DE69211723T2

DE69211723T2 - Mit einem Zellwachstumsfaktor bewirkte Anregung von Wachstum im Knocheninneren

Info

Publication number: DE69211723T2
Application number: DE69211723T
Authority: DE
Inventors: Takayasu Ito; Koichi Kato; Hiroshi Mayahara
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2012-02-14
Also published as: EP0499242B1; DE69211723D1; ATE139700T1; EP0499242A1; CA2061211A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei Warmblütern.

Hintergrund der Erfindung

Osteoporose ist ein pathologischer Zustand, der durch eine pathologische Reduktion der Knochenmasse gekennzeichnet ist, die zu klinischen Symptomen führt, wie Abnahme der Körpergröße und Kyphose, was zu vertebraler Kompressionsfraktur und Gliederknochenfraktur führt. In entwickelten Ländern hat die Zahl der Osteoporosepatienten mit der Zunahme des Durchschnittsalters der Bevölkerung stetig zugenommen.
Die Reduktion der Knochenmasse, die Ursache der Osteoporose, tritt aufgrund verschiedener Hormonanomalien auf, insbesondere Östrogenmangel nach der Menopause, Calcitoninmangel, Mangel an Wachstumshormonen, Hyperparathyreose und Hyperthyreose sowie das physiologische pHänomen des Alterns. Zu den weiteren Faktoren, die die Osteoporose beeinflussen, gehören Krankheiten (chronischer Gelenkrheumatismus und Diabetes mellitus), Ernährungs- oder Stoffwechselanomalien (Mangel an Calcium, Vitamin D, Vitamin C oder Vitamin K, übermäßige Aufnahme von Protein, Phosphor oder Natrium), das Ausmaß der körperlichen Betätigung, genetische Faktoren und Rassenunterschiede. Osteoporose tritt auch als Symptom (Cushing-Syndrom) der nachteiligen Wirkungen von adrenocorticoiden Steraiden auf, die zur Behandlung verschiedener chronischer Krankheiten verwendet werden.
Das Knochengewebe erwachsener Säuger wird in einem wohlausgewogenen Vorgang der osteolyse/Knochenabbau (Knochenresorption) durch Osteoklasten und Osteogenese durch Osteoblasten ständig erneuert (remodelliert). Osteoporose kann als ein Zustand der ständigen Reduktion der Knochenmasse angesehen werden, bei dem die Menge an resorbiertem Knochen aufgrund eines unausgewogenen Verhältnisses von Knochenresorption und Osteogenese, das mit verschiedenen Faktoren verbunden ist, die Menge an gebildetem Knochen überschreitet.
Herkömmlicherweise werden zur Behandlung dieser Krankheit Östrogen, Calcitonin, aktives Vitamin D, Ipriflavon und andere Medikamente verabreicht.
Osteoporose kann durch Verabreichen eines Medikaments behandelt werden, das die Reduktion der Knochenmasse unterdrückt oder die Knochenmasse erhöht. Alle oben genannten Therapeutika unterdrücken jedoch hauptsächlich die Knochenresorption; es gibt kein Therapeutikum, das eine die Qsteogenese fördernde Wirkung (die Knochenmasse erhöhende Wirkung) als zugelassene Wirkung besitzt. Daher verzögert häufig auch eine langfristige Verabreichung dieser Medikamente an Osteoporosepatienten nur das Fortschreiten der Symptome. Außerdem haben diese Medikamente fast keinen therapeutischen Wert mehr, wenn die Osteoporose so weit fortgeschritten ist, daß Knochenfraktur auftritt. Entsprechend besteht ein Bedürfnis nach der Entwicklung eines Medikaments mit einer starken, die Knochenmasse erhöhenden oder die Osteogenese fördernden Wirkung bei kurzfristiger Verabreichung.
Im Hinblick auf die oben beschriebene Hintergrundsituation führten die Erfinder Untersuchungen durch und fanden, daß Zellwachstumsfaktoren die endosteale Knochenbildung bei Warmblütern stimulieren. Die Erfinder führten auf der Grundlage dieses Befunds weitere Untersuchungen durch und vollendeten die vorliegende Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft also die Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei Warmblütern.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 1 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 2 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 1 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit rhbFGF-Mutein CS23 behandelten Gruppe zeigt.
Figur 3 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein anderes histologisches Bild des in Beispiel 1 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 4 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein anderes histologisches Bild des in Beispiel 1 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit rhbFGF-Mutein CS23 behandelten Gruppe zeigt.
Figur 5 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 1 erhaltenen Brustbeins bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 6 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 1 erhaltenen Brustbeins bei der mit rhbFGF-Mutein CS23 behandelten Gruppe zeigt.
Figur 7 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 2 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 8 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 2 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit rhbFGF behandelten Gruppe zeigt.
Figur 9 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 3 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 10 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 3 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit rhaFGF behandelten Gruppe zeigt.
Figur 11 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 4 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 12 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 4 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit hst-1-Mutein N27 behandelten Gruppe zeigt.
Figur 13 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 5 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 14 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 5 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit EGF behandelten Gruppe zeigt.
Figur 15 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 6 erhaltenen Schienbeinknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 16 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 6 erhaltenen Schienbeinknochens bei der mit rhbFGF-Mutein CS23 behandelten Gruppe zeigt.
Figur 17 ist ein Kontaktmikroradiogramm (CMR) des in Beispiel 6 erhaltenen Schienbeinknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe.
Figur 18 ist ein CMR des in Beispiel 6 erhaltenen Schienbeinknochens bei der mit rhbFGF-Mutein CS23 behandelten Gruppe.
Figur 19 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 7 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der unbehandelten Kontrollgruppe zeigt.
Figur 20 ist eine lichtmikroskopische Mikrophotographie, die ein histologisches Bild des in Beispiel 7 erhaltenen Oberschenkelknochens bei der mit rhbFGF-Mutein CS23 behandelten Gruppe zeigt.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
(1) ein Verfahren zur Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei einem Warmblüter, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Zellwachstumsfaktors an das Tier umfaßt;
(2) eine pharmazeutische Zellwachstumsfaktorzusammensetzung zur Erzielung einer prophylaktischen oder therapeutischen Wirkung bei der Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei Warmblütern, die [A] eine wirksame Menge eines Zellwachstumsfaktors und [B] einen pharmazeutisch annehmbaren Träger bzw. ein Verdünnungsmittel oder einen Arzneimittelhilfsstoff umfaßt;
(3) die Verwendung einer Zellwachstumsfaktorzusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments, um eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung bei der Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei einem Warmblüter zu erzielen; und
(4) ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, um eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung bei der Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei Warmblütern zu erzielen, umfassend das Mischen einer wirksamen Menge eines Zellwachstumsfaktors mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneimittelhilfsstoff.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Beispiele für die Zellwachstumsfaktoren der vorliegenden Erfindung sind solche mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 25000.
Beispiele für die Zellwachstumsfaktoren sind ein Peptid, das zur Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) gehört, die Nervenwachstumsfaktoren NGF-1 und NGF-2/NT-3, der Epithelzellenwachstumsfaktor (EGF), der Thrombocyten-Wachstumsfaktor (PDGF), die insulinartigen Wachstumsfaktoren IGF-I und -II, der koloniestimulierende Faktor (CSF), Erythropoietin (EPO), Thrombopoietin, die Interleume IL-1, IL-2, JL-3, IL-4, IL-5 und IL-6, der knorpelabgeleitete Faktor (CDF), die transformierenden Wachstumsfaktoren TGF-α, TGF-β und TGF-γ2, der Tumorangiogenesefaktor (TAF), Insulin, Transferrin, Fibronectin, Laminin, Chondronektin, Hydronektin, der Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF), der Leukämiezellen-abgeleitete Wachstumsfaktor (LGF), dermakrophagen-Wachstumsfaktor (MGF), die knochenmorphogenetischen Proteine BMP-1, -2A, -2B und -3, B2-Mikroglobulin (B2-m) und der osteoinduktive Faktor (OIF). Diese Zellwachstumsfaktoren können von der Art der natürlicherweise vorkommenden oder von der Art eines Muteins sein.
Bevorzugt wird ein Peptid, das zur FGF-Familie gehört.
Zur FGF-Familie gehören ein basisches FGF (im folgenden auch als BFGF bezeichnet), ein saures FGF (im folgenden auch als AFGF bezeichnet), int-2, hst-1, k-FGF, FGF-5, FGF-6 usw. Muteine davon gehören ebenfalls dazu.
Das FGF kann von Säugern abgeleitet sein. Beispiele für solche Sauger sind Menschen, Affen, Schweine, Rinder, Schafe und Pferde.
Das FGF kann auch aus verschiedenen Organen extrahiert sein, von denen man weiß, daß sie FGF enthalten, wie Gehirn und Hypophyse. Das FGF kann auch gentechnisch hergestellt sein.
Das BFGF kann durch DNA-Rekombinationstechnik erhalten werden (FEBS Letters, 213, 189-194 (1987); Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. 237,966).
In der vorliegenden Beschreibung wird rekombinantes basisches FGF auch als rhbFGF bezeichnet.
Das FGF kann ein Mutein sein. Das FGF-Mutein ist im wesentlichen eine Variante, die sich aus einer Mutation der Aminosäuresequenz des ursprünglichen Peptids oder Proteins ergibt; zu diesen Mutationen gehören daher die Addition von Aminosäuren, die Deletion konstitutioneller Aminosäuren und ihre Substitution durch andere Aminosäuren.
Addition von Aminosäuren bedeutet Addition von mindestens einer Aminosäure.
Deletion konstitutioneller Aminosäuren bedeutet die Deletion mindestens einer konstitutionellen Aminosäure von FGF.
Substitution durch andere Aminosäuren bedeutet die Substitution mindestens einer konstitutionellen Aminosäure von FGF durch eine andere Aminosäure.
Die Addition von Aminosäuren umfaßt weder Methionin, das vom Startcodon für die Peptidexpression stammt, noch das Signalpeptid.
Bei der Herstellung der obigen Muteine über die Addition von Aminosäuren kann jede Zahl von Aminosäuren hinzugefügt werden, solange die Natur des FGF aufrechterhalten wird. Vorzugsweise kann die hinzugefügte Aminosäure eine partielle oder gesamte Aminosäuresequenz irgendeines Proteins sein, das Homologie zu FGF und damit ähnliche Wirkungen zeigt.
Bei der Herstellung der obigen Muteine über die Deletion konstitutioneller Aminosäuren aus FGF kann jede Zahl von Aminosäuren fehlen, solange die Natur des FGF aufrechterhalten wird.
Bei der Herstellung der obigen Muteine über die Substitution durch andere Aminosäuren kann jede Zahl von Aminosäuren durch andere Aminosäuren substituiert sein, solange die Natur des FGF aufrechterhalten wird. Das substituierte Mutein ist vorzugsweise ein Mutein, bei dem wenigstens ein Cysteinaminosäurebestandteil durch Serin ersetzt ist. Bei dieser Substitution können zwei oder mehr Substitutionen zu gleicher Zeit durchgeführt werden, wobei die Substitution von zwei oder drei Aminosäurebestandteilen bevorzugt ist.
Das Mutein kann das Ergebnis einer Kombination von zwei oder drei Additionen, Deletionen und Substitutionen, wie sie oben beschrieben sind, oder einer Kombination davon sein. Das Mutein kann auch das Ergebnis einer Einführung einer Bindungsstelle für Zuckerketten sein.
Beispiele für das Mutein sind die in den Europäischen Patentanmeldungen (im folgenden auch als EP bezeichnet) Veröffentlichungs-Nr. 281,822, Nr. 326,907 und Nr. 394,951 beschriebenen Muteine.
Das Mutein ist vorzugsweise ein Mutein, das sich aus der Substitution wenigstens eines Aminosäurebestandteils von humanem basischem FGF durch eine andere Aminosäure ergibt, wobei das Human-BFGF-Mutein CS23 bevorzugt wird, das sich durch Substitution des 70- und des 88-Cys-Restes in Human-BFGF durch Ser (Serin) ergibt (siehe EP Nr. 281,822).
Ein Beispiel für das oben beschriebene AFGF ist das FGF mit der Aminosäuresequenz, die in Biochemical and Biophysical Research Communications, 138, 611-617 (1986), gezeigt ist.
Zu den typischen AFGF-Muteinen gehören Muteine des Deletionstyps, wie die, die eine Polypeptidkette aus 90 bis 133 aufeinanderfolgenden Aminosäuren als Teil der Sequenz von 140 Aminosäuren umfassendem AFGF umfassen, wobei Muteine bevorzugt sind, die eine Polypeptidkette aus 120 bis 131 aufeinanderfolgenden Aminosäuren als Teil der Aminosäuresequenz von AFGF umfassen.
Beispiele für solche AFGF-Muteine sind die in der BP-Veröffentlichung Nr. 420,222 beschriebenen.
Beispiele für das oben beschriebene hst-1 sind die Proteine, die in den Proceedings of National Academy of Science, USA, 84, 2980 (1987), den Proceedings of National Academy of Science, USA, 84, 7305 (1987) und in Molecular and Cellular Biology, 8, 2933 (1988) offenbart sind.
Beispiele für hst-1-Muteine sind Muteine des Deletionstyps, wie die, die sich durch Deletion wenigstens einer der 175 Aminosäurebestandteile von hst-1 ergeben, vorzugsweise durch Deletion von 1 bis 47 aufeinanderfolgender Aminosäurebestandteile von hst-1, noch bevorzugter durch Deletion von 1 bis 43 aufeinanderfolgender Aminosäurebestandteile von hst-1 und am besten durch Deletion irgendwelcher 1 bis 27 aufeinanderfolgender Aminosäurebestandteile von hst-1.
Beispiele für solche hst-1-Muteine sind die in der BP-Veröffentlichung Nr. 421,455 beschriebenen.
Das EGF für die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel durch Genrekombinationstechnik hergestellt werden. Zu den Beispielen für solche Herstellungsverfahren gehört das in der EP-Veröffentlichung Nr. 326,046 beschriebene Verfahren.
In der vorliegenden Erfindung wird die endosteale Knochenbildung stimuliert. Wenn das Medikament der vorliegenden Erfindung einem Warmblüter verabreicht wird, treten im Einklang mit der Route, der Dosierung und der Zeit der Verabreichung insbesondere eine merkliche Vermehrung von Osteoblasten, eine merkliche Neubildung von Knochen und eine merkliche Erhöhung der Knochensalzmasse bei allen langen oder Röhrenknochen, wie den Oberschenkelknochen, flachen Knochen, wie dem Brustbein und den Rippen, und unregelmäßigen Knochen, wie den Wirbeln, auf. Seine Toxizität ist gering. Daher kann das Medikament der vorliegenden Erfindung als prophylaktische/therapeutische Medizin für verschiedene Knochenkrankheiten einschließlich Knochenschwundkrankheiten, wie Osteoporose, usw. verwendet werden.
Außerdem wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt, bei dem die Vermehrung von Osteoblasten und die Knochenbildung auf der endostealen Seite der Diaphyse und Metaphyse auftreten und keine Knochenbildung auf der periostealen Seite (Außenfläche) des Knochens auftritt. Daher kann das Medikament der vorliegenden Erfindung die endosteale Knochenbildung stimulieren, und neuer Knochen wird in Richtung zur Markhöhle hin gebildet. Die endosteale Knochenbildung erhöht die Dicke des Rindenknochens der Diaphyse. Sie erhöht auch die Dicke jedes Knochenbälkchens in der Knochenschwammsubstanz in der Metaphyse. Sowohl die Erhöhung der Dicke des Rindenknochens in der Diaphyse als auch die Erhöhung der Dicke jedes Knochenbälkchens in der Metaphyse verstärkt die Skelettknochen und verhindert so die Knochenschwundkrankheiten, wie Osteoporose, Osteopenie, Hypercalciämie usw., oder unterstützt deren Therapie.
Die Natur des Medikaments der vorliegenden Erfindung, das heißt die Stimulierung der endostealen Knochenbildung, nicht aber der periostealen (an der Außenseite) Knochenbildung, eignet sich am besten für eine prophylaktische/therapeutische Wirkung gegen Knochenschwundkrankheiten, da sie die Knochenmasse ohne die Nachteile von Schmerzen oder Skelettverformungen aufgrund einer nach außen gerichteten Erweiterung des Knochengewebes erhöhen kann.
Bei reifen Tieren wird zuerst altes Knochengewebe durch Osteoklasten resorbiert (Knochenresorption) und dann durch Osteoblasten repariert (Osteogenese), so daß eine Homöostase des Knochens beibehalten wird; dieser Mechanismus wird Remodellierung genannt. In der vorliegenden Erfindung ist die durch Zellwachstumsfaktor bewirkte Knochenbildung von einer Vermehrung der Osteoblasten, aber nicht von einer Vermehrung der Osteoklasten begleitet. Mit anderen Worten, die vorliegende Erfindung sorgt für eine Knochenbildung ohne homöostatische Remodellierung. Frühere medikamentöse Behandlungen von Knochenschwundkrankheiten strebten eine Verminderung des Knochenschwundes durch Verminderung der Knochenresorption durch Osteoklasten an. Daher erfolgt die Wirkung einer Erhöhung der Knochenmasse bei der früheren medikamentösen Behandlung indirekt und, wenn überhaupt, langsam. Dagegen ist die Knochenbildung durch den Zellwachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung direkt und schnell, da er die Vermehrung der Osteoblasten und die Osteogenese direkt stimuliert, ohne den Vorgang der Remodellierung zu stören.
Beispiele für die bei der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßten Knochenkrankheiten, ob angeboren oder erworben, sind Knochenschwundkrankheiten, wie Osteoporose, Osteopenie, Osteodystrophie, Dysostose und Hypercalciamie. Das prophylaktische/ therapeutische Medikament für Knochenkrankheiten der vorliegenden Erfindung ist bei der Vorbeugung oder Behandlung von Knochenkrankheiten, die mit einer Reduktion der Knochenmasse und einer Aushöhlung des Knochengewebes einhergehen, wie Osteoporose, sehr wirkungsvoll, da es eine Vermehrung der Osteoblasten, eine Verstärkung der Knochenneubildung und eine Erhöhung der Knochensalzmasse bewirkt und somit wiederum alle langen oder Röhrenknochen, flachen Knochen und unregelmäßigen Knochen verstärkt.
Das präventive/therapeutische Medikament für Knochenkrankheiten der vorliegenden Erfindung kann als solches oder in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen zusammen mit einem pharmakologisch annehmbaren Träger, z.B. Trägern, Arzneimittelhilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln, für Injektionen, Tabletten; Kapseln, Lösungen, Salben usw. sicher oral oder parenteral an Warmblüter (z.B. Menschen, Mäuse, Ratten, Hamster, Kaninchen, Hunde, Katzen, Rinder, Schafe, Schweinel Pferde), vorzugsweise Säuger, zum Zwecke der Verhinderung oder Behandlung ihrer Knochenkrankheiten verabreicht werden, wobei eine parenterale Verabreichung bevorzugt wird.
Was die Darreichungsform betrifft, so wird das Medikament der Erfindung vorzugsweise als Injektion, Lösung für eine Injektion oder lyophilisiertes Produkt hergestellt. Es kann auch nach Bedarf als Präparat mit verzögerter Freisetzung hergestellt werden.
Bei der Herstellung des Medikaments der vorliegenden Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung werden bekannte pharmazeutische Herstellungsverfahren befolgt, wobei nach Bedarf pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel oder Arzneimittelhilfsstoffe verwendet werden.
Wenn das Medikament zum Beispiel als wäßrige Lösung für die Injektion hergestellt wird, wird es nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von wäßrigen Lösungsmitteln (z.B. destilliertem Wasser), wasserlöslichen Lösungsmitteln (z.B. physiologischer Kochsalzlösung, Ringer-Lösung) und öligen Lösungsmitteln (z.B. Sesamöl, Olivenöl) hergestellt, wobei nach Bedarf Lösungsvermittler (z.B. Natriumsalicylat, Natriumacetat), Puffer (z.B. Natriumcitrat), isotonisierende Mittel (z.B. Glucose, Invertose), Stabilisatoren (z.B. Human-Serumalbumin, Polyethylenglycol), Konservierungsstoffe (z.B. Benzylalkohol, Phenol), Analgetika (z.B. Benzalkoniumchlorid, Procain-Hydrochlorid) und andere Additive hinzugefügt werden.
Wenn das Medikament der vorliegenden Erfindung zum Beispiel als festes Präparat für die Injektion hergestellt wird, kann das gewünschte feste Präparat für die Injektion nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung eines Gemischs von Verdünnungsmitteln (z.B. destilliertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Glucose), Arzneimittelhilfsstoffen (z.B. Carboxymethylcellulose (CMC), Natriumalginat), Konservierungsstoffe (z.B. Benzylalkohol, Benzalkoniumchlorid, Phenol), Analgetika (z.B. Glucose, Calciumgluconat, Procain-Hydrochlorid) oder anderer Substanzen hergestellt werden.
Bei der Herstellung eines pharmazeutischen Präparats für das Medikament der vorliegenden Erfindung können Monosaccharide, wie Glucose, Aminosäuren, verschiedene Salze, Human-Serumalbumin und andere Substanzen hinzugefügt werden, wobei isotonisierende Medikamente, pH-Regulatoren, Analgetika, Antiseptika und andere Additive hinzugefügt werden, so daß man stabile, wirksame Präparate erhält.
Was die Dosis des Medikaments der vorliegenden Erfindung betrifft, so sollte es in solchen Mengen verabreicht werden, daß der Zellwachstumsfaktorgehalt in der Körperflüssigkeit lebender Körper etwa 1 bis etwa 1000 pg/ml, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 500 pg/ml, beträgt, was etwa 0,1 bis etwa 1000 µg/kg Körpergewicht, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 300 µg/kg Körpergewicht, entspricht.
Zu den Wegen der parenteralen Verabreichung des Medikaments der vorliegenden Erfindung gehören die intravenöse Verabreichung, die subkutane Verabreichung, die intramuskuläre Verabreichung, die Injektion direkt in die Markhöhle oder in das Knochengewebe und die Verabreichung durch die Schleimhaut. Zu den Wegen der Verabreichung durch die Schleimhaut gehören die nasale Verabreichung, die intraorale Verabreichung und die rektale Verabreichung.
Vorzugsweise wird das Medikament der vorliegenden Erfindung dem betreffenden Warmblüter systemisch verabreicht. Es wird daher vorzugsweise in das Kreislaufsystem verabreicht, zum Beispiel durch intravenöse Verabreichung. Die Häufigkeit der Verabreichung kann in einem Bereich von mehr als einmal pro Tag bis zu weniger als einmal pro Woche liegen und kann regelmäßig oder stoßweise erfolgen.
Das Medikament der vorliegenden Erfindung kann auch in Form eines Präparats mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden. Zu diesen Präparaten mit verzögerter Freisetzung gehören Mikrokapseln und implantierte Preßlinge. Insbesondere gewährleistet ein subkutan implantiertes Präparat mit verzögerter Freisetzung eine länger anhaltende Wirkung des Wirkstoffs. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Präparat mit verzögerter Freisetzung direkt in die Markhöhle oder in das Knochengewebe implantiert oder injiziert, was eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs gewährleistet.
Bei der Verabreichung des Präparats gemäß der vorliegenden Erfindung kann gleichzeitig ein Calciummedikament verwendet werden, da die Osteogenese Calcium erfordert. Suppressoren der Knochenresorption, wie aktives Vitamin D aktives Vitamin D3, Calcitonin, Östrogen und Ipriflavon können ebenfalls gleichzeitig verwendet werden.
Das in den unten angegebenen Beispielen verwendete rekombinante humane basische FGF-Mutein CS23 (im folgenden auch als rhbFGF- Mutein CS23 bezeichnet) wird nach dem Verfahren hergestellt, das in Beispiel 7 und 24 der EP-Veröffentlichung Nr. 281,822 und in Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 701-708 (1988), beschrieben ist, wobei die Transformante Escherichia coli MM294/pTB762 (IFO 14613, FERM BP-1645) eingesetzt wird.
Die oben genannte Transformante E. coli MM294/pTB762 wurde beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan, hinterlegt. Die Zugriffsnummern und Zugriffsdaten sind in Tabelle 1 unten gezeigt. Was die FRI-Hinterlegung betrifft, so wurde zuerst eine inländische Hinterlegung unter einer FERM-P-Zugriffsnummer vorgenommen. Diese Hinterlegung wurde dann in eine Hinterlegung unter dem Budapester Abkommen umgewandelt; seitdem wird die Transformante beim FRI unter einer FERM-BP-Zugriffsnummer aufbewahrt. Tabelle 1 Transformante E. coli
Das in den unten angegebenen Beispielen verwendete Human-bFGF wurde nach dem Verfahren hergestellt, das in den Beispielen der EP-Veröffentlichung Nr. 237,966 beschrieben ist, wobei die Transformante Escherichia coli K12MM294/pT8669 (IFO 14532, FERM BP-1281) verwendet wird.
Das in den unten angegebenen Beispielen verwendete Human-aFGF wurde nach dem Verfahren hergestellt, das in Beispiel 1 der BP- Veröffentlichung Nr. 406,738 beschrieben ist, wobei die Transformante Escherichia coli MM294(DE3)/pLysS,pTB975 (IFO 14936, FERM BP-2599) verwendet wird.
Das in den unten angegebenen Beispielen verwendete hst-1-Mutein N27 wurde nach dem Verfahren hergestellt, das in den Beispielen der BP-Veröffentlichung Nr. 421,455 beschrieben ist, wobei die Transformante Escherichia coli MM294 (DE3)/pLysS,PTBL975 (IFO 14952, FERM BP-2621) verwendet wird.
Das in den unten angegebenen Beispielen verwendete EGF wurde nach dem Verfahren hergestellt, das in der EP-Veröffentlichung Nr. 326,046 beschrieben ist. Insbesondere wurde das EGF nach dem Verfahren hergestellt, das in den Beispielen 1, 2, 3 (ii), 4 und 5 der BP-Veröffentlichung Nr. 326,046 beschrieben ist, wobei Bacillus brevis H102(pNU200-EGF31) verwendet wurde; die Transformante wurde durch Insertieren des Plasmids pNU200-EGF31, das aus der Transformanten Badilus brevis 47-5(pNU200-EGF31) (IFO 14729, FBRM BP-1772) abgetrennt worden war, in den Wirt Bacillus brevis H102 (FERM BP-1087, siehe US-Patent 4,946,789) hergestellt.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand des folgenden Bezugsbeispiels und der folgenden Arbeitsbeispiele näher beschrieben, aber die Erfindung wird dadurch in keiner Weise eingeschränkt.

Bezugsbeispiel 1 Verfahren zur Messung der Knochenbildung oder Osteogenese

Bin Schnitt des Oberschenkelknochens oder Schienbeins wurde von einer Stelle 5 bis 100 mm vom distalen Ende her angefertigt. Ein Röntgenradiogramm wurde von einem sagittalen Abschnitt des Schnittes aufgenommen, wobei eine Radiographieapparatur mit weichen Röntgenstrahlen (Softex, Modell CSM-2) verwendet wurde. Auf diesem Röntgenradiogramm wurden mit Hilfe eines Bildanalysators (Pias Corporation, Modell 555) die Querschnittsfläche (A) und die Markhöhlenfläche (B) des Schnittes bestimmt. Wert B wurde von Wert A subtrahiert, um die Fläche des Rindenknochens zu erhalten, die in Prozent des Wertes A ausgedrückt wurde.

Beispiel 1 Osteogenese-fördernde Wirkung von rhbFGF-Mutein CS23 bei Ratten

Vier männlichen-Ratten und vier weiblichen Ratten (Jcl: Wistar) in jeder Gruppe wurde beginnend bei einem Alter von 6 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,01, 0,03, 0,1 bzw. 0,3 mg/kg/Tag rhbFGF-Mutein CS23 intravenös verabreicht. Nach Ende der Verabreichungszeit wurden die Tiere getötet, und ihre Oberschenkelknochen, Brustbeine und Rippen wurden in 10%igem Formalin fixiert, entcalcifiziert, in Paraffin eingebettet und längs geschnitten, so daß man 4 µm dicke Schnitte erhielt. Nach dem Anfärben mit Hämatoxylin-Bosin (H-B) wurden diese Schnitte histopathologisch untersucht, um die Auswirkungen auf das Knochengewebe zu bewerten. Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei den behandelten Gruppen physiologische Kochsalzlösung verabreicht.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Vermehrung der Osteoblasten in den Oberschenkelknochen, Brustbeinen und Rippen bei Dosen von 0,1 mg/kg oder mehr dosisabhängig war. Dieser Befund wurde bei den Oberschenkelknochen auf der Markhöhlenseite der Metaphyse und Diaphyse (siehe Figur 1, 2, 3 und 4) und bei den Brustbeinen und Rippen auf der Markhöhlenseite des Knochenmittelteils erhalten.
Die Einzelheiten der Figuren 1 bis 4 sind wie folgt:
Figur 1: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-B-Anfärbung, 8,5 x, keine keine anormalen Befunde.
Figur 2: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg rhbFGF-Mutein CS23, H-E-Anfärbung, 85 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle.
Figur 3: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-E-Anfärbung, 85 x, keine anormalen Befunde.
Figur 4: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg rhbFGF-Mutein CS23, H-B-Anfärbung, 85 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle, keine Osteogenese auf der periostealen Seite zu erkennen (Pfeil).
Bei der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, wurden ähnliche Befunde auf der Markhöhlenseite der Rippen an der Rippenknorpelverbindung erhalten. Bei diesen Knochen trat Osteogenese nur auf der Markhöhlenseite auf, und nicht auf der Außenseite (periostealen Seite) des Knochens. Bei keiner der Dosen trat eine Vermehrung von Osteoklasten auf. Bei der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, wurde außerdem eine epiphysiale Vermehrung von Osteoblasten festgestellt, was auf eine Förderung der endochondralen Knochen bildung hinweist (siehe Figur 5 und 6).
Die Einzelheiten der Figuren 5 und 6 sind wie folgt:
Figur 5: Brustbein, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-E-Anfärbung, 170 x, keine anormalen Befunde.
Figur 6: Brustbein, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg rhbFGF-Mutein CS23, H-E-Anfärbung, 170 x, zeigt Hypertrophie und Vermehrung der Osteoblasten (Pfeil) sowie Knochenneubildung.
Nach dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde bei den Oberschenkelknochenschnitten der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, die Fläche des Rindenknochens (%) berechnet (Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben). Die Fläche des Rindenknochens (%) bei der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, war statistisch größer als bei der Gruppe, die physiologische Kochsalzlösung erhielt. Tabelle 2 Gruppe Zahl der Tiere Fläche des Rindenknochens (%) physiologische Kochsalzlösung rhbFGF-Mutein CS23
*: bedeutet, daß der Unterschied zwischen den Gruppen mit einem Signifikanzniveau von 1% statistisch signifikant ist (Mittelwert ± Standardfehler) Beispiel 2 Osteogenese-fördernde Wirkung von rhbFGF bei Ratten
Vier weiblichen Ratten (Jcl: Wistar) in jeder Gruppe wurde beginnend bei einem Alter von 6 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,03, 0,1 bzw. 0,3 mg/kg/Tag humaner basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (rhbFGF) intravenös verabreicht. Einen Tag nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere getötet, und die Oberschenkelknochen, Brustbeine und Rippen wurden in 10%igem Formalin fixiert, entcalcifiziert, in Paraffin eingebettet und längs geschnitten, so daß man 4 µm dicke Schnitte erhielt. Nach dem Anfärben mit Hämatoxylin-Bosin (H-E) wurden diese Schnitte histopathologisch untersucht, um die Auswirkungen auf das Knochengewebe zu bewerten. Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei den behandelten Gruppen ein Puffer mit 0,02 M Tris- HCl/l M NaCl (pH 7,4) verabreicht.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Vermehrung der Osteoblasten und die Knochenneubildung in den Oberschenkelknochen bei Dosen von 0,03 mg/kg oder mehr und in den Brustbeinen bei 0,1 mg/kg oder mehr dosisabhängig war. Dieser Befund wurde bei den Oberschenkelknochen auf der Markhöhlenseite der Metaphyse und Diaphyse (siehe Figur 7 und 8) und bei den Brustbeinen auf der Markhöhlenseite des Mittelteils erhalten. Auf der periostealen Seite trat keine Osteogenese auf.
Die Einzelheiten der Figuren 7 und 8 sind wie folgt:
Figur 7: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-B-Anfärbung, 85 x, keine anormalen Befunde.
Figur 8: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg rhbFGF, H-E-Anfärbung, 85 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle, keine Knochenneubildung auf der periostealen Seite zu erkennen (Pfeil)
Nach dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde bei den Oberschenkelknochenschnitten der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, die Fläche des Rindenknochens (%) berechnet (Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben). Die Fläche des Rindenknochens (%) bei der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, war statistisch größer als bei der Gruppe, die Tris-HCl-Puffer erhielt. Tabelle 3 Gruppe Zahl der Tiere Fläche des Rindenknochens (%) Tris-HCl-Puffer
*. bedeutet, daß der Unterschied zwischen den Gruppen mit einem Signifikanzniveau von 1% statistisch signifikant ist (Mittelwert ± Standardfehler).

Beispiel 3 Osteogenese-fördernde Wirkung von rhaFGF bei Ratten

Vier weiblichen Ratten (Jcl: Wistar) in jeder Gruppe wurde beginnend bei einem Alter von 6 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,03, 0,1 bzw. 0,3 mg/kg/Tag humaner saurer Fibroblastenwachstumsfaktor (rhaFGF) intravenös verabreicht. Einen Tag nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere getötet, und ihre Oberschenkelknochen, Brustbeine und Rippen wurden in 10%igem Formalin fixiert, entcalcifiziert, in Paraffin eingebettet und längs geschnitten, so daß man 4 µm dicke Schnitte erhielt. Nach dem Anfärben mit Hämatoxylin-Eosin (H-E) wurden diese Schnitte histopathologisch untersucht, um die Auswirkungen auf das Knochengewebe zu bewerten. Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei den behandelten Gruppen ein Tris-HCl-Puffer mit 0,9 M NaCl (pH 7,4) verabreicht.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Vermehrung der Osteoblasten und die Knochenneubildung in den Oberschenkelknochen und Brustbeinen bei Dosen von 0,03 mg/kg oder mehr dosisabhängig war. Dieser Befund wurde bei den Oberschenkelknochen auf der Markhöhlenseite der Metaphyse und Diaphyse (siehe Figur 9 und 10) und bei den Brustbeinen auf der Markhöhlenseite des Mittelteils erhalten. Auf der periostealen Seite wurde keine Osteogenese gefunden.
Die Einzelheiten der Figuren 9 und 10 sind wie folgt:
Figur 9: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-B-Anfärbung, 85 x, keine anormalen Befunde.
Figur 10: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg rhaFGF, H-E-Anfärbung, 85 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle, keine Knochenneubildung auf der periostealen Seite zu erkennen (Pfeil).
Nach dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde bei den Oberschenkelknochenschnitten der Gruppe, die 0,1 mg/kg erhielt, die Fläche des Rindenknochens (%) berechnet (Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben). Die Fläche des Rindenknochens (%) bei der Gruppe, die 0,1 mg/kg erhielt, war statistisch größer als bei der Gruppe, die Tris-HCl-Puffer erhielt. Tabelle 4 Gruppe Zahl der Tiere Fläche des Rindenknochens (%) Tris-HCl-Puffer
*: bedeutet, daß der Unterschied zwischen den Gruppen mit einem Signifikanzniveau von 1% statistisch signifikant ist (Mittelwert + Standardfehler).

Beispiel 4 Osteogenese-fördernde Wirkung von hst-1-Mutein N27 bei Ratten

Vier weiblichen Ratten (Jcl: Wistar) in jeder Gruppe wurde beginnend bei einem Alter von 6 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,03, 0,1 bzw. 0,3 mg/kg/Tag rekombinantes humanes Heparin-bindendes sekretorisches transformierendes Protein-1-(hst-1)-Mutein N27 intravenös verabreicht. Einen Tag nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere getötet, und ihre Oberschenkelknochen, Brustbeine und Rippen wurden in 10%igem Formalin fixiert, entcalcifiziert, in Paraffin eingebettet und längs geschnitten, so daß man 4 µm dicke Schnitte erhielt. Nach dem Anfärben mit Hämatoxylin-Bosin (H-E) wurden diese Schnitte histopathologisch untersucht, um die Auswirkungen auf das Knochengewebe zu bewerten. Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei den behandelten Gruppen ein Puffer mit 0,01 M Tris-HCl/0,2 M NaCl (pH 7,4) verabreicht.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Vermehrung der Osteoblasten und die Knochenneubildung in den Oberschenkelknochen und Brustbeinen bei Dosen von 0,03 mg/kg oder mehr und bei den Rippen bei 0,1 mg/kg oder mehr dosisabhängig war. Dieser Befund wurde bei den Oberschenkelknochen auf der Markhöhlenseite der Metaphyse und Diaphyse (siehe Figur 11 und 12) und bei den Brustbeinen und Rippen auf der Markhöhlenseite des Mittelteils erhalten. Auf der periostealen Seite wurde keine Osteogenese gefunden.
Die Einzelheiten der Figuren 11 und 12 sind wie folgt:
Figur 11: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-E-Anfärbung, 85 x, keine anormalen Befunde.
Figur 12: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg hst-1-Mutein N27, H-E-Anfärbung, 85 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle, keine Knochenneubildung auf der periostealen Seite zu erkennen (Pfeil).
Nach dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde bei den Oberschenkelknochenschnitten der Gruppe, die 0,1 mg/kg erhielt, die Fläche des Rindenknochens (%) berechnet (Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben). Die Fläche des Rindenknochens (%) bei der Gruppe, die 0,1 mg/kg erhielt, war statistisch größer als bei der Gruppe, die Tris-HCl-Puffer erhielt. Tabelle 5 Gruppe Zahl der Tiere Fläche des Rindenknochens (%) Tris-HCl-Puffer hst-1-Mutein N27
*: bedeutet, daß der Unterschied zwischen den Gruppen mit einem Signifikanzniveau von 1% statistisch signifikant ist (Mittelwert ± Standardfehler).

Beispiel 5 Osteogenese-fördernde Wirkung von EGF bei Ratten

Vier weiblichen Ratten (Jcl: Wistar) in jeder Gruppe wurde beginnend bei einem Alter von 6 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,03, 0,1 bzw. 0,3 mg/kg/Tag Epithelzellenwachstumsfaktor (EGF) intravenös verabreicht. Einen Tag nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere getötet, und ihre Oberschenkelknochen, Brustbeine und Rippen wurden in 10%igem Formalin fixiert, entcalcifiziert, in Paraffin eingebettet und längs geschnitten, so daß man 4 µm dicke Schnitte erhielt. Nach dem Anf ärben mit Hämatoxylin- Bosin (H-E) wurden diese Schnitte histopathologisch untersucht, um die Auswirkungen auf das Knochengewebe zu bewerten. Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei den behandelten Gruppen ein Ammoniumacetatpuffer (pH 6,8) verabreicht.
Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Vermehrung der Osteoblasten und die Knochenneubildung in den Oberschenkelknochen bei Dosen von 0,1 mg/kg oder mehr dosisabhängig war. Dieser Befund wurde bei den Oberschenkelknochen auf der Markhöhlenseite der Metaphyse und Diaphyse (siehe Figur 13 und 14) erhalten. Auf der periostealen Seite wurde keine Osteogenese gefunden.
Die Einzelheiten der Figuren 13 und 14 sind wie folgt:
Figur 13: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-E-Anfärbung, 85 x, keine anormalen Befunde.
Figur 14: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg EGF, H-E-Anfärbung, 85 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle, keine Osteogenese auf der periostealen Seite zu erkennen (Pfeil).
Nach dem in Bezugsbeispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde bei den Oberschenkelknochenschnitten der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, die Fläche des Rindenknochens (%) berechnet (Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben). Die Fläche des Rindenknochens (%) bei der Gruppe, die 0,3 mg/kg erhielt, war statistisch größer als bei der Gruppe, die Ammoniumacetatpuffer erhielt. Tabelle 6 Gruppe Zahl der Tiere Fläche des Rindenknochens (%) Ammoniumacetatpuffer
*: bedeutet, daß der Unterschied zwischen den Gruppen mit einem Signifikanzniveau von 1% statistisch signifikant ist (Mittelwert + Standardfehler).

Beispiel 6 Fördernde Wirkung von rhbFGF-Mutein CS23 auf die Bildung calcifizierter Knochenschwammsubstanz bei Ratten

Fünf männlichen Ratten (Jcl: Wistar) wurde beginnend bei einem Alter von 6 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,1 mg/kg/Tag rhbFGF-Mutein CS23 intravenös verabreicht. Fünf Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei der behandelten Gruppe ein Lösungsmittel zum Auflösen von rhbFGF-Mutein CS23 (50 mM Citratpuffer) verabreicht. Nach Ende der Verabreichungszeit wurden die Tiere durch Ausbluten getötet, und die Schienbeine wurden in 70%igem Ethanol fixiert. Ein proximaler Teil des Schienbeins wurde mit Hilfe eines Knochenschneiders abgeschnitten, mit Vilanueba Bone (VB) angefärbt, entwässert und dann in Methylmethacrylatharz eingebettet. Aus dem in Harz eingebetteten Schienbein wurden mit Hilfe eines Knochenmikrotoms 250 µm dünne Frontalschnitte herausgeschnitten und mit einem mechanischen Poliermittel auf eine Dicke von 70 µm poliert. Von diesen polierten Schnitten wurden mit Hilfe einer Radiographieapparatur mit weichen Röntgenstrahlen Kontaktmikroradiogramme (CMR) aufgenommen. Die Filme wurden mit D-19 entwickelt, gestoppt, fixiert und dann an der Luft getrocknet und in Kanadabalsam eingebettet, so daß man mikroskopische Präparate erhielt. Polierte Schnitte wurden weiter auf eine Dicke von 50 µm poliert und in Kanadabalsam eingebettet, so daß man mikroskopische Präparate erhielt.
Lichtmikroskopie zeigte bei den polierten Präparaten bei der Gruppe, die 0,1 mg/kg erhielt, eine partielle Hypertrophie der Wachstumsplatte im proximalen Teil des Schienbeins und eine ausgeprägte Vermehrung von Knochenschwammsubstanz im Mark von der Metaphyse bis zur Diaphyse (siehe Figur 15 und 16). Da die Untersuchung des CMR-Präparats die Gegenwart eines klaren Schattenbildes in beinahe der gesamten proliferierten Knochenschwammsubstanz zeigte, wurde die proliferierte Knochenschwammsubstanz als calcifizierter Knochen identifiziert (siehe Figur 17 und 18).
Die Einzelheiten der Figuren 15 bis 18 sind wie folgt:
Figur 15: Schienbein, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Männchen, Kontrollgruppe, VB-Anfärbung, 8,5 x, keine anormalen Befunde.
Figur 16: Schienbein, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Männchen, Gruppe mit 0,1 mg/kg rhbFGF-Mutein CS23, VB-Anfärbung, 8,5 x, zeigt ausgeprägte Vermehrung von Knochenschwammsubstanz im Mark der Metaphyse und Diaphyse und eine partielle Hypertrophie in der proximalen Wachstumsplatte.
Figur 17: Schienbein, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Männchen, Kontrollgruppe, CMR, 7,5 x, keine anormalen Befunde.
Figur 18: Schienbein, Jcl: Wistar-Ratte, 8 Wochen altes Männchen, Gruppe mit 0,1 mg/kg rhbFGF-Mutein CS23, CMR, 7,5 x, zeigt ausgeprägte Vermehrung von calcifizierter Knochenschwammsubstanz von der Metaphyse bis zur Diaphyse.

Beispiel 7 Osteogenese-fördernde Wirkung von rhbFGF-Mutein CS23 bei älteren Ratten

Vier weiblichen Ratten (Jcl: Wistar) wurde beginnend bei einem Alter von 71 Wochen 2 Wochen lang eine Dosis von 0,3 mg/kg/Tag das Mutein CS23 von rekombinantem humanem basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (rhbFGF) intravenös verabreicht. Einen Tag nach der letzten Verabreichung wurden die Tiere getötet, und die Oberschenkelknochen, Brustbeine, Schienbeine und Lendenwirbel wurden in 10%igem Formalin fixiert, entcalcifiziert, in Paraffin eingebettet und längs geschnitten, so daß man 4 µm dicke Schnitte erhielt. Nach dem Anfärben mit Hämatoxylin-Eosin (H-E) wurden diese Schnitte histopathologisch untersucht, um die Auswirkungen auf das Knochengewebe zu bewerten. Tieren in der Kontrollgruppe wurde in derselben Weise wie bei den behandelten Gruppen 50 TNM Citratpuffer (pH 7,0) verabreicht.
Als Ergebnis wurde in allen untersuchten Knochengeweben Vermehrung der Osteoblasten und Knochenneubildung gefunden. Dieser Befund wurde bei den Oberschenkelknochen (siehe Figur 19 und 20) und Schienbeinen auf der Markhöhlenseite der Metaphyse und Diaphyse und bei den Brustbeinen und Lendenwirbeln auf der Markhöhlenseite des Mittelteils erhalten. Auf der periostealen Seite trat keine Knochenbildung auf (Pfeil)
Die Einzelheiten der Figuren 19 und 20 sind wie folgt:
Figur 19: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 73 Wochen altes Weibchen, unbehandelte Kontrollgruppe, H-E-Anfärbung, 45 x, keine anormalen Befunde.
Figur 20: Oberschenkelknochen, Jcl: Wistar-Ratte, 73 Wochen altes Weibchen, Gruppe mit 0,3 mg/kg rhbFGF-Mutein CS23, H-E-Anfärbung, 45 x, zeigt Knochenneubildung in der Markhöhle. Auf der periostealen Seite ist keine Knochenbildung zu erkennen (Pfeil).
Die obigen Ergebnisse, daß das rhbFGF-Mutein CS23 das Potential besitzt, bei älteren Tieren die endosteale Knochenbildung zu stimulieren, zeigen, daß der Wachstumsfaktor das Potential besitzt, unabhängig vom Alter der Tiere die endosteale Knochenbildung zu stimulieren. Wegen dieser Eigenschaft eignet sich der Wachstumsfaktor für ein prophylaktisches/therapeutisches Medikament für Knochenschwundkrankheiten, da solche Krankheiten am häufigsten bei älteren Menschen auftreten.

Beispiel 8 Herstellung einer Injektion

Eine wäßrige Lösung (pH 7,4), die 0,5 mg rhbFGF-Mutein CS23, 10 mg Sucrose und 15 mg Natriumcitrat pro ml enthielt, wurde für eine stabile Injektion hergestellt.

Claims

1. Verwendung einer Zellwachstumsfaktorzusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments, um eine prophylaktische oder therapeutische Wirkung bei der Stimulierung der endostealen Knochenbildung bei Warmblütern zu erzielen.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die prophylaktische oder therapeutische Wirkung auf eine Knochenschwundkrankheit angewandt wird.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die prophylaktische oder therapeutische Wirkung auf Osteoporose angewandt wird.

4. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Zellwachstumsfaktor ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 25000 hat.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Zellwachstumsfaktor zu der Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) gehört.

6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die FGF-Familie ein Mutein von basischem Human-FGF umfaßt.

7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Mutein ein Polypeptid umfaßt, bei dem wenigstens ein Cysteinbestandteil von basischem Human-FGF durch Serin ersetzt ist.

8. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Zellwachstumsfaktor ein Epithelzellenwachstumsfaktor (EGF) oder ein Mutein davon ist.

9. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Zellwachstumsfaktor hst-1 oder ein Mutein davon, bei dem 1 bis 27 aufeinander folgende konstituierende Aminosäurereste von hst-1 fehlen, ist.

10. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei dem Tier gleichzeitig mit dem Zellwachstumsfaktor ein Calciummittel verabreicht wird.