DE60305443T2

DE60305443T2 - Pharmazeutische zusammnesetzung zur verbesserten in-vivo genübertragung

Info

Publication number: DE60305443T2
Application number: DE60305443T
Authority: DE
Inventors: Bruno Pitard
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-07
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2023-02-08
Also published as: ATE326986T1; US20100179212A1; JP4613011B2; CA2473212C; US7709452B2; US8367631B2; DE60305443D1; US20050152870A1; CA2473212A1; EP1471944B1; EP1471944A2; JP2005522433A; FR2835749A1; AU2003222896A8; FR2835749B1; ES2265569T3; WO2003066104A2; WO2003066104A3; AU2003222896A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft hauptsächlich eine Arzneimittelzusammensetzung, die es ermöglicht, in vivo den zellulären Transfer von Nucleinsäure(n) und insbesondere in Muskel- oder Herzzellen zu erleichtern.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung gestellte Aufgabe besteht im Transfer einer genetischen Information in eine Zelle und insbesondere in deren Kern, um das entsprechende Gen dort in ein Protein zu translatieren.
Derzeit werden hauptsächlich zwei Techniken zur zellulären Genübertragung angewandt. Die erste Technik bedient sich eines adenoassoziierten Virus AAV, bei dem es sich um rekombinantes Virus handelt. Bei der zweiten Technik handelt es sich um den Elektrotransfer, der darin besteht, an die in Betracht kommenden Zellen nach Injektion von DNA ein elektrisches Feld anzulegen. Obgleich diese beiden Methoden es ermöglichen, mit ausreichendem Wirkungsgrad einen Gentransfer zu erreichen, sind sie mit Nachteilen in Bezug auf ihre Toxizität behaftet. Noch wichtiger ist, dass AAV derzeit zahlreiche technische Schwierigkeiten bei seiner Herstellung, Reinigung und/oder Charakterisierung verursacht und die mögliche Gefahr der Integration in das Genom der Wirtszelle zu Krebsentwicklung führen kann. Schließlich ist der Transfer von Genen in den Herzmuskel durch Elektrotransfer wegen seines lebensbedrohenden Charakters nicht zugänglich.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht diesbezüglich gerade in der Transfektion von Skelettmuskeln, glatten Muskeln und Herzmuskeln.
Synthetische Vektoren (z. B. kationische Lipide) erweisen sich in vivo als unwirksam. Nur bloße DNA ist zur Durchführung der Expression eines Proteins nach Injektion in Skelettmuskel und Herzmuskel befähigt. Ungünstigerweise bleibt die Menge des nach intramuskulärer Injektion von bloßer DNA synthetisierten Proteins für klinische Anwendungen unzureichend. Tatsächlich besteht eine der Hauptschwierigkeiten bei der Verwendung von bloßer DNA für den Gentransfer in Muskelgewebe im geringen Wirkungsgrad, der sich durch Erhöhung der injizierten DNA-Mengen nicht verbessert. Somit wäre es aus Zweckmäßigkeitsgründen, insbesondere in Bezug auf die Zugänglichkeit, besonders erstrebenswert, die Expression von Proteinen von therapeutischem Interesse lokal oder systemisch im Bereich dieser Muskeln zu begünstigen.
Somit besteht derzeit ein echtes Bedürfnis nach einem idealen Vektor bei der Gentherapie, d. h. einem nicht-toxischen Vektor, der keine immunologischen Reaktionen hervorruft und der es ermöglicht, eine optimale Expression eines Proteins, dessen therapeutische Wirkung gefragt ist, zu erreichen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Verwendung von speziellen chemischen Molekülen vorzuschlagen, mit denen der Wirkungsgrad der Transfektion von DNA, mit der sie assoziiert sind, erhöht wird.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Arzneimittelzusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in ihr mindestens eine Nucleinsäure, mit mindestens einem Mineralsalz eines tetrafunktionellen Copolymeren der Formel (I) kombiniert ist
in der x und y unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 500 darstellen, wobei x einen solchen Wert hat, dass das Molekül mindestens 30 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten enthält, wobei die Zusammensetzung mit einem Tyrode-Medium, d. h. 140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM Hepes, pH-Wert 7,4, und 10 mM Glucose formuliert ist (Tyrode Pharmacology, Philadelphia, 1908, 2. Auflage, 1912).
Die vorerwähnten Moleküle, bei denen es sich um spezielle Poloxamine handelt, sind aus hydrophoben Segmenten (Propylenoxid mit den Indizes y), hydrophilen Segmenten (Ethylenoxid mit den Indizes x) und einem zentralen, positiv geladenen Ethylendiaminbereich (NCH₂-CH₂N) zusammengesetzt.
Die Erfinder haben insbesondere gezeigt, dass diese Poloxamine, die bisher als nicht-ionische Polymere vorlagen (WO-00/47 186), eine kationische Form annehmen können.
Überraschenderweise beeinträchtigt das Auftreten dieser positiven Ladungen im zentralen Ethylendiamin-Bereich in keiner Weise die Wirksamkeit des zellulären Transfers, vielmehr ist das Gegenteil der Fall. Denn kationische chemische Moleküle vom Typ kationischer Lipide, Proteine und Peptide verbessern im Vergleich zu bloßer DNA nicht den Gentransfer im Muskelgewebe (M. M. Lluis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 96 (1999), 5. 4262-4267).
WO-01/65911 A beschreibt die Verwendung von Poloxameren und von Tetronic^R-Produkten zur Verbesserung des Transfers von Genen und Nucleinsäuren in Muskelzellen (Seite 3, Zeilen 9-14). Die Nucleinsäuren sind in D1 als cDNA, genomische DNA, Plasmid-DNA oder kondensierte Nucleinsäure, mit kationischen Lipiden zubereitete Nucleinsäure, mit Peptiden oder kationischen Polymeren zubereitete Nucleinsäure, RNA oder mRNA definiert (Seite 7, Zeile 36). Bei der verwendeten DNA kann es sich um ein therapeutisches Gen handeln, das für ein Proteinprodukt mit therapeutischer Wirkung kodiert, z. B. "hGH, VEGF, DEL-1, EPO, IGF-1, TPO, Faktor IX, IFN-α, IFN-β, IL-2, IL-12 oder dergleichen handeln (Seite 7, Zeilen 33-36). Klebe et al. (Tetratogenesis, Carcinogenesis, Mutagenesis, Bd. 6, Nr. 3 (1986), 5. 245-250) beschreiben die Verwendung von Derivaten von Polyethylenglycol zur genetischen Umwandlung (Transfektion von i-RNA). Das Tetronic^R-304-Polyol (eine Zusammensetzung der Formel (I)) weist eine ausgeprägte Aktivität als Promotor der genetischen Transformation auf (Tabelle I). Die zur Transfektion verwendete Lösung enthält KCl, CaCl₂ und NaCl (Pufferlösung TES) (Seite 246, Absatz 4).
WO-93/15745 A beschreibt Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit der Transfektion von Zellen mit exogenen Makromolekülen, insbesondere DNA, indem man Copolymere, wie Poloxamine, verwendet (Zusammenfassung, Seite 11, Zeilen 28-35).
WO-96/15778 A beschreibt Zusammensetzungen zum Stabilisieren von Polynucleotiden und zur Erhöhung ihrer Fähigkeit zur Passage von Zellmembranen, um ihre Wirkung im Zellinneren zu entfalten (Zusammenfassung). Die Poloxamine Tretonic^R werden als Wirkstoffe für die Transfektion bezeichnet (Seite 10, Zeile 21, bis Seite 12, Zeile 11).
WO-00/51645 A beschreibt eine Zusammensetzung, die (a) eine Nucleinsäure oder ein Oligonucleotid und (b) ein Blockcopolymeres mit einer funktionellen Gruppe, die dazu dient, den Block positiv zu laden, umfasst. Die Zusammensetzung könnte zum Transfer einer Nucleinsäure oder eines Oligonucleotids in eine Zelle verwendet werden.
Prokop et al. (J. Pharm. Sci., Bd. 91, Nr. 1 (2002), S. 67-76) beschreiben die Verwendung von Verbindungen mit einer relativ schwachen positiven Ladung, beispielsweise von Tetronic^R-Polymeren, zur Verbesserung des in vivo-Transfers eines Gens (Zusammenfassung). Das beste Resultat wird mit den Polymeren Tetronic^R T 704 erreicht (Tabelle 3).
WO-96/21470 A beschreibt Zusammensetzungen und in vitro- und in vivo-Verfahren zur Verabreichung von Nucleinsäuren, wobei die Aufnahme dieser Nucleinsäuren verbessert wird, um die Peptide oder Polypeptide zu exprimieren (Zusammenfassung; Seite 1, Absatz 1). Die Poloxamine (Tetronics^R) sind für diesen Zweck als Wirkstoffe erwähnt (Seite 3, Zeile 30, bis Seite 4, Zeile 17).
Das US-Patent 6 221 959 B beschreibt Zusammensetzungen zur Stabilisierung von Nucleinsäuren (RNA, DNA, antisense-(Poly)-nucleinsäuren) und zur Erhöhung ihres Vermögens zur Passage von Zellmembranen, damit sie ihre Wirkung im Inneren der Zellen ausüben können (Zusammenfassung; Spalte 3, Absatz 1). Der Ausdruck "Nucleinsäuren" umfasst: natürliche, synthetische und in kovalenter Weise modifizierte DNAs und RNAs, z. B. antisense-Nucleinsäuren, DNA, die für ein Gen kodiert, Ribozyme, antigene Nucleinsäuren und dergleichen (Spalte 16, Zeilen 27-45). Unter den Wirkstoffen sind die Tetronics^R-Produkte erwähnt (Spalte 22, Zeilen 50-51).
Ein spezieller Gegenstand der Erfindung ist somit eine Arzneimittelzusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass in ihr mindestens eine Nucleinsäure mit mindestens einem Mineralsalz (anorganischem Salz) eines tetrafunktionellen Copolymeren der Formel (I) kombiniert ist
das in kationischer Form vorliegt,
in der x und y unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 500 darstellen, wobei x einen solchen Wert hat, dass das Molekül mindestens 30 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten enthält, wobei die Zusammensetzung mit einem Tyrode-Medium, d. h. 140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM Hepes, pH-Wert 7,4, und 10 mM Glucose formuliert ist. Die Anwesenheit von Tyrode ermöglicht insbesondere die Kontrolle der Ionenzusammensetzung und des pH-Werts der Zubereitung und infolgedessen die Bereitstellung der Verbindung der Formel (I) in kationischer Form.
Ohne Festlegung auf einen Wirkungsmechanismus haben die Erfinder festgestellt, dass die in kationischer Form vorliegenden Poloxamine in Gegenwart des Tyrode-Mediums die Kondensation von DNA ermöglichen.
Überraschenderweise haben die Erfinder ferner festgestellt, dass die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in der die Ethylenoxid-Einheiten in einem Anteil von mindestens 30 Gew.-% vorliegen, sich als besonders wirksam für den in vivo-Transfer eines assoziierten Gens erweisen. Diese Wirksamkeit wird insbesondere durch das nachstehende Beispiel 1 erläutert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mindestens 85 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten. Insbesondere weisen sie 35 bis 50 Gew.-% und ganz besonders 40 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Moleküle der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ferner ein Molekulargewicht von mindestens 800 g/mol und insbesondere von 1000 bis 25000 g/mol auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Verbindungen dieser allgemeinen Formel ein EO/PO-Verhältnis (OE/OP-Verhältnis) der Einheiten von 0,5 bis 1,5 und insbesondere in der Größenordnung von 1 ± 0,2 auf.
Als Verbindungen der allgemeinen Formel (I), die insbesondere unter die vorliegende Erfindung fallen, lassen sich speziell Moleküle mit einem Molekulargewicht von 1650 g/mol bei einem EO/PO-Verhältnis von 15:16 (z. B. Poloxamin 304), von 5500 g/mol bei einem EO/PO-Verhältnis von 50:56 (z. B. Poloxamin 704) und von 6700 g/mol bei einem EO/PO-Verhältnis von 61:68 (z. B. Poloxamin 904) erwähnen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck Nucleinsäure sowohl eine Desoxyribonucleinsäure als auch eine Ribonucleinsäure.
Im vorliegenden Fall kann es sich um Sequenzen natürlichen oder künstlichen Ursprungs handeln, und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, iRNA, ("small interference RNA"), Hybridsequenzen oder synthetische Sequenzen oder halbsynthetische Oligonucleotide, die gegebenenfalls modifiziert sind. Diese Nucleinsäuren können menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen Ursprungs und dergleichen sein. Sie können durch sämtliche, dem Fachmann geläufige Techniken erhalten worden sein, und insbesondere durch Auswahl in Banken, durch chemische Synthese oder auch durch gemischte Verfahren, die eine chemische oder enzymatische Modifikation von durch Auswahl aus Banken erhaltenen Sequenzen erzeugt worden sind. Sie können chemisch modifiziert werden.
Was insbesondere Desoxyribonucleinsäuren betrifft, so können diese einzel- oder doppelsträngig sein, wobei es sich um kurze Oligonucleotide oder um längere Sequenzen handeln kann. Diese Desoxyribonucleinsäuren können therapeutische Gene, regulatorische Sequenzen für die Transkription oder Replikation, antisense-Sequenzen, die gegebenenfalls modifiziert sind, Verknüpfungsregionen mit anderen zellulären Bestandteilen und dergleichen enthalten. Sie können insbesondere die Synthese eines Polypeptids, das für ein infektiöses Mittel spezifisch ist, dirigieren oder sie können zur Behebung eines genetischen oder erworbenen Defekts befähigt sein.
Erfindungsgemäß sind unter einem therapeutischen Gen insbesondere alle Gene zu verstehen, die für ein Proteinprodukt kodieren, das eine therapeutische Wirkung besitzt. Bei dem auf diese Weise kodierten Proteinprodukt kann es sich um ein Protein, ein Peptid und dergleichen handeln. Dieses Proteinprodukt kann zur Zielzelle homolog sein (d. h. es kann sich um ein Produkt handeln, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn diese keine pathologische Beschaffenheit aufweist). In diesem Fall ermöglicht es die Expression eines Proteins, beispielsweise eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifikation inaktiven oder schwach aktiven Proteins oder auch die Überexpression dieses Proteins zu beheben. Das therapeutische Gen kann auch für eine Mutante eines zellulären Proteins, die eine erhöhte Stabilität, eine modifizierte Aktivität und dergleichen aufweist, kodieren. Das Proteinprodukt kann auch zur Zielzelle heterolog sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine fehlende Aktivität in der Zelle vervollständigen oder herbeiführen, was es ihm ermöglicht, einen pathologischen Zustand zu bekämpfen oder eine Immunantwort zu simulieren.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinn der vorliegenden Erfindung lassen sich insbesondere erwähnen: Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine, wie Interleukine, Interferone, TNF und dergleichen, Wachstumsfaktoren, wie der endotheliale vaskuläre Wachstumsfaktor, der insulinartige Wachstumsfaktor und der Fibroblasten-Wachstumsfaktor, die Neurotransmitter oder deren Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren, wie BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 und HARP/Pleiotrophin, Dystrophin oder ein Minidystrophin, Utrophin, mit Mukoviszidose assoziiertes CFTR-Protein, tumorenunterdrückende Gene, wie p53, Rb, Rap1A, DCC und k-rev, Gene, die für an der Koagulation beteiligte Faktoren vom Typ VII, VIII und IX kodieren, Gene, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, Suizidgene (Thymidin-kinase, Cytosin-desaminase), Gene für Hämoglobin oder andere Proteintransporteure, Gene, die Proteinen entsprechen, die am Stoffwechsel von Lipiden vom Apolipoprotein-Typ, ausgewählt unter den Apolipoproteinen A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J und Apo(A) beteiligt sind, Stoffwechselenzyme, z. B. Lipoprotein-lipase, Lipase der Leber, Lecithin-cholesterin-acyltransferase, 7-alpha-Cholesterin-hydroxylase, Phosphatidinsäure-phosphatase oder auch Transferproteine für Lipide, wie das Protein zum Transfer von Cholesterinestern und das Protein zum Transfer von Phospholipiden, HDL-Verknüpfungsproteine oder Rezeptoren, die beispielsweise unter LDL-Rezeptoren ausgewählt sind, Rezeptoren von Chylomikron-Resten und Scavenger-Rezeptoren, Erythropoietin, Proteinkinase C-3 und dergleichen.
Bei der therapeutischen Nucleinsäure kann es sich auch um ein Gen oder eine antisense-Sequenz handeln, deren Expression in der Zielzelle die Kontrolle der Expression von Genen oder die Transkription von zellulärer mRNA ermöglicht. Diese Sequenzen können beispielsweise in der Zielzelle in RNA, die zu zellulärer mRNA komplementär ist, transkribiert werden und so die Translation zu einem Protein blockieren. Die therapeutischen Gene umfassen auch Sequenzen, die für Ribozyme kodieren, die zur selektiven Zerstörung von Ziel-RNA befähigt sind.
Wie vorstehend erwähnt, kann die Nucleinsäure auch ein oder mehr Gene tragen, die für ein antigenes Peptid kodieren, das beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort herbeiführen kann. Bei dieser speziellen Ausführungsform ermöglicht die Erfindung demnach die Bereitstellung sowohl von Impfstoffen als auch von immunotherapeutischen Behandlungen, die bei Mensch oder Tier insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebs zur Anwendung kommen. Es kann sich insbesondere um spezielle antigene Peptide des Epstein-Barr-Virus, des HIV-Virus, des Hepatitis B- Virus, des Pseudotollwut-Virus, des Syncytium bildenden Virus, anderer Viren oder auch tumorspezifischer Viren handeln.
Vorzugsweise umfasst die Nucleinsäure auch Sequenzen, die die Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens, das für das antigene Peptid in der erwünschten Zelle oder dem erwünschten Organ kodiert. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des in Betracht gezogenen Gens verantwortlich sind, wenn die Sequenzen in der infizierten Zelle funktionieren können. Es kann sich auch um Sequenzen von abweichender Herkunft handeln (die für die Expression von anderen Proteinen verantwortlich sind, oder sogar um synthetische Sequenzen). Insbesondere kann es sich um Sequenzen handeln, die für eukaryontische oder virale Gene als Promotoren wirken. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die vom Genom der Zelle, die man infizieren möchte, stammen. Gleichermaßen kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die vom Genom eines Virus stammen. Diesbezüglich lassen sich beispielsweise die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV und die gewebespezifischen Promotoren, wie die Promotoren der Myosin-Ketten und dergleichen, erwähnen. Ferner können diese Expressionssequenzen durch Addition von Aktivierungssequenzen, Regulierungssequenzen und dergleichen modifiziert sein. Es kann sich auch um einen Promotor handeln, der induzierbar oder reprimierbar ist.
Im übrigen kann die Nucleinsäure (insbesondere strangaufwärts vom therapeutischen Gen) eine Signalsequenz aufweisen, die das synthetisierte therapeutische Produkt zu den Sekretionswegen der Zielzelle dirigiert. Bei dieser Signalsequenz kann es sich um eine natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts handeln, es kann sich aber auch um eine ganze andere funktionelle Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln. Die Nucleinsäure kann ferner eine Signalsequenz aufweisen, die das synthetisierte therapeutische Produkt in ein spezielles Kompartiment der Zelle dirigiert.
Neben der Verbindung der allgemeinen Formel (I) können die beanspruchten Zusammensetzungen ein oder mehr Adjuvantien und insbesondere ein oberflächenaktives Mittel enthalten.
Als Vertreter dieser Adjuvantien lassen sich insbesondere folgende Produkte erwähnen: Cellulosen, wie Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hyaluronat- oder Alginatsalze, Pectine, Polyethylenglycole, Dextrane, Polyvinylpyrolidone, Chitosane, Polyvinylalkohole, Propylenglycole, Polyvinylacetate, Lecithine, Polymilchsäuren und Polyhydroxybuttersäuren und Poloxamere aus der Pluronic^®-Reihe (PEO-PPO-PEO) und der umgekehrte Pluronic^R-Reihe (PPO-PEO-PPO).
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können sich auch eines oder mehrerer Zielelemente bedienen, die es ermöglichen, die Nucleinkomplexe zu Rezeptoren oder Liganden an der Oberfläche der Zelle zu dirigieren. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen oder mehrere Antikörper umfassen, die gegen die Moleküle der Zelloberfläche gerichtet sind, oder auch einen oder mehrere Liganden von Membranrezeptoren, wie Insulin, Transferrin, Folsäure oder andere Wachstumsfaktoren, Cytokine oder Vitamine. Vorteilhafterweise kann man in der Zusammensetzung Lectine, die gegebenenfalls modifiziert sind, einsetzen, um spezielle Polysaccharide zielgerichtet auf die Zelloberfläche oder die benachbarte extrazelluläre Matrix abzugeben. Proteine mit RGD-Einheiten, Peptide mit einem Gehalt an RGD-Tandemeinheiten, die gegebenenfalls zyklisch sind, sowie Polylysinpeptide oder Ligandenpeptide, die natürlichen oder synthetischen Ursprungs sind, können ebenfalls verwendet werden.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) kann in einer Menge von 0,005 bis 15 % (Gew./Vol.) der Zusammensetzung und insbesondere in einer Menge von 0,01 bis 10 % (Gew./Vol.) einverleibt werden.
Die beanspruchten Zusammensetzungen werden durch Vermischen der entsprechenden Nucleinsäure mit mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Lösung, die mit einer in vivo-Verabreichung verträglich ist, vermischt. Beispielsweise können die Zusammensetzungen gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren hergestellt werden: entsprechende Volumenteile einer die Nucleinsäure (insbesondere DNA) enthaltenden Lösung mit der doppelten Konzentration in 300 mM NaCl oder Tyrode 2X (doppelte Konzentration) und einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an einer Zusammensetzung der allgemeinen Formel (I) (doppelte Konzentration) werden vermischt. Das Gemisch wird bewegt, vorzugsweise durch Wirbelbildung (VORTEX).
Dabei wurde festgestellt, dass die beanspruchten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) es ermöglichen, die vom Muskel synthetisierte Proteinmenge um einen Faktor von 5 bis 20 zu erhöhen, verglichen mit bloßer DNA. Im übrigen wurde bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung keine Expression eines Transgens in Zellen in in vitro-Kultur festgestellt, wobei man sich üblicher Zellkulturverfahren bediente.
Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen einen pharmazeutisch verträglichen Träger für eine injizierbare Zubereitung, insbesondere zur direkten Injektion in das erwünschte Organ, oder zu einer Verabreichung auf topischem Wege, z. B. auf die Haut und/oder auf Schleimhäute. Es kann sich insbesondere um sterile isotonische Lösungen oder um trockene Zusammensetzungen, insbesondere lyophilisierte Produkte, handeln, die je nach den Umständen mit sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum versetzt werden, um injizierbare Lösungen bereitstellen zu können.
Es ist ersichtlich, dass die für Injektionszwecke verwendeten Nucleinsäuredosen sowie die Anzahl der Verabreichungen an verschiedene Parameter angepasst werden können, und insbesondere in Funktion von der in Betracht gezogenen Verabreichungsart, des pathologischen Zustands, der Natur des zu exprimierenden Gens oder der Dauer der angestrebten Behandlung.
Was insbesondere die Verabreichungsart betrifft, kann es sich um eine direkte Injektion in Gewebe oder den Kreislauf oder um eine Behandlung von Zellkulturen unter anschließender in vivo-Reimplantation durch Injektion oder Transplantation handeln.
Die beanspruchte Zusammensetzung erweist sich insbesondere für eine interne Verabreichung als vorteilhaft.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet eine interne Verabreichung, dass die beanspruchten Zusammensetzungen mit einer Verabreichung im Gewebe eines Organismus, z. B. eines Muskels, auf intradermalem oder subkutanem Wege verträglich sind. Auf der anderen Seite können sie auf topischem, oralem, pulmonalem, nasalem und mukosalem Wege, z. B. bukkal, vaginal oder rektal, eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen sind auf dem therapeutischen Gebiet besonders vorteilhaft.
Die möglichen Anwendungen können auch auf dem Gebiet der Gentherapie und insbesondere bei der Erzeugung eines Proteins von therapeutischem Interesse durch ein Muskelgewebe, und zwar auf lokaler oder systemischer Ebene, liegen.
Nach dem Transfer von Genen in den Muskel in Gegenwart von mindestens einem Molekül der allgemeinen Formel (I) kann nämlich das Organ als Synthesespeicher für heterologe Proteine dienen, die auf lokaler Ebene (Angiogenesefaktor) oder auf systemischer Ebene (Koagulationsfaktor, Wachstumsfaktor, Insulin ...) wirken.
Ferner kann es die beanspruchte Zusammensetzung ermöglichen, die mit bloßer DNA erzielte Plateauwirkung zu beseitigen. Wenn nämlich die in den Muskel injizierte DNA-Menge zunimmt, steigt die Transfektion linear bis zu einer gewissen Dosis, wonach die exprimierte Proteinmenge nicht weiter ansteigt. Im Gegensatz dazu nimmt mit den erfindungsgemäßen Zubereitungen die exprimierte Proteinmenge exponentiell mit der Erhöhung der in den Muskel injizierten DNA-Menge zu.
Eine weitere Anwendungsmöglichkeit liegt auf dem Gebiet der Vakzination. Dabei injiziert man eine DNA, die für ein bakterielles, virales oder anderartiges Antigen kodiert, in Zellen, vorzugsweise in Muskelzellen. Soweit die beanspruchten Zusammensetzungen sich als besonders vorteilhaft zur Erhöhung der Menge des durch die transfizierten Zellen synthetisierten Proteins erweisen, ist es auf diesem Umweg möglich, höhere Konzentrationen an Antikörpern und zytotoxischen T-Lymphozyten zu erreichen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder eines organischen oder anorganischen Salzes als Vektor zum zellulären in vivo-Transfer mindestens einer Nucleinsäure gemäß der erfindungsgemäßen Definition.
In den Bereich der Erfindung fällt auch die Verwendung einer Zusammensetzung der allgemeinen Formel (I) gemäß der vorstehenden Definition zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Gewährleistung des zellulären in vivo-Transfers mindestens einer Nucleinsäure bestimmt ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein zelluläres in vivo-Transfektionsverfahren mindestens einer Nucleinsäure, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man diese Nucleinsäure zusammen mit mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) gemäß der vorstehenden Definition oder zusammen mit einem organischen oder anorganischen Salz davon verabreicht.
Die Verabreichung kann auf topischem Wege, direkt in die in Betracht kommenden Zellen oder auf einem der vorstehend erörterten Verabreichungswege erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den Zielzellen um Muskel- oder Herzzellen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man Poloxamin 304 als Vektor zum in vivo-Transfer in Muskelzellen oder vor allem in Herzzellen.
Poloxamin 304 wird in einer Zusammensetzung mit einem Gehalt an Tyrode-Medium zubereitet.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Figuren, die aber lediglich zu Erläuterungszwecken vorgelegt werden, und keine Beschränkung darstellen, beschrieben.
Zubereitungen, die mit NaCl hergestellt sind, sind nicht Gegenstand der patentierten Erfindung und werden in den Beispielen zu Vergleichszwecken erwähnt.
Figuren
1: Expression von Luciferase nach intramuskulärer Injektion einer erfindungsgemäßen DNA-Zubereitung.
2: Makroskopische Sichtbarmachung der β-Galactosidase-Aktivität nach Injektion einer erfindungsgemäßen DNA-Zubereitung in den vorderen Schienbeinmuskel einer Maus.
3: Sichtbarmachung durch Fluoreszenzmikroskopie der Expression von GFP in einer Muskelzelle.
4: Darstellung der Expression von β-Galactosidase im vorderen Schienbeinmuskel einer Maus nach Injektion von DNA oder einer erfindungsgemäßen Zubereitung durch Elektrotransfer.
5: Sichtbarmachung durch elektronische Kryomikroskopie. Bei 10 %-Poloxamin 904 handelt es sich um ein Gemisch mit DNA in einer Konzentration von 0,15 mg/ml in 150 mM NaCl (A, B) oder in Tyrode (140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM Hepes, pH-Wert 7,4, und 10 mM Glucose (C, D, E)). Maßstabssymbol 100 nm.
Materialien
Die getesteten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt, in der die physikochemischen Eigenschaften der Verbindungen angegeben sind.
Tabelle 1
Beispiel 1
In vivo-Transfektion eines Gens in den Muskel in Gegenwart einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Herstellung der Proben
Für jedes der getesteten Produkte werden zwei optimierte Konzentrationen berücksichtigt.
Bei jedem Test werden 15 μg DNA in 50 μl 150 mM NaCl zusammen mit zwei verschiedenen Konzentrationen einer getesteten Verbindung der allgemeinen Formel (I) verwendet.
Die getesteten Konzentrationen betragen für die Verbindung 904 0,01 und 0,1 %, für die Verbindung 704 0,25 und 0,5 % und für die Verbindung 304 5 und 10 %.
Die DNA-Vergleichsprobe wird in Abwesenheit von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zubereitet.
Die einzelnen auf diese Weise zubereiteten Proben werden in den vorderen Schienbeinmuskel von Swiss-Mäusen mit einem Alter von sieben Wochen injiziert. Nach diesen Tagen werden die Mäuse getötet. Ihr vorderer Schienbeinmuskel, an dem die Injektion vorgenommen worden ist, wird herausgeschnitten, im Lysis-Puffer in Gegenwart eines Cocktails von Protease-Inhibitoren der Firma Roche Diagnostics zerkleinert. Die Luciferase-Aktivität im Überstand wird durch Luminometrie bestimmt (Vektor 2 der Firma Perkin Elmer, Les Ulis, Frankreich), wobei man die Testpackung mit der Bezeichnung Luciferase Assay System^R der Firma Promega (Charbonnières, Frankreich) verwendet.
Die Ergebnisse sind in 1 wiedergegeben.
Man stellt fest, dass die Anwesenheit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) eine signifikante Besserung der Expression der Luciferase-Aktivität um einen Faktor von 10 bis 15 ermöglicht.
Beispiel 2
Transfer eines für β-Galactosidase kodiherenden Gans in einem Skelettmuskel
Auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 wird im rechten Schienbeinmuskel einer Maus eine Injektion von bloßer DNA (A), von erfindungsgemäßen Zubereitungen mit einem Gehalt an 5 % (B) oder von 10 % der Verbindung 304 (C), von 0,01 % (D) und 0,1 % der Verbindung 904 (E) vorgenommen.
Sieben Tage nach der Injektion wird die Expression von β-Galactosidase durch makroskopische Sichtbarmachung von Muskeln, an denen eine Injektion mit der erfindungsgemäßen Zubereitung vorgenommen worden ist, festgestellt. Die Muskeln weisen Zonen von Fasern auf, die β-Galactosidase exprimieren und die nach Eintauchen der Muskeln in eine Lösung mit einem Gehalt an 2 mM MgCl₂, Kaliumhexacyanoferrat(III), Kaliumhexacyanoferrat(IV), 5 mM PBS, pH-Wert 7, und in Gegenwart von 1 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-galactopyranosid sich blau färben. Die Muskeln werden nach 24-stündiger Inkubation in dieser Lösung bei 37°C fotografiert. Die Muskeln, denen bloße DNA verabreicht worden ist, ermöglichen keine Sichtbarmachung der Expression von β-Galactosidase.
In 2 sind die Ergebnisse dargestellt.
Beispiel 3
Histologische Analyse der Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) sieben Tage nach Injektion von 50 μg bloßer DNA (A) oder von 50 μg erfindungsgemäß zubereiteter DNA
Getestete erfindungsgemäße Zubereitungen:

– Verbindung 304 in einer Konzentration von 5 % (Gew./Vol.) (B);
– Verbindung 704 in einer Konzentration von 0,25 % (Gew./Vol.) (C);
– Verbindung 904 in einer Konzentration von 0,1 % (Gew./Vol.) (D) und
– Verbindung 908 in einer Konzentration von 10^–3 % (Gew./Vol.).

Die Expression von GFP wird sieben Tage nach Injektion der Zubereitungen durch Betrachtung eines zwischen Plättchen montierten Gewebeschnitts, der anschließend durch Fluoreszenzmikroskopie geprüft wird, festgestellt. Aus 3 lässt sich feststellen, dass die Anzahl von Muskelfasern, die GFP exprimieren, deutlich höher ist, wenn DNA mit Verbindung 304 in einer Konzentration von 5 % (B), mit Verbindung 704 in einer Konzentration von 0,25 % (C) und mit Verbindung 904 in einer Konzentration von 0,1 % (D) zubereitet wird. Im speziellen Fall von DNA, die mit der Verbindung 908 in einer Konzentration von 10^–3 % (E) zubereitet wird, wird festgestellt, dass die Anzahl der transfizierten Fasern der Anzahl entspricht, die mit bloßer DNA erhalten wird.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen ermöglichen somit eine mindestens ebenso wirksame bzw. deutlich überlegene Transfektion im Vergleich zu bloßer DNA. Diese Ergebnisse bestätigen die Bedeutung der beanspruchten Zubereitungen für die Expression eines lokalen oder systemisch wirkenden therapeutischen Proteins von Interesse.
Beispiel 4
Vergleich der Wirksamkeit der Transfektion der erfindungsgemäßen Zubereitung im Muskel im Vergleich zum Elektrotransfer
Für den Elektrotransfer wurden 50 μg DNA, die für β-Galactosidase kodiert, in die labial-kranialen Muskeln von Swiss-Mäusen im Alter von 8 Wochen injiziert. Anschließend wurde der Muskel den vorstehend beschriebenen Bedingungen unterworfen. Für die Zubereitungen wurden 50 μg DNA-PCMV-β-gal mit den Verbindungen 304, 704 und 904 vermischt. Diese Zubereitungen wurden in die labial-kranialen Muskeln der Mäuse injiziert.
Die Technik des Elektrotransfers stellt eines der wenigen nicht-viralen Verfahren dar, die im Skelettmuskel eine Besserung der in vivo-Transfektion ermöglichen.
Die in Zusammenhang mit dem Vergleichstest herangezogene Elektrotransfer-Technik besteht darin, den Muskel einem elektrischen Feld von 200 V/cm bei acht Impulsen von 20 ms mit einer Frequenz von 2 Hz zu unterziehen. Dieser Test wird durch die Expression von β-Galactosidase im Muskel bestätigt.
Die Ergebnisse sind in 4 aufgeführt. Man stellt fest, dass die Injektion von bloßer DNA in den dem Elektrotransfer unterzogenen Muskel es ermöglicht, sieben Tage nach der Injektion 10 μg β-Galactosidase, das durch den Muskel synthetisiert worden ist, zu erhalten. Die Zubereitungen DNA 304 in einer Konzentration von 10 % (Gew./Vol.) und DNA 704 in einer Konzentration von 0,25 % (Gew./Vol.) ermöglichen die Synthese von 14 bzw. 11 μg β-Galactosidase/Muskel.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen ermöglichen mindestens den gleichen Transfektionswirkungsgrad (oder einen höheren Wirkungsgrad) wie beim Elektrotransfer von DNA. Darüber hinaus bietet die vorliegende Erfindung den klaren Vorteil, dass sie keine spezielle Ausrüstung benötigt und wesentlich einfacher durchzuführen ist, da es ausreicht, die Verbindung (I) mit Plasmid-DNA zu vermischen. Schließlich ist zu betonen, dass der Elektrotransfer im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen Zubereitungen nicht für den Transfer von Genen in den Herzmuskel verwendet werden kann.
Der Elektrotransfer stellt außerdem eine schmerzhafte Technik dar und erfordert zumindest eine regionale, wenn nicht allgemeine Anästhesie.
Beispiel 5
Durch elektronische Kryomikroskopie sichtbar gemachte Morphologie von Poloxamin/DNA-Teilchen in Abhängigkeit vom Zubereitungsmedium
Poloxamin 904/DNA-Teilchen werden mit NaCl (150 mM) oder Tyrode (Medium mit einem Gehalt an 3 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 6 mM KCl, 140 mM NaCl, 10 mM Glucose und 10 mM Hepes, pH-Wert 7,4) zubereitet.
Beispielsweise hat das zeta-Potential von Poloxamin 904 im Tyrode-Medium einen Wert von +9,5 mV, was die kationische Beschaffenheit des Poloxamins bei der Assoziation mit DNA in Gegenwart von Tyrode zeigt.
Die Morphologie der Teilchen wurde anschließend durch die elektronische Kryomikroskopie sichtbar gemacht. Das Ergebnis der Sichtbarmachung ist in 5 dargestellt.
Bei Zubereitung mit NaCl (150 mM) aggregieren die DNA-Moleküle in Gegenwart von Poloxamin 904 miteinander, wobei recht "lockere" Strukturen von großen Abmessungen gebildet werden, während mit Tyrode die DNA-Moleküle zusammen mit Poloxamin 904 kleine kugelförmige Teilchen bilden (5C, D und E). Die gleiche Beobachtung lässt sich mit Poloxamin 304 machen.
Gleichermaßen werden durch Kontrolle des pH-Werts und der ionischen Zusammensetzung des Mediums und insbesondere in Gegenwart von CaCl₂ kugelförmige Teilchen von kleinen Abmessungen erzeugt, die vermutlich ein erhöhtes Vermögen zur Diffusion im Gewebe aufweisen.
Beispiel 6
Einfluss des Zubereitungsmediums auf den Transfektionswirkungagrad der Poloxamin/DNA-Zubereitungen in NaCl oder Tyrode
Swiss-Mäusen im Alter von acht Wochen werden 50 μl Zubereitungen mit einem Gehalt an 15 μg Plasmid-DNA, die für Luciferase kodiert, in den vorderen Schienbeinmuskel injiziert. Die Muskeln werden sieben Tage später entfernt, zerkleinert und einer Messung der Luciferase-Aktivität unterzogen.
Die nachstehende Tabelle zeigt, dass die durch den Skelettmuskel erzeugte Proteinmenge deutlich höher ist, wenn die Zubereitungen in Tyrode hergestellt werden.
Beispiel 7
In vivo-Transfer eines Gens, das für β-Galactosidase kodiert, in das Herz in Gegenwart einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
Vorbereitung der Proben
Für jeden Test werden 200 μg Plasmid-DNA mit einem Gehalt an dem Gen, das für β-Galactosidase kodiert, und einem Polymeren in 700 μl Tyrode verwendet.
Das Polymere PE 6400 (für die Vergleichsprobe) und die Poloxamine 304, 704 und 904 werden in Konzentrationen (Gew./Vol.) von 0,5, 2,5, 0,75 bzw. 0,1 % getestet.
Jede auf diese Weise zubereitete Probe wird in den Herzbeutel von erwachsenen Ratten von etwa 200 g nach Durchqueren des Zwerchfells injiziert. Sieben Tage nach der Injektion werden die Herzen entnommen und histologisch zur Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität analysiert. Nur die Zubereitungen auf der Basis von Poloxamin ermöglichen die Transfektion von Kardiomyozyten im linken Ventrikel. Insbesondere Poloxamin 304 führt zu den besten Ergebnissen. Bei Poloxamin 304 wurde festgestellt, dass Kardiomyozyten, die β-Galactosidase exprimieren und somit blau gefärbt wurden, in einer Tiefe von 2/3 der Ventrikelmasse vorhanden waren, was ihr erhebliches Diffusionsvermögen zeigt.

Claims

Arzneimittelzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass in ihr mindestens eine Nukleinsäure mit mindestens einem Mineralsalz eines tetrafunktionellen Copolymeren der Formel (I) kombiniert ist
das in kationischer Form vorliegt, in der x und y unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 500 darstellen, wobei x einen solchen Wert hat, dass das Molekül mindestens 30 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten enthält, wobei die Zusammensetzung mit einem Tyrode-Medium, d.h. 140 mM NaCl, 6 mM KCl, 3 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM Hepes pH 7,4 und 10 mM Glucose formuliert ist.
Zusammensetzung nach dem vorhergehenden Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (I) höchstens 85 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (I) zwischen 35 und 50 Gew.-% Ethylenoxid-Einheiten enthält.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (I) ein Molekulargewicht von mindestes 800 g/Mol und vorzugsweise zwischen 1000 und 25 000 g/Mol aufweist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis OE/OP zwischen 0,5 und 1,5 und vorzugsweise in der Größenordnung von 1±0,2 liegt.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das besagte Molekül unter Molekülen ausgewählt ist, die ein Molekulargewicht von 1650 g/Mol mit einem Verhältnis OE/OP von 15:16, ein Molekulargewicht von 5500 g/Mol für ein Verhältnis OE/OP von 50:56 und ein Molekulargewicht von 6700 g/Mol für ein Verhältnis OE/OP von 61:68 haben.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (I) in einer Menge von 0,005 % bis 15 (Gewicht/Volumen) und bevorzugt zwischen 0,01 % und 10 (Gewicht/Volumen) vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (I) außerdem mindestens ein intra- oder extrazelluläres Target enthält, das unter Antikörpern, Membranrezeptor-Liganden, Lectinen und Proteinen mit RGD-Einheiten ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure einen Desoxyribonukleinsäure ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch modifiziert ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine mit Antisinn ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein ARN-Interferent ist.
Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein therapeutisches Gen enthält.
Arzneimittelzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, hergestellt durch Vermischen einer Volumenmenge zu einer Volumenmenge einer zweifach konzentrierten Lösung, welche die Nukleinsäure und Tyrode-Medium enthält, und einer wässerigen zweifach konzentrierten Lösung, die das tetrafunktionelle Copolymere enthält.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Gewährleistung des Zelltransfers mindestens einer Nukleinsäure in vivo bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Transfer in vivo ein Transfer in Muskelzellen ist.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Transfer in vivo ein Transfer in Herzzellen ist.
Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I) Poloxamin 304 ist, welches mit Tyrode-Medium, d.h. 140 mM NaCl, 6mM KCl, 3mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10mM Hepes pH 7,4 und 10 mM Glucose formuliert ist.