DE69837393T2

DE69837393T2 - Stimulierung von hämatopoietischen zellen im vitro

Info

Publication number: DE69837393T2
Application number: DE69837393T
Authority: DE
Inventors: William Melrose BACHOVCHIN; Barbara Cohasset WALLNER
Original assignee: Point Therapeutics Inc
Current assignee: Point Therapeutics Inc
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2018-09-30
Also published as: AU9588798A; AU743996B2; EP1019494A1; ES2285785T3; WO1999016864A1; CN1272136A; EP1019494B1; CA2304206A1; BR9813233A; NO20001583L; US20040152192A1; DE69837393D1; IL135068A0; KR20010030775A; KR100458403B1; JP2006081554A; ATE357509T1; US7276371B2; US6703238B2; JP4102403B2

Description

Diese Anmeldung beansprucht gemäß Titel 35 des United States Code §119(e) die Priorität der vorlaufiger US Anmeldung Nr. 60/060,306, die am 29. September 1997 eingereicht wurde und den Titel STIMULATION OF HEMATOPOIETIC CELLS IN VITRO trägt, und deren gesamter Inhalt durch Bezugnahme in dieses Dokument aufgenommen ist.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Agenzien, die an die Dipeptidylpeptidase des Typs IV (DPIV, auch bekannt als CD26) binden, zur in vitro-Stimulierung von hämatopoetischen Zellen.
Knochenmarktransplantationen werden häufig bei Patienten angewandt, die sich einer hochdosierten Chemotherapie oder Strahlentherapie unterziehen. Die Dosis-begrenzenden Nebenwirkungen einer Chemotherapie und einer Strahlentherapie sind ihre durch die Zerstörung der Knochenmarkzellen, die die Vorläuferzellen aller hämatopoetischen Zellen sind, bedingten schädlichen Wirkungen auf hämatopoetische Zellen. Diese Schädigung des Marks führt zur Knochenmarksuppression oder Myeloablation und macht Patienten über einen verlängerten Zeitraum anfällig für opportunistische Infektionen. Zu einer Knochenmarktransplantation gehört die Infusion von frühen Knochenmarkprogenitorzellen, die die Fähigkeit besitzen, das hämatopoetische System der Patienten, einschließlich des Immunsystems, wiederaufzubauen. Die Transplantation verkürzt die Zeit, die normalerweise für die Wiederherstellung des Immunsystems nach der Chemotherapie oder Strahlentherapie benötigt wird und in der ein Risiko besteht, an opportunistischen Infektionen zu erkranken.
Knochenmarkzellen enthalten totipotente Stammzellen, die hämatopoetische Zellen aller Linien entstehen lassen, die lymphoide, myeloide und erythroide Linien umfassen. Stammzellen haben gleichermaßen die Fähigkeit, sich selbst zu erneuern und zu Progenitorzellen aller hämatopoetischen Linien zu differenzieren. Progenitorzellen behalten die Fähigkeit, zu proliferieren und differenzierte Zellen aller Linien entstehen zu lassen. Differenzierte Zellen verlieren die Fähigkeit, zu proliferieren und zeigen morphologische Kennzeichen, die für ihre jeweiligen Linien (wie beispielsweise Makrophagen, Granulozyten, Blutplättchen, rote Blutzellen, T-Zellen und B-Zellen) spezifisch sind. Stammzellen und Progenitorzellen exprimieren CD34 auf ihrer Oberfläche, während differenzierte Zellen dies nicht tun. Knochenmarkzellen umfassen gleichermaßen Stammzellen und Progenitorzellen der lymphoiden (T- und B-Zellen), myeloiden (Granulozyten, Makrophagen) und erythroiden (rote Blutzellen) Linien.
Zur Verwendung bei Knochenmarktransplantaten können hämatopoetische Vorläuferzellen entweder von dem Krebspatienten (autologes Transplantat) oder von einem gewebeverträglichen Spender (allogener Spender) stammen. Diese Zellen können aus dem Knochenmark, dem peripherem Blut oder aus Nabelschnurblut isoliert werden. In jedem Fall werden die Zellen vor der Chemotherapie oder Strahlentherapie geerntet. Die Zahl der Progenitorzellen, die auf einmal geerntet werden können, ist gering und in vielen Fällen nicht ausreichend für ein erfolgreiches Transplantat. Dementsprechend wurden mehrere Verfahren entwickelt, um aus Blutapheresen oder aus Nabelschnurblut erhaltene Knochenmarkzellen oder Progenitorzellen in vitro zu expandieren.
Die Fähigkeit, diese Zellen zu expandieren, hat zur Fortentwicklung der Knochenmarktransplantationstechnologie als praktikable Zusatztherapie bei Krebsbehandlungen beigetragen, zu denen hochdosierte Chemotherapien und/oder Bestrahlungen gehören. Die vorhandenen Verfahren zur Expansion hämatopoetischer Zellen erfordern jedoch das Hinzugeben von geeigneten Zytokinen, um die in vitro-Expansion hämatopoetischer Stammzellen zu erlauben. Die hohen Kosten solcher Wachstumsfaktoren haben die Fähigkeit der Fachleute, hämatopoetische Zellen zur Transplantation oder für andere Zwecke in vitro zu expandieren, nachteilig beeinflusst. Dementsprechend besteht ein Bedarf, neue Verfahren zum Expandieren hämatopoetischer Zellen in vitro zu entwickeln, bei denen exogen hinzugegebene Zytokine nicht benötigt werden, um das Wachstum und die Differenzierung von Zellen zu unterstützen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Stimulieren des Wachstums und der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen in vitro bereit. Das Hinzugeben exogen hinzugegebener Zytokine, um die Stimulierung von hämatopoetischen Zellen in vitro zu unterstützen, ist bei den Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise nicht notwendig. Dementsprechend sind die Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung zur Steigerung der Zahl von hämatopoetischen Zellen in vitro und/oder zum Bewirken der Differenzierung früher Progenitorzellen nützlich. Das Steigern der Zahl und/oder der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen in einer Zellkultur erlaubt gleichermaßen die Charakterisierung derartiger Zellen in der Zellkultur unter einer Vielzahl von Bedingungen und die Verwendung solcher kultivierter Zellen zur in vitro-Produktion von rekombinanten oder natürlich vorkommenden Molekülen aus solchen Zellen. Darüber hinaus sind die stimulierten hämatopoetischen Zellen der Erfindung bei der Behandlung von Störungen nützlich, die durch eine verringerte Zahl hämatopoetischer Zellen oder ihrer Vorläufer in vivo gekennzeichnet sind. Solche Zustände treten häufig bei Patienten auf, die, zum Beispiel in Folge einer Chemotherapie und/oder Strahlentherapie gegen Krebs, immunosupprimiert sind.
Die Neuheit der Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung, dass Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase des Typs IV ("DPIV") zum Stimulieren des Wachstums und der Differenzierung hämatopoetischer Zellen in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Zytokinen oder anderen Wachstumsfaktoren oder Stromazellen nützlich sind. Diese Entdeckung steht im Widerspruch zu dem Dogma auf dem Gebiet der Stimulierung hämatopoetischer Zellen, das besagt, dass das Hinzugeben von Zytokinen oder Zellen, die Zytokine produzieren (Stromazellen) für das Erhalten und Stimulieren des Wachstums und der Differenzierung von hämatopoetischen Zellen in Kultur ein notwendiges Element darstellt. (Siehe zum Beispiel internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/LTS93/017173, veröffentlicht als WO94/03055).
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Stimulieren hämatopoetischer Zellen zum Wachsen und Differenzieren in vitro bereitgestellt. Zu dem Verfahren gehört: (1) das Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Inhibitors der Dipeptidylpeptidase des Typs IV zur Steigerung der Zahl und/oder Differenzierung von hämatopoitischen Zellen, wenn die Zellen in Anwesenheit des Inhibitors kultiviert werden, in Bezug auf die Zahl und Differenzierung hämatopoetischer Zellen, die in einer Kontrollkultur anwesend sind, die nicht mit dem Inhibitor kontaktiert wird, aber anderweitig den gleichen Kulturbedingungen unterworfen wird wie die hämatopoetischen Zellen, die in Anwesenheit des Inhibitors kultiviert werden; (2) das Kultivieren der hämatopoetischen Zellen in Anwesenheit des Inhibitors und in Abwesenheit von exogen hinzugegebenem Zytokin unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die zur Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen und/oder zur Differenzierung solcher Zellen in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen ausreicht, die in der Kontrollkultur anwesend sind.
Im Allgemeinen bedeutet das Steigern der Zahl hämatopoetischer Zellen das Steigern der Zahl von Zellen um mindestens ungefähr das Zweifache in Bezug auf die Zahl von hämatopoetischen Zellen, die vorhanden sind, wenn die Zellen das erste Mal mit dem Inhibitor kontaktiert werden. Im Allgemeinen ist die Zahl der Zellen, die in einer Kontrollkultur vorhanden sind, die nicht mit dem Inhibitor kontaktiert, aber anderweitig genauso behandelt wurde, ungefähr genau so hoch wie die zuerst vorhandene Zahl an Zellen in der Kultur vor dem Kontakt mit dem Inhibitor. Bevorzugterweise wird die Zahl der hämatopoetischen Zellen mindestens ungefähr um das Vierfache, das Zehnfache, das Zwanzigfache oder bevorzugtesterweise mindestens das Hundertfache in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen gesteigert, die vorhanden sind, wenn die hämatopoetischen Zellen zuerst mit dem Inhibitor kontaktiert werden.
Wie hierin verwendet, umfassen hämatopoetische Zellen hämatopoetische Stammzellen, primordiale Stammzellen, frühe Progenitorzellen, CD34⁺-Zellen, frühe Zellen aus den Linien der mesenchymalen, myeloiden, lymphoiden und erythroiden Linien, Knochenmarkzellen, Blutzellen, Nabelschnurzellen, Stromazellen und anderen hämatopoetischen Vorläuferzellen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Wie hierin verwendet, bedeutet ein Inhibitor eine Dipeptidylpeptidase des Typs IV ("DPIV") im Allgemeinen ein Molekül, das die funktionelle Aktivität der DPIV inhibiert. Dementsprechend umfassen die Inhibitoren der Erfindung Inhibitoren der enzymatischen Aktivität der Dipeptidylpeptidase des Typs IV. Bevorzugterweise verbinden sich die Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von DPIV mit dem aktiven Zentrum von DPIV durch kovalentes Binden daran oder durch das Ausbilden einer ionischen Wechselwirkung damit. Solche Inhibitoren umfassen kompetitive Inhibitoren von DPIV, wie beispielsweise Übergangszustand-Analoga von DPIV, und nicht-kompetitive Inhibitoren von DPIV wie beispielsweise Fluoralkylketone. Inhibitoren von DPIV umfassen auch nicht-kompetitive Inhibitoren von DPIV, die selektiv (kovalent oder über ionische Wechselwirkungen) an eine Stelle des DPIV Proteins binden, die nicht das aktive Zentrum ist, und dadurch die enzymatische Aktivität der DPIV inhibieren. Solche nicht-kompetitiven Inhibitoren umfassen eine Kategorie von bindenden Molekülen, die selektiv an DPIV binden und die Fähigkeit besitzen, hämatopoetische Zellen oder Thymozyten in vitro zu stimulieren. Andere bindende Moleküle, die selektiv an DPIV binden und die Fähigkeit aufweisen, hämatopoetische Zellen zu stimulieren, umfassen monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper und Fragmente der vorstehenden, die in der Lage sind: (1) an DPIV zu binden und (2) hämatopoetische Zellen und/oder Thymozyten in vitro zu stimulieren. Die Inhibitoren von DPIV, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können immobilisiert sein oder in einer unlöslichen Form vorliegen. Im Allgemeinen können die vorstehenden Inhibitoren monovalent, bivalent oder multivalent sein. (Siehe zum Beispiel US Seriennummern 08/671,756 und 08/837,305 mit dem Titel „Multivalent Compounds for Crosslinking Receptors and Uses Thereof" für eine Beschreibung von Dimeren und anderen Konjugaten von DPIV-Inhibitoren). Der immobilisierte DPIV-Inhibitor kann auf einer Vielzahl von Immobilisierungsstrukturen immobilisiert sein, die gewöhnliche Kulturgefäße (zum Beispiel gerührte Kolben, Rührkesselreaktoren, Druckluftreaktoren, Zellsuspensionsreaktoren, Zelladsorptionsreaktoren und Zelleinschlußreaktoren, Petrischalen, Multi-Reaktionsnapf-Platten, Mikrotiterplatten, Reagenzgläser, Kulturflaschen, Beutel und Hohlfaservorrichtungen und Zellschaum) umfassen. Solche Immobilisierungsstrukturen sind bevorzugterweise aus Materialien hergestellt, die zum Beispiel Polystyrol, Polypropylen, Acrylatpolymere, Nylon, Gewebe, Nitrozellulose, Agarose, Sepharose und so weiter umfassen.
Gemäß diesem Verfahren der Erfindung werden die hämatopoetischen Zellen an einer Immobilisierungsstruktur oder in einer alternativen Zellkulturvorrichtung, die löslichen DPIV-Inhibitor enthält, mit einer ausreichenden Menge des DPIV-Inhibitors kontaktiert, um die Zahl der hämatopoetischen Zellen zu steigern und/oder die Differenzierung solcher Zellen zu bewirken, wenn die Zellen in Anwesenheit des Inhibitors kultiviert werden. Im Allgemeinen erfolgt die Bestimmung einer Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen und/oder die Untersuchung ihres Differenzierungszustandes unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die kultivierten hämatopoetischen Zellen dazu veranlasst werden können, zu differenzieren und/oder ihre Zahl in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Zytokinen zu steigern. Durch das Bereitstellen eines Verfahrens zum Stimulieren hämatopoetischer Zellen in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Zytokinen liefert die Erfindung wesentliche Kostensenkungen bei der Kultivierung solcher Zellen und gleichermaßen das vorteilhafte Verringern der Wahrscheinlichkeit einer Kontamination solcher Zellkulturen durch das Eliminieren des Agens, von dem die Anmelder entdeckt haben, dass es für die Stimulierung hämatopoetischer Zellen in Kultur nicht wesentlich ist.
Gemäß eines zweiten Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Expandieren Antigenspezifischer T-Zellen in vitro bereitgestellt. Unten werden drei Ausführungsformen dieses Verfahrens beschrieben, um dieses Verfahren zu veranschaulichen. Im Allgemeinen unterscheiden sich die Ausführungsformen durch die Auswahl der hämatopoetischen Zellen, die in vitro stimuliert werden, voneinander. Bei jedem Verfahren wird mindestens ein Kultivierungsschritt/einer der Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogen hinzugegebenem Zytokin durchgeführt. Die bevorzugten Heterokonjugate, die bei der jeweiligen Ausführungsform verwendet werden, enthalten ein Tumor-spezifisches Antigen oder ein Krankheitserreger-spezifisches Antigen, das an einen DPIV-Inhibitor der Erfindung gekoppelt ist.
Die erste Ausführungsform des Verfahrens zum Erhalten Antigen-spezifischer T-Zellen betrifft das Stimulieren von Knochenmarkzellen in einer Kultur. Die Knochenmarkzellen in der Kultur können eine Mischung aus Zellen umfassen; bevorzugterweise sind die Knochenmarkzellen in der Kultur jedoch isolierte CD34⁺-Zellen oder isolierte Stammzellen. Gemäß dieser Ausführungsform gehört zu dem Verfahren: (1) das Kultivieren der Knochenmarkzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors (z. B. DPIV-Monomer und/oder -Homokonjugat), um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie in Kultur zu expandieren; und (2) das Kultivieren der frühen Zellen der T-Linien mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, das einen Inhibitor eines DPIV-Inhibitors umfasst, der an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebunden ist, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur zu expandieren. Schritt (2) kann in Anwesenheit oder Abwesenheit von spezifischem Antigen durchgeführt werden. Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen mit einer Kontrollkultur von Knochenmarkzellen verglichen, die wie in den Schritten (1) und (2) beschrieben behandelt wurde, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht mit dem Heterokonjugat kontaktiert wird. Bei jedem Schritt werden die Zellen in Anwesenheit des DPIV-Inhibitors oder -Heterokonjugates für eine Zeitdauer kultiviert, die ausreichend ist, um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie zu erhöhen bzw. die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen zu expandieren, jeweils in Bezug auf die Zahlen solcher Zellen, die in der Kontrollkultur anwesend sind.
Die zweite Ausführungsform betrifft das Stimulieren von Nabelschnurblutzellen in Kultur. Diese Ausführungsform umfasst: (1) das Kultivieren der Nabelschnurblutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors (z. B. ein DPIV-Monomer und/oder -Homokonjugat), um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie in Kultur zu expandieren; und (2) das Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie mit einem Heterokonjugat, das einen Inhibitor eines DPIV-Inhibitors enthält, der an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebunden ist, um die Zahl der Antigenspezifischen T-Zellen zu expandieren, die in der Kultur vorhanden sind. Schritt (2) kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden. Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen mit einer Kontrollkultur von Nabelschnurblutzellen verglichen, die wie in den Schritten (1) und (2) beschrieben behandelt wurde, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht mit dem Heterokonjugat kontaktiert wird. Bei jedem Schritt werden die Zellen in Anwesenheit des DPIV-Inhibitors oder –Heterokonjugates für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreichend ist, um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie zu erhöhen bzw. die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in Bezug auf die Zahlen solcher Zellen, die in der Kontrollkultur anwesend sind, zu erhöhen.
Die dritte Ausführungsform betrifft das Stimulieren der peripheren Blutstammzellen in einer Kultur. Diese Ausführungsform umfasst: (1) das Kultivieren der Stammzellen des peripheren Blutes in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors (z. B. ein DPIV-Monomer und/oder -Homokonjugat), um die Zahl der T-Zellen in der Kultur zu erhöhen; und (2) das Kultivieren der T-Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, das einen Inhibitor eines DPIV-Inhibitors enthält, der an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumoroder Pathogen-spezifisches Antigen) gebunden ist, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur zu expandieren. Schritt (2) kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden. Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen mit einer Kontrollkultur von Stammzellen des peripheren Blutes verglichen, die wie in den Schritten (1) und (2) behandelt wurde, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht mit dem Heterokonjugat kontaktiert wird. Bei jedem Schritt werden die Zellen in Anwesenheit eines DPIV-Inhibitors oder -Heterokonjugates für eine Zeitdauer kultiviert, die ausreichend ist, um die Zahl der T-Zellen zu erhöhen bzw. die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in Bezug auf die Zahlen solcher Zellen zu expandieren, die in der Kontrollkultur vorhanden sind. Weil bekannt ist, dass peripheres Blut T-Zellen enthält, ist es alternativ möglich, die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in einer Kultur ohne den Stimulierungsschritt (1) zu expandieren, d. h. zu dem Verfahren zum Expandieren der Zahl von Antigen-spezifischen T-Zellen gehört das Kultivieren der peripheren Blutzellen mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, das einen Inhibitor eines DPIV-Inhibitors enthält, der an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebunden ist, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur zu expandieren. Dieser Schritt kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden.
Gemäß eines dritten Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum in vitro-Stimulieren hämatopoetischer Stammzellen bereitgestellt, umfassend:

(1) Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit einer Menge einer Verbindung, die ausreicht, um die Zahl der hämatopoetischen Zellen und/oder den Differenzierungszustand der hämatopoetischen Zellen in Bezug auf die Zahl und die Differenzierung der hämatopoetischen Zellen zu steigern, die in einer Kontrollkultur anwesend sind, die nicht mit der Verbindung kontaktiert wurde, ansonsten aber anderweitig den gleichen Kulturbedingen unterworfen wird wie die hämatopoetischen Zellen, die in Anwesenheit der Verbindung kultiviert werden; und
(2) Kultivieren der hämatopoetischen Zellen in Anwesenheit der Verbindung und in Abwesenheit von exogenem Zytokin unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die zur Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen und/oder der Differenzierung hämatopoetischer Zellen in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen, die in der Kontrollkultur anwesend sind, ausreicht, wobei die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist und D1-A1-A2- eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und,
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.

Gemäß eines vierten Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Expandieren Antigenspezifischer T-Zellen in vitro bereitgestellt, umfassend:

(1) Kultivieren von Knochenmarkzellen oder Nabelschnurblutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge einer Verbindung zum Expandieren der Zahl früher Zellen der T-Linie in der Kultur; und
(2) Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, enthaltend die Verbindung, die an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin mindestens einer der vorstehenden Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird, und worin die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist; und D1-A1-A2 eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.

Gemäß eines fünften Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Expandieren Antigenspezifischer T-Zellen in vitro bereitgestellt, umfassend:

(1) Kultivieren peripherer Blutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge einer Verbindung zum Expandieren der Zahl von T-Zellen in der Kultur; und
(2) Kultivieren der T-Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, enthaltend die Verbindung, die an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist;

Gemäß eines sechsten Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Expandieren Antigenspezifischer T-Zellen in vitro bereitgestellt, umfassend das Kultivieren peripher Blutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend eine Verbindung, die an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur angeheftet ist;
worin mindestens einer der obigen Kulturschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird, und
worin die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist und D1-A1-A2- eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung und jeder ihrer verschiedenen Aspekte sind wie unten beschrieben oder wie in den Unteransprüchen definiert.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden genau so wie verschiedene Vorteile bei den nützlichen Anwendungen durch Bezugnahme auf die Zeichnungen und die detaillierte Beschreibung der Erfindung offenkundiger werden.
1:
Frisch isolierte Knochenmarkzellen wurden isoliert, und 10000 Zellen pro Reaktionsnapf wurden 4 Tage lang in 96-Mikrotiterplatten in CellGro Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) und mit oder ohne (Kontrolle) den angegebenen Konzentrationen von Pro-boroPro inkubiert. Am Ende dieser Inkubationszeit wurden die Zellen unter dem Mikroskop gezählt. Die Kulturen ohne Pro-boroPro enthielten am Ende der 4 Tage 10000 Zellen. Die Kulturen, die Pro-boroPro enthielten, wiesen bei 10^–6M 53000 Zellen, bei 10^–8M 38.000 Zellen und bei 10^–10M 42000 Zellen auf. Die Kulturen, die eine Mischung von Wachstumsfaktoren (GF) enthielten, enthielten 82000 Zellen. Die Wachstumsfaktoren wurden in OPITEN^® Giant Cell Tumor-conditioned medium (IGEN) geliefert.
2:
Nabelschnurblutzellen wurden unter den im Wesentlichen gleichen Bedingungen inkubiert, wie sie in der Legende zu 1 beschrieben sind, mit der Ausnahme, dass Val-boroPro bei den angegebenen Konzentrationen als Stimulans verwendet wurde. Nach 4-tägiger Inkubation:
A: Nabelschnurblut-Menge; Gesamtzellzahlen. Kontrollkultur: 0,2 × 10⁶ Zellen; Wachstumsfaktoren 5 × 10⁶ Zellen; Val-boroPro: 3 × 10⁶ (10^–6M); 3 × 10⁶ (10^–8M); 4 × 10⁶ (10^–10M).
B: Isolierte CD34+-Zellen: CD34+-Zellen wurden unter Verwendung von zur Positivselektion an Kügelchen gekoppeltem CD34mAk isoliert. Die Zellpräparationen enthielten 98 % CD34+-Zellen. Nach 4-tägiger Inkubation enthielt die Kultur, die 10^–10M Val-boroPro enthielt, 8,5 × 10⁶ Zellen, im Vergleich zu 0,6 × 10⁶ Zellen in der Kontrolle und 4 × 10⁶ Zellen bei der Inkubation mit Wachstumsfaktoren.
C: Prozentsatz an CD34+-Zellen, die nach 4-tägiger Kultur verbleiben: Kulturen, die mit Val-boroPro inkubiert wurden, enthielten nach 4-tägiger Kultur zwischen 10 und 15 % CD34+-Zellen. Mit Wachstumsfaktoren inkubierte Kulturen wiesen nur 4 % verbliebene CD34+-Zellen auf (Feld b). Dies zeigte, dass Val-boroPro Zellen zusätzlich zu einer Wirkung auf die Differenzierung von CD34+-Zellen zu reifen peripheren Blutzellen eine Wachstumsstimulierende Wirkung auf CD34+- aufweist. Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass das Kultivieren dieser CD34+-Zellen in Anwesenheit von Val-boroPro und Wachstumsfaktoren nicht den Prozentsatz an CD34+-Zellen in der Kultur im Vergleich zu dem Prozentsatz, der mit Val-boroPro alleine beobachtet wurde, verändert, obwohl sich die Gesamtzellzahl in dieser vereinigten Kultur im Vergleich zu den 8,5 × 10⁶ Zellen bei der Inkubation mit Val-boroPro alleine (Feld a) auf 55 × 10⁶ Zellen erhöht hatte.
3:
Im Vergleich zur Wirkung der monomeren Form von Lys-boroPro steigert die Dimerisierung von Lys-boroPro (Homokonjugat) die Stimulierung des Wachstums von Knochenmarkzellen dramatisch. Die Kulturen wurden wie in der Legende zu 1 beschrieben vorbereitet, mit der Ausnahme, dass Lys-boroPro und das Homokonjugat verwendet wurden, und 4 Tage lang inkubiert.
4
Knochenmarkzellen wurden wie in 1 beschrieben inkubiert, mit der Ausnahme, dass bei einer 4-tägigen Kultur Val-boroPro und das Homokonjugat verwendet wurden.
A: Val-boroPro ergab eine ähnliche Expansion der Knochenmarkzellen wie die Wachstumsfaktormischung (GF), während das Dimer die Wirkung mehr als verdoppelte.
B: (Feld a): Isolierte CD34+-Zellen (Reinheit 98 %), die mit Val-boroPro inkubiert wurden, ergaben eine bis zu 20-fache Steigerung der Stimulierung des Zellwachstums verglichen mit einer 18-fachen Steigerung mit Wachstumsfaktoren gegenüber der in Kontrollkulturen. Das Homokonjugat steigerte die Wachstumsaktivität bei einer Konzentration von 10^–6M 125-fach und bei einer Konzentration von 10^–6 M 96-fach.
(Feld b): Prozentsatz an CD34+-Zellen, die in der Kultur nach 4-tägiger Inkubationszeit verblieben: Kontrolle 63 %; GF 5 %; Val-boroPro 43 %; Homodimer 10 %.
Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Stimulierung hämatopoetischer Zellen in einer Kultur und insbesondere ein Verfahren zur Stimulierung hämatopoetischer Zellen in vitro in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Zytokinen bereit. Die Erfindung der Anmelder betrifft die Entdeckung, dass das Hinzugeben von Zytokinen oder von Zellen, die Zytokine exprimieren (Stromazellen), zu hämatopoetischen Zellen in Kultur kein wesentliches Element für die Erhaltung oder Stimulierung hämatopoetischer Zellen ist, wenn ein DPIV-Inhibitor hinzugegeben ist. Dementsprechend ergibt die Entdeckung der Anmelder dadurch, dass die Notwendigkeit, Zytokine für Zellkulturen bereitzustellen, entfällt, und gleichermaßen dadurch, dass vorteilhafterweise eine potentielle Quelle von Kontaminierungen solcher Zellen in Kultur entfällt, eine erhebliche Kostensenkung.
Gemäß eines Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Stimulieren hämatopoetischer Zellen in vitro bereitgestellt. Zum Verfahren gehört (1) das Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Inhibitors einer Dipeptidylpeptidase des Typs IV („DPIV") in vitro zur Steigerung der Zahl der hämatopoetischen Zellen und/oder der Differenzierung solcher hämatopoetischer Zellen in Bezug auf die Zahl und die Differenzierung hämatopoetischer Zellen, die in einer Kontrollkultur vorhanden sind, die nicht mit einem Inhibitor kontaktiert wird, aber ansonsten den gleichen Kulturbedingungen unterworfen ist wie die hämatopoetischen Zellen, die in Anwesenheit des Inhibitors kultiviert werden; und (2) das Kultivieren der hämatopoetischen Zellen in Anwesenheit des Inhibitors und in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Zytokinen unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die zur Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen und/oder ihrer Differenzierung in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen, die in der Kontrollkultur vorhanden sind, ausreicht. Wie hierin verwendet, bedeutet das Stimulieren hämatopoetischer Zellen das Induzieren hämatopoetischer Zellen zu wachsen und/oder zu differenzieren. Somit sind die Verfahren und Zusammensetzungen und Vorrichtungen der Erfindung sowohl zur Steigerung der Zellzahl als auch dahingehend nützlich, die Differenzierung früher Progenitorzellen zu bewirken.
Wie hierin verwendet, bedeuten hämatopoetische Zellen Zellen, die die Herstellung von Blutzellen betreffen. Beispielhafte hämatopoetische Zellen umfassen hämatopoetische Stammzellen, primordiale Stammzellen, frühe Progenitorzellen, CD34+-Zellen, frühe Zellen aus den Linien der mesenchymalen, myeloiden, lymphoiden und erythroiden Linien, Knochenmarkzellen, Blutzellen, Nabelschnurblutzellen, Stromazellen und andere hämatopoetische Vorläuferzellen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Gemäß einer Übereinkunft auf dem Gebiet schließt die Definition von hämatopoetischen Zellen Thymozyten aus. Thymozyten aus dem Thymus werden nicht als „hämatopoetische Progenitor"-Zellen betrachtet, weil solche Zellen aus dem Thymus erhalten werden und bereits spezialisiert sind. Die Anmelder haben entdeckt, dass bestimmte Verfahren der Erfindung sowohl in Verbindung mit hämatopoetischen Zellen als auch in Verbindung mit Thymozyten nützlich sind. Dementsprechend soll verstanden werden, dass die Verfahren der Erfindung mit hämatopoetischen Zellen alleine, mit Thymozyten alleine oder mit hämatopoetischen Zellen in Kombination mit Thymozyten praktiziert werden können.
Knochenmarkzellen enthalten totipotente Stammzellen, die hämatopoetische Zellen aller Linien entstehen lassen, die lymphoide, myeloide und erythroide Linien umfassen. Stammzellen haben gleichermaßen die Fähigkeit, sich zu erneuern und zu Progenitorzellen aller hämatopoetischen Linien zu differenzieren. Progenitorzellen behalten die Fähigkeit, zu proliferieren und differenzierte Zellen aller Linien entstehen zu lassen. Differenzierte Zellen verlieren die Fähigkeit, zu proliferieren und zeigen morphologische Merkmale, die für ihre Linien (wie beispielsweise Makrophagen, Granulozyten, Blutplättchen, rote Blutzellen, T-Zellen und B-Zellen) spezifisch sind. Knochenmarkzellen umfassen gleichermaßen Stammzellen und Progenitorzellen der lymphoiden (T- und B-Zellen), myeloiden (z. B. Granulozyten, Makrophagen) und erythroiden (rote Blutzellen) Linien. Stammzellen und Progenitorzellen exprimieren CD34 auf ihrer Oberfläche, während differenzierte Zellen dies nicht tun. Dementsprechend kann der Nachweis von CD34 verwendet werden, um differenzierte von undifferenzierten Zellen zu unterscheiden.
Zur Verwendung bei Knochenmarktransplantaten können hämatopoetische Vorläuferzellen entweder von dem Krebspatienten (autologes Transplantat) oder von einem gewebeverträglichen Spender (allogener Spender) stammen. Diese Zellen können aus dem Knochenmark, peripheren Blut oder aus Nabelschnurblut isoliert werden. Im Allgemeinen werden die Zellen vor der Chemotherapie oder der Strahlentherapie geerntet. Knochenmark wird typischerweise in einer langen und schmerzhaften Prozedur aus dem Darmbeinkamm abgesaugt. Das Knochenmark ist reich an CD34+-Zellen; typischerweise sind 1 bis 2 % der Markzellen Vorläuferzellen. Peripheres Blut enthält typischerweise weniger als 1 % CD34+-Zellen. Um CD34+-Zellen anzureichern, werden Blutprogenitorzellen aus dem Knochenmark durch Vorbehandlung mit einer niedrig dosierten Chemotherapie oder mit bestimmten Zytokinen wie beispielsweise G-CSF oder SCF in die Peripherie mobilisiert. Nabelschnurblut ist sehr reich an frühen Progenitorzellen und als Quelle von Zellen für hämatopoetische Zelltransplantate sehr vielversprechend.
Die Zahl von Progenitorzellen, die auf einmal aus einer dieser Quellen geerntet werden kann, ist gering, und sie ist in vielen Fällen nicht ausreichend für ein erfolgreiches Transplantat. Mehrere Verfahren wurden entwickelt, um Knochenmarkzellen oder Progenitorzellen, die aus Blutapheresen oder aus Nabelschnurblut erhalten wurden, in in vitro-Kulturen zu expandieren. Die Fähigkeit, diese Zellen zu expandieren, hat zur Fortentwicklung der Knochenmarktransplantattechnologie als praktikable Zusatztherapie für Krebsbehandlungen beigetragen, zu denen eine hochdosierte Chemotherapie und/oder Strahlentherapie gehören. Die in vitro-Expansion hämatopoetischer Stammzellen erfordert das Hinzugeben geeigneter Wachstumsfaktoren und bestimmte Wachstumsbedingungen, die von so genannten Stromazellen bereitgestellt werden. Stromazellen stellen körperlichen Halt für hämatopoetische Progenitorzellen und bestimmte Wachstumsfaktoren bereit, die zur Erhöhung der Stammzellzahlen benötigt werden.
Die Abtrennung von CD34+-Zellen (differenzierte Zellen) von undifferenzierten Zellen kann unter Verwendung einer Reihe verschiedener Verfahren erreicht werden. Das am häufigsten verwendete ist eine positive immunologische Selektion, die auf der Bindung dieser Zellen an anti-CD34-Antikörper beruht, die auf einem festen Träger immobilisiert sind (Cellpro, Baxter). Andere Selektionsverfahren umfassen eine negative Selektion, wobei alle Zellen, die nicht CD34 exprimieren, von den CD34+-Zellen auf der Grundlage ihrer Expression von Linien-spezifischen Zelloberflächenantigenen isoliert werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden hämatopoetische Stammzellen mit den Monomeren bei Abwesenheit von hinzugegebenen Zytokinen, Stromazellen oder Thymozyten stimuliert. Bei anderen Ausführungsformen werden hämatopoetische Zellen oder Thymozyten mit den Verbindungen der Erfindung (bevorzugterweise unter Ausschluss von Monomeren) bei Abwesenheit von hinzugegebenen Zytokinen oder Stromazellen stimuliert. Die Anmelder haben repräsentative Monomere und Konjugate der Erfindung verwendet, um isolierte CD34+-Zellen (z. B. nach Entfernung von Stromazellen) in Abwesenheit von hinzugegebenen Zytokinen und/oder Stromazellen zu stimulieren. Die Anmelder haben auch gezeigt, dass solche Zellen dazu stimuliert werden können, in einer Flüssigkultur zu wachsen und zu differenzieren. Somit besteht ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung darin, dass für die hierin offenbarten Verfahren keine Stromazellen zur Stimulierung von hämatopoetischen Zellen oder von Thymozyten benötigt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die hierin offenbarten Verbindungen und Verfahren zur Stimulierung menschlicher Stammzellen (CD34+) nützlich sind. Solche Zielzellen sind wichtige Ziele für die Expansion wegen ihrer Fähigkeit, zu reifen Zelltypen zu differenzieren, die wichtige therapeutische Anwendungen aufweisen. Von einer Stimulierung von Stammzellen bei Abwesenheit zugefügter Zytokine oder von Stromazellen wurde bisher noch nicht berichtet.
Die Expansion von Progenitorzellen kann in einer Vielzahl von verschiedenen Kulturgefäßen und unter verschiedenen Kulturbedingungen ausgeführt werden. Im Allgemeinen werden hierin die gleichen Kulturbedingungen verwendet, die für das Kultivieren von hämatopoetischen Zellen unter Verwendung von Verfahren des Standes der Technik verwendet werden, mit der Ausnahme, dass die DPIV-Inhibitoren die Zytokine der Kulturverfahren des Standes der Technik ersetzen. Ein beispielhaftes Protokoll zur Kultivierung von Zellen nach dem Stand der Technik wird unten bereitgestellt. Dementsprechend wird dieses Protokoll zur Benutzung gemäß den Verfahren der Erfindung dadurch modifiziert, dass die Zellen bei Anwesenheit von DPIV-Inhibitoren und in Abwesenheit von exogen hinzugegebenen Zytokinen kultiviert werden.
Nach der Auftrennung werden Vorläuferzellen in einem Kulturmedium wie RPMI, Iscove's DMEM, TC 199, X-VIVO-10, bevorzugterweise unter Zugabe von menschlichen oder fötalem Kälberserum und einer Mischung von Wachstumsfaktoren, inkubiert. Serum oder Plasma kann zu einer Konzentration von 5 bis 50 % hinzugegeben werden. Wachstumsfaktoren umfassen jedes Interleukin oder alle Interleukine (IL-1 bis IL-16), Interferone (INF-alpha, -beta und -gamma), Erythropoietin (EPO), Stammzellfaktor (SCF), insulinartige Wachstumsfaktoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor, Tumorwachstumsfaktor Beta, Tumornekrosefaktor alpha, Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF), Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), fms-artigen Tyrosinkinase-3-Liganden (Fft-3-Ligand) und cKIT-Liganden (cKL). Viele dieser Wachstumsfaktoren sind im Handel erhältlich. Die am häufigsten verwendete Mischung von Wachstumsfaktoren umfasst G-CSF, GM-CSF, SCF, IL-1, IL-3 und IL-6. Die meisten der verwendeten Wachstumsfaktoren werden durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt und in verschiedenen Ausmaßen aufgereinigt. Einige Wachstumsfaktoren sind durch biochemische Standardverfahren aus dem Kulturmedium von Tumorzelllinien aufgereinigt. Ein häufig verwendeter Wachstumsfaktor ist PIXY 321, der durch rekombinante Verfahren hergestellt wird und sowohl GM-CSF- als auch IL-3-Aktivität zeigt. Die Menge der in den Kulturen verwendeten Wachstumsfaktoren hängt von der Aktivität des Faktorpräparats und von der Kombination der verwendeten Wachstumsfaktoren ab. Typischerweise reichen die Konzentrationen von 0,5 bis 500 ng/ml. Die optimale Konzentration jedes Wachstumsfaktors muss für individuelle Kulturbedingungen bestimmt werden, da manche Wachstumsfaktoren mit anderen Wachstumsfaktoren synergistisch wirken. Wie oben festgehalten, schließen die Verfahren der Erfindung exogen hinzugegebene Zytokine aus und verwenden stattdessen DPIV-Inhibitoren, um die hämatopoetischen Stammzellen in der Kultur zu stimulieren.
Wie hierin verwendet, bedeutet das Steigern der Zahl der hämatopoetischen Zellen das Steigern der Zahl der Zellen um mindestens ungefähr das Zweifache in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen, die in einer parallelen Kontrollkultur von Zellen anwesend sind, die den gleichen Bedingungen unterworfen wird wie die mit DPIV-Inhibitor behandelten Kulturen, abgesehen davon, dass solche Kontrollkulturen nicht mit den DPIV-Inhibitoren kontaktiert sind. Bevorzugterweise wird die Zahl der hämatopoetischen Zellen um mindestens etwa das Vierfache, bevorzugtererweise Zahnfache und noch bevorzugtererweise um mindestens das Zwanzigfache in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen gesteigert, die in der parallelen Kontrollkultur anwesend sind.
Die Zeitspanne, in der die Zahl der hämatopoetischen Zellen erhöht wird, ist zumindest teilweise eine Funktion des Zelltyps und des verwendeten spezifischen Kulturgefäßes. Im Allgemeinen reicht diese Zeitdauer von etwa 2–3 Tagen (für kurzfristige Expansion) bis zu mehreren Wochen für die Expansion von Zellen, die zum langfristigen Transplantateinwachsen geeignet sind. Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Routineverfahren können verwendet werden, um die Zahl der Zellen in der Kultur als Funktion der gesteigerten Inkubationszeit der kultivierten Zellen mit dem DPIV-Inhibitor zu bestimmen. Typischerweise wird die Expansion (Steigerung der Zellzahl) durch das Zählen der Zellzahlen, z. B. durch das Messen des Einbaus eines spezifischen Farbstoffes oder durch die Bestimmung des Hämatokrits unter Verwendung eines Hämatozytometers oder eines Zellzählers gemessen. Damit ist zur Optimierung der besonderen Wachstumsbedingungen und zur Auswahl der Mengen der DPIV-Inhibitoren, die notwendig sind, um die oben angegebenen vielfachen Steigerungen der Zellzahlen zu erreichen, nicht mehr als routinemäßiges Experimentieren notwendig. Ein solches routinemäßige Experimentieren umfasst zum Beispiel (i) das Verändern der Menge des DPIV-Inhibitors bei konstanter Inkubationszeit; (ii) das Verändern der Inkubationszeit bei konstanter Menge des DPIV-Inhibitors; (iii) das Anwenden der vorstehenden Optimierungsexperimente, um die besonderen Bedingungen zu bestimmen, die notwendig sind, um ein zuvor festgelegtes Ausmaß der Erhöhung der Zellzahl für einem zuvor festgelegten Zelltyp zu erreichen; und (iv) das Verändern anderer Faktoren, einschließlich z. B. der Identität, der Valenz (z. B. monovalent oder bivalent) oder des Zustandes des DPIV-Inhibitors (ob löslich oder immobilisiert), um die Kulturbedingungen für das Erreichen der erwünschten Ergebnisse zu optimieren. Somit schwankt die Länge der Inkubationszeitdauer bei der Zellkultur und hängt von dem Ausmaß der erwünschten Expansion ab. Bei den meisten Anwendungen reicht diese Zeitdauer von etwa 4 bis 14 Tagen. Im Allgemeinen wird die Expansion in Flüssigkulturen durch die Zunahme der gesamten Zellzahl seit dem Beginn der Inkubation und/oder durch das Bestimmen des Prozentansatzes an CD34+-Zellen in der Kultur oder durch das Bestimmen der Gesamtzellzahl in Bezug auf eine Kontrollkultur, die nicht mit dem DPIV-Inhibitor kontaktiert wurde, bestimmt. Die CFU-GM-Zahl wird bestimmt, wenn Iscove's Methylzellulosemedium, das geeignete Wachstumsfaktoren enthält, in 35 mm Petrischalen für einen Zeitraum von 10 bis 14 Tagen mit Zellen angeimpft wird. Die typische Dichte zu Beginn beträgt 1000 Zellen/ml. Am Ende der Inkubationszeit werden Koloniezahlen, die mehr als 50 Zellen von myeloidem (CFU-GM) oder erythroidem (BFU-E) Ursprung enthalten, unter Verwendung eines Umkehrmikroskopes gezählt.
Nach der Expansion und vor der Infusion in den Patienten werden die Zellen geerntet und mit frischem Kulturmedium gewaschen.
Wie hierin verwendet, bedeutet das Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit dem DPIV-Inhibitor das Einbringen der DPIV-Inhibitoren in die Kulturen in einer Weise, die den DPIV-Inhibitoren erlaubt, in direkten physischen Kontakt mit den Zellen zu treten. Im Allgemeinen werden die löslichen DPIV-Inhibitoren mit den Zellen in der Kultur auf die gleiche Weise kontaktiert, mit der lösliche Zytokine oder andere lösliche Wachstumsfaktoren in die Zellkulturen eingebracht werden, mit der Ausnahme, dass die löslichen DPIV-Inhibitoren die viel üblicheren Zytokinfaktoren des Standes der Technik ersetzen. Somit können die löslichen DPIV-Inhibitoren z. B. in der Form einer wässrigen Lösung oder in der Form eines Pulvers (z. B. lyophilisiert) zur Zellkultur hinzugegeben werden, um in der Zellkulturmatrix eine wässrige Lösung zu ergeben. Eine beispielhafte Vorgehensweise für das Kontaktieren mehrerer repräsentativer DPIV-Inhibitoren wird in den Beispielen bereitgestellt.
Im Allgemeinen werden die unlöslichen DPIV-Inhibitoren mit den Zellen in der Kultur in einer Weise kontaktiert, die durch die physikalische Form der unlöslichen DPIV-Inhibitoren vorgegeben ist. Ein unlöslicher DPIV-Inhibitor bedeutet ein DPIV-Inhibitor, der nicht in Lösung vorliegt und nicht in eine solche überführt werden kann. Dementsprechend bedeuten unlösliche DPIV-Inhibitoren DPIV-Inhibitoren, die an eine unlösliche Phase gebunden sind. Die unlösliche Phase kann ein Zellkulturgefäß sein, und in diesem Fall sind die Inhibitoren an die mit der Kultur in Kontakt befindlichen Oberfläche des Kulturgefäßes gebunden oder die unlösliche Phase kann alternativ in Partikelform (z. B. magnetische Partikel, Sepharose) vorliegen, und in diesem Fall sind die Inhibitoren an die Oberfläche der Partikel gebunden. Dementsprechend gehört zum Kontaktieren der unlöslichen DPIV-Inhibitoren, die an die Oberfläche des Kulturgefäßes gebunden sind, das Überführen der Zellen in die Kulturgefäße zusammen mit den geeigneten Nährstoffen, die für das Wachstum hämatopoetischer Zellen bekannt sind, die aber exogen hinzugegebene Zytokine ausschließen. Zum Kontaktieren unlöslicher DPIV-Inhibitoren, die an Partikel gebunden sind, gehört das Einbringen der Partikel (trocken oder suspendiert) in ein Kulturgefäß, das die hämatopoetischen Zellen enthält. Alternativ können die hämatopoetischen Zellen in ein Kulturgefäß gegeben werden, das die löslichen oder unlöslichen DPIV-Inhibitoren bereits enthält. Unabhängig von dem physikalischen Zustand der DPIV-Inhibitoren (löslich oder unlöslich) wird das Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit den Inhibitoren in Abwesenheit von exogen zugefügten Zytokinen durchgeführt.
Die DPIV-Inhibitoren der Erfindung sind Moleküle, die an DPIV binden. Im Allgemeinen gibt es zwei Kategorien von DPIV-Inhibitoren: (1) Inhibitoren der aktiven Zentren und (2) Agenzien, die nicht an die aktiven Zentren binden. Inhibitoren aktiver Zentren bedeuten Agenzien, die (kovalent oder über ionische Wechselwirkungen) an das katalytische aktive Zentrum von DPIV binden und dadurch die enzymatische Aktivität von DPIV inhibieren. Beispielhafte Inhibitoren der aktiven Zentren umfassen kompetitive enzymatische Inhibitoren von DPIV wie beispielsweise Übergangszustandanaloga der natürlichen DPIV-Substrate (unten beschrieben). Agenzien, die nicht an das aktive Zentrum binden, bedeuten Agenzien, die (kovalent oder über ionische Wechselwirkungen) an eine Stelle des DPIV-Proteins binden, die nicht das aktive Zentrum ist, und die die Fähigkeit haben, hämatopoetische Zellen oder Thymozyten unter den hierin beschriebenen Bedingungen zu stimulieren. Das Binden bestimmter Agenzien, die nicht an das aktive Zentrum binden, an DPIV (z. B. nicht-kompetitive DPIV-Inhibitoren) kann alternativ durch das Beobachten einer Verringerung der DPIV-Enzymaktivität nach Exponierung gegenüber dem Agens, das nicht an das aktive Zentrum bindet, nachgewiesen werden. Beispielhafte Agenzien, die nicht an das aktive Zentrum binden, umfassen Antikörper gegen DPIV und Fragmente davon, die in einer Weise selektiv an DPIV binden, was dazu führt, dass das bindenden Agen in der Lage ist, hämatopoetische Zellen und/oder Thymozyten zu stimulieren, wenn sie unter den hierin beschriebenen Bedingungen mit solchen Zellen kultiviert werden.
Tests zur Messung der enzymatischen Aktivität von DPIV wurden beschrieben (W.G. Gutheil und W.W. Bachovchin, Biochemistry 32, 8723–8731 (1993); Gutheil, W.G., und W., B.W. Kinlsq, Analytical Biochemstry 223, 13–20 (1994); und Gutheil, W.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 6594–6598 (1994)). Bei diesen Verfahren wird das chromatogene Substrat Ala-Pro-p-Nitroanilid (AppNA) und das fluoreszierende Substrat Ala-Pro-7-Amino-4-Trifluormethylcoumarin (AP-AFC) verwendet. AppNA und AP-AFC sind im Handel erhältlich (z. B. Enzyme Systems Products, Dublin, CA). Solche Verfahren können als Screeningtests verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein DPIV-Inhibitor die enzymatische Funktion von DPIV in vitro inhibiert.
DPIV ist ein Mitglied der Serinproteasefamilie, das dahingehend eine Aktivität zeigt, dass es nach Prolyl spaltet. Dementsprechend ist das natürliche Substrat von DPIV ein Peptid, das an seinem aminoterminalen Ende das Dipeptid Xaa-Pro enthält, wobei Xaa für jede Aminosäure steht und Pro in Übereinstimmung mit der Standardnomenklatur für Aminosäuren für Prolin steht. Die Inhibitoren des aktiven Zentrums der Erfindung inhibieren die Bindung und/oder die Spaltungsreaktion von DPIV mit seinem natürlichen Substrat.
Monomere Inhibitoren der Erfindung, die an das aktive Zentrum binden, werden durch die Formel I dargestellt: Oberfläche-(L)₉ P¹R¹ (I),wobei P¹ für eine erste Zielkomponente, bevorzugterweise ein Peptid, steht, das die Substratbindungsstelle von DPIV nachahmt;
R¹ für eine reaktive Gruppe steht, die mit einer funktionellen Gruppe im aktiven Zentrum von DPIV reagiert;
L für ein optional vorhandenes Verbindungsmolekül steht, das (i) ein Molekulargewicht zwischen etwa 100 Dalton bis etwa 2000 Dalton aufweist, (ii) eine Länge zwischen etwa 20 Å und etwa 300 Å aufweist; (iii) eine Kette aus Atomen enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die C, O, N, S und Phosphoratome enthält, die durch Einfach-, Doppel- oder Dreifachbindungen verbunden sind; und (iv) eine Oberflächendichte von etwa 20 Å bis etwa 300 Å aufweist, wenn es an einer Oberfläche gebunden ist, d. h. die Entfernung zwischen einer kovalenten Bindung des Verbindungsmoleküls an die Oberfläche und der nächsten kovalenten Bindung des Verbindungsmoleküls an die Oberfläche; und
q 0 oder 1 ist, d. h. wenn q = 0, ist das Verbindungsmolekül nicht vorhanden, und der monomere Inhibitor, der an das aktive Zentrum bindet, ist nicht über ein Verbindungsmolekül an eine Oberfläche (d. h. die Gewebekulturgefäßoberfläche oder der magnetische Partikel) gebunden, und wenn q = 1, ist das Verbindungsmolekül vorhanden und der monomere Inhibitor des aktiven Zentrums ist über ein Verbindungsmolekül an eine Oberfläche gebunden. Bei solchen Ausführungsformen wird L als bivalente Verbindung bezeichnet, weil es dazu dient, eine einzelne bindende Komponente kovalent an eine Oberfläche zu koppeln. Solche bivalenten Verbindungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und werden unten detaillierter beschrieben.
Die Peptide P¹, die die Substratbindungsstelle von DPIV nachahmen, umfassen kompetitive Inhibitoren von DPIV, wie beispielsweise Übergangszustandanaloga von DPIV, und nichtkompetitive Inhibitoren von DPIV wie beispielsweise Fluoralkylketone. Alle diese Inhibitortypen werden unten diskutiert. Bei wichtigen Ausführungsformen der Erfindung ist P¹ ein Peptid oder ein peptidomimetisches Molekül.
Multivalente Inhibitoren des aktiven Zentrums gemäß der Erfindung sind durch die Formel II dargestellt:
wobei P¹, R¹, L wie oben definiert und q = 1 ist;
P² eine zweite Zielkomponente, bevorzugterweise ein Peptid darstellt, die die gleiche oder eine andere als die erste Zielkomponente sein kann;
R² eine zweite reaktive Gruppe darstellt, die die gleiche oder eine andere als die erste Gruppe sein kann;
m = 0 oder 1;
n eine ganze Zahl zwischen 0 und 10 ist;
r = 0 oder 1; und
A ein Arm des Verbindungsmoleküls ist, der an eine Oberfläche gekoppelt sein kann, d. h. wenn r = 0 ist, ist das Verbindungsmolekül L nicht an eine Oberfläche gekoppelt, und wenn r = 1 ist, ist die Verbindung an eine Oberfläche gekoppelt.
Bei bestimmten Ausführungsformen der Verbindung kann, wenn P² = P¹ ist, R² abwesend, das gleiche wie oder etwas anderes als R¹ sein. Im Allgemeinen ist n 1, und die Verbindungen der Erfindung werden als Homokonjugate (d. h. P² = P¹) oder als Heterokonjugate (d. h. P² ≠ P¹) bezeichnet.
Bei bestimmten Ausführungsformen ist L weiterhin vermittels einer Oberfläche (z. B. ein Gewebekulturgefäß oder ein magnetischer Partikel) gebunden. Bei solchen Ausführungsformen wird L als multivalentes Verbindungsmolekül bezeichnet, weil es dazu dient, zwei oder mehr bindende Komponenten aneinander und an eine Oberfläche zu koppeln. Solche multivalenten Verbindungsmoleküle sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Beispielhafte bindende Komponenten R¹, die Peptide sind und die wie berichtet nützlich beim Inhibieren von nach Prolyl spaltenden Enzymen sind, und die, wenn sie an eine reaktive Gruppe gekoppelt sind, einen kovalenten Komplex mit einer funktionellen Gruppe des aktiven Zentrums eines nach Prolyl spaltenden Enzyms bilden, sind in U. S.-Patent Nr. 4,935,493, „Protease Inhibitors", erteilt an Bachovchin et al. („Bachovchin '493"); U.S. 5,462,928, „Inhibitors of Dipeptidyl-aminopeptidase Type IV", erteilt an Bachovchin et al. („Bachovchin '928"); U.S. 5,543,396, „Prolin Phosphonate Derivatives", erteilt an Powers et al., („Powers '396"); U.S. 5,296,604, "Proline Derivates and Compositions for Their Use as Inhibitors of HIV Protease", erteilt an Hanko et al., („Hanko '604"); PCT/LTS92/09845, „Method for Making a Prolineboronate Ester" und ihrer U.S.-Prioritätsanmeldungen (USSN 07/796,148 und 07/936,198), Anmelder Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. („Boehringer"); und PCT/GB94/02615, „DPIV-Serine Protease Inhibitors", Anmelder Ferring V.V. („Ferring") beschrieben. Repräsentative Beispiele der vorstehenden Inhibitoren sind unten beschrieben und umfassen die Inhibitoren auf der Grundlage des Übergangszustandanalogons Xaa-boroPro, einschließlich Lys-BoroPro, Pro-BoroPro und Ala-BoroPro, wobei „boroPro" das Analogon von Prolin bedeutet, bei dem die Carboxylatgruppe (COOH) durch eine Boronylgruppe [B(OH)₂] ersetzt ist. Alternative Inhibitoren des aktiven Zentrums der Erfindung weisen eine analoge Struktur auf, bei der die Boronylgruppe durch ein Phosphonat oder ein Fluoralkylketon (unten beschrieben) ersetzt ist. Fachleute auf dem Gebiet werden anerkennen, dass es andere Veränderungen gibt, die ausgeführt werden können, ohne dass die Bindungs- und Komplexbildungs-Eigenschaften dieser Verbindungen erheblich beeinflusst werden.
Die Entwicklung von Phage display-Bibliotheken und chemischen kombinatorischen Bibliotheken, aus denen synthetische Verbindungen ausgewählt werden können, die die Substratbindungsstelle von DPIV nachahmen, erlaubt die Identifizierung von weiteren Zielkomponenten P¹, an die eine reaktive Gruppe R¹ kovalent gebunden werden kann, um eine Bindungskomponente zu bilden, die die Substratbindungsstelle der Protease nachahmt und mit einer funktionellen Gruppe des aktiven Zentrums der Protease einen Komplex bildet. Solche Bibliotheken können gescreent werden, um nicht natürlich vorkommende, mutmaßliche Zielkomponenten durch das Testen der Protease-Spaltaktivität in Gegenwart und Abwesenheit des mutmaßlichen Phage display-Bibliothek-Moleküls oder des Moleküls der kombinatorischen Bibliothek zu identifizieren und um zu bestimmen, ob das Molekül die Spaltung ihres natürlichen Substrates oder eines Substratanalogons (z. B. eines chromophoren Substratanalogons, das in einem spektrophotometrischen Test leicht nachweisbar ist) durch die Protease inhibiert. Diese Moleküle aus Phagenbibliotheken und/oder kombinatorischen Bibliotheken, die eine Inhibition der Protease zeigen, können dann kovalent an die reaktiven Gruppen R¹, die hierin offenbart sind, gekoppelt und wiederum getestet werden, um zu bestimmen, ob diese neuen Moleküle die Protease selektiv binden (z. B. durch das Wiederholen des oben angegebenen Screening-Tests). Auf diese Weise wird ein einfacher Hochdurchsatzscreening-Test zum Identifizieren nicht natürlich vorkommender Zielkomponenten der Erfindung bereitgestellt.
Im Allgemeinen sind die ersten bindenden Komponenten P¹ der Erfindung über eine Carboxylgruppe an ihrer C-terminalen Aminosäure kovalent an eine erste reaktive Gruppe R¹ gekoppelt. Wie hierin verwendet, bezeichnet R¹ eine reaktive Gruppe, die in der Lage ist, mit einer funktionellen Gruppe im aktiven Zentrum von DPIV zu reagieren. Mit dem Reagieren mit einem aktiven Zentrum dieser Zielprotease ist gemeint, dass das R¹ eine kovalente Bindung oder eine starke ionische Wechselwirkung mit einer funktionellen Gruppe bildet, die sich an dem aktiven Zentrum befindet. Reaktive Gruppen R¹, die von dem Umfang der Erfindung umfasst sind, umfassen die reaktiven Gruppen, die in US 4,935,493 , „Proteaseinhibitoren", das an Bachovchin et al. erteilt wurde, als die Gruppe „T" bezeichnet wurden. Diese umfassen Boronatgruppen, Phosphonatgruppen und Fluoralkylketongruppen. Beispielhafte Boronatgruppen sind unten und in den Beispielen beschrieben. Die Phosphonat- und Fluoralkylketon-Gruppen sind unten beschrieben. Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass die Verbindung zwischen dem C-Terminus der Zielkomponente und der reaktiven Gruppe die L-Konfiguration aufweist. Es wird auch bevorzugt, dass die reaktive Gruppe eine kovalente Bindung mit einer funktionellen Gruppe am aktiven Zentrum bildet; es besteht jedoch keine Notwendigkeit zur Bildung einer kovalenten Bindung, um einen Komplex zwischen der bindenden Komponente und dem aktiven Zentrum zu bilden.
Bei dieser Anmeldung wird durchgehend die übliche Terminologie verwendet, die in geeigneten Lehrbüchern angegeben ist, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, um die Isomere wie unten beschrieben zu bezeichnen. (Siehe z. B. Principles in Biochemistry, Herausgeber A. L. Lehninger, S. 99–100, Worth Publishers, Inc. (1982) New York, NY; Organic Chemistry, Morrison und Boyd, 3. Ausgabe, Kap. 4, Allyn und Bacon, Inc., Boston, MA (1978); siehe auch die gemäß Patent Cooperation Treaty veröffentlichte Anmeldung WO 93/10127, Anmeldungungsnummer PCT/US92/09845).
Mit Ausnahme von Glycin enthalten alle Aminosäuren ein asymmetrisches oder chirales Kohlenstoffatom und können mehr als ein chirales Kohlenstoffatom enthalten. Das asymmetrische α-Kohlenstoffatom der Aminosäure wird als ein Chiralitätszentrum bezeichnet und kann in zwei verschiedenen isomeren Formen vorkommen. Diese Formen sind im Hinblick auf alle chemischen und physikalischen Eigenschaften mit einer Ausnahme identisch, nämlich der Richtung, in der sie die Drehung von linear polarisiertem Licht bewirken können. Diese Aminosäuren werden als „optisch aktiv" bezeichnet, d. h. die Aminosäuren können das linear polarisierte Licht in die eine Richtung oder in die andere Richtung drehen.
Die vier verschiedenen Substituentengruppen, die an den α-Kohlenstoff gebunden sind, können im Raum zwei verschiedene Anordnungen einnehmen. Diese Anordnungen sind Spiegelbilder voneinander, die nicht übereinander gelegt werden können und als optische Isomere, Enantiomere oder Stereoisomere bezeichnet werden. Eine Lösung eines Stereoisomers einer gegebenen Aminosäure wird linear polarisiertes Licht nach links drehen und wird als das linksdrehende Isomer [bezeichnet als (–)] bezeichnet; das andere Stereoisomer der Aminosäure wird linear polarisiertes Licht im gleichen Umfang, aber nach rechts drehen und wird als rechtsdrehendes Isomer [bezeichnet als (+)] bezeichnet.
Ein systematischeres Verfahren zur Klassifizierung und Benennung von Stereoisomeren ist die absolute Konfiguration der vier verschiedenen Substituenten im Tetrahedryin um das asymmetrische Kohlenstoffatom (z. B. das α-Kohlenstoffatom). Um dieses System einzuführen, wurde eine Referenzverbindung (Glycerinaldehyd) gewählt, die der kleinste Zucker ist, der ein asymmetrisches Kohlenstoffatom aufweist. Aufgrund von einer Konvention auf dem Gebiet werden die zwei Stereoisomere von Glycerinaldehyd als L und D bezeichnet. Ihre absoluten Konfigurationen wurden durch Röntgenstrukturanalyse bestimmt.
Die Bezeichnungen L und D wurden unter Bezugnahme auf auf absolute Konfiguration von Glycerinaldehyd auch den Aminosäuren zugeordnet. Somit werden Stereoisomere chiraler Verbindungen, die eine Konfiguration aufweisen, die der von L-Glycerinaldehyd entspricht, als L bezeichnet, und die Stereoisomere, die eine Konfiguration aufweisen, die der von D-Glycerinaldehyd entspricht, werden als D bezeichnet, unabhängig von der Richtung, in der sie das linear polarisierte Licht drehen. Somit bezeichnen die Symbole L und D die absolute Konfiguration der vier Substituenten um das Kohlenstoffatom herum.
Im Allgemeinen kommen natürlich vorkommende Verbindungen, die ein Chiralitätszentrum aufweisen, nur in einer stereoisomeren Form, entweder D oder L, vor. Natürlich vorkommende Aminosäuren sind die L-Stereoisomere; jedoch umfasst die Erfindung Aminosäuren, die in der Konfiguration des D-Stereoisomers vorliegen.
Die meisten Aminosäuren, die in Proteinen gefunden werden, können eindeutig unter Verwendung des DL-Systems benannt werden. Jedoch können Verbindungen, die zwei oder mehr Chiralitätszentren aufweisen, in 2n möglichen stereoisomeren Konfigurationen vorliegen, wobei n die Zahl der Chiralitätszentren ist. Diese Stereoisomere werden manchmal unter Verwendung des RS-Systems benannt, um die Konfigurationen von Aminosäuren, die zwei oder mehr Chiralitätszentren enthalten, deutlicher anzugeben. Zum Beispiel können Verbindungen wie beispielsweise Threonin und Isoleucin zwei asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten und daher vier stereoisomere Konfigurationen aufweisen. Die Isomere von Verbindungen, die zwei Chiralitätszentren aufweisen, sind als Diastereomere bekannt. Eine vollständige Besprechung des RS-Systems zum Benennen von optischen Isomeren von Aminosäuren findet sich in Principles in Biochemistry, Herausgeber A.L. Lehninger, S. 99–100, a.a.O. Es folgt eine kurze Zusammenfassung dieses Systems.
Das RS-System wurde erfunden, um Zweideutigkeiten zu vermeiden, wenn eine Verbindung zwei oder mehr Chiralitätszentren aufweist. Im Allgemeinen wurde das System entworfen, um die vier verschiedenen Substituentenatome um ein asymmetrisches Kohlenstoffatom in der Reihenfolge absteigender Ordnungszahlen oder in der Reihenfolge von abnehmenden Valenzdichten anzuordnen, wenn die kleinste oder die die geringste Priorität aufweisende Gruppe direkt von dem Betrachter wegzeigt. Die verschiedenen Prioritätenreihenfolgen sind auf dem Gebiet wohlbekannt und auf Seite 99 des Lehrbuchs von Lehninger beschrieben. Wenn ein Abnehmen der Prioritätenreihenfolge im Uhrzeigersinn festgestellt wird, wird die Konfiguration um das Chiralitätszentrum als R bezeichnet; wenn ein Abnehmen der Prioritätenreihenfolge gegen den Uhrzeigersinn erfolgt, wird die Konfiguration als S bezeichnet. Dementsprechend wird jedes Chiralitätszentrum unter Verwendung dieses Systems benannt. Bei der Anwendung dieses Systems auf Threonin würde der Fachmann bestimmen, dass die Bezeichnung L-Threonin im RS-System (2S, 3R)-Threonin bezeichnet. Die traditionelleren Bezeichnungen L-, D-, L-allo und D-allo für Threonin werden seit langer Zeit allgemein verwendet und werden von Fachleuten auf dem Gebiet weiterhin verwendet. Jedoch wird das RS-System zunehmend verwendet, um die Aminosäuren zu benennen, besonders diejenigen, die mehr als ein Chiralitätszentrum aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die boroProlin-Verbindung eine Val-boroProlin-Verbindung. Eine „Val-boroProlin-Verbindung" bezeichnet eine Verbindung, bei der das C-terminale boroProlin kovalent über eine Peptidbindung gemäß der Standardpeptidchemie mit einem Valin-Aminosäurerest verbunden ist. Die Valin-Aminosäure ist optional weiterhin über eine Peptidbindung an zusätzliche Aminosäurereste gekoppelt, vorausgesetzt, dass die weiteren Aminosäurereste nicht die Fähigkeit der Val- boroProlin-Verbindung inhibieren, an CD26 zu binden. In einer bevorzugtesten Ausführungsform ist die Verbindung der Erfindung Val-boroPro (auch als „PT-100" bezeichnet). Aufgrund der in den Aminosäureresten und in dem Kohlenstoffatom, das an das Boratom angeheftet ist, vorhandenen chiralen Kohlenstoffatome kann Val-boroPro in mehreren isomeren Formen existieren: (a) L-Val-S-boroPro, (b) L-Val-R-boroPro, (c) D-Val-S-boroPro und (d) D-Val-R-boroPro. Die Verbindung ist bevorzugtererweise L-Val-SboroPro oder L-Val-R-boroPro. In analoger Weise können die anderen boroProlin-Verbindungen der Erfindung in verschiedenen isomeren Formen existieren; die Formen, in denen jedes Chiralitätszentrum einer Aminosäure eine „L-"Konfiguration aufweist und in dem das boroPro in der R- oder S-Konfiguration vorliegt, sind jedoch im Allgemeinen die bevorzugten Formen der Verbindungen.
Die ersten Zielkomponenten mit einer ersten reaktiven Gruppe P¹R¹ der Erfindung, die boroProlin-Peptide sind, können derart aufgefasst werden, dass sie die folgende Formel aufweisen:

(a) worin B Bor ist,
(b) worin jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird,
(c) worin -A3-A4 die Struktur
(d) worin D1-A1-A2- eine Aminosäure mit einer Struktur ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und

Diese Boroprolin-Peptide sind über Aminopeptidbindungen und/oder chemische Quervernetzungsagenzien mit der zweiten Zielkomponente P² verbunden, über die Aminosäureseitenkette R an, z. B., die Seitenkette des antigenen Peptides, um die oben beschriebenen Verbindungen, [P²(R²)_m]_n (L)_q-P¹R¹] zu bilden. Beispielhafte Peptide umfassen ein Autoimmunkrankheiten betreffendes antigenes Peptid, ein Infektionskrankheiten betreffendes antigenes Peptid und ein Allergiekrankheiten betreffendes antigenes Peptid. Die bevorzugten antigenen Peptide sind Peptide, die an einen T-Zellen-Oberflächenrezeptor oder an einen B-Zellen-Oberflächenrezeptor binden, z. B. TCR/CD3, CD2, CD4, CD8, CD10, CD26, CD28, CD40, CD45, B7.1 und B7.2.
Alternativ kann die reaktive Komponente ein Fluoralkylketon oder eine Phosphonatgruppe sein.
Die reaktiven Gruppen der Erfindung, die reaktive Fluoralkylketon-Gruppen sind, weisen die folgende Formel auf:
wobei G entweder H, F oder eine Alkylgruppe ist, die 1 bis 20 Kohlenstoffatome und optional Heteroatome enthält, die N, S oder O sein können. Wie hierin verwendet, weisen die reaktiven Gruppen der Erfindung, die Phosphonatgruppen sind, die folgende Formel auf:
wobei jedes J unabhängig O-Alkyl, N-Alkyl oder Alkyl (wobei jedes etwa 1–20 Kohlenstoffatome enthält) und optional Heteroatome, die n = N, S oder O sein können, ist.
Zusätzliche beispielhafte Prolinphosphonat-Derivate, die eine Perfluoralkylgruppe, eine Phenylgruppe oder eine substituierte Phenylgruppe enthalten und die gemäß der Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind diejenigen, die in US 5,543,396 (Powers '396) beschrieben sind. Andere Ketoamide, Ketacide und Ketoester, die nützliche reaktive Gruppen zum Reagieren mit dem aktiven Zentrum einer Protease (z. B. einer Serin- oder einer Cysteinprotease) sind, sind in PCT/US91/09801, „Peptides, Ketoamides, Ketacids, and Ketoesters", Anmelder: Georgia Tech Research Corp. („GA Tech") beschrieben, die die Priorität von US 635,287 , die am 28. Dezember 1990 eingereicht wurde, beansprucht.
Bei bestimmten Ausführungsformen sind die reaktiven Gruppen aus den Gruppen ausgewählt, die die Formeln
ein Alphaketoamid;
aufweisen, wobei R eine Alkyl-
oder Arylgruppe ist und substituiert oder unsubstituiert, ein Alphaketoester; und
eine Alphaketosäure sein kann.
Die reaktiven Gruppen der Erfindung umfassen auch die reaktiven Gruppen, die in der PCT/GB94/02615, „DPIV-Serine Protease Inhibitors" (Ferring) beschrieben sind. Diese umfassen die oben angegebenen Boronylgruppen [B(OH)₂], genauso wie Pyrrolidide und die folgenden reaktiven Gruppen, von denen jede substituiert oder nicht substituiert sein kann, vorausgesetzt, dass die Substitution die funktionale Aktivität der reaktiven Gruppe oder der bindenden Komponente, an die sie gebunden ist, nicht nachteilig beeinflusst: CN, C≡C, CHO und CN=NPh, wobei Ph Phenyl bedeutet. Diese Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Umfang der Erfindung beschränken sollen. Wie bei Ferring festgestellt, können Verbindungen, die diese repräsentativen reaktiven Gruppen enthalten, durch eine Abwandlung des allgemeinen Weges hergestellt werden, der von E. Schon et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler: 372:305–311 (1991) und von W.W. Bachovchin et al., J. Biol. Chem. 265:3738–3743 (1990) beschrieben wurde.
(Siehe auch die oben zitierten Bachovchin-US-Patente).
Die zweite Zielkomponente, P², bindet an ein Molekül, das auf der Oberfläche der gleichen oder einer anderen Zelle vorhanden ist, an die die erste Zielkomponente bindet. Bevorzugterweise bindet die zweite Zielkomponente an ein Molekül (z. B. einen Rezeptor, ein Molekül des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC), das auf der Oberfläche einer T-Zelle oder auf der Oberfläche einer B-Zelle vorhanden ist. Bei bestimmten Ausführungsformen weist die zweite Zielkomponente eine Struktur auf, die die Substratbindungsstelle einer Protease nachahmt, die auf einer an einer Modulation des Immunsystems beteiligten Zelle vorhanden ist. Somit kann die zweite Zielkomponente die gleiche sein wie die erste Zielkomponente, und die Verbindungen der Erfindung sind zum Quervernetzen von DPIV-Molekülen auf den gleichen oder auf verschiedenen Zellen nützlich. Zum Beispiel können die Verbindungen dieser Erfindung verwendet werden, um eine erste Protease (z. B. ein nach Prolyl spaltendes Enzym) auf einer ersten Zelle und eine andere Protease (z. B. ein Trypsin, Chymotrypsin, eine Elastase oder eine andere Serinprotease oder eine Cysteinprotease), die auf der Oberfläche der gleichen oder einer anderen zweiten Zelle exprimiert wird, querzuvernetzen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die erste und die zweite Zielkomponente identisch (d. h. P² = P¹), und die zweite reaktive Gruppe R² kann fehlen (d. h., m = 0), oder kann die gleiche wie oder eine andere als die erste reaktive Gruppe R¹ (d. h. R¹ ≠ R²) sein. Verbindungen, die identische P¹- und P²-Gruppen und identische R¹- und R²-Gruppen umfassen, werden als „Homokonjugate" bezeichnet. In noch weiteren Ausführungsformen, sind die erste und zweite Zielkomponente unterschiedlich, und diese Verbindungen werden als „Heterokonjugate" bezeichnet.
In noch weiteren Ausführungsformen ist die zweite Zielkomponente ein Antigen, das selektiv an ein MHC-Molekül auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle bindet. Solche Ausführungsformen der Erfindung sind zur Expansion von Antigen (z. B. Tumor-spezifischen T-Zellen nützlich. Somit können die oben beschriebenen DPIV-Inhibitoren, die eine zweite Zielkomponente, P², umfassen, die ein Antigen (z. B. ein Tumor-spezifisches Antigen) ist, gemäß eines verwandten Aspektes der Erfindung verwendet werden, um hämatopoetische Progenitorzellen (über die erste Zielkomponente P¹) der T-Zellen-Linie allgemein zu stimulieren, und gleichermaßen, um spezifisch eine, Untermenge der Population von T-Zellen des peripheren Blutes zu expandieren, um Antigen-spezifische T-Zellen zu erhalten. Insbesondere sind solche Verbindungen nützlich, um solche Untermengen der T-Zellen-Population zu expandieren und Antigen-spezifische T-Zellen anzureichern. Somit stellt die Erfindung ein verbessertes Verfahren bereit, das die Stimulierung hämatopoetischer Zellen mit der ex vivo-Expansion Antigen-spezifischer T-Zellen in synergistischer Weise verbindet. Dies wäre therapeutisch wirksam, um Immunreaktionen gegen übriggebliebene Tumorzellen, metastatische Zellen, auszulösen oder um die gegen Tumore gerichtete T-Zellen-Aktivität bei Homotransplantaten zu verstärken. Es könnte auch zur ex vivo-Expansion von peripheren Gedächtnis-T-Zellen verwendet werden, die spezifisch für Tumorantigene, Antigene von Krankheitserregern oder andere Antigene sind, die mit einem nachteiligen medizinischen Zustand verbunden sind. Somit umfassen die Antigene, die gemäß den vorstehenden Verfahren verwendet werden können, Antigene, die für Krankheitserreger charakteristisch sind, und Krebsantigene.
Die vorstehenden Verfahren und Zusammensetzungen sind ebenfalls für die ex vivo-Expansion von Stammzellen nach der Transfektion mit retroviralen oder anderen Vektoren nützlich, die eine heterologe Nukleinsäure (z. B. ein Antisense-Oligonukleotid, eine Nukleinsäure, die für ein therapeutisches Protein oder Peptid kodiert) für gentherapeutische Anwendungen enthalten. Stammzellen, in die ex vivo eine heterologe Nukleinsäure eingeführt wurde, können in ein Lebewesen unter Verwendung der bekannten Verfahren zum Implantieren transfektierter Zellen in einen Menschen zur Gentherapie eingeführt werden. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,399,346 („Gene Therapy"), das an Anderson et al. erteilt wurde; die internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/US92/01890 (Veröffentlichungsnummer WO 92/15676, „Somatic Cell Gene Therapy"), die die Priorität der US-Seriennummer 667,169, die am B. März 1991 eingereicht wurde, Erfinder I. M. Verma, beansprucht); die internationale PCT-Anmeldung Nr. PCT/US89/05575 (Veröffentlichungsnummer WO 90/06997, „Genetically Engineered Endothelial Cells and Uses Thereof", die die Priorität der US-Seriennummer 283,586 beansprucht, die am B. Dezember 1989 eingereicht wurde, Erfinder Anderson, W. F. et al.).
Antigene, die für Tumorantigene kennzeichnend sind, stammen typischerweise von der Zelloberfläche, aus dem Cytoplasma, dem Nukleus, den Organellen und dergleichen von den Zellen eines Tumorgewebes. Beispiele umfassen Antigene, die charakteristisch für Tumorproteine sind, einschließlich Proteine, die von mutierten Onkogenen kodieren sind, virale Proteine, die mit Tumoren verbunden sind, und Tumormuzine und -glycolipide umfassen. Tumore umfassen, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen aus den folgenden krebsbefallenen Stellen und Krebstypen: Lippe, Nasen-Rachen-Raum, Rachen- und Mundhöhle, Speiseröhre, Magen, Kolon, Rektum, Leber, Gallenblase, Gallengangsystem, Pankreas, Kehlkopf, Lunge und Bronchien, Melanome der Haut, der Brust, des Cervix, der Gebärmütter, der Gebärmutter, der Ovarien, der Blase, der Niere, des Gehirns und von anderen Teilen des Nervensystems, der Schilddrüse, der Prostata, der Hoden, Hodgkin'sche Krankheit, Non-Hodgin-Lymphom, multiples Myelom und Leukämie. Virale Proteine, die mit Tumoren verbunden sind, sind diejenigen aus den oben genannten Virenklassen. Antigene, die kennzeichnend für Tumore sind, können Proteine sein, die normalerweise nicht von einer Tumorvorläuferzelle exprimiert werden oder können ein Protein sein, das normalerweise in einer Tumorvorläuferzelle exprimiert wird, aber eine Mutation aufweist, die für einen Tumor kennzeichnend ist. Ein für einen Tumor kennzeichnendes Antigen kann eine mutierte Variante des normalen Proteins sein, die eine veränderte Aktivität oder subzelluläre Verteilung aufweist. Zusätzlich zu den oben spezifizierten können Mutationen von Genen, die Tumorantigene entstehen lassen, in den kodierenden Regionen, in 5'- oder 3'-nicht-codierenden Regionen oder Introns eines Gens liegen und können das Ergebnis von Punktmutationen, Leserahmenverschiebungen, Deletionen, Additionen, Vervielfältigungen, chromosomalen Umordnungen und dergleichen sein. Ein Fachmann auf dem Gebiet ist mit der breiten Vielzahl von Veränderungen der normalen Genstruktur und -expression vertraut, die Tumorantigene entstehen lassen. Spezifische Beispiele für Tumorantigene umfassen: Proteine wie den Ig-Idiotyp von B-Zellen-Lymphom, mutierte Cyclin-abhängige Kinase 4 aus einem Melanom, Pmel-17 (gp100) aus einem Melanom, MART-1 (Melan-A) aus einem Melanom, p15-Protein aus einem Melanom, Tyrosinase aus einem Melanom, MAGE 1, 2 und 3 aus einem Melanom, Drüsenmark, kleinzelliger Lungenkrebs, Kolon- und/oder bronchialer Schuppenzellkrebs, BAGE der Blase, Melanom, Brust und Schuppenzellkarzinom, gp75 von Melanom, onkofötales Antigen aus einem Melanom; Kohlenhydrate/Lipide wie beispielsweise mucl-Muzin aus Brust-, Pankreas- und Ovarienkrebs, GM2- und GD2-Ganglioside aus einem Melanom; Onkogene wie das mutierte p53 aus Karzinom; mutiertes ras aus Kolonkrebs und HER-2/neu Proto-Onkogen aus Brustkarzinom; virale Produkte wie die Proteine des menschlichen Papillomavirus aus Schuppenzellkrebsarten von Cervix und Ösophagus. Es wird auch vorgesehen, dass Tumorantigene aus Proteinen durch HLA-Moleküle als spezifische Peptide präsentiert werden, die aus dem ganzen Protein stammen. Das metabolische Verarbeiten von Proteinen, um antigene Peptide zu ergeben, ist auf dem Gebiet wohl bekannt; siehe z. B. US-Patent 5,342,774 (Boon et al.).
Bevorzugte Tumorantigene der Erfindung umfassen die Melanom-Tumorantigene (z. B. MAGE-Proteinfamilie (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3); MART-1 (Peptid 27-35); und gp100); und die Kolonkarzinomantigene (z. B. Peptide des mutierten APC-Genproduktes). Besonders bevorzugte Melanom-Tumorantigen-Sequenzen sind diejenigen, die von Slingluff et al., in Curr. Opin. in Immunol. 6:733–740 (1994) veröffentlicht wurden:
Berichten zufolge wurde die MAGE-Proteinfamilie auch mit mehr als einem Typ Karzinom in Verbindung gebracht: MAGE-1 (Melanom, Schilddrüsenmark und kleinzelliges Lungenkarzinom), MAGE-2 (Melanom, kleinzelliges Lungen-, Kolon-, Bronchialschuppenzell- und Schilddrüsenmark-Karzinom), und MAGE-3 (Melanom, kleinzelliges Lungen-, Kolon-, Bronchialschuppenzell- und Schilddrüsenmark-Karzinom). Siehe auch Morioka et al., „A Decapeptide (Gln-Asp-Leu-Thr-Met-Lys-Tyr-Gln-Ile-Phe) aus Human Melanoma Is Recognized by CTL in Melanoma Patients", J. Immunol. 153:5650 (1994), für zusätzliche Tumorantigene (z. B. P1A, Connexin 37, MAGE-1, MAGE-3, MART 1/Aa, gp100, Tyrosinase) und/oder Informationen, die die Gewebeverteilung von ausgewählten Tumorantigenen betreffen.
Besonders bevorzugte Tumorantigene, die Peptide des mutierten APC-Genproduktes sind, sind diejenigen, die von Townsend et al., in Nature 371:662 (1994) veröffentlicht wurden:
In alternativen Ausführungsformen ist die zweite Zielkomponente ein Ligand, der selektiv an auf der Oberfläche einer Zelle (bevorzugterweise einer T-Zelle oder einer B-Zelle) exprimierten Rezeptor bindet. Beispielhafte Rezeptoren, bei denen es natürlich vorkommende Liganden gibt, die durch die zweiten Zielkomponenten der Erfindung nachgeahmt werden können, umfassen Rezeptoren, die aus der folgenden Gruppe gewählt sind: CD2, TCR/C3, CD4, CD8, CD10, CD26, CD28, CD40, CD44, CD45, B7.1 und B7.2. Gemäß noch weiteren Ausführungsformen ist die zweite Zielkomponente ein Antikörper oder Antikörperfragment, das selektiv an ein auf der Zelloberfläche exprimiertes Epitop bindet. Das Epitop kann ein Teil von jedem der vorstehenden Rezeptoren sein.
Ungeachtet der Natur des Ziels der zweiten Zielkomponente (z. B. Protesae, Rezeptor,MHC-Komplex, Epitop) können Phage display- und andere Arten von kombinatorischen Bibliotheken auf eine Weise gescreent werden, die analog zu der oben beschriebenen ist, um nicht natürlich vorkommende Zielkomponenten zu identifizieren, die dahingehend nützlich sind, dass sie Verbindungen der Erfindung darstellen.
DPIV-bindende Agenzien, die nicht an das aktive Zentrum binden, sind Agenzien, die (i) selektiv an DPIV an einer Stelle binden, die nicht das aktive Zentrum ist, und (ii) in der Lage sind, hämatopoetische Zellen und/oder Thymozyten unter den hierin beschriebenen Bedingungen zu stimulieren. Bestimmte DPIV-bindende Agenzien, die nicht an das aktive Zentrum binden (z. B. nicht-kompetitive DPIV-Inhibitoren) können auch die enzymatische Aktivität von DPIV inhibieren. Die Inhibition der enzymatischen Aktivität von DPIV kann z. B. durch die Messung der proteolytischen Spaltungsenzymaktivität von DPIV in Anwesenheit und Abwesenheit von einem mutmaßlichen DPIV-Inhibitor und durch das Bestimmen, ob der Inhibitor eine solche enzymatische Aktivität von DPIV inhibiert, bewertet werden. Bevorzugterweise sind solche bindenden Agenzien isolierte Polypeptide, die selektiv an das DPIV binden, bewertet werden. Isolierte bindende Polypeptide umfassen Antikörper und Fragmente von Antikörpern (z. b. Fab, F(ab)₂, Fd und Antikörperfragmente, die eine CDR3-Region umfassen, die selektiv an das DPIV bindet). Bevorzugte isolierte bindende Polypeptide sind diejenigen, die an ein Epitop binden, das sich an oder nahe der katalytischen Stelle des DPIV befindet.
Daher gehört zur Erfindung die Verwendung von Antikörpern oder Fragmenten von Antikörpern, die die Fähigkeit haben, selektiv an DPIV zu binden und hämatopoetische Zellen und/oder Thymozyten unter den hierin offenbarten Bedingungen zu stimulieren. Antikörper umfassen polyklonale und monoklonale Antikörper, die gemäß üblichen Methoden hergestellt sind.
Bemerkenswerterweise ist, wie auf dem Gebiet wohl bekannt ist, nur ein kleiner Teil eines Antikörpermoleküls, das Paratop, an der Bindung des Antikörpers an sein Epitop beteiligt (Siehe allgemein Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, L (1991) Essential Immunology, 7. Aufl., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Die pFc'- und Fc-Regionen sind zum Beispiel Effektoren der Komplementkaskade, aber nicht an der Antigenbindung beteiligt. Ein Antikörper, von dem die pFc'-Region enzymatisch abgespaltet wurde, oder der ohne die pFc'-Region hergestellt wurde und als ein F(ab')₂-Fragment bezeichnet wird, behält beide der Antigen-bindenden Stellen eines intakten Antikörpers. In ähnlicher Weise behält ein Antikörper, von dem die Fc-Region enzymatisch abgespaltet wurde, oder der ohne die Fc-Region hergestellt wurde und als Fab-Fragment bezeichnet wird, eine der Antigen-bindenden Stellen eines intakten Antikörpermoleküls. Fab-Fragmente bestehen aus der kovalent gebundenen leichten Kette eines Antikörpers und einem Teil der schweren Kette des Antikörpers, der als Fd bezeichnet wird. Die Fd-Fragmente sind die Elemente, die im Wesentlichen die Antikörperspezifität bestimmen (ein einzelnes Fd-Fragment kann mit bis zu zehn verschiedenen leichten Ketten verbunden sein, ohne dass die Spezifität des Antikörpers verändert wird), und Fd-Fragmente behalten bei der Isolierung ihre Fähigkeit, Epitope zu binden.
Wie auf dem Gebiet wohlbekannt ist, gibt es innerhalb des Antigen-bindenden Teils eines Antikörpers Komplementarität-bestimmende Regionen (CDRs), die mit dem Epitop des Antigens direkt wechselwirken, und Gerüstregionen (FRs), die die Tertiärstruktur des Paratops aufrechterhalten (siehe allgemein Clark, 1986; Roitt, 1991). Sowohl beim Fd-Fragment der schweren Kette als auch bei der leichten Kette von IgG-Immunoglobulinen gibt es vier Gerüstregionen (FR1 bis FR4), die jeweils durch drei Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDR1 bis CDR3) getrennt sind. Die CDRs, und spezifisch die CDR3-Regionen und spezifischer die schwere Kette CDR3 sind weitgehend für die Antikörperspezifität verantwortlich.
Es gilt auf dem Gebiet mittlerweile als gesichert, dass die nicht-CDR-Regionen eines Säugetierantikörpers durch ähnliche Regionen von nicht zur gleichen Art gehörenden oder heterospezifischen Antikörpern ersetzt werden können, wobei die Epitop-Spezifität des ursprünglichen Antikörpers erhalten bleibt. Dies äußert sich am deutlichsten bei der Entwicklung und Verwendung „humanisierter" Antikörper, bei denen nicht-menschliche CDRs kovalent mit menschlichen FR- und/oder Fc/pFc'-Regionen verknüpft sind, um einen funktionellen Antikörper herzustellen. So lehrt zum Beispiel die internationle PCT-Veröffentlichungsnummer WO 92/04381 die Herstellung und Verwendung von humanisierten murinen RSV-Antikörpern, bei denen mindestens ein Teil der murinen FR-Regionen durch FR-Regionen menschlichen Ursprungs ersetzt sind. Solche Antikörper, die Fragmente von intakten Antikörpern mit Antigen-bindenden Fähigkeiten umfassen, werden häufig als „chimäre" Antikörper bezeichnet.
Daher stellt die vorliegende Erfindung, wie für den Fachmann auf dem Gebiet offenkundig sein wird, auch F(ab')₂-, Fab-, Fv- und Fd-Fragmente; chimäre Antikörper, bei denen die Fc- und/oder FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder Leichtketten-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht menschliche Sequenzen ersetzt sind; chimäre F(ab')₂-Fragment-Antikörper, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder Leichtketten-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht menschliche Sequenzen ersetzt sind; chimäre Fab-Fragment-Antikörper, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2- und/oder Leichtketten-CDR3-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt sind; und chimäre Fd-Fragment-Antikörper bereit, bei denen die FR- und/oder CDR1- und/oder CDR2-Regionen durch homologe menschliche oder nicht-menschliche Sequenzen ersetzt sind. Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls so genannte Einzelketten-Antikörper. Somit umfasst die Erfindung Polypeptide zahlreicher Größen und Arten, die spezifisch an DPIV binden und ihre funktionelle Aktivität inhibieren. Diese Polypeptide können auch aus anderen Quellen als der Antikörpertechnologie stammen. Zum Beispiel können solche bindenden Polypeptidagenzien durch Bibliotheken aus degenerierten Peptiden bereitgestellt sein, die leicht in Lösung, in immobilisierter Form oder als Phage-display-Bibliotheken hergestellt werden können. Kombinatorische Bibliotheken können auch aus Peptiden, die eine oder mehr als eine Aminosäure enthalten, synthetisiert sein. Bibliotheken können weiterhin aus Peptiden und nicht-peptidischen synthetischen Komponenten hergestellt sein.
Phage display kann beim Identifizieren bindender Peptide, die gemäß der Erfindung nützlich sind, besonders wirksam sein. Kurz gesagt stellt man unter Verwendung gewöhnlicher Vorgehensweisen eine Phagenbibliothek her (z. B. unter Verwendung des m13-, fd- oder lambda-Phagen), die eingebaute Stücke aus 4 bis etwa 80 Aminosäureresten aufweist. Die eingebauten Stücke können eine völlig degenerierte oder verzerrte Anordnung repräsentieren. Anschließend kann man Phagen-tragende eingebaute Stücke selektieren, die an das DPIV binden. Dieser Vorgang kann über mehrere Zyklen der wiederholten Selektion von Phagen, die an das DPIV binden, wiederholt werden. Wiederholte Runden führen zur Anreicherung von Phagen, die bestimmte Sequenzen tragen. Eine Analyse durch DNA-Sequenzierung kann dann durchgeführt werden, um die Sequenzen der exprimierten Polypeptide zu bestimmen. Der minimale lineare Teil der Sequenz, die an DPIV bindet, kann bestimmt werden. Man kann die Vorgehensweise unter Verwendung einer verzerrten Bibliothek wiederholen, die eingebaute Stücke enthält, die einen Teil der oder den gesamten minimalen linearen Teil plus einen oder mehr als einen stromaufwärtigen oder stromabwärtigen, zusätzlichen degenerierten Rest enthalten. Somit kann DPIV, eine extrazelluläre Domäne davon oder dergleichen verwendet werden, um Peptidbibliotheken zu screenen, die Phage display-Bibliotheken umfassen, um peptidische Bindungspartner des extrazellulären Teils von DPIV zu identifizieren und zu selektieren. Solche selektierten Moleküle können anschließend in Screeningtests untersucht werden, bei denen die Fähigkeit der bindenden Agenzien gemessen wird, die funktionelle Aktivität von DPIV zu inhibieren, z. B. die enzymatische funktionale Aktivität von DPIV, oder die Stimulierung des Wachstums und/oder die Differenzierung hämatopoetischer Zellen zu stimulieren.
Die oben beschriebenen bindenden Agenzien, die selektiv an DPIV binden, sind direkt oder indirekt (über ein Verbindungsmolekül) an ein Kulturgefäß oder eine andere Oberfläche unter Verwendung der gleichen Arten chemischer Reaktionen gebunden, die oben im Zusammenhang mit der Bindung von Inhibitoren des aktiven Zentrums von DPIV an solche Oberflächen beschrieben sind.
Ein Verbindungsmolekül ist in einer Weise kovalent an die erste und (optional) zweite Zielkomponente, P¹ und (optional) P² gebunden, die die Fähigkeit dieser Komponenten, an ihre jeweiligen addressierten Bindungspartner zu binden, nicht nachteilig beeinflusst. Bevorzugterweise umfassen solche Verbindungen eine funktionellele Gruppe zum Binden der Zielkomponenten an ein Kulturgefäß, an eine andere Oberfläche und/oder zusätzliche Zielkomponenten. Das bevorzugte Verbindungsmolekül L weist eine Länge auf, die derart beschaffen ist, dass seine Anordnung zwischen einer bindenden Komponenten und einer zweiten bindenden Komponente oder Oberfläche eine minimale Länge von etwa 20 Ångström zwischen den Komponenten oder zwischen der Komponente und der Oberfläche ergibt. Bevorzugterweise beträgt diese Distanz 20 bis 60 Ångström, bevorzugtererweise 30 bis 50 Ångström. Beispielhafte Verbindungsmoleküle, einschließlich einer Beschreibung der Zusammensetzung, Größe der Verbindungsmoleküle und Vorgehensweisen zum Koppeln des Verbindungsmoleküls an die Zielkomponenten, sind unten bereitgestellt. Im Allgemeinen sind solche Verbindungsmoleküle im Handel erhältlich (siehe z. B. Katalog und Handbuch von Pierce, Rockford, I11.) und werden unter Verwendung von gewöhnlichen Kopplungsprozeduren, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, an die Zielkomponenten gekoppelt.
Im Allgemeinen enthalten die Verbindungsmoleküle L mindestens zwei reaktive Gruppen. Homobivalente Quervernetzer können zwei gleiche reaktive Gruppen enthalten, und heterobivalente Quervernetzer enthalten zwei verschiedene reaktive Gruppen. Es sind zusätzliche multivalente Verbindungsmoleküle verfügbar, die mehr als zwei reaktive Gruppen enthalten, die gleiche Gruppen (homomultivalent) oder verschiedene Gruppen (heteromultivalent) sein können. Typischerweise koppeln die Verbindungsmoleküle die Zielkomponente P¹ über eine Amino- oder Sulfhydrylgruppe an die zweite Zielkomponente oder Oberfläche, weil solche funktionellen Gruppen üblicherweise in Proteinen und Polymeren gefunden werden, die verwendet werden, um Trägermaterialien zur Immobilisierung von Proteinen zu bilden. Amin-reaktive Gruppen umfassen Imidoester und N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)-Ester. Sulhydryl-reaktive Gruppen umfassen Maleimide, Alkyl- und Aryl-Halide, α-Haloacetyle und Pyridyldisulfide. Die Mehrheit der im Handel erhältlichen heterobivalenten Quervernetzer enthält eine Amin-reaktive funktionelle Gruppe. Quervernetzer, die an einem Ende Amin-reaktiv und am anderen Ende Sulhydryl-reaktiv sind, sind durchaus üblich. Es sind andere Verbindungsmoleküle im Handel erhältlich, die die Zielkomponente P¹ kovalent an eine weitere Zielkomponente, Oberfläche oder zusätzliche Zielkomponente über andere reaktive Gruppen als Amino- oder Sulfhydryl-Gruppen kovalent binden, z. B. über Hydroxyle, Carboxyle, Phenole oder Kohlenhydrat-Gruppen. Carbodiimide können auch verwendet werden, um Carboxyle an primäre Amine oder Hydrazide zu binden, was zur Bildung von Amid- oder Hydrazon-Bindungen führt.
Proteine, Peptide und andere Moleküle können zur Verwendung gemäß der Verfahren der Erfindung auf Festphasen-Matrizen immobilisiert werden. Die Matrizen können aus Agarose, Kügelchen aus Polymeren, Polystyrolplatten oder -kugeln, porösem Glas oder Glasplättchen und Nitrozellulose oder aus anderen Membranmaterialien bestehen. Manche Trägermaterialien können zum direkten Koppeln an einen Liganden aktiviert werden. Andere Trägermaterialien werden mit nukleophilen oder anderen funktionellen Gruppen hergestellt, die unter Verwendung von Quervernetzern mit Proteinen oder anderen Liganden vernetzt werden können.
Die Immobilisierung der DPIV-Inhibitoren der Erfindung auf Festphasen-Trägermaterialien kann unter Verwendung von routinemäßigen Kopplungsreaktionen erreicht werden. Im Allgemeinen werden die Verbindungen der Erfindung dadurch immobilisiert, dass die Verbindungen eine zugängliche erste funktionelle Gruppe (z. B. eine Alkoholgruppe) umfassen, und die Verbindung mit einem Festphasen-Trägermaterial kontaktiert wird, das eine komplementäre zweite funktionelle Gruppe (z. B. Carboxylgruppen) enthält, unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die ausreichend sind, um zu erlauben, dass die erste und die zweite funktionelle Gruppe miteinander unter Bildung einer kovalenten Gruppe (z. B. Esterbindung) reagieren. „Zugänglich" in Zusammenhang mit einer funktionellen Gruppe bedeutet, dass die funktionelle Gruppe in einer Form vorliegt, die reaktiv ist, und die nicht sterisch daran gehindert ist, mit dem Festphasen-Trägermaterial zu reagieren. Das Anheften kann direkt oder indirekt (d. h. über ein Verbindungsmolekül L) erfolgen.
Die funktionellen Gruppen zur Immobilisierung der Verbindungen der Erfindung an ein Festphasen-Trägermaterial können in die peptidischen Bindungskomponenten oder die
Verbindungsmolekülteile dieser Verbindungen eingeführt werden. Zum Beispiel können Aminosäuren, die funktionelle Gruppen in ihren Seitenketten umfassen (z. B. Aspartat, Glutamat, Cysteinreste), während der Synthese in die peptidische Bindungskomponente eingebaut und in einer ausreichenden Entfernung zur reaktiven Gruppe, die an das Zielprotein bindet, angeordnet werden, um eine unerwünschte sterische Hinderung durch das Festphasen-Trägermaterial bei der Reaktion zwischen der Verbindung und ihrem Zielprotein zu verhindern. Alternativ können die Verbindungen der Erfindung über eine funktionelle Gruppe im Verbindungsmolekül auf ein Festphasen-Trägermaterial immobilisiert werden. Somit können die Verbindungsmoleküle, die verwendet werden, z. B. zusätzlich zur ersten und zweiten reaktiven Gruppe des Verbindungsmoleküls zum Binden der ersten und der zweiten peptidischen Bindungskomponente eine weitere funktionelle Gruppe zum Binden an das Festphasen-Trägermaterial enthalten. Ein beispielhaftes multivalentes (trivalentes) Verbindungsmolekül dieser Art ist unten veranschaulicht. Solche multivalenten Verbindungsmoleküle sind im Handel erhältlich und können durch den Fachmann auf dem Gebiet unter Verwendung von lediglich routinemäßigem Experimentieren synthetisiert
Um Seitenreaktionen zu verhindern, ist bevorzugt, dass die zum Koppeln des Verbindungsmoleküls an die peptidische Bindungskomponente verwendeten reaktiven Gruppen des Verbindungsmoleküls andere als die funktionellen Gruppen sind, die verwendet werden, um das Verbindungsmolekül an das Festphasen-Trägermaterial zu koppeln. Solche funktionellen Gruppen können zu jeder Zeit während oder nach der Synthese dieser Moleküle in die Verbindungsmoleküle eingeführt werden. Somit können im Allgemeinen die gleichen Arten von funktionellen Gruppen, Schutz/Entschützungs-Reaktionen und Reagenzien und Reaktionsbedingungen, die in der Technik für die Verwendung von Verbindungsmolekülen etabliert sind, um, z. B., Proteine oder Peptide miteinander oder an Festphasenträger zu koppeln, verwendet werden, um die Verbindungen der Erfindung auf einem Festphasen-Trägermaterial zu immobilisieren.
Am Ende umfasst die detaillierte Beschreibung Tabellen, die eine repräsentative Auswahl im Handel erhältlicher Quervernetzer zeigen, z. B. aus dem Katalog und Handbuch von Pierce, Rockford, I11. Die Tabelle zeigt auch, mit welcher Gruppe das Verbindungsmolekül reagiert, z. B: Sulfhydryle, Carboxyle.
Eine Vielzahl von Kulturgefäßen kann verwendet werden. Im Handel erhältliche Inkubationsgefäße umfassen Rührkolben (Corning, Inc., Corning, NY), Rührkesselreaktoren (Verax, Libanon, NH), Druckluftreaktoren, Suspensionszellreaktoren, Zelladsorptionsreaktoren und Zelleinschlußreaktoren, Petrischalen, Multi-Reaktionsnapf-Platten, Flaschen, Beutel und Hohlfaservorrichtungen, Zellschaum (Cytomatrix), Maxisorb-Platten (NUNC) und Zellkultursysteme (z. B. Aastrom Cell Production System, siehe auch US-Patent Nr. 5,635,386, mit dem Titel „Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture", das an Palsson et al. erteilt wurde, und US-Patent Nr. 5,646,043 mit dem Titel „Methods for the ex vivo replication of human stem cells and/or expansion of human progenitor cells", erteilt an Emerson et al.). Die Aastrom-Kultivierungsvorrichtung ist eine Inkubationskammer zur Expansion menschlicher Stammzellen ex vivo unter Verwendung eines spezifischen Kultursystems mit Mediumaustausch. Die Vorrichtung ist Berichten zufolge zum Expandieren aller Arten von hämatopoetischen Zellen nützlich, die z. B. Stammzellen, Progenitorzellen, Stromazellen, aber nicht lymphoide Zellen umfassen. Im Allgemeinen werden die Zellkulturen unter Verwendung der oben angegebenen Kulturgefäße und durch eine Vielzahl von Methoden in Suspension gehalten, die Rühren, Bewegen, oder Suspension mit Hilfe von Kügelchen umfassen. Im Allgemeinen werden solche Gefäße aus einem oder mehr als einem der folgenden Bestandteile hergestellt: Polystyrol, Polypropylen, Acryl, Nylon und Glas. In den Ausführungsformen, bei denen die erste Zielkomponente P¹ an die Oberfläche von einem Kulturgefäß gebunden ist, werden gewöhnliche Immobilisierungsverfahren verwendet, um die Komponente entweder direkt oder über ein Verbindungsmolekül L an die Oberfläche zu binden.
Die oben aufgelisteten unlöslichen Matrizen besitzen selbst keine funktionellen Gruppen für die Bindung der Verbindungen der Erfindung und müssen deshalb chemisch modifiziert werden, ein Vorgang, der als Aktivierung bekannt ist. Zum Beispiel kann Polystyrol durch Chlormethylierung der Phenylreste aktiviert werden (Pierce Chemical Company Katalog und Handbuch; Combinatorial Peptide & Nonpeptide Libraries. A Handbook VCH Weinheim Ed. Giuntha Jung – 1996 – Kapitel 16 & 17), um Chlormethyl-Polystyrol zu ergeben. Anschließend kann die reaktive benzylische funktionelle Chlorgruppe ausgenutzt werden, um Carboxylat-, Amino-, Hydroxyl-, Maleimid-, Sulhydryl-, N-Sukzinimidyl- und viele andere funktionelle Gruppen einzuführen. Das Einführen der funktionellen Gruppen erlaubt anschließend, Reaktionen auszuführen, die das kovalente Binden von Verbindungen der Erfindung entweder direkt oder über eine Verbindungsmolekül-Spacer-Einheit erlauben. Die Verbindungsreaktionen erfordern kompatible funktionelle Gruppen auf der Matrix und dem Liganden oder der Spacer-Verbindungsmolekül-Gruppe, die an die Verbindung der Erfindung gebunden ist oder werden wird. Zum Beispiel erlaubt die Einführung einer Carboxylatgruppe auf der Matrix das kovalente Binden an freie Aminogruppen. Ein Polystyrol, das derart derivatisiert ist, dass es Carboxylatgruppen trägt, kann durch das Koppeln an die freie ε-Aminogruppe der Lys-Seitenkette oder durch ein Spacer-Verbindungsmolekül, das eine freie Aminogruppe aufweist, direkt kovalent an Lys-boroPro gebunden sein. Alternativ kann ein Polystyrol, das derart derivatisiert ist, dass es eine Aminogruppe trägt, beispielsweise an LysboroPro durch das Koppeln mit einem Spacer-Verbindungsmolekül gebunden sein, das zwei Carboxylatgruppen enthält, eine, um an die ε-Aminogruppe von Lys-boroPro zu koppeln, die andere, um an die Aminogruppe des Amino-derivatisierten Polystyrols zu binden.
Die Reaktionen, die zu einem derartigen Koppeln (ihren, sind wohlbekannt und in vielen Quellen beschrieben, die die Kataloge von Firmen wie Pierce Chemical umfassen, die sowohl die aktivierten und nicht aktivierten Matrizen als auch die Verbindungsmolekül-Spacer-Moleküle verkaufen. Andere Lieferanten umfassen unter anderem Sigma, Novabiochem. Verfahren zum Binden von Liganden sind oben bezüglich Polystyrol beschrieben, es sind aber spezifische Verfahren für die anderen oben aufgelisteten Matrices verfügbar, wohlbekannt, und in Quellen wie denjenigen beschrieben, die oben und in Immobilized Affinity Ligand Techniques. „All the 'recipes' for successful affinity matrix preparation"; Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, von Shan S. Wong beschrieben sind.
Die Matrizen sind in verschiedenen Formen im Handel erhältlich, die Kügelchen und magnetische Kügelchen umfassen, die die besonders einfache Entfernung des an die Matrix gebundenen Liganden erlauben.
Avidin-Biotin-Reaktionen stellen eine andere Möglichkeit bereit, das gleiche Endergebnis zu erzielen, nämlich das Binden der Verbindungen der Erfindung an unlösliche Matrizen. Biotin kann z. B. leicht an die ε-Aminogruppe von Lys-boroPro gebunden werden und das sich daraus ergebende Konjugat wird mit hoher Affinität an Avidin oder Streptavidin binden. Eine breite Auswahl unlöslich gemachter Derivate von Avidin und Streptavidin sind im Handel erhältlich (Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook – Entwickelt von den Experten der technischen Unterstützung von Pierce).
Alternativ kann die Zielkomponente P¹ an eine partikuläre Form (z. B. einen Partikel oder eine Membran) gebunden sein, die eine Oberfläche aufweist, an die die Zielkomponente direkt oder indirekt gebunden wird. Beispielhafte Materialien, die verwendet werden können, um solche Partikel zu bilden, umfassen Nitrozellulose, Agarose, Sepharose und andere Arten von Trägermaterialien, an die Liganden routinemäßig gebunden werden, um z. B. Affinitätschromatographie-Materialien herzustellen. In den bevorzugten Ausführungsformen ist der Partikel ein magnetischer Partikel, wie beispielsweise in den US-Patenten mit den Nummern 4,554,088, erteilt an Whitehead et al. mit dem Titel „Magnetic Particles for use in separations"; 5,382,468, erteilt an Chagnon et al., mit dem Titel „Degradable magnetic microclusters and methods for making them"; 4,454,234, erteilt an Czerlinkski, mit dem Titel „Coated magnetizable microparticles, reversible suspensions thereof and processes related thereto"; 4,795,698, erteilt an Owen et al., mit dem Titel „Magnetic-polymer particles"; und 4,582,622, erteilt an Ikeda et al. mit dem Titel „Magnetic particulate for immobilization of biological protein and process of producing the same", beschrieben.
Ein Apparat zum Praktizieren des oben beschriebenen Verfahrens wird bereitgestellt. Der Apparat enthält einen Behälter, und einen Inhibitor von DPIV, der darin enthalten oder darin gebunden ist. Bevorzugterweise ist der Behälter ein steriler Behälter. Der DPIV-Inhibitor kann wie oben beschrieben in löslicher oder unlöslicher Form vorliegen. Damit kann der DPIV-Inhibitor in dem Behälter z. B. in einem trockenen Zustand (z. B. lyophilisiert), ungebunden oder an die Oberfläche des Behälters gebunden sein und an den Endverbraucher in steriler Form verkauft werden, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontaminierung durch den Endverbraucher (z. B. wenn der Inhibitor in den Behälter eingeführt wird) zu minimieren, und um weiterhin die Wahrscheinlichkeit eines Aktivitätsverlustes des Inhibitors zu minimieren (z. B. durch Bereitstellen des Inhibitors in einem trockenen Zustand, der bei der Lagerung mit geringerer Wahrscheinlichkeit Aktivität verlieren wird). Alternativ kann der DPIV-Inhibitor an einen Partikel wie beispielsweise einen magnetischen Partikel gebunden sein, und dieser Partikel kann dann in trockenem Zustand in einem getrennten Gefäß verkauft oder in dem Behälter zur Zellkultur bereitgestellt werden.
Es wird ein Kit zur Stimulierung des Wachstums und/oder der Differenzierung hämatopoetischer Zellen in vitro bereitgestellt. Der Kit umfasst den oben beschriebene Apparat zusammen mit Anweisungen zur Verwendung des Apparats, um das Wachstum und/oder die Differenzierung hämatopoetischer Zellen in vitro zu stimulieren. Optional enthält der Kit weiterhin die angemessenen zusätzlichen Wachstumsnährstoffe zum Kultivieren der hämatopoetischen Zellen. Solche Nährstoffe können in flüssigem oder trockenem Zustand in dem Behälter des Apparats oder in einem getrennten Container bereitgestellt sein, dessen Inhalt zum Zeitpunkt der Kultivierung der Zellen zu dem Apparat hinzugegeben werden kann.
Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zur Expansion Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro bereitgestellt.
Unten sind drei Ausführungsformen dieses Verfahrens beschrieben, um es zu veranschaulichen. Im Allgemeinen unterscheiden sich die Ausführungsformen voneinander hinsichtlich der Selektion der hämatopoetischen Zellen, die in vitro stimuliert werden. Bei jedem Verfahren wird mindestens ein Kultivierungsschritt/einer der Kultivierungsschritte in Abwesenheit von hinzugefügten Zytokinen oder Stromazellen durchgeführt. Die bei jeder Ausführungsform verwendeten bevorzugten Heterokonjugate enthalten ein Tumor-spezifisches Antigen oder ein Krankheitserreger-spezifisches Antigen.
Die erste Ausführungsform des Verfahrens zum Erhalten Antigen-spezifischer T-Zellen umfasst das Stimulieren von Knochenmarkzellen in einer Kultur. Die Knochenmarkzellen in der Kultur können eine Mischung von Zellen umfassen; bevorzugterweise sind die Knochenmarkzellen in der Kultur jedoch isolierte CD34+-Zellen oder isolierte Stammzellen. Gemäß dieser Ausführungsform gehört zu dem Verfahren: (1) das Kultivieren der Knochenmarkzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors (z. B. eines DPIV-Monomers und/oder -Homokonjugats), um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie in Kultur zu expandieren; und (2) das Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, das einen an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebundenen DPIV-Inhibitor enthält, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur zu expandieren. Schritt (2) kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden. Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder sequenziell durchgefihrt werden. Im Allgemeinen wird die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen mit einer Kontrollkultur aus Knochenmarkzellen verglichen, die wie bei den Schritten (1) und (2) beschrieben behandelt wird, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht mit dem Heterokonjugat kontaktiert wird. Bei jedem Schritt werden die Zellen in Anwesenheit des DPIV-Inhibitors oder des Heterokonjugates für eine Zeitdauer kultiviert, die ausreichend ist, um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie zu erhöhen bzw. die Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen zu erhöhen, jeweils in Bezug auf die Zahlen solcher Zellen, die in der Kontrollkultur vorhanden sind.
Die zweite Ausführungsform ist auf das Stimulieren von Nabelschnurblutzellen in Kultur gerichtet. Diese Ausführungsform umfasst: (1) das Kultivieren der Nabelschnurblutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors (z. B. eines DPIV-Monomers und/oder -Homokonjugats), um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie in der Kultur zu expandieren; und (2) das Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie mit einem Heterokonjugat, das einen an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebundenen DPIV-Inhibitor enthält, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen, die in der Kultur vorhanden sind, zu erhöhen. Schritt (2) kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden. Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen mit einer Kultur von Nabelschnurzellen verglichen, die wie in den Schritten (1) und (2) behandelt wurde, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht mit dem Heterokonjugat kontaktiert wird. Bei jedem Schritt werden die Zellen in Anwesenheit des DPIV-Inhibitors oder des Heterokonjugates für eine Zeitdauer kultiviert, die ausreichend ist, um die Zahl der frühen Zellen der T-Linie zu erhöhen bzw. die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen zu expandieren, jeweils in Bezug auf die Zahlen solcher Zellen, die in der Kontrollkultur vorhanden sind.
Die dritte Ausführungsform ist auf das Stimulieren von Stammzellen des peripheren Blutes in einer Kultur gerichtet. Diese Ausführungsform umfasst: (1) das Kultivieren der Stammzellen des peripheren Blutes in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors (z. B, eines DPIV-Monomers und/oder -Homokonjugates), um die Zahl der T-Zellen in der Kultur zu erhöhen; und (2) das Kultivieren der T-Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, das einen an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebundenen DPIV-Inhibitor enthält, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur zu expandieren. Schritt (2) kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden. Die Schritte (1) und (2) können gleichzeitig oder sequenziell durchgeführt werden. Im Allgemeinen wird die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen mit einer Kontrollkultur aus Stammzellen des peripheren Blutes verglichen, die wie in den Schritten (1) und (2) beschrieben behandelt ist, mit der Ausnahme, dass die Kontrollkultur nicht mit dem Heterokonjugat kontaktiert wird. Bei jedem Schritt werden die Zellen in Anwesenheit des DPIV-Inhibitors oder des Heterokonjugates für eine Zeitdauer kultiviert, die ausreichend ist, um die Zahl der T-Zellen zu erhöhen bzw. die Zahl der Antigen-spezifischen Zellen zu expandieren, jeweils in Bezug auf die Zahlen solcher Zellen, die in der Kontrollkultur vorhanden sind. Weil bekannt ist, dass peripheres Blut T-Zellen enthält, ist es alternativ möglich, die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur ohne den Stimulierungsschritt (1) zu expandieren, d. h. zum Verfahren zum Expandieren der Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen gehört das Kultivieren der Zellen des peripheren Blutes mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugates, das einen an ein antigenes Peptid (z. B. ein Tumor- oder ein Krankheitserreger-spezifisches Antigen) gebundenen DPIV-Inhibitor enthält, um die Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur zu erhöhen. Dieser Schritt kann in Anwesenheit oder Abwesenheit des spezifischen Antigens durchgeführt werden.
Eine beispielhafte Vorgehensweise zum Kontaktieren mehrerer repräsentativer DPIV-Inhibitoren wird unten angegeben.

1. Gewubbe Knochenmark oder Nabelschnurblut in einem mit Heparin behandelten Röhrchen (grüner Verschluss). Kann bis zur Verwendung innerhalb von 48 Stunden bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Mische Mark/Blut 1:1 mit Phosphat-gepufferter Saline, pH 7,4 (PBS), die bei 4°C gelagert wurde.
3. Schichte die Blut-PBS-Mischung vorsichtig auf eine doppelte Volumenmenge Histopaque (Sigma), das bei 4°C gelagert wurde.
4. Zentrifugiere bei 400 g 20 Minuten lang bei 37°C.
5. Sammle die Zellen an der Grenzfläche vorsichtig und wasche sie 2x in kaltem PBS.
6. Zähle lebensfähige Zellen unter Verwendung von Trypanblau.
7. Bereite die Zellen als 1 ml-Kulturen in Plastikkulturröhrchen (oder Mikrotiterplatten mit 96 oder 24 Reaktionsnäpfen) bei einer Konzentration von 104 Zellen/ml in CellGro Iscove's Modified Dulbecco's-Medium (Meditech), das Kanamycin (5 μg/ml), die erwünschte Konzentration von Xaa-boroPro oder einer anderen Verbindung der Erfindung enthält und bei Abwesenheit oder Anwesenheit von Giant Cell Tumor-Conditioned Medium (GCT-CM, Origen) als Quelle für Wachstumsfaktoren vor. Xaa-boroPro oder andere Verbindungen der Erfindung sollten in Medium verdünnt und erst nachdem die Zellen in dem Kulturröhrchen sind, hinzugegeben werden.
8. Die Zellen werden bei 37°C in einem feuchten Inkubator kultiviert, der 5 % CO₂ enthält.
9. Zu erwünschten Zeitpunkten werden Zellaliquots entfernt und gezählt.
10. Das Zählen kann unter dem Mikroskop (direkt) oder unter Verwendung des MTT-Tests (kolorimetrischer Test) durchgeführt werden.

Die Ergebnisse von Experimenten, bei denen dieses Protokoll verwendet wurde, sind in den hier beigefügten Figuren veranschaulicht und sind in der kurzen Beschreibung der Figuren beschrieben. REAKTIVITÄT VON IM HANDEL ERHÄLTLICHEN QUERVERNETZERN
REAKTIVITÄT VON IM HANDEL ERHÄLTLICHEN QUERVERNETZERN
REAKTIVITÄT VON IM HANDEL ERHÄLTLICHEN QUERVERNETZERN
REAKTIVITÄT VON IM HANDEL ERHÄLTLICHEN QUERVERNETZERN
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Stimulieren hämatopoetischer Zellen in vitro, umfassend: (1) Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Inhibitors einer Dipeptidylpeptidase des Typs IV zur Steigerung der Zahl von genannten hämatopoetischen Zellen und/oder des Differenzierungszustands der genannten hämatopoetischen Zellen in Bezug auf die Zahl und die Differenzierung hämatopoetischer Zellen, die in einer Kontrollkultur anwesend sind, die nicht mit dem Inhibitor kontaktiert wird, aber anderweitig den gleichen Kulturbedingungen unterworfen wird wie die hämatopoetischen Zellen, die in Anwesenheit des Inhibitors kultiviert werden; und (2) Kultivieren der hämatopoetischen Zellen in Anwesenheit des Inhibitors und in Abwesenheit von exogenem Zytokin unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die zur Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen und/oder der Differenzierung hämatopoetischer Zellen in Bezug auf die Zahl hämotopoetischer Zellen, die in der Kontrollkultur anwesend sind, ausreicht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen die Steigerung der Zahl von Zellen um mindestens das Zweifache in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen umfasst, die anwesend waren, als die hämatopoetischen Zellen initial mit dem Inhibitor kontaktiert wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die hämatopoetischen Zellen aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus hämatopoetischen Stammzellen, primordialen Stammzellen, frühen Progenitorzellen, CD34+-Zellen, frühen Zellen aus den Linien der mesenchymalen, myeloiden, lymphoiden und erythroiden Linien, Knochenmarkzellen, Blutzellen, Nabelschnurblutzellen, Stromazellen und den hämatopoetischen Vorläuferzellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Inhibitor einer Dipeptidylpeptidase Typ IV (DPIV) aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem löslichen Inhibitor der DPIV und einem immobilisierten Inhibitor der DPIV.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Inhibitor der DPIV aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Lys-boroPro-Monomer, einem Pro-boroPro-Monomer, einem Val-boroPro-Monomer und einem Lys-boroPro-Konjugat.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Inhibitor einen immobilisierten Inhibitor darstellt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der immobilisierte Inhibitor den Inhibitor umfasst, der an eine Immobilisationsstruktur angeheftet ist, bei der es sich um ein Gewebskulturgefäß handelt.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der immobilisierte Inhibitor den Inhibitor umfasst, der an eine Immobilisationsstruktur angeheftet ist, bei der es sich um ein Partikel handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die ausreichende Inhibitormenge die Menge darstellt, die zur Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen um das mindestens Zweifache notwendig ist.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend: (1) Kultivieren der Knochenmarkzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors zum Expandieren der Zahl früher Zellen der T-Linie in der Kultur; und (2) Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend einen DPIV-Inhibitor, der an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl von Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin mindestens einer der vorstehenden Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend: (1) Kultivieren von Nabelschnurblutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors zum Expandieren der Zahl früher Zellen der T-Linie in der Kultur; und (2) Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend einen DPIV-Inhibitor, der an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin mindestens einer der vorstehenden Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend: (1) Kultivieren peripherer Blutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines DPIV-Inhibitors zum Expandieren der Zahl von T-Zellen in der Kultur; und (2) Kultivieren der T-Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend einen DPIV-Inhibitor, der an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin mindestens einer der vorstehenden Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend: (1) Kultivieren peripherer Blutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend einen DPIV-Inhibitor, der an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin das Kultivieren in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, 11, 12 oder 13, worin der DPIV-Inhibitor ein DPIV-Inhibitor-Monomer, ein DPIV-Inhibitor-Homokonjugat und eine Kombination des Vorstehenden einschließt.
Verfahren nach Anspruch 10, 11, 12 oder 13, worin das Heterokonjugat ein Tumor-spezifisches Antigen enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, 11, 12 oder 13, worin das Heterokonjugat ein Pathogen-spezifisches Antigen enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, worin ein Kultivierungsschritt in Anwesenheit von zugefügten Zytokinen oder Stromazellen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, worin Schritt (1) in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, worin Schritt (2) in Anwesenheit des antigenen Peptids durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin Schritt (1) in Anwesenheit des antigenen Peptids durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, 11 oder 12, worin Schritt (1) und Schritt (2) simultan in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, worin die Knochenmarkzellen aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus isolierten CD34⁺-Zellen und isolierten Stammzellen.
Verfahren zum Stimulieren hämatopoetischer Zellen in vitro, umfassend: (1) Kontaktieren der hämatopoetischen Zellen mit einer ausreichenden Menge einer Verbindung zur Steigerung der Zahl von genannten hämatopoetischen Zellen und/oder des Differenzierungszustands der genannten hämatopoetischen Zellen in Bezug auf die Zahl und die Differenzierung hämatopoetischer Zellen, die in einer Kontrollkultur anwesend sind, die nicht mit der Verbindung kontaktiert wird, aber anderweitig den gleichen Kulturbedingungen unterworfen wird wie die hämatopoetischen Zellen, die in Anwesenheit der Verbindung kultiviert werden; und (2) Kultivieren der hämatopoetischen Zellen in Anwesenheit der Verbindung und in Abwesenheit von exogenem Zytokin unter Bedingungen und für eine Zeitdauer, die zur Steigerung der Zahl hämatopoetischer Zellen und/oder der Differenzierung der hämatopoetischen Zellen in Bezug auf die Zahl hämatopoetischer Zellen, die in der Kontrollkultur anwesend waren, ausreicht, worin die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist und D1-A1-A2- eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.
Verfahren zum Stimulieren hämatopoetischer Zellen in vitro, umfassend: Kultivieren hämatopoetischer Zellen in Abwesenheit von exogenen Zytokinen und in Anwesenheit einer Menge eines Inhibitors der Dipeptidylpeptidase Typ IV (DPIV), die zum Stimulieren der hämatopoetischen Zellen ausreicht.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend: (1) Kultivieren von Knochenmarkzellen oder Nabelschnurblutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge einer Verbindung zum Expandieren der Zahl früher Zellen der T-Linie in der Kultur; und (2) Kultivieren der frühen Zellen der T-Linie in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend die Verbindung, die an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin mindestens einer der vorstehenden Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird, und worin die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist und D1-A1-A2 eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend: (1) Kultivieren peripherer Blutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge einer Verbindung zum Expandieren der Zahl von T-Zellen in der Kultur; und (2) Kultivieren der T-Zellen mit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend die Verbindung, die an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl Antigen-spezifischer T-Zellen in der Kultur angeheftet ist; worin mindestens einer der vorstehenden Kultivierungsschritte in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird, und worin die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist und D1-A1-A2- eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.
Verfahren zum Expandieren Antigen-spezifischer T-Zellen in vitro, umfassend das Kultivieren peripherer Blutzellen in Anwesenheit einer ausreichenden Menge eines Heterokonjugats, enthaltend eine Verbindung, die an ein antigenes Peptid zum Expandieren der Zahl der Antigen-spezifischen T-Zellen in der Kultur angeheftet wird; worin das Kultivieren in Abwesenheit von exogenem Zytokin durchgeführt wird, und worin die Verbindung die Struktur
aufweist, worin B für Bor steht, jedes von Y1 und Y2 unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Hydroxyl-Komponente und einer reaktiven Komponente, die unter physiologischen Bedingungen in eine Hydroxyl-Komponente umgewandelt wird; -A3-A4- die Struktur
aufweist und D1-A1-A2- eine Aminosäure mit einer Struktur darstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und
worin R die Seitenkette der Aminosäure darstellt.
Verfahren nach Anspruch 1, 10, 11, 12, 13, 23, 25 oder 26, worin die Verbindung Val-boroPro, Lys-boroPro, Pro-boroPro oder Ala-boroPro darstellt.
Verfahren nach Ansprüchen 1, 3, 5, 10 bis 13, 23 und 25 bis 27, worin die Abwesenheit von exogenem Zytokin auf die Abwesenheit von Stromazellen zurückzuführen ist.