DE60110908T2

DE60110908T2 - Antibiotische tripropeptine und verfahren ihrer herstellung

Info

Publication number: DE60110908T2
Application number: DE60110908T
Authority: DE
Inventors: Tomio Takeuchi; Hideki Hashizume; Masayuki Atsugi-shi IGARASHI; Hiroshi Naganawa; Masa Hamada
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2021-03-29
Also published as: EP1285928B1; US20030162697A1; US7271147B2; JP4054576B2; EP1285928A1; EP1285928A4; WO2001074850A1; ES2240434T3; ATE295852T1; DE60110908D1; AU2001244594A1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft neue Antibiotika und zwar die Tripropeptine Z, A, B, C, und D oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, welche jeweils außerordentliche antibakterielle Wirkung aufweisen. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Tripropeptins. Ferner betrifft diese Erfindung ein Arzneimittel, insbesondere eine antibakterielle Zusammensetzung, umfassend als einen Wirkstoff ein Tripropeptin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon. Noch weiter betrifft diese Erfindung Lysobacter sp. BMK333-48F3 als einen neuen Mikroorganismus, der die kennzeichnende Eigenschaft aufweist, dass er im Stande ist, ein Tripropeptin produzieren zu können.
Hintergrund des Fachgebietes
Da Antibiotika häufig gebraucht wurden, sind mehrfach Arzneistoff-resistente Bakterien, insbesondere Methicillin-resistente Bakterien, weithin aufgetreten und diese resistenten Bakterien haben zu einem klinischen Problem geführt. Die Methicillin-resistenten Bakterien können nicht nur Resistenz gegen Methicillin aufweisen, sondern auch gegen viele Antibiotika wie zum Beispiel Antibiotika der Aminoglycoside, Tetracycline, β-Lactame und Makrolide.
In den letzten Jahren sind sogar Arzneimittel-resistente Bakterien gegen Vancomycin aufgetaucht, welches ein Antibiotikum ist, das als letzter verbleibender Ausweg für die Therapie von Infektionen mit den Methicillin-resistenten Bakterien bekannt ist. Es besteht daher jetzt eine große Nachfrage für die Entdeckung und Bereitstellung einer neuartigen Verbindung, die außerordentliche antibakterielle Wirksamkeit gegen Arzneistoff-resistente, insbesondere Methicillin-resistente Bakterien und Vancomycin-resistente Bakterien zeigt.
Ein Gegenstand dieser Erfindung ist es, ein neuartiges Antibiotikum bereitzustellen, das außerordentliche antibakterielle Wirksamkeiten aufweist und im Stande ist, die vorstehend erwähnten Vorraussetzungen zu erfüllen.
Offenbarung der Erfindung
Wir, die Erfinder dieser Erfindung, haben unsere Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, nützliche Antibiotika zu entdecken. Als Ergebnis haben wir frühzeitig herausgefunden, dass ein neuer Bakterienstamm Lysobacter sp. BMK333-48F3, welcher der Gattung Lysobacter angehört und der von uns aus einer Bodenprobe isoliert wurde, ein neuartiges Antibiotikum erzeugen kann, das starke antibakterielle Wirksamkeiten gegen Gram-positive Bakterien und deren Arzneistoff-resistente Bakterien aufweist. Wir haben dieses neuartige Antibiotikium als Tripropeptin bezeichnet. Obwohl dieses Tripropeptin in Form eines farblosen Pulvers vorliegt, von welchem die chemische Struktur noch nicht bestimmt worden ist, ist Tripropeptin als eine Substanz isoliert worden, die eine molekulare Formel von C₁₅H₈₃N₁₁O₁₉ aufweist (Japanische Patentanmeldung 2000-93405, eingereicht am 30. März 2000). Wir haben unsere Studien weiter fortgesetzt und haben jetzt herausgefunden, dass dieser Lysobacter sp. BMK333-48F3-Stamm vier weitere Antibiotika, zusätzlich zu dem vorstehend erwähnten Tripropeptin, erzeugt. Wir haben diese fünf Antibiotika, einschließlich Tripropeptin und der letzteren vier Antibiotika, nun gemeinsam als ein Tripropeptin bezeichnet. Wir haben nun weiters herausgefunden, dass ein Tripropeptin starke antibakterielle Wirksamkeit gegen Gram-positive Bakterien und deren Arzneistoff-resistente Bakterien zeigt. Wir haben unsere Studien weiter fortgesetzt und haben nun durch die physikalisch-chemische Analyse der Tripropeptine bestätigt, dass es fünf Verbindungen gibt, welche in einer Klasse von Tripropeptinen zusammengefasst werden. Demzufolge haben wir das vorher erhaltene Tripropeptin in Tripropeptin C umbenannt und haben auch die letzteren vier, nun erhaltenen Verbindungen als Tripropeptin Z, A, B bzw. D bezeichnet. Wir haben nun die chemischen Strukturen dieser fünf Verbindungen bestimmt. Darüber hinaus haben wir nun bestätigt und festgestellt, dass die Tripropeptine Z, A, B, C und D neuartige Verbindungen sind und dass sie alle gemeinsam durch eine nachstehend angeführte allgemeine Formel (I) verkörpert werden. Weiters wurde offenbart, dass diese Tripropeptine eine gemeinsame und grundlegende Grundstruktur aufweisen, wie sie in der allgemeinen Formel (I) gezeigt wird, wobei die Seitenkettengruppe R verzweigte Alkylgruppen von 8 bis 12 Kohlenstoffatomen bezeichnet, die sich voneinander unterscheiden.
Gemäß einem ersten Aspekt dieser Erfindung wird daher ein Antibiotikum, Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C oder Tripropeptin D, bereitgestellt, welches eine Verbindung ist, wie dargestellt in der folgenden allgemeinen Formel (I),
wobei R für Tripropeptin Z eine 7-Methyl-octyl-Gruppe; für Tripropeptin A eine 8-Methyl-nonyl-Gruppe; für Tripropeptin B eine 9-Methyl-dodecyl-Gruppe; für Tripropeptin C eine 10-Methyl-undecyl-Gruppe; und für Tripropeptin D eine 11-Methyl-dodecyl-Gruppe oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.
Ein Tripropeptin der allgemeinen Formel (I) gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung umfasst, wie nachstehend gezeigt, Tripropeptin Z von der Formel (Iz), Tripropeptin A von der Formel (Ia), Tripropeptin B von der Formel (Ib), Tripropeptin C von der Formel (Ic) und Tripropeptin D in der Formel (Id):

(1) Tripropeptin Z dargestellt in der Formel (Iz):
[Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R eine 7-Methyl-octyl-Gruppe ist];
(2) Tripropeptin A dargestellt in der Formel (Ia):
[Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R eine 8-Methyl-nonyl-Gruppe ist];
(3) Tripropeptin B dargestellt in der Formel (Ib):
[Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R eine 9-Methyl-decyl-Gruppe ist];
(4) Tripropeptin C dargestellt in der Formel (Ic):
[Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R eine 10-Methyl-undecyl-Gruppe ist]; und
(5) Tripropeptin D dargestellt in der Formel (Id):
[Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R eine 11-Methyl-dodecyl-Gruppe ist].

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Tripropeptin Z der Formel (Iz) gemäß des ersten Aspektes dieser Erfindung sind wie folgt:

(1) Erscheinung farbloses Pulver
(2) Molekulare Formel C₄₈H₇₇N₁₁O₁₉
(3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1112.5475 (M + H)⁺ Berechnet: 1112.5490
(4) Spezifische Rotation [α]_D ²⁴ –14,0° (c 1, CH₃OH)
(5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λ_max nm (ε): Endadsorption
(6) Infrarotes Absorptionsspektrum Wie in 1 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
(7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum Protonen-NMR-Spektrum, wie gemessen in DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur, wird in 2 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(8) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum ¹³C-NMR-Spektrum, wie gemessen in DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur, wird in 3 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(9) Löslichkeit Löslich in Methanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Wasser, aber unlöslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform.
(10) DC Der R_f-Wert ist 0,25, wenn es auf einem Silicagel 60F₂₅₄ (ein Produkt von Merck & Co.) einer Dünnschichtchromatographie unterzogen wird, wobei das Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) besteht.

Gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist Tripropeptin Z eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen wie zum Beispiel quaternäre Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedensten Metallen, beispielsweise seine Salze mit alkalischen Metallen wie zum Beispiel Natriumsalz, oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure beispielhaft erläutert werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Tripropeptin A der Formel (Ia) gemäß des ersten Aspektes dieser Erfindung sind wie folgt:

(1) Erscheinung farbloses Pulver
(2) Molekulare Formel C₄₉H₇₉N₁₁O₁₉
(3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1126.5632 (M + H)⁺ Berechnet: 1126.5657
(4) Spezifische Rotation [α]_D ²⁴ –7,8° (c 1, CH₃OH)
(5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λ_max nm (ε): Endadsorption
(6) Infrarotes Absorptionsspektrum Wie in 4 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
(7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum Protonen-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur, wird in 5 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(8) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum ¹³C-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur, wird in 6 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser aber unlöslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform.
(10) Dc Der R_f-Wert ist 0,25, wenn es auf einem Silicagel 60F₂₅₄ (ein Produkt von Merck & Co.) einer Dünnschichtchromatographie unterzogen wird, wobei das Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) besteht.

Gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist Tripropeptin A eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen wie zum Beispiel quaternäre Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedensten Metallen, beispielsweise seine Salze mit alkalischen Metallen wie zum Beispiel Natriumsalz, oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure beispielhaft erläutert werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Tripropeptin C der Formel (Ib) gemäß des ersten Aspektes dieser Erfindung sind wie folgt:

(1) Erscheinung farbloses Pulver
(2) Molekulare Formel C₅₀H₈₄N₁₁O₁₉
(3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1140.5788 (M + H)⁺ Berechnet: 1140.5776
(4) Spezifische Rotation [α]_D ²⁴ –7,9° (c 1, CH₃OH)
(5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λ_max nm (ε): Endadsorption
(6) Infrarotes Absorptionsspektrum Wie in 7 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
(7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum Protonen-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur, wird in 8 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(8) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum ¹³C-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur, wird in 9 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, aber unlöslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform.
(10) DC Der R_f-Wert ist 0,25, wenn es auf einem Silicagel 60F₂₅₄ (ein Produkt von Merck & Co.) einer Dünnschichtchromatographie unterzogen wird, wobei das Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) besteht.

Gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist Tripropeptin B eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen wie zum Beispiel quaternäre Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedensten Metallen, beispielsweise seine Salze mit alkalischen Metallen wie zum Beispiel Natriumsalz, oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure beispielhaft erläutert werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Tripropeptin C der Formel (Ic) gemäß des ersten Aspektes dieser Erfindung sind wie folgt:

(1) Erscheinung farbloses Pulver
(2) Molekulare Formel C₅₁H₈₃N₁₁O₁₉
(3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1154.5927 (M + H)⁺ Berechnet: 1154.5945
(4) Spezifische Rotation [α]_D ²⁴ –8,4° (c 1, CH₃OH)
(5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λ_max nm (ε): Endadsorption
(6) Infrarotes Absorptionsspektrum Wie in 10 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
(7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum Protonen-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur, wird in 11 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(8) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum ¹³C-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur, wird in 12 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, aber unlöslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform.
(10) DC Der R_f-Wert ist 0,25, wenn es auf einem Silicagel 60F₂₅₄ (ein Produkt von Merck & Co.) einer Dünnschichtchromatographie unterzogen wird, wobei das Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) besteht.

Gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist Tripropeptin C eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen wie zum Beispiel quaternäre Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedensten Metallen, beispielsweise seine Salze mit alkalischen Metallen wie zum Beispiel Natriumsalz, oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure beispielhaft erläutert werden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Tripropeptin D der Formel (Id) gemäß des ersten Aspektes dieser Erfindung sind wie folgt:

(1) Erscheinung farbloses Pulver
(2) Molekulare Formel C₅₂H₈₅N₁₁O₁₉
(3) Hochauflösende Massenspektrometrie (HRFABMS: Kationenmodus) Gefunden: 1168.6101 (M + H)⁺ Berechnet: 1168.6074
(4) Spezifische Rotation [α]_D ²⁴ –13,8° (c 1, CH₃OH)
(5) Ultraviolettes Absorptionsspektrum (in Methanol) λ_max nm (ε): Endadsorption
(6) Infrarotes Absorptionsspektrum Wie in 13 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
(7) Magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum Protonen-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur, wird in 14 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(8) ¹³C-Kernmagnetisches Resonanzspektrum ¹³C-NMR-Spektrum, wie gemessen in einem Lösungsmittelgemisch aus DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur, wird in 15 der beigefügten Darstellungen gezeigt.
(9) Löslichkeit Löslich in Methanol, DMSO und Wasser, aber unlöslich in Aceton, Ethylacetat und Chloroform.
(10) DC Der R_f-Wert ist 0,25, wenn es auf einem Silicagel 60F₂₅₄ (ein Produkt von Merck & Co.) einer Dünnschichtchromatographie unterzogen wird, wobei das Entwicklungs-Lösungsmittel aus Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) besteht.

Gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung ist Tripropeptin D eine amphotere Substanz und die pharmazeutisch verträglichen Salze davon können durch seine Salze mit organischen Basen wie zum Beispiel quaternäre Ammoniumsalze, seine Salze mit verschiedensten Metallen, beispielsweise seine Salze mit alkalischen Metallen wie zum Beispiel Natriumsalz, oder seine Säureadditionssalze mit organischen Säuren wie zum Beispiel Essigsäure oder mit anorganischen Säuren wie zum Beispiel Salzsäure beispielhaft erläutert werden.
Der Ausdruck „ein Tripropeptin", der in dieser Beschreibung einfach gegeben wird, kann manchmal übrigens entweder jedes einzelne von Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C und Tripropeptin D oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren oder ein Gemisch von allen bedeuten.
Tripropeptine, welche gemäß dieser Erfindung die vorstehend angeführte allgemeine Formel (I) aufweisen, haben die nachstehend genannten biologischen Eigenschaften.
Demnach zeigen Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C und Tripropeptin D jeweils antibakterielle Wirksamkeiten gegen Gram-positive Bakterien, einschließlich Arzneistoff-resistente Stämme (Methicillin-resistente Stämme und andere). Die antibakteriellen Wirksamkeiten von einem Tripropeptin gegen diese Bakterien werden durch die folgenden Verfahren getestet.
Testbeispiel 1
Minimale Wachstums-inhibitorische Konzentrationen (μl/ml) von Tripropeptin Z gegen eine Vielfalt von Mikroorganismen wurden auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium (hergestellt von Difco Laboratories) oder auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium für Enterococcus, das mit 5% Schafsblut ergänzt war (hergestellt von Difco Laboratories) durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß einem Standardverfahren, wie es von der Japanese Society of Chemotherapy bereitgestellt wird, gemessen. Die sich daraus ergebenden antibakteriellen Spektren werden in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Testbeispiel 2
Minimale Wachstums-inhibitorische Konzentrationen (μl/ml) von Tripropeptin A gegen eine Vielfalt von Mikroorganismen wurden auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium (hergestellt von Difco Laboratories) oder auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium für Enterococcus, das mit 5% Schafsblut ergänzt war (hergestellt von Difco Laboratories) durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß einem Standardverfahren, wie es von der Japanese Society of Chemotherapy bereitgestellt wird, gemessen. Die sich daraus ergebenden antibakteriellen Spektren werden in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Testbeispiel 3
Minimale Wachstums-inhibitorische Konzentrationen (μl/ml) von Tripropeptin B gegen eine Vielfalt von Mikroorganismen wurden auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium (hergestellt von Difco Laboratories) oder auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium für Enterococcus, das mit 5% Schafsblut ergänzt war (hergestellt von Difco Laboratories) durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß einem Standardverfahren, wie es von der Japanese Society of Chemotherapy bereitgestellt wird, gemessen. Die sich daraus ergebenden antibakteriellen Spektren werden in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Testbeispiel 4
Minimale Wachstums-inhibitorische Konzentrationen (μl/ml) von Tripropeptin C gegen eine Vielfalt von Mikroorganismen wurden auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium (hergestellt von Difco Laboratories) oder auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium für Enterococcus, das mit 5% Schafsblut ergänzt war (hergestellt von Difco Laboratories) durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß einem Standardverfahren, wie es von der Japanese Society of Chemotherapy bereitgestellt wird, gemessen. Die sich daraus ergebenden antibakteriellen Spektren werden in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Testbeispiel 5
Minimale Wachstums-inhibitorische Konzentrationen (μl/ml) von Tripropeptin D gegen eine Vielfalt von Mikroorganismen wurden auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium (hergestellt von Difco Laboratories) oder auf einem Müller-Hinton-Agar-Medium für Enterococcus, das mit 5% Schafsblut ergänzt war (hergestellt von Difco Laboratories) durch ein serielles Verdünnungsverfahren gemäß einem Standardverfahren, wie es von der Japanese Society of Chemotherapy bereitgestellt wird, gemessen. Die sich daraus ergebenden antibakteriellen Spektren werden in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Gemäß einem zweiten Aspekt dieser Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C und/oder Tripropeptin D bereitgestellt, die durch die vorstehend genannte allgemeine Formel (I) dargestellt sind, gekennzeichnet dadurch, dass das Verfahren die Züchtung eines Bakterienstammes umfasst, welcher zu der Gattung Lysobacter gehört und welcher im Stande ist, mindestens eines von in der allgemeinen Formel (I) dargestelltem Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C und Tripropeptin D zu produzieren und die Gewinnung von mindestens einem der Tripropeptine Z, A, B, C, und D von der sich daraus ergebenden Kultur.
Der Mikroorganismus oder Bakterienstamm, der im Stande ist, das Antibiotikum, ein Tripropeptin, zu erzeugen und der im Verfahren gemäß des zweiten Aspekts dieser Erfindung verwendbar ist, kann jeder Stamm dieser Mikroorganismen sein, welcher die Fähigkeit besitzt, diese Antibiotika zu produzieren, die die vorstehend erwähnten physikalischen-chemischen Eigenschaften und biologischen Eigenschaften besitzen, und er kann von einer großen Vielfalt an Mikroorganismen ausgewählt werden. Unter solchen verwendbaren Mikroorganismen kann der Bakterienstamm, welchem die Stammnummer BMK333-48F3 zugeteilt wurde und welcher aus einer Bodenprobe von Naha-City, Okinawa-ken, Japan durch unser Microbial Chemistry Research Institute im Dezember 1994 isoliert wurde, als ein bevorzugtes konkretes Beispiel eines Mikroorganismus genannt werden, der im Stande ist, die Antibiotika Tripropeptine zu produzieren.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes BMK333-48F3 werden nun nachstehend beschrieben.
1. Morphologie
Der Stamm BMK333-48F3 war ein Gram-negatives Stäbchen, dessen Zelldimensionen etwa 0,5 bis 0,8 × 1,6 bis 2,0 μm waren. Polymorphie der Zelle wurde nicht beobachtet. Die Zelle hatte kein Flagellum. Aber die Zelle hatte ein gleitendes Bewegungsvermögen.
2. Wachstumsmerkmale auf verschiedenen Kulturmedien
Alle Tests, mit Ausnahme der Gelatine-Brühen-Stich-Kultur, wurden bei 30°C durchgeführt.
(1) Brühen-Agarplatten-Kultur
Die Kolonien waren hoch viskos, durchscheinend und glänzend und wiesen eine hellgelbe Farbe auf. Es wurde kein diffusionsfähiges Pigment beobachtet.
(2) Brühen-Flüssigkultur
Einen Tag nach dem Beginn der Züchtung wurde geringes Wachstum bemerkt, aber zwei Tage nach dem Beginn der Züchtung wurde der Niederschlag des Stammes am Boden des Teströhrchens festgestellt.
(3) Gelatine-Brühen-Stich-Kultur
In der Züchtung bei 20°C begann die Verflüssigung ab etwa drei Tagen nach dem Beginn der Züchtung und war 37 Tage nach dem Beginn der Züchtung fast vollständig. In der Züchtung bei 30°C begann die Verflüssigung ab 24 Stunden nach dem Beginn der Züchtung und war 7 Tage nach dem Beginn der Züchtung vollständig.
(4) Milch
Koagulation wurde ab etwa 7 Tagen nach dem Beginn der Züchtung festgestellt und Peptonisierung war 20 Tage nach dem Beginn der Züchtung vollendet. Die Koagulation verlief unter einer sauren Bedingung.
3. Physiologische Eigenschaften (die Züchtungstemperatur war, sofern nicht anders angegeben, in allen Fällen 30°C,)

(1) Gram-Färbung: negativ
(2) Reduktion von Nitrat: positiv
(3) Denitrifizierung: (gemäß dem Verfahren von Komagata et. al.,: Classification and Identification of Microorganisms, herausgegeben von Takeji Hasegawa, Seite 223, University of Tokyo-Verlag, 1975): negativ
(4) MR-Test: negativ
(5) V-P-Test: negativ
(6) Produktion von Indol: negative
(7) Produktion von Schwefelwasserstoff: negative
(8) Verwendung von Zitronensäure: Auf Koser-Medium, negativ Auf Christensen-Medium, negativ
(9) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: Für Natriumnitrat, negativ Für Ammoniumsulfat, negativ
(10) Bildung von Pigment: Es wurde weder auf King A-Medium noch auf King B-Medium lösliches Pigment beobachtet.
(11) Urease (in einem Harnstoffmedium, bereitgestellt von Eiken Chemical): negativ
(12) Oxidase: positiv
(13) Katalase: positiv
(14) Wachstumsbereich: Das Wachstum des Stammes wurde bei einem pH-Wert in einem Bereich von pH 6,0 bis 9,0 festgestellt und der optimale pH-Wert ist 6,0 bis 8,0. Darüber hinaus wurde das Wachstum des Stammes bei einer Temperatur im Bereich von 27°C bis 37°C beobachtet und die optimale Wachstumstemperatur war 27°C bis 30°C.
(15) Verhalten zu Sauerstoff: aerob
(16) O-F-Test (gemäß dem Hugh Leifson-Verfahren): Leicht oxidative Form
(17) Die Bildung von Säuren und Gasen von Sacchariden (im Basismedium): Von Glucose, Arabinose, Maltose und Trehalose wurde die Produktion einer kleinen Menge an Säuren festgestellt. Von D-Xylose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Saccharose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin und Stärke wurde jedoch keine Produktion einer Säure festgestellt. Außerdem wurde von keinem der Saccharide die Produktion von Gasen festgestellt.
(18) Hydrolyse von Casein: positiv
(19) Hydrolyse von Esculin: positiv
(20) Säurebeständigkeit: nicht säurebeständig

4. Chemotaxonomische Eigenschaften
(1) Basenzusammensetzung (G + C-Gehalt) der DNA: 70,5%
Fasst man die vorstehend erwähnten Eigenschaften des Stammes BMK333-48F3 zusammen, so war dieser Stamm dadurch gekennzeichnet, dass er als aerobe Gramm-negative Stäbchen vorlag, keine Flagellen und Sporen aufwies, ein gleitendes Bewegungsvermögen hatte und nicht säurebeständig war; dass das Wachstum des Stammes auf Agar-Medium durchsichtig und hoch viskos war; dass die Dimensionen der Zelle etwa 0,5 bis 0,8 × 1,6 bis 2,0 μm waren; dass der Stamm bei einem pH-Wert in einem Bereich von pH 6 bis 9 wuchs; dass der Stamm bei einer Temperatur in einem Bereich von 27°C bis 37°C und der optimalen Wachstumstemperatur von 24°C bis 30°C wuchs; und dass der Stamm in seiner DNA einen (G + C)-Gehalt von 70,5% aufwies.
In Anbetracht dieser vorstehenden Eigenschaften wird angenommen, dass der Stamm BMK333-48F3 zur Gattung Lysobacter zählt. Wir haben daher den Stamm BMK333-48F3 als Lysobacter sp. BMK333-48F3 bezeichnet.
Darüber hinaus ist der Stamm BMK333-48F3 bei einer autorisierten japanischen Hinterlegungsstelle, dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Advanced Industrial Science and Technology, Agency of Ministry of Economy, Trade and Industry, die sich auf Nr. 1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-City, Ibaraki-ken, Japan befindet, unter der Hinterlegungsnummer FERM-17741 am 22. Februar 2000, hinterlegt worden. Dieser Stamm wurde nun, seit 2. März 2001, beim National Institute unter der Hinterlegungsnummer "FERM BP-7477" hinterlegt, übertragen gemäß dem Budapester Vertrag.
Gemäß dem zweiten Verfahrensaspekt dieser Erfindung kann die Herstellung des Antibiotikums, eines Tripropeptins, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt werden.
Die Herstellung des Antibiotikums, eines Tripropeptins, kann daher durch Beimpfen eines Nährmediums mit einem Bakterienstamm durchgeführt werden, der im Stande ist ein Tripropeptin zu erzeugen, vorzugsweise des Stammes Lysobacter sp. BMK333-48F3 und durch Züchtung dieses Bakterienstammes bei einer Temperatur von 27°C mit Schütteln unter aeroben Bedingungen, um die Kultur hervorzubringen, welche die antibiotischen Tripropeptine enthält. Als das für diesen Zweck verwendete Nährstoffmedium kann jedes Nährstoffmedium verwendet werden, das für die Züchtung von Mikroorganismen verwendbar ist. Als die Nährstoffquelle können Stickstoffquellen wie zum Beispiel Pepton, Hefe-Extrakt, Fleischextrakt, Baumwollsamenmehl und Ammoniumsulfat verwendet werden, die im Handel erhältlich sind. Als Kohlenstoffquellen können Kohlenhydrate wie zum Beispiel Glycerin, Stärke, Glucose, Galactose, Dextrin und Fette verwendet werden. Ferner können anorganische Salze wie zum Beispiel Natriumchlorid und Calciumcarbonat als Zusatzstoffe verwendet werden. Falls nötig können andere Zusatzstoffe wie zum Beispiel Metallsalze in sehr kleinen Mengen hinzugefügt werden. Diese zusätzlichen Substanzen können jedes dieser Materialen sein, die von einem Tripropeptin-produzierenden Stamm benützt werden und für die Herstellung des antibiotischen Tripropeptins nützlich sind und von welchen bekannt ist, dass sie für die Züchtung von Mikroorganismen in dem Kulturmedium verwendbar sind.
Für die Herstellung des antibiotischen Tripropeptins kann ein Mikroorganismus verwendet werden, der die Fähigkeit hat die antibiotischen Tripropeptine zu produzieren. Im Besondern wurde von dem von uns isolierten Stamm Lysobacter sp. BMK333-48F3 wurde bestätigt, dass er die antibiotischen Tripropeptine produziert. Jeder andere Stamm, der im Stande ist diese Antibiotika zu produzieren, kann aus der Natur durch Anwendung jeder bekannten Isolationstechnik isoliert werden, die für die Isolierung von Antibiotikum-produzierenden Stämmen zur Verfügung steht. Es gibt noch eine Methode, durch welche die Fähigkeit eines Tripropeptin-produzierenden Stammes, einschließlich des Stammes Lysobacter sp. BMK333-48F3, die antibiotischen Tripropeptine zu produzieren, verbessert wird, indem man einen solchen Stamm einer Mutationsbehandlung durch radioaktive Strahlung oder andere Verfahren unterzieht. Ferner können die antibiotischen Tripropeptine durch ein gentechnisches Verfahren hergestellt werden.
Die Antibiotika, Tripropeptine, werden durch aerobe Kultivierung eines Tripropeptin-produzierenden Stammes, der zur Gattung Lysobacter zählt, in einem geeigneten Kulturmedium und Gewinnung des (der) erwünschten Tripropeptins(e) von der sich ergebenden Kulturbrühe hergestellt. Die Züchtungstemperatur kann im Bereich von Temperaturen liegen, bei welchen die gewünschten Antibiotika hergestellt werden können, ohne dabei im Wesentlichen das Wachstum des Tripropeptin-produzierenden Stammes, wie er verwendet wird, zu verhindern. Die Züchtungstemperatur kann dabei, abhängig von der Natur eines Tripropeptin-produzierenden Stammes, wie er verwendet wird, genau gewählt werden und eine bevorzugte Züchtungstemperatur liegt in einem Bereich von 25 bis 30°C.
Die Herstellung des antibiotischen Tripropeptins durch den Stamm BMK333-48F3 kann gewöhnlich innerhalb von 2 bis 4 Tagen der Züchtung des Stammes ein Maximum erreichen. Im Allgemeinen jedoch wird die Züchtung des Stammes fortgesetzt, bis eine ausreichende antibakterielle Aktivität an das Kulturmedium weitergegeben wurde. Die zeitabhängige Veränderung im Titer der Tripropeptine in der resultierenden Kulturbrühe kann entweder durch das HPLC-Verfahren oder durch ein Zylinderplatten-Verfahren gemessen werden, in welchem Staphylococcus aureus oder Bacillus stearothermophilus als ein Testbakterienstamm verwendet wird.
Im zweiten Verfahrensaspekt dieser Erfindung werden die Tripropeptine von der Kulturbrühe gewonnen, die, wie vorstehend beschrieben, erhalten wurde und in welcher Tripropeptine hergestellt und angereichert wurden. Als das Verfahren zur Gewinnung und Isolierung des (der) gewünschten Tripropeptins (Tripropeptine) kann jedes der Routineverfahren sachgemäß verwendet werden, die herkömmlich für die Isolierung von (einem) Stoffwechselprodukt(en) verwendet werden, die (das) von Mikroorganismen produziert werden (wird). Zum Beispiel ein Verfahren zur Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, das nicht mit Wasser mischbar ist, und ein Verfahren zur Nutzung des Unterschiedes der Adsorptionsaffinitäten der Tripropeptine auf verschiedene Adsorptionsmittel sowie zum Beispiel ein Verfahren zur Gelfiltration und ein chromatographisches Verfahren mit Gegenstromverteilung usw., kann einzeln oder in Kombination verwendet werden, um das (die) Tripropeptin(e) vom Überstand der Kulturbrühe zu gewinnen. Von den auf diese Weise von der Kulturbrühe abgetrennten mikrobiellen Zellen des Stammes ist es ferner möglich, Tripropeptin(e) zu gewinnen, indem die mikrobiellen Zellen einer Lösungsmittel-Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel unterzogen werden, oder durch ein Verfahren, welches das Aufbrechen von mikrobiellen Zellen und die Elution des (der) erwünschten Tripropeptins(e) aus den aufgebrochenen Zellen durch Extraktion umfasst; und dann ist es möglich, das (die) so gewonnenen Tripropeptin(e) zu isolieren und zu reinigen. Auf diese Weise können ein oder mehrere der antibiotischen Tripropeptine geerntet werden. Im Übrigen kann die Isolierung der Tripropeptine Z, A, B, C und D voneinander durch Säulenchromatographie erfolgen (beziehen Sie sich auf Beispiel 1, wie nachstehend beschrieben).
Ferner, gemäß einem dritten Aspekt dieser Erfindung, wird ein Arzneistoff bereitgestellt, welcher als Wirkstoff mindestens eines der Tripropeptine Z, A, B, C, und D, die durch die allgemeine Formel (I) dargestellt sind, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon in Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichem Trägerstoff oder pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen enthält.
Der Arzneimittel gemäß dem dritten Aspekt dieser Erfindung kann in der Form einer Zusammensetzung vorliegen, die als Wirkstoff eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) in Beimischung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen, festen oder flüssigen Trägerstoff umfasst, zum Beispiel Stärke, Zucker, Ethanol, Wasser, physiologische Kochsalzlösung und so weiter.
Tripropeptin(e) der allgemeinen Formel (I) oder ein Salz davon, welches) gemäß dem dritten Aspekt dieser Erfindung in dem Arzneimittel verwendet wird (werden), kann oral oder parenteral durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion oder durch intraperitoneale oder intrarektale Verabreichung und so weiter verabreicht werden.
Für die orale Verabreichung kann das Arzneimittel gemäß dem dritten Aspekt dieser Erfindung in Form eines Präparats wie zum Beispiel einem Pulver, Tabletten, Kapseln, einer Suspension, einem Sirup und ähnlichem durch Mischen der Wirkstoffe, nämlich eines Tripropeptins nach der allgemeinen Formel (I) oder eines Salzes davon mit einem herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen, festen oder flüssigen Trägerstoff formuliert werden.
Der Anteil der Verbindung der allgemeinen Formel (I), welcher als Wirkstoff in dem Arzneimittel des dritten Aspekts dieser Erfindung enthalten ist, kann abhängig von der Art des Präparates variieren, aber ein geeigneter Anteil des Tripropeptins kann im Bereich von etwa 2 bis 90% liegen, basierend auf dem Gewicht einer einzelnen Dosierungseinheit der Zusammensetzung.
In Fällen, in welchen die Zusammensetzung aus dem dritten Aspekt dieser Erfindung in Form von Injektionen formuliert wurde, kann eine bevorzugte Form des injizierbaren Präparates eine sterilisierte wässrige Lösung oder ein sterilisiertes und lyophilisiertes Präparat einschließen, welches die Verbindung der allgemeinen Formel (I) als Wirkstoff enthält. Als Beispiele für flüssige Trägerstoffe, die für diesen Zweck verwendet werden können, werden Wasser, physiologische Kochsalzlösung, wässriges Ethanol, Glycerin, Propylenglycol, pflanzliches Öl und ähnliche bevorzugt.
Die Dosis eines Tripropeptins der allgemeinen Formel (I) oder eines Salzes davon, welches als Wirkstoff in der Zusammensetzung dieser Erfindung verwendet wird, kann abhängig von der Art der bakteriellen Infektionen, die behandelt werden müssen, dem Zweck der therapeutischen Behandlung und dem Ausmaß des Zustandes des Patienten und so weiter variieren. Eine optimale Dosis eines Tripropeptins kann jedoch von Fachleuten durch geeignete einleitende Tests festgesetzt werden. Im Übrigen hat Tripropeptin C in Mäusen keine Toxizität (ICR-Typ, 4 Wochen alt, männlich) gezeigt, wenn es intravenös mit einer Dosis von 300 mg/kg verabreicht wurde.
Gemäß dem vierten Aspekt dieser Erfindung wurde ferner ein Stamm Lysobacter sp. BMK333-48F3 als ein neuartiger Mikroorganismus bereitgestellt, welcher eine charakteristische Beschaffenheit aufweist, dass er im Stande ist Tripropeptine der allgemeinen vorstehend angeführten Formel (I) zu produzieren und welcher als der Stamm identifizierbar ist, der in einer japanischen Hinterlegungsstelle, dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Advanced Industrial Science and Technology, Agency of Ministry of Economy, Trade and Industry, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7477 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt worden ist.
Kurze Beschreibung der beigefügten Zeichnungen
1 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Tripropeptin Z, wie gemessen durch das KBr-Tablettenverfahren.
2 ist ein magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin Z, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur.
3 ist ein ¹³C-Kernmagnetisches-Resonanzspektrum von Tripropeptin Z, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur.
4 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Tripropeptin A, wie gemessen durch das KBr-Tablettenverfahren.
5 ist ein magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin A, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur.
6 ist ein ¹³C-Kernmagnetisches-Resonanzspektrum von Tripropeptin A, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur.
7 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Tripropeptin B, wie gemessen durch das KBr-Tablettenverfahren.
8 ist ein magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin B, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur.
9 ist ein magnetisches ¹³C-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin B, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur.
10 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Tripropeptin C, wie gemessen durch das KBr-Tablettenverfahren.
11 ist ein magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin C, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur.
12 ist ein ¹³C-Kernmagnetisches-Resonanzspektrum von Tripropeptin C, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur.
13 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Tripropeptin D, wie gemessen durch das KBr-Tablettenverfahren.
14 ist ein magnetisches Protonen-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin D, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 500 MHz bei Raumtemperatur.
15 ist ein magnetisches ¹³C-Kernresonanzspektrum von Tripropeptin D, wie gemessen in einer Lösung von DMSO-d₆ – D₂O (20 : 1) bei 125 MHz bei Raumtemperatur.
Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung
Diese Erfindung wird jetzt ausführlicher mit Hinweisen auf die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Herstellung der antibiotischen Tripropeptine
Ein Stamm, Lysobacter sp. BMK333-48F3 (hinterlegt unter der Zugangsnummer FERM BP-7477), welcher auf schrägem Agar-Kulturmedium gezüchtet wurde, wurde in ein steriles Kulturmedium inokuliert. Das hier verwendete sterile Kulturmedium ist hergestellt worden, indem 110 ml-Anteile von flüssigem Kulturmedium in Erlenmeyerkloben (mit je 500 ml Kapazität) gegeben wurden, welches 1,5% Glycerin, 1,5% Baumwollsamenmehl, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Natrium-L-Glutamat (eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4) enthielt und das Kulturmedium in den Kolben in der üblichen Weise sterilisiert wurde, bevor die Inokulation des Stammes BMK333-48F3 durchgeführt wurde. Das so inokulierte flüssige Kulturmedium wurde dann unter Schütteln bei 27°C für 24 Stunden inkubiert, um dadurch eine Saat-Kulturbrühe hervorzubringen, wie vorgesehen.
Darüber hinaus wurden 110 ml-Anteile eines flüssigen Kulturmediums, welches 1,5% Glycerin, 1,5% Baumwollsamenmehl, 0,3% Natriumchlorid und 0,5% Natrium L-Glutamat (eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4) enthielt, in Erlenmeyerkloben (mit je 500 ml Kapazität) gegeben, gefolgt von Sterilisierung in der üblichen Weise. Das auf diese Weise hergestellte flüssige Kulturmedium wurde als ein produktives Kulturmedium verwendet. 50 Liter dieses produktiven Kulturmediums wurden mit einem ein 2%-Anteil der vorstehend erwähnten Saat-Kulturbrühe inokuliert und dann wurde die Schüttelzüchtung bei 27°C für 2 Tage mit Rotation durchgeführt.
Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um sich in Kulturbrühen-Filtrat und die gezüchteten mikrobiellen Zellen aufzutrennen. Die gezüchteten mikrobiellen Zellen wurden mit 10 Liter Methanol extrahiert und danach wurde der Methanol-Extrakt unter vermindertem Druck konzentriert. Die daraus resultierende konzentrierte Lösung wurde mit dem Kulturbrühen-Filtrat vereinigt und 50 Liter des daraus resultierenden Gemischs wurden durch eine Säule geschickt, welche 6 Liter eines synthetischen adsorbierenden Harzes enthielt, bestehend aus einem porösen Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer, und zwar „Diaion HP-20"-Harz (ein Produkt von Mitsubishi Chemical Co., Japan), wobei die Tripropeptine an das Diaion HP-20-Harz angelagert wurden. Durch diese Diaion HP-20-Harzsäule, welche die angelagerten Tripropeptine enthielt, wurden jeweils in dieser Reihenfolge 18 Liter entionisiertes Wasser, 50% wässriges Methanol und 65% wässriges Aceton durchgeleitet. Das Eluat, wie es durch Eluieren der Säule mit dem 65% wässrigen Aceton erhalten wurde, ist eine aktive Fraktion und dieses Eluat wurde unter vermindertem Druck zu Trockenheit konzentriert, wobei 30 g eines festen Extraktes, welcher Tripropeptine enthielt, erhalten wurde. Dieser feste Rohextrakt, welcher die Tripropeptine enthielt, wurde auf eine Silicagel-Säule (im Handel erhältlich von Merck Co., USA) (1500 ml) aufgetragen und nacheinander mit Lösungsmittelgemischen von Chloroform-Methanol-Wasser (10 : 5 : 1) und Butanol-Methanol-Wasser (4 : 1 : 2) chromatographiert. Diese aktiven Fraktionen wurden gewonnen und konzentriert, wobei 10,8 g eines festen, teilweise gereinigten Produktes erhalten wurden, welches Tripropeptine enthielt. Dieses teilweise gereinigte Produkt wurde in 50% wässriges Methanol aufgenommen und die sich daraus ergebende Lösung wurde durch eine Säule (250 ml) geschickt, welche das aromatische, synthetische adsorbierende Harz „Diaion CHP20P"-Harz (ein Produkt von Mitsubishi Chemical Co., Japan) enthielt, wobei die Tripropeptine an das Diaion CHP20P-Harz angelagert wurden. Durch diese Diaion CHP20P-Harzsäule, welche die angelagerten Tripropeptine enthielt, wurden nacheinander je 750 ml von 20% wässrigem Aceton, 30% wässrigem Aceton, 35% wässrigem Aceton, 40% wässrigem Aceton, 45% wässrigem Aceton, 50% wässrigem Aceton, 55% wässrigem Aceton und 60% wässrigem Aceton durchgeleitet.
Die Fraktion, wie durch Eluierung dieser Säule mit dem 40% wässrigem Aceton erhalten, wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um 65,7 mg an Tripropeptin Z hervorzubringen. Die Fraktion, wie durch Eluierung der Säule mit dem 45% wässrigem Aceton erhalten, wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um 189,7 mg an Tripropeptin A hervorzubringen. Manche der Fraktionen, wie durch Eluierung der Säule mit dem 45% wässrigem Aceton bis 50% wässrigem Aceton erhalten, wurden unter vermindertem Druck konzentriert, um 210,6 mg an Tripropeptin B hervorzubringen. In ähnlicher Weise wurden einige andere der Fraktionen, wie durch Eluierung mit dem 45% wässrigem Aceton bis 50% wässrigem Aceton erhalten, unter vermindertem Druck konzentriert, um 1,0 g an Tripropeptin C hervorzubringen. Die Fraktion, wie durch Eluierung mit dem 50% wässrigen Aceton erhalten, wurde unter vermindertem Druck konzentriert, um 50,1 mg an Tripropeptin D hervorzubringen.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß dieser Erfindung wird, wie hierin vorstehend beschrieben, jedes der Tripropeptine Z, A, B, C, und D, welche die allgemeine Formel (I) aufweisen, als die neuen Antibiotika bereitgestellt. Die Tripropeptine weisen alle außerordentliche antibakterielle Wirksamkeiten gegen verschiedene Gram-positive Bakterien und deren Arzneistoff-resistente Stämme auf. Ein Tripropeptin gemäß dieser Erfindung ist daher als ein antibiotisches Mittel nützlich, welches zur Behandlung bakterieller Infektionen, einschließlich ihrer Arzneistoff-resistenten Stämme, effektiv ist.

Claims

Antibiotikum Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C oder Tripropeptin D, das eine Verbindung ist wie dargestellt in der allgemeinen Formel (I):
wobei R für Tripropeptin Z eine 7-Methyl-octyl-Gruppe, für Tripropeptin A eine 8-Methyl-nonyl-Gruppe; für Tripropeptin B eine 9-Methyl-dodecyl-Gruppe; für Tripropeptin C eine 10-Methyl-undecyl-Gruppe; und für Tripropeptin D eine 11-Methyl-dodecyl-Gruppe ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Antibiotikum gemäß Anspruch 1, das Tripropeptin Z ist wie dargestellt in der Formel (Iz):
das heißt, die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) wie gezeigt in Anspruch 1, wobei R eine 7-Methyl-octyl-Gruppe ist.
Antibiotikum gemäß Anspruch 1, das Tripropeptin A ist wie dargestellt in der Formel (Ia):
das heißt, die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) wie gezeigt in Anspruch 1, wobei R eine 8-Methyl-nonyl-Gruppe ist.
Antibiotikum gemäß Anspruch 1, das Tripropeptin B ist wie dargestellt in der Formel (Ib):
das heißt, die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) wie gezeigt in Anspruch 1, wobei R eine 9-Methyl-decyl-Gruppe ist.
Antibiotikum gemäß Anspruch 1, das Tripropeptin C ist wie dargestellt in der Formel (Ic):
das heißt, die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) wie gezeigt in Anspruch 1, wobei R eine 10-Methyl-undecyl-Gruppe ist.
Antibiotikum gemäß Anspruch 1, das Tripropeptin D ist wie gezeigt in der Formel (Id):
das heißt, die Verbindung gemäß der allgemeinen Formel (I) wie gezeigt in Anspruch 1, wobei R eine 11-Methyl-dodecyl-Gruppe ist.
Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikums Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C und/oder Tripropeptin D wie dargestellt in der allgemeinen Formel (I) von Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Züchten eines mikrobiellen Stamms, der der Gattung Lysobacter angehört und der in der Lage ist, zumindest eines der Antibiotika Tripropeptin Z, Tripropeptin A, Tripropeptin B, Tripropeptin C und Tripropeptin D herzustellen, und das Erhalten von zumindest einem der Tripropeptine Z, A, B, C und D aus der sich ergebenden Kultur umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei als mikrobieller Stamm, der in der Lage ist, zumindest eines der Tripropeptine Z, A, B, C und D herzustellen, ein Stamm Lysobacter sp. BMK333-48F3, verwendet wird, der beim National Institute of Bioscience and Human Technology of Advanced Industrial Science and Technology, Agency of Ministry of Economy, Trade and Industry unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7477 hinterlegt wurde.
Arzneimittel, umfassend als wirksamen Inhaltsstoff zumindest eines der Tripropeptine Z, A, B, C und D, das die allgemeine Formel (I) von Anspruch 1 aufweist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder pharmazeutisch verträglichen Trägern.
Arzneimittel gemäß Anspruch 9, das ein antibakterielles Arzneimittel ist.
Neuer Mikroorganismus, ein Stamm Lyscobacter sp. BMK333-48F3 der dadurch gekennzeichnet ist, dass er in der Lage ist, die Tripropeptine Z, A, B, C und D gemäß der allgemeinen Formel (I) von Anspruch 1 herzustellen und der beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Advanced Industrial Science and Technology, Agency of Ministry of Economy, Trade and Industrz unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7477 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt wurde.