DE69827001T2

DE69827001T2 - Gewebedezellularization

Info

Publication number: DE69827001T2
Application number: DE69827001T
Authority: DE
Inventors: Steven Goldstein; S. Kirby BLACK
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-10
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2018-04-11
Also published as: AU7105898A; ES2231980T3; EP0987998A4; CA2286655A1; US20010000804A1; CA2286655C; DK0987998T3; DE69827001D1; PT987998E; EP0987998B1; WO1998046165A1; US20030228692A1; EP0987998A1; AU746318B2; JP2001520542A; ATE279163T1; US7318998B2

Description

FACHGEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Gewebe-Dezellularisierung und insbesondere die Behandlung von Geweben, beispielsweise von Herzklappen, Sehnen und Bändern, sodass sie azellulär gemacht werden und dadurch Mineralisierung und/oder Immunreaktivität bei In-vivo-Implantation eingeschränkt werden. Die behandelten Gewebe werden zur Herstellung eines Medikaments verwendet, das defektes Gewebe in einem Säugetier ersetzt.
HINTERGRUND
Herzklappenstörungen können schwerwiegend sein und sind tatsächlich häufig tödlich. Die Behandlung kann das Ersetzen der Klappe mit einer – mechanischen oder bioprosthetischen – prosthetischen Klappe erfordern. Bioprosthetische Klappen umfassen typischerweise einen Blättchenabschnitt und einen Blutgefäßabschnitt, wobei beide im Allgemeinen aus biologischem Material bestehen, und möglicherweise einen Stent.
Während bioprosthetische Klappen zahlreiche Vorteile gegenüber mechanischen Klappen aufweisen, umfassend ein geringes Komplikationsrisiko aufgrund von Thrombenbildung, sind sie mit einem höheren Risiko der Mineralisierung verbunden. Dieses erhöhte Risiko schränkt die Lebensdauer der Ersatzklappe signifikant ein. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Gewebe, umfassend Herzklappen, resistent gegen Mineralisierung zu machen, während biomechanische Eigenschaften des Gewebes aufrechterhalten bleiben. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Reduktion von Immunreaktivität transplantierter Gewebe, die vor der Implantation nicht durch chemische oder physikalische Mittel oder einer Kombination davon fixiert werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers bereit, um defektes Gewebe im Säugetier zu ersetzen, worin das defekte Gewebe aus der aus Herzklappe, Sehne, Band, Arterie, Vene, Zwerchfell, Perikard, Fascia, Dura mater und Trommelfell bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das Medikament ein bioprosthetisches Gewebe umfasst, das dezellularisiert und unfixiert ist, und worin das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(i) Waschen eines Ausgangsgewebes mit einem Antibiotikum, so dass das Ausgangsgewebe desinfiziert wird, worin das Ausgangsgewebe aus der aus Herzklappe, Sehne, Band, Arterie, Vene, Zwerchfell, Perikard, Fascia, Dura mater und Trommelfell bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
(ii) nach Schritt (i) Kontaktieren der desinfizierten Gewebes mit einer hypotonischen Lösung, so dass eine Lyse von Zellen des desinfizierten Gewebes ausgelöst wird; und
(iii) Inkubieren des mit einer hypotonischen Lösung behandelten Gewebes aus Schritt (ii) mit einer Nucleaselösung.

Beispiele für Herzklappengewebe, die der vorliegenden Erfindung unterzogen werden können, umfassen Blättchen und mit den Herzklappen in Verbindung stehende Blutgefäße.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A und B zeigen die Wirkung von Dezellularisierung auf die Dehnbarkeit und den Elastizitätsmodul von Aorta- und Pulmonalblättchen.
Die 2A und B zeigen die Wirkung von Dezellularisierung auf die Geschwindigkeit des Spannungsabbaus von Aorta- und Pulmonalblättchen.
Die 3A, B und C zeigen die Wirkung von Dezellularisierung auf Fehlbelastung, Maximalbelastung und Elastizitätsmodul von Aorta- und Pulmonalblättchen.
Die 4A, B, C und D zeigen die Wirkung von Dezellularisierung auf Verkalkung von Schweineherzaorta- und -pulmonalherzklappengewebe.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Verleihen azellulärer Eigenschaft an biologisches Gewebe. Das Verfahren umfasst das Aussetzen des Gewebes gegenüber einer hypotonischen Lösung unter Bedingungen, so dass Zelllyse resultiert, und Unterziehen des resultierenden Gewebes einer Nucleasebehandlung, sodass Nucleinsäuren und assoziierte, Phosphor enthaltende Gruppen, die Calcium binden können, entfernt werden. Nucleasebehandlung beendet wirksam Zellreplikation und Proteinsynthese. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform wird das Gewebe im Wesentlichen azellulär gemacht, wobei die Bezeichnung "im Wesentlichen" bedeutet, dass das Gewebe zumindest 70 % weniger Zellen aufweist als das natürlich vorkommende, biologische Material. Das Ausmaß der Dezellularisierung kann histochemisch bestimmt werden, beispielsweise durch Färben des Gewebes mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung von Standardverfahren. Immunhistochemisches Färben kann beispielsweise auch verwendet werden, um zellspezifische Marker wie Glattmuskel-Actin und Histokompatibilitätsantigene sichtbar zu machen – wobei die Abwesenheit solcher Marker ein weiterer Hinweis auf Dezellularisierung ist.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren wird biologisches Gewebe zuerst in einer Antibiotikalösung gewaschen. Das Gewebe kann anschließend sofort dezellularisiert oder es kann gefrierkonserviert werden. Gefrierkonserviertes Gewebe wird vor der Dezellularisierung unter solchen Bedingungen aufgetaut, dass das Gefrierschutzmittel eliminiert wird, wodurch dadurch entstehende Toxizität unterbunden wird. Geeignete Auftaubedingungen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Das Gewebe wird (frisch oder zuerst gefrierkonserviert und dann aufgetaut) anschließend in hypo tonische Lösung gegeben, um Zelllyse zu bewirken. Geeignete Lösungen umfassen Wasser oder eine Lösung, die eine Konzentration an gelöster Substanz (z.B. ein Salz wie NaCl) von bis zu 80 Milliosmol aufweist (beispielsweise eine Lösung mit 10-20 oder 20-40 mM NaCl). Lyse kann beispielsweise bei einer Temperatur im Bereich von 30 °C bis 40 °C, vorzugsweise 37 °C, und vorteilhaft in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ beispielsweise etwa 4 bis 24 Stunden lang erfolgen. Das Gewebe wird dann in eine (z.B. DNAse- und/oder RNAse-hältige) Nucleaselösung übertragen und wird, beispielsweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 30 °C bis etwa 40 °C, vorzugsweise 37 °C, vorteilhaft in einer Atmosphäre von 5 % CO₂, beispielsweise etwa 4 bis 24 Stunden lang, inkubiert. In weiterer Folge wird das Gewebe in eine Lösung übertragen, die die strukturelle Integrität von Gewebe aufrechterhalten kann, beispielsweise eine physiologisch normale (isotonische) Lösung wie ein Zellkulturmedium, z.B. DMEM. Zelllyse kann während Aufrechterhaltung des Gewebes in der physiologisch normalen Lösung fortgesetzt werden, und so kann das Gewebe aus den Lyse/Nuclease-Lösungen entfernt werden, bevor 70%ige Dezellularisierung erreicht worden ist.
Gewebe, die dezellularisiert wurden, können zum Schluss unter Verwendung zahlreicher verschiedener Sterilisationsmitteln sterilisiert werden. Beispielsweise kann das Gewebe γ-Strahlung, Ethylenoxid, Peressigsäure, β-Propiolacton, Povidoniod oder UV-Strahlung in Gegenwart oder Abwesenheit von Photosensibilisatoren unterzogen werden. Geeignete Bedingungen zur Durchführung abschließender Sterilisation sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Biologische Gewebe, die zur Verwendung im vorliegenden Verfahren geeignet sind, umfassen jene, die zur Implantation in Menschen oder Tiere geeignet sind. Gewebe können menschlicher oder nichtmenschlicher Abstammung sein (z.B. von Rindern, Schweinen oder nichtmenschlichen Primaten). Wie zuvor erwähnt können die Gewebe frisch oder gefrierkonserviert sein. In beiden Fällen wird das Gewebe vor jeglicher Fixierung dezellularisiert. Während die vorliegende Erfindung in Bezug auf Herzklappenblättchen als Beispiel dargestellt wird, ist das Dezellularisierungsverfah ren ebenfalls auf andere Gewebe anwendbar, umfassend Sehnen, Bänder, Fascia, Arterien, Venen, Zwerchfell, Perikard, Nabelschnur, Dura mater oder Trommelfell.
Nach Beendigung der Dezellularisierung kann das biologische Gewebe so bearbeitet und/oder hergestellt werden, wie es je nach letztendlicher Verwendung des Gewebes geeignet ist. Unfixiertes Gewebe wird in einem Medikament verwendet, das unter Verwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Unfixiertes Gewebe kann mit jedem beliebigen Mittel einer großen Auswahl imprägniert werden, umfassend jene, die Rezellularisierung bei der Implantation des dezellularisierten Gewebes in vivo stimulieren. Beispiele für solche Mittel umfassen Wachstumsfaktoren, Adhäsionsfaktoren, wie Glykosaminoglykane, und lösliche, extrazelluläre Matrix-Glykoproteine wie Fibronectin, Laminin, Vitronectin usw. Andere Mittel, die verwendet werden können, umfassen jene, die Hämokompatibilität verbessern, Thrombomodulatoren und Antibiotika. Geeignete Imprägnierverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ist das Gewebe eine Herzklappe, so kann die Herstellung mit einem biologischen oder nichtbiologischen Stent unter Verwendung von Standardprotokollen erfolgen.
Bioprothesen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, werden als Ersatz für defektes Gewebe bei Säugetieren, insbesondere Menschen, verwendet. Verfahren zur Durchführung der Ersetzung von beispielsweise Herzklappen, Sehnen, Bändern, Blutgefäßen usw. sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Gewebe, das gemäß der vorliegenden Erfindung dezellularisiert ist, ist in vivo geringerer Mineralisierung (z.B. Verkalkung) ausgesetzt als nicht behandeltes Gewebe. Dezellularisierung resultiert auch in einem Gewebe, das reduzierte Immunogenität aufweist.
Bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend in den nicht einschränkenden Beispielen näher beschrieben. Während sich die Methodik zur Dezellularisierung der vorliegenden Erfindung und jener des USP 5.595.571 unter scheiden, versteht es sich, dass bestimmte Details dieser Offenbarung auch in der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, umfassend Quellen biologischen Gewebes, Verfahren zur Überwachung des Ausmaßes der Dezellularisierung und Verfahren zur Bearbeitung und Herstellung nach der Dezellularisierung.
BEISPIEL I
Dezellularisierung von Blättchen und ganzen Klappen
Die folgenden Lösungen werden in den folgenden Protokollen verwendet:
1 M Tris pH 7,6: Zu 80 ml entionisiertem Wasser sind 11,21 g Tris zuzusetzen, der pH ist auf 7,6 mit 1 N NaOH einzustellen, und das Volumen ist auf 100 ml zu bringen und die Lösung bei 4 °C zu lagern.
1 M CaCl₂: Zu 20 ml entionisiertem Wasser sind 2,22 g CaCl₂ zuzusetzen und bei 4 °C zu lagern.
1 M MgCl₂: Zu 10 ml entionisiertem Wasser sind 2,033 g MgCl₂ zuzusetzen und bei 4 °C zu lagern.
DNAse-I-Lösung: Zu 4,95 ml sterilem Wasser sind 5 ml Glycerin (Endkonzentration: 50 %), 20 mg DNAse I (Sigma D5025) (Endkonz.: 2 mg/ml) und 50 μl 1 M CaCl₂ (Endkonz.: 5 mM) zuzusetzen. Je 1 ml sind auf gekühlte, markierte, 1,5-ml-Mikrozentrifugen-Röhrchen aliquot aufzuteilen und bei –20 °C zu lagern.
RNAse-A-Lösung: Zu 10 ml sterilem Wasser sind 100 mg RNAse A zuzusetzen und zur Auflösung damit zu vermischen. Je 500 μl Lösung sind auf 20 vorgekühlte 1,5-ml-Mikrozentrifugen-Röhrchen aliquot aufzuteilen und bei –20 °C zu lagern.
Nuclease-Lösung: Zu 93,66 ml sterilem Wasser sind 4,8 ml 1 M Tris pH 7,6 (Endkonz.: 48 mM), 288 μl 1 M MgCl₂ (Endkonz.: 2,88 mM), 96 μl 1 M CaCl₂ (Endkonz.: 0,96 mM) zuzusetzen, das Ganze ist unter Verwendung eines 0,2-μm-Filters Sterilfiltration zu unterziehen, und 960 μl 2 mg/ml DNAse I (Endkonz.: 19,2 μg/ml) und 192 μl 10 mg/ml RNAse A (Endkonz.: 19,2 μg/ml) sind zuzusetzen.
Dezellularisierung von Blättchen
TAG 1
Eine Klappe wird aus einen Flüssigstickstofftiefkühler entfernt und in ein 37-°C-Wasserbad etwa 15 Minuten lang getaucht. Unter sterilen Bedingungen wird die Klappe aus der Verpackung entfernt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine sterile 7-oz.-Musterschale mit etwa 50 ml Laktat-Ringer-5%-Dextrose- (LRD5-) Lösung gegeben. Die Klappe wird durch einen einzelnen Schnitt die Kommissur entlang geschnitten, die zwischen den linken und rechten Koronararterien verläuft. Die Klappe wird mit dem Mitralklappenblättchen nach oben bloßgelegt, das linke Koronarblättchen nach links, das rechte Koronarblättchen nach rechts, und das nichtkoronare Blättchen in der Mitte. Die Blättchen werden so nahe wie möglich an der Gefäßwand von der Klappe freigeschnitten und in getrennte, markierte, konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen, die mit 10 ml LRD5-Lösung gefüllt sind, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gegeben. Die Blättchen werden in zweite, markierte, konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen, gefüllt mit 10 ml LRD5-Lösung, transferiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Blättchen werden in dritte, markierte, konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen, gefüllt mit 10 ml sterilem Wasser, transferiert und 2 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂, platziert. Die Blättchen werden in 6-Well-Kulturplatten platziert und mit sterilen Glasringen beschwert. 5 ml Nucleaselösung werden jedem Well zugesetzt, und die Blättchen werden über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂, inkubiert.
TAG 2
Die Nucleaselösung wird entfernt, 5 ml DMEM werden jedem Well zugesetzt, und die Blättchen werden wieder in den Inkubator gegeben.
TAG 3-16
Das Medium wird jeden zweiten Tag zwei Wochen lang ausgewechselt.
Alternativverfahren für ganze Klappen
Wurden Klappen gefrierkonserviert, so werden sie wie zuvor beschrieben aufgetaut und gewaschen; sind die Klappen frisch, so werden sie nur einmal in 80 ml LRD5 15 Minuten lang in einer sterilen 7-oz.-Musterschale gewaschen.
Nachdem die Klappe gewaschen wurde, wird sie in eine sterile 7-oz.-Musterschale, die etwa 80 ml steriles H₂O enthält, übertragen und 4 Stunden lang in den 37 °C/5 % CO₂- Inkubator platziert.
Die Klappe wird entfernt und in eine sterile 7-oz.-Musterschale, die etwa 80 ml Nucleaselösung enthält, platziert und darin über Nacht in den Inkubator zurückgegeben.
TAG 2
Die Klappe wird entfernt und in eine sterile 7-oz.-Musterschale gegeben, die etwa 80 ml (ALT+)-Lösung enthält (umfassend Netilmicin, 54 μg/ml; Lincomycin, 131 μg/ml; Cefotaxim, 145 μg/ml; Vancomycin, 109 μg/ml; Rifampin, 65 μg/ml; Fluconazol, 100 μg/ml; und Amphotericin B, 84 μg/mC).
TAG 3-16
Das Medium wird jeden zweiten Tag zwei Wochen lang unter Verwendung von ALT+-Lösung in der ersten Woche und DMEM in der zweiten Woche ausgewechselt.
Die obigen Verfahren sind offene Kulturverfahren. Dies bedeutet, dass die Musterschalendeckel beim Platzieren in den Inkubator geöffnet werden.
BEISPIEL II
Details zum Experiment
Schweineherzklappen. Schweineherzen wurden von Schweinen mit Marktgewicht (> 120 kg) erhalten. Nach Spülen in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung wurden die Herzen vor Ort seziert (der Apex entfernt) und bei 4 °C in steriler PBS transportiert. Alle Herzen kamen innerhalb von 24 Stunden nach Schlachtung des Tieres an. Aorta- und der Inkubation zur Reduktion der Gesamtkeimzahl in einem Gemisch von Antibiotika und Antimycotika 48 Stunden lang bei 48 °C unterzogen. Die desinfizierten Gewebe wurden entweder gefrierkonserviert (10 Vol.-%. DMSO und 10 Vol.-% fötales Rinderserum, –1 °C/min) oder wurden durch ein Verfahren dezellularisiert, das die Behandlung mit hypotonischem Medium, gefolgt von Verdau mit einem Gemisch aus Desoxyribonuclease I und Ribonuclease A, umfasst. Nach 12 Tagen wurden die dezellularisierten Klappen entweder wie zuvor gefrierkonserviert oder chemisch in 0,35 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd bei 2 mmHg in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) insgesamt 7 Tage lang fixiert; die Fixierung unter geringem Druck stellt die Aufrechterhaltung der natürlichen Kräuselung der Collagenmatrix sicher. Die fixierten Gewebe wurden nicht gefrierkonserviert, sondern wurden in 0,35%iger Glutaraldehydlösung gelagert.
Vor jeglicher Untersuchung (Verkalkung, Biomechanik, Histologie) wurden die gefrierkonservierten Gewebe rasch aufgetaut, um durch Eintauchen des verpackten Gewebes in ein 37-°C-Wasserbad Eis-Umkristallisierung zu vermeiden. Gefrierkonserviertes Medium wurde aus den aufgetauten Klappen mit 500 ml laktierter Ringer-Lösung mit 5 % Dextrose eluiert. Die Glutaraldehyd-fixierten Gewebe wurden dreimal jeweils mit 200 ml normaler Salzlösung gewaschen.
Statische In-vivo-Verkalkung. Verkalkung von behandeltem Gewebe wurde in vivo durch subdermale Implantationen bei Ratten bewertet. Entwöhnte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden von den Charles Rivers Laboratories erhalten. Nach einer Woche des Ausgleichs wogen die Tiere im Mittel 136 ± 18 g. Die Herzklappen wurden seziert, um Aorta- und Pulmonalblättchen und Blutgefäßschnitte bereitzustellen, die jeweils 0,5-cm-Quadrate darstellten. Während die Ratten unter Ketamin- und Xylazin- (10 mg/kg bzw. 5 mg/kg, IP) Anästhesie standen und die Vorbereitung unter Wahrung eines sterilen Umfelds getroffen wurden, wurden Taschen mit 2 cm Durchmesser in den dorsalen Subcubitae gebildet, vier pro Tier, und Gewebeschnitte wurden insertiert. Die Schnitte wurden mit Edelstahlklammern geschlossen. Die Ratten konnten sich zuerst erholen, worauf hin sie freien Zugang zu Nahrung und Wasser hatten. Gewebeproben wurden nach 1, 2 und 4 Monaten nach der Implantation zur Bestimmung des Calciumgehalts entnommen.
Verfahren zur Calciumbestimmung in Gewebeproben.
Entnommenes Gewebe wurden in steriler Calcium- und Magnesium-freier, Phosphat-gepufferter Salzlösung dreimal mit 10 ml jeweils gewaschen. Das Nassgewicht wurde gemessen, und nach dem Zerkleinern wurden die Stücke über Nacht in einem Zentrifugenverdampfer (Savant Speed-Vac) getrocknet. Nach Aufzeichnung des Trockengewichts wurden die Gewebe in 10 ml 25 Vol.-% HNO₃ zumindest 24 Stunden lang bei 70 °C aufgelöst. Eine Aliquote der Auflösungslösung wurde 10fach in 0,2 N HCl, das 1 Vol.-% Lanthannitrat enthielt, verdünnt. Schließlich wurde der Calciumgehalt unter Verwendung eines Perkin-Elmer-300- Atomabsorptionsspektrometers gemessen, das mit einem zertifizierten Calciumstandard der SPEX Plasma Standards (Cat. PLCA2-3Y) kalibriert war. Die Reaktion in diesem System war zwischen 0,2-20 μg/ml linear.
Biomechanische Tests. Aorta- und Pulmonalblättchen wurden mit einer Stanzmatrize in Umfangsrichtung ausgeschnitten, um "Hundeknochen"-förmige Muster mit einer Breite von 0,5 cm im Mittelteil bereitzustellen. Die Dicke jeder Probe wurde vom Mittel der drei Messungen abgeleitet, die mit einem leichten Stift, der mit einem Leitkreislauf und einer digitalen Messlehre verbunden ist, abgenommen wurden. Die Blättchen wurden in speziell angefertigten Klammern mit einer Standardmesslänge von 1 cm angebracht. Alle Tests wurden mit dem Gewebe in Hank's ausgeglichener Salzlösung, die auf 37 ± 2 °C gehalten wurde, durchgeführt. Jedes Muster wurde auf eine Belastung von 150 g vorbehandelt, bis aufeinanderfolgende Belastungs-Verlängerungskurven überlagerbar waren (~ 20 Zyklen). Die folgenden Messungen wurden dann vorgenommen: 1) Verlängerung unter geringer Belastung, um Spannungs-Dehnungs-Beziehungen abzuleiten, während bis zu 150 g Belastung am Gewebe bei einer Ausdehnungsgeschwindigkeit von 10 mm/min angebracht wurde, eine Geschwindigkeit, die zuvor durchgeführten Studien über Blättchen-Biomechanik gerecht wird (Leesson-Dietrich et al., J. Heart Valve Disease 4, 88 (1995)); 2) Untersuchung von viskoelastischen Eigenschaften der Muster in einer Spannungs-Entspannungs-Studie (Gewebe wird durch eine Belastung von 150 g ausgedehnt, worauf Restbelastungen bis zu 1.000 Sek. weiter bestehen) – sowohl die % der anfänglich verbleibenden Belastung nach diesen Zeitpunkten als auch die Geschwindigkeit der Spannung-Entspannung (d.h. die der Anstieg der prozentuellen Spannung gegenüber Zeit) wurden bestimmt; und 3) abschließende einachsige Zugprüfung auf Gewebefehler. Zumindest 8 Muster jedes Gewebetyps wurden untersucht.
Histochemie. Proben von frischem und explantiertem Gewebe wurden in 10%ige Saccharoselösung 4-18 Stunden lang bei 4 °C getaucht. Nach kurzer Fixierung in 10 % Formalin wurden die Stücke in Formen gegeben und in OCT unter Verwendung eines flüssigen Stickstoffbads eingefroren. Kryoschnitte, 6-10 μm dick, wurden unter Verwendung eines IEC-Kryostats geschnitten (Needham Heights, MA). Die Schnitte wurden dann entweder mit Hematoxylin und Eosin gefärbt oder spezifisch für Calcium gemäß dem Verfahren von von Kossa gefärbt (Theory and Practice of Histological Techniques, hrsg. von Bancroft und Stephens, Churchill Livingstone, Edinburgh (1990)). Die Schnitte wurden betrachtet und unter Verwendung eines Nikon-Optiphot-Mikroskops photographiert.
Statistik. Statistische Unterschiede im Gruppenmittel biomechanischer Parameter wurden durch unabhängige t-Tests bestimmt. Ein p-Wert von 0,05 wurde als das Niveau signifikanter Unterschiede ausgewählt. Calciumdaten wurden gemäß dem ANOVA-Test analysiert, der mit dem statistischen Programm für den IBM-PC, SPSS-PC, durchgeführt wurde.
Ergebnisse
Biomechanik. Test bei geringer Belastung-Dehnbarkeit und geringer Modul. Die biomechanischen Eigenschaften von Streifen aus Aorta- und Pulmonalherzklappenblättchen von Schweinen wurden zwischen frisch-gefrierkonservierten und dezellularisiert-gefrierkonservierten Geweben verglichen. Für frische Aorta- und Pulmonalblättchen wurde herausgefunden, dass sie signifikante Unterschiede hinsichtlich der Dehnbarkeit aufwiesen; Pulmonalblättchen hatten eine 2,3fach größere Ausdehnung als Aortablättchen (p < 0,01). Der Elastizitätsmodul dieser Gewebe war jedoch vor der Dezellularisierung nicht unterschiedlich (10,6 ± 1,1 gegenüber 9,15 ± 0,64, p = 0,255, 1). Durch die Dezellularisierung wurde die Dehnbarkeit der zwei Blättchentypen ununterscheidbar (30,4 ± 2,5 gegenüber 30,2 ± 3,3, p = 0,981). Der Elastizitätsmodul der Aortablättchen blieb durch Dezellularisierung unverändert (p = ns (nicht signifikant) im Vergleich zu frischem Gewebe). Im Gegensatz dazu war Pulmonalblättchengewebe durch Dezellularisierung merkbar steifer geworden, wobei der Elastizitätsmodul um 660 % stieg (p = <0,05). Als Ergebnis war der Elastizitätsmodul dezellularisierten Pulmonalgewebes um 550 % höher als jener der dezellularisierten Aortablättchen.
Spannungs-Entspannungs-Tests. Die Anfangs- (10 Sek.) und End- (1.000 Sek.) Geschwindigkeiten von Spannung-Entspannung für frische Aorta- und Pulmonalblättchen waren vergleichbar und statistisch gesehen nicht unterschiedlich (p = 0,103 bzw. p = 0,115, 2). Bei dezellularisierten Geweben wurde nur die Anfangsgeschwindigkeit von Spannung-Entspannung von Aortablättchen erhalten; diese wies keinen Unterschied zu den Werten für frisches Gewebe auf. Die stärkere Versteifung der Pulmonalblättchen mit Dezellularisierung, die bei Tests mit geringer Belastung beobachtet wurde, zeigte sich in einem höheren Endniveau verbleibender Spannung (Steigerung von 64,1 ± 2,18 % auf 81,5 ± 2,5 %). Die Entspannungssteigung bei Pulmonalblättchen veränderte sich umgekehrt proportional zur Dezellularisierung und nahm von 9,8 ± 0,8 im frischen Gewebe auf 4,7 ± 1,5 im behandelten Gewebe ab.
Abschließende Dehnungstests-Fehlbelastung, maximale Spannung und Elastizitätsmodul (3). In frischem Gewebe versagten die Aortablättchen erst bei doppelter Belastung im Vergleich mit Pulmonalklappengewebe (p < 0,001). Es gab jedoch keinen statistisch relevanten Unterschied hinsichtlich der Maximalspannung beim Versagen bei Aorta- und Pulmonalblättchen (8,0 ± 1,2 MPa gegenüber 6,0 ± 0,9, p = 0,202). Die Moduln der frischen Blättchen waren ebenfalls statistisch gesehen nicht unterschiedlich (p = 0,333).
Dezellularisierte Aortablättchen versagten bei derselben Belastung und Maximalspannung wie das frische Gewebe. Die Belastung am Punkt des Versagens bei Pulmonalblättchen stieg leicht, jedoch nicht signifikant, an, doch es gab beinahe eine Verdreifachung der Spannung bei Versagen zu verzeichnen.
Die Versteifung von Pulmonalblättchen, die bei den Belastungstests beobachtet wurde, zeigte wiederum, wenn das Gewebe bis zum Versagen belastet wurde. Die Moduln von Pulmonalblättchen, die bis zum Versagen belastet wurden, stiegen nach Dezellularisierung um das 2,6fache; im Gegensatz dazu waren die Elastizitätsmoduln der dezellularisierten Aortablättchen leicht rückläufig (45,5 ± 6,2 MPa gegenüber 38,3 ± 5,2 MPa).
Gewebeverkalkung. Die Verkalkungskinetik von Schweineherzklappengewebe nach 1, 2 und 4 Monaten nach Implantation sind in 4 dargestellt. Glutaraldehydfixiertes Pulmonalherzklappengewebe von Schweinen schien besonders stark dazu zu neigen, im subdermalen Rattenmodell zu verkalken. Die Pulmonalblättchen und -blutgefäße verkalkten rascher als ihre Aortaklappen-Gegenstücke, wobei die fixierten Pulmonalblättchen unter allen untersuchten Gewebearten am raschesten verkalkten. Weiters erreichten Glutaraldehyd-fixierte Pulmonalblättchen den höchsten Calciumgehalt in Gewebe im Laufe der vier Monate subkutaner Implantation. Im Allgemeinen verkalkten die fixierten Blutgefäße langsamer als die Blättchen vom selben Klappentyp, und der Endcalciumgehalt war nach 4 Monaten signifikant niedriger (p < 0,05 sowohl für Aorta- als auch für Pulmonalklappen).
Die Auswirkung der Dezellularisierung auf Herzklappenverkalkung, gesehen als eine Verlangsamung der Verkalkung von fixiertem oder nicht-fixiertem Gewebe (Pulmonalblättchen) oder eine Maximalverkalkung (Plateau-Effekt) zwei Monate nach der Implantation (Aortablättchen, Aortagefäß, Pulmonalarterie). Das Plateau-Phänomen wurde entweder in den nicht-fixierten Geweben oder in jenen Geweben beobachtet, die vor der Glutaraldehyd-Fixierung dezellularisiert worden waren. Keine statistisch singifikanten Unterschiede hinsichtlich der Verkalkung der Aortagefäße wurden unter den Behandlungsgruppen im Laufe der 4 Monate nach Implantation verzeichnet. Die Verkalkung dezellularisierter Aortagefäße ging rascher voran als jene fixierten Gewebes in den ersten zwei Monaten nach der Implantation und stellte sich auf ein gleichbleibendes Niveau ein, während der Calciumgehalt in fixierten Gefäßen weiterhin anstieg. Auch wurde eine abschwächende Wirkung auf den Anstieg des Calciumgehalts in Pulmonalarterien im Vergleich zu allen fixierten Gewebegruppen beobachtet.
Aorta- und Pulmonalblättchen zeigten etwas unterschiedliche Reaktionen auf Dezellularisierung. Dezellularisierung von Aortablättchen mit anschließender Fixierung führte zu einem geringeren Calciumgehalt (73 ± 17 mg Ca²⁺/g Gewebe) als bei Aortablättchen, die nicht fixiert wurden (121 ± 8 mg/g, p < 0,05). Obwohl Gewebe nach vier Monaten nicht verfügbar war, neigte bei Pulmonalblättchen das dezellularisierte Gewebe an sich dazu, einen geringeren Calciumgehalt aufzuweisen (152 ± 5 gegenüber 101 ± 34 mg/g nach zwei Monaten nach der Implantation).
Histologische Untersuchungen. Für bestimmte Bereiche von dezellularisierten Schweineaortablättchen nach 1 Monat kann gezeigt werden, dass sie frei von endogenen Zellen innerhalb der Gewebematrix sind und keine Ablagerungen aufweisen. Da der gemessene Gewebe-Calciumgehalt in dieser Gruppe bei 60 ± 14 mg/g lag, wurden Kalkablagerungen nur in bestimmten Bereichen festgestellt. Mittels weiterer Untersuchung unter Verwendung von Kossa-Färbung wurden solche Bereiche sichtbar. Innerhalb dieser Bereiche traten Kalkablagerungen in Verbindung mit nicht-spezifischen Strukturen auf. Im Gegensatz dazu stand die frühe Verkalkung von nicht-dezellularisierten, Glutaraldehyd-fixierten Geweben immer mit Zellkernen im Zusammenhang. Das wachsende Ausmaß an Einbindung des Blättchengewebes im Laufe der Zeit nach der Implantation wird aus der Entwicklung nach 1, 2 und 4 Monaten deutlich sichtbar. Der Mittelteil der Blättchen verkalkte früh, während die Ränder erst später verkalkten. Sowohl in Aorta- als auch Pulmonalklappengefäßteilen beschränkten sich die verkalkten Bereiche typischerweise auf die Randbereiche des Implantats, und nur sehr selten wiesen Gewebe des Mittelteils des Implantats Zeichen von Mineralisierung auf.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Säugetiers, um defektes Gewebe im Säugetier zu ersetzen, worin das defekte Gewebe aus der aus Herzklappe, Sehne, Band, Arterie, Vene, Zwerchfell, Perikard, Fascia, Dura mater und Trommelfell bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das Medikament ein bioprosthetisches Gewebe umfasst, das dezellularisiert und unfixiert ist, und worin das Verfahren folgende Schritte umfasst: (i) Waschen eines Ausgangsgewebes mit einem Antibiotikum, so dass das Ausgangsgewebe desinfiziert wird, worin das Ausgangsgewebe aus der aus Herzklappe, Sehne, Band, Arterie, Vene, Zwerchfell, Perikard, Fascia, Dura mater und Trommelfell bestehenden Gruppe ausgewählt ist; (ii) nach Schritt (i) Kontaktieren der desinfizierten Gewebes mit einer hypotonischen Lösung, so dass eine Lyse von Zellen des desinfizierten Gewebes ausgelöst wird; und (iii) Inkubieren des mit einer hypotonischen Lösung behandelten Gewebes aus Schritt (ii) mit einer Nucleaselösung.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren außerdem folgenden Schritt umfasst: (iv) nach Schritt (iii) Kontaktieren des aus Schritt (iii) resultierenden Gewebes mit einer physiologisch isotonischen Lösung.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ausgangsgewebe menschliches Gewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das Ausgangsgewebe menschliches Herzklappengewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das aus Schritt (iii) resultierende Gewebe zu zumindest 70 % dezellularisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleaselösung DNAase oder RNAase enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nucleaselösung DNAase und RNAase enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ausgangsgewebe nichtmenschliches Gewebe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (ii) bei einer Temperatur im Bereich von 30 °C bis 40 °C durchgeführt wird.