DE69707701T2

DE69707701T2 - Eine methode zur enzymatischen behandlung von biofilmen

Info

Publication number: DE69707701T2
Application number: DE69707701T
Authority: DE
Inventors: Charlotte Johansen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2002-08-01
Anticipated expiration: 2017-12-17
Also published as: EP0946207B1; WO1998026807A1; DE69707701D1; AU5310298A; PT946207E; EP0946207A1; CA2275157A1; US6100080A; ATE207367T1; ES2167022T3; JP4191253B2; JP2001508677A; CA2275157C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Desinfektion einer von einer Biofilmschicht bedeckten Oberfläche und eine Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung zur Verwendung bei dem Verfahren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

In Nährstoff-knappen Ökosystemen besitzen Bakterien eine deutliche Neigung zur Haftung an Oberflächen und zur Auslösung einer Bioflimbildung. Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroben, die in eine an einer Oberfläche anhaftende organische Polymermatrix eingebettet sind. In Nährstoff-knappen natürlichen und industriellen Ökosystemen überwiegen Biofilmzellen und führen zu Problemen, wie erhöhter Reibungswiderstand gegenüber Fluiden in Wasserleitungen und an Schiffsrümpfen (fouling), verminderter Wärmeaustausch aus Wärmeaustauschern, Korrosion von Metallsubstraten und Verunreinigungen in der Nahrungsmittel- und Biotechnologie-Industrie. Biofilme stellen auch ein ernsthaftes Problem in der Medizin und Industrie dar und führen zu Zahnplaque, verunreinigten Endoskopen und verunreinigten Kontaktlinsen, Besiedlung von Prothesenvorrichtungen und Biofilmbildung auf medizinischen Implantaten.
Die Biofilmmatrix ist eine Ansammlung von Mikrokolonien mit Wasserkanälen dazwischen und einer Reihe von Zellen und extrazellulären Polymeren (Polysaccharide, Glycoproteine, Proteine). Extrazelluläre bakterielle Polysaccharide bestehen aus Homo- und Heteropolysacchariden, insbesondere von Glucose-, Fucose-, Mannose-, Galactose-, Fructose-, Pyruvat-, Mannuronsäure- oder Glucuronsäurebasierenden Komplexen. Die unterschiedlichen Bindungen zwischen den Sacchariden führen zu einer Vielzahl von unterschiedlichen Polysacchariden, einschließlich Lävanen, Polymannanen, Dextranen, Cellulose, Amylopektin, Glycogen und Alginat.
In Biofilmen wachsende Bakterien sind gegenüber Antibiotika und Desinfektionsmitteln resistenter als Planktonzellen, und die Beständigkeit nimmt mit dem Alter des Biofilms zu. Bakterielle Biofilme zeigen ferner eine erhöhte physikalische Beständigkeit gegenüber Austrocknung, Temperaturextrema oder Licht. Wie erwähnt, verursacht die Bioflimbildung Probleme in der Industrie, Umwelt und Medizin, und die Schwierigkeiten beim Reinigen und Desinfizieren eines bakteriellen Biofilms mit Chemikalien ist in vielen Industrien ein sehr großes Problem. Außerdem kann durch den Trend zu milderen Desinfektions- und Reinigungszusammensetzungen die unzureichende Reinigung von mit Biofilm bedeckten Oberflächen zunehmen.
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines effektiven und umweltfreundlichen Verfahrens zur Beseitigung eines Biofilms und auf einer Oberfläche vorhandener lebender Bakterienzellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Überraschenderweise wurde gefunden, daß es möglich ist, einen auf einer Oberfläche vorhandenen Biofilm durch enzymatische Behandlung mit mindestens zwei verschiedenen Enzymen, die in der Lage sind, den Biofilm von der Oberfläche zu entfernen/abzulösen bzw. die lebenden mikrobiellen Zellen zu töten, zu desinfizieren und zu beseitigen.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung und Desinfektion einer Oberfläche, die mindestens teilweise von einer Biofilmschicht bedeckt ist, wobei das Verfahren die aufeinanderfolgenden oder gleichzeitigen Schritte
a. In Kontakt bringen des Biofilms mit einer Reinigungszusammensetzung, die eine oder mehrere Hydrolasen in einer Menge enthält, die entweder zur vollständigen oder teilweisen Entfernung oder Ablösung der Biofilmschicht von der Oberfläche wirksam ist; und
b. In Kontakt bringen des Biofilms mit einer bakteriziden desinfizierenden Zusammensetzung, die eine Oxidoreductase in einer Menge enthält, die zum Abtöten der in dem Biofilm vorhandenen lebenden Bakterienzellen wirksam ist, umfaßt.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung eine enzymatische Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung und die Verwendung der Zusammensetzung zum Reinigen oder Desinfizieren von Biofilm bedeckten Oberflächen.
Das erfindungsgemäße rein enzymatische Verfahren ist zweckmäßig, da es eine sehr wirksame Reinigung und Desinfektion bereitstellt, während es gleichzeitig nicht aggressiv, nicht gefährlich, nicht toxisch und umweltfreundlich ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Begriff "Reinigen", wie hier verwendet, soll die vollständige oder teilweise Entfernung von unerwünschtem Material, z. B. einem Biofilm, bedeuten.
Die Reinigung kann durch teilweise oder vollständige Zersetzung des Biofilms durch die katalytische Wirkung von Enzymen erfolgen.
Der Begriff "Desinfizieren", wie hier verwendet, soll die Fähigkeit bedeuten, lebende mikrobielle Zellen, d. h. Bakterien-, Pilz- oder Hefezellen, abzutöten.
In dem vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "bakterizid" als zum Abtöten von Bakterienzellen verstanden werden.

Die Oberfläche

Der Begriff "Oberfläche", wie hier verwendet, betrifft jede Oberfläche, die mit einer Biofilmschicht bedeckt sein kann. Beispiele für Oberflächen können harte Oberflächen, wie Metall, Kunststoffe, Kautschuk. Pappe, Glas, Holz, Papier, Zement, Fels, Marmor, Gips und Keramikmaterialien, die gegebenenfalls z. B. mit Farbe, Email etc. beschichtet sind; oder jede weiche Oberfläche, wie Fasern jeder Art (Garne, Textilien, pflanzliche Fasern, Steinwolle, Haar etc.); oder poröse Oberflächen; Haut (menschlich oder tierisch); keratinöse Materialien (Fingernägel etc.) sein. Die harte Oberfläche kann in einem Prozeßanlagebauteil eines Kühlturms, einer Wasseraufbereitungsanlage, einer Molkerei, einer Lebensmittelverarbeitungsanlage, einer chemischen oder pharmazeutischen Prozeßanlage vorhanden sein. Die poröse Oberfläche kann in einem Filter, z. B. einem Membranfilter, vorhanden sein. Demgemäß ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung und das erfindungsgemäße Verfahren auch in einem herkömmlichen Vor-Ort- Reinigungssystem (C-I-P) geeignet.

Der Biofilm

Ein Biofilm kann eine große Anzahl von verschiedenen Mikroorganismen enthalten oder kann einen speziellen Mikroorganismus als überwiegende Mikrobe aufweisen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der zu behandelnde Biofilm beherrscht oder ist gekennzeichnet durch unerwünschte Bakterienzellen, xorzugsweise lebende Zellen, die aus den Bakteriengattungen Pseudomonas, Staphylococcus, Aeromonas, oder aus der Familie Enterobakteriaceae (einschließlich z. B. Escherichia coli) ausgewählt sind.

Die Enzyme

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird (werden) die verwendete(n) Hydrolase(en) aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Glucosidasen, d. h. Zellulasen (Endoglucanasen, Cellobiohydrolasen, β-Glucosidasen), Hemicellulasen (Xylanasen, Mannasen, Xylanacetylesterasen), Pectinasen (Arabinasen, α-Arabinofuranosidasen, Galactanasen, Pectinlyasen, Pectinmethylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonanacetylesterasen, Rhamnogalacturonasen), Amylasen; Proteasen und Lipasen.
Die zu verwendenden Hydrolasen können je nach Eigenschaften, sofern bekannt, des speziellen zu entfernenden Biofilms ausgewählt werden, oder es kann eine Kombination von mehreren Hydrolasen mit verschiedenen Enzymaktivitäten eingesetzt werden.
Beispiele für spezielle Enzyme, die zum Biofilmabbau in der Lage sind, sind: 1,2-1,3-α-D-Mannan-mannohydrolase, 1,3-β-D-Xylan-xylanhydrolase, 1,3-β-D-Glucan-gIucanhydrolase, 1,3(1,3; 1,4)-α-D-Glucan-3-glucanhydrolase; 1,3(1,3; 1,4)-β-D-Glucän-3(4)-glucanhydrolase; 1,3-1,4-α-D-Glucan-4-glucanhydrolase, 1,4-α-D-Glucan-glucanhydrolase; 1,4-α-D-Glucan-glucohydrolase; 1,4-(1,3; 1,4)-β-D-Glucan-4-glucanhydrolase; 1,4-β-D-Glucan-glucohydrolase; 1,4-β-D-Xylan-xylanhydrolase; 1,4-β-D-Mannan-mannanhydrolase; 1,5-α-L- Arabinan-1,5-α-L-arabinanhydrolase; 1,4-α-D-Glucan-malthohydrolase; 1,6-α-D- Glucan-6-glucanhydrolase; 2,6-β-D-Fructan-fructanohydrolase, α-Dextrin-6- glucanhydrolase, α-Dglactoside-galactohydrolase, α-D-Glucosid-glucohydrolase, α-D-Mannosid-mannohydrolase, Acylneuraminyl-hydrolase, Aerobacter-Kapselpolysaccharid-galactohydrolase, β-D-Fructofuranosid-fructohydrolase, β-D-Fucosid-fucohydrolase, β-D-Fructan-fructohydrolase, β-D-Galactosid-galactohydrolase, β-D-Glucosid-glucohydrolase, β-D-Glucuronosid-glucuronosohydrolase, β-D-Mannosid-mannohydrolase, β-N-Acetyl-D-hexosaminid-N-acetylhexosaminohydrolase, Cellulose-sulfat-sulfohydrolase, Collagenase, Dextrin-6-α-Dglucanhydrolase, Glycoprotein-phosphatidylinosit-phosphatidohydrolase, Hyaluronat-4-glycanohydrolase, Hyaluronoglucuronidase, Pectin-pectylhydrolase, Peptidoglycan-N-acetylmuramoylhydrolase, Phosphatidylcholin-2-acylhydrolase, Phosphatidylcholin-1-acylhydrolase, Poly(1,4-α-D-galacturonid), Poly(1,4-(Nacetyl-β-D-glucosaminid))-glycanohydrolase, Proteasen, Saccharose-α-glucosidase, Triacylglycerin-acylhydrolase, Triacylglycerin-Protein-acylhydrolase.
Ein geeignetes hydrolytisches Enzym für das erfindungsgemäße Verfahren ist jedes Enzym mit einer proteolytischen Aktivität bei den tatsächlichen Verfahrensbedingungen. Somit kann das Enzym ein proteolytisches Enzym pflanzlichen Ursprungs, z. B. Papain, Bromelain, Ficin, oder tierischen Ursprungs, z. B. Trypsin und Chymotrypsin, oder mikrobiellen Ursprungs, d. h. bakteriellen Ursprungs oder aus Pilzen oder Hefen, sein. Es ist selbstverständlich, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren jedes Gemisch verschiedener proteolvtischer Enzyme anwendbar sein kann.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das proteolytische Enzym eine Serinprotease, eine Metalloprotease oder eine Aspartatprotease. Eine Serinprotease ist ein Enzym, das die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und in dem an der aktiven Stelle ein wirksamer Serinrest vorhanden ist. Sie werden durch Diisopropylfluorphosphat gehemmt, allerdings sind sie im Gegensatz zu Metalloproteasen gegenüber Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) resistent (obwohl sie bei hohen Temperaturen durch Calciumionen stabilisiert werden). Sie hydrolysieren einfache terminale Ester und entsprechen in der Aktivität eukaryotischem Chymotrypsin, ebenfalls eine Serinprotease. Ein enger gefaßter Begriff, Alkaliprotease, die eine Untergruppe abdeckt, spiegelt das hohe pH-Optimum einiger der Serinproteasen von pH 9,0 bis 11,0 wider. Die Serinproteasen zeigen in der Regel im alkalischen pH-Bereich eine maximale proteolytische Aktivität, wohingegen die Metalloproteasen und die Aspartatproteasen in der Regel im neutralen bzw. sauren pH-Bereich eine maximale proteolytische Aktivität zeigen.
Eine Untergruppe der Serinproteasen wird in der Regel als Subtilisine bezeichnet. Ein Subtilisin ist eine Serinprotease, die von grampositiven Bakterien oder Pilzen produziert wird. Es wurde die Aminosäuresequenz einer Anzahl von Subtilisinen bestimmt, einschließlich von mindestens sechs Subtilisinen aus Bacillusstämmen, nämlich Subtilisin 168, Subtilisin BPN, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin DY, Subtilisin Amylosacchariticus und Mesentericopeptidase, einem Subtilisin aus einem Actinomycetales, Thermitase aus Thermoactinornyces vulgaris und einem Subtilisin aus Pilzen, Proteinase K aus Tritirachium album. Eine weitere Untergruppe der Subtilisine, Subtilasen, wurde neuerdings erkannt. Subtilasen werden als stark alkalische Subtilisine beschrieben und umfassen Enzyme wie Subtilisin BP92 (MAXACAL®, Gist-Brocades NV), Subtilisin 309 (SAVINASE®, NOVO NORDISK A/S) und Subtilisin 147 (ESPERASE®. NOVO NORDISK A/S).
Im Zusammenhang der Erfindung bedeutet eine Subtilisin-Variante oder eine mutierte Subtilisin-Protease ein Subtilisin, das von einem Organismus produziert worden ist, der ein mutiertes Gen exprimiert, das sich von einem elterlichen Mikroorganismus ableitet, welcher ein originales oder elterliches Gen besaß und welcher ein entsprechendes elterliches Enzym produzierte. wobei das elterliche Gen mutiert worden ist, um das mutierte Gen zu produzieren wovon die mutierte Subtilisin-Protease bei Expression in einem geeigneten Wirt produziert wird. Diese erwähnten Subtilisine und Varianten hiervon machen eine bevorzugte, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Klasse von Proteasen aus. Ein Beispiel für eine geeignete Subtilisin-Variante ist eine Variante von Subtilisin 309 (SAVINASE®), worin in Position 195 Glycin durch Phenylalanin (G195F oder ¹&sup9;&sup5;Gly durch ¹&sup9;&sup5;Phe) substituiert ist.
In der Regel sind herkömmliche fermentierte, im Handel erhältliche Proteasen geeignet. Beispiele für solche im Handel erhältliche Proteasen sind Alcalase® (produziert durch submerse Fermentation eines Stammes von Bacillus licheniformis), Esperase® (produziert durch submerese Fermentation einer alkalophilen Spezies von Bacillus), Rennilase® (produziert durch submerse Fermentation eines nicht pathogenen Stammes von Mucor miehei), Savinas® (produziert durch submerse Fermentation eines genetisch modifizierten Stammes von Bacillus), z. B. die Variante, die in der internationalen, als WO 92/19729 veröffentlichten Patentanmeldung offenbart sind und Durazym® (eine Protein-technisch veränderte Variante von Savinase®). Sämtliche erwähnten handelsüblichen Proteasen werden von der Firma Novo Nordisk A/S. DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark produziert und verkauft. Weitere bevorzugte Serinproteasen sind Proteasen von Nocardiopsis, Aspergillus, Rhizopus, Bacillus alkalophilzrs, B. cereus, N. natto, B. vulgatus, B. mycoide und Subtilisine von Bad/Zus, insbesondere Proteasen der Spezies Nocardiopsis sp. und Nocardiopsis dassonvillei, wie diejenigen, die in der internationalen als WO 88/03947 veröffentlichten Patentanmeldung offenbart sind, insbesondere Proteasen aus der Spezies Nocardiopsis sp., NRRL 18262 und Nocardiopsis dassonvillei, NRRL 18133. Noch weitere bevorzugte Proteasen sind die Serinproteasen aus Mutanten von Bacillus-Subtilinen, die in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/DK89/00002 und in der internationalen, als WO 91/00345 veröffentlichten Patentanmeldung veröffentlicht sind, und die in der EP 415 296 veröffentlichten Proteasen.
Eine weitere bevorzugte Klasse von Proteasen sind die Metalloproteasen mikrobiellen Ursprungs. In der Regel sind fermentierte herkömmliche kommerzielle Proteasen geeignet. Beispiele für eine solche kommerzielle Protease ist Neutrase® (Zn) (produziert durch submerse Fermentation eines Stammes von Bacillus subtilis), die von der Fa. Novo Nordisk A/S. DK-2880 Bagsvaerd, Dänemark produziert und verkauft wird.
Weitere geeignete, im Handel erhältliche Protease-Enzympräparationen sind Bactosol® WO und Bactosol® SI, erhältlich von der Fa. Sandoz AG, Basel, Schweiz; Toyozyme®, erhältlich von Toyo Boseki Co. Ltd., Japan und Proteinase K® (produziert durch submerse Fermentation eines Stammes von Bacillus sp. KSM-K16), erhältlich von Kao Corporation Ltd., Japan.
Ein weiteres hydrolytisches Enzym, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sein kann, ist eine mikrobielle Lipase. Als solche kann die Lipase aus Hefe, z. B. Candida-Lipasen, Bakterien, z. B. Pseudomonas- oder Bacillus- Lipasen; oder Pilzen, z. B. Humicola- oder Rhizomucor-Lipasen, gewählt werden.
Besonders geeignete Lipasen können die Rhizomucormiehei-Lipase (z. B. hergestellt wie beschrieben in der EP 238 023), die Therntomyceslanuginosa-Lipase, z. B. hergestellt wie beschrieben in der EP 305 216 (erhältlich von der Fa. Novo Nordisk unter dem Warennamen LipolaseTM), Humicolainsolens-Lipase, Pseudomonasstutzeri-Lipase, Pseudomonascepacia-Lipase. Candidaantarctica-Lipase A oder B oder Lipasen von rGPL, Absidia blakesleena. Absidia corymbifera, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Penicillum cyclopium, Penicillum crustosum, Penicillum expansum, Rhodotorula glutinis, Thiarosporella phaseolina, Rhizopus microsporus, Sporobolomyces shibatanus, Aureobasidium pullulans, Hansenula anomala, Geotricum penicillatum, Lactobacillus curvatus, Brochothrix thermosohata, Coprinus cinerius, Trichoderma harzanium, Trichoderma reesei, Rhizopus japonicus oder Pseudomonas plantari sein. Weitere Beispiele für geeignete Lipasen können Varianten von einer der vorstehend erwähnten Lipasen sein, z. B. wie beschrieben in der WO 92/05249 oder in der WO 93/11254.
Beispiele für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Amylasen umfassen Bacillzts-Amylasen, z. B. Bacillus stearothermophilus-Amylase, Bacillus amyloliduefaciens-Amylase, Bacillus subti/is-Amylase oder Bacillus licheniformis- Amylase (z. B. wie erhältlich von der Fa. Novo Nordisk unter dem Warennamen Termamyl®) oder Aspergillus-Amylasen, z. B. Aspergillus niger- oder Aspergillus oryzae-Amylase. Weitere Beispiele für geeignete Amylasen können Varianten einer der oben erwähnten Amylasen sein, z. B. wie beschrieben in der US 5 093 257, EP 252 666, WO 91/00353, FR 2 676 456, EP 285 123, EP 525 610, PCT/DK93/00230.
Ein weiteres geeignetes hydrolytisches Enzym ist eine "Cellulase" oder ein "cellulolytisches Enzym", das ein Enzym betrifft, das den Abbau von Cellulose zu Glucose, Cellobiose, Triose und weiteren Cellooligosacchariden katalysiert. Vorzugsweise ist die Cellulase eine Endoglucanase, mehr bevorzugt ein mikrobielles Endoglucanase-Enzym, insbesondere ein bakterielles Endoglucanase-Enzym oder ein Endoglucanase-Enzym aus Pilzen. Beispiele für bakterielle Endoglucanasen sind Endoglucanasen, die sich von Bakterien aus der Gruppe der aus Pseudomonas oder Bacillus lautus bestehenden Gattung ableiten oder hiervon produziert werden.
Die Cellulase oder Endoglucanase kann eine Säure, eine neutrale oder eine alkalische Cellulase oder Endoglucanase sein, d. h. die eine maximale cellulolytische Aktivität im sauren, neutralen bzw. alkalischen Bereich zeigt. Demgemäß ist eine geeignete Cellulase oder Endoglucanase eine saure Cellulase oder saure Endoglucanase, vorzugsweise eine saure Cellulase oder Endoglucanase aus Pilzen, mehr bevorzugt eine saure Cellulase oder Endoglucanase aus Pilzen mit einer nennenswerten cellulolytischen Aktivität unter sauren Bedingungen, die aus Pilzen stammt oder von Pilzen aus der Gruppe der aus Trichoderma, Actinomyces, Myrothecium, Aspergillus und Botrytis bestehenden Gattung produziert werden kann.
Eine bevorzugte geeignete saure Cellulase oder Endoglucanase leitet sich von Pilzen aus der Gruppe der Spezies bestehend aus Trichoderma viride, Trichoderma reesei, Trichoderma longibrachiatum, Myrothecium verrucaria, Aspergilhrs niger, Aspergillus oryzae und Botrytis cinerea ab oder kann hiervon produziert werden.
Eine weitere geeignete Cellulase oder Endoglucanase ist eine neutrale oder alkalische Cellulase oder Endoglucanase, vorzugsweise eine neutrale oder alkalische Cellulase oder Endoglucanase aus Pilzen, mehr bevorzugt eine alkalische Cellulase oder Endoglucanase aus Pilzen mit nennenswerter cellulolytischer Aktivität unter alkalischen Bedingungen, die sich von Pilzen aus der Gruppe der Gattung bestehend aus Aspergillus, Penicillium, Myceliophthora, Humicola, Irpex, Fusarium, Stachybotrys, Scopulariopsis, Chaetomium, Mycogone, Verticillium, Myrothecium, Papulospora, Gliocladium, Cephalosporlum und Acremonium ableitet oder hiervon produziert werden kann.
Eine bevorzugte alkalische Cellulase oder Endoglucanase leitet sich von Pilzen aus der Gruppe der Spezies, bestehend aus Humicola insolens, Fusarium oxysporum, Myceliopthora thermophile oder Cephalosporirrm sp., vorzugsweise aus der Gruppe von Spezies bestehend aus Humicola insolens, DSM 1800, Fusarium oxysporum, DSM 2672, Myceliopthora thermophila, CBS 117,65 oder Cephalosporium sp., RYM-202 ab oder ist hiervon produzierbar.
Beispiele für bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Xylanasen umfassen Enzyme mit xylanolytischer Aktivität, die von einem Stamm produziert werden oder produzierbar sind, der aus der Gruppe von Spezies ausgewählt ist, bestehend aus Humicola insolens (siehe z. B. WO 92/17573), Aspergillus aculeatus (ein Enzym, das Xylanaseaktivität zeigt, wobei das Enzym immunologisch mit einem Antikörper reaktiv ist, der gegen eine gereinigte Xylanase gezüchtet wurde, die sich ableitet von Aspergillus aculeatus, CBS 101.43, siehe z. B. WO 94/21785), Bcrcillus pumilus (siehe z. B. WO 92/03540), Bacillus steurathermophilus (siehe z. B. WO 91/18976, WO 91/10724), Bacillzrs sp. AC13 (insbesondere der Stamm NCIMB 40482, siehe z. B. WO 94/01532). Trichoderma longibrachiatum und Chainia sp. (siehe z. B. EP 0 353 342 A1), Thermoascus aurantiacus (siehe z. B. US-Patentschrift 4 966 850), Trichoderma harzicrnum und Trichoderma reseei (siehe z. B. US Patentschrift 4 725 544), Aureobasidium pullulans (siehe z. B. EP 0 373 107 A2), Thermomyces lanuginoszrs (siehe z. B. EP 0 456 033 A2), Bacillus eirculans (WO 91/18978), Aspergillus oryzae (siehe z. B. SU 4610007), Thermomonospora fusca (siehe z. B. EP 0 473 545 A2), Streptomyces lividans (siehe z. B. WO 93/03155), Streptomyces viridosporus (siehe z. B. EP 496 671 A1), Bacillus licheniformis (siehe z. B. JP 9213868) und Trichoderma longibrachiatum (siehe W.J.J. von den Tweel et al. (Hrsg.), "Stability of Enzymes", Lehren eines internationalen Symposiums, abgehalten in Maastricht, Niederlande, 22.-25. November 1992, Fisk, R.S. und Simpson, S. 323-328); oder von der Gruppe der Gattungen bestehend aus Thermotoga (siehe z. B. WO 93/19171), Rhodothermus (siehe z. B. WO 93/08275), Dictyoglomus (siehe z. B. WO 92118612) und Streptomyces (siehe z. B. US-Patentschrift 5 116 746). Weitere Beispiele für geeignete Xylanasen können Varianten sein (Derivate oder Homologe) von einen der eben erwähnten Enzyme mit xylanolytischer Aktivität.
Eine geeignete Pectinase kann ein Enzym sein, das den Enzymklassen Polygalacturonasen (EC 3.2.1.15), Pectinesterasen (EC 3.2.1.11), Pectinlyasen (EC 4.2.2.10) und Hemicellulasen, wie Endo-1,3-b-xylosidase (EC 3.2.1.32), Xylan-1,4-b-xylosidase (EC 3.2.1.37) und α-L-Arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) angehört. Ein geeigneter Quellorganismus für Pectinasen kann Aspergillus niger sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reinigungszusammensetzung eine hydrolytische Enzymzusammensetzung, die von einem Stamm des Pilzes Aspergillus aculeatzrs, vorzugsweise Aspergillus aculecrtus, CBS 101.43, produziert wird. Es ist bekannt, daß dieser Stamm eine Enzymzusammensetzung produziert, die pectolytische und einen Bereich von hemicellulolytischen Enzymaktivitäten enthält.
Die Hydrolase(en) sind in der Reinigungszusammensetzung in einer Menge von etwa 0,01 bis etwa 5000 ug Protein/ml Zusammensetzung, vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 500 ug Protein/ml Zusammensetzung vorhanden.
Der Begriff "Oxidoreductase", wie hier verwendet, bezeichnet ein nach der Enzymnomenklatur (1992) als EC 1 klassifiziertes Enzym, d. h. jedes Enzym, das klassifiziert ist als EC 1.1 (das auf die CH-OH-Gruppe von Donoren wirkt), EC 1.2 (das auf die Aldehyd- oder Oxo-Gruppe von Donoren wirkt), EC 1.3 (das auf die CH-CH-Gruppe der Donoren wirkt), EC 1.4 (das auf die CH-NH&sub2;-Gruppe von Donoren wirkt), EC 1.5 (das auf die CH-NH-Gruppe von Donoren wirkt), EC 1.6 (das auf NADH oder NADPH wirkt), EC 1.7 (das auf andere stickstoffhaltige Verbindungen als Donoren wirkt), EC 1.8 (das auf eine Schwefelgruppe von Donoren wirkt), EC 1.9 (das auf eine Häm-Gruppe von Donoren wirkt), EC 1.10 (das auf Diphenole und verwandte Substanzen als Donoren wirkt), EC 1.11 (das auf Peroxid als Akzeptor wirkt), EC 1.12 (das auf Wasserstoff als Donor wirkt), EC 1.13 (das auf einzelne Donoren unter Einarbeitung von molekularem Sauerstoff (Oxygenasen) wirkt), EC 1.14 (das auf gepaarte Donoren unter Einarbeitung von molekularem Sauerstoff wirkt), EC 1.15, das auf Superoxidradikale als Akzeptor wirkt), EC 1.16 (oxidiert Metallionen), EC 1.17 (das auf -CH&sub2;-Gruppen wirkt), EC 1.18 (das auf reduziertes Feredoxin als Donor wirkt), EC 1.19 (das auf reduziertes Flavodoxin als Donor wirkt) und EC 1.97 (andere Oxidoreductasen).
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße zu verwendende Oxidoreductase aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus Oxidasen, Peroxidasen und Laccasen, vorzugsweise aus Glucoseoxidasen, Aminosäureoxidasen, Xanthinoxidasen, Ascorbinsäureoxidasen, Lactoperoxidasen, Meerrettichperoxidasen, Myeloperoxidasen, Laccasen, Coprinus-Peroxidasen und Haloperoxidasen.
Laccasen sind Enzyme, die die Oxidation eines Substrates mit Sauerstoff katalysieren; sie sind aus mikrobiellem, pflanzlichem und tierischem Ursprung bekannt. Insbesondere sind Laccasen (EC 1.10.3.2) Oxidoreductasen, die mit molekularem Sauerstoff als Elektronenakzeptor wirken. Molekularer Sauerstoff aus der Atmosphäre ist in der Regel in ausreichender Menge vorhanden, so daß es normalerweise nicht notwendig ist, dem Verfahrensmedium zusätzlichen Sauerstoff zuzusetzen. Beispiele für ein in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignetes Laccaseenzym ist Laccase, die aus dem Stamm Coprinus cinereus IFO 30116 oder von einer Laccase mit immunchemischen Eigenschaften, die mit denjenigen einer Laccase identisch sind, die aus Coprinus cinereus IFO 30116 stammt, oder aus einem Stamm von Myceliophthora thermophila, wie offenbart in der WO 91/05839, erhältlich ist.
Eine geeignete Peroxidase ist vorzugsweise von Pflanzen (z. B. Meerrettich- oder Soja-Peroxidase) oder Mikroorganismen, wie Pilze oder Bakterien, produzierbar. Einige bevorzugte Pilze umfassen Stämme, die der Unterabteilung Deuteromycotina, Klasse Hyphomycetes, z. B. Fusarium, Hunzicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticilhrm, Arthronryces Caldariomyces, Ulocladiunz, Embellisia, Cladosporium oder Dreschlera, insbesondere Fusarium oxysporurn (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma resii, Myrothecium verrucaria (IFO 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlie, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariornyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia alli oder Dreschlere halodes angehören. Weitere bevorzugte Pilze umfassen Stämme, die der Unterabteilung Basidiomycotina, Klasse Basidiomycetes, z. B. Coprinus, Phanerochaete, Coriolus oder Trametes, insbesondere Coprinus cinereus f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporlum (z. B. NA&sub2;O-12) oder Trametes (bisher Polyporus genannt), z. B. T. Versicolor (z. B. PR4 28-A) angehören. Weitere bevorzugte Pilze umfassen Stämme, die der Unterabteilung Zygomycotina, Klasse Mycoraceae, z. B. Rhizopus oder Mucor, insbesondere Mucor hiemalis angehören.
Einige bevorzugte Bakterien umfassen Stämme der Ordnung Actinomycetales, z. B. Streptomyces spheroides (ATTC 23965), Streptornyces thermoviolaceus (IFO 12382) oder Streptoverticilhcm verticillium ssp. Verticillitem. Weitere bevorzugte Bakterien umfassen Bacillus pumilus (ATCC 12905), Bacilhcs stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) oder Pseudomonas fluorescens (NRRL B- 11). Weitere bevorzugte Bakterien umfassen Stämme, die zu Myxococcus, z. B. M. virescens gehören.
Im Zusammenhang mit der Erfindung, umfassend Verbindungen, die Peroxidaseaktivität aufweisen, Peroxidaseenzyme und Peroxidase-aktive Fragmente, die von Cytochromen, Hämoglobin, oder Peroxidaseenzymen und synthetischen oder halbsynthetischen Derivaten hiervon, z. B. Eisenporphyrinen und Eisenphthalocyanin, und Derivaten hiervon, stammen.
In der Regel können die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Enzyme einkomponentige (rekombinante) Enzyme sein, d. h. Enzyme, die im wesentlichen von anderen Proteinen oder Enzymproteinen frei sind. Ein rekombinantes Enzym kann kloniert und nach den einem Fachmann geläufigen Standardtechniken exprimiert werden. Das Enzym kann allerdings auch in Form einer Enzympräparation verwendet werden, die gegebenenfalls mit einem Enzym angereichert ist, das die gewtnschte Enzymaktivität als Hauptenzymkomponente enthält, z. B. einer einkomponentigen Enzympräparation.
Insbesondere ist eine rekombinant hergestellte Peroxidase eine Peroxidase, die sich von einem Coprinus sp., insbesondere C. macrorhizus oder C. cinereus gemäß WO 92/16634 oder einer Variante hiervon, z. B. einer Variante, wie beschrieben in der WO 94/12621, ableitet. Die Peroxidase kann allerdings durch herkömmliche Fermentation eines Stammes hergestellt werden, der der Gattung Coprinus, vorzugsweise der Spezies Coprinus cinereus oder Coprinus mactorhizus, mehr bevorzugt Coprinus cinereus IFO 8371 oder IFO 30114 angehört.
In Kombination mit einer Peroxidase ist die Verwendung eines Verstärkungsmittels bevorzugt, das als Elektronendonor zu wirken vermag. Geeignete Beispiele für solche Verstärkungsmittel sind nachstehend beschrieben.
A. Eine Quelle von ionischem Iodid, welches bei Kontakt mit Peroxidaseenzym in einer wäßrigen Lösung für eine Zeit und unter Bedingungen, die zur Durchführung der Überführung ausreichen, enzymatisch in Jod übergeführt werden kann. Im vorliegenden Zusammenhang ist eine Quelle für ionisches Iodid ein wasserlösliches Iodidsalz, wie ein Alkalimetalliodidsalz, z. B. Kaliumiodid (KI), Natriumiodid (NaI) oder Lithiumiodid, Ammoniumiodid, Calciumiodid. Natriumiodid und Kaliumiodid sind bevorzugt.
8. Ein weiteres bevorzugtes Verstärkungsmittel ist eine Quelle für das Thiocyanation (SCN&supmin;), z. B. Natriumthiocyanat, Kaliumthiocyanat, Ammoniumthiocyanat, und weitere Thiocyanatsalze, vorzugsweise Natriumthiocyanat und Kaliumthiocyanat.
C. Ein weiteres geeignetes Verstärkungsmittel ist die durch die folgende Formel beschriebene Verbindung:
wobei die Formel X(-O-) oder (-S-) darstellt und die Substituentengruppen R¹ bis R&sup9;, die gleich oder verschieden sein können unabhängig einen der folgenden Reste darstellen: Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Formyl, Carboxyl und Ester und Salze hiervon, Carbamoyl, Sulfo und Ester und Salze hiervon, Sulfamoyl, Nitro, Amino, Phenyl. C&sub1;-C&sub1;&sub4;-Alkyl, C&sub1;-C&sub5;-Alkoxy. Carbonyl- C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, Aryl- C&sub1;-C&sub5;-Alkyl; wobei die Carbamoyl-, Sulfamoyl- und Aminogruppen außerdem unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit einer Substituentengruppe R¹&sup0; substituiert sein können;
und wobei Phenyl außerdem unsubstituiert oder mit einer oder mehreren Substituentengruppen R¹&sup0; substituiert sein kann; und wobei die C&sub1;-C&sub1;&sub4;-Alkyl-, C&sub1;-C&sub5;-Alkoxy-, Carbonyl-C&sub1;-C&sub5;-alkyl- und Aryl-C&sub1;-C&sub5;-alkyl-Gruppen gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und außerdem unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituentengruppen R¹&sup0; substituiert sein können;
wobei die Substituentengruppe R¹&sup0; einen der folgenden Reste darstellt: Halogen, Hydroxy, Formyl, Carboxy und Ester und Salze hiervon, Carbamoyl, Sulfo und Ester und Salze hiervon, Sulfamoyl, Nitro, Amino, Phenyl, Aminoalkyl, Piperidino, Piperazinyl, Pyrrolidin-1-yl, C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, C&sub1;-C&sub5;-Alkoxy; wobei die Carbamoyl-, Sulfamoyl- und Aminogruppen außerdem unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit Hydroxy zu C&sub1;-C&sub5;-Alkyl, zu C&sub1;-C&sub5;-Alkoxy substituiert sein können; und wobei Phenyl außerdem mit einem oder mehreren der folgenden Reste substituiert sein kann: Halogen, Hydroxy, Amino, Formyl, Carboxy und Ester und Salze hiervon, Carbamoyl, Sulfo und Ester und Salze hiervon und Sulfamoyl; und wobei C&sub1;-C&sub5;-Alkyl- und C&sub1;-C&sub5;-Alkoxy-Gruppen außerdem gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt sein können und außerdem ein- oder zweifach mit einem der folgenden Reste substituiert sein können: Halogen, Hydroxy, Amino, Formyl, Carboxy und Ester und Salze hiervon, Carbamoyl, Sulfo und Ester und Salze hiervon, und Sulfamoyl;
oder wobei in der allgemeinen Formel zwei der Substituentengruppen R¹-R&sup9; zusammen eine Gruppe -B- bilden können, wobei B eine der folgenden Gruppen darstellt: (-CHR¹&sup0;-N=N-), (-CH=CH-)n, (-CH=N-)n oder (-N=CR¹&sup0;-NR¹¹-), wobei in den Gruppen n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, R¹&sup0; eine Substituentengruppe wie vorstehend definiert bedeutet und R¹¹ wie R¹&sup0; definiert ist. (Es ist selbstverständlich, daß, wenn die oben erwähnte Formel zwei oder mehrere R¹&sup0;- Substituentengruppen aufweist, diese R¹&sup0;-Substituentengruppen gleich oder verschieden sein können.)
Bei besonderen Ausführungsformen ist das Verstärkungsmittel 10-Methylphenothiazin, Phenothiazin-10-propionsäure, N-Hydroxysuccinimid-phenothiazin-10-propionat, 10-Ethylphenothiazin-4-carbonsäure, 10-Ethylphenothiazin, 10-Propylphenothiazin, 10-Isopropylphenothiazin, Methylphenothiazin- 10-propionat, 10-Phenylphenothiazin, 10-Allylphenothiazin, 10-(3-(4-Methylpiperazin-1-yl)propyl)phenothiazin, 10-(2-Pyrrolidin-1-yl-ethyl)phenothiazin, 2-Methoxy-10-methylphenothiazin, 1-Methoxy-10-methylphenothiazin, 3-Methoxy-10-methylphenothiazin, 3,10-Dimethylphenothiazin, 3,7,10-Trimethylphenothiazin, 10-(2-Hydroxyethyl)phenothiazin, 10-(3-Hydroxypropyl)- phenothiazin, 3-(2-Hydroxyethyl)-10-methylphenothiazin, 3-Hydroxyethyl-10- methylphenothiazin, 3,7-Dibromphenothiazin-10-propionsäure, Phenothiazin-10- propionamid, Chlorpromazin, 2-Chlor-10-methylphenothiazin, 2-Acetyl-10- methylphenothiazin, 10-Methylphenoxazin, 10-Ethylphenoxazin, Phenoxazin-10- propionsäure, 10-(2-Hydroxyethyl)phenoxazin oder 4-Carboxyphenoxazin-10- priopionsäure.
D. Ein weiteres Beispiel für ein geeignetes Verstärkungsmittel ist eine durch die folgende Formel beschriebene Verbindung:
wobei in der Formel A für eine Gruppe, wie -D, -CH=CH-D, -CH=CH-CH=CH- D, -CH=N-D, -N=N-D oder -N =CH-D, steht, wobei D ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CO-E, -SO&sub2;-E, -N-XY und -N&spplus;-XYZ, wobei E -H, -OH, -R oder -OR bedeuten kann und X und Y und Z gleich oder verschieden und aus -H und -R ausgewählt sein können; R ein C&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkyl, vorzugsweise ein C&sub1;-C&sub8;-Alkyl bedeutet, wobei das Alkyl gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt und gegebenenfalls mit einer Carboxy-, Sulfo- oder Aminogruppe substituiert sein kann; und B und C gleich oder verschieden und aus CmH2m+1; 1 ≤ m ≤ 5; ausgewählt sein können.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform bedeutet A in der oben erwähnten Formel -CO-E, wobei E -H, -OH, -R oder -OR bedeuten kann; wobei R ein C&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkyl, vorzugsweise ein C&sub1;-C&sub8;-Alkyl bedeuten kann, wobei das Alkyl gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder unverzweigt und gegebenenfalls mit einer Carboxy-, Sulfo- oder Aminogruppe substituiert sein kann; und B und C gleich oder verschieden und aus CmH2m+1; 1 ≤ m ≤ 5 ausgewählt werden.
In der oben erwähnten Formel kann A statt wie gezeigt in der Paraposition in Metaposition zur Hydroxygruppe angeordnet sein.
Bei besonderen Ausführungsformen ist das Verstärkungsmittel Acetosyringon, Methylsyringat, Ethylsyringat, Propylsyringat, Butvlsyringat, Hexylsyringat oder Octylsyringat.
E. Noch ein weiteres geeignetes Verstärkungsmittel ist eine durch die allgemeine Formel
A=N-N=B
beschriebene Azinoverbindung, wobei in der Formel die Symbole A und B, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig jeden der in Fig. 2 aufgeführten Substituenten II, III, IV und V bedeuten; wobei in den Substituenten die Symbole X und Y, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig Kohlenstoff, Stickstoff wobei Stickstoff unsubstituiert oder mit einer Substituentengruppe R&sup5; substituiert sein kann, Schwefel, Sauerstoff, Selen oder Tellur darstellen; und wobei in den Substituenten die Substituentengruppen R¹, R², R³ und R&sup4;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig folgendes bedeuten: Wasserstoff, Halogen, eine Hydroxygruppe, eine C&sub1;-C&sub3;-Alkoxygruppe, eine Formylgruppe, eine Carboxygruppe, eine Sulfogruppe, eine Nitrogruppe, eine C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe, wobei die Alkylgruppe außerdem gesättigt oder ungesättigt, linear oder verzweigt sein kann, oder eine Aminogruppe, wobei die Aminogruppe außerdem unsubstituiert oder ein- oder zweifach mit einer Substituentengruppe R&sup5; substituiert sein kann, wobei die Substituentengruppe R&sup5; Halogen, eine Hydroxygruppe, eine C&sub1;-C&sub3;-Alkoxygruppe, eine C&sub1;-C&sub5;-Alkylgruppe oder eine Aminogruppe bedeutet. Das Peroxidase-Verstärkungsmittel kann in freier Form oder in Form eines Additionssalzes vorliegen.
Bei den bevorzugten Ausführungsformen bedeuten die Substituentengruppen R¹, R², R³ und R&sup4;, die gleich oder verschieden sein können, unabhängig Wasserstoff, Halogen, eine Hydroxygruppe, eine C&sub1;-C&sub3;-Alkylgruppe oder eine Sulfogruppe. Vorzugsweise bedeutet Halogen Fluor, Chlor oder Brom. Vorzugsweise bedeutet die C&sub1;-C&sub3;-Alkylgruppe Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl.
Bei bevorzugten Ausführungsformen bedeutet die Substituentengruppe R&sup5; Halogen, eine Hydroxygruppe, C&sub1;-C&sub3;-Alkoxygruppe, C&sub1;-C&sub3;-Alkylgruppe oder eine Aminogruppe.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Peroxidase-Verstärkungsmittel 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat). Diese Verbindung, abgekürzt ABTS, ist ein chromogenes Substrat und ein gebräuchliches Peroxidase- und Phenoloxidase-Testreagenz.
Es wurde allerdings gezeigt, daß ABTS im Gegensatz zu den bekannten vorstehend beschriebenen Verstärkungsmitteln in der Lage ist, als Peroxidase- Verstärkungsmittel unter stark alkalischen Bedingungen, d. h. über pH 9, zu wirken. Dieses Merkmal gestattet, daß ABTS z. B. in Detergenzzusammensetzungen eingearbeitet wird, deren Leistung im pH-Bereich 7-13, insbesondere im pH- Bereich 8-12, vorzugsweise im pH-Bereich 9-11 gedacht ist.
Das Verstärkungsmittel kann in der antimikrobiellen Zusammensetzung in Konzentrationen entsprechend 0,005 bis 1000 mmol pro g Substrat (mikrobielle Zellen, Biomasse), vorzugsweise von 0,05 bis 500 mmol pro g Substrat, mehr bevorzugt von 0,5 bis 100 mmol pro g Substrat vorhanden sein.
Ohne auf eine Theorie begrenzt zu sein, wird derzeit davon ausgegangen, daß eine positive Korrelation zwischen der Halbwertszeit des Radikals, welches das Verstärkungsmittel in dem relevanten wäßrigen Medium bildet, und seiner Wirksamkeit besteht und daß diese Halbwertszeit wesentlich größer ist als die Halbwertszeit eines der Substanzen, die aus der Gruppe bestehend aus p-Hydroxyzimtsäure, 2,4-Dichlorphenol, p-Hydroxybenzolsulphonat, Vanillin und p-Hydroxybenzolsäure ausgewählt sind (d. h. die in der WO 92/18683 offenbarten Verstärkungsmittel).
Da die Halbwertszeit des Radikals u. a. von dem pH-Wert, der Temperatur und dem Puffer des wäßrigen Mediums abhängt, ist es sehr wichtig, daß alle diese Faktoren bei Vergleich der Halbwertszeiten der Radikale verschiedener Verstärkungsmittel gleich sind.
Vorzugsweise beträgt die Menge an Oxidoreductase in der erfindungsgemäßen Desinfektionszusammensetzung etwa 0,01 bis etwa 1000 ug Protein/ml Zusammensetzung, mehr bevorzugt etwa 10 bis etwa 100 ug Protein/ml Zusammensetzung. Im Falle von Oxidasen und Peroxidasen beträgt die bevorzugte Menge etwa 0,01 bis etwa 100 Oxidase oder Peroxidaseeinheiten (z. B. GODU oder PODU) pro ml Zusammensetzung, mehr bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 50 Einheiten/ml.

Definition von Enzymeinheiten

1 Glucoseoxidaseeinheit (GODU) ist die Menge an Enzym, die unter Standardbedingungen (d. h. pH 5,6, 30ºC, 20 min Inkubationszeit, Acetatpuffer und Glucose 16,2 g/l, 90 mM als Substrat) 1 mmol Wasserstoffperoxid pro Minute bildet. Ein Faltblatt AF 266/1, das dieses Analyseverfahren beschreibt, ist auf Nachfrage von der Fa. Novo Nordisk A/S. Dänemark, erhältlich, wobei das Faltblatt hiermit als Referenz mit umfaßt ist.
1 Peroxidaseeinheit (PODU) ist die Menge an Enzym, die die Umwandlung von 1 mmol Wasserstoffperoxid pro Minute bei folgenden Analysebedingungen katalysiert: 0,88 mM Wasserstoffperoxid, 1,67 mM 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat), 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, inkubiert bei 30ºC, photometrisch verfolgt bei 418 nm.
1 Pectinaseeinheit (PSU) ist die Menge an Enzym, die die Viskosität einer Lösung von Pectinsäure vermindert. Die Aktivität wird relativ zu einem bekannten Standard von 7000 PSU/g bei den folgenden Analysebedingungen gemessen: Acetatpuffer, 40ºC, pH 4,0, 1,43% Pectinsäure und 30 min Reaktionszeit.
1 Lactoperoxidaseeinheit (LP) bildet in 20 sec bei pH 6,0 bei 20ºC 1,0 mg Purpurgallin aus Pyrogallol. Standardtest von Sigma Chemical Company.

Die Zusammensetzung

Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann eine Reinigungszusammensetzung, d. h. sie enthält eine oder mehrere Hydrolasen, die in der Lage sind, einen Biofilm von einer Oberfläche zu entfernen oder abzulösen, eine Desinfektionszusammensetzung, d. h. sie enthält eine Oxidoreductase, die in der Lage ist, lebende mikrobielle, vorzugsweise bakterielle Zellen, die in einem Biofilm vorhanden sind, abzutöten, oder eine Kombination hiervon, d. h. eine Zusammensetzung, die mindestens eine Hydrolase und eine Oxidoreductase in Mengen enthält, die zum Reinigen und Desinfizieren einer vollständig oder teilweise von einem Biofilm bedeckten Oberfläche wirksam sind, sein.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung enthält außerdem ein gebräuchliches oberflächenaktives Mittel.

Das Verfahren

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einem pH oder in einem pH-Bereich durchgeführt, bei dem die angewandten Enzyme aktiv sind, beispielsweise innerhalb eines pH-Bereiches, wobei die tatsächlichen Enzyme mindestens etwa 50% relative Aktivität, mehr bevorzugt mindestens etwa 80% Aktivität aufweisen. Demgemäß ist es bevorzugt, daß der pH der Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung im Bereich von 4,5-11, vorzugsweise 5- 9, mehr bevorzugt 5,5-7,5 liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur oder in einem Temperaturbereich durchgeführt, bei dem die angewandten Enzyme aktiv sind, beispielsweise innerhalb eines Temperaturbereiches, wobei die tatsächlichen Enzyme mindestens etwa 50% relative Aktivität, mehr bevorzugt mindestens etwa 80% Aktivität aufweisen. Typischerweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur (der Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung) im Bereich von 10-60ºC, vorzugsweise 20-50ºC, mehr bevorzugt 25- 40ºC durchgeführt.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

BEISPIEL 1

In einem Modelsystem wurden unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa ATCC 10148, Pseudomonas fluorescens Stamm AH 2 (Gram et al. 1990), Staphylococcus epidermidis DMS 20042 und Staphylococcus aureus ATCC 25923 Biofilme gezüchtet. Trypton-Soja-Brühe (TSB) von Oxoid CM131 wurde als Wachstumsmedium eingesetzt.
Edelstahl Typ AISI 304 mit einer Oberflächebeschaffenheit Nr. 4 (Politurkorngröße 180) wurde in 12·20-mm-Scheiben geschnitten. Polypropylenscheiben (12·20 mm; Ral. 7032, Dukadan A/S) wurden durch Schrubben in einem neutralen Reinigungsmittel (Triton) gereinigt und anschließend vor dem Autoklavieren mit Wasser abgespült. Die Scheiben wurden in Wasser und anschließend mit Chloroform, Methanol und schließlich Aceton (jeweils 5 min) vor der Sterilisation durch Autoklavieren bei 121ºC für 20 min vor der Verwendung gereinigt.

Biofilmentwicklung

Die sterilen Stahl- oder Polypropylenscheiben wurden vertikal auf einem sterilen Stahlständer in einem Becherglas festgeklemmt. Der Ständer hält bis zu 20 Scheiben in einer Anordnung, die die freie Zirkulation von Flüssigkeit beim Eintauchen in Kulturmedium gestattet. S. aureus, P. aeruginosa und P. fluorescens wurden in TSB 24 h bei 26ºC vorkultiviert.
S. epidermidis wurde in TSB 24 h bei 30ºC vorkultiviert. Staphylococcus spp. Wurde in TSB übergeimpft, und Pseudomonas spp. wurde in TSB, verdünnt 1 : 5 mit sterilem Wasser, übergeimpft (ungefähr 10³ cfu/ml). Die angeimpften Medien wurden in das Becherglas gegossen und bedeckten die Scheiben, und die Entwicklung eines Biofilm auf beiden Seiten der Scheiben bei 26ºC (S. epidermidis bei 30ºC) während 4 Tage unter leichtem Rühren (200 U/min) wurde zugelassen.
Sämtliche Scheiben wurden 1 min aseptisch in sterilem Phosphatpuffer (0,067 M, pH 7) zur Entfernung von Planktonzellen vor der Inkubation mit Enzymen gespült.

Antibakterielle Enzyme

Glucoseoxidase (Novo Nordisk A/S) wurde mit 3 g/l D(+)-Glucose (Sigma G- 7528) als Elektronendonor und Sauerstoff als Elektronenakzeptor, der zu Wasserstoffperoxid reduziert wird, verwendet.
Lactoperoxidase (Sigma Chemicals Co.) wurde mit Wasserstoffperoxid als Elektronenakzeptor und 2 mM Thiocyanat als Elektronendonor verwendet.
Pectinase, erzeugt durch Fermentation eines Stammes von Aspergillus aculeatus (Novo Nordisk), ist eine im Handel erhältliche mehrkomponentige Enzympräparation, die Proteaseaktivität und einen breiten Bereich von Carbohydrasen, einschließlich Pectinase-, Arabanase-, Cellulase-, Hemicellulase-, β-Glucanase- und Xylanaseaktivitäten, enthält.

Enzymatische Entfernung und Abtötung von Biofilmzellen

Die Enzyme wurden im Phosphatpuffer (pH 7) verdünnt, über Filter sterilisiert und dem Puffer, der die Biofilmscheiben enthielt, zugesetzt. Stahl- und Polypropylenscheiben wurden bei 20ºC 15 min ohne Rühren mit den Enzymen inkubiert. Für beide Substrate wurde Sterilpuffer ohne zugesetzte Enzyme als Kontrolle verwendet. Nach der Enzymbehandlung wurden die Substrate vorsichtig einmal im Sterilpuffer gespült und anschließend vor der Mikroskopie oder der Zählung durch Leitfähigkeitsmessungen angefärbt.
Die bakterizide Wirksamkeit von Glucoseoxidase und Lactoperoxidase wurde ebenfalls an Planktonzellen von S. aureus, S. eperdimidis, P. aeruginosa und P. fluorescens bestimmt. Planktonzellen aus der Biofilmentwicklung wurden in 0,067 M Phosphatpuffer (pH 7,0) 1 : 19 verdünnt und mit Glucoseoxidase (0,5 oder 10 GODU/ml) und Lactoperoxidase (0,1 oder 5 U/ml) bei 20ºC 15 min gemischt. Die bakterizide Wirksamkeit gegen Planktonzellen wurde durch Überimpfen von 0,1 ml der Zellsuspensionen auf Malthus-Zellen bewertet.

Bewertung von Biofilm

Fluoreszenzmikroskopie: Das Tetrazoliumsalz 5-Cyano-2,3-ditolyltetrazoliumchlorid (CTC) (Polysciences, Inc., Warrington, PA) wurde in destilliertem sterilfiltriertem Wasser (10 mM) gelöst. CTC wurde als Indikator der Zellüberlebensfähigkeit verwendet, da die wäßrige Lösung von CTC nahezu farblos und nicht floureszierend ist, während das entsprechende Formazanprodukt im roten Bereich bei ungefähr 620 nm bei Anregung mit 420 nm fluoresziert. Das DNA-bindende Fluorochrom DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol, Sigma D-9542) wurde als Indikator für die Zellgesamtzahl eingesetzt, und die Biofilmzellen wurden mit DAPI nach CTC-Anfärbung angefärbt, um die Zählung von Zellen insgesamt und atmenden Zellen in derselben Präpäration (30) zu ermöglichen.
Die Scheiben mit Biofilm wurden nach der Enzymbehandlung 45 min (20ºC) mit 0,5 ml Tryptosephosphatbrühe (TPB) und TC-Tetrazoliumsalz (12,5 mM) im Dunkeln inkubiert. Während der letzten 5 min des CTC-Anfärbens wurde DAPI (3 mM) zugesetzt. Die angefärbten Zellen wurden mit dem · 100- Ölimmersionsfluoreszenz-Objektiv auf einem Olympus-Mikroskopmodell BX 50, ausgestattet mit einem 200 W Quecksilberlicht, geprüft. Die zum Ansehen der CTC-angefärbten Zellen verwendete Filterkombination war ein 480-550-nm- Anregungsfilter und ein 590-nm-Sperrfilter (Olympus Würfelmodell U-MSWG). Die DAPI-angefärbten Zellen wurden mit einem 330-385-nm-Anregungsfilter und einem 420-nm- Sperrfilter (Olympus Würfelmodell U-MWU) betrachtet.
Leitfähigkeitsmessungen: Indirekte Malthus-Messungen wurden zum Zählen von auf den Substraten anhaftenden Zellen (Johnston & Jones, 1995) angewandt. Die Scheiben wurden nach der Inkubation mit Enzymen in dem gleichen Puffer wie für die Enzymbehandlung verwendet gespült und in Malthus-Röhrchen, die 3 ml Wachstumsmedium in dem äußeren Röhrchen und 0,5 ml 0,1 M KOH in dem inneren Röhrchen enthielten, übergeführt (Dezenclos et al. 1994). TSB wurde als Wachstumsmedium zum Nachweis von P. aeruginosa und P. fluorescens verwendet, wohingegen BHI zum Nachweis von S. aureus und Strep. Mutans verwendet wurde. Die Röhrchen wurden in ein Malthus 2000 (Malthus Flexi 2000, Malthus Instrument Limited) gegeben und mit der Ausnahme der Proben mit P. fluorescens, die bei 25ºC inkubiert wurden, bei 37ºC inkubiert.
Von den die Bakterien produziertes Kohlendioxid wird durch das KOH absorbiert und verändert dadurch die Leitfähigkeit. Die Änderungen in der Leitfähigkeit wurden gegen die Zeit aufgetragen, und die Nachweiszeit (DT) wurde als Zeit vom Start der Messung bis zum Nachweis einer schnellen Änderung in der Leitfähigkeit durch das Malthus-Verfahren bestimmt. Die DT kann unter Verwendung einer Eichkurve, die für jeden Organismus durch Überimpfen in Malthus- Röhrchen mit einer zehnfachen Verdünnungsreihe (Johansen et al. 1995) erstellt wurde mit der zu Beginn des Testes vorhandenen Anzahl von Zellen verknüpft werden.

Ergebnisse

Die Abschätzung der exakten Anzahl lebender Zellen auf den Substraten wurde in sämtlichen Experimenten durch Leitfähigkeitsmessungen bestimmt. Allerdings ist es durch das Malthus-Verfahren nicht möglich, zwischen einer bakteriziden Wirksamkeit der Enzyme oder einer enzymatischen Entfernung von Biofilm zu unterscheiden. Darum muß eine Abnahme in den lebenden Bakterien auf den Substraten mit der gleichzeitigen Entfernung von Biofilm aus den Substraten, die durch DAPI/CTC-Anfärben geschätzt wurde, verglichen werden.
Pectinase verringert die Anzahl von Bakterienzellen in Biofilmen auf Edelstahl (Tabelle 1). Die Aktivität von Pectinase wurde als Entfernung von Biofilm ohne nennenswerte bakterizide Wirksamkeit gegen keinen der vier Stämme beobachtet, bestimmt durch das kombinierte DAPI/CTC-Anfärben.
Tabelle 1: Verminderung von Biofilm auf Edelstahl nach Behandlung mit Pectinex Ultra SP für 15 min bei 20ºC (pH 7).
Sämtliche durch DAPI anfärbbaren Zellen wurden ebenfalls mit CTC angefärbt, was anzeigte, daß alle sichtbaren Zellen atmeten. Nach der Behandlung mit Pectinase zeigte die DAPI-Anfärbung eindeutig eine Ablösung von P. aeruginosa- Biofilm von der Oberfläche, und die CTC-Anfärbung zeigte, daß die verbleibenden Zellen atmeten, was keine bakterizide Wirksamkeit von Pectinase anzeigte.
In der Regel waren S. aureus- und S. epidermidis-Biofilme gegenüber der enzymatischen Ablösung durch Pectinase empfindlicher als P. aeruginosa- und P. fluorescens-Biofilme (Tabelle 1). S. aureus-Biofilm war gegenüber Pectinase am empfindlichsten, da 0,18 PSU Pectinase pro ml 83% des Biofilms abgelöste. P. fluorescens war der widerstandsfähigste Biofilm, da 1800 PSU Pectinase pro ml benötigt wurden, um 85% des Biofilms zu entfernen. Die Ablösung von Biofilm auf Polypropylen durch Pectinase entsprach der Ablösung von Biofilm auf Edelstahl.
Die Kombination von Glucoseoxidase und Lactoperoxidase senkte deutlich die Anzahl der aktiv atmenden Zellen und verminderte die Anzahl von lebenden Zellen in den vier getesteten Biofilmen (Tabelle 2 und 3). Die Lebensfähigkeit von Staphy/ococcus-Biofilm wurde bei Exposition gegenüber Glucoseoxidase (10 GODU/ml) und Lactoperoxidase (5 U/ml) um 1 bis 2 logarithmische Einheiten vermindert, wohingegen die Lebensfähigkeit von Pseudomonas-Biofilm um mehr als 3 logarithmische Einheiten vermindert wurde. Das Ausmaß der Abtötung war allerdings geringer als dasjenige, das bei Exposition von Suspensionen von Planktonzellen erhalten wurde, da Planktonzellen von Pseudomonas spp. bei Exposition gegenüber Glucoseoxidate (10 GODU/ml) und Lactoperoxidase (5 U/ml) (Tabelle 2) ungefähr um 5 logarithmische Einheiten vermindert wurden.
Tabelle 2: Bakterizide Wirksamkeit gegen Pseudomonas aeruginosa- und Pseudomonas fluorescens-Zellen in Biofilm auf Edelstahl und Planktonzellen, verursacht durch Glucoseoxidase und Lactoperoxidase nach 15-minütiger Behandlung bei 20ºC. Die Zellkonzentration vor der Enzymbehandlung ist angegeben, und die bakterizide Wirksamkeit ist relativ zu der Zellanzahl unbehandelter Proben gezeigt.
Plankontzellen von S. aureus waren in der Empfindlichkeit gegenüber Oxidoreductasen mit Biofilmzellen vergleichbar, somit wurde S. aureus bei Exposition gegenüber Glucoseoxidase (10 GODU/ml) und Lactoperoxidase (5 U/ml) um ungefähr 2-3 logarithmische Einheiten vermindert (Tabelle 3). Planktonzellen von S. epidermidis waren gegenüber Oxidoreductasen deutlich empfindlicher als die Biofilmzellen, da die Anzahl von lebensfähigen Planktonzellen im Vergleich zu einer Verminderung um 1 logarithmische Einheit in der Anzahl von Biofilmzellen ungefähr um 5 logarithmische Einheiten abnahm. Die Konzentration überlebensfähiger Zellen in dem S. epidermidis-Biofilm betrug allerdings 10&sup7; cfu/Scheibe, wohingegen die Konzentration von Planktonzellen ungefähr 10&sup6; cfu/ml betrug, darum war das Verhältnis zwischen Zellanzahl und Konzentration der Oxidoreductasen für Biofilm- bzw. Planktonzellen von S. epidermidis unterschiedlich (Tabelle 3).
Tabelle 3: Bakterizide Wirksamkeit gegen Staphylococcus aureus- und S. epidermidis-Zellen in Biofilm auf Edelstahl und Planktonzellen, verursacht durch Glucoseoxidase und Lactoperoxidase nach Behandlung für 15 min bei 20ºC. Die Zellkonzentration vor der Enzymbehandlung ist angegeben, und die bakterizide Wirksamkeit ist relativ zu der Zellanzahl unbehandelter Proben gezeigt.
Es existiert kein wesentlicher Unterschied in der bakteriziden Wirksamkeit des Oxidoreductasesystems gegenüber Biofilm auf Edelstahl im Vergleich zu Biofilm auf Polypropylen, mit Ausnahme von P. aeruginosa-Biofilm auf Polypropylen, wo Glucoseoxidase (5 GODU/ml) in Kombination mit Lactoperoxidase (5 U/ml) 99, 99% der Biofilmzellen im Vergleich zu 98% des P. aeruginosa-Biofilms auf Edelstahl abtötete.
Das Komplexgemisch von Polysaccharid-hydrolysierenden Enzymen in Pectinex Ultra vermochte einen bakteriellen Modell-Biofilm auf Edelstahl zu entfernen, zeigte allerdings keine nennenswerte bakterizide Wirksamkeit. Im Gegensatz dazu waren Oxidoreductasen gegenüber Biofilmzellen bakterizid, bewirkten allerdings keine Ablösung des Biofilms. Außerdem war die Kombination von Oxidoreductasen und Polysaccharid-hydrolysierenden Enzymen bakterizid und abgelöste den Biofilm.
Die Kombination von Glucoseoxidase mit Lactoperoxidase war gegen Biofilmzellen bakterizid, allerdings war die Bakterizidwirksamkeit des Oxidoreductasesystems gegen Biofilmzellen im Vergleich zu seiner Wirksamkeit auf Planktonzellen nicht so stark. Es ist ein gut bekanntes Phänomen, daß Biofilmzellen resistenter sind als Planktonzellen (Brown et al. 1995, Khardori et al. 1995). Die Diffusion von Thiocyanat und Wasserstoffperoxid in den Biofilm vermindert die Empfindlichkeit der Biofilmzellen im Vergleich zu Planktonzellen, was nahelegt, daß die darunterliegenden Zellen in dem Biofilm der bakteriziden Wirkung der Oxidoreductasen entgehen, wenn die Biofilmzellen nicht von der Oberfläche abgelöst werden. Dies kann den geringen Unterschied in der Empfindlichkeit von Staphylococcus-Biofilm bzw. Planktonzellen erklären, da die dünnen Biofilme von Staphy/ococcus spp. im Vergleich zu den dicken Biofilmen von Pseudomonas spp. einen begrenzten Schutz der Biofilmzellen aufweisen. Darum kann die bakterizide Wirksamkeit von Oxidoreductasen unter Verwendung einer Kombination von Biofilm-abbauenden Enzymen zusammen mit dem Oxidoreductasesystem verbessert werden.
LITERATUR
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Dezenclos, T., M. Ascon-Cabrera, D. Ascon, J.-M. Lebeault and A. Pauss. 1994. Optimisation of the indirect impedancemetry technique; a handy technique for microbial growth measürements. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 232-238.
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Claims

1. Verfahren zur Reinigung und Desinfektion einer Oberfläche, die mindestens teilweise von einer Biofilmschicht bedeckt ist, wobei das Verfahren die aufeinanderfolgenden oder gleichzeitigen Schritte umfaßt:

a) In-Kontakt bringen des Biofilms mit einer Reinigungszusammensetzung, die eine oder mehrere Hydrolasen in einer entweder zur vollständigen oder teilweisen Entfernung oder Ablösung der Biofilmschicht von der Oberfläche wirksamen Menge enthält; und

b) In-Kontakt bringen des Biofilms mit einer bakteriziden desinfizierenden Zusammensetzung, die eine Oxidoreductase in einer zum Abtöten der in dem Biofilm vorhandenen lebenden Bakterienzellen wirksamen Menge enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hydrolase aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Cellulasen (Endoglucanasen, Cellobiohydrolasen, β-Glucosidasen), Hemicellulasen (Xylanasen, Mannanasen, Xylanacetylesterasen), Pectinasen (Arabinanasen, α-Arabino-Furanosidasen, Galactanasen, Pectinlyasen, Pectinmethylesterasen, Polygalacturonasen, Rhamnogalacturonanacetylesterasen, Rhamnogalacturonasen), Amylasen, Proteasen und Lipasen.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Reinigungszusammensetzung eine hydrolytische Enzymzusammensetzung enthält, die von einem Stamm des Pilzes Aspergillus aculeatus, vorzugsweise Aspergillus aculeatus CBS101.43, produziert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Menge an Hydrolase in der Reinigungszusammensetzung etwa 0,01 bis etwa 5000 ug Protein/ml Zusammensetzung, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 500 ug Protein/ml Zusammensetzung beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4. wobei die Oxidoreductase aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Oxidasen, Peroxidasen und Laccasen, vorzugsweise aus Glucoseoxidasen. Aminosäureoxidasen, Xanthinoxidasen, Ascorbinsäureoxidasen, Lactoperoxidasen, Meerrettichperoxidasen, Myeloperoxidasen und Haloperoxidasen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Oxidoreductase eine Peroxidase ist, die produziert wird oder ableitbar ist von einem Pilz, der der Gattung Coprinus, vorzugsweise der Spezies Coprinus cinereus oder Coprinus mactorhizus, mehr bevorzugt Coprinus cinereus IFO 8371 oder IFO 30114 angehört.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 oder 6, wobei die Menge an Oxidoreductase in der Desinfektionszusammensetzung etwa 0,01 bis etwa 1000 ug Protein/ml Zusammensetzung, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 100 ug Protein/ml Zusammensetzung beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei der pH der Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung im Bereich von 4,5-11, vorzugsweise im Bereich von 5-9, mehr bevorzugt im Bereich von 5,5-7, 5 liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Temperatur der Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung im Bereich von 10- 60ºC, vorzugsweise im Bereich von 20-50ºC, mehr bevorzugt im Bereich von 25-40ºC liegt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei die Biofilmschicht lebende Zellen enthält, ausgewählt aus den Bakteriengattungen Pseudomonas, Staphylococcus, Aeromonas oder aus der Familie Enterobacteriaceae.

11. Reinigungs- und/oder Desinfektionszusammensetzung, enthaltend eine oder mehrere Hydrolasen, eine Oxidoreductase, ausgewählt aus Peroxidase und Laccase, und ein oberflächenaktives Mittel.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Oxidoreductase eine Peroxidase ist und die Zusammensetzung außerdem ein Verstärkungsmittel enthält.

13. Verwendung der Zusammensetzung nach den Ansprüchen 11 oder 12 zur Reinigung oder Desinfektion von Biofilm bedeckten Oberflächen.