DE69104624T2

DE69104624T2 - Natamycingewinnung.

Info

Publication number: DE69104624T2
Application number: DE69104624T
Authority: DE
Inventors: James R. Kohler Wi 53044 Millis; Phillip Terry Manitowoc Wi 54220 Olson; Michael Henry Sheboygan Wi 53081 Reimer
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Danisco Cultor America Inc
Priority date: 1990-12-07
Filing date: 1991-12-05
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2011-12-06
Also published as: BR9107207A; JPH06504908A; CA2097840A1; WO1992010580A1; JP2908562B2; AU9157091A; CA2097840C; EP0563269B1; EP0563269A1; DE69104624D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Natamycin aus einer Fermentationslösung, die Natamycin enthält, indem Methanol zugegeben wird und der PH-Wert auf 1,0 bis 4,5 eingestellt wird, um das ausgefällte Natamycin aufzulösen, und indem die verbleibenden suspendierten Feststoffe entfernt werden und der PH-Wert auf 6,0 bis 9,0 angehoben wird, um hochrreines Natamycin auszufällen.
Natamycin ist ein Antibiotikum, das seit Jahrzehnten bekannt ist (Florey, "Analytical Profiles of Drug Substances", Bd. 10, 1981; Merck Index, "Pimaricin", S. 834). Trotz seiner anerkannten wertvollen antibiotischen Eigenschaften wurde bisher mit Natamycin aufgrund der extrem hohen Kosten seiner Herstellung wenig Forschung oder kommerzielle Vermarktung angestellt. Die Erfindung betrifft ein preiswertes schnelles Verfahren zur Gewinnung von Natamycin aus einer Fermentationslösung.
Wie bei Florey dargelegt, besitzt Natamycin eine gut definierte spezifische chemische Struktur, einen Schmelzpunkt und ein UV-Spektrum. Seine speziellen physikochemischen Eigenschaften, insbesondere seine Löslichkeit in verschiedenen Flüssigkeiten, erfordern für diese Verbindung spezielle Bearbeitungstechniken. Bisherige Verfahren für Natamycin waren im allgemeinen aus wirtschaftlicher Sicht nicht akzeptabel. Verfahren zur Gewinnung anderer Verbindungen mit unterschiedlichen Eigenschaften ergeben wenig Einblick in die Gewinnung von Natamycin.
Natamycin wurde bisher durch Fermentation hergestellt, wie beschrieben in der britischen Patentschrift 846 933 (American Cyanamid) unter Verwendung von Streptomyces gilvosporeus. Gemäß dieser patentschrift wird Natamycin durch Methanolextraktion gewonnen, worauf sich zeitaufwendige Stufen der Adsorption und Elution anschließen.
Die U.S.-Patentschrift 3 378 441 (Penick) beschreibt die Gewinnung von Natamycin durch Aussalzen aus der Fermentationslösung, Extraktion mit Methanol, Entfernen der Feststoffe und anschließend Eindampfen der Flüssigkeit zur Gewinnung des Natamycin.
Die U.S.-Patentschrift 3 892 850 (Gist-Brocades) beschreibt die Gewinnung von pimaricin durch Extraktion mit angesäuertem Butanol und anschließende Destillation und Ausfällung. Zu bemerken ist, daß die Identifizierung von Pimaricin in dieser Patentschrift nicht mit der von Natamycin, wie sie von Florey beschrieben wird, übereinstimmt.
Alle diese Verfahren erfordern eine teure letzte Gewinnungsstufe, wie Absorption und Elution, Destillation oder Eindampfen der Flüssigkeiten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde gefunden, daß hochreines Natamycin aus einer natamycinhaltigen Fermentationslösung durch einfache Extraktion mit einer methanolischen Extraktionsflüssigkeit unter kontrollierten pH-Wertbedingungen gewonnen werden kann. Das Verfahren umf aßt die folgenden Stufen:
1. Zugabe von Methanol zu einem Natamycin-Fermentationsprodukt, das ausgefälltes Natamycin enthält, wobei das Fermentationsprodukt plus Extraktionsflüssigkeit wenigstens 2 g/l Natamycin enthalten,
2. Einstellen des pH-Wertes auf 1,0 bis 4,5, um Natamycin in Lösung zu bringen,
3. Entfernung der verbleibenden suspendierten Feststoffe und
4. Anheben des pH-Wertes auf 6,0 bis 9,0, um Natamycin auszufällen.
Nach Stufe 4 wird Natamycin normalerweise mechanisch aus der Flüssigkeit entfernt, wie durch Filtration oder Zentrifugation, anschließend mit Wasser gewaschen und getrocknet, wobei sich Natamycin mit einer Reinheit von über 80 % und im allgemeinen von über 90 % ergibt.
In den Stufen 2 und 4 wird zur Annäherung an stabile Löslichkeitsbedingungen genügend Zeit zur Verfügung gestellt, wobei im allgemeinen, je nach Volumen der Lösung, Konzentration der Feststoffe, Gefäßanordnung und dergleichen, 15-45 Minuten ausreichen. Rühren kann hilfreich sein.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Die Figur ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das erfindungsgemäße Verfahren erfordert, daß Fermentationsprodukt plus Extraktionsflüssigkeit wenigstens 2 g/l Natamycin enthalten. Enthält die direkte Fermentationslösung zu wenig Natamycin, so muß Wasser entfernt werden. Da das Fermentationsprodukt im wesentlichen aus Wasser und Natamycin plus festen Biomassen besteht, kann Wasser durch irgendein zweckmäßiges Fest-Flüssig-Trennverfahren, wie Abfiltrieren und/oder Abzentrifugieren von Wasser, entfernt werden. Konzentrationen von bis zu 50 % Feststoffen sind auf diesem Weg erreichbar. Wird ein höherer Gehalt an Feststoffen in dem Substratstrom zur Gewinnung gewünscht, um das erforderliche Methanol so gering wie möglich zu halten, kann eine wärmeunterstützte Vakuumverdampfung eingesetzt werden. Typischerweise wird eine Temperatur im Bereich von 30 ºC bis 80 ºC angewendet. Eine längere Anwendung von Temperaturen oberhalb von 95 ºC sollte vermieden werden, um eine mögliche Zersetzung von Produkt oder Biomasse zu vermeiden.
Das Fermentationsprodukt, das als Substratvorrat bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, umfaßt festes suspendiertes Natamycin, Biomasse und Wasser. Der Gehalt an Feststof fen kann so niedrig wie 20 % oder niedriger sein, beispielsweise wenn kein Wasser aus der Fermentationslösung entfernt wird. Muß Wasser entfernt werden, um ein Fermentationsprodukt plus Extraktionsmittel zu erhalten, die wenigstens 2 g/l Natamycin enthalten, braucht nur ein Minimum an Wasser entfernt zu werden. Alternativ kann es je nach Apparaturverfügbarkeit insbesondere zur Wiedergewinnung von Methanol wünschenswert sein, im wesentlichen das gesamte Wasser vor der Zugabe des Methanol-Extraktionsmittels zu entfernen.
Für eine optimale Natamycingewinnung kann die Konzentration von Natamycin so niedrig wie 2 g/l Natamycin sein. Jedoch sind höhere Konzentrationen an Natamycin aufgrund seiner höheren Löslichkeit in Methanol, das niedrigere Mengen Wasser enthält, wünschenswert, wenn der Wassergehalt des Substratstroms verringert wird. Somit beträgt der Natamycingehalt vorzugsweise wenigstens 6 g/l, wo der Gehalt an Feststoffen des Substratstroms über etwa 50 % liegt.
Die Figur zeigt schematisch das erfindungsgemäße, im folgenden beschriebene Verfahren.
In Stufe 1 wird Methanol als Extraktionsmedium verwendet, da Natamycin in diesem preiswerten Lösungsmittel im Vergleich zu höheren Alkoholen eine ausgezeichnete Löslichkeit besitzt und da einfache Techniken zur Wiedergewinnung von Methanol gut bekannt sind. Um eine optimale Natamycingewinnung zu gewährleisten, wird Methanol im Bereich von 20 bis etwa 150 g Natamycin pro Liter Methanol im Substratstrom verwendet. Da Natamycin dazu neigt, aus dem angesäuerten Methanol/Wasserextraktionsmedium bei hohen Konzentrationen auszufallen, wird eine niedrigere Konzentration im Bereich von 20 g bis 120 g Natamycin pro Liter Methanol bevorzugt. Wiederum werden aufgrund der verringerten Löslichkeit von Natamycin, wenn der Wassergehalt der methanolischen Extraktionsflüssigkeit zunimmt, größere Mengen an Methanol benötigt, um dieselbe Gewinnung zu erzielen. Wenn beispielseise das Substrat 70 % Wasser enthält, ist etwa dreimal so viel Methanol erforderlich als wenn von einem im wesentlichen trockenen Substratstrom ausgegangen wird. Wenn das Substrat 40 % Wasser enthält, wird zweimal so viel Methanol benötigt.
In Stufe 2 wird der pH-Wert durch Zugabe eines Mittels zum Ansäuern in irgendeinem Stadium auf 1,0-4,5 eingestellt, wie beispielsweise direkt zu dem Methanol oder gleichzeitig mit oder nach der Methanolzugabe direkt zu dem Fermentationsprodukt. Dies macht Natamycin in dem methanolischen Lösungsmittel hochlöslich. Chlorwasserstoffsäure ist ein ausgezeichnetes Mittel zum Ansäuern, obwohl jedes herkömmliche kompatible saure Material annehmbar ist.
Unter bestimmten Umständen kann es wünschenswert sein, auch ein anorganisches Salz hinzuzugeben, um die Löslichkeit zu fördern, obwohl dies normalerweise nicht erforderlich ist. Typische Salze, die verwendet werden können, sind NaCl, CaCl&sub2; und weitere, wie sie bei Penick, U.S.-Patentschrift 3 378 441 beschrieben werden.
In Stufe 3 werden die verbleibenden suspendierten Feststoffe der Biomasse durch irgendein zweckmäßiges Mittel, wie Filtrieren oder Zentrifugieren, entfernt. Diese Feststoffe, die noch eine deutliche Menge Natamycin enthalten, können weiteren wertvollen Verwendungen zugeführt werden.
In Stufe 4 kann irgendein kompatibles basisches Material verwendet werden, um den pH-Wert der Flüssigkeit aus Methanol/Wasser/Natamycin auf 6,0-9,0 anzuheben. Diese Änderung des pH-Wertes führt zum Ausfallen von hochreinem Natamycin, das entfernt und getrocknet wird. Typische geeignete preiswerte kompatible basische Materialien sind Natrium- und Kaliumhydroxid. Falls gewünscht, kann in Stufe 4 auch Wasser zugegeben werden, um die Natamycinausfällung zu fördern. Dies kann notwendig sein, wenn die Konzentration an Wasser im Substratstrom niedrig und die Natamycinkonzentration hoch ist. Das verbleibende flüssige Nebenprodukt, das wertvolles Natamycin, Fermentationsrückstände, Methanol, anorganische Salze und Wasser enthält, wird der Rückgewinnung von Methanol zugeführt. Natamycin von etwa 80%iger Reinheit kann durch das Verfahren der Methanolrückgewinnung gewonnen werden.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von im wesentlichen wasserfreiem Fermentationsprodukt als Substratvorrat für das erfindungsgemäße Verfahren.
Die Fermentationslösung wird auf 98 % Feststoffe (einschließlich einer kleinen Menge von Nährstoffrückständen) durch Zentrifugieren und anschließendes Trocknen bei 40 ºC unter Vakuum konzentriert. Feststoffe, die etwa 13 g Natamycin enthalten, werden in 240ml Methanol aufgeschlämmt, und der pH-Wert wird durch Zugabe von konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf 3,8 verringert. Die Aufschlämmung wird 30 Minuten lang gemischt, um die Auflösung von Natamycin zu fördern. Die suspendierten Feststoffe (Biomasse und etwas Natamycin) werden durch Filtrieren entfernt.
Die geklärte Flüssigkeit, die im wesentlichen aus 61 g/l Natamycin, Methanol und einer kleinen Menge Wasser besteht, wird durch Zugabe von Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht und 30 Minuten stehengelassen. Es bildet sich ein dicker farbloser Niederschlag von Natamycin. Die Feststoffe werden durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und bei 40 ºC unter Vakuum getrocknet.
9,3 g der Feststoffe werden erhalten, was einer 93%igen Reinheit von Natamycin (auf wasserfreier Basis) entspricht.

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel beschreibt die Anwendung einer Fermentationsprodukt-Konzentrierung ausschließlich durch Filtrieren.
Die Fermentationslösung wird durch Filtration auf 50 % Feststoffe konzentriert. Dieser Substratvorrat, der etwa 13 g Natamycin enthält, wird in 500 ml Methanol aufgeschlämmt.
Danach wird das Verfahren von Beispiel 1 befolgt, außer daß Essigsäure und NaOH als saure und basische Zusatzstoffe zur pH-Einstellung verwendet werden.
Etwa 9,5 g Natamycin von einer Reinheit von über 90 % werden erhalten.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung eines Ausgangsvorrates an Substrat eines Fermentationsprodukts mit einem geringen Gehalt an Feststoffen.
Die Fermentationslösung wird durch einfache mechanische Filtration auf 23 % Feststoffe konzentriert. Dieses Fermentationsprodukt, das etwa 2,9 g Natamycin enthält, wird mit 40 ml Methanol aufgeschlämmt und der pH-Wert durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf 2,2 verringert. Die Aufschlämmung wird 30 Minuten lang gerührt, und sodann werden die Feststoffe durch Zentrifugieren und anschließendes Filtrieren entfernt.
Der pH-Wert der geklärten Flüssigkeit, die 38 g/l Natamycin enthält, wird durch Zugabe von Kaliumhydroxid auf 7,5 angehoben, und sie wird 30 Minuten lang stehengelassen. Es bildet sich ein dicker farbloser Niederschlag. Die Feststoffe werden durch Filtrieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das trockene Produkt ist 92 % reines Natamycin.
3,6 g/l Natamycin verbleibt in der Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeit der Rückgewinnung von Methanol zugeführt wird, wobei Natamycin von 80%iger Reinheit gewonnen wird.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Natamycin aus einem Produkt eines Fermentationsmediuins, das wenigstens 2 g/l Natamycin enthält, umfassend die folgenden Stufen:

a. Zugeben von Methanol zu dem genannten Produkt des Nährmediums,

b. Einstellen des pH-Wertes auf 1,0 bis 4,5, um Natamycin in Lösung zu bringen,

c. Entfernen der suspendierten Feststoffe und

d. Erhöhen des pH-Wertes auf 6,0 bis 9,0, um Natamycin auszufällen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das ausgefällte Natamycin gewonnen und getrocknet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Produkt des Fermentationsmediums 20 bis 98 % Feststoffe enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Produkt des Fermentationsmediums wenigstens 50 % Feststoffe enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Methanol in einer Menge von 1 l Methanol auf 20 g bis 150 g Natamycin in dem Produkt des Fermentationsmediums hinzugegeben wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Methanol in einer Menge von 1 l Methanol auf 20 g bis 120g Natamycin in dem Produkt des Fermentationsmediums hinzugegeben wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Wasser in Stufe 4 zugegeben wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Produkt aus dem Fermentationsmedium durch Entfernen des Wassers aus dem direkten Fermentationsmedium hergestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die genannte Entfernung des Wassers mechanisch erfolgt.