DE69520613T2

DE69520613T2 - Injizierbares Verabreichungssystem für Arzneistoffe auf Kollagen-Basis und seine Verwendung

Info

Publication number: DE69520613T2
Application number: DE69520613T
Authority: DE
Inventors: Richard A. Berg; Joel S. Rosenblatt
Original assignee: Cohesion Technologies Inc
Current assignee: Surgical Specialties US Corp
Priority date: 1994-02-09
Filing date: 1995-02-06
Publication date: 2001-09-06
Anticipated expiration: 2015-02-07
Also published as: CA2140053A1; JPH0834747A; AU701743B2; US5807581A; EP0671165B1; DE69520613D1; CA2140053C; EP0671165A3; AU1029595A; EP0671165A2; JP2006131648A

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein System zur Langzeit-Abgabe eines Arzneimittels, bzw. Wirkstoffs, an einen Patienten. Spezieller betrifft sie ein injizierbares Arzneimittel- Abgabesystem und seine Verwendung, um die Abgabe eines Arzneimittels an einen Patienten mit Langzeitwirkung über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten.

Hintergrund der Erfindung

Während der letzten 25 Jahre nahm die Erkenntnis zu, daß der Weg auf dem Arzneimittel an Patienten verabreicht werden, eine wichtige Rolle bei ihrer Wirksamkeit spielen kann. Eine Vielfalt von Systemen zur Steuerung und Aufrechterhaltung der Abgabe von Arzneimitteln an Patienten ist beschrieben worden. Diese umfassen Systeme, bei denen die Geschwindigkeit der Arzneimittel-Abgabe gesteuert wird durch die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel osmotisch aus einem Reservoir gepumpt wird, die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel von einem Träger abgespalten wird, die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel aus einer Umhüllung freigesetzt wird, und die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel durch eine Membran oder aus einer Matrix diffundiert, um nur einige übliche Methoden zu nennen.
Diese Systeme zur Arzneimittel-Abgabe können auf verschiedene Weisen verwendet werden. Z. B. können sie auf für Arzneimittel durchlässige Membranen des Körpers, wie auf die Haut oder die Schleimhaut des Mundes, in Körperhöhlen, wie den Magen, den Dickdarm, oder die Bindehaut des Auges, auf/eingebracht werden oder sie können in vivo durch Injektion oder Implantation verwendet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft ein System, das zum Zeitpunkt der Verabreichung flüssig ist und sich somit zur Injektion eignet.
Die Arzneimittel-Abgabesysteme nach der Erfindung verwenden Collagen als eine Komponente. Collagen ist als Komponente für Arzneimittel-Abgabesysteme erwähnt worden aber, soweit bekannt, nicht in dem Zusammenhang wie bei der vorliegenden Erfindung.
Collagen ist die hauptsächliche Proteinkomponente von Knochen, Knorpeln, Haut und Bindegewebe von Tieren. Collagen ist in seiner nativen Form typischerweise ein steifes, stäbchenförmiges Molekül mit einer Länge von etwa 300 nm und einem Durchmesser von etwa 1,5 nm. Es besteht aus drei Collagen-Polypeptiden, die eine dichte Tripel-Helix bilden. Die Collagen-Polypeptide sind gekennzeichnet durch einen langen Mittelbereich mit der wiederkehrenden Sequenz -Gly-X-Y-, wobei X und Y häufig Prolin oder Hydroxyprolin sind, das an jedes Ende der "Telopeptid"-Bereiche gebunden ist, die weniger als etwa 5% des Moleküls ausmachen. Die Telopeptid-Bereiche der Collagen-Ketten sind typischerweise verantwortlich für die Vernetzung zwischen Ketten und für die Immunogenität des Proteins. Collagen tritt in verschieden "Typen" auf, die unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben. Die am häufigsten vorkommenden Typen sind die Typen I-III.
Collagen wird typischerweise aus natürlichen Quellen, wie Rinderhäuten, -knorpeln oder -knochen, gewonnen. Knochen werden üblicherweise getrocknet, entfettet, zerstoßen und entmineralisiert, um Collagen zu extrahieren, während Häute und Knorpel üblicherweise fein zerkleinert und mit proteolytischen Enzymen (außer Collagenase) abgebaut werden. Da Collagen gegenüber den meisten proteolytischen Enzymen resistent ist, dient dieses Verfahren bequemerweise dazu, den größten Teil des verunreinigenden Proteins, das sich zusammen mit Collagen findet, zu entfernen.
Daniels et al. beschreiben in der US-PS 3 949 073 die Herstellung von löslichem Collagen durch Auflösen von Gewebe in wäßriger Säure und anschließenden enzymatischen Abbau. Das erhaltene Atelopeptid Collagen ist löslich und wesentlich weniger immunogen als unmodifiziertes Collagen. Dieses Material ist jetzt von Collagen Corporation (Palo Alto, CA) unter dem Handelsnamen Zyderm® Collagen Implant im Handel erhältlich
Luck et al. beschreiben in der US-PS 4 488 911 ein Verfahren zur Herstellung von Collagen in Lösung (CIS), bei dem natives Collagen aus tierischem Gewebe in verdünnter wäßriger Säure extrahiert und anschließend mit einem Enzym, wie Pepsin, Trypsin oder Pronase®, abgebaut wird. Durch den enzymatischen Abbau werden die Telopeptid-Anteile der Collagen-Moleküle entfernt und man erhält "Atelopeptid"- Collagen in Lösung. Das so gebildete Atelopeptid CIS ist im wesentlichen nichtimmunogen und ist auch im wesentlichen nicht vernetzt, aufgrund des Verlustes der primären Vernetzungsbereiche. Das CIS kann dann durch Dialyse in einer Umgebung mit mäßigen Scherkräften ausgefällt werden unter Bildung von Collagen-Fasern, die an native Collagen-Fasern erinnern. Die ausgefällten rekonstituierten Fasern können zusätzlich vernetzt werden unter Verwendung eines chemischen Mittels (z. B. von Aldehyden, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd) Wärme oder Bestrahlung.
Smestad et al. beschreiben in der US-PS 4 582 640 eine mit Glutaraldehyd vernetzte Atelopeptid CIS-Zubereitung (GAX), die geeignet ist zur Verwendung in medizinischen Implantaten. Das Collagen wird unter Bedingungen vernetzt, die eher eine intrafibräre als eine interfibräre Bindung begünstigen. Ein solches Produkt ist von Collagen Corporation unter dem Handelsnamen Zyplast® Collagen Implant im Handel erhältlich.
Die folgende Reihe von verwandten Patenten beschreibt verschiedene Arten von Collagen enthaltenden Materialien. Die Patente sind die US-PS 4 703 108, erteilt am 27.10.1987, 4 861 714, erteilt am 29.8.19989, 4 863 856, erteilt am 5.9.1989, 4 925 924, erteilt am 15.5.1990, 4 970 298, erteilt am 13.11.1990 und 4 997 753, erteilt am 5.3.1991. Diese Patente beschreiben Collagen-Materialien, bei denen Collagene vom Typ I, II und II mit einem Vernetzungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cabodiimid oder einem aktiven Succinimidyl-ester, in Kontakt gebracht wurden.
Rhee et al. beschreiben in der US-PS 5 162 430 die Verwendung von hydrophilen synthetischen Polymeren, um mit Collagen chemisch ein Konjugat zu bilden. Die Möglichkeit des Einbaus biologisch aktiver Faktoren, wie Epidermis-Wachstumsfaktor, in das Konjugat wird angegeben, ebenso wie die Möglichkeit, eine Reaktion zwischen dem Collagen und dem synthetischen Polymer in situ nach der Injektion durchzuführen. In dieser Patentschrift wird erwähnt, daß das hydrophile Vernetzungs-Polymer Collagen an Glycosaminoglycane, Chondroitinsulfate, Fibronectin und Wachstumsfaktoren binden kann und daß das Anbinden ein wirksames Abgabesystem mit langsamer Freisetzung des Arzneimittels ergeben kann.
Als weiterer Hintergrund soll darauf hingewiesen werden, daß der Miterfinder Rosenblatt u. a. die Freisetzungsgeschwindigkeit von Arzneimitteln aus Gemischen von nicht vernetztem Collagen und flexiblen Polymeren an der University of Maryland vor der Einreichung der vorliegenden Anmeldung untersuchten.

Beschreibung der Erfindung

Es ist jetzt festgestellt worden, daß Arzneimittel mit Langzeitwirkung aus einem in vivo Depot abgegeben werden können, das aus einer injizierbaren Zubereitung auf Collagen-Basis besteht. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die flüssige Zubereitung, wenn sie injiziert wird, flüssig aber wird in situ vernetzt unter Bildung einer vernetzten Collagen-Matrix, die das abzugebende Arzneimittel einschließt. Die Zubereitung enthält auch ein Polymer mit flexibler Kette, das elektrostatisch oder ionisch in der Ladung dem Collagen vor der Vernetzung entspricht. Dieses Polymer mit flexibler Kette ist ebenfalls in der Matrix eingeschlossen und verändert die effektive Porosität der Matrix Das Arzneimittel diffundiert aus der Matrix mit einer Geschwindigkeit, die von der effektiven Porosität und der Steifigkeit der Matrix abhängt.
So liefert die Erfindung gemäß einer Ausführungsform eine injizierbare Zubereitung mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung wie in Anspruch 1 definiert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform liefert die Erfindung eine subdermale Zubereitung mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung wie in Anspruch 26 definiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren pharmazeutisch annehmbaren Zubereitung, die in der Lage ist, ein Arzneimittel-Abgabedepot mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung zu bilden, wie in Anspruch 27 definiert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Erfindung wird unter Bezug auf die Zeichnungen näher erläutert, wobei:
Fig. 1 eine Grafikist, die die Abgabegeschwindigkeit eines Arzneimittels aus Matrizes auf Collagen-Basis, die kein zugesetztes flexibles Polymer und unterschiedliche Mengen an flexiblem Polymer enthalten, zeigt.
Fig. 2 eine Grafikist, die die Abgabegeschwindigkeit eines Arzneimittels aus einer Collagen-Matrix allein und die Abgabegeschwindigkeit aus einer zweiten Matrix, die zusätzlich ein Polymer mit flexibler Kette enthält, zeigt.

Detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung

Diese detaillierte Beschreibung wird in die folgenden Unterabschnitte, bezogen auf die nach der Erfindung verwendeten Materialien unterteilt:
Collagen
Vernetzungsmittel
Polymere mit flexibler Kette
Arzneimittel
Gesamte injizierbare Zubereitung
Depot-Charakterisitka
Herstellungsverfahren
Anwendungsverfahren
Diesen Unterabschnitten folgen Beispiele, die Ausführungsformen nach der Erfindung angeben.

Collagen

Der Ausdruck "Collagen", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf alle Formen von Collagen, wie sie oben in dem Hintergrund-Abschnitt beschrieben sind, einschließlich solchen, die bearbeitet oder modifiziert worden sind. Das Collagen kann menschlichen oder tierischen Ursprungs sein und kann nach Rekombinationstechniken gebildet worden sein. Nach der vorliegenden Erfindung können diese und andere bekannte Arten von Collagen, einschließlich natürlichem Collagen und verschiedenen Collagen-Derivaten, verwendet werden.
Bevorzugte Collagene sind nicht-immunreaktives Atelopeptid Collagen, wobei die Typen I, II und III bevorzugt sind. Collagene können löslich sein (z. B. im Handel erhältliches Vitrogen® 100 Collagen-in-Lösung) und können die Telopeptid-Bereiche enthalten oder nicht. Collagen kann in Form von rekonstituiertem fibrillären Atelopeptid Collagen, z. B. Zyderm® Collagen Implant (ZCI) sein, ist aber vorzugsweise nicht-fibrilläres Atelopeptid Collagen in Lösung (CIS), wie das Vitrogen-Material. Verschiedene Formen von Collagen sind im Handel erhältlich oder können nach Verfahren hergestellt werden, wie sie z. B. in den US-PS 3 949 073, 4 488 911, 4 424 208, 4 582 640, 4 642 117 4 557 764 und 4 689 399 angegeben sind, auf die hier alle verwiesen wird. Gemische von verschiedenen Arten von Collagen, sowie fibrilläres Collagen, nicht-fibrilläres Collagen und Gemische davon können ebenfalls verwendet werden. Nicht-fibrilläres, Atelopeptid Collagen in Lösung ist bevorzugt.
Wenn fibrilläres Collagen oder anderes vernetztes Collagen als Ausgangsmaterial verwendet wird, kann es von Vorteil sein, es zu einer suspendierbaren Teilchengröße zu zerhacken, zerkleinern oder vermahlen, so daß geeignete injizierbare Materialien daraus hergestellt werden können.
Collagen (und sogar vorher vernetztes Collagen) enthält eine Anzahl an verfügbaren Amino-, Carboxy- und Hydroxy-Gruppen, die als Vernetzungsstellen angewandt werden können. Diese Gruppen sind in der Lage, bei unterschiedlichen pH-Bedingungen verschieden Ladungen annehmen. Z. B. können die Aminogruppen bei pH-Werten unter 8 eine positive Ladung annehmen und zu Ammonium-Gruppen werden. Ähnlich können Carboxyl-Gruppen ungeladen oder negativ geladen sein, abhängig davon, ob sie ionisiert sind oder ihren sauren Wasserstoff verloren haben.
Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich darauf, daß das vernetzte Collagen und das Polymer mit flexibler Kette gleich geladen sind und vermischt werden und miteinander kompatibel sind. So ist es häufig erwünscht, die Ladung des Collagens bei neutralem pH einzustellen. Wege, dies zu erreichen, sind in der Literatur gut dokumentiert. z. B. kann man die Carboxyl-Gruppen verestern, um ihre Fähigkeit, bei neutralem pH eine negative Ladung anzunehmen, auszuschalten und sie Collagen zu verleihen. Die Methylierung der Carboxyl-Gruppen ist die üblichste Veresterung, aber natürlich können, soweit erwünscht, andere ähnliche nicht toxische bekannte Blockierungs-Gruppen angewandt werden. Die in Lysinen in dem Collagen vorhandenen Aminogruppen können durch Umsetzung mit einem aktiven Amid-bildenden Mittel in Amidgruppen umgewandelt werden. Beispiele für diese Stufe umfassen die Succinylierung und Glutarylierung der verfügbaren Amine. Miyata et al. beschreiben in der US-PS 4 165 559 Verfahren, die angewandt werden können, um die Netto-Ionenladung von Collagen zu verändern. Auf diese Patentschrift wird hier verwiesen.
Außer den Verfahren zur Veränderung der Ladung von Collagen, die auf der Blockierung von ionisierbaren Gruppen beruhen, die in nativem Protein auftreten, kann man die Ladung des Collagens auch verändern durch Aufpfropfen von Arten die Sulfonate, Phosphonate, Phosphate und/oder verschieden ionisierbare Amine und ähnliches enthalten, auf das Collagen, um dem Collagen die gewünschte Ladung zu verleihen. Abhängig von der Art des reaktionsfähigen Moleküls, kann eine Carboxyl-Gruppe für jedes Amin, das reagiert, eingebaut werden.

Vernetzungsmittel

Die bevorzugten Materialien nach der Erfindung umfassen zusätzlich ein oder mehrere Vernetzungsmittel. Geeignete Vernetzungsmittel sollten nicht toxisch sein, wenn sie als Teil der injizierbaren Gemische nach der Erfindung durch Injektion verabreicht werden. Sie sollten auch, wenn sie injiziert worden sind, nicht schnell in dem Blut des Patienten dispergiert werden.
In der Theorie könnte man irgendeines der zur Vernetzung von Collagen bekannten Vernetzungsmittel verwenden. Diese umfassen einfache Aldehyd-Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd und Glutaraldehyd, Carbodiimnide und die aktive Succinimidyl- Ester. Vorzugsweise werden jedoch Vernetzungsmittel auf Polymer-Basis verwendet. Diese Materialien sind bevorzugt aufgrund ihrer größeren Molekülgröße, die sich in einer geringeren Toxizität und einer geringeren Geschwindigkeit des Dispergierens nach der Injektion zeigt. Diese polymeren Vernetzungsmittel sind typischerweise auf der Basis von hydrophilen Polymeren, sowohl natürlichen als auch synthetischen.
Der Ausdruck "synthetisches hydrophiles Polymer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein synthetisches Polymer mit einem mittleren Molekulargewicht und einer Zusammensetzung, die das Polymer im wesentlichen mit Wasser verträglich machen, Bevorzugte Polymere sind hochrein oder werden zu einer hochreinen Form gereinigt, so daß das Polymer pharmazeutisch rein ist oder gemacht worden ist. Die meisten hydrophilen Polymere können hydrophil oder sogar wasserlöslich gemacht werden durch Einbau einer ausreichenden Anzahl an Sauerstoff- (oder seltener Stickstoff-) atomen, die zur Bildung von Wasserstoffbrücken in wäßrigen Lösungen verfügbar sind. Bevorzugte Polymere sind hydrophil und vorzugsweise (aber nicht notwendigerweise) wasserlöslich. Hydrophile Polymere, die hier verwendet werden, umfassen Poly(ethylenglykol) (PEG), Poly(oxyethylen), Poly(methylenglykol), Poly(trimethylenglykol), Poly(vinylpyrrolidon) und Derivate davon, wobei PEG besonders bevorzugt ist. Die Polymere können linear oder mehrfach verzweigt sein und sind im wesentlichen nicht vernetzt. Andere geeignete Polymere umfassen Poly(oxyethylen)/Poly(oxypropylen)-Blockcopolymere und -Copolymere. Poly(oxyethylen)/Poly(oxypropylen)-Blockcopolymere mit einem Ethylendiamin-Kern (und die somit 4 Enden aufweisen) stehen ebenfalls zur Verfügung und können bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden.
Natürlich vorkommende Polymere, wie Proteine, Stärke, Cellulose, Dextran und ähnliche eignen sich, obwohl sie nicht unter die Definition "synthetische" hydrophile Polymere fallen, als "hydrophile" Polymere und sind von der Verwendung bei der Durchführung der Erfindung nicht ausgeschlossen. Aufgrund der Leichtigkeit, reine Materialien zu erhalten, sind die synthetischen Polymere bevorzugt.
Alle geeigneten Polymere sind nicht toxisch, nicht zu Entzündungen führend und nicht-immunogen, wenn sie subkutan verabreicht werden, und werden vorzugsweise im wesentlichen in vivo über einen Zeitraum von mindestens einigen Stunden und vorzugsweise mindestens einigen (d. h. zwei) Tagen nicht abgebaut.
Da diese Polymere als Vernetzungsmittel für das Collagen dienen, sollten sie mindestens zwei Stellen enthalten, die mit dem Collagen reagieren und an dieses binden können. Obwohl dies keine Einschränkung der Erfindung darstellt, ist zu bemerken, daß die Collagen-Moleküle Hydroxylgruppen und freie Aminogruppen in Form von Lysin-Resten enthalten. Die Hydroxylgruppen können unter Bildung von Ether- und Ester- Bindungen reagieren, und die freien Aminogruppen können in Vernetzungsreaktionen mit Säure- oder aktiven Ester-Gruppen, die in den polymeren Vernetzungsmitteln vorhanden sind, kovalente Amid-Bindungen bilden. Diese Säure- oder Ester-Gruppen können in die polymeren Vernetzungsmittel über Ether-Bindungen eingebaut werden, die ihrerseits aus Hydroxylgruppen, und besonders aktivierten Hydroxylgruppen, auf den hydrophilen Polymeren gebildet werden, obwohl andere äquivalente Stellen angewandt werden können.
Collagen enthält eine Anzahl von verfügbaren Amino- und Hydroxygruppen, die als Stellen zur Bildung von Vernetzungen angewandt werden können. Das Collagen kann an das Vernetzungsmittel unter Anwendung einer "Bindungsgruppe" gebunden werden, da die nativen Hydroxy- oder Aminogruppen in Collagen und in dem Polymer häufig eine Aktivierung erfordern, bevor sie gebunden werden können. Z. B. kann man Verbindungen, wie Dicarbonsäureanhydride (z. B. Glutar- oder Bernsteinsäureanhydrid) verwenden, um ein Polymer-Derivat (z. B. Succinat) zu bilden, das dann durch Verestern mit einer geeigneten austretenden Gruppe, z. B. N-Hydroxysuccinimid, N,N'-Disuccinimidyl-oxalat, N,N'-Disuccinimidyl-carbonat u. ä. aktiviert werden kann. Siehe auch Davis, US-PS-4 179 337 (auf die hier verwiesen wird) bezüglich weiterer Bindungsgruppen. Verschiedene funktionalisierte Polyethylenglykole wurden wirksam angewandt auf Gebieten, wie der Proteinmodifikation (s. Abuchowski et al., Enzymes as Drugs, John Wiley & Sons: New York, NY (1981) S. 367-383 und Dreborg et al., Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 : 315, auf die beide hier verwiesen wird), der Peptid-Chemie (s. Mutter et al., The Peptides, Academic: New York, NY 2: 285-332 und Zalipsky et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1987) 30: 740, auf die beide hier verwiesen wird) und der Synthese von polymeren Arzneimitteln (s. Zalipsky et al., Eur. Polym. J. (1983) 19: 1177 und Ouchi et al., J. Macromol. Sci. Chem. (1987) A24: 1011, auf die beide hier verwiesen wird).
Derzeit bevorzugte Dicarbonsäureanhydride, die zur Bilddung von aktivierten Vernetzungs-Polymeren verwendet werden, umfassen Glutarsäureanhydrid, Adipinsäureanhydrid, 1,8-Naphthalin-dicarbonsäureanhydrid und 1,4,5,8-Naphthalin-tetracarbonsäuredianhydrid. Das so aktivierte Polymer kann dann mit dem Collagen reagieren unter Bildung einer vernetzten Collagen/Polymer-Zubereitung.
Derzeit bevorzugte hydrophile Polymer-Vernetzungsmittel sind bi- und multifunktionelle Polyethylenglykole (PEG). Bifunktionelles PEG kann seine zwei reaktiven Stellen an einer beliebigen Stellung entlang der Kette haben, aber typischerweise hat es eine reaktive Hydroxylgruppe an jedem Ende, während ein polyfunktionelles Material zusätzliche Gruppen entlang der Kette aufweist.
Bifunktionelles PEG hat vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht von 400 Da bis 100 kDa, insbesondere 3 kDa bis 10 kDa. Multifunktionelles PEG hat vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht zwischen 3 kDa und 100 kDa. Ähnliche Größen sind auch für andere äquivalente Vernetzungsmittel bevorzugt.
Der Fachmann wird erkennen, daß synthetische Polymere, wie Poly(ethylenglykol) praktisch nicht so hergestellt werden können, daß sie genaue Molekulargewichte haben, und daß der Ausdruck "Molekulargewicht", wie er hier verwendet wird, sich auf das mittlere Molekulargewicht einer Anzahl von Molekülen in einer vorgegebenen Probe bezieht, wie es auf dem Gebiet üblich ist. So kann eine Probe von PEG 3 000 ein statistisches Gemisch von Polymer-Molekülen im Bereich eines Gewichts von z. B. 1,5 bis 4,5 kDa enthalten, wobei sich ein Molekül über einen Bereichs leicht von dem nächsten unterscheidet. Die Angabe eines Bereichs für das Molekulargewicht gibt an, daß das mittlere Molekulargewicht irgendeinen Wert zwischen den angegebenen Grenzen haben kann, und kann Moleküle außerhalb dieser Grenzen umfassen. So bezeichnet ein Molekulargewichts-Bereich von 3 kDa bis 10 kDa ein mittleres Molekulargewicht von mindestens 3 kDa und bis zu 10 kDa.

Polymere mit flexibler Kette

Die erfindungsgemäßen Zubereitungen umfassen ein oder mehrere Polymere mit flexibler Kette. Die Polymere mit flexibler Kette, die in den Zubereitungen nach der Erfindung vorhanden sind, sollten biologisch verträglich, nicht toxisch, nicht zu Entzündungen führend und nicht-immunogen sein, wenn sie subkutan verabreicht werden, und werden vorzugsweise in vivo über den gleichen Zeitraum wie das Vernetzungsmaterial im wesentlichen nicht abgebaut (einige Stunden und vorzugsweise einige Tage).
Die Polymere mit flexibler Kette sollten eine Ladung mit gleichem Vorzeichen haben, wie die Ladung auf dem Collagen vor der Vernetzung. Beide Materialien können positiv geladen sein, beide können negativ geladen sein oder beide können ungeladen sein. Am häufigsten sind beide Materialien geladen. Die Gleichheit der Ladung erlaubt es, die beiden Materialien innig miteinander zu vermischen ohne daß Ausfällung eintritt, wie sie zwischen Polymeren unterschiedlicher Ladung auftreten könnte. Hydrophile Polymere mit flexibler Kette sind bevorzugt, aufgrund ihrer Fähigkeit, sich mit Collagen zu vermischen und Wasser aufzunehmen, wenn sie in der Matrix vorhanden sind.
Das Polymer mit flexibler Kette ist gekennzeichnet durch seine relative Persistenz. Es sollte eine Persistenz von nicht mehr als dem 0,1-Fachen der Persistenz des Collagens haben, mit dem es vermischt wird. Collagen hat typischerweise eine Persistenz in der Größenordnung von 150 bis 250 nM. Polymere mit flexibler Kette sollten eine Persistenz von weniger als von weniger als 15 nM, vorzugsweise weniger als 10 nM und insbesondere 2 bis 5 nM aufweisen. Ein anderes Charakteristikum der Polymere mit flexibler Kette, besteht darin, daß sie ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 100 kDa oder darüber und vorzugsweise mehr als 500 kDa, insbesondere mehr als 1 000 kDa aufweisen.
Das Polymer mit flexibler Kette kann ein synthetisches Material sein. Repräsentative synthetische Materialien umfassen z. B.:
Poly(acrylsäure)
Poly(vinylalkohol)
Poly(acrylamid)
Poly(N-isopropylacrylamid)
Poly(methacrylat)
Poly(hydroxyethylmethacrylat)
Poly(vinylacetat)
Copolymere und Derivate dieser Materialien u. a.
Das Polymer mit flexibler Kette kann ein natürlich vorkommendes Material oder ein Derivat eines natürlich vorkommenden Materials, wie ein Glycosaminoglycan, eine Cellulose oder eine Poly(nucleinsäure) sein.
Die Glycosaminoglycane sind komplexe Polysaccharide mit wiederkehrenden Einheiten von entweder der gleichen Saccharid-Untereinheit oder unterschiedlichen Saccharid-Untereinheiten. Einige Beispiele für Glycosaminoglycane umfassen Hyarulonsäure, die Chondroitinsulfate, Chitin, Chitosan und Derivate von allen oder einigen dieser Materialien. Allgemein werden die Glycosaminoglycane aus einer natürlichen Quelle extrahiert, gereinigt und ein Derivat gebildet. Sie können jedoch auch synthetisch durch Mikroorganismen, wie Bakterien, gebildet werden.
Hyaluronsäure umfaßt natürlich vorkommende und synthetische Formen des Polymers mit der Formel
(C&sub8;H&sub1;&sub3;O&sub4;N)n · (C&sub6;H&sub8;O&sub5;)nO - (n = 1 bis n = 500),
und Derivate davon. Die Verbindung umfaßt abwechselnde Einheiten von 1,4- gebundenem N-Acetylglucosamin und Glucuronsäure-Einheiten wie unten angegeben. HYALURONSÄURE
Abwechselnde Einheiten von 1,4-gebundenem N-Acetylglucosamin und Glucuronsäure
Hyaluronsäure ist ein viskoses, hochmolekulares Mucopolysaccharid, das sich in Flüssigkeiten und Bindegewebe von Säugetieren findet. Hyaluronsäure wird typischerweise mit einem Molekulargewicht von mehr als 1 000 kDa und oft mehr als 2 000 kDa erhalten.
Es gibt drei Hauptverbindungen die von dem Ausdruck "Chondroitin-sulfat" umfaßt werden. Diese sind Chondroitin-sulfat A, Dermatan-sulfat (auch bekannt als Chondroitin-sulfat B, ein Isomer von Chondroitin-sulfat A) und Chondroitin-sulfat C. Die Strukturen dieser drei Verbindungen sind im folgenden angegeben. Wiederkehrende Einheit von Chondroitin-sulfat A
Wiederkehrende Einheit von Chondroitin-sulfat C
Wiederkehrende Einheit von Dermatan-sulfat (Chondroitin-sulfat B)
Chitin umfaßt Polymere, enthaltend wiederkehrende Einheiten von N-Acetylglucosamin Die Struktur von Chitin ist im folgenden angegeben. CHITIN
Der Ausdruck "Chitosan" umfaßt sowohl partiell als auch vollständig deacetyliertes Chitin, wie unten angegeben. CHITOSAN partiell deacetyliertes Chitin CHITOSAN vollständig deacetyliertes Chitin

Arzneimittel

Die Arzneimittel, die von den Systemen nach der Erfindung abgegeben werden, sind typischerweise in makromolekularer Form vorhanden. Der Ausdruck "Arzneimittel", wie er hier verwendet wird, ist so definiert, daß er nicht nur Verbindungen oder Arten umfaßt, die selbst inhärent pharmakologisch oder biologisch aktiv sind, sondern auch Materialien, die eine oder mehrere dieser aktiven Verbindungen oder Arten enthalten, kombiniert mit, gebunden an oder auf andere Weise assoziiert mit anderen Materialien wie Polymeren, Trägern, Verkapselungsmitteln und ähnlichem.
Die Systeme nach dieser Erfindung wirken nach dem Prinzip der Diffusion aus einer porösen Matrix. Im molekularen Maßstab besteht die Matrix aus einer Reihe von miteinander verbundenen Fäden, die ein Maschenwerk bilden, im Gegensatz zu zylindrischen Tunneln oder Hohlräumen in einem festen Substrat. Die Poren der Matrix haben eine Größe in der Größenordnung von 3 bis 30 Nanometer als mittlerer Durchmesser. Die Porengröße kann größer gemacht werden durch Anwendung einer Reihe von größeren miteinander verbundenen Fäden, um ein offeneres Netzwerk zu bilden. Fibrilläre, bzw. faserförmige, Matrizes auf Collagen-Basis haben typischerweise größere - Matrizes mit Porengrößen von bis zu 100 nm oder darüber. Bei Porengrößen von 3 Nanometer tritt eine minimale Steuerung der Diffusionsgeschwindigkeit für kleine oder niedermolekulare Arzneimittel mit einem Molekulargewicht von z. B. einigen Hundert Dalton auf.
Arzneimittel mit einem Molekulargewicht (oder scheinbaren Molekulargewicht) von mindestens 10 kDa und so hoch wie 1 000 kDa oder darüber können mit Matrizes mit einer Porengröße von 3 bis 30 Nanometer verwendet werden. Vom Gesichtspunkt der Größe aus haben solche Materialien eine Größe, die im wesentlichen in Wechselwirkung tritt mit und im wesentlichen beschränkt ist durch die vernetzte starre Matrix. Das tritt bei Arzneimitteln ein, die eine Größe von z B mindestens 3 nm entlang ihrer längsten Achse haben. Bevorzugte Arzneimittel sind 4 bis 5 nm oder größer, entlang ihrer längsten Achse.
Diese Arzneimittel können Moleküle sein, die selbst diese erwünschten hohen Gewichte und großen Größen aufweisen. Derartige Materialien umfassen Gerinnungsfaktoren, Wachstumsfaktoren und Cytokine, um nur drei repräsentative Klassen zu nennen. Gerinnungsfaktoren umfassen Faktor 8, Faktor 9 und Protein C. Cytokine umfassen Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (MCSF) und Erythropoein.
Einige dieser potentiellen Arzneimittel sind Materialien wie Proteine, die in der Theorie mit dem Vernetzungsmittel reagieren und sich selbst in das vernetzte Collagen- Netzwerk einbinden könnten. Dies wäre nicht erwünscht, da diese Bindung wahrscheinlich die erwünschte Freisetzung des Arzneimittels verhindern würde. Diese unerwünschte Wirkung kann vermieden werden durch Schützen oder Blockieren von potentiell reaktiven Stellen auf dem Arzneimittel. Poly(ethylenglykol) kann mit dem Arzneimittel umgesetzt werden, um diese unerwünschten Reaktionen zu vermeiden. Diese Stufe, die als "Behandeln mit PEG, bzw. PEGylieren" des Arzneimittels bezeichnet wird, kann an dem Arzneimittel durchgeführt werden vor dem Vermischen des Arzneimittels mit dem Matrix und der in situ Vernetzung. Das verhindert, daß das Arzneimittel fest mit der Matrix verbunden wird, wodurch sicher gestellt wird, daß es von der Matrix freigesetzt werden kann. Behandlungsverfahren mit PEG und ihre positive Wirkung auf Arzneimittel sind beschrieben von Nucci et al., in Advanced Drug Delivery Reviews (1991) 6: 133-151, worauf hier verwiesen wird.
Neben diesen repräsentativen inhärent großen Arzneiniitteln kann man auch kleinere Arzneimittel verabreichen, wenn sie so mit einem Trägermolekül assoziiert oder daran gebunden sind, so daß sie ein geeignet großes scheinbares Molekulargewicht ergeben. Das kann erreicht werden durch kovalentes Binden des Arzneimittels an den Träger, das es erlaubt, daß das Arzneimittel seine biologische Aktivität beibehält oder in einer Weise, die es erlaubt, daß das Arzneimittel von der Hauptkette abgespalten wird, entsprechend seiner die Freisetzungsgeschwindigkeit steuernden Diffusion aus der vernetzten Collagen/flexibles Polymer-Matrix.
Die aktiven Arten können auch über ionische Bindungen oder durch immunologische Bindung (Antikörper/Antigen) unter Anwendung einer Biotin/Avidin-Bindung, oder durch hydrophobe oder Wasserstoffbindung an ein Polymer oder einen ähnlichen Träger gebunden sein. Ähnlich können mehrere Einheiten einer kleinen Art miteinander verbunden oder auf eine Polymerkette aufgepfropft sein, um das erwünschte große Arzneimittel zu erhalten.
Träger zum Kuppeln an aktive Pharmazeutika zur Erhöhung ihrer Größe können natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Repräsentative Materialien umfassen die Glycosaminoglycane, wie oben als flexible Polymere beschrieben, Proteine, Kohlenhydrate u. ä. Beispiele umfassen Stärke, Dextran, Fibronectin, Albumin, besonders Human-Albumin, synthetische Polymere, wie Poly(vinylamin), monofunktionelles PEG u. ä.
Außerdem kann eine kleine aktive Art physikalisch in ein Liposom oder eine andere ähnliche physikalische Struktur eingeschlossen werden, um ein Arzneimittel- Teilchen mit einer Größe zu erhalten, die es geeignet macht zur verzögerten Freisetzung aus den erfindungsgemäßen Systemen (Weiner et al. J. Pharm. Sci. (1985) 74 (9): 922-925, Dougardi, US-PS 5 198 465, EP-Anmeldung 509338 (1992), EP-Anmeldung 525132 (1993), EP-Anmeldung 525167 (1993), DE-Anmeldung 4028622 (1992), DE-Anmeldung 3912693 (1990) und Handjani et al., US-PS 4 820 857, auf die alle zur Beschreibung von verschieden Liposom-Zubereitungen und ihrer Herstellung verwiesen wird). Liposome u. ä. sind häufig verhältnismäßig groß, d. h. einige Zehn Nanometer oder sogar noch größer. Derartige Materialien wirken oft am besten mit Matrizes auf der Basis von faserförmigem Collagen, das Porengrößen ergeben kann, die derartigen Arten entsprechen.
Aktive Arten können an PEG gebunden sein, um ihr Molekulargewicht zu erhöhen (Nucci et al. a.a.O.) und liefern die erwünschten großen Arzneimittel. Derartige Arten können glycosyliert sein unter Anwendung von Polysacchariden, wieder um ihr Molekulargewicht zu erhöhen. Eine kleine aktive Einheit kann auch in emulgiertem Fett u. a. verkapselt sein. Nach allen diesen Möglichkeiten, die alle in der Literatur gut dokumentiert sind, kann des erfindungsgemäße System hergestellt werden, damit es wirkt - und nahezu jedes Arzneimittel nach und nach abgibt. Der Ausdruck Arzneimittel wird in seinem weitesten Sinn verwendet und umfaßt auch Vitamine, Nährstoffe, Promotoren sowie pharmazeutische Substanzen. Beispiele für geeignete Arzneimittel umfassen ohne Einschränkung die oben beschriebenen Faktoren, entzündungshemmende Mittel, Hormone, Antibiotica u. ä.
Das Arzneimittel-Abgabesystem nach der Erfindung ist besonders geeignet für große glycolysierte Arzneimittel. Die Langzeit-Abgabe von Faktor 8 ist eine andere erwünschte Therapie, die mit diesem System durchgeführt werden kann.

Gesamte Zubereitungen

Die nach der Erfindung vorgesehenen injizierbaren Zubereitungen sind Gemische von Materialien. Die Anteile der verschiedenen Materialien sind wie folgt:
Collagen 0,1 bis 10 Gew.-% der gesamten injizierbaren Zubereitung
Vernetzungsmittel 0,1 bis 5 Gew.-% der gesamten injizierbaren Zubereitung
Flexibles 0,1 bis 15 Gew.-% der gesamten injizierbaren Zubereitung
Arzneimittel 0,001 bis 10 Gew.-% der gesamten injizierbaren Zubereitung
Diese Materialien werden in einem geeigneten injizierbaren Träger dispergiert (gelöst oder suspendiert) unter Bildung einer injizierbaren Matrix. Dieser Träger kann von einer injizierbaren Salzlösung zu irgendeiner anderen pharmazeutisch annehmbaren injizierbaren wäßrigen Flüssigkeit reichen. Der Träger ist die größte Komponente in den Gemischen und reicht allgemein von 60 bis 99 Gew.-% der gesamten Zubereitung.
Bevorzugte Zubereitungen haben die folgende Zusammensetzung.
Collagen 1 bis 5 Gew.-%
Vernetzungsmittel 0,1 bis 1 Gew.-%
Flexibles Polymer 0,5 bis 5 Gew.-%
Arzneimittel 0,01 bis 1 Gew.-%
Träger 88 bis 99 Gew.-%, um 100 Gew.-% der gesamten injizierbaren Zubereitung zu erreichen.
Am häufigsten beträgt das Gewichtsverhältnis von flexiblem Polymer zu Collagen plus Vernetzungsmittel 0,02 : 1 bis 5 : 1. An dem unteren Ende dieses Bereichs ist das flexible Polymer so gering, daß seine Wirkung zu vernachlässigen ist. Am oberen Ende beginnt das flexible Polymer das Gemisch zu dominieren. Bevorzugte Verhältnisse sind 0,1 : 1 bis 1 : 1.
Diese Zubereitungen werden in ihrer einfachsten Form dargestellt. Es ist leicht zu erkennen, daß andere Komponenten von Konservierungsmitteln zu antibakteriellen Mitteln zu grenzflächenaktiven Mittel zu Mitteln zur Einstellung der Tonizität o. ä., soweit erwünscht, bei der Formulierung eines Fertigproduktes zugesetzt werden können.

Depot Charakteristika

Nach der Injektion an einen Patienten vernetzen die bevorzugten injizierbaren Zubereitung nach der Erfindung in situ unter Bildung einer Matrix, die als Depot zur Arzneimittel-Freisetzung wirkt. In dieser Rolle schränkt das Depot die Freisetzung des Arzneimittels ein und hält so seine Freisetzung über einen längeren Zeitraum aufrecht, als es der Fall wäre, wenn die Matrix nicht vorhanden wäre.
Bei alternativen Ausführungsformen kann das Arzneimittel aus einem Depot freigesetzt werden, das auf einer vorher gebildeten flexibles Polymer enthaltenden vernetzten Collagen-Matrix beruht. Diese Matrix kann gebildet werden aus vernetztem Collagen, in das das Arzneimittel und flexible Polymer vor, während oder nach dem Vernetzen eingebaut worden sind. Diese Matrix kann durch Injektion in einer Suspension in einem geeigneten injizierbaren Träger in die Anwendungsumgebung eingebracht, oder im Falle eines festen Körpers, in die Anwendungsumgebung implantiert werden.
Es gibt zwei Charakteristika der Matrix, die ihren Diffusionswiderstand gegenüber gelösten, darin eingeschlossenen Stoffen definieren. Ein Charakteristikum ist die Maschen- oder Porengröße der Matrix (die der Abstand zwischen Stäben in dem Käfig ist, der durch die Polymerketten der Matrix gebildet wird), das andere ist die Steifigkeit der Collagen-Ketten, die die Matrix bilden (Johansson et al., Macromolecules (1991) 24: 6019.
Eine gewisse Steifigkeit zu haben ist wichtig, da die flexiblen Polymer-Ketten sich verwinden können und so das Arzneimittel leichter aus der Matrix heraus diffundieren kann. So wird angenommen, daß bei Matrizes mit ähnlichen Maschengrößen aber unterschiedlichen Steifigkeiten der Polymer-Kette, der primäre Widerstand gegen eine Diffusion in der flexibleren Matrix auf Reibung beruht (Phillies, J. Phys. Chem., (1998) 93: 5029) im Gegensatz zu der steiferen Matrix, wo die Polymer-Ketten als unbewegliche Hindernisse wirken, die es erforderlich machen, daß das diffundierende Arzneimittel einen komplizierten Weg nimmt, um die Matrix zu verlassen (Doi et al., The Theory of Polymer Dynamics, Clarendon, Oxford (1986) Kap. 9).
Bei Collagen-Matrizes können die Moleküle aufgrund der Steifigkeit der Collagen-Tripelhelix sowie aufgrund des hohen Verhältnisses von Länge zu Durchmesser nicht dicht genug gepackt werden, um die gewünschte geringe Porengröße zu erreichen, Andererseits können flexible Polymere aufgrund ihrer Flexibilität dichter gepackt werden und führen so zu geringeren Maschengrößen. So führt das innige Vermischen des flexiblen Polymers in einer Collagen-Matrix zu einem wirksamen "Verstopfen" der Porengröße der Matrix durch Auffüllen der Zwischenräume zwischen den Collagen- Molekülen, die die Collagen-Moleküle selbst (aufgrund ihrer Steifigkeit) nicht besetzen können.
Die Collagen-Matrix hat wiederum eine verstärkende Wirkung auf das flexible Polymer (durch geometrischen Zwang) was das verschlungene flexible Polymer wirksam versteift. Diese Wechselwirkung zwischen steifen und flexiblen Polymeren wurde in einem Modellsystem gezeigt. Bei diesem Modellsystem wurde eine Reihe von Elektronen-Spin-Resonanz (ESR) Versuchen durchgeführt unter Anwendung von Spinmarkierter Polyacrylsäure in verschiedenen Gemischen mit Hyaluronsäure (einem flexiblen Polymer) und succinyliertem (aber nicht vernetztem) Collagen (einem steiferen Polymer). (V. Shenoy, Controlled Release of Macromolecules from Biopolymer Matrices: Diffusional Effects, M. S. Thesis, Univ. of Maryland, Baltimore (1993), Kap.2). Die Mobilität der Polyacrylsäure-Kette wurde deutlich behindert in konzentrierten Collagen- Matrizes, bezogen auf konzentrierte Hyaluronsäure-Matrizes.
Diese synergistische Wirkung des Gemisches aus dem Polymer mit flexibler Kette und der vernetzten Collagen-Matrix nach der Erfindung bei der Verringerung der wirksamen Porengröße sowie in Versteifung der flexiblen Kette führt zu einer stärkeren Behinderung der Diffusion als eine Matrix nur aus einem steifen Polymer oder einem flexiblen Polymer.
Ein anderes Charakteristikum der aus den injizierbaren Zubereitungen nach der Erfindung gebildeten Depots besteht darin, daß sie, um ein inniges Vermischen der steifen und flexiblen Polymere zu erreichen, gleich geladen sein sollten, andernfalls können sie zu einer Phasentrennung neigen. Zusätzlich ist das flexible Polymer in dem Depot vorzugsweise hydrophil, so daß es sich ausstreckt und mit dem Collagen verwindet.
Die Matrizes nach der vorliegenden Erfindung können eine maßgeschneiderte Porengröße aufweisen, um die gewünschten Geschwindigkeiten der Arzneimittel- Freisetzung zu ergeben. Die größten möglichen Porengrößen, die mit den kleinsten Anteilen an flexiblem Polymer erreicht werden können (und die so groß sind, daß sie im allgemeinen keine geeignete Beschränkung der Arzneimittel-Freisetzung ergeben), betragen etwa 30 nm im Falle von Matrizes auf der Basis von nicht-fibrillärem Collagen und bis zu 100 nm oder 200 nm bei Materialien auf der Basis von fibrillärem Collagen. Die Porengrößen können, falls erwünscht, bis auf 3 nm oder sogar noch geringer, maßgeschneidert werden durch Erhöhung der Collagen-Konzentration oder durch Erhöhung des Anteils an flexiblem Polymer. (S. Rosenblatt et al., Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. (1993) 20: 264). Porengrößen von Matrizes aus succinyliertem Collagen betragen bei 43 mg/ml 3 nm und bei 5 mg/ml 30 nm. Bei Hyaluronsäure-Matrizes mit einer Konzentration von 30 bzw. 8 mg/ml sind die Porengrößen 3 nm bzw. 30 nm. Matrizes aus fibrillärem Collagen haben wesentlich größere Porengrößen (etwa 55 nm bei 35 mg/ml). (S. Rosenblatt et al., J. Controlled Release (1998) 9: 195). Eine andere Literaturstelle für die Maschengröße von Hyaluronsäure, die unter Anwendung von Sondenverfahren ähnliche Werte zeigt, wie die oben angegebenen, ist De Smedt et al., Macromolecules 22: 141 (1994).
Diese Matrix ist stabil. Die oben beschriebenen Vernetzungsmittel können eine Matrix ergeben, die eine längere Lebensdauer besitzt als den Zeitraum der erwünschten Langzeit-Freisetzung des Arzneimittels. Typische Lebensdauern für diese Matrizes betragen etwa 2 Tage bis ein Jahr oder darüber, abhängig von dem zu behandelnden Zustand und dem Verlauf der erwünschten Therapie.
Die Matrix umfaßt das Polymer mit flexibler Kette. Dieses Polymer windet sich um die Elemente der Matrix und "verstopft" die Porengröße der Matrix wirksam bis zu einem Punkt, wo sie die Diffusion des Arzneimittels aus der Matrix beschränken. (Diese "neue" Porengröße, die aus einer Wechselwirkung zwischen dem flexiblen Polymer und der Collagen-Matirx resultiert, wird als die "effektive" Porengröße bezeichnet). Effektive Porengrößen liegen im Bereich von 3 nm bis 100 nm und vorzugsweise im Bereich von 10% bis 60% und insbesondere 10% bis 50% der Porengröße, die erhalten würde, wenn kein Polymer mit flexibler Kette vorhanden wäre.
Als allgemeine Regel ist die Schrumpfung der effektiven Porengröße um so größer, je größer der Anteil an flexiblem Polymer in der Matrix ist, bis die einengende Wirkung der verringerten Porengröße auf die Diffusionsgeschwindigkeit überwunden wird durch eine Zunahme der Flexibilität der Poren aufgrund des Anteils an vorhandenem flexiblem Polymer. So kann man die Freisetzungsgeschwindigkeit für ein Arzneimittel sehr einfach einstellen durch Variieren der relativen Anteile an Collagen plus Vernetzungsmittel und Polymer mit flexibler Kette.
Vorzugsweise wird die Matrix in situ vernetzt, so daß ein Abbau der Matrix minimal gehalten wird und die Matrix so perkutan implantiert werden kann. Da einige Modifikationen von Collagen thermisch und/oder hydrolytisch instabil sind und gegenüber Proteinasen empfindlich, stabilisiert das Vernetzen das Collagen und hemmt eine proteolytische Auflösung. Da einige nicht vernetzte modifizierte Collagene unter physiologischen Bedingungen löslich sind, kann eine nicht vernetzte Matrix auch durch Solubilisieren abgebaut werden.

Herstellungsverfahren

Die injizierbaren Zubereitungen nach der Erfindung werden typischerweise unmittelbar vor der Verwendung hergestellt. Diese Herstellung umfaßt das Vermischen von Collagen, Vernetzungsmittel, Polymer mit flexibler Kette und Arzneimittel in einem injizierbaren Medium. Das Collagen und das Vernetzungsmittel reagieren typischerweise innerhalb weniger Minuten oder einer Stunde, z. B. 10 Minuten bis 2 Stunden. Nach dem Vernetzen wird die Zubereitung ein festes Gel und kann nicht mehr leicht injiziert werden.
Das Vermischen kann in irgendeiner geeigneten Weise durchgeführt werden. Ein Vermischen zwischen Spritzen oder andere manuelle äquivalente Arbeitsweisen vor der Verabreichung führen zu guten Ergebnissen.
Die verschiedenen Komponenten der injizierbaren Zubereitungen sind zusammen mit ihren Herstellungsverfahren im stand der Technik angegeben. Aus Gründen der Kürze werden diese Herstellungsverfahren hier nicht wiederholt.

Anwendungsverfahren

Bei der Anwendung werden die injizierbaren Zubereitungen nach der Erfindung in den Körper des zu behandelnden Patienten injiziert. Dieses Injizieren sollte in einer Weise durchgeführt werden, die es erlaubt, daß die injizierbare Zubereitung die Gelegenheit hat, nicht dispergiert zu verbleiben während die Vernetzung stattfindet und das Depotgebildet wird. Folglich sind die intravenöse oder intraarterielle Injektion, die zu einem schnellen Dispergieren der injizierbaren Zubereitung führen würden, keine bevorzugten Verabreichungsformen. Die Injektion in weniger turbulente Umgebungen ist bevorzugt, z. B. sind subkutane, intradermale, intramuskuläre und intrakraniale Injektionen geeignet. Die Menge der Zubereitung, die verabreicht wird, sollte eine solche Menge sein, die eine wirksame Dosis des eingeschlossenen Arzneimittels ergibt. Der Ausdruck "wirksame Menge" bezieht sich auf die Menge an biologisch wirksamem Mittel, die erforderlich ist, um die erwünschte Wirkung zu erzielen. Die tatsächliche Menge, von der bestimmt wird, daß es eine effektive Menge ist, variiert abhängig von Faktoren wie der Größe, dem Zustand, dem Geschlecht und dem Alter des Patienten und kann von dem behandelnden Arzt (caregiver) leichter bestimmt werden.
Darüber hinaus kann die erwünschte Abgabegeschwindigkeit durch Routineversuche bestimmt werden, z. B. durch Herstellung einer Modellzubereitung nach den unten angegebenen Beispielen und Bestimmen der Freisetzungsgeschwindigkeit an einem geeigneten Tiermodell.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind angegeben, um eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu liefern, wie die injizierbaren Zubereitungen und die Depots, die sie bilden können, herzustellen sind, und sollen keine Einschränkung des Rahmens darstellen, was die Erfinder als ihre Erfindung ansehen. Es sind Anstrengungen unternommen worden, um die Genauigkeit der angegebenen Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, Molekulargewicht usw.) sicher zu stellen, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten berücksichtigt werden. Soweit nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, das Molekulargewicht ist das mittlere Molekulargewicht, die Temperatur ist in ºC angegeben und der Druck ist Atmosphärendruck oder nahe dabei.
Die vorliegende Erfindung wird hier in der Form gezeigt und beschrieben, die als die praktischste und bevorzugte Ausführungsform angesehen wird. Es wird jedoch anerkannt, daß Abweichungen davon durchgeführt werden können, die im Rahmen der Erfindung liegen und daß offensichtliche Modifikationen für den Fachmann beim Lesen dieser Beschreibung offenkundig werden.

Beispiel 1

Herstellung von aktiviertem Vernetzungsmittel

(C) Bifunktionelles PEG 3400 (34 g, 10 mmol, Aldrich Chemical Co.) wird in 1,2- Dichlorethan (250 ml) gelöst und unter Rückfluß mit Glutarsäureanhydrid (10 g) und Pyridin (4 ml) 3 Tage unter Stickstoff erhitzt. Die Lösung wird dann filtriert und das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand in Wasser (100 ml) gelöst und mit Diethylether (2 · 50 ml) gewaschen. Das erhalten PEG-glutarat wird mit Chloroform (2 · 50 ml) aus dem Wasser extrahiert und das Chloroform abgedampft unter Bildung von PEGdiglutarat. Das PEG-diglutarat wird dann in DMF (200 ml) bei 37ºC gelöst und N-Hydroxysuccinimid (10 mol% xs) zugegeben. Die Lösung wird auf 0ºC gekühlt und eine äquivalente Menge Dicyclohexylcarbodümid in DMF-Lösung (10 ml) zugegeben. Das Gemisch wird 24 h bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann filtriert. Dann wird kaltes Benzol (100 ml) zugegeben und das PEG-di(succinimidyl-glutarat) (dPEG-SG) durch Zugabe von Petrolether (200 ml) bei 0ºC ausgefällt. Der Niederschlag wird auf einem Sinterglasfilter gesammelt. Das Lösen in Benzol und anschließende Ausfällen mit Petrolether wird dreimal wiederholt um "aktiviertes" dPEG (dPEG*) zu erhalten.

Beispiel 2

Gele wurden hergestellt durch Succinylieren von Collagen nach dem Verfahren von Miyata (US-PS 4 164 559 (1979)). Das succinylierte Collagen (SC) wurde bei pH 4,5 ausgefällt und durch Zentrifugieren konzentriert. Der pH wurde auf 7,2 eingestellt und die Lösung gepuffert in 20 mM Natriumphosphat und 130 mM Natriumchlorid durch erschöpfende Dialyse gegen eine wäßrige Lösung von 20 mM Natriumphosphat, 130 mM Natriumchlorid, eingestellt auf pH 7,2 (PBS). Die Konzentration des succinylierten Collagens wurde an diesem Punkt zu 45 mg/ml gemessen. Für eine bei diesen Versuchen hergestellte Matrix wurde das SC vor der Herstellung der Matrix mit PBS auf 20 mg/ml verdünnt. Eine Hyaluronsäure/Arzneimittel-Lösung mit 20 mg/ml wurde hergestellt durch Lösen von 100 mg pulverförmiger Hyaluronsäure und Arzneimittel (Pulver) in 5 ml PBS. Für Arzneimittel in flüssiger Form konnte die Flüssigkeit zu der Hyaluronsäure (HA) Lösung zugefügt und das Volumen der Arzneimittel-Lösung von dem Volumen des zugesetzten PBS abgezogen werden. Im Prinzip gibt es keinen Grund, warum das Arzneimittel nicht zu der Collagen-Lösung zugesetzt werden könnte. Bei diesen Versuchen wurde mit Fluorescein markiertes Ficol mit 400 kDa, im folgenden als "Ficol" bezeichnet (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) als Modell Arzneimittel-Verbindung verwendet. Eine Matrix mit einer Endzusammensetzung von 10 mg/ml SC, 10 mg/ml HA und 3 mg/ml Ficol wurde hergestellt durch Vermischen von 0,75 ml SC mit 0,75 ml HA-Lösung. Diese 1,5 cm³ Matrix wurden dann vermischt mit 4,5 mg pulverförmigem Ficol. Das Vermischen wurde durch Austausch zwischen 3 cm³ Spritzen durchgeführt (100 Durchgänge). Das Gemisch konnte sich über Nacht äquilibrieren. Das Gemisch wurde vernetzt durch Vermischen von 10 mg dPEG*-Pulver mit 1,5 cm³ der HAISC/Ficol-Lösung. Das Vermischen wurde zwischen zwei 3 cm³ Spritzen durchgeführt (50 Durchgänge), von denen eine anfangs nur dPEG*-Pulver enthielt und die andere die HA/SC/Ficol-Lösung. Das Gemisch wurde in eine 1 cm³ Spritze übergeführt und konnte über Nacht bei Raumtemperatur (22ºC) härten; wobei sich ein zylinderförmiges Gel bildete.
Ein anderes Gel wurde mit einer Endzusammensetzung von 16 mg/ml SC, 4 mg/ml HA und 3 mg/ml Ficol hergestellt durch Vermischen von 0,96 ml 25 mg/ml SC mit 0,54 mg/ml 11,2 mg/ml HA. Diese 1,5 cm³ Matrix wurden dann mit 4,5 mg pulverförmigem Ficol vermischt. Ein Gel, enthaltend 30 mg/ml SC, 6 mg/ml HA uns 3 mg/ml Ficol wurde hergestellt durch Vermischen von 1 cm³ 45 mg/ml SC mit 0,5 cm³ 18 mg/ml HA. 1,5 cm³ HA/SC-Gemisch wurden mit 4,5 mg trockenem Ficol-Pulver vermischt. Diese Gele wurden vermischt und vernetzt unter Anwendung identischer Verfahren wie bei dem oben beschriebenen Gel. Anstatt daß das Gel in der 1 cm³ Spritze härten konnte, wie es hier der Fall war, konnte das Gemisch von Materialien zur Bildung des Arzneimittelabgabe-Depots injiziert werden.

Beispiel 3

Freisetzung von mit Fluorescein markiertem Ficol aus 20 mg/ml succinyliertem Collagen LSC)/ Hyarulonsäure (HA) Matrizes

Die in Beispiel 2 hergestellten, Ficol enthaltenden Gele wurden zu Zylindern mit einer Länge von 22 mm und einem Durchmesser von 5,5 mm geschnitten. Alle Zylinder wurden auf eine Masse von 500 mg zurecht geschnitten. Die Zylinder wurden in 4 ml- Polypropylenfläschchen gegeben und 2 ml PBS zugegeben, so daß der Zylinder vollständig eingetaucht war. Die Zylinder wurden etwa einen Tag bei 22ºC stehen gelassen. Das den Zylinder umgebende PBS wurde dann entfernt und durch frisches PBS ersetzt. Das entfernte PBS wurde aufbewahrt zur Messung der Menge an freigesetztem Ficol durch Messung der Intensität der Fluoreszenz. Das gleiche Elutionsverfahren wurde nach einem weiteren Tag wiederholt, um einen zweiten Zeitpunkt zu erhalten. Freisetzungsprofile für diese Gele wurden im Duplikat untersucht. Aus Ficol (3 mg/ml) und SC (20 mg/ml) bestehende Gele, die mit 7,5 mg/ml dPEG* vernetzt waren, wurden als Kontrolle angewandt. Es wurde sorgfältig darauf geachtet, die Fläschchen, die die Gele enthielten, während der Messung nicht zu stören.
Zu den Zeitpunkten, zu denen die eluierenden Puffer entfernt wurden, wurde die Intensität der Fluoreszenz von 200 ul Proben in einem Mikroplatten-Fluorimeter Modell 7620 (Cambridge Technologies, Watertown, MA) abgelesen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 als kumulative freigesetzte Fluoreszenz gegen die Zeit für 20 mg/ml succinylierte Collagen-Matrizes, vermischt mit 10 mg/ml SC -10 mg/ml HA-Matrizes und 16 mg/ml SC 4 mg/ml HA-Matrizes angegeben. Die aufgetragenen Werte stellen das Mittel von Proben von zwei getrennten Matrizes dar und sind in willkürlichen Fluoreszenz-Einheiten oder "A.F.U." angegeben. Die einzelnen Ablesungen lagen in allen Fällen im Bereich von 5% von dem Mittelwert.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Freisetzung aus den Matrizes, die 20% flexibles Polymer enthielten, langsamer war. Bei den Matrizes, enthaltend 50% flexibles Polymer war die Freisetzung schneller als bei der Matrix aus dem steifen Polymer allen (nur SC). Es ist zu bemerken, daß bei diesen Versuchen das Gesamtgewicht von Collagen plus Vernetzungsmittel plus flexibles Polymer konstant gehalten wurde. So war bei einem 50/50-Gemisch die Menge an Collagen, das der Matrix Steifigkeit verlieh, wesentlich verringert.
Wenn der Collagen-Gehalt konstant gehalten wurde, ist die Geschwindigkeit der Arzneimittel-Freisetzung kontinuierlich abgefallen, selbst wenn ein äquivalentes Gewicht an flexiblem Polymer zugesetzt wurde.

Beispiel 4

Freisetzung von mit Fluorescein markiertem Ficol aus 36 mg/ml SC- und HA-Matrizes

Ein Freisetzungs-Versuch, ähnlich demjenigen des Beispiels 4 wurde für Matrizes durchgeführt, bestehend aus 36 mg/ml SC und Gemischen aus 30 mg/ml SC und 6 mg/ml HA, enthaltend Ficol. Der Eluier-Puffer wurde zu bestimmten Zeitpunkten erneuert und die Anzahl an Fluoreszenz-Einheiten von 200 ul Proben von Eluier-Puffer wurden entnommen und in einem Fluorimeter abgelesen. Die kumulativen freigesetzten Fluoreszenz-Einheiten gegen die Zeit sind in Fig. 2 aufgetragen. Die aufgetragenen Werte geben den Mittelwert von Proben von zwei verschiedenen Matrizes an. Die einzelnen Ablesungen lagen in allen Fällen im Bereich von 5% von dem Mittelwert.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 2 angegeben. Sie zeigen, daß bei einer höheren Konzentration an steifen stäbchenförmigen Molekülen die vorteilhafte Geschwindigkeit bestimmende Wirkung des Zusatzes einer flexiblen Komponente zu der Matrix stärker ausgeprägt ist.

Claims

1. Injizierbare pharmazeutisch annehmbare Zubereitung mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung umfassend:

i) Collagen;

ii) ein Vernetzungsmittel auf Polymer-Basis, das in der Lage ist, in situ nach der Injektion von Collagen kovalente Bindungen mit dem Collagen zu bilden;

iii) ein Polymer mit flexibler Kette, wobei das Polymer mit flexibler Kette hydrophil ist und ein Molekulargewicht von mindestens 100 kDa, eine Persistenz von weniger als 10% der Persistenz des Collagens und eine Ladung, die im Vorzeichen derjenigen von Collagen entspricht, aufweist;

iv) ein Arzneimittel und

v) einen pharmazeutisch annehmbaren injizierbaren Träger;

wobei nach Injektion der Zubereitung an einen Patienten das Vernetzungsmittel in der Lage ist, das Collagen in situ zu vernetzen unter Bildung einer porösen Matrix, in der sowohl das Arzneimittel als auch das Polymer mit flexibler Kette eingeschlossen sind, und wobei die vernetzte Matrix in der Lage ist zur länger anhaftenden Diffusion des Arzneimittels aus der Matrix.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Collagen und das Polymer mit flexibler Kette jeweils positiv geladen sind.

3. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Polymer mit flexibler Kette ein synthetisches Polymer mit flexibler Kette ist.

4. Zubereitung nach Anspruch 3, wobei das synthetische Polymer mit flexibler Kette ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Poly(acrylsäure); Poly(vinylalkohol), Poly(acrylamid), Poly(N-isopropylacrylamid), Poly(methylacrylat), Poly(hydroxyethylmethacrylat), Poly(vinylacetat) und Copolymeren davon.

5. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Polymer mit flexibler Kette ein natürlich vorkommendes Material ist.

6. Zubereitung nach Anspruch 5, wobei das natürlich vorkommende Polymer mit flexibler Kette ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glycosaminoglycanen, Cellulosen und Poly(nucleinsäure)n.

7 Zubereitung nach Anspruch 6, wobei das natürlich vorkommende Polymer mit flexibler Kette ein Glycosaminoglycan ist, ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat A, Chondroitinsulfat B, Chondroitinsulfat C, Chitin und Chitosan.

8. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Collagen fibrilläres Collagen ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Collagen Atelopeptid-Collagen ist.

10. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Collagen fibrilläres Atelopeptid- Collagen ist.

11. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Collagen nicht-fibrilläres Atelopeptid- Collagen ist.

12. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Collagen mindestens einen Lysin- Rest zur Vernetzung verfügbar hat.

13. Zubereitung nach Anspruch 8, wobei das fibrilläre Collagen hergestellt worden ist durch Vermahlen oder Zerreißen von collagenem Gewebe.

14. Zubereitung nach Anspruch 10 oder 11, wobei das Atelopeptid-Collagen hergestellt worden ist durch Lösen von Gewebe in einer wäßrigen Säure und anschließenden enzymatischen Abbau.

15. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Vernetzungsmittel ein synthetisches hydrophiles Polymer ist.

16. Zubereitung nach Anspruch 15, wobei, das synthetische hydrophile Polymer funktionalisiertes Polyethylenglykol ist.

17. Zubereitung nach Anspruch 16, wobei das funktionalisierte Polyethylenglykol difunktionalisiert ist.

18. Zubereitung nach Anspruch 17, wobei das difunktionalisierte Polyethylenglykol Succinimidyl-glutaryl-polyethylenglykol ist.

19. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ein scheinbares Molekulargewicht von mindestens 10 kDa hat.

20. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel in Liposomen verkapselt ist.

21. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ein Wachstumsfaktor, ein Cytokin, Gerinnungsfaktor 9, PEGbehandeltes TGF-β- oder Erythropoietin ist.

22. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel kovalent an ein Trägermolekül gebunden ist.

23. Zubereitung nach Anspruch 22, wobei das Trägermolekül ein Glycosaminoglycan oder ein Protein ist.

24. Zubereitung nach Anspruch 22, wobei das Trägermolekül Stärke, Glycogen, Fibrinogen, Human-Albumin, monofunktionelles PEG, Fibronectin oder ein Lipid ist.

25. Zubereitung nach Anspruch 22, wobei das Arzneimittel ein Enzym, ein PEG- behandeltes Protein oder Gerinnungsfaktor 8 ist.

26. Arzneimittelabgabedepot mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung zur Verabreichung eines Arzneimittels an eine Umgebung in einem Patienten, umfassend ein Arzneimittel und ein Polymer mit flexibler Kette, wobei sowohl das Arzneimittel als auch das Polymer mit flexibler Kette in einer porösen Matrix aus Collagen, das mit einem Vernetzungsmittel vernetzt ist, eingeschlossen sind, wobei die Porengröße kleiner als 200 nm ist,

wobei das Polymer mit flexibler Kette hydrophil ist und ein Molekulargewicht von mindestens 100 kDa, eine Persistenz von weniger als 10% der Persistenz des Collagens und eine Ladung, die im Vorzeichen derjenigen von Collagen entspricht, aufweist, und

wobei das Polymer mit flexibler Kette die effektive Porengröße einer Matrix aus vernetztem Collagen auf eine Größe verändert, die in der Lage ist, zur länger anhaltenden Diffusion des Arzneimittels aus der Matrix in das umgebende Gewebe.

27. Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die in der Lage ist, ein Arzneimittelabgabedepot mit verzögerter Wirkstoff-Freisetzung zu bilden, umfassend die folgenden Stufen:

i) Bereitstellen von;

a) einem Arzneimittel,

b) Collagen,

c) mindestens einem Vernetzungsmittel, das in der Lage ist, mit Collagen Bindungen zu bilden;

d) mindestens einem Polymer mit flexibler Kette, wobei das Polymer mit flexibler Kette hydrophil ist und ein Molekulargewicht von mindestens 100 kDa, eine Persistenz von weniger als 10% der Persistenz des Collagens und eine Ladung, die im Vorzeichen derjenigen von Collagen entspricht, aufweist und

e) einem pharmazeutisch annehmbaren injizierbaren Medium; und

ii) Bilden einer pharmazeutisch annehmbaren Zubereitung, umfassend die unter

i) angegebenen Komponenten;

wobei nach Injektion der Zubereitung an einen Patienten das Vernetzungsmittel in der Lage ist, das Collagen in situ zu vernetzen unter Bildung einer porösen Matrix, in der sowohl das Arzneimittel als auch das Polymer mit flexibler Kette eingeschlossensind, und wobei die vernetzte Matrix in der Lage ist, zur länger anhaltenden Diffusion des Arzneimittels aus der Matrix.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei mindestens ein Vernetzungsmittel nur zur Vernetzung von Collagen dient.

29. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei die Zubereitung 1 bis 5 Gew.-% Collagen, 0,1 bis 1 Gew.-% Vernetzungsmittel und 0,5 bis 5 Gew.-% flexibles Polymer enthält.

30. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Gewichtsverhältnis von flexiblem Polymer zu Collagen plus Vernetzungsmittel zwischen 0,02 : 1 und 5 : 1 liegt.

31. Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Gewichtsverhältnis von flexiblem Polymer zu Collagen plus Vernetzungsmittel zwischen 0,1 : 1 und 1 : 1 liegt.

32. Arzneimittelabgabedepot nach Anspruch 26, wobei das Vernetzungsmittel ein synthetisches hydrophiles Polymer ist.