DE69721265T2

DE69721265T2 - Hydrolysierbare hydrogele zur gesteuerten freisetzung

Info

Publication number: DE69721265T2
Application number: DE69721265T
Authority: DE
Inventors: Everhardus Wilhelmus HENNINK; Nelletha Wendelmoed VAN DIJK-WOLTHUIS
Original assignee: Rijksuniversiteit Utrecht
Current assignee: Universiteit Utrecht
Priority date: 1996-07-01
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-07-02
Also published as: AU3360197A; EP0910412B1; JP4625548B2; EP0910412A1; WO1998000170A1; PT910412E; US6497903B1; DK0910412T3; US20020131952A1; ATE238068T1; US7060296B2; ES2198579T3; DE69721265D1; JP2000515853A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Hydrogele, die ein gut kontrolliertes Freisetzungsverhalten aufweisen, und Verfahren zur Herstellung derartiger Hydrogele.
Die schnellen Entwicklungen auf dem Gebiet der Molekularbiologie und der Biotechnologie haben es ermöglicht, eine große Anzahl pharmazeutisch interessanter Erzeugnisse in großen Mengen herzustellen. Beispielsweise können pharmazeutisch aktive Peptide und Proteine geeignet als Arzneimittel bzw. Wirkstoffe bei der Behandlung lebensbedrohlicher Erkrankungen, z. B. Krebs, und verschiedener Arten viraler, bakterieller und parasitischer Erkrankungen; bei der Behandlung von z. B. Diabetes; in Impfstoffen, z. B. für prophylaktische Zwecke, und für empfängnisverhütende Zwecke eingesetzt werden. Insbesondere die spezialisierten biologischen Aktivitäten dieser Arten von Wirkstoffen schaffen enorme Vorteile gegenüber anderen Arten von Arzneimitteln.
Um die schnellen Entwicklungen zu erläutern, wurde berichtet (siehe z. B. Soeterboek und Verheggen, Pharm. Weekblad 130 (1995) 670–675), dass sich in den Vereinigten Staaten von Amerika ungefähr 275 biotechnologische Erzeugnisse in Untersuchungen der Phase IV befinden, während sich mehr als 500 Produkte in der Erforschung befinden.
Beispiele für (rekombinante) Proteine, die in pharmazeutischer Hinsicht als sehr interessant gelten, sind Cytokine, wie z. B. Interleukine, Interferone, Tumornekrosefaktor (TNF), Insulin, Proteine für eine Verwendung in Impfstoffen und Wachstumshormonen.
Aufgrund ihrer Beschaffenheit können Proteine und proteinhaltige bzw. proteinartige Erzeugnisse, einschließlich Peptide, wobei diese Erzeugnisgruppe hier nachstehend als Proteinwirkstoffe bezeichnet wird, nicht oral verabreicht werden. Diese Erzeugnisse neigen dazu, sich im Gastrointestinaltrakt schnell abzubauen, insbesondere aufgrund der dortigen sauren Umgebung und Gegenwart proteolytischer Enzyme.
Darüber hinaus können die meisten Proteinwirkstoffe Endothel- und Epithelbarrieren aufgrund ihrer Größe und ihrer im Allgemeinen polaren Eigenschaften nicht passieren.
Aus diesen Gründen müssen Proteinwirkstoffe parenteral in das System gebracht werden, z. B. durch Injektion. Das pharmakokinetische Profil dieser Erzeugnisse ist jedoch so, dass eine Injektion des Erzeugnisses als solches eine häufige Verabreichung erfordert. Denn es ist eine bekannte Tatsache, dass proteinhaltiges Material innerhalb von Minuten aus dem Blutkreislauf entfernt wird.
Da, anders ausgedrückt, Proteinwirkstoffe chemisch und/oder physikalisch unstabil sind und im Allgemeinen eine kurze Halbwertzeit im menschlichen oder tierischen Körper haben, sind zahlreiche tägliche Injektionen oder kontinuierliche Infusionen erforderlich, damit der Proteinwirkstoff eine gewünschte therapeutische Wirkung ausübt. Es ist offensichtlich, dass dies für Patienten unangenehm ist, die diese Proteinwirkstoffe benötigen. Darüber hinaus erfordert diese Art der Verabreichung oft einen Krankenhausaufenthalt und hat logistische Nachteile.
Zudem scheint es, dass zumindest für bestimmte Klassen pharmazeutischer Proteine, wie Cytokine, die derzeit z. B. bei Krebsbehandlungen verwendet werden, die therapeutische Wirksamkeit stark von einer wirk samen Abgabe, z. B. intra- oder peritumoral, abhängt. In solchen Fällen sollten die Proteinwirkstoffe an die Stellen geleitet werden, wo ihre Aktivität während eines längeren Zeitraums benötigt wird.
Daher besteht ein Bedarf für Abgabesysteme, welche die Fähigkeit zur kontrollierten Freisetzung haben. Im Fachgebiet wurden Abgabesysteme vorgeschlagen, die aus polymeren Netzwerken bestehen, die mit den Proteinen beladen sind und aus denen diese allmählich freigesetzt werden.
Im Einzelnen können derzeit zwei Hauptarten polymerer Abgabesysteme unterschieden werden: biologisch abbaubare Polymere und biologisch nicht abbaubare Hydrogele.
Biologisch abbaubare Polymere, z. B. Polymilchsäure (PLA) und Copolymere von PLA mit Glycolsäure (PLGA), werden häufig als Abgabesysteme für Proteine verwendet.
Proteine können in pharmazeutische Abgabesysteme, z. B. Mikrokügelchen, durch eine Reihe von Verfahren eingefügt werden. In vivo und in vitro wird üblicherweise ein zweiphasiges Freisetzungsprofil beobachtet: ein anfänglicher Ausbruch gefolgt von einer mehr allmählichen Freisetzung. Der Ausbruch wird durch proteinartiges Material verursacht, das an oder nahe der Oberfläche der Mikrokügelchen vorliegt, und durch proteinartiges Material, das in den Poren vorliegt. Die allmähliche Freisetzung wird einer Kombination aus Diffusion des proteinartigen Materials durch die Matrix und Abbau der Matrix zugeschrieben. Insbesondere für größere Proteine ist eine Diffusion in diesen Matrizes vernachlässigbar, sodass die Freisetzung von dem Abbau des Polymers abhängt. Der Abbau kann durch die (Co)polymerzusammensetzung beeinflusst werden. Eine be kannte Strategie zur Erhöhung der Abbaurate von PLA ist eine Copolymerisation mit Glycolsäure.
Obgleich Abgabesysteme auf Basis biologisch abbaubarer Polymere interessant sind, ist es sehr schwierig, die Freisetzung des eingebauten Proteins zu kontrollieren. Dies beeinträchtigt die Anwendbarkeit dieser Systeme insbesondere für Proteine mit einem engen therapeutischen Fenster, wie Cytokine und Hormone. Darüber hinaus müssen organische Lösemittel für die Verkapselung des Proteins in diesen polymeren Systemen verwendet werden. Der Kontakt von Proteinen mit organischen Lösemitteln führt im Allgemeinen zur Denaturierung, welche die biologische Aktivität des Proteins beeinträchtigt. Darüber hinaus können die sehr strengen Anforderungen der Zulassungsbehörden in Bezug auf mögliche Spuren schädlicher Substanzen die Verwendung solcher Formulierungen therapeutischer Wirkstoffe bei menschlichen Patienten verbieten.
Auch Hydrogele werden häufig als Abgabesysteme für Proteine und Peptide verwendet. Hydrogele können durch Vernetzen eines wasserlöslichen Polymers erhalten werden, wodurch sich ein dreidimensionales Netzwerk ergibt, das große Mengen Wasser enthalten kann. Proteine können in das Gel geladen werden, indem das Protein dem Polymer zugegeben wird, bevor die Vernetzungsreaktion durchgeführt wird, oder indem ein vorgeformtes Hydrogel in einer Proteinlösung durchtränkt wird. So müssen keine (aggressivenj organischen Lösemittel zum Beladen der Hydrogele mit Proteinmolekülen verwendet werden.
Im Gegensatz zu den biologisch abbaubaren Polymeren kann die Freisetzung von Proteinen aus Hydrogelen leicht kontrolliert und manipuliert werden, indem die Hydrogeleigenschaften, wie z. B. der Wassergehalt und die Vernetzungsdichte des Gels variiert werden. Jedoch besteht ein Hauptnachteil der derzeit verwendeten Hydrogel-Abgabesysteme darin, dass sie nicht biologisch abbaubar sind. Daher ist eine operative Entfernung des Gels aus dem Patienten nach der Freisetzung des Proteins erforderlich, um Komplikationen aufgrund des Einschlusses des leeren Hydrogelmaterials (häufig wird Wundgewebe gebildet) zu vermeiden.
Biologisch abbaubare Hydrogele wurden bei der Herstellung von Abgabesystemen für Proteinwirkstoffe verwendet. Eines dieser Systeme umfasst vernetzte Dextrane, die durch Koppeln von Glycidylmethacrylat (GMA) an Dextran und anschließend radikalischer Polymerisation einer wässrigen Lösung von GMA-derivatisiertem Dextran (dex-GMA) erhalten werden. In dieser Hinsicht wird auf Van Dijk-Wolthuis et al. in Macromolecules 28, (1995), 6317–6322 und De Smedt et al. in Macromolecules 28, (1995), 5082–5088 Bezug genommen.
Proteine können in den Hydrogelen verkapselt werden, indem sie einer Lösung von GMA-derivatisiertem Dextran vor der Vernetzungsreaktion zugegeben werden. Es scheint, dass die Freisetzung der Proteine aus diesen Hydrogelen von dem Vernetzungsgrad und dem Wassergehalt des Gels abhängt und dadurch kontrolliert werden kann (Hennink et al., J. Contr. Rel. 39, (1996), 47–57).
Obwohl erwartet wurde, dass die beschriebenen vernetzten Dextran-Hydrogele biologisch abbaubar sind, sind diese Hydrogele unter physiologischen Bedingungen ziemlich stabil. Dies wird in Beispiel 5 weiter ausgeführt. Unter anderem wird gezeigt, dass die Auflösezeit von Dextran-Hydrogelen, die durch Polymerisation von mit Glycidylmethacrylat derivatisiertem Dextran (DS = 4) erhalten werden, ungefähr 100 Tage beträgt. Dextran-Hydrogele, in denen die Dextrane einen höheren Substitutions grad aufwiesen, zeigten sogar bei extremen Bedingungen während 70 Tagen keine Anzeichen eines Abbaus.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Abgabesystem mit langsamer oder kontrollierter Freisetzung zu schaffen, das die vorstehend genannten Nachteile nicht besitzt und insbesondere keine Verwendung organischer Lösemittel erfordert, keine unerwünschten und unkontrollierbaren Ausbrucheffekte zeigt und kein schlecht kontrollierbares Freisetzungsverhalten besitzt. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die Vorteile beider Arten bekannter Abgabesysteme zu kombinieren, nämlich ein System, das unter physiologischen Bedingungen (biologisch) abbaubar ist – entweder chemisch und/oder enzymatisch – mit kontrollierter Freisetzung eines Proteinwirkstoffs.
Die vorliegende Erfindung schafft sichere und einfach kontrollierbare Abgabesysteme auf Basis bestimmter biologisch abbaubarer Hydrogele, welche die Anwendbarkeit von Proteinwirkstoffen für die Behandlung vieler Erkrankungen erhöhen. Die mit diesen Wirkstoffen verbundenen Risiken, wie Ausbrüche im Freisetzungsprofil und die Unannehmlichkeiten für den Patienten sind reduziert, während die therapeutische Wirksamkeit von Wirkstoffbehandlungen unter Verwendung der Hydrogele gemäß der vorliegenden Erfindung erhöht ist.
Im Einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein biologisch abbaubares Hydrogel, das Bindungen aufweist, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbar sind. Die Hydrogele gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten hydrolytisch labile Spacer, die im menschlichen oder tierischen Körper gelöst bzw. gespalten werden. Wie vorstehend grob dargestellt wurde, ist ein Hydrogel definiert als ein mit Wasser gequollenes dreidimensionales Netzwerk vernetzter hydrophiler Makromoleküle. Detaillierter gesagt, bestehen die erfindungsgemäßen Hydrogele aus zwei sich durchdringenden Netzwerken, die miteinander durch hydrolysierbare Spacer verbunden sind. Hydrogele enthalten im Allgemeinen 20 bis über 99 Gew.% Wasser.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels, bei dem Makromoleküle, z. B. Polymere, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbare Bindungen enthalten, in einer wässrigen Lösung vernetzt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können alle Arten biologisch abbaubarer Hydrogele verwendet werden, sofern hydrolytisch labile Spacer in diese Strukturen eingeführt werden können. Wenn die Hydrogelstruktur in das System eines menschlichen oder tierischen Körpers gebracht wird, wird sie mehr oder weniger allmählich gespalten. Die Abbauprodukte müssen nach der Therapie nicht entfernt werden. Sie können einfach von dem Körper metabolisiert und/oder ausgeschieden werden.
Vorzugsweise basieren die Hydrogele auf wasserlöslichen Polymeren, die mindestens eine Anzahl von Seitengruppen mit der Fähigkeit aufweisen, Verbindungen zu anderen Polymeren zu bilden, z. B. Dextran oder derivatisierte Dextrane, wobei Stärke und Stärkederivate, Cellulosederivate, wie z. B. Hydroxyethyl- und Hydroxypropylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Proteine, Polyaminosäuren, Polyvinylalkohol, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polyethylenglycole, die eine Anzahl von Monomereinheiten aufweisen, die Seitenketten bilden können, usw., sowie deren Copolymere ebenfalls verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Hydrogele basieren geeigneterweise auf einem Polymer, das mit Methacrylateinheiten vernetzt ist. Andere Vernetzungs einheiten sind Acrylateinheiten, Vinylether und Vinylester sowie andere Einheiten, die dem Fachmann auf dem Gebiet für diesen Zweck bekannt sind.
Im Allgemeinen werden die in der vorliegenden Erfindung verwendeten, mit Wasser quellbaren Hydrogele hydrolysierbar gemacht, indem mindestens eine hydrolytisch labile Einheit in den Spacern zwischen den Hauptketten der wasserlöslichen Polymere und der zweiten Polymerkette eingeführt wird, die durch die vernetzbaren Einheiten, wie in dem vorhergehenden Absatz beschrieben ist, gebildet wird. Es ist auch möglich, Polymerketten zu verwenden, die hydrolytisch labile Monomereinheiten in der Hauptkette aufweisen. Jedoch liegen Hydrogele, die nur Polymerketten enthalten, die nur durch hydrolysierbare Spacergruppen miteinander Kopf-Schwanz-verbunden sind, nicht im Bereich der vorliegenden Erfindung. Im Gegensatz zu erfindungsgemäßen Hydrogelen korreliert der Vernetzungsgrad bei Hydrogelen auf Basis von quellbaren Polymeren, die nur mit labilen Spacern Kopf-Schwanz-substituiert sind, direkt mit dem Wassergehalt des Gels. Das Polymersystem des erfindungsgemäßen Hydrogels macht es möglich, die Freisetzung einer Komponente durch Einstellen des Wassergehalts und/oder des Vernetzungsgrades unabhängig zu kontrollieren.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Hydrogele gemäß der vorliegenden Erfindung als hydrolytisch labile Einheiten hydrolysierbare Lactat- und/oder Carbonatesterbindungen auf. Diese Bindungen können in das Hydrogel gebracht werden, indem z. B. (Poly)glycolsäure- und/oder (Poly)milchsäure-Reste zwischen der Hauptkette des Polymers und den vernetzbaren Gruppen des Polymers eingeführt werden. Mit dem Begriff (Poly)glycolsäure sind sowohl Glycolsäure als auch ihre Di- und Oligomere gemeint. Mit dem Begriff (Poly)milchsäure sind sowohl Milchsäure als auch ihre Di- und Oligomere gemeint. Andere Möglichkeiten für hydrolytisch labile Einheiten basieren auf Einheiten, die Carbonsäureester, Urethane, Anhydride, (Halb)acetale, Amide und Peptidbindungen einführen.
Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden (Poly)glycolsäure- und/oder (Poly)milchsäure-Spacer zwischen polymerisierbare Methacrylatgruppen und Dextran eingeführt. Wird ein aus diesem Material geformtes Hydrogel in eine physiologische Umgebung eingeführt, wird das Hydrogel biologisch abbaubar, wobei Dextran, Polyhydroxyethylmethacrylat (PHEMA), Milchsäure und/oder Glycolsäure als Abbauprodukte resultieren. Diese Abbauprodukte sind alle bioverträglich. Es wird angemerkt, dass Milchsäure und Glycolsäure endogene Verbindungen sind. Dextran ist ein ungiftiges Polymer, das seit vielen Jahren als Plasmaexpander eingesetzt wird und in Abhängigkeit von seinem Molekulargewicht von den Nieren ausgeschieden wird. PHEMA ist ein bekanntes bioverträgliches Polymer, das wahrscheinlich ebenfalls über die Nieren ausgeschieden wird.
Erfindungsgemäße Hydrogele können geeigneterweise hergestellt werden, indem zunächst Spacer synthetisiert werden, die mindestens eine vernetzbare Gruppe und mindestens eine hydrolytisch labile Gruppe enthalten; solche Spacer mit einem wasserlöslichen Polymer gekoppelt werden und die erhaltenen Polymere vorzugsweise in der Gegenwart der freizusetzenden Komponente vernetzt werden.
Bevorzugte Spacer gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen eine Hydroxyethylmethacrylat-(HEMA)-Gruppe, die mit einer oder mehreren Lactid- und/oder Glycolid-Einheiten gekoppelt ist, wie in den Schritten a und b von Schema 1 beispielhaft dargestellt ist. Detaillierter gesagt, kön nen Polymilchsäure-Vorpolymere mit HEMA-Enden durch Lösungspolymerisation von Lactid in Toluol unter Verwendung von HEMA als Initiator und Aluminiumalkoxid als Katalysator oder durch eine Massepolymerisation von Lactid unter Verwendung von HEMA als Initiator und Zinn(II)-octoat als Katalysator synthetisiert werden. In Abhängigkeit von dem Verhältnis HEMA/Milchsäure können Vorpolymere synthetisiert werden, die sich im Molekulargewicht des Milchsäureblocks unterscheiden. Copolymere von Glycolsäure und Glycolsäure-co-Milchsäure mit endständigem HEMA können analog synthetisiert werden. Die Prepolymere können durch bekannte Techniken charakterisiert werden, z. B. NMR- und IR-Spektroskopie, Differentialscanningkalorimetrie (DSC) und Gelpermeationschromatographie (GPC). Um die Polymichsäure- und/oder Polyglycolsäure-Prepolymere mit endständigem HEMA an Dextran zu koppeln, muss die endständige Hydroxylgruppe aktiviert werden. Vorzugsweise wird die Bindung von HEMA an Dextran durch Carbonyldiimidazol (CDI) als Kopplungsmittel bewirkt. Jedoch können auch andere Aktivierungsverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise die Reaktion der Hydroxylfunktion des HEMA-Milchsäure-Prepolymers mit Bernsteinsäureanhydrid und anschließende Aktivierung der gebildeten Carboxylgruppe unter Verwendung eingeführter Verfahren (z. B. Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)). Das letztere Verfahren ergibt Dextranderivate, in denen nur hydrolytisch unstabile Esterbindungen vorliegen, die unterschiedliche Abbaueigenschaften im Vergleich zu den mit dem CDI-Verfahren synthetisierten Dextranderivaten schaffen, bei denen sowohl Esterbindungen als auch Carbonatbindungen vorliegen.
Die aktivierten Polymilchsäure- und/oder Polyglycolsäure-Prepolymere mit endständigem HEMA werden anschließend in einem geeigneten aprotischen Lösemittel (wie z. B. DMSO) in der Gegenwart eines Katalysators, z. B. N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP), an Dextran gekoppelt. Der Sub stitutionsgrad (d. h. die Anzahl von Molen des Methacrylatgruppen enthaltenden Prepolymers pro 100 Mol Dextran-Glucoseeinheiten), kann durch das Verhältnis von HEMA enthaltenem Prepolymer zu Dextran in dem Reaktionsgemisch maßgeschneidert werden.
Aus diesen substituierten Polymeren werden Hydrogele z. B. durch eine radikalische Polymerisation einer wässrigen Lösung von mit HEMA-Prepolymer funktionalisiertem Dextran unter Verwendung eines bekannten Initiatorsystems aus einem tertiären Amin und einem Persulfat hergestellt (siehe z. B. die vorstehend zitierten Artikel von Van Dijk-Wolthuis et al. in Macromolecules 28 und Hennink et al. in J. Contr. Rel. 39). Es ist auch möglich, eine Polymerisation mit Gamma-Bestrahlung einzusetzen mit dem Vorteil, das keine Initiator- und/oder Katalysatorrückstände aus dem Hydrogel extrahiert werden müssen.
Das Hydrogelsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann einfach unter Berücksichtigung der Freisetzungskinetiken von Proteinwirkstoffen maßgeschneidert werden, wodurch die Anwendbarkeit von Proteinwirkstoffen enorm erweitert wird. Insbesondere im Falle von Modifikatoren einer biologischen Antwort mit einem engen therapeutischen Fenster, die bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen unter Beteiligung des Immunsystems nützlich sind, ist dies sehr wichtig.
Ein steigender Substitutionsgrad (DS; Menge an hydrolysierbarem Spacer, der vernetzbare Zweige aufweist, pro 100 Einheiten des wasserlöslichen Hauptpolymers; bestimmbar durch ¹H-NMR) ergibt ein stärker vernetztes Netzwerk. Dies führt zu einer langsameren Quellrate und einer verlängerten Auflösezeit des Gels.
Die Hydrogele gemäß der vorliegenden Erfindung können so hergestellt werden, dass Auflösezeiten von weniger als 1 Tag bis zu ungefähr 3 Monaten und länger erhalten werden können. Dies kann beispielsweise durch Variieren des anfänglichen Wassergehalts der zu vernetzenden wässrigen Polymerlösung und des DS bewirkt werden. Gele mit einem hohen anfänglichen Wassergehalt, wie z. B. Wassergehalte von über 85 Gew.-%, enthalten überwiegend intramolekulare Vernetzungen, während niedrigere anfängliche Wassergehalte mehr intermolekulare Vernetzungen ergeben. Gele mit weniger intermolekularen Vernetzungen lösen sich bei gleichem DS schneller auf.
Wirkstoffe können entweder durch Gleichgewichtseinstellung in einer wirkstoffhaltigen Lösung (siehe z. B. Kim et al. in Phar. Res. 9 (3) (1992) 283–290) oder durch Einfügen des Wirkstoffs während der Hydrogelherstellung (siehe z. B. Heller et al. in Biomaterials 4, (1983) 262–266) in Hydrogele geladen werden.
Das Beladen durch Gleichgewichtseinstellung führt jedoch normalerweise zu einem ziemlich geringen Wirkstoffgehalt in dem Abgabesystem. Dies ist insbesondere der Fall, wenn der Wirkstoff eine makromolekulare Substanz ist. Sofern die Porengröße des Hydrogels nicht ziemlich groß ist, haften die Makromoleküle nur an der äußeren Oberfläche, was zu einer Ausbruch-Freisetzung führen kann.
Daher wird der Wirkstoff vorzugsweise während der Polymerisation oder des Vernetzens geladen.
Da Suspensionen von Mikrokügelchen einfach herzustellen und einfach für eine Injektion zu verwenden sind, werden die Hydrogele im Allgemeinen als Mikrokügelchen verschiedener Größen angewandt. Mikrokügel chen können durch Lösen von mit HEMA derivatisiertem Dextran in Wasser hergestellt werden, wonach diese Lösung einer Ölphase (z. B. Silikonöl) zugegeben wird, sodass sich eine Wasser-in-Öl-Emulsion ergibt. Nach Zugabe eines geeigneten Initiatorsystems polymerisieren die Methacrylatgruppen, sodass sich stabile Mikrokügelchen ergeben.
Die Wirkstoffe werden aus dem biologisch abbaubaren Hydrogelen gemäß der vorliegenden Erfindung während der Hydrolyse des Hydrogels freigesetzt, obgleich zumindest in gewissem Ausmaß eine Diffusion von Proteinen aus dem Hydrogel stattfindet. Tatsächlich kann das Hydrolyseverhalten des Hydrogels und die Zeit, während der in dem Hydrogelsystem vorliegende Komponenten freigesetzt werden, so aufeinender eingestellt werden, dass die Freisetzung bei einem beliebigen Niveau zwischen Freisetzung erster Ordnung (kein Abbau des Hydrogels) und nullter Ordnung (vollständig vom Abbau kontolliert) stattfinden kann (siehe in dieser Hinsicht nachstehend Beispiel 6). Dies schafft einen offensichtlichen Vorteil gegenüber Hydrogelsystemen, die unter physiologischen Bedingungen nicht hydrolysierbar sind, aber ziemlich stabil sind, wie das bekannte Dextran-GMA-Hydrogelsystem, oder gegenüber Systemen, in denen die Polymere in dem Hydrogel nur in einer Dimension verlängert sind.
Proteinwirkstoffe werden aus den ziemlich stabilen Hydrogelen gemäß Kinetiken erster Ordnung freigesetzt – die Proteinfreisetzung ist proportional zur Quadratwurzel der Zeit -, die für monolithische Abgabesysteme üblich sind. Die Hydrogele gemäß der vorliegenden Erfindung zeigen jedoch eher ein Freisetzungsverhalten nullter Ordnung – die Proteinfreisetzung ist proportional zur Zeit. Wenn sich das Hydrogel während des Freisetzungsvorgangs abbaut, steigt der Diffusionskoeffizient des in dem Hydrogel vorliegenden Proteinwirkstoffs. Dies führt zu einer konstanteren Freisetzung über die Zeit.
Das Hydrogelsystem der vorliegenden Erfindung bietet, wie gesagt, die Möglichkeit, die Freisetzungsprofile verkapselter Proteinwirkstoffe maßzuschneidern. Im Einzelnen kann die Abbaurate des Hydrogels durch Variieren des Wassergehalts des Hydrogels, des Substitutionsgrades, der Anzahl und Länge hydrolysierbarer Gruppen in den Spacern und der Wahl der hydrolysierbaren Spacer eingestellt werden.
Es wurde ermittelt, dass Spacer auf Glycolsäurebasis eine höhere Hydrolyseempfindlichkeit aufweisen als Spacer auf Milchsäurebasis. Liegen Spacer auf Glycolsäurebasis vor, wird eine beschleunigte Abbaurate des Hydrogels im Vergleich zu Spacern auf Milchsäurebasis beobachtet.
Die Wirkung des Wassergehalts des Hydrogels und des Substitutionsgrades der Hydrogelpolymere wird in den nachstehend folgenden Beispielen ausgeführt.
Darüber hinaus hängt die Freisetzungsrate von der Größe der Hydrogelpartikel ab. Diese Größe kann durch Variieren der Rührgeschwindigkeit, der Viskosität der äußeren Phase usw. während der Herstellung von Mikrokügelchen eingestellt werden.
Die Freisetzungsrate hängt nicht von der Länge der wasserlöslichen Polymere ab, zumindest nicht in einem hohen Ausmaß. Dies steht im Gegensatz zu Hydrogelsystemen, in denen die hydrolysierbaren Gruppen nur in der Hauptkette des Polymers vorliegen (eindimensional verlängerte Polymere).
Wie vorstehend dargelegt wurde, kann die freisetzbare Komponente ein Proteinwirkstoff sein. Jedoch ist es auch möglich, Pharmaka, die Nanopar tikel enthalten, z. B. Liposome, ISCOMs, Polymilchsäurepartikel, Polycaprolactonpartikel und Genabgabesysteme, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, zu verkapseln. Die Verkapselung dieser Nanopartikel hat den Vorteil, dass das Auftreten einer zu schnellen Freisetzung der verkapselten Komponente verhindert wird oder, in anderen Worten, Ausbruch-Effekte auf sicherere Weise vermieden werden können.
Ein Beispiel für ein beladenes Hydrogelsystem gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Hydrogel, welches das Cytokin Interleukin-2 (IL-2) enthält. IL-2 ist ein Proteinwirkstoff, der z. B. bei der Behandlung bestimmter Arten von Krebs verwendet werden kann.
Damit IL-2 bei einer Krebsbehandlung therapeutisch wirksam werden kann, ist eine verlängerte Anwesenheit von IL-2 an der Stelle des Tumorwachstums erforderlich. Dies kann entweder durch Verabreichen hoher Dosen von IL-2 intravenös durch häufige Bolusinjektionen (siehe z. B. Rosenberg et al., JAMA 271, (1994) 907–913), durch verlängerte permanente Infusion (siehe z. B. West et al., N. Engl. J. Med. 316, (1987) 898-905) oder durch häufige Verabreichung geringer Dosen von IL-2 intra- oder peritumoral (siehe z. B. Den Otter et al., Anticancer Res. 13, (1993) 2453–2455) erreicht werden.
Ein Hauptnachteil des intravenösen Weges besteht darin, dass zum Erreichen ausreichend hoher IL-2-Spiegel an der Stelle des Tumorwachstums so hohe IL-2-Dosen intravenös verabreicht werden müssen, dass es stark toxisch wird. Im Gegensatz dazu hat sich der intra- oder peritumorale, von Den Otter et al. entwickelte Ansatz bei verschiedenen transplantierten und spontanen Tumoren als sehr erfolgreich und praktisch ungiftig erwiesen.
Ein ernsthaftes Problem für die Anwendung dieser Therapieform bei menschlichen Krebspatienten besteht jedoch darin, dass IL-2 5 bis 10 Mal innerhalb von 1 bis 2 Wochen intra- oder peritumoral injiziert werden muss. Bei vielen Krebsarten ist das eine nicht tragbare Belastung für den Patienten, wie in Fällen von Lungenkrebs, Blasenkrebs und Magenkrebs. Bei ersten Versuchen, die sehr wirksame lokale, niedrig dosierte Il-2-Behandlung in die menschliche Krebsklinik zu übertragen, wurden diese logistischen Probleme der IL-2-Abgabe bereits angetroffen. Das Abgabesystem mit langsamer Freisetzung gemäß der vorliegenden Erfindung macht den Einsatz lokaler IL-2-Immuntherapien möglich.
Für die in-vivo-Anwendung enthalten Hydrogel-Suspensionen (Mikrokügelchen) normalerweise bis zu 10⁵ I. E. IL-2 in 0,5 ml, die während eines Zeitraums von 5 Tagen freigesetzt werden (d. h. pro Tag werden 2 × 104 I. E. IL-2 freigesetzt). Die freigesetzte Proteinmenge kann mit empfindlichen quantitativen Detektionsverfahren (HPLC, ELISA-Assays) bestimmt werden. Um zu untersuchen, ob das freigesetzte IL-2 noch biologisch aktiv ist und in welchem Ausmaß (d. h. was ist die Wirkung dieser chemischen Verfahren auf die spezifische Aktivität von IL-2), können Proliferations-Assays unter Verwendung der von IL-2 abhängigen CTLL-Zellinie durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun noch eingehender erklärt, wobei auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele Bezug genommen wird.
Beispiele
Um ein Dextran-Hydrogel zu erhalten, wurde zuerst eine polymerisierbare Methacrylatgruppe in Dextran eingeführt. Für alle nachstehend beschrieben Reaktionen wurde Dextran von Fluka (T40, M_n = 15.000, M_w = 32.500 g/mol) verwendet. Vier verschiedene Dextranderivate wurden synthetisiert (Beispiele 1–4), in denen der Methacrylatester über einen Spacer an Dextran gekoppelt war. Der Spacer enthält verschiedene hydrolysierbare Bindungen (Carbonat- und/oder Carbonsäureester). Das Abbauverhalten der aus diesen Derivaten hergestellten Gele wurde mit Dextrangelen verglichen, die von Glycidylmethacrylat (dex-GMA) stammen. Bei dieser Bezugsverbindung ist der Methacrylatester direkt an eine Hydroxylgruppe von Dextran gekoppelt. Dieses Bezugsgel baut sich äußerst langsam ab.
Beispiel 1: Synthese von dex-HEMA
Mit Hydroxyethylmethacrylat derivatisiertes Dextran (dex-HEMA) wurde synthetisiert, indem mit Carbonyldiimidazol (CDI) aktiviertes HEMA (HEMA-CI) an Dextran gekoppelt wurde.
CDI (1,62 g; 10 mmol) wurde in ungefähr 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Diese Lösung wurde zu einer Lösung von HEMA (1,30 g; 10 mmol) in 5 ml wasserfreiem THF gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdampfen des Lösemittels wurde eine leicht gelbe Flüssigkeit erhalten (Ausbeute 2,93 g). Dieses Rohprodukt wurde in Ethylacetat gelöst, mit Wasser extrahiert, um Imidazol und nicht umgesetztes HEMA zu entfernen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Filtration wurde das Lösemittel verdampft und fast reines, mit CDI aktiviertes Hydroxyethylmethacrylat (HEMA-Cl) erhalten. Die Struktur dieses Produkts wurde durch NMR- und IR-Spektroskopie bestätigt.
Verschiedene Mengen HEMA-Cl (0,73, 1,49 oder 2,19 g; 96% Reinheit) wurden zu einer Lösung von Dextran (10 g; 62 mmol Glucoseeinheiten) und N,N-Dimethylaminopyridin (DMAP; 2 g, 16,4 mmol) in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO; 90 ml) gegeben. Diese Reaktionsgemische wurden 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Reaktion durch die Zugabe von ungefähr 2 ml konzentrierter HCl beendet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage gegen Wasser bei 4°C dialysiert. Dex-HEMA wurde durch Gefriertrocknung isoliert und ergab ein weißes, flaumiges Material (Ausbeute > 90%). Der Grad der HEMA-Substitution wurde durch NMR-Spektroskopie ermittelt und betrug 4, 9 bzw. 13.
Beispiel 2: Synthese von dex-SA-HEMA
Dextran, das mit dem Halbester von Bernsteinsäure (SA) und HEMA (dex-SA-HEMA) derivatisiert ist, wurde wie folgt synthetisiert.
SA (2,00 g, 20 mmol), HEMA (2,6 g, 20 mmol), Triethylamin (TEA; 0,28 ml, 2 mmol) und Hydrochinon (Hemmstoff, ± 10 mg) wurden in ungefähr 30 ml wasserfreiem THF gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Tage bei 45 °C gerührt, wonach das Lösemittel verdampft wurde. Es wurde eine gelbe Flüssigkeit erhalten (Ausbeute: 4,88 g). Die Struktur von HEMA-SA wurde durch NMR- und IR-Spektroskopie bestätigt.
HEMA-SA (0,99 g (94% Reinheit), 4 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC; 0,83 g, 4 mmol) wurden in ungefähr 20 ml wasserfreiem DMSO gelöst. Nach 15 min hatte sich ein Niederschlag gebildet (Dicyclohexylureum; DCU), und dieses Gemisch wurde zu einer Lösung von Dextran (2,57 g, 16 mmol Glucoseeinheiten) und TEA (0,56 ml, 4 mmol) in wasserfreiem DMSO (20 ml) gegeben: Das resultierende Gemisch wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach 3 Tropfen konzentrierte HCl zugegeben wurden, um die Reaktion zu beenden. Danach wurde das Reaktionsgemisch filtriert, um DCU zu entfernen und 3 Tage bei 4 °C dialysiert. Nach Gefriertrocknung wurde ein weißes, flaumiges Produkt erhalten (Ausbeute 2,78 g). Der Substitutionsgrad wurde durch NMR-Spektroskopie festgestellt und betrug 3.
Beispiel 3: Synthese von dex-Lactat-HEMA
Mit HEMA-Oligolactid derivatisiertes Dextran wurde wie folgt gemäß der Darstellung in Schema 1 synthetisiert. Drei Schritte können unterschieden werden.

a. Koppeln von Lactat an HEMA, sodass sich HEMA-Lactat ergibt.
b. Aktivieren von HEMA-Lactat unter Verwendung von CDI, sodass sich HEMA-Lactat-Cl ergibt.
c. Koppeln von HEMA-Lactat-Cl an Dextran.

Ein Gemisch aus L-Lactid (4,32 g; 30 mmol) und HEMA (3,90 g; 30 mmol) wurde auf 110°C erwärmt. Danach wurde eine katalytische Menge in ungefähr 0,5 ml Toluol gelöstes Zinn(II)-octoat (SnOct₂; 121,5 mg, 0,3 mmol) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch in THF (20 ml) gelöst. Diese Lösung wurde in Wasser (180 ml) getropft und der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert. Das Pellet wurde in Ethylacetat (40 ml) aufgenommen, zentrifugiert, um Feststoffmaterial zu entfernen, getrocknet (MgSO₄) und filtriert. Das Lösemittel wurde verdampft, sodass sich ein viskoses Öl (3,74 g, 45%) ergab. Das Produkt (HEMA-Lactat) wurde durch NMR- und IR-Spektroskopie charakterisiert.
HEMA-Lactat (3,74 g, 10,8 mmol) wurde zu einer Lösung von CDI (1,76 g, 10,8 mmol) in THF gegeben und 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, sodass sich ein viskoses Öl ergab. Das als Hauptkomponenten (NMR-Analyse) HEMA- Lactat-Cl und Imidazol enthaltende Produkt wurde ohne weitere Aufreinigung verwendet.
Zu einer Lösung von Dextran (10 g, 62 mmol Glucoseeinheiten) und DMAP (2,0 g, 10,6 mmol) wurden verschiedene Mengen HEMA-Lactat-Cl (1,61, 3,23 bzw. 4,84 g; 80% Reinheit) gegeben. Diese Gemische wurden 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Reaktion durch die Zugabe von ungefähr 2 ml konzentrierter HCl beendet wurde. Die Lösungen wurden 2 Tage gegen Wasser dialysiert. Nach Gefriertrocknung wurden weiße, flaumige Produkte erhalten (Ausbeute um 85%). Der Substitutionsgrad (gemäß Bestimmung durch NMR-Spektroskopie) betrug 3, 6 bzw. 10 für die drei Produkte.
Unter Verwendung ähnlicher Verfahren kann die Länge des Lactat-Spacers durch Ändern des Molverhältnisses von HEMA und Lactid in der ersten Reaktion variiert werden.
Beispiel 4: Synthese von dex-Glycolid-HEMA
Dex-Glycolid-HEMA wurde nach dem gleichen Verfahren, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, synthetisiert, wobei Lactid durch Glycolid ersetzt wurde.
Bezugsbeispiel 1: Dex-GMA
Dex-GMA wurde, wie bei Van Dijk-Wolthuis et al., Macromolecules 28, (1995), 6317–6322 beschrieben, synthetisiert. Eine neue Untersuchung des erhaltenen Dextranderivats zeigte, dass die Methacrylestergruppe direkt an eine der Hydroxylgruppen von Dextran gekoppelt ist, was bedeutet, dass kein Glyceryl-Spacer vorliegt.
Beispiel 5: Herstellung von Dextran-Hydrogelen
Hydrogele wurden durch eine radikalische Polymerisation wässriger Lösungen von methacryliertem Dextran (hergestellt gemäß den Beispielen 1-4 und Bezugsbeispiel 1) erhalten. Methacryliertes Dextran (100 mg) wurde in 760 μl PBS-Puffer (10 mM Phosphat, 0,9% NaCl, 0,02% NaN₃, pH 7,2) gelöst. Zu dieser Lösung wurden 90 μl Kaliumperoxydisulfat (KPS; 50 mg/ml) in dem gleichen Puffer pro Gramm Lösung gegeben und gut gemischt. Anschließend wurde N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED; 50 μl; 20% (Vol./Vol.) in Wasser, pH-Wert auf 7 eingestellt) zugegeben, und die resultierende Lösung wurde schnell in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur polymerisiert, sodass sich nach der Polymerisation ein Hydrogelmaterial mit einem anfänglichen Wassergehalt von 90% (Gew./Gew.) ergab.
Die Gele wurden aus den Röhrchen entnommen, genau gewogen und in PBS bei 37°C inkubiert. Regelmäßig wurde das Gewicht der Gele bestimmt und dazu verwendet, den Quellgrad (= W_t/Wo, wobei W_t das Gewicht des Gels am Zeitpunkt t und Wo das Anfangsgewicht des Gels ist) zu berechnen. Die Hydrogelabbau-(Auflöse-)zeit ist definiert als die Zeit, bei der das Quellverhältnis = 0 (oder W_t = 0) ist.
1 zeigt das Quellverhalten von drei verschiedenen Dextran-Hydrogelen (anfänglicher Wassergehalt 90%). Das dex-GMA (DS = 4) erreichte eine Gleichgewichtsquellung nach 3 Tagen. Danach blieb das Gewicht der Gele konstant, was zeigt, dass keine signifikante Hydrolyse von Methacrylestern auftrat. Dex-HEMA und dex-Lactat-HEMA zeigten eine mit der Zeit zunehmende Quellung bis sich diese Gele vollständig gelöst hatten. Dies zeigt, dass bei diesen Hydrogelsystemen eine Hydrolyse von Carbonat estern (dex-(Lactat-)HEMA) und/oder Lactatestern (dex-Lactat-HEMA) auftrat.
2 zeigt das Quellverhalten von dex-Lactat-HEMA-Hydrogelen (anfänglicher Wassergehalt 92%) mit verschiedenen Substitutionsgraden. Wie zu sehen ist, führte ein steigender DS zu einer längeren Auflösezeit.
3 zeigt das Quellverhalten von dex-Lactat-HEMA-Hydrogelen mit einem festen DS (6) und unterschiedlichem anfänglichen Wassergehalt. Es scheint, dass sich die Auflösezeit mit einem steigenden anfänglihen Wassergehalt verlängert.
4 zeigt das Quellverhalten von dex-SA-HEMA-Hydrogel (DS 3) und einem variierenden anfänglichen Wassergehalt.
Die folgenden Tabellen geben einen Überblick über die Auflösezeiten verschiedener Dextran-Hydrogele.
Die Auflösezeiten von Dextran-Hydrogelen (anfänglicher Wassergehalt 92%), die durch Polymerisieren von mit GMA derivatisiertem Dextran (DS 4) erhalten wurden, betrugen ungefähr 100 Tage (pH 7,2, 37°C). Durch Polymerisieren von mit GMA derivatisiertem Dextran erhaltene Gele (anfänglicher Wassergehalt 80%, DS 11) zeigten während 70 Tagen sogar bei extremen Bedingungen (37°C, pH 12 und pH 1) keine Anzeichen eines Abbaus (verstärktes Quellen).
Beispiel 6: Proteinfreisetzung aus sich abbauenden Dextran-Hydrogelen
Die Freisetzung aus sich nicht abbauenden dex-GMA-Hydrogelen wurde ausführlich untersucht. Es schien, dass wenn der Proteindurchmesser kleiner als die Mesh-Größe des Hydrogels war, die Freisetzung des Proteins zutreffend durch die Theorie des freien Volumens beschrieben werden konnte. In diesem Fall war die Gesamtmenge an freigesetztem Protein proportional zur Quadratwurzel der Zeit (W. E. Hennink, Controlled release of proteins from dextran hydrogels, Journal of Controlled Release 39, (1996) 47–55).
5 zeigt die Freisetzung eines Modellproteins (IgG) aus sich abbauenden Dextran-Hydrogelen (dex-Lactat-HEMA, DS 2,5). Die Freisetzung von IgG aus diesen sich abbauenden Gelen ist nullter Ordnung (Gesamtfreisetzung proportional zur Zeit). Dies steht im Gegensatz zu der Freisetzung von Proteinen aus sich nicht abbauenden Dextran-Hydrogelen, bei denen eine Freisetzung erster Ordnung beobachtet wurde.

Claims

Arzneimittelabgabesystem auf Basis eines biologisch abbaubaren Hydrogels, umfassend ein Netzwerk aus Polymerketten, worin die Polymerketten miteinander durch Spacer verbunden sind und die Spacer eine Vernetzungseinheit und wenigstens eine unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbare Bindung umfassen, wobei die wenigstens eine unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbare Bindung aus der Gruppe aus ein oder mehreren Lactateinheiten, ein oder mehreren Glycolateinheiten, ein oder mehreren Carbonateinheiten, ein oder mehreren Succinateinheiten, ein oder mehreren Carbonsäureestereinheiten, Urethanbindungen, Anhydridbindungen, (Halb)acetalbindungen, Amidbindungen, Peptidbindungen und Gemischen aus diesen Einheiten und Bindungen ausgewählt ist, und einen Wirkstoff, wobei der Wirkstoff beim Abbau der hydrolytisch labilen Spacer freigesetzt wird.
Arzneimittelabgabesystem nach Anspruch 1, worin die wenigstens eine unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbare Bindung aus der Gruppe aus ein oder mehreren Lactideinheiten, ein oder mehreren Glycolideinheiten sowie Gemischen aus Lactid- und Glycolideinheiten ausgewählt ist.
Arzneimittelabgabesystem nach Anspruch 1 oder 2, worin die Polymerketten auf Dextran oder einem derivatisiertem Dextran basieren.
Arzneimittelabgabesystem nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Vernetzungseinheit eine Methacrylateinheit ist.
Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels, umfassend ein Netzwerk aus Polymerketten, wobei die Polymerketten miteinander durch Spacer verbunden sind, die aus vernetzten Einheiten bestehenden, wobei die Spacer zwischen den Polymerketten und der vernetzten Einheit Bindungen aufweisen, welche unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbar sind, und man bei dem Verfahren wenigstens zwei vernetzbaxe Einheiten in einem wässrigen Medium vernetzt.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Polymerketten auf Dextran oder einem derivatisiertem Dextran basieren.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin die unter physiologischen Bedingungen hydrolysierbaren Bindungen aus der Gruppe aus ein oder mehreren Lactateinheiten, ein oder mehreren Glycolateinheiten, ein oder mehreren Carbonateinheiten, ein oder mehreren Succinateinheiten, ein oder mehreren Carbonsäureestereinheiten, Urethanbindungen, Anhydridbindungen, (Halb)acetalbindungen, Amidbindungen, Peptidbindungen und Gemischen aus diesen Einheiten und Bindungen ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin ein Wirkstoff während des Vernetzungsschritts anwesend ist.