstrichenen, beschreibenden Farben wurden entnommen aus Kelly und Judd [Nat. Bur. Stand., Spec. Publ., 440 (1976)] und dem zugehörigen Intersociety Color Council, National Bureau of Standards Centroid Color Charts.

Wachstumscharakteristika:
Tabelle V beschreibt die Wachstumscharakteristika von Kulturen LL-D42067 auf verschiedenen Agarmedien. Diese wurden ausgewählt unter solchen, wie sie vom International Streptomyces Project Committee (im folgenden als ISP bezeichnet) empfohlen wurden.

Mikromorphologie:
Die mikroskopische Untersuchung des Stamms ergab, daß er kurze Ketten von Conidien auf Lufthyphen bildet, die geringfügig verhakt sind mit kurzen Spiralen (bis zu drei Windungen). Die Sporenoberflächen sind glatt, wenn sie mit dem Elektronenmikroskop beobachtet werden. Damit unterscheidet sich dieses Isolat von A. verrucosopora.

Zellwandzusammensetzung:
Die Gesamtzellanalysen zeigen, daß der Stamm Mesodiaminopimelinsäure (DAP) sowie den Zucker 3-O-Methyl-D-galactose (Madurose) enthält. Damit gehört der Stamm zum Gesamtzellmuster Typ B. Die Zellwandzusammensetzung ist vom Typ III (meso-DAP, Glutaminsäure, Alanin, Muraminsäure und Glucosamin). Das Phospholipid- Muster ist vom Typ PIV (Phosphatidyl-ethanolamin und/oder Methylethanolamin plus unbekannte, Glucosamin-haltige Phospholipide). Aufgrund dieser Daten rechtfertigt sich die Zuordnung des Stamms zur Gattung Actinomadura. Der PIV-Phospholipid-Typ ist für A. madurae nicht typisch. Gewöhnlich wird PI beobachtet.

Physiologische Reaktionen:
Die physiologischen Reaktionen der Stämme LL-D42067α und LL-D42067β wurden untersucht, und zwar sowohl nach dem ISP-System, Shirling und Gottlieb [Intern. J. Syst. Bacteriol., 16, 313-340 (1974)], als auch mit den Gordon-Tests, Gordon et al. [Intern. J. Syst. Bacteriol., 24, 54-63 (1974)]. In der Tabelle VI ist das Nutzungsmuster des Stamms auf ISP- Kohlenhydratmedien angegeben, zusammen mit den Mustern anderer Mitglieder der Gattung, welche ähnlich reagieren. Die Kultur LL-D42067 ähnelt den Actinomadura madurae- und Actinomadura verrucosopora-Gruppen. Wie oben angegeben, unterscheidet sie sich jedoch von Actinomadura verrucosopora darin, daß sie glatte Sporenwände aufweist. Ein Vergleich der Reaktionen bei der Gordon-Testserie von Actinomadura madurae (Gordon's Werte; siehe obige Literaturstelle) und LL-D42067, wie in Tabelle VII zusammengefaßt, zeigt an, daß Unterschiede lediglich hinsichtlich der Amylase-Produktion und der Säure aus Glycerin und Raffinose bestehen. Da man festgestellt hat, daß die Amylase-Produktion und die Raffinose-Nutzung bei Actinomadura madurae variieren [N. Goodfellow et al., J. Gen. Microbiol., 112, 95-111 (1979)], bleibt die Glycerin- Reaktion das einzige physiologische Unterscheidungsmerkmal, mit dem sich LL-D42067 von diesem Taxon unterscheidet.

Da der Stamm LL-D42067 hinsichtlich aller untersuchten Eigenschaften mit Ausnahme seiner Glycerin-Reaktionen und seines PIV-Phospholipid-Musters Actinomadura madurae gleicht, wurde der Stamm dem Taxon Actinomadura madurae als eine Subspecies zugeordnet und als Actinomadura madurae Subspecies simaoensis bezeichnet.

Tabelle V

Tabelle VI

Tabelle VII

Hinsichtlich der Herstellung dieses neuen, bakteriellen und antiparasitären Mittels ist die vorliegende Erfindung nicht auf die vorstehenden spezifischen Organismen beschränkt oder auf Organismen, die den oben angegebenen Wachstumscharakteristika und mikroskopischen Charakteristika vollständig entsprechen. Diese Eigenschaften sind lediglich zum Zwecke der Erläuterung angegeben. Von der Erfindung umfaßt ist die Verwendung von natürlich vorkommenden Mutanten dieses Organismus sowie von induzierten Mutanten, die aus diesem Organismus mittels der verschiedenen, dem Fachmann bekannten mutagenen Mitteln erzeugt werden können, z. B. durch die Behandlung mit Senfgas (Stickstoffmustard), Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, N′-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin, Actinophagen u. dgl. Von der Erfindung umfaßt sind ferner inter- und intraspezifische, genetische Rekombinanten, die nach bekannten Gentechniken erzeugt werden können, z. B. durch Konjugation, Transduktion und Techniken des genetic engineering.

Das in vitro antimikrobielle Spektrum von LL-D42067β wurde bestimmt nach dem Agarplatten-Verdünnungsverfahren mit Mueller-Hinton-Agar. Dabei wurde ein Inokulum des jeweiligen Testorganismus von etwa 10⁴ koloniebildenden Einheiten mittels der Steer-Replikationsvorrichtung abgegeben. Die minimale Hemmkonzentration (MIC) in mcg/ml ist definiert als die geringste Konzentration an LL-D42067β, welche das sichtbare Wachstum nach 18stündiger Inkubation bei 35°C inhibiert.

Die in der nachfolgenden Tabelle VIII zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß LL-D42067β gegen verschiedene gram-positive Bakterien wirksam ist und gegenüber Hefen eine mäßige Wirksamkeit aufweist.

Tabelle VIII

Antimikrobielles Spektrum von LL-D42067β

Die Nützlichkeit des Antibiotikums LL-D42067β beruht auf seiner antibakteriellen und antiparasitären Wirkung. Beispielsweise kann das Antibiotikum verwendet werden zur Unterdrückung von intestinaler Bakterienflora, als topisches, antibakterielles Mittel oder Antiseptikum gegen gram-positive Bakterien sowie als allgemeines Desinfektionsmittel für Oberflächen, wie bei Instrumenten. Es ist ferner brauchbar als Antiprotozoenmittel zur Behandlung von Malaria. Zusätzlich zu seiner antimikrobiellen und antiparasitären Wirkung ist LL-D42067β als Antikokzidienmittel bei Geflügel wirksam.

Bei der therapeutischen Verwendung kann die erfindungsgemäße Verbindung in Form herkömmlicher, pharmazeutischer Mittel verabreicht werden, die für den angestrebten Verwendungszweck geeignet sind. Derartige Mittel können in der Weise formuliert werden, daß sie sich für orale oder topische Verabreichung eignen. Der Wirkstoff kann kombiniert werden mit einem nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen Träger und im Gemisch mit diesem vorliegen. Das Trägermaterial kann je nach der angestrebten Verabreichungsart, d. h. oral oder topisch, aus einer Vielzahl verschiedener, bekannter Formen ausgewählt werden.

Allgemeine Fermentationsbedingungen

Die Kultivierung von Actinomadura madurae subsp. simoaensis NRRL 15734 kann in einer Vielzahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden. Brauchbare Medien für die Herstellung des neuen Antibiotikums LL-D42067α umfassen eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Dextrin, Saccharose, Melasse, Glycerin, etc.; eine assimilierbare Quelle von Stickstoff, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser, etc.; sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid, etc. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer, etc., werden in Form von Verunreinigungen anderer Bestandteile des Mediums zugeführt. Die Belüftung von Tanks und Flaschen wird bewirkt, indem man sterile Luft durch das fermentierende Medium durchleitet oder auf dessen Oberfläche aufträgt. Eine weitere Bewegung in dem Tank erfolgt mittels eines mechanischen Rührers. Erforderlichenfalls kann ein Antischäummittel, wie ein Siliconöl, zugesetzt werden.

Allgemeine Verfahrensweise für die Isolierung von LL- D42067α und LL-D42067β

Das LL-D42067α-Antibiotikum wird aus der Fermentationsbrühe folgendermaßen isoliert. Zunächst wird durch Diatomeenerde filtriert. Das Antibiotikum wird in ein Lösungsmittel, wie Methylenchlorid, extrahiert und durch Säulenchromatographie an Silikagel gereinigt, wobei das System Hexan : Ethylacetat (80/20) verwendet wird. Dabei werden unerwünschte Fette entfernt. Anschließend wird das System Methylenchlorid : 1% Essigsäure in Methanol (9 : 1) verwendet, wobei man ein Rohprodukt erhält.

Dieses rohe LL-D42067α wird anschließend mittels einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt, und zwar an einer Phasenumkehrsäule (reverse phase column) unter Verwendung des Systems Acetonitril/Wasser/Essigsäure (600 : 400 : 0,28).

Das Antibiotikum LL-D42067β wird aus der Gesamterntemaische folgendermaßen gewonnen. Zunächst wird durch ein Medium, wie Diatomeenerde, filtriert. Dann wird das Antibiotikum in ein Lösungsmittel, wie Ethylacetat, extrahiert, zu einem Sirup konzentriert, zwischen Heptan und Methanol verteilt und die Methanolphase zu einem Rückstand konzentriert. Dieser Rückstand wird mit Hexan verrieben, dann zu einem Rückstand konzentriert, der in einem Gemisch gleicher Teile Acetonitril und Wasser aufgelöst und nachfolgend eingedampft wird. Dabei erhält man ein Präzipitat. Dieses wird gereinigt durch eine präparative Phasenumkehr-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Dabei wird das System Acetonitril/ Wasser/Essigsäure (3000 : 6000 : 5) verwendet. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, zu einer wäßrigen Suspension eingedampft und mit Ethylacetat extrahiert. Dieses wird abgedampft, wobei man das reine LL-D42067β erhält.

Beispiel 1 Inokulum-Herstellung

Ein typisches Medium, das zur Aufzucht des Primär-Inokulums verwendet wird, wurde gemäß der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Dieses Medium wird auf pH 7,2 eingestellt und dann sterilisiert. Eine 100-ml-Portion dieses sterilen Mediums in einer 500-ml-Flasche wird inokuliert mit abgekratztem Myzel von einem geneigten Agarmedium (agar slant) von Actinomadura madurae subsp. simaoensis NRRL 15734. Das Medium wird dann auf einen Drehschüttler placiert und 48 bis 72 h bei 210 U/min und 28°C heftig geschüttelt. Dieses Primär-Inokulum wird nachfolgend verwendet, um 12 l des gleichen sterilen Mediums zu inokulieren, welches anschließend 48 h bei 28°C gezüchtet wird, um ein Sekundär- Inokulum zu erhalten.

Beispiel 2 Fermentierung

Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:


%
Saccharose
3,0
Sojamehl	1,5
Maisquellwasser	0,5
Calciumcarbonat	0,5
Wasser q.s.	100

Das Medium wird sterilisiert und in einem Verhältnis von 12 l Sekundär-Inokulum von Beispiel 1 pro 300 l Medium beimpft. Die Fermentierung wird bei 28°C durchgeführt, wobei ein steriler Luftstrom von 200 l/l Maische/min durchgeleitet wird und mittels eines Propellers gerührt wird, der mit 230 U/min betrieben wird. Nach 135 bis 159 h wird die Maische geerntet und durch Diatomeenerde filtriert.

Beispiel 3 Isolierung von LL-D42067α

Das Fermentationsfiltrat aus drei Fermentierungen, die gemäß Beispiel 2 durchgeführt wurden, wird vereinigt. Man erhält auf diese Weise eine Gesamtmenge von 1800 l mit einem pH von 7,5. Das Filtrat wird mit 900 l Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird im Vakuum konzentriert, wobei man 84,1 g Rückstand erhält.

Eine 75,2-g-Portion dieses Rückstands wird in 300 ml Hexan/Ethylacetat (80 : 20) suspendiert. Das Ganze läßt man in eine Glassäule (2 Zoll × 20 Zoll) einsickern, die mit Silikagel trocken gepackt ist. Die Säule wird mit einer Gesamtmenge von 4 l der gleichen Lösungsmittelmischung eluiert, um Fette und Siliconöl zu entfernen. Anschließend wird mit 4 l Methylenchlorid/1% Essigsäure in Methanol (9 : 1) eluiert, wobei man 15-ml-Fraktionen auffängt. Die Fraktionen werden mittels Dünnschicht-Chromatographie analysiert. Das Antibiotikum LL-D42067α erscheint als sichtbarer, gelber Fleck (Rf = 0,5) mit dem gleichen Lösungsmittelsystem. Die Fraktionen 31 bis 60, die den größten Teil des Antibiotikums enthalten, werden zusammengegossen und im Vakuum konzentriert, wobei man 11,1 g eines roten Rückstands erhält.

Eine 5,5-g-Portion des obigen Rückstands wird mittels einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [Prep LC System-500, Prep PAK-500/C18 Patrone, Acetonitril/Wasser/ Essigsäure (600 : 400 : 0,28), 100 ml/min, 5,5 g/30 ml/Injektion] fraktioniert. Dreißig 200-ml-Fraktionen werden aufgefangen; durch Analyse der Fraktionen mittels Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie-Analyse wird festgestellt, daß die Hauptmenge an LL-D42067α sich in der Fraktion 5 befindet. Die Fraktion 5 wird über Nacht stehengelassen. Die resultierenden, gelben Kristalle werden gesammelt, indem man die Mutterlauge abdekantiert. Die Mutterlauge wird aufbewahrt. Die Kristalle werden mit der mobilen Phase gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält 11 mg LL-D42067α in Form gelber Kristalle.

Die Mutterlauge wird durch langsames Eindampfen konzentriert. Das resultierende Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt, wobei man 377 mg LL-D42067α als gelben, amorphen Feststoff erhält.

Die analytischen HPLC-Bedingungen sind wie folgt:

Säule: μ Bondapack C18, 3,9 mm × 30 cm, Waters Associates;
mobile Phase: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (400 : 600 : 0,28);
Detektor: UV 254 nm und UV 365 nm, 0,2 AUFS;
Strömungsrate: 1,0 ml/min;
Retentionsvolumen von LL-D42067α: 11,5 ml.

Beispiel 4 Inokulum-Herstellung

Ein typisches Medium, das zur Aufzucht der verschiedenen Stufen des Inokulums verwendet wird, wurde gemäß der folgenden Rezeptur hergestellt:

Dieses Medium wird sterilisiert. Eine 100-ml-Portion des sterilen Mediums wird in einer Flasche mit abgeschabtem Myzel von einer geneigten Agarkultur von Actinomadura madurae subsp. simaoensis NRRL 15734 inokuliert. Das Medium wird anschließend heftig auf einem Drehschüttler während 48 bis 72 h bei 28°C geschüttelt, um ein Primär- Inokulum zu erhalten. Dieses Primär-Inokulum wird dann verwendet, um 10 l des obigen sterilen Mediums zu beimpfen. Dieses wird wiederum 48 h bei 28°C kultiviert. Man erhält ein Sekundär-Inokulum. Dieses Sekundär- Inokulum wird verwendet, um 250 l des obigen sterilen Mediums in einem Tank zu beimpfen. Man läßt 48 h bei 28°C wachsen, wobei ein Strom steriler Luft von 200 l/min eingeleitet wird. Auf diese Weise erhält man ein Tertiär-Inokulum.

Beispiel 5 Fermentation

Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

Dieses Medium wird sterilisiert und nachfolgend beimpft mit 125 l des Tertiär-Inokulums, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, pro 3000 l des obigen sterilen Fermentationsmediums. Die Fermentierung wird bei 28°C durchgeführt. Dabei wird ein steriler Luftstrom von 6,6 l/l Maische zugeführt, es wird mit einem Propeller gerührt, der mit 110 U/min betrieben wird, und es wird ein Silicon-Entschäumungsmittel zugeführt. Nach 137 h Kultivierung unter den obigen Bedingungen wird die Maische geerntet.

Beispiel 6 Isolierung von LL-D42067β

Eine Gesamtmenge von 4500 l geerntete Maische, die aus zwei im wesentlichen gemäß Beispiel 2 durchgeführten Fermentierungen stammt, wird mit 1% ihres Volumens an Diatomeenerde kombiniert. Das Ganze wird 1 h vermischt und dann der pH auf 3,0±0,3 unter Verwendung von konz. Chlorwasserstoffsäure eingestellt. Eine Hälfte des Maischevolumens an Ethylacetat wird zugesetzt und dieses Gemisch 3 h gerührt. Dann wird Diatomeenerde in einer Menge von 5% des Maischevolumens zugesetzt und das Gemisch filtriert. Die Ethylacetat-Phase des Filtrats wird abgetrennt, mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen und dann zu einem Sirup konzentriert. Dieses Material wird zwischen Heptan/Methanol (2 : 1) verteilt.

Die 4,5 l der Methanol-Phase werden zu einem Rückstand konzentriert, der mit Hexan verrieben wird. Das Hexan wird dekantiert und der Rückstand zur Trockene konzentriert. Dieses Material wird durch präparative Phasenumkehr- HPCL unter folgenden Bedingungen gereinigt: [Als Packungsmaterial dienen 300 g einer Octadecyl(C)- gebundenen Phase auf Kieselsäure-Basis (Dimensionen 5,7 cm × 30 cm), eingetragenes Warenzeichen der Wieley Associates, Inc., Milford, Mass.]:

Säule: eine einzige PrepPAK®-500/C₁₈-Patrone;
mobile Phase 1: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (8000 : 12 000 : 10);
mobile Phase 2: Acetonitril/Wasser/Essigsäure (3000 : 6000 : 5);
Strömungsrate: 50 ml/min;
Fraktionierung: 200 ml/Fraktion;
Probenbeladung: 2 bis g/30/ml Injektion.

Unter Verwendung der mobilen Phase 1 findet man LL- D42067β in den Fraktionen 7 bis 10. Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum eingedampft, um den größten Teil des Acetonitrils zu entfernen. Die resultierende, wäßrige Suspension wird mit einem gleichen Volumen an Ethylacetat behandelt. Die Ethylacetat-Phase wird abgetrennt und nacheinander mit gleichen Volumina 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat, 0,1N Chlorwasserstoffsäure und zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einem Feststoff eingedampft.

Dieser Feststoff wird wiederum chromatographiert unter Verwendung der mobilen Phase 2. In dieser mobilen Phase findet man LL-D42067β in den Fraktionen 15 bis 21. Diese werden kombiniert und wie oben beschrieben behandelt. Man erhält reines LL-D42067β als gelben Feststoff.

Beispiel 7 Bewertung der Testverbindungen als Antikokzidienmittel

Die Brauchbarkeit der Antibiotikum LL-D42067α und LL- D42067β als Antikokzidienmittel bei Küken wird durch die folgenden Tests demonstriert.

Bei dem Test wird ein Geflügelfutter der folgenden Zusammensetzung verwendet:


%
Vitamin-Aminosäure-Premix
0,5
Spurenmineralien	0,1
Natriumchlorid	0,3
Dicalciumphosphat	1,2
gemahlener Kalkstein	0,5
stabilisiertes Fett	4,0
getrocknetes Alfalfa, 17% Protein	2,0
Kornglutenmehl, 41% Protein	5,0
Menhadenfischmehl, 60% Protein	5,0
Sojabohnenölmehl, 44% Protein	30,0
gemahlener, gelber Mais, fein zum Auffüllen auf	100,0

Das Vitamin-Aminosäure-Premix der obigen Futterzusammensetzung wird gemäß der folgenden Rezeptur hergestellt. Die Mengenangaben beziehen sich auf Einheiten/kg der fertigen Futterzusammensetzung:

butyliertes Hydroxytoluol\|125,0 mg
dl-Methionin	500,0 mg
Vitamin A	3300,0 I.E.
Vitamin D₃	1100,0 I.C.E.
Riboflavin	4,4 mg
Vitamin E	2,2 I.E.
Nicotinsäure	27,5 mg
Panthothensäure	8,8 mg
Cholinchlorid	500,0 mg
Folsäure	1,43 mg
Menadion-natriumbisulfat	1,1 mg
Vitamin B₁₂	11,0 mcg
gemahlener gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf	5,0 g

Ein gemischtes Inokulum von 5000 sporulierten Oocysten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl von Oocysten von Eimeria tenella zur Erzeugung von 60- bis 75%iger Mortalität bei unbehandelten Kontrolltieren wird Eintagsküken verabreicht, und zwar durch direktes Einimpfen in den Kropf jedes Kükens. Alle Küken erhalten freien Zugang zum Futter und Wasser während der gesamten Testperiode. 2 Tage vor der Beimpfung wird den verschiedenen Kükengruppen mit Medikamenten versetztes Futter angeboten, wobei der Wirkstoff jeweils in unterschiedlichen Mengen enthalten ist. 7 Tage nach der Beimpfung werden die Tests beendet. Die Küken werden gewogen, getötet und ihr Verdauungstrakt wird auf Läsionen untersucht. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen angegeben. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Überlebensrate der infizierten Küken verbessert wird, falls man 0,2 bis 5,0 TpM des Antibiotikums an die infizierten Küken zusammen mit ihrem Futter verabreicht. Bei diesen Wirkstoffniveaus wird ferner eine signifikante Unterdrückung von Läsionen beobachtet, die durch E. tenella und E. acervulina hervorgerufen werden.

Tabelle IX

Tabelle X

Beispiel 8 Bewertung der Testverbindungen als Antikokzidienmittel bei Küken

Die Brauchbarkeit des Antibiotikums LL-D42067α wird anhand seiner Anti-Kokzidienwirkung gegen eine Vielzahl von Kokzidienspecies demonstriert, welche bei Küken Erkrankungen verursachen.

Das 80fache der empfohlenen Konzentration eines im Handel erhältlichen Anti-Kokzidienimpfstoffs mit einem Gehalt gemischter Species von Eimeria wird durch direkte Einimpfung in den Kropf jedes Kükens eingebracht. Die Küken sind zum Zeitpunkt der Inokulation 10 Tage alt. 2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten vermischtes Futter, das den Wirkstoff mit unterschiedlichen Dosisniveaus enthält, den verschiedenen Kükengruppen angeboten. 6 Tage nach der Inokulation wird der Test beendet und die Verdauungstrakts der Küken werden auf Läsionen untersucht. Je nach der Anwesenheit oder Abwesenheit von Läsionen und ihrem Ausmaß wird bei jedem Küken eine Bewertung vorgenommen, die von 0 bis 4 pro Vogel reicht. Diese Bewertung wird mit der Anzahl der Vögel pro Gruppe multipliziert. Die prozentuale Verringerung der Läsionen wird folgendermaßen berechnet:

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XI zusammengestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß bei Küken die durch fünf Species von Eimeria ausgelösten Läsionen verhindert oder deutlich verringert werden können, falls man den Wirkstoff in so geringen Konzentrationen wie 0,2 TpM in der Nahrung verabreicht.

Claims

1. Actinomadura madurae subsp. simaoensis NRRL 15734 oder dieser Stamm in einer Form, nachdem er mutagenen Behandlungen unterworfen worden ist, die zu einer genetischen Veränderung des Mikroorganismus geführt haben, wobei jedoch die Fähigkeit zur Synthese der Antibiotika LL-D42067α und LL-D42067β erhalten geblieben ist.

2. Die mit LL-D442067α und LL-D42067β bezeichneten Verbindungen, gekennzeichnet durch folgende Strukturformel oder sowie deren pharmazeutisch und pharmakologisch akzeptablen Salze.

3. Verfahren zur Herstellung der antibiotisch wirksamen Verbindungen LL-D42067α und LL-D42067β gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen den Stamm Actinomadura madurae subsp. simaoensis NRRL 15734 oder eine die antibiotisch wirksame Verbindung LL-D42067α oder LL-D42067β produzierende Mutante desselben in einem sterilen, flüssigen Medium, enthaltend assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Anion- und Kationsalzen, fermentiert, bis eine wesentliche Menge von LL-D42067α oder LL- D42067β in dem Medium gebildet worden ist, und danach die antibiotisch wirksamen Verbindungen daraus isoliert.

4. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 2 zur Bekämpfung von Protozoeninfektionen bei warmblütigen, besonders fleischerzeugenden Tieren, insbesondere Geflügel.

5. Verwendung nach Anspruch 4 in Form einer Tierfutter- Premixzusammensetzung, umfassend einen festen, eßbaren Träger und etwa 0,00001 bis etwa 5 Gew.-% der Verbindung gemäß Anspruch 2.