DE69033703T2

DE69033703T2 - Nichtglykosyliertes fgf-4 und dieses enthaltende präparate

Info

Publication number: DE69033703T2
Application number: DE69033703T
Authority: DE
Inventors: Thomas Rogers; S. Seehra; M. Wolfman
Original assignee: New York University NYU
Current assignee: New York University NYU
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 2001-09-13
Anticipated expiration: 2010-11-16
Also published as: EP0835932A1; JPH05503090A; DE69033703D1; CA2068871C; ES2156107T3; DK0500773T3; GR3035682T3; CA2068871A1; ATE199167T1; WO1991007491A1; AU642947B2; EP0500773B1; AU6894291A; EP0500773A1; US5126323A; JP3020605B2; US5430019A

Description

Hintergrund

Wachstumsfaktoren vermitteln die Prozesse, durch die ein multizellulärer Organismus verschiedene Formen von Beschädigungen seiner Integrität repariert. Zu diesen Prozessen gehören Wundreparatur, zum Beispiel Hautschließung nach Schnitten oder Punkturen, und kompensatorisches Wachstum, zum Beispiel Wiederherstellen der Funktion von bestimmten Organen, um das ursprüngliche Funktionsausmaß und die Größe nach einer Beschädigung durch mechanische oder chemische Mittel wiederherzustellen. Die Faktoren sind für das Wachstum und die Differenzierung der Zellen notwendig, die das zerstörte oder beschädigte Gewebe ersetzen. Es wurden zahlreiche aktive Faktoren basierend auf der Fähigkeit von Gewebeextrakten, die die Faktoren enthalten, die Vermehrung und Differenzierung von bestimmten gezüchteten Zelllinien zu stimulieren, identifiziert.
Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) scheinen spezifisch in die Vermittlung von Wundreparaturprozessen involviert zu sein. Sie sind blutgefäßbildende, hormonartige Proteine, welche unter anderem die Vermehrung stimulieren und die Differenzierung von endothelialen Zellen auslösen oder verzögern, die die Blutgefäße des Organismus bilden. Vgl. Patt et al. Kidney International 23: 603-610 (1983). Für eine Übersicht zu Wachstumsfaktoren, die allgemein bei der Wundheilung eine Rolle spielen, vgl. ten Dijke, Biotechnology 7: 793-97 (August 1989).
Zwei Mitglieder der FGF-Familie, saurer und basischer FGF (aFGF und bFGF), wurden ursprünglich beschrieben und waren Gegenstand umfangreicher Forschung. Vgl. zum Beispiel Thomas, FASEB 434-40 (1987); Gospodarowicz et al. J. Cell. Phys. Supp. 5: 15-26 (1987) und die PCT-Publikation WO 87/01728, veröffentlicht am 26. März 1987. Vor kurzem wurden fünf zusätzliche mutmaßliche Mitglieder identifiziert: FGF-5, vgl. Zhan et al., Mol. and Cell. Biol. 8(8): 3487-95 (1988); FGF-6, vgl. Marics, Oncogene 4: 335-40 (1989); Int-2, vgl. Moore et al., EMBO J. 5(5): 919-24 (1989) und Dickson et al., Nature 326: 833 (1987); KGF, vgl. Finch et al., Science 245: 752-55 (1989) und FGF-4, vgl. Delli Bovi et al., Cell 50: 729-37 (1987) und Taira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2980-84 (1987). Früher war FGF-4 als K-FGF bekannt. Die Nomenklatur dieser Proteingruppe wurde revidiert, was in der Umbenennung von K-FGF in FGF-4 resultierte. Beide Bezeichnungen beziehen sich auf den gleichen Wachstumsfaktor.

Zusammenfassung der Erfindung

Besonders FGF-4 ist ein wünschenswerter therapeutischer Wirkstoff, nützlich bei der Förderung von Zellwachstum und Differenzierung, wie zum Beispiel bei der Bewirkung von beschleunigter Heilung von Wunden, verbranntem Gewebe oder anderer Beschädigung des Säugergewebes.
Die vollständige Sequenz für FGF-4, gewonnen aus einem Unkogen, welches aus Kaposisarkom-DNA isoliert wurde, ist bestimmt worden. Delli Bovi, Cell, a. a. O.. Für die Verwendung als therapeutischen Wirkstoff müssen jedoch homogene Präparate des Proteins angewandt werden. Diese Erfindung stellt solche Präparate bereit.
In einem Aspekt stellt diese Erfindung nicht-glycosylierten FGF-4 bereit, der die Aminosäuresequenz von Tabelle 1 oder die Aminosäuresequenz von Tabelle 1 mit der Deletion des ersten Aminosäurerests (Met) und/ oder der Deletion des zweiten Aminosäurerests (Ala*) hat. In einer bevorzugten Erscheinungsform ist der nichtglycosylierte FGF-4 dieser Erfindung außerdem dadurch charakterisiert, dass er ein Molekulargewicht von ungefähr 21 kD hat, wenn er durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) unter reduzierenden Bedingungen wie in Beispiel 3 und bei Abwesenheit von Oligosaccharideinheiten, die an das Polypeptid angeschlossen sind, analysiert wird. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung homogenen, nichtglycosylierten FGF-4 bereit, welcher die vorstehend beschriebene Aminosäuresequenz besitzt. Homogener, nicht-glycosylierter FGF-4 ist dadurch charakterisiert, dass er das gleiche Molekulargewicht und keine Oligosaccharideinheiten wie der nicht-glycosylierte FGF-4 besitzt und er ist zusätzlich dadurch charakterisiert, dass er sich unter den Bedienungen, die in Beispiel 4 dargestellt werden, als ein einzelner Peak bei der Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigchromatographie bewegt, oder dass er unter den Bedingungen von Beispiel 5 als eine Einzelbande bei der SDS-PAGE nach Coomassie-Blau-Färbung erscheint.
Die Erfindung stellt auch eine DNA-Sequenz bereit, die ein FGF-4-Polypeptid codiert, das die DNA-Sequenz aus Tabelle 1 oder die DNA-Sequenz aus Tabelle 1 mit der Deletion des Codons, das das erste reife Ala* von der 4-codierenden FGF-Region codiert, enthält.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Prozess zur Herstellung von nichtglycosyliertem FGF-4 bereit. Dieser Prozess schließt die Züchtung von geeigneten Bakterienzellen ein, die mit der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenz transformiert wurden. Die DNA-Sequenz, die in diesem Prozeß angewandt wird, ist auch in einer funktionellen Verbindung mit einer passenden Expressions-Kontrollsequenz. Der so hergestellte FGF-4 wird dann getrennt in homogener, reiner Form gewonnen.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung topische und injizierbare Arzneimittel zur Verwendung bei der Wundheilung bereit, die wirkungsvolle Mengen des homogenen FGF-4 dieser Erfindung in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel enthalten.
In noch einem weiteren Aspekt schließt die Erfindung Verwendungen des FGF-4 der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung von Arzneimitteln ein, die für die Behandlung von Knochen- oder Weichteilwunden geeignet sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Chromatogramm, das das Elutionsprofil des homogenen, nichtglycosylierten FGF-4-Proteins der vorliegenden Erfindung zeigt, welches mit der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie behandelt wurde, und die Absorption von Fraktionen bei 280 Nanometer versus Zeit veranschaulicht.
Fig. 2 ist ein SDS-PAGE-Gel-Profil des homogenen, nicht-glycosylierten FGF-4- Proteins der vorliegenden Erfindung, welches wie in Beispiel 3 behandelt wurde, wobei das Profil eine Einzelkomponente darstellt, die ein ungefähres apparentes Molekulargewicht von 21 kD hat.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung stellt ein nichtglycosyliertes und homogenes, nichtglycosyliertes FGF-4-Protein bereit, das die vorstehend beschriebene Aminosäuresequenz hat. Unter "homogen" verstehen wir frei oder im Wesentlichen frei von Substanzen, die normalerweise FGF-4 in seiner nativen Form begleiten (d. h. wie es in der Natur oder in rekombinanten Zelllinien vorkommt), besonders von anderen Säugerproteinen. Wir stellen fest, dass homogenes FGF-4 Protein, ob aus der Natur isoliert oder rekombinant hergestellt in Säuger- und Nichtsäugerzellen, unseres Wissens bisher noch nie in der Wissenschaftsliteratur erwähnt wurde.
Der nicht-glycosylierte FGF-4 ist charakterisiert durch die Abwesenheit von Oligosaccharideinheiten, die an eine Polypeptidkette oder an ein Teil des Moleküls gebunden sind, und durch ein Molekulargewicht von circa 21,000 Dalton durch SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, die in Beispiel 3 beschrieben werden. Zusätzlich zeigt homogener, nicht-glycosylierter FGF-4 unter den Bedingungen, die in Beispiel 4 beschrieben werden, eine Bewegung als einzelner Peak bei der Umkehrphasen- HPLC und erscheint als Einzelbande bei der SDS-PAGE nach Coomassie-Blau-Färbung unter den in Beispiel 5 beschriebenen Bedingungen. Homogener, nicht-glycosylierter FGF-4 erscheint auch als Einzelbande bei reduzierender SDS-PAGE und hat einen Endotoxingehalt von weniger als circa 0,125 Einheiten pro 500 Mikrogramm FGF-4, wie durch den Limulus Amebocyte Lysat-Test [Associates of Cape Cod, Inc.] getestet. Nichtglycosylierter und homogener, nicht-glycosylierter FGF-4 können auch dadurch charakterisiert werden, dass sie einen halbmaximalen ³H-Thymidin-Einbau im Bereich zwischen circa 0,1 und circa 1,0 Nanogramm pro Milliliter haben, stärker bevorzugt zwischen circa 0,4 und circa 0,6 Nanogramm pro Milliliter und am meisten bevorzugt bei circa 0,5 Nanogramm pro Milliliter, im ³H-Thymidin Aufnahmetest unter Verwendung von Balb C-3T3-Zellen haben. Homogener, nicht-glycosylierter FGF-4 kann FGF-4 enthalten, der den Alanin-N-Terminus oder den Prolin-N-Terminus aufweist (vgl. Beispiel 1). In beiden Fällen können das Gesamte oder ein Teil des bakteriell exprimierten, homogenen Produkts den Initiator-Methioninrest enthalten. Gegebenenfalls kann der Initiator-Methioninrest durch Expression des FGF-4 in einem Bakterienstamm entfernt werden, der die Methionin-Amino-Peptidase überexprimiert, welche das terminale Methionin effizient entfernt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von nichtglycosyliertem FGF-4 bereit. Das Verfahren schließt die Züchtung von bakteriellen Wirtszellen ein, die mit der oben beschriebenen DNA-Sequenz transformiert ist (d. h. diese enthält und exprimieren kann), welche unter der Expressionskontrolle von geeigneten transkriptionalen Kontrollsequenzen ist. Die DNA-Sequenz codiert die gleiche reife Peptidsequenz, oder die im Wesentlichen gleiche reife Peptidsequenz, die in Delli Bovi, Cell 50: 729-37 (1987), Yoshida, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7305- 09 (1987) und Taira, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2980-84 (1987) offenbart ist; sie ist so konstruiert, dass sie bevorzugte Codons für die Expression in Bakterienzellen, wie in Tabelle 1 gezeigt, umfasst. Das resultierende Expressionsprodukt von einer solchen gezielt konstruierten DNA-Sequenz kann eine vollständige, reife Peptidsequenz, wie in Tabelle 1 enthalten, und kann auch eine verkürzte, biologisch aktive, reife Peptidsequenz, die mit einem Serin an Position 24, gezählt vom N-terminalen Alanin, beginnt, enthalten.
Die DNA, die menschlichen FGF-4 codiert, kann gemäß der Methode von Delli Bovi, Cell 50: 729-37 (1987); Mol. and Cell. Biol. 8(7): 2933-41 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5660-64 (1987); oder Yoshida, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7305-09 (1987) und Taira, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2980-84 (1987) isoliert und geklont werden, indem geeigneteVektoren, selektierbare Marker und rekombinante DNA-Techniken genutzt werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Eine FGF-4-codierende cDNA kann durch solche Verfahren gewonnen werden. Alternativ kann eine FGF-4-codierende DNA-Sequenz synthetisch hergestellt werden - als Ganzes oder als Teil. Die Sequenz kann auch geeignet modifiziert werden, wie in Tabelle 1 gezeigt und in Beispiel 1 diskutiert.
Die FGF-4-codierende DNA-Sequenz kann durch konventionelle Verfahren in einen Expressionsvektor, passenden für die gewünschte Bakterienwirtszelle, eingeführt werden, wie im Fachgebiet wohl bekannt ist. Der Vektor sollte typische, im Fachgebiet wohl bekannte Vektorelemente, enthalten, die Replikationsstellen, selektierbare Marker und transkriptionale Kontrollsequenzen einschließen, die kompatibel mit dem gewählten Wirt sind. Verschiedene Stämme von E. coli, die als Wirtszellen für die Herstellung von homogenem FGF-4 brauchbar sind, sind wohlbekannt. Eine nicht erschöpfende Liste von solchen Stämmen umfasst MC1061, DH1, RR1, C600hf1, K803, JA221, HB101, JM101 und verschiedene K12 Stämme, einschließlich des Stammes, der in den Beispielen benutzt wird. Alternativ können andere Bakterienspezies benutzt werden. Andere geeignete Bakterien umfassen B. subtilis, verschiedene Stämme von Pseudomonas, andere Bazillen und ähnliches.
Der FGF-4 dieser Erfindung kann normalerweise ohne Rücksicht auf Rückfaltung intrazellular exprimiert werden, da das typischerweise unnötig ist, um das Protein in aktiver Form zu erhalten, oder er kann in aktiver Form von Bakterienzellen sekretiert werden, falls ein sekretorischer Leader einbehalten wird. Wo notwendig oder gewünscht bei beobachten einer verringerten Bioaktivität, kann das FGF-4-Produkt durch rein konventionelle Verfahren rückgefaltet werden.
Bei einem bevorzugten Versuchsansatz werden E. coli-Zellen, die genetisch konstruiert wurden, um, wie hier beschrieben, eine FGF-4-DNA-Sequenz zu exprimieren, unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, was die Herstellung und intrazellulare Akkumulation von FGF-4-Protein erlaubt. Die Zellen werden dann geerntet, d. h. von dem Medium, in welchem sie gezüchtet wurden, und von jeglichen anderen Materialien getrennt, und lysiert, und das gewünschte, biologisch aktive FGF-4-Protein wird aus dem Lysat gereinigt. Der Ausdruck "biologisch aktiv" bedeutet ein FGF-4-Päparat, das eine nachweisbare Menge an mitogener Aktivität bei Balb C-3T3-Zellen in einem ³H-Thymidin- Aufnahmetest zeigt. Verschiedene Reinigungstechniken, wie zum Beispiel Säulenchromatographie, Gelfiltration und Umkehrphasen-HPLC, können zumindest teilweise bei der Reinigung des gewünschten Proteins nützlich sein. Vgl, zum Beispiel, Gospodarowicz et al., J. Cell. Phys. 122: 323-32 (1985); Iwane et al. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 146: 470-77 (1987); Fox et al., J. Biol. Chem. 263: 18452-58 (1988), EP 0 259 953, veröffentlicht am 4. Juni 1987 und EP 0 237 966, veröffentlicht am 23. September 1987. Wir haben jedoch ein besonders effektives Reinigungsverfahren entwickelt, das nicht in einem gleichzeitigen signifikanten Verlust der biologischen Aktivität des Proteins resultiert.
Das bevorzugte Reinigungsverfahren beinhaltet, dass das Lysat, welches den FGF-4 enthält, mit einer wässrigen Lösung, welche eine Salzkonzentration größer als etwa 0,1 M, aber weniger als etwa 2 M hat, in Verbindung gebracht wird und FGF-4 solubilisieren kann. Jegliches nichtlösliches Material wird dann aus der sich daraus ergebenden Lösung entfernt, zum Beispiel durch Zentrifugieren oder Filtration, und die Salzkonzentration dieser Lösung wird reduziert, um die Präzipitation des FGF-4 zu erreichen, zum Beispiel durch Dialyse oder Diafiltration. Der präzipitierte FGF-4 wird dann getrennt von den noch gelösten Materialien gewonnen, zum Beispiel durch Zentrifugierung des Gemisches und durch Entfernung des Pellets vom Überstand oder jegliche andere konventionelle Trennungsverfahren, einschließlich Gelfiltration oder Ionenaustauschchromotographie. Der gewonnene FGF-4, der ungefähr 50% rein sein wird, kann weiter gereinigt werden durch Heparinsepharosen- Säulenchromotographie, Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromotographie oder verschiedene Kombinationen davon oder andere konventionelle Verfahren. Die bevorzugte Methode, die die Löslichkeitscharakteristika von FGF-4 nutzt, resultiert in effektiverer und weniger teurer Reinigung, da wiederholte Filtration oder chromatographische Schritte eliminiert werden können, und vermeidet die Reduzierung der biologischen Aktivität, die aus der Reinigung mit Umkehrphasen-HPLC resultieren kann.
Bei der Durchführung des bevorzugten Reinigungsverfahrens kann eine Vielzahl von neutralen Salzen angewandt werden. Zum Beispiel kann jedes der folgenden Salze genutzt werden: NaCl, Kcl, Na&sub2;SO&sub4;, K&sub2;SO&sub4;, Na&sub3;C&sub6;H&sub5;O&sub7;, NaC&sub2;H&sub3;O&sub2;, NH&sub2;SO&sub4;, MgCl&sub2;, wobei das Salz vorzugsweise bis zu einem pH-Wert von 7,5 titriert wird. NaCl und MgCl&sub2; sind bevorzugte Salze. Wenn NaCl benutzt wird, wird eine Salzkonzentration im Bereich von etwa 0,5 M bis etwa 2 M bevorzugt. Wenn MgCl&sub2; benutzt wird, wird eine Salzkonzentration im Bereich von etwa 0,1 M bis etwa 0,5 M bevorzugt, und eine Konzentration von etwa 0,2 M wird besonders bevorzugt.
Arzneimittel, die den nicht- glycosylierten oder den homogenen, nicht-glycosylierten FGF-4 der vorliegenden Erfindung enthalten, können als Wundheilungs- oder die Knochenbildung induzierende Wirkstoffe nützlich sein. Solche Arzneimittel können auch pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren und/oder andere Materialien, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, enthalten. Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" bezeichnet ein Material, das die Effektivität der biologischen Aktivität des (der) aktiven Bestandteils (Bestandteile) nicht stört und welches für den Wirt, dem es verabreicht wird, nicht toxisch ist. Die Charakteristika des Trägers oder anderen Materials wird vom Weg der Verabreichung abhängen.
Die Verabreichung kann auf verschiedenen konventionellen Wegen durchgeführt werden. Lokale Verabreichung an die Wunde oder die Verletzungsstelle wird bevorzugt. In diesem Falle wird das FGF-4 der vorliegenden Erfindung in Form einer pyrogen-freien, dermatologisch verträglichen Flüssigkeit oder einer halbfesten Formel vorliegen, wie zum Beispiel einer Salbe, Creme, Lotion, einem Schaum oder Gel. Die Herstellung von solchen lokal angewandten Formulierungen ist innerhalb des Könnens auf dem Fachgebiet.
Ein bevorzugtes Arzneimittel für die lokale Anwendung ist eine Gelformulierung. Solche Gelformulierungen sollten zusätzlich zu FGF-4 etwa 2 bis etwa 5% Gew./Gew. eines gelierenden Mittels enthalten. Das gelierende Mittel kann auch stabilisierend auf den aktiven FGF-4-Bestandteil wirken und sollte vorzugsweise wasserlöslich sein. Die Formulierung sollte auch etwa 2% Vol./Gew. eines bakteriziden Wirkstoffes und ein pufferndes Mittel enthalten.
Beispielhafte Gele umfassen Ethyl-, Methyl-, und Propylcellulosen. Bevorzugte Gele umfassen Carboxypolymethylen, wie zum Beispiel Carbopol (934P; B. F. Goodrich), Hydroxypropylmethylcellulosephthalate, wie zum Beispiel Methocel (K100M Premium; Merrill Dow), Cellulosegummis, wie zum Beispiel Blanose (7HF; Aqualon, U. K.), Xanthangummis, wie zum Beispiel Keltrol (TF; Kelko International), Hydroxyethylcellulose, wie zum Beispiel Cellosize (QP 100 MH; Union Carbide), Polyethylenoxide, wie zum Beispiel Polyox (WSR 303; Union Carbide), Propylenglykole, Polyethylenglykole und Gemische davon. Wenn Carbopol benutzt wird, wird auch ein neutralisierendes Mittel, wie zum Beispiel NaOH, benötigt, um den pH-Wert im gewünschten Bereich von etwa 7 bis etwa 8 und am meisten bevorzugt bei etwa 7,5 zu halten. Exemplarisch bevorzugte bakterizide Wirkstoffe umfassen Sterylalkohole, besonders Benzylalkohole. Das puffernde Mittel kann jedes Mittel sein, das im Fachgebiet zur Herstellung medizinischer Formulierungen bereits als nützlich bekannt ist, zum Beispiel 20 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5.
Kutane oder subkutane Injektion kann auch angewandt werden, und in diesem Fall wird der FGF-4 der vorliegenden Erfindung in Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung sein. Die Herstellung von solchen parenteral verträglichen Proteinlösungen, die pH-Wert, Isotonizität, Stabilität usw. gebührend berücksichtigen, ist innerhalb des Könnens auf dem Fachgebiet.
Die Menge an aktiven Bestandteilen wird von der Schwere des Zustandes, dem Anwendungsweg, der mitogenen Aktivität des FGF-4 abhängen und wird letztlich vom behandelnden Arzt entschieden werden. Es ist zu erwarten, dass die verschiedenen Arzneimittel etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 Milligramm pro Milliliter FGF-4 enthalten sollten. Für kleine Wunden sollten die Formulierungen, besonders die lokalen Formulierungen, FGF-4 im Bereich von etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 100 Mikrogramm pro Milliliter enthalten. Für größere oder chronische Wunden kann eine höhere Konzentration wünschenswert sein. Zum Beispiel wäre eine Konzentration im Bereich von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 1 Milligramm pro Milliliter angebracht. Für eine häufigere Dosierung kann ein Bereich von etwa 1-100 Mikrogramm pro Milliliter benutzt werden.
Die FGF-4-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können zur in vivo-Behandlung von Säugern durch Ärzte in einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen im Zusammenhang mit Wunden oder Knochen benutzt werden. Einige dieser Anwendungen umfassen thermische und chemische Verbrennungen, chirurgische Schnitte, dekubitale Geschwüre (Wundliegen), Diabetesgeschwüre, Geschwür aufgrund einer Venenstenose, chirurgische Abschürfungen infolge einer plastischen Operation oder Abschürfungen aus anderen Ursachen, Haut- oder Knochentransplantationen, Knochenbrüche, Ligament-, Knorpel- und Sehnenrisse und Entzündungen von Schleimbeuteln und Sehnen, obwohl erwartet wird, dass der FGF-4 der vorliegenden Erfindung als ein pharmakologischer Wirkstoff bei jeder Weichteilverletzung oder Muskel-Knochenskelett-Verletzung brauchbar sein würde. FGF-4 kann auch benutzt werden, um die Reparatur von beschädigtem zentralem und peripherem Nervengewebe zu unterstützen, und kann für diese Indikationen wahlweise in Kombination mit einem Nervenwachstumsfaktor benutzt werden. Insgesamt können die Methode und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Weichteilverletzungen, die durch epidermale Verletzungen oder Unterbrechungen oder durch Blutgefäßrisse charakterisiert sind, und zur Behandlung von Muskel-Knochenskelett- und Nervengewebserkrankungen und -Verletzungen angewandt werden.
In der Anwendung der Behandlungsmethode dieser Erfindung wird eine therapeutisch effektive Menge von FGF-4 einem Säuger mit einer solchen Verletzung oder Wunde gegeben. Der Ausdruck "therapeutisch effektive Menge" bezeichnet die Gesamtmenge jeder aktiven Komponente der Methode oder der Zusammensetzung, die ausreicht, um einen bedeutungsvollen Nutzen für den Patienten zu zeigen, d. h. Heilung eines chronischen Zustandes oder Anstieg in der Heilungsrate. Wenn auf einen einzelnen aktiven Bestandteil angewandt, der alleine gegeben wird, dann bezieht sich der Ausdruck ausschließlich auf diesen Bestandteil. Wenn auf eine Kombination angewandt, dann bezieht sich der Ausdruck auf die vereinten Mengen der aktiven Bestandteile, aus denen der therapeutischen Effekt resultiert, ob in Kombination, nacheinander oder simultan gegeben. Es wird erwartet, dass eine therapeutisch effektive Dosis von FGF-4 dieser Erfindung im Bereich von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 100 Milligramm pro Milliliter pro Anwendung liegt. Die Zahl der Anwendungen kann variieren, abhängig vom einzelnen Patienten und der Schwere der Verletzung. Für lokale Verletzungen können lokale Standardformulierungen angewendet werden.
Die FGF-4-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können allein oder in Kombination mit anderen Therapien gegeben werden. Zum Beispiel kann der FGF-4 wirkungsvoll mit einem koloniestimulierenden Faktor kombiniert werden, der als chemotaktischer Wirkstoff, der die Zellmigration in das verletzte Gebiet fördert und das Zeliwachstum stimuliert, fungieren wird. Ein bevorzugter koloniestimulierender Faktor ist M- CSF. Es wird erwartet, dass die Gabe von M-CSF dazu dienen wird, die Wunde oder die Verbrennungsstelle zu reinigen und die Klärung zu beschleunigen, was dem homogenen FGF- 4 erlaubt, die Heilung schneller zu fördern.
Verschiedene Formen oder Arten von M-CSF wurden durch Reinigung aus natürlichen Quellen oder durch rekombinante DNA-Techniken isoliert und hergestellt. Vgl. zum Beispiel Wong et al., Science 235: 1504-08 (1987); WO87/06954, EP 0 261 592, WO88/03173, EP 0 276 551, U. S. Seriennr. 4,847,201, EP 0 249 477, GB 2 016 777, WO89/03881, U. S. Seriennr. 4, 847,325, WO88/08003 und WO86/04587. Es wird erwartet, dass jeder M-CSF, einschließlich derer, aber nicht darauf beschränkt, die in den gerade zitierten Veröffentlichungen dargestellt werden, in der Methode dieser Erfindung angewandt werden kann, so lange dieser M-CSF seine charakteristische biologische Aktivität zeigt, nämlich die Fähigkeit, das Wachstum von Zellen hauptsächlich aus der Monocyten/Makrophagen-Linie im Standardknochenmarktest von Wong et al., Science 235 : 1504-08 (1987), zu fördern und von DNAs codiert wird, die zur Hybridisierung besonders unter stringenten Bedingungen mit DNAs für die natürlich auftretende Form fähig sind, wie in Fig. 2 von Wong, a. a. O., gezeigt. Selbstverständlich sind natürlich auftretende Isotypen oder allelische Variationen in den Proteinen oder in ihren codierenden Sequenzen, wie sie bei unterschiedlichen Mitgliedern der Arten auftreten, auch eingeschlossen.
Ein Arzneimittel, das eine Art von M-CSF als aktiven Bestandteil enthält, kann parenteral gegeben werden, zum Beispiel intravenös oder subkutan. Wenn parenteral verabreicht, kann das M-CSF-Mittel in Form einer nicht-pyrogenen, sterilen, parenteral verträglichen, wässrigen Lösung vorliegen. Die Herstellung solch einer Lösung liegt innerhalb des Könnens auf dem Fachgebiet.
Wenn es in Verbindung mit homogenem FGF-4 der vorliegenden Erfindung angewandt wird, kann das M-CSF-Arzneimittel mit dem FGF-4-Mittel verabreicht werden, vorzugsweise vorher oder simultan damit. In jedem Fall wird erwartet, dass eine therapeutisch effektive Dosis im Bereich von etwa 10-200 Mikrogramm M-CSF/kg/Tag, vorzugsweise in einem Bereich zwischen etwa 20-100 Mikrogramm/kg/Tag liegt.
FGF-4 kann auch effektiv mit einem die Knochenbildung induzierenden Faktor, wie zum Beispiel BMP, kombiniert werden, das als ein das Knochen- oder Knorpelwachstum vermittelnder Wirkstoff fungieren wird. Es wird erwartet, dass die Verabreichung von BMP in Kombination mit dem FGF-4 der vorliegenden Erfindung die Bildungsrate von Knorpel und Knochen additiv oder synergetisch vergrößern wird, und dabei die Genesung von Knorpel- und Knochenverletzungen, Gelenkersatzoperationen, plastischen Operationen, chronischen Knochenstörungen, periodontalen Krankheiten und ähnlichem beschleunigt.
Verschiedene Formen oder Arten von BMP wurden isoliert und hergestellt. Vgl. zum Beispiel WO 88/00205, veröffentlicht am 14. Januar 1988, und WO 89/10409 veröffentlicht am 2. November 1989. Es wird erwartet, dass jedes BMP, einschließlich derer, aber nicht darauf beschränkt, die in den eben zitierten Veröffentlichungen dargestellt werden, in der Methode dieser Erfindung angewandt werden kann, so lange das BMP seine charakteristische biologische Aktivität zeigt, nämlich die Fähigkeit, Knorpel-und/oder Knochenbildung im durch Rosen modifizierten Sampath-Reddi-Rattenknochenbildungstest zu induzieren, der in den vorangegangenen Veröffentlichungen beschrieben wird, vgl. auch Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6591-95 (1983), und durch DNAs codiert wird, die besonders unter stringenten Bedingungen fähig sind, mit darin offenbarten DNAs zu hybridisieren. Selbstverständlich sind auch natürlich vorkommende Isotypen oder allelische Variationen in den Proteinen oder in ihren codierenden Sequenzen, wie sie bei unterschiedlichen Mitgliedern der Arten auftreten, eingeschlossen. Ein bevorzugte Form ist BMP-2.
Ein Arzneimittel, das eine Art von BMP als aktiven Bestandteil enthält, kann lokal, systemisch oder lokal als Implantat oder als Vorrichtung verabreicht werden. Wenn es verabreicht wird, kann das BMP-Mittel in einer pyrogen-freien, physiologisch verträglichen Form sein und kann zur Freisetzung an die Stelle der Knochen- oder Knorpelbeschädigung eingekapselt oder in einer viskosen Form injiziert werden oder kann eine Matrix einschließen, die fähig ist, das BMP an der beschädigten Stelle freizusetzen, und die eine Oberfläche und eine Unterstützungsstruktur für die sich entwickelnden Knochen oder Knorpel bereitstellt. Solche Matrizen, die optimalerweise vom Körper resorbiert werden können, können aus Materialien geformt werden, die derzeit für andere medizinische Implantatsanwendungen benutzt werden und im Fachgebiet bekannt sind.
Wenn es in Kombination mit dem homogenen FGF-4 der vorliegenden Erfindung angewandt wird, kann das BMP-Arzneimittel entweder vor, nach oder simultan mit dem FGF- 4 gegeben werden. In jedem Fall wird erwartet, dass eine therapeutisch effektive Dosis im Bereich zwischen etwa 10 bis etwa 10&sup6; Nanogramm BMP pro Gramm gewünschtem Knochengewicht liegt.
Es wird auch erwartet, dass andere Mitglieder der FGF-Familie wirkungsvoll mit den vorangegangenen koloniestimulierenden Faktoren oder die Knochenbildung induzierenden Faktoren zur Behandlung der besprochenen Indikationen kombiniert werden können.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, mit der Absicht, die Erfindung zu veranschaulichen, ohne den Schutzbereich einzuschränken.

BEISPIEL 1: cDNA SUBCLONIERUNG UND E. COLI-EXPRESSION

Während eine Vielzahl von verschiedenen Vektortypen und Expressionssytemen benutzt werden kann, entwickelten und konstruierten wir den bakteriellen Expressionsvektor pAYLC/KSF(A)-781, welcher eine FGF-4-codierende intronlose cDNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle des pL-Promotors und eine cII-Ribosomenbindungsstelle enthält. Die eDNA-codierende Sequenz wurde so modifiziert, dass sie ein MET-Codon anstelle der nativen sekretorischen Leader-Sequenz enthält, und die nicht-codierende Sequenz am 3' Ende wurde verkürzt, wie in Tabelle 1 gezeigt. Zusätzlich wurden 32 der 33 ersten Codons der Sequenz modifiziert, um den G/C Gehalt zu reduzieren, von 76% in der nativen Sequenz auf 48% in der modifizierten Sequenz. Die einzelnen Nucleotidsubstitutionen werden insertiert in jedes Codon gezeigt; die ersetzten nativen Nucleotide werden über den Codons gezeigt. Tabelle 1
Ein zweiter Expressionsvektor, pAYLC/KSF (P) -781, wurde auch konstruiert. Dieser Vektor unterscheidet sich vom Ursprungsvektor durch die Deletion des ersten reifen Codons (Ala*) von der codierenden FGF-4-Region, was ein Prolincodon als erstes Codon nach dem Initiator- Methionincodon hinterlässt. Vgl. Tabelle 1.
Die benutzte bakterielle Wirtszelle war GI 595, ein gentechnisch hergestellter Stamm des E. coli Stamms W3110, welcher auf pAYLC/KSF (A)-781 oder pAYLC/KSF (P)-781 für ein Wachstum in einem nicht mit Thymin oder Thymidin angereicherten Medium angewiesen ist.
Expression von FGF-4 durch den Stamm GI 595 unter Benutzung des Vektors pAYLC/KSF (A) -781 wurde durch Zucht der Zellen in einem Medium ohne Thymin oder Thymidin bis zur mittleren Garithmusphase bei 30 Grad C erreicht. Bei dieser Temperatur unterdrückt der cI857 Lambda-Repressor effektiv die Transkription vom pL-Promotor. Die Kultur wurde dann auf 40 Grad C verlagert um die Transkription des FGF-4 Gens von pL zu induzieren. Dem nicht-glycosylierten FGF-4 Produkt wurde durch Aufrechterhaltung der Inkubation bei 40 Grad C vor der Ernte die Anhäufung erlaubt. Die Zellen wurden geerntet und bei -80 Grad C gelagert.
Die Expression von FGF-4 unter Benutzung von Vektor pAYLC/KSF(P) -781 kann auf die gleiche Weise erreicht werden.

BEISPIEL 2: REINIGUNG

100 Gramm des gefrorenen E. coli-Zellmaterials, geerntet und gelagert wie im obigen Beispiel 1, wurden mit 0,5 l Break-Puffer (6,0 g/l Tris, pH-Wert mit HCl auf 7,0 eingestellt, 1,9 g/l EDTA, 1,7 g/l PMSF, 1,0 g/l pABA (p-Aminobenzamidin) und 50 ml/l Glycerin) in einem im Handel erhältlichen 4 l Waring Mischgerät vereinigt. Das gefrorene Zellmaterial wurde für etwa 1 Minute unter höchster Energieeinstellung unter einer Stickstoffatmosphäre vermengt.
Die Zellsuspension wurde in einen Probenbehälter eines vorgekühlten (bei 4 Grad C für 12 Stunden) Modell 15 M-Gaulin-Laborhomogenisator überführt. Die Zellen wurden drei Durchgängen durch den Homogenisator unterworfen, der auf Druckunterschiede zwischen 8000 bis 9000 PSI eingestellt wurde. Das Aufbrechen der Zellen wurde visuell mit dem Phasen-Kontrastmikroskop bei 1000X überwacht. Lysiertes Zellmaterial wurde nach dem dritten Durchgang aus dem Homogenisator direkt in ein kryogenes 101-Dewar-Gefäß von Nalgene, das mit flüssigem Stickstoff gefüllt war, ausgestoßen.
150 Gramm dieses lysierten Zellmaterials wurden aus dem Dewar-Gefäß entnommen. Zu diesem Lysat wurden 50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, das 5 mM pABA, 5 mM EDTA und 1 mM PMSF enthielt, hinzugefügt, und das Gemisch wurde für eine Stunde bei 4 Grad C gerührt. Die Suspension wurde unter Verwendung einer 60 ml-Spritze durch eine 23-Gauge- Nadel gezwängt und bei 25000 · g für 50 Minuten bei 4 Grad C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt. Dem Pellet wurden 150 ml 50 mM Hepes, 1,0 M NaCl, pH-Wert 7,5, das 5 mM pABA, 5 mM EDTA und 1 mM PMSF enthielt, hinzugefügt. Dies wurde für 15 Stunden bei Grad C gerührt. Die Suspension wurde dann bei 25000 · g für 45 Minuten bei 4 Grad C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und bei 4 Grad C gegen ein 2,0 l- Volumen 50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, dialysiert. Das Dialysat wurde bei 10000 · g für 30 Minuten bei 4 Grad C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 200 ml 50 mM Hepes, 0,75 M NaCl, pH-Wert 7,5, unter Rühren für 6 Stunden bei 4 Grad C erneut gelöst und dann bei 25000 · g für 30 Minuten bei 4 Grad C zentrifugiert. Die daraus resultierende Überstandlösung wurde durch Zufügung von 400 ml von 50 mM Hepes, pH- Wert 7,5, verdünnt und mit 1,25 ml/Minute über eine Toyo-Pearl Q-Säule (7,5 · 2,5 cm), die vorher mit 50 mM Hepes, 0,25 M NaCl, pH-Wert 7,5, ins Gleichgewicht gebracht wurde, geleitet. Das Eluat, etwa 650 ml, wurde gesammelt, und die Konzentration von NaCl wurde durch Hinzufügen von festem NaCl auf 0,75 M erhöht. Die Lösung wurde bei 4 Grad C auf eine Heparin-Sepharose-Säule (10.0 · 1,5 cm) geladen und mit einem Gradienten von 0,75 bis 1,5 m NaCl in 50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, eluiert. Der FGF-4 eluierte bei etwa 1,1 M NaCl und wurde durch SDS-PAGE/Coomassie-Blau-Färbung und weitere Charakterisierungsstudien als homogen erkannt.
Es wird festgestellt, dass andere Materialien für die spezifischen Materialien, die in diesem Beispiel aufgeführt werden, substituiert werden können. Zum Beispiel kann jede ins Gleichgewicht gebrachte Säule aus stark anionischem Harz für die Toyo-Pearl Q-Säule substituiert werden und jede auf Heparin-basierende Affinitätssäule benutzt werden. Solche Substitutionen liegen innerhalb des Könnens auf dem Fachgebiets.

BEISPIEL 3: BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTS

Proteinproben, die in Beispiel 2 erhalten wurden, wurden unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ("SDS-PAGE"), wie bei Laemmeli, Nature 15 Bd. 22(259): 680-85 (1970) beschrieben, analysiert. Molekulargewichtsbestimmungen wurden wie folgt durch SDS-PAGE durchgeführt:
Aliquots, die 10 Mikrogramm Protein enthielten, wurden dem Probenpuffer, zusammengesetzt aus 125 mM Tris, pH-Wert 6,8, 4% Natriumdodecylsulfat, 20% Glycerin, 10% 2-Mercaptoethanol und 0,05% Bromphenolblau, hinzugefügt. Die Proben wurden für 3 Minuten gekocht und dann auf eine 12,5% Polyacrylamidgelplatte (0,75 mm) mit einem 4% Sammelgel aufgetragen. Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen wurde auf identische Weise durchgeführt, außer dass das 2-Mercaptoethanol im Puffer weggelassen wurde und die Proben nicht gekocht wurden. Ein Proteinstandardgemisch, das 10 Mikrogramm per Standard enthielt, wurde auch auf jedes Gel aufgetragen. Die SDS-PAGE ergab eine einzelne Komponente, die ein ungefähres, apparentes Molekulargewicht von 21 kD aufwies.

BEISPIEL 4: UMKEHRPHASEN-HPLC

Ungefähr 0,2 ml des gereinigten Materials aus Beispiel 2 wurde auf eine C-4 Vydac R-P- HPLC-Säule (25 · 0,45 cm) injiziert und durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung der Gradientenbedingungen, die in Tabelle 2 beschrieben werden, fraktioniert. Ein einzelner Proteinpeak, wie in der Figur gezeigt, wurde durch UV-Absorption bei 280 nm entdeckt. Die Identität von FGF-4 wurde durch sein Verhalten bei der SDS-PAGE und N-terminale Aminosäuresequenzierung bestätigt.

Tabelle 2

Pumpe A 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser
Pumpe B 95% Acetonitril in 0,1% TFA in Wasser
Gradienten Zeit (min) %B
Die Homogenität des Proteins wurde durch dieses Vorgehen bestätigt. Aber ein signifikanter Verlust an biologischer Aktivität wurde beobachtet. Für beste Ergebnisse kann daher das Protein wie in Beispiel 2 gereinigt werden.

BEISPIEL 5: COOMASSIE BLAU-FÄRBUNG

Die Gelplatte aus Beispiel 3 wurde wie folgt mit Coomassie-Blau gefärbt: ungefähr 250 ml von 0,05% Coomassie-Blau R-250 in 25% Isopropanol, 10% Essigsäure, wurden auf 60 Grad C erhitzt. Das Gel wurde für eine Stunde unter vorsichtigem Schaukeln in dieser Lösung eingeweicht. Das Gel wurde mit mehreren 250 ml-Aliquots aus 10% Isopropanol, 10% Essigsäure entfärbt, bis der Hintergrund klar war und keine blaue Farbe zeigte. Eine einzelne Bande ergab sich beim Entfärben.

BEISPIEL 6: ³H-THYMIDIN-AUFNAHME TEST

FGF-4, erhalten wie in Beispiel 2, wurde unter Verwendung eines ³H-Thymidinaufnahmetests auf seine mitogene Wirkung auf Balb C-3T3-Zellen getestet. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen bis fast zur Konfluenz in DME (Dulbeeco's Modifikation des Eagle's Mediums [Hazelton]), 1 mM Glutamin und 10% Kälberserum [Gibco] gezüchtet, mit PBS gewaschen und für 2-3 Tage in DME, 1mM Glutamin und 0,5% Kälberserum ausgehungert. FGF-4 wurde in einer Reihenverdünnung in dreifacher Ausführung zu den Vertiefungen hinzugefügt, und die Platten wurden für 20 Stunden inkubiert, bevor 1 Mikrocurie ³H- Thymidin pro Vertiefung hinzugefügt wurde. Nach weiteren 4 Stunden wurden die Zellen von den Platten durch Hinzufügen von Trypsin zu 1% gelöst. Die Zellen wurden unter Verwendung eines "Zellernters" Modell 1295-001 [LKB] auf einen Filter übertragen, mit Wasser und schließlich mit 70% Ethanol gewaschen. Die Menge an ³H-Thymidineinbau wurde in einem "Betaplate" Modell 1205-Szintillationszähler [LKB] gemessen, und die Ergebnisse wurden graphisth ausgewertet, um die Konzentration von FGF-4 zu bestimmen, die in 50% des maximalen Einbaus von ³H-Thymidin resultierte. Diese wurde mit etwa 0,5 Nanogramm FGF-4 pro ml in diesem Test bestimmt.

BEISPIEL 7: SOLUBILITÄT

Die Solubilität des nicht-glycosylierten FGF-4, welcher unter Verwendung des Salz- Präzipitationsverfahrens aus Beispiel 2 partiell bis auf etwa das Niveau von 50% gereinigt wurde, wurde mit der Solubilität des homogenen, nicht-glycosylierten FGF-4 aus jenem Beispiel, der unter Verwendung von Toyo-Pearl Q- und Heparin-Sepharose Säulenchromotographie zur Entfernung von Proteinunreinheiten und -pyrogenen noch weiter gereinigt wurde, verglichen. Es wurde festgestellt, dass die Solubilität des partiell gereinigten FGF-4 von der ionischen Stärke (zwischen 50 und 1000 mM NaCl) abhängt und unabhängig vom pH-Wert (zwischen pH 7,5 und pH 9,0) ist. Es gab keine bedeutende Verbesserung der Solubilität zwischen 0,5 und 1,5 M NaCl. Die beobachtete maximale Solubilität war etwa 1 mg/ml.
Das Solubilitätsverhalten des gereinigten, pyrogen-freien FGF-4, das wie in Beispiel 2 hergestellt wurde, unterschied sich sehr von dem des partiell gereinigten Proteins. Konzentrationen von 500-800 Mikrogramn/ml wurden für das gereinigte Protein bei Abwesenheit von jeglichem zusätzlichen Salz (50 mM Hepes, pH-Wert 7,5) beobachtet.

BEISPIEL 8: VERWENDUNG BEI DER WUNDHEILUNG

Der homogene FGF-4 aus Beispiel 2 wurde auf seine Verwendbarkeit als Wundheilungsmittel unter Verwendung des Schweinewundheilungsmodells von Winter, Epidermal Wound Healing S. 71-112 (Maibach, HI und Rovee, DT, Hrsg.) Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, wie von Eaglstein und Mertz modifiziert, J. Invest. Dermatol. 71: 382-84 (1978), untersucht. Fünf junge, weiße Yorkshireschweine, jedes 20-30 Pfund schwer und ungefähr zwei bis drei Monate alt, wurden benutzt. Die Haare auf dem Rücken und an den Seiten eines jeden Tieres wurden mit Standard-Tierscheren geschnitten, und die exponierte Haut wurde gewaschen und mit milder Seife und Wasser gespült. Die Schweine wurden mit Ketamin (300 mg i. m.) und Halothan (3%, offene Maske) betäubt. 200 rechteckige 7 · 10 mm-Wunden, 0,3 mm tief, wurden paravertebral in Brust- und Lendenbereich eines jeden Tieres mit einem Castro-Viejo-Dermatom gemacht. Die Wunden eines jeden Tieres wurden in fünf Behandlungsstellen aufgeteilt (vierzig Wunden pro Behandlungsstelle), und jede Behandlungsstelle an jedem Tier wurde wie folgt am Tag 0 behandelt:
C Luft exponierte Kontrolle, keine Behandlung
T1 mit 10 Mikrogramm FGF-4/20 Mikroliter wässeriges Vehikel/Wunde
T2 mit 1 Mikrogramm FGF-4/20 Mikroliter wässeriges Vehikel/Wu
T3 mit 0,1 Mikrogramm K-FGS/20 Mikroliter wässeriges Vehikel/Wunde
V nur mit wässerigem Vehikel, zusammengesetzt aus 50 mM Hepes, pH-Wert 7,5, und
125 mM NaCl, 20 Mikroliter/Wunde
Um eine einheitliche Verteilung zu sichern, wurden die vorgenannten Behandlungen bei jedem Tier an einer anderen Behandlungsstelle angewandt.
Die wässerigen Behandlungen wurden lokal angewandt und für 30 Minuten ungestört gelassen, um eine vollständige Absorption in das Wundbett zu erlauben. Täglich von Tag 3 bis 7 wurden von fünf Wunden wahllos ausgesuchte Wundproben von jeder Behandlungsstelle bei jedem Tier durch Ausschneiden mit einem Castro-Viejo-Dermatom (22 · 33 mm tief, einschließlich des gesamten Wundbetts und etwas unbehandeltem Umgebungsgewebe) entnommen. Die Proben wurden in Übereinstimmung mit der Methode von Mertz et al., Swine in Biomedical Research S. 291-302 (Tumbleson, ME, Hrsg.) Plenum Press, New York, untersucht. Der homogene FGF-4 aus dieser Erfindung bewirkte einen Anstieg der relativen Heilungsrate zwischen etwa 10 und etwa 20% im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein FGF-4 Polypeptid codiert und die DNA-Sequenz der Tabelle 1 oder die DNA-Sequenz der Tabelle 1 mit der Deletion des Codons, das das erste reife Ala* von der FGF-4 codierenden Region codiert, enthält.

2. Rekombinanter Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 umfaßt.

3. Rekombinante Wirtszeile, die den Vektor nach Anspruch 2 enthält.

4. Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 3, die E. coli ist.

5. Nicht-glycosyliertes FGF-4 Polypeptid, das durch die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

6. Nicht-glycosyliertes FGF-4 Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 oder die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 mit der Deletion des ersten Aminosäurerests (Met) und/oder der Deletion des zweiten Aminosäurerests (Ala*) besitzt.

7. Verfahren zur Herstellung des FGF-4 Polypeptids nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Verfahren die Züchtung der Wirtszelle nach Anspruch 3 oder 4 und die Isolierung des Polypeptids aus der Kultur umfaßt.

8. Rekombinantes FGF-4 Polypeptid, hergestellt gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7.

9. Arzneimittel, das das EGF-4-Polypeptid nach Anspruch 5, 6 oder 8 in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel umfaßt.

10. Arzneimittel nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Wundheilung oder zur Förderung der Blutgefäßbildung.

11. Topisches Präparat zur Behandlung von Weichteilverietzungen, das das FGF- 4 Polypeptid nach Anspruch 5, 6 oder 8 in einem dermatologisch verträglichen, topischen Vehikel umfaßt.

12. Injizierbares Präparat zur Behandlung von Weichteilverletzungen oder Störungen, die das Knochenskelett oder dis Muskulatur betreffen, das das FGF-4 Polypeptid nach Anspruch 5, 6 oder 8 in einem pyrogenfreien, parenteral verträglichen Vehikel umfaßt.

13. Verwendung des FGF-4 Polypeptids nach Anspruch 5, 6 oder 8 zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung von Weichteilverietzungen oder Störungen, die das Knochenskelett oder die Muskulatur betreffen, geeignet ist, zur Verwendung bei der Wundheilung oder zur Förderung der Blutgefäßbildung.

14. Verwendung einer DNA-Sequenz, die ein FGF-4 Polypeptid codiert und die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 oder die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 mit der Deletion des ersten Aminosäurerests (Met) und/oder der Deletion des zweiten Aminosäurerests (Ala*) enthält, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Weichteilverletzungen oder Störungen, die das Knochenskelett oder die Muskulatur betreffen, oder zur Verwendung bei der Wundheilung oder zur Förderung der Blutgefäßbildung.

15. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Wundheilung.

16. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Blutgefäßbildung.

17. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein FGF-4 Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 oder die Aminosäuresequenz der Tabelle 1 mit der Deletion des ersten Aminosäurerests (Met) und/oder der Deletion des zweiten Aminosäurerests (Ala*) enthält.

18. Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors nach Anspruch 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Weichteilverletzungen oder Störungen, die das Knochenskelett oder die Muskulatur betreffen, oder zur Verwendung bei der Wundheilung oder zur Förderung der Blutgefäßbildung.

19. Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors nach Anspruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Wundheilung.

20. Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors nach Anpruch 18 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Förderung der Blutgefäßbildung.

21. Verfahren zur Herstellung des Arzneimittels oder Präparats nach einem der Ansprüche 9, 10, 11 oder 12, das die Kombination des FGF-4 Polypeptids mit dem geeigneten Vehikel umfaßt.

22. Verfahren zur Herstellung der DNA-Sequenz nach Anspruch 1, umfassend die Verwendung von geeigneten Vektoren, selektierbaren Markern und rekombinanter DNA-Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, oder die synthetische Herstellung und, gegebenenfalls, die Modifizierung in geeigneter Weise.