DE69316501T2

DE69316501T2 - Proteasen zur Inhibierung und Beseitigung von Biofilm

Info

Publication number: DE69316501T2
Application number: DE69316501T
Authority: DE
Inventors: Irene Yeatman Aldridge; Alan Bruce Chmurny; Donald Richard Durham; Lai-Duien Grace Fan; Rowena Lisa Roberts
Original assignee: BetzDearborn Inc
Current assignee: Veolia WTS USA Inc
Priority date: 1992-09-28
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 1998-09-10
Anticipated expiration: 2013-09-25
Also published as: JPH06262165A; ES2111710T3; DE69316501D1; ATE162499T1; EP0590746B1; DK0590746T3; CA2106609A1; EP0590746A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung und/oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit einem wäßrigen System in Kontakt stehen, und insbesondere die Verwendung von Proteasen in wäßrigen Systemen zur Hemmung und/oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen.

Hintergrund der Erfindung

Kühlwassersysteme, insbesondere offene rezirkulierende Systeme, bieten günstige Bedingungen für das Wachstum von mikrobiellen Lebensformen, die im folgenden als Biofilm bezeichnet werden. Die Ablagerung des Biofilms auf den Oberflächen der wäßrigen Systeme kann zu verringerter Effizienz des Hitze-Austauschs an den Oberflächen, zur Verstopfung der Rohre und zur Korrosion innerhalb des Systems führen. Die Zusammensetzung der Biofilm- Ablagerungen auf einer verunreinigten Oberfläche besteht grundsätzlich primär aus Bakterien. Bei den im Biofilm anzuf indenden Bakterien-Gattungen sind Gram-negative Arten vorherrschend, insbesondere Pseudomonas, Acinetobacter und Aerobacter. Weitere Gattungen, die in Biofilm zu finden sind, können Flavobacterium, Desulfovibrio, Escherichia und in geringer Zahl einige Grampositive Gattungen, wie Bacillus und Sarcina umfassen.
Die Zellwandstruktur der Gram-negativen Bakterien ist ein wesentliches Merkmal, das zur Bildung des Biof ilms beiträgt. Die Zellwand besteht aus einem Peptidoglykan, das Acetylamin-Zucker und Aminosäuren enthält, und einer äußeren Membran bestehend aus Proteinen, Lipopolysacchariden und Lipoproteinen. Im Gegensatz dazu besteht die Zellwandstruktur von Gram-positiven Bakterien im wesentlichen aus Peptidoglykan und Teichonsäuren.
Mikroorganismen produzieren ferner umfangreiche Schleimschichten oder Kapseln, die in ihrer Zusammensetzung variieren können. Mit Ausnahme sehr weniger Fälle besteht der von Bakterien erzeugte Schleim aus einer Form von Polysaccharid, wie Dextran, Glukan oder Polyuronid. Das Schleimvolumen, das von einem einzigen Bakterium erzeugt wird, kann bis zu dem 4fachen des Volumens eines einzelnen Bakteriums betragen. Aufgrund der Ähnlichkeit ihrer Zusammensetzung mit bestimmten Kohlenhydrat-reichen tierischen Zellen haben Costerton et al. die Schleimschicht als die "Glycocalyx" bezeichnet. Die Glycocalyx wird von nahezu allen Bakterien erzeugt, die in Biofilmen nachgewiesen wurden, und stellt mehrere wichtige Mechanismen zur Bindung an Oberflächen zur Verfügung. Erstens stellt die Glycocalyx eine Pufferzone zwischen der Oberfläche und dem Bakterium dar, die die elektrostatische Abstoßung verringert, welche anderweitig einen Kontakt verhindern würde, und zweitens können Polymere in der Glycocalyx physikalische und/oder elektrostatische Verbindungen zu den Substraten der Oberfläche bilden. Aus experimentellen Nachweisen ist bekannt, daß die Entwicklung natürlicher Biofilme auf einer Oberfläche eine Abfolge bakterieller Gattungen umfaßt, die innerhalb des Biofilms verschiedene Schichten erzeugen. Obwohl die Matrix des Biofilms in ihrer Zusammensetzung heterogen sein kann, besteht sie primär aus Polysacchariden. Daher wurden Forschungsaufwendungen darauf konzentriert, das Potential von Polysaccharidasen (carbohydrasen) und Lipasen (für Lipopolysaccharide und Lipoprotein-Bestandteile) zur Entfernung von Biofilm zu bewerten.
US-A-4 936 994 offenbart die Verwendung einer Zusammensetzung bestehend aus Cellulase, α-Amylase und Protease zur Entfernung von Biofum. WO-A-92/13807 schlägt zur Entfernung von Biofilm vor, die mit Biofilm beschichteten Oberflächen mit (1) wenigstens einer sauren Protease oder alkalischen Protease, (2) wenigstens einer Glucoamylase oder α-Amylase und (3) wenigstens einem Tensid in Kontakt zu bringen. Es wird festgestellt, daß die Kombination in der Lage war, die Polysaccharid-Bestandteile zu zerstören, die seßhafte Mikroorganismen umgeben. EP-A- 0 372 520 offenbart, daß Mikroorganismen, die kein Biofilm erzeugen, zu einem Wassersystem gegeben werden können, um die Menge der darin vorliegenden organischen Bestandteile zu reduzieren. Als Folge daraus soll sich eine Verringerung des Wachstums der Biofilm-erzeugenden Mikroorganismen ergeben.
Protease-enthaltende Zusammensetzungen zur Reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Solche Zusammensetzungen sind kommerziell erhältlich und werden im Stand der Technik umfangreich beschrieben. Vertreter dieser Veröffentlichungen sind US-Patentschriften RE 30 602, 3 553 139, 3 674 643, 3 697 451, 3 748 233, 3 790 482, 3 827 938, 3 871 963, 3 931 034, 4 162 987, 4 169 817, 4 287 101, 4 429 044, 4 480 037, 4 511 490, 4 515 705 und 4 543 333; sowie "Innovations in Biotechnology" herausgegeben von E.H. Houwink und R.R. van der Meer, Seiten 31 bis 52 (Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1984).
Die in Reinigern am häufigsten verwendeten Proteasen sind die alkalinen Proteasen, die von verschiedenen Stämmen von Bacillus stammen. Solche Proteasen, die unter Marken wie Esperase und Alcalase von Novo Nordisk Bioindustrials Inc., Danbury, Conn. und Maxatase und Maxacal von Gist-Brocades, Charlotte, N.C. vertrieben werden, haben erwünschte alkaline Stabilitätseigenschaften und proteolytische Aktivitäten.
US-Patentschrift Nr. 4 865 983 beschreibt die Verwendung einer Protease, die von Vibrio proteolyticus (ATCC 53559) (nachfolgend als "Vibriolysin" bezeichnet) erzeugt wird, in Reinigern. Eine Vielzahl verschiedener weiterer Proteasen und ihre entsprechende Verwendung werden ferner in Cowan et al., Trends in Biotechnology, Vol 3, No. 3, Seiten 68-72 (1985), beschrieben.

Zusammenfassuna der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein ungefährliches, ökologisch sicheres Verfahren zur Hemmung und/oder Entfernung von Biofum-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit wäßrigen Systemen in Kontakt stehen, zur Verfügung zu stellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, eine neue Zusammensetzung, eine Kombination aus Proteasen und Tensiden enthaltend, zur Verfügung zu stellen sowie deren Verwendung zur Hemmung bei der Ansammlung von Biofilm auf Oberflächen, die in Kontakt mit wäßrigen Systemen stehen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen industrieller Wassersysteme, wie Kühlturmsysteme, zur Verfügung zu stellen, bei dem Zusammensetzungen verwendet werden, die kompatibel und effizient in Kombination mit weiteren konventionellen Agenzien zur Behandlung von Wasser, wie Korrosionsinhibitoren, Kesselstein-Inhibitoren, Bioziden, Dispersionsmittel und ähnlichen verwendet werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Hemmung und/oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit einem wäßrigen System in Kontakt stehen, zur Verfügung gestellt, bei dem man eine Enzym-Zusammensetzung, die im wesentlichen aus Protease besteht, in einer Menge zu dem System gibt, die ausreicht, um Biofilm-Ablagerungen zu hemmen oder zu entfernen, wobei die Protease Esperase oder eine Metalloprotease ausgewählt aus der Gruppe Vibriolysin, Thermoase, Neutrase und Mischungen ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird auch eine Zusammensetzung zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit einem wäßrigen System in Kontakt stehen, zur Verfügung gestellt, die eine Protease und ein Tensid in einem Verhältnis an Einheit Protease-Aktivität : Gewicht des Tensids im Bereich zwischen 0,001 : 1 und 100 : 1 umfaßt, wobei die Zusammensetzung keine Amylase enthält.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die im Kontakt mit einem wäßrigen System stehen, zur Verfügung gestellt, bei dem man zu dem System eine Zusammensetzung gibt, die eine Protease und ein Tensid in einer Menge enthält, die ausreicht, um die Biofilm-Ablagerung zu hemmen oder zu entfernen, wobei die Zusammensetzung keine Amylase enthält.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen von Oberflächen, die in Kontakt mit einem wäßrigen System stehen, zur Verfügung, bei dem man nacheinander 1) eine Enzym-Zusammensetzung zu dem wäßrigen System gibt, die im wesentlichen aus Proteasen besteht, 2) die Enzym-Zusammensetzung durch das wäßrige System zirkulieren läßt, um einen Kontakt der Enzym-Zusammensetzung mit den Biofilm-Ablagerungen zu ermöglichen, und 3) wenigstens eine Lipase, Carbohydrase oder eine Mischung davon zu dem wäßrigen System gibt, wobei die Enzym-Zusammensetzung und die Lipase, Carbohydrase oder Mischung davon in Mengen zugegeben werden, die ausreichen, um die Biofilm-Ablagerung zu hemmen oder zu entfernen.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft bestimmte neue Verfahren und Zusammensetzungen zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm auf Oberflächen, die in Kontakt mit einem wäßrigen System stehen. Der Begriff "Hemmen oder Entfernen von Biofum" wird hierin verwendet, um die Hemmung der Adhäsion des Biofilms zu bezeich nen und nicht eine biozide Aktivität, die mikrobiologische Organismen, die in dem wäßrigen System vorliegen, aktiv tötet. Bei dem Verfahren gibt man eine Enzym-Zusammensetzung, die im wesentlichen aus Proteasen besteht, in einer Menge zu dem wäßrigen System, die ausreicht, um Biofilm auf Oberflächen, die in Kontakt mit einem wäßrigen System stehen, zu hemmen oder zu entfernen. Diese Enzym-Zusammensetzungen können gegebenenfalls verschiedene Tenside enthalten, um eine weitergehende Entfernung des Biofilms zu erzielen. Die Enzym-Zusammensetzungen können ferner zusammen mit bestimmten anderen Enzymen, die nachfolgend beschrieben werden, in einer Menge verwendet werden, die ausreicht, um eine gesteigerte Hemmung oder Entfernung von Biofilm zu erreichen.
Die Verfahren und Enzym-Zusammensetzungen der Erfindung enthalten im wesentlichen Proteasen als primären aktiven Bestandteil für die Behandlung. Demgemäß wurde nunmehr festgestellt, daß Proteasen alleine eine ausreichende Hemmung von Biofilm-Ablagerungen zur Verfügung stellen und daher die Gegenwart weiterer Enzyme, wie beispielsweise Cellulase oder Amylase, zur Hemmung von Biofilm nicht benötigt werden. Bis jetzt war man davon ausgegangen, daß diese weiteren Enzyme zur Hemmung von Biofilm notwendig seien. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung enthalten die Verfahren und Enzym-Zusammensetzungen daher im wesentlichen Proteasen und sind im wesentlichen frei von anderen Enzymen, wie Cellulase, Amylase und ähnlichen.
Die Effektivität der Protease-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zur Hemmung von Biofilm in wäßrigen Systemen war überraschend und unerwartet, da man davon ausgegangen war, daß die Adhäsion von Biofilm auf den Polysaccharid-Bestandteilen beruht, die von Proteasen nicht beeinträchtigt werden sollten.
Für die Erfindung geeignete Proteasen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Serin-Proteasen, wie Esperase (Novo), Alcalase (Novo), Subtilisin (Sigma), Maxatase (Gist-Brocades), Maxacal (Gist-Brocades), Trypsin (Sigma), Metalloproteasen, wie Vibriolysin (W.R. Grace), Thermolysin (Sigma), Thermoase (Daiwa Kasei KK), Novo TS (Novo), Neutrase (Novo), SP-369 (Novo), Protease 2A (Amano), Seaprose S (Amano), Prozyme 6 (Amano), Cystein-Proteasen, wie Papain, Asparagin-Proteasen und ähnliche, sowie Mischungen davon, wie beispielsweise eine Mischung aus Serin- und Metalloproteasen, die von Sigma unter der Marke Pronase kommerziell erhältlich ist.
Proteasen sind in mehreren Formen kommerziell erhältlich, darunter Pulver, Granulate, Suspensionen und Flüssigkeiten. Da sich die vorliegende Erfindung im wesentlichen auf die Behandlung wäßriger Systeme richtet, ist die suspendierte oder flüssige Form der Protease bevorzugt, grundsätzlich ist jedoch die Verwendung jeder Protease für die Erfindung geeignet. Ein besonderer Vorteil der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist die Stabilität der Protease in wäßrigen Systemen in Gegenwart von weiteren Zusammensetzungen zur Behandlung von Wasser, wie Oxidationsmitteln, Biozide, Kesselstein-Inhibitoren, Korrosionsinhibitoren, optischen Aufhellmitteln, Phosphaten, Phosphonaten, Polyphosphaten, Silikaten, Puffern, Tensiden, Carboxylaten, Sulfonaten und ähnliche.
Es ist dem Fachmann wohlbekannt, daß bestimmte Proteasen eine gesteigerte Aktivität und erhöhte Stabilität unter bestimmten pH- und Temperatur-Bedingungen aufweisen. Eine wesentliche Überlegung für die Erzielung optimaler Ergebnisse im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt daher darin, eine geeignete Protease auszuwählen, die sowohl eine hohe Aktivität als auch eine gute Stabilität unter den bestimmten pH- und Temperatur-Bedingungen des bestimmten wäßrigen Systems aufweist, das behandelt werden soll. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß die Protease Vibriolysin, die wie in US-Patent Nr. 4,865,983 offenbart, von Vibrio proteolyticus (ATCC 53559) ausgeschieden wird, aufgrund ihrer Stabilität über breite pH- und Temperatur-Bereiche besonders zur Behandlung großer Bereiche wäßriger Systeme geeignet ist. Ferner weist Vibriolysin eine ausgezeichnete Stabilität in Gegenwart von Oxidationsmitteln, wie Chlor, auf. Vibriolysin, Alcalase und Esperase sind ferner in Gegenwart von anderen üblichen Agenzien zur Behandlung von Wasser besonders stabil, darunter, jedoch nicht auf diese beschränkt, Biozide, Kesselstein-Inhibitoren, Korrosionsinhibitoren, optischen Aufhelimitteln, Phosphate, Phosphonate, Polyphosphate, Silikate, Puffer, Tenside, Carboxylate, Sulfonate und ähnliche. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung richtet sich daher auf ein Verfahren zur Hemmung oder Entfernung von Biof ilm von Oberflächen, die in Kontakt mit einem wäßrigen System stehen, bei dem man zu dem System eine Biofilm-hemmende Menge einer Protease gibt, die aus der Gruppe bestehend aus Vibriolysin, Alcalase und Esperase ausgewählt wurde.
Diese wäßrigen Systeme, die in vorteilhafter Weise mit den erfindungsgemäßen Agenzien zur Hemmung und Entfernung von Biofilm behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Kühlwassersysteme, wie z.B. Kühltürme, Entsalzungseinheiten, Pulpe- und Papierfabrik-Systeme, Gas-Waschanlagen und andere rezirkulierende Wassersysteme, von denen bekannt ist, daß sich Biofilm-Ablagerungen bilden. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere zur Behandlung von Kühlwassersystemen geeignet, die bei einer Temperatur zwischen 15,6 ºC und 93,3 ºC [60 ºF und 200 ºF] arbeiten, insbesondere offene, rezirkulierende Kühlwassersysteme, die bei Temperaturen zwischen 26,6 ºC und 65,6 ºC [80 ºF bis 150 ºF] arbeiten.
Die Enzym-Zusammensetzungen der Erfindung werden zu dem wäßrigen System in Mengen gegeben, die ausreichen, um den Biofilm zu hemmen oder zu entfernen. Die genaue Dosierung ist per se nicht von Bedeutung für die Erfindung und kann stark variieren, was zu einem bestimmten Ausmaß von der Natur des wäßrigen Systems, das behandelt werden soll und von dem Ausmaß an Schutz, der erreicht werden soll, abhängig ist. Grundsätzlich kann jedoch die Protease in einer Konzentration zwischen 0,0001 E/ml und 100 E/ml zu dem wäßrigen System gegeben werden, wobei E die Einheiten der Aktivität bezeichnet, die genauer in Beispiel 4 beschrieben werden. Innerhalb dieses Dosierungsbereichs werden grundsätzlich geringe Dosierungen zwischen 0,0005 und 1 E/ml bevorzugt. Es ist natürlich möglich, eine größere Menge zu den Systemen zu geben, die sehr starke Biof ilm-Ablagerungen enthalten. Aus rein ökonomischen Gründen sind diese Dosierungen jedoch grundsätzlich nicht zu empfehlen.
Bei der Ausführung der Erfindung in industriellen wäßrigen Systemen ist es bevorzugt, anfangs eine höhere "start-up"-Dosierung zuzuführen, um die bestehenden Biofilm-Ablagerungen zu inhibieren und/oder zu entfernen. Die "start-up"-Dosierung kann anschließend in eine geringere "Kontroll"-Dosierung übergehen, in einer Menge, die ausreicht( um eine minimale Hemmschwelle aufrechtzuerhalten. Die "start-up-"Dosierung kann natürlich in Abhängigkeit von der Natur des wäßrigen Systems, das behandelt werden soll, und dem Ausmaß der bestehenden Biofilm-Ablagerungen in dem System stark variieren. Die "start-up"-Dosierung liegt vorzugsweise im Bereich zwischen 0,1 E/ml und 100 E/ml. Die Kontroll-Dosierung liegt vorzugsweise im Bereich zwischen 0,001 E/ml und 1 E/ml. Die im Hinblick auf ein bestimmtes wäßriges System exakt notwendig Dosierung kann vom Durchschnittsfachmann nach bekannten Verfahren ohne weiteres bestimmt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren der Erfindung die Zugabe einer Enzym-Zusammensetzung, die im wesentlichen aus Proteasen besteht, zu einem wäßrigen System zusammen mit einem oder mehreren Tensiden. Da beide, Tenside und Proteasen, Biofilm-hemmende und -entfernende Eigenschaften aufweisen, konnte gezeigt werden, daß diese bestimmte Kombination gesteigerte Effekte bei der Hemmung und Entfernung von Biofilm aufweist. Im Hinblick auf diesen Aspekt der Erfindung wird daher eine neue Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die eine Kombination einer Protease und eines Tensids umfaßt, und die eine gesteigerte Hemmung und/oder Entfernung von Biofilm von Oberflächen, die in Kontakt mit einem wäßrigen System stehen, ermöglicht. Die relativen Anteile dieser Bestandteile der Zusammensetzung werden nicht per se als kritisch für die Erfindung betrachtet, vorausgesetzt natürlich, daß die Dosierungsmenge in dem behandelten System ausreicht, um Biofilm-Ablagerungen zu hemmen oder zu entfernen. Grundsätzlich werden Tenside in einer Dosierung zwischen 0,001 % und 1 %, auf einer Gew./Vol. Grundlage, zu dem System gegeben. Diese Dosierung entspricht daher einer Enzym-Tensid-Zusammensetzung in einem Verhältnis von (Ein heiten an Protease-Aktivität) : (Gewicht des Tensides) zwischen 0,0001 1 und 100 : 1 respektive, vorzugsweise zwischen 0,005 : 1 und 10 : 1 respektive. Die Enzyme und Tenside können getrennt zu dem wäßrigen System gegeben werden oder können in vorteilhafter Weise auch als eine vorgemischte Zusammensetzung zugegeben werden, die die obigen Verhältnisse aufweist.
Die Tenside, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, umfassen Kationen-, nichtionische, Anionen-, ampholytische und Zwitterionen-Tenside. Es ist grundsätzlich bevorzugt, ein nichtschäumendes oder geringe Konzentrationen eines schäumenden Ten sides zu verwenden. Zur Erläuterung, aber nicht zur Begrenzung, umfassen geeignete anionische Tenside wasserlösliche Salze von Alkylbenzensulfonaten, Alkylsulfaten, Alkylpolyethoxyethersulfaten, Paraffinsulfonaten, α-Olefinsulfonaten, α-Sulfocarboxylaten und deren Ester, Alkylglycerylethersulfonaten, Fettsäure-monoglyceridsulfaten und -sulfonaten, Alkylphenolpolyethoxyethersulfaten, 2-Acyloxyalkan-1-sulfonaten und β-Alkyloxyalkansulfonaten. Geeignete nichtionische Tenside umfassen wasserlösliche Ethoxylat-Zusammensetzungen, wie primäre und sekundäre Ethoxylate und Alkylphenolethoxylate.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine gesteigerte Entfernung von Biofilm erreicht werden, in dem man die obigen Protease-Enzym-Zusammensetzungen zu dem wäßrigen System gibt und anschließend Lipasen, Carbohydrasen oder deren Mischungen zugibt. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Hemmung und/oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die in Kontakt mit einem wäßrigen System stehen, zur Verfügung gestellt, bei dem man nacheinander 1) eine Enzym-Zusammensetzung zu dem wäßrigen System gibt, die im wesentlichen aus Proteasen besteht, gegebenenfalls zusammen mit Tensiden; 2) die Enzym- Zusammensetzung zirkulieren läßt, um einen Kontakt der Enzym- Zusammensetzung mit den Biofilm-Ablagerungen zu ermöglichen, und 3) wenigstens eine Lipase, Carbohydrase oder eine Mischung davon zu dem wäßrigen System gibt, wobei die Enzym-Zusammensetzung und die Lipase, Carbohydrase oder Mischung davon in Mengen zugegeben werden( die ausreichen, um die Biofilm-Ablagerungen zu hemmen oder zu entfernen. Die Mengen an Lipase, Carbohydrase oder einer Mischung davon entsprechen den vorgenannten Protease-Mengen.
Geeignete Lipasen umfassen Lipolase (Novo), Lipase P-30 (Amamo), Lipase MAP-10 (Amano), Lipase N (Amano), Lipase APL2 (Amano), Pankreas-Lipase vom Schwein (Sigma), Candida-Lipase (Sigma), Pseudomonas-Lipase (Amano), Rhizopus-Lipase (Amano), Mucor-Lipase (Amano), Aspergillas-Lipase (Amano) und ähnliche.
Geeignete Carbohydrasen umfassen BAN 120L (Novo), Viscozyme 120L (Novo), Termamyl 120L (Novo), Cereflo 200L (Novo), Glukanase (Sigma), (β-Glukuronidase (Sigma), Maxamyl (Gist-Brocades), Cellulase (Sigma), Dextranase (Amano), Pektinase P-II (Amano), Cellulase TAP (Amano) und Cytophaga Glukonase (Sigma).
Es wird davon ausgegangen, daß der Durchschnittsfachmann unter Verwendung der vorstehenden detaillierten Beschreibung ohne weitere Ausführungen die vorliegende Erfindung in ihrem vollem Umfang benutzen kann.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Erfindung zu erläutern, sollen jedoch keinesfalls, außer wie in den beigefügten Ansprüchen, zur Begrenzung der Erfindung ausgelegt werden. Alle Anteile und Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben wird.

Beispiel 1

Erzeugung von Biofilm

Unter Verwendung eines Consortiums von 16 repräsentativen Biofilm-erzeugenden Mikroorganismen, die aus etwa 200 Mikroorganismen ausgewählt wurden, welche aus verschiedenen Kühlwasserumgebungen isoliert wurden, wurde Biofilm erzeugt. Das Consortium bestand aus Organismen verschiedener Gattungen, darunter Pseudomonas, Acinetobacter, Serratia, ein thermophiles und mehrere Mitglieder der Familie der Enterobacteriaceae. Diese Stämme wurden als reine Kulturen im gefrorenen Zustand bei -70 ºC erhalten.
Die Test-Oberflächen, die zur Bestimmung von Biofilm-Bildung verwendet wurden, bestanden aus 4omaschigen, 316 Edelstahlmaschendraht-Schirmabschnittständern innerhalb eines Edelstahlgenerator-Gefäßes.
Das in dem Biofilm-Generator verwendete Wachstumsmedium bestand aus synthetischem Kühlturmwasser (synthetic cooling tower water "SCTW") enthaltend: 4,7 mM MgSO&sub4;, 23,4 mM NaCl, 11,5 mM Na&sub2;SO&sub4;, 4,4 mM NaHCO&sub3;, 2,5 mM CaCl&sub2;, 2,6 mM CaSO&sub4; 2 H&sub2;O, und 0,3 mM Na&sub2;SiO&sub3; 9 H&sub2;O. SCTW wurde mit 2,25 g/l Glycerin und 0,45 g/l Trypticase Soy Broth (TSB) Feststoffen supplementiert. Die Biofilm-Generatoren wurden geschüttelt, mit Luft befüllt und bei 30 ºC und pH 7,2-7,8 durch Zugabe einer Säure oder Base während des Biofilm-Wachstums gehalten. Eine Phase von sieben bis zehn Tagen wurde zur Bildung des Biofilms auf den Edelstahlabschnitten benötigt.

Beispiel 2

Enzym-Behandlung der Abschnitte

Angefaulte Abschnitte wurden aus den Generator-Ständern entfernt und kurz in sauberem SCTW gewaschen, um Plankton-Bakterien zu entfernen. Die Abschnitte jeder Behandlungsgruppe wurden in zwei leere Petrischalen gelegt, die oberhalb des Schalenbodens durch dünne Plastikstreifen verstärkt waren. Die Lösungen, die Protease oder Protease plus Tensid enthielten, wurden zu jeder Schale gegeben, bis die Abschnitte leicht bedeckt waren. Die Schalen wurden auf einen rotiertenden Schüttler gestellt und bei 40 ºC und vorsichtigem Schütteln (65 UpM) für 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation mit der Testlösung wurde jeder Abschnitt mit sauberem SCTW gespült( um den nicht-bindenden Biofilm zu entfernen.
In Versuchen zur Prävention von Biofilm wurde die Protease oder die Protease plus ein Tensid direkt zu dem Biofilm-Generator nach der Inokulation mit dem bakteriellen Consortium gegeben. Ein Kontroll-Biofilm-Generator, ohne Zugabe von Protease, wurde zur selben Zeit wie der behandelte Generator gestartet. Die Protease-Aktivität der Flüssigkeit wurde unter Verwendung von einem von zwei in Beispiel 4 dargestellten Nachweisverfahren periodisch überwacht. Sofern es für den Erhalt der anfänglichen Protease-Aktivität notwendig war, wurde zusätzliches Enzym zugegeben. Nach sieben bis zehn Tagen wurden die Abschnitte aus den Generatoren entfernt und vor dem Nachweis der gebundenen Biomasse in sauberem SCTW gespült.

Beispiel 3

Messung der gebundenen Biomasse

Nach Beendigung eines Versuchs wurden die Edelstahlabschnitte und die daran gebundene Biomasse in sauberem SCTW gespült und an der Luft getrocknet. In einem heißen Wasserlösungsschritt wurde die getrocknete Biomasse entfernt. Die sich aus jedem Abschnitt ergebene Lösung konnte auf ihren Gesamt-Protein-Gehalt pro Ab schnitt unter Verwendung des BCA-Protein-Nachweistestkits analysiert werden, der von Pierce kommerziell erhältlich ist. Dieses Nachweisverfahren erwies sich als ein zufriedenstellendes Meßverfahren der Biofilm-Menge, basierend auf Vergleichen zwischen Protein-Mengen pro Abschnitt und Messungen des tatsächlichen Trockengewichts der gesamten Biomasse auf einem Abschnitt (siehe Tabelle 1). Tabelle 1 Vergleich der Biofilm-Entfernung, nachgewiesen mittels Gesamt- Protein und direkten Messungen des Biofilm-Trockengewichts bestimmt nach Enzymbehandlung
(¹) Um eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm zu erreichen, mußte das Verhältnis von Protein/Trockengewichtentfernung > 12 % (0,4 mg) betragen.

Beispiel 4

Messung der Enzym-Aktivität

Um die Enzym-Aktivität für jeden Versuch zu standardisieren und damit die Effizienz der Enzyme, die zur Entfernung von Biofilm oder in den Versuchen zur Prävention verwendet wurden, zu bestimmen und die Aktivität eines Enzyms während der Behandlungs- und Inkubationsphase zu messen, wurden die folgenden zwei Nachweisverfahren zur Überwachung der Protease-Aktivität verwendet:

A. Azocaseinhydrolyse

Eine Probe der Protease wird für 10 Minuten bei 37 ºC in 50 Mm Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) inkubiert, der 1,0 mg/ml Azocasein (Sulfanilamid-Azocasein, Sigma Corp., St. Louis, MO) in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml enthält. Am Ende dieser Inkubationsphase werden 0,5 ml einer 10 Gew./Vol.-%igen Essigsäure zugegeben und sofort vermischt sowie die resultierende Mischung für 10 Minuten auf Eis gelagert. Die Mischung wird anschließend zentrifugiert und die optische Dichte des resultierenden Überstands wird bei 420 nm gegen eine Blindprobe, die entweder kein Enzym oder inaktiviertes Enzym in der gepufferten Azocasein- Lösung enthält, bestimmt. Eine Einheit an Aktivität wird als die Enzym-Menge definiert, die benötigt wird, um einen Wechsel in der Absorption von 2,5 bei 420 nm zu verursachen.

B. Peptidase-Nachweisverfahren für Serin-Proteasen

Dieses Nachweisverfahren mißt die Zunahme der Absorption bei 410 nm durch die Freisetzung von P-Nitroanilin aus Succinyl-L- alanyl-L-alanyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-P-nitroanilid (sAAPFpN), wie in DelMar, E.G., et al., Anal. Biochem., 99:316 (1979) dargestellt. Die Reaktionsmischungen enthalten 1 mM sAAPFpN in 50 mM Tris-Puffer (pH 8,5) und eine geeignete Menge der Protease in einem Endvolumen von 1,0 ml.

Beispiel 5

Herstellung von Vibriolysin

Vibrio proteolyticus ATCC 53559 wurde in einem Medium mit den folgenden Bestandteilen gezogen (g oder ml pro Liter): NZ- Amin B, 40; Na&sub2;SO&sub4;, 25; Dextrose, 10; K&sub2;HPO&sub4;, 4; MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 0,4; Anti-Schaum-Agenzien, 0,1 ml; und 6,1 ml einer Lösung mit Spurenelementen. Die Spurenelemente-Stammlösung enthält (in Gramm pro Liter) die folgenden Bestandteile: ZnSO&sub4; 7 H&sub2;O, 18,29; MnCl&sub2; 4 H&sub2;O, 18,86; CaSO&sub4; 2 H&sub2;O, 0,91; HBO&sub3;, 0,07; und Na&sub2;MoO&sub4; 2 H&sub2;O, 0,04. Vor der Sterilisierung wurde der pH-Wert auf 7,0 eingestellt.

V. proteolyticus

wurde entweder in 1,5- oder 10-Liter Fermentern gezogen. Fermenter mit dem vorgenannten Medium wurden mit einer 1 % (Vol./Vol.) Kultur angeimpft, die durch Züchtung von

V. proteolyticus

in Schüttelflaschen für 20 Stunden erhalten wurden, die ein Medium gleicher Zusammensetzung enthielten. Die Fermentation wurde bei 28 ºC, 1000-1250 UpM und einer Belüftung von 1,0 Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute durchgeführt. Der pH-Wert wurde während der Fermentation durch automatische Zugabe einer Säure oder Base bei pH-Wert 7,8 gehalten.
Das Wachstums von V. proteolyticus wurde durch Messung der optischen Dichte bei 640 nm überwacht und die Protease-Aktivität wurde mittels des Azocasein-Nachweisverfahrens bestimmt, das bereits oben dargestellt wurde. Während der frühen stationären Wachstumsphase der Fermentation erreicht das Protease-Produkt Titer zwischen etwa 85 200 und 127 800 Azocasein-Einheiten/Liter. Um die Zell-Fraktion abzutrennen wurde das Medium mittels Zentrifugation geerntet.
Der Überstand enthielt die proteolytische Aktivität und wurde unter Verwendung eines Amicon S10Y10 spiralen Wundf ilters (Amicon Corp., Lexington, MA) konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 10 mM Tris-Puffer diafiltriert, der 1 mM CaCl&sub2; enthielt( bis die Leitfähigkeit des Rückstands etwa 1 mS betrug und der pH-Wert neutral war. Dieses Produkt wurde lyophilisiert und bei -20 ºC bis zur späteren Verwendung gelagert.

Beispiel 6

Entfernung von Biofilm durch Esperase 8,0 L

Angefaulte Abschnitte wurden wie in Beispiel 1 hergestellt und mit Esperase 8,0-L in SCTW (pH-Wert 8,5) bei 40 ºC für 24 Stunden behandelt. Die Platten( die die Abschnitte enthielten, wurden bei 65 UpM geschüttelt, um eine vorsichtige Bewegung der Enzym-Lösung über den angefaulten Oberflächen zu erhalten. Die Zugabe eines Tensides wie Neodol 25-7 (nichtionisch, Shell Chemical) verbesserte die Entfernung des Biofilms im Vergleich zu der Aktivität des Enzyms alleine. Die Enzym-Aktivität ist als Azocasein-Einheiten/ml angegeben. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von Esperase 8,0 L auf die Entfernung von Biofilm

Fußnoten

(1) Um eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm zu erhalten, mußte die Entfernung von Protein ≥ 1,3 mg Protein erreichen (13 % Entfernung).
(2) Eine E/ml Esperase entspricht etwa 70 ug Enzym/ml.

Beispiel 7

Entfernung von Biofilm durch Alcalase 2,4 L

Angefaulte Abschnitte, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden mit Lösungen von Alcalase 2,4 L (Novo Nordisk Bioindustrials, Inc.) in SCTW (pH-Wert 8,5) bei 40 ºC für 24 Stunden behandelt. Das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren wurde wiederholt und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
(1) Um eine statistisch signifikante Entfernung von Biofum zu erhalten, mußte die Protein-Entfernung ≥ 1,56 mg Protein oder ≥ 17,9 % erreichen.

Beispiel 8

Entfernung von Biofilm mittels Vibriolysin

Angefaulte Abschnitte wurden wie in Beispiel 1 beschrieben her gestellt und mit Lösungen von vibriolysin in SCTW (pH-Wert 8,5) bei 40 ºC für 24 Stunden behandelt. Das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren wurde wiederholt und die Ergebnisse werden in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4
¹ Um eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm zu erhalten, mußte die Entfernung von Protein ≥ 1,3 mg Protein (13 % Entfernung) erreichen.

Beispiel 9

Auswirkungen einer Behandlung mit Esperase + Neodol auf die Prävention der Biofilm-Bildung

Um die enzymatische/Tensid-Behandlung zur Prävention der Biofilm-Bildung zu bewerten, wurden Versuche durchgeführt. Zwei Generatoren wurden aufgebaut und mit dem bakteriellen Consortium wie in Beispiel 1 inokuliert. Ein Generator wurde mit 1 E/ml Esperase und 0,01 % Neodol 25-7 behandelt, während der Kontroll-Generator keine Supplemente enthielt. Periodische Zugabe von Esperase zu dem behandelten Generator wurden durchgeführt, um eine gleichbleibende Protease-Konzentration zu erhalten. Die periodische Zugabe von Nährstoffen zu beiden Generatoren wurde durchgeführt, um die Biofilm-Bildung zu stimulieren. Nach einer Phase von 10 Tagen wurde die Menge an Biofilm, die auf den Abschnitten in jedem Generator verblieb, mittels des Trockengewichts und des Gesamtproteins (BCA-Verfahren) bestimmt. Zählungen lebender Zellen der planktonischen, mikrobiellen Population wurde an den Tagen 2, 4 und 8 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, wie in Tabellen 5 und 6 dargestellt, daß die mikrobielle Population in einer konstanten Menge bei 108 lebenden Zellen/ml verbleibt. Die Behandlung scheint daher eine Hemmung der Zell- Adhäsion an die Abschnitte und keine biozide Aktivität zu verursachen. Tabelle 5 Auswirkung der enzymatischen/Tensid-Behandlung auf die Prävention der Biofim-Bildung Tabelle 6 Bestimmung mikrobieller Plankton-Population in behandelten (Esperase/Neodol) und unbehandelten Biolilm-Generatoren
Beispiel 10

Auswirkungen einer Behandlung mit Alcalase + Neodol auf die Prävention der Biofilm-Bildung

Zwei Generatoren wurden aufgebaut und mit dem bakteriellen Consortium wie in Beispiel 1 inokuliert. Ein Generator wurde mit 1 E/ml Alcalase 2,4 L und 0,01 % Neodol 25-7 behandelt, während der Kontroll-Generator keine Supplemente erhielt. Eine periodi sche Zugabe von Alcalase zu dem behandelten Generator wurde durchgeführt, um eine konstante Konzentration an Protease zu erhalten. Die periodische Zugabe von Nährstoffen wurde wie in Beispiel 9 durchgeführt. Nach einer Phase von acht Tagen wurde der Biofilm, der auf den Abschnitten verblieb, wie in Beispiel 9 bestimmt. Tabelle 7 Auswirkung von Alcalase und Neodol auf die Prävention der Biofilm-Akkumulation auf Maschendraht-Abschnitten über eine Phase von acht Tagen
1 Kolonie-bildende Einheiten lebender Mikroorganismen pro ml Generator-Medium.
2 Durchschnitt von zehn zufällig gewählten Abschnitten.

Beispiel 11

Auswirkungen einer Behandlung von Vibriolysin und Neodol auf die Prävention der Biofilm-Bildung

Zwei Generatoren wurden aufgebaut und mit dem bakteriellen Consortlum wie in Beispiel 1 inokuliert. Ein Generator wurde mit 1 E/ml Vibriolysin und 0,01 % Neodol 25-7 behandelt, während der Kontroll-Generator keine Supplemente erhielt. Vibriolysin wurde periodisch zu dem behandelten Generator gegeben, um eine gleichmäßige Protease-Konzentration zu erhalten. Die periodische Zugabe von Nährstoffen zu beiden Generatoren wurde wie in Beispiel 9 durchgeführt. Nach einer Phase von acht Tagen wurde der Biofilm wie in Beispiel 9 bestimmt, der auf zwölf Abschnitten verblieb. Tabelle 8 Auswirkung von Vibriolysin und Neodol auf die Prävention der Bildung von Biofilm
1 Durchschnittlicher Wert, der von zwölf Abschnitten erhalten wurde.
Die zwei Türme, die die verbleibenden angefaulten Abschnitte aus diesem Beispiel enthielten, wurden in zwei Generatoren mit frischem SCTW überführt. Zu beiden Generatoren wurde anschließend Vibriolysin (1 E/ml) und Neodol 25-7 (0,01 %) zugegeben. Vibriolysin wurde periodisch zugegeben, um eine konstante Protease- Menge von 1 Azocasein-Einheiten pro ml zu erhalten.
Das Schütteln, die Lüftung, der pH-Wert und die Temperatur wurden wie in Beispiel 1 kontrolliert, es wurden jedoch keine zusätzlichen Nährstoffe oder bakterielles Inokulum zugegeben. Nach einer Phase von zwei Tagen wurde der auf zwölf zufällig ausgewählten Abschnitten verbleibende Biofilm wie in Beispiel 9 bestimmt. Tabelle 9 In situ Entfernung von Biofilm unter Verwendung von Vibriolysin und Neodol
1 Durchschnittswert, der von zwölf Abschnitten erhalten wurde.

Beispiel 12

Entfernung von Biofilm durch seguentielle Behandlungen mit Protease und Lipase
Dieses Beispiel zeigt die Auswirkungen einer sequentiellen Zugabe von Protease und Lipase bei der Enzymbehandlung schwer angefaulter Abschnitte. Die Effektivität einer Behandlung wurde durch den Unterschied zwischen der Entfernung von Biofilm (Protein) auf unbehandelten Kontroll-Abschnitten in synthetischem Kühlturmwasser (SCTW) ( 15 mg Protein/Abschnitt) und behandelten Abschnitten bestimmt. Die Gesamt-Inkubationszeit der einzelnen Behandlung (a) betrug 24 Stunden; während bei der sequentiellen Behandlung (b) eine Inkubation von insgesamt 48 Stunden gewählt wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 10 dargestellt. Tabelle 10
Die sequentielle Behandlung der Abschnitte unter Verwendung von Esperase /Neodol gefolgt von Lipolase/Neodol führte zu einer besseren Protein-Entfernung von den angefaulten Abschnitten, als der additive Effekt der einzelnen Enzyms alleine. Unerwarteterweise war das umgekehrte Verfahren nicht effektiv (z.B. zunächst Behandlung mit Lipase gefolgt von Protease-Behandlung).

Beispiel 13

Entfernung von Biofilm durch sequentielle Behandlung mit Enzymen

Dieses Beispiel zeigt die Auswirkungen einer sequentiellen Behandlung mit Enzymen unter Verwendung von Protease und entweder einer Carbohydrase oder einer Mischung aus Lipase/Carbohydrase auf angefaulte Abschnitte. Die gezeigten Ergebnisse stellen den Durchschnitt von drei getrennten Versuchen dar. Die Effektivität einer Behandlung wurde durch die Differenz zwischen Biofilm (Protein)-Entfernung auf unbehandelten Kontroll-Abschnitten in synthetischem Kühlturmwasser (SCTW, 2,5 mg Protein/Abschnitt) und behandelten Abschnitten bestimmt. Die Gesamt-Inkubationszeit betrug pro Behandlung (a) 24 Stunden; während bei der sequentiellen Behandlung die Inkubation insgesamt 24 Stunden betrug. Die Ergebnisse werden in den folgenden Tabellen 11 und 12 dargestellt. Tabelle 11 Auswirkungen sequentieller Enzym-Behandlungen unter Verwendung von Esperase und Carbohydrase
1 Um eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm zu erhalten, mußte die Biofilm-Entfernung > 12 % Protein-Entfernung (0,3 mg) betragen. Abschnitte ab einer Proteinladungsrate von 3 mg/Abschnitt wurden für 24 Stunden pro einzelne Enzym/SCTW-Behandlung oder für insgesamt 48 Stunden inkubiert; a und b stellen die sequentiellen Behandlungen dar. Tabelle 12
Diese Ergebnisse stimmen mit denen überein, die in Beispiel 12 dargestellt werden. In der Tat müssen angefaulte Oberflächen zunächst mit Protease und anschließend mit einer zweiten Gruppe von Enzym(en) behandelt werden, um mehr als eine additive Wirkung zu erreichen. Das umgekehrte Verfahren ergab wiederum ein unerwartetes Ergebnis.

Beispiel 14

Kompatibilität der Esperase mit Chemikalien zur Behandlung von Wasser

Dieses Beispiel zeigt die Stabilität der Esperase -Aktivität in Gegenwart von Chemikalien zur Behandlung von Wasser, darunter Hypochlorit und Kesselstein- und Korrosions-Chemikalien, sowie ferner, daß Esperase Biofum auch in Gegenwart von Bioziden effektiv entfernt. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 13 und 16 dargestellt. Unter Berücksichtigung der robusten Natur des Enzyms würde man nicht erwarten, daß die Effektivität der Esperase in Gegenwart von anderen Arten von Chemikalien zur Behandlung gegenteilige Auswirkungen haben würde. Tabelle 13 Auswirkungen der Dearborn Chemikalien zur Behandlung von Wasser auf die Stabilität der Esperase
(1) Das obige Dispersionsmittel ist ein Dispersionsmittel vom Amid-Typ, und Dearborn A, Dearborn B und Dearborn C enthalten Mischungen aus organischen Trennmitteln, Dispersionsmitteln und Korrosionsinhibitoren. Die Inkubationstemperatur betrug 40 ºC. Tabelle 14 Auswirkungen verschiedener Chemikalien zur Behandlung von Wasser auf die Entfernung von Biofilm(1)
(1) Dasdispersionsmittel, Dearborn A, Dearborn B und Dearborn C sind wie in Tabelle 13 definiert. Die Inkubationstemperatur (2) betrug 40 ºC.
Eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm ergab sich bei einer Protein-Entfernung von > 0,4 mg Protein (12 %). Tabelle 15 Kompatibilität der Esperase mit ausgewählten Dearborn Bioziden
(1) Inkubationstemperatur betrug 40 ºC Tabelle 16 Auswirkung einer Enzym-Behandlung in Kombination mit Dearborn-Bioziden auf angefaulte Abschnitte
(1) Die aktiven Bestandteile jedes der in den Tabellen 15 und 16 genannten Biozide werden unten angegeben. Alle Enzym-Behandlungen umf aßten die Zugabe von 0,05 % Neodol 25-7, mit Ausnahme der Behandlung mit SCTW.
(2) Eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm wurde bei einer Protein-Entfernung von > 0,8 mg Protein (12 % Entfernung) erreicht.
Biozid A - 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on, 2-Methyl-4- isothiazidin-3-on
Biozid B - N-Alkyl-1,3-propandiamin
Biozid C - Methylenbis-(thiocyanat)
Biozid D - Natriumdimethyldithiocarbamat, Dinatriumethylenbis- (dithiocarbamat)
Biozid E - Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid, Bis(tri-n- butylzinn) oxid
Biozid F - Poly[oxyethylen(dimethylimino)ethylen(dimethylimino)ethylendichlorid]
Biozid G - 2,2-Dibromo-3-nitrilopropionamid
Biozid H - N-Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid-bis-(tri-w- butylzinn)oxid, N-Alkyl-1,3-propandiamin

Beispiel 15

Kompatibilität von Vibriolysin und Alcalase mit Chemikalien zur Behandlung von Wasser

Dieses Beispiel zeigt die Stabilität der Aktivität von Vibriolysin in Gegenwart von Chemikalien zur Behandlung von Wasser, darunter Hypochlorit und Kessel- und Korrosions-Chemikalien, sowie ferner, daß Vibriolysin auch in Gegenwart der Biozide Biofilm effektiv entfernt. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 17 bis 19 dargestellt. Unter Berücksichtigung der robusten Natur des Enzyms würde man nicht erwarten, daß die Gegenwart anderer Arten von Chemikalien zur Behandlung eine gegenteilige Wirkung auf die Effizienz des Vibriolysins hätte.
In Tabelle 20 werden die Ergebnisse der Stabilität der Alcalase in Gegenwart verschiedener Biozide dargestellt. Die Untersuchungen zur Entfernung von Biofilm in Gegenwart dieser Verbindungen wurden nicht durchgeführt, obwohl, unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit von Esperase und Alcalase , vergleichbare Aktivitäten erwartet werden. Tabelle 17
(a) Vibriolysin (20 E/ml) wurde bei 40 ºC in SCTW inkubiert, das verschiedene Chemikalien zur Behandlung von Wasser enthielt; Proben wurden genommen und die residuale Aktivität wurde mittels des Azocasein-Nachweisverfahrens bestimmt.
(b) Die Konzentration der Chemikalien zur Behandlung von Was ser waren wie folgt:
Dispersionsmittel (50 ppm), Dearborn A (250 ppm), Dearborn B (75 ppm), Dearborn C (150 ppm), Neodol 25-7 (0,05 %) und NaC1O (5 ppm). Tabelle 18 Kompatibilität von Vibriolysin mit ausgewählten Dearborn Bioziden
(a) Vibriolysin (1 E/ml) wurde in SCTW, das 0,05 % Neodol 25-7 enthielt, bei 40 ºC in Gegenwart oder Abwesenheit der Biozide inkubiert.
(b) Vibriolysin (20 E/ml) wurde in SCTW, das 0,05 % Neodol 25- 7 und 5 ppm NaClO enthielt, in Gegenwart oder Abwesenheit der Biozide inkubiert.
(c) Biozid-Konzentrationen waren wie folgt: A (250 ppm), B (100 ppm), C (100 ppm), D (120 ppm), E (150 ppm), F (200 ppm), G (12 ppm) und H (125 ppm). Tabelle 19 Auswirkung der Dearborn Chemikalien zur Behandlung von Wasser auf die Effizienz von Vibriolysin(a)
(a) Vibriolysin (1 E/ml) wurde zu angefaulten Abschnitten in SCTW gegeben und die Bestimmung der Biofilm-Entfernung wurde in Gegenwart oder Abwesenheit der Chemikalien zur Behandlung von Wasser durchgeführt. Die Konzentrationen der Biozide und des Neodols entsprach denen in Tabelle 18.
(b) Eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm ergab sich bei einer Protein-Entfernung von ≥ 0,9 mg oder 12 % Entfernung.
(c) Eine statistisch signifikante Entfernung von Biofilm ergab sich bei einer Entfernung von > 0,48 mg oder 7,3 % Protein-Entfernung. Tabelle 20 Auswirkung der Chemikalien zur Behandlung 5 von Wasser auf die Stabilität der Alcalase (a)
(a) Alcalase (20 E/ml) wurde in SCTW, das 0,05 % Neodol 25-7 enthielt, bei 40 ºC in Gegenwart oder Abwesenheit der Biozide inkubiert; Proben wurden entnommen und die residuale Aktivität wurde unter Verwendung des Standard Azocasein-Nachweisverfahrens bestimmt.
(b) Die Konzentration der Biozide war wie in Tabelle 18 beschrieben.

Claims

1. Verfahren zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit einem wäßrigen System in Kontakt stehen, bei dem man eine Enzym-Zusammensetzung, die im wesentlichen aus Protease besteht in einer Menge zu dem System gibt, die ausreicht, um Biofilm-Ablagerungen zu hemmen oder zu entfernen, wobei die Protease Esparase oder eine Metalloprotease ausgewählt aus der Gruppe Vibriolysin, Thermoase, Neutrase und Mischungen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Dosierungsmenge an Protease im Bereich von 0,0001 E/ml bis 100 E/ml liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Dosierungsmenge an Protease in einem Bereich von 0,0005 E/ml bis 1 E/ml liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Enzym-Zusammensetzung dem wäßrigen System zusammen mit einem oder mehreren Agenzien zur Behandlung von Wasser zugegeben wird, die aus der Gruppe bestehend aus Biozide, Tenside, Korrosionsinhibitoren, Kieselstein-Inhibitoren, Dispersionsmittel, Chelatbildnern, polymeren Agenzien, Phosphaten, Polyphosphaten, Silikaten, Puffern, Carboxylaten, Sulfonaten und optischen Aufhellmitteln ausgewählt sind.

5. Zusammensetzung zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm- Ablagerungen auf Oberflächen, die mit wäßrigen Systemen in Kontakt stehen, die Protease und ein Tensid in einem Verhältnis der Einheiten von Proteaseaktivität : Gewicht des Tensids im Bereich von 0,001 : 1 bis 100 : 1 aufweist, wobei die Zusammensetzung keine Amylase enthält.

6. Verfahren zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit einem wäßrigen System in Kontakt stehen, bei dem man zu dem System eine Zusammensetzung gibt, die eine Protease und ein Tensid in einer Dosierung - enthält, die ausreicht, um die Ablagerung von Biofilm zu hemmen oder zu entfernen, wobei die Zusammensetzung keine Amylase enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Protease aus der Gruppe bestehend aus Serin-Proteasen, Metalloproteasen, Cystein-Proteasen, Aspartat-Proteasen und Mischungen dieser ausgewählt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Protease eine Serin- Protease ist, die aus der Gruppe bestehend aus Esparase Alcalase , Subtilisin, Maxatase , Maxacal , und Trypsin ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Protease Esparase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Protease Alcalase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Protease eine Metalloprotease ist, die aus der Gruppe bestehend aus Vibriolysin, Thermolysin, Thermoase, Novo TS, Neutrase , SP-369, Protease 2A, Seaprose 5, Prozyme 6 und Mischungen davon ausgewählt ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Protease Vibriolysin ist.

13. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Dosierungsmenge an Protease im Bereich von 0,0001 E/ml bis 100 E/ml liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Dosierungsmenge an Protease im Bereich von 0,0005 E/ml bis 1 E/ml liegt.

15. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Enzym-Zusammensetzung dem wäßrigen System in Verbindung mit einem oder mehreren Agenzien zur Behandlung von Wasser zugegeben wird, die aus der Gruppe bestehend aus Bioziden, Tensiden, Korrosionsinhibitoren, Kesselstein-Inhibitoren, Dispersionsmittel, Chelatbildnern, polymeren Agenzien, Phosphaten, Polyphosphaten, Silikaten, Puffern, Carboxylaten, Sulfonaten und optischen Aufhellmitteln ausgewählt sind.

16. Verfahren zur Hemmung oder Entfernung von Biofilm-Ablagerungen auf Oberflächen, die mit einem wäßrigen System in Kontakt stehen, bei dem man nacheinander 1) eine Enzym-Zusammensetzung zu dem wäßrigen System gibt, die im wesentlichen aus Proteasen besteht, 2) die Enzym-Zusammensetzung durch das wäßrige System zirkulieren läßt, um einen Kontakt der Enzym-Zusammensetzung mit den Biofilm-Ablagerungen zu ermöglichen, und 3) wenigstens eine Lipase, Carbohydrase oder eine Mischung davon zu dem wäßrigen System gibt, wobei die Enzym-Zusammensetzung und die Lipase, Carbohydrase oder Mischung davon in Mengen zugegeben werden, die ausreichen, um die Biofilm-Ablagerungen zu hemmen oder zu entfernen.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Enzym-Zusammensetzung dem wäßrigen System in Verbindung mit einem oder mehreren Agenzien zur Behandlung von Wasser zugegeben wird, die aus der Gruppe bestehend aus Biozide, Tenside, Korrosionsinhibitoren, Kesselstein-Inhibitoren, Dispersionsmittel, Chelatbildnern, polymeren Agenzien, Phosphaten, Polyphosphaten, Silikaten, Puffern, Carboxylaten, Sulfonaten und optischen Aufhellmitteln ausgewählt sind.

18. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Dosierungsmenge an Protease im Bereich von 0,0001 E/ml bis 100 E/ml liegt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Dosierungsmenge an Protease im Bereich von 0,0005 E/ml bis 1 E/ml liegt.

20. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Dosierungsmenge an Lipase, Carbohydrase oder Mischungen derselben im Bereich von 0,0001 E/ml bis 100 E/ml liegt.

21. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Dosierung der Menge an Lipase, Carbohydrase oder deren Mischung im Bereich von 0,0005 E/ml bis 1 E/ml beträgt.