DE69634903T2

DE69634903T2 - Hyaluronidase zusammensetzungen zur behandlung intravitrealen hemorrhagischen blutes

Info

Publication number: DE69634903T2
Application number: DE69634903T
Authority: DE
Inventors: Hampar L. Karageozian; Vicken H. Karageozian; Maria C. Kenney; Jose L. G. Flores; Gabriel A. C. Aragon; Anthony B. Nesburn
Original assignee: ISTA Pharmaceuticals Inc
Current assignee: ISTA Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-20
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2016-11-21
Also published as: ATE298584T1; ES2245458T3; CA2238360C; EP0862456A1; KR19990071565A; WO1997018835A1; AU1407097A; DK0862456T3; US20060034822A1; CA2238360A1; CN1207684A; US6551590B2; KR100463009B1; EP0862456A4; JP2000502325A; MX9804051A; PT862456E; US20030129182A1; US6939542B2; BR9611617A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Hyaluronidase-Zubereitungen zur therapeutischen Verabreichung an den Augen von Menschen oder anderen Säugern und insbesondere a) die Verwendung davon zur Beschleunigung der Rate, mit der hämorrhagisches Blut aus dem Glaskörper eines Säugerauges beseitigt wird, und b) eine verbesserte Hyaluronidase-Zubereitung zur ophthalmischen Verabreichung.
Hintergrund der Erfindung
i. Anatomie des menschlichen Auges
Beim Menschen weist die Anatomie des Auges einen "Glaskörper" auf, der ungefähr vier fünftel der Augenhöhle hinter der Linse einnimmt. Der Glaskörper ist aus gallertigem Material geformt, das als Humor vitreus bekannt ist. Typischerweise enthält der Humor vitreus eines normalen menschlichen Auges ungefähr 99 % Wasser zusammen mit 1 % Makromolekülen, die aufweisen: Kollagen, Hyaluronsäure, lösliche Glykoproteine, Zucker und andere Metaboliten von geringer Molekülmasse.
Die Retina bzw. Netzhaut ist im wesentlichen eine Schicht von Nervengewebe, die an der inneren hinteren Oberfläche des Augapfels gebildet ist. Die Retina ist von einer Zellschicht umgeben, die als Choroidea bzw. Aderhaut bekannt ist. Die Retina kann unterteilt werden in a) einen optischen Bereich, der an dem visuellen Mechanismus teilnimmt, und b) einem nichtoptischen Bereich, der nicht an dem visuellen Mechanismus teilnimmt. Der optische Bereich der Retina enthält die Stäbchen und Zapfen, welche die wirksamen Sehorgane sind. Eine Reihe von Arterien und Venen treten in die Retina an ihrer Mitte ein und breiten sich nach außen aus, um für die Durchblutung der Retina zu sorgen.
Der hintere Bereich des Glaskörpers ist in direktem Kontakt mit der Retina. Fibrillennetze gehen von der Retina aus und treten in den Glaskörper ein oder sind in diesen eingeführt, um so den Glaskörper an der Retina zu befestigen.
ii. Ursachen, Behandlungen und Folgeerscheinungen einer intravitrealen Einblutung
Diabetische Retinopathie, Trauma und andere ophthalmologische Störungen resultieren manchmal in einem Reißen oder Undichtwerden von Netzhautblutgefäßen mit daraus resultierender Einblutung in den Humor vitreus des Auges (d. h. "intravitreale Einblutung"). Eine solche intravitreale Einblutung manifestiert sich typischerweise als Trübung oder Opakifikation des Humor vitreus.
Eine intravitreale Einblutung ist manchmal, jedoch nicht immer, begleitet von einem Reißen oder Ablösen der Netzhaut. In Fällen, in denen die intravitreale Einblutung von einem Netzhautriß oder einer Netzhautablösung begleitet ist, ist es wichtig, daß eine solche Netzhautablösung oder ein solcher Netzhautriß prompt diagnostiziert und durch einen Eingriff repariert wird. Wenn der Netzhautriß oder die -ablösung nicht prompt diagnostiziert und repariert wird, können Fotorezeptorzellen der Netzhaut im Bereich des Risses oder der Ablösung absterben. Ein solches Absterben der Fotorezeptorzellen der Retina kann zu einem Sehverlust führen. Außerdem kann dadurch, daß die Netzhautablösung über einen längeren Zeitraum unrepariert bleibt, eine weitere intravitreale Einblutung und/oder die Bildung von fibrösem Bindegewebe an der Einblutungsstelle resultieren. Diese Bildung von fibrösem Bindegewebe kann zur Bildung einer unerwünschten fibrösen Festlegung zwischen dem Glaskörper und der Netzhaut führen.
Das typische chirurgische Vorgehen, das zur Reparatur von Netzhautrissen oder einer Netzhautablösung angewandt wird, macht es notwendig, daß der Chirurg fähig ist, durch den Humor vitreus hindurchzusehen, um den geschädigten Bereich der Netzhaut zu betrachten (d. h. "Betrachtung durch den Glaskörper hindurch"). Wenn eine intravitreale Einblutung stattgefunden hat, kann die Anwesenheit des hämorrhagischen Bluts in dem Glaskörper dazu führen, daß der Glaskörper so trüb wird, daß der Chirurg die Netzhaut nicht durch den Glaskörper betrachten kann. Diese hämorrhagische Trübung des Glaskörpers kann 6 bis 12 Monate oder länger dauern, bis sie so weit aufgehoben ist, daß eine Betrachtung der Netzhaut durch den Glaskörper hindurch möglich ist. Angesichts der potentiellen Komplikationen, die aus einer verzögerten Diagnose oder Behandlung eines Netzhautrisses oder einer Netzhautablösung resultieren können, ist es im allgemeinen nicht wünschenswert, auf das Eintreten dieses natürlichen Verschwindens des hämorrhagischen Blutes zu warten.
Auch wenn die intravitreale Einblutung nicht von einem Riß oder einer Ablösung der Retina begleitet ist, ist es häufig schwierig festzustellen, daß ein Riß oder eine Ablösung der Retina nicht aufgetreten ist, weil die hämorrhagische Trübung des Glaskörpers den Arzt daran hindert, die routinemäßige Untersuchung der Retina mit dem Ophthalmoskop auszuführen. Ferner kann die Anwesenheit von hämorrhagischem Blut in dem Glaskörper das Sehvermögen des Patienten durch das betroffene Auge erheblich beeinträchtigen, und zwar so lange, bis das hämorrhagische Blut im wesentlichen oder vollständig verschwunden ist.
Somit verursacht die Anwesenheit von hämorrhagischem Blut im Glaskörper eine Vielzahl von klinischen Problemen wie a) die Unfähigkeit, die Einblutungsstelle und/oder einen begleitenden Riß oder eine Ablösung der Retina durch Sicht zu untersuchen und zu diagnostizieren, b) vollständige oder teilweise Beeinträchtigung des Sehvermögens in dem betroffenen Auge und c) Beeinträchtigung oder Verhinderung der Durchführung von transvitrealen chirurgischen Eingriffen der Art, die typischerweise vorgenommen werden, um die Einblutungsstelle zu reparieren und/oder einen begleitenden Riß oder eine Ablösung der Retina zu reparieren.
In Fällen, in denen die intravitreale Einblutung zu einer erheblichen Trübung oder Opakifikation des Glaskörpers geführt hat, kann der behandelnde Arzt die Option haben, einen als Vitrektomie bekannten Eingriff durchzuführen, bei dem der gesamte Glaskörper (oder ein Teil desselben) aus dem Augeninneren entfernt und durch eine klare Flüssigkeit ersetzt wird. Die Durchführung einer solchen Glaskörperresektion soll es dem Chirurgen ermöglichen, die Netzhaut hinreichend sehen zu können, um die erforderliche Netzhautuntersuchung und/oder chirurgische Reparatur der Einblutung und einer etwaigen Netzhautablösung oder eines Netzhautrisses durchzuführen. Solche Glaskörperresektionen erfordern jedoch außerordentliches Können und sind von mehreren signifikanten Nachteilen, Risiken und Komplikationen begleitet. Unter diesen Nachteilen, Risiken und Komplikationen ist die Gefahr, daß der Vorgang des Entfernens des Glaskörpers eine weitere Ablösung oder einen weiteren Riß der Retina verursacht und/oder daß eine solche Glaskörperresektion zu einer weiteren Einblutung aus den bereits geschwächten Blutgefäßen der Retina führt.
iii. Bekannte opthalmische Anwendungen von Hyaluronidase und anderen Enzymen
Bei dem Versuch, die Gefahr einer weiteren Ablösung oder eines weiteren Reißens der Retina während der Glaskörperresektion zu minimieren, ist bereits in der US-PS 5 292 509 (Hageman) vorgeschlagen worden, bestimmte proteasefreie Glycosaminoglycanase-Enzyme in den Glaskörper zu injizieren, um den Glaskörper zu veranlassen, von der Retina abgekoppelt zu werden oder nicht mehr in sie eingesetzt zu sein, und zwar vor dem Entfernen des Glaskörpers. Ein solches Entfernen oder Abkoppeln des Glaskörpers soll die Gefahr minimieren, daß während der Resektion des Glaskörpers weiteres Reißen oder Ablösen der Retina eintritt. Beispiele von spezifischen proteasefreien Glycosaminoglycanase-Enzymen, die verwendet werden können, um diese Glaskörperablösung zu bewirken, sollen die folgenden umfassen: Chondroitinase ABC, Chondroitinase AC, Chondroitinase B, Chondroitin-4-Sulfatase, Chondroitin-6-Sulfatase, Hyaluronidase und β-Glucuronidase.
Es ist zwar bekannt, daß das Hyaluronidase-Enzym für verschiedene ophthalmische Anwendungen einsetzbar ist, u. a. die die Vitrektomie begleitende Anwendung, die in der US-PS 5 292 509 (Hageman) beschrieben wird, veröffentlichte Studien haben aber gezeigt, daß das Hyaluronidase-Enzym selbst für die Retina und/oder andere anatomische Strukturen des Auges toxisch sein kann. Siehe hierzu The Safety of Intravitreal Hyaluronidase; Gottleib, J.L.; Antoszyk, A.N., Hatchell, D.L. und Soloupis, P., Invest Ophthalmol Vis Sci 31:11, 2345-52 (1990).
Die opthalmische Toxizität von einigen Hyaluronidase-Zubereitungen ist von anderen Forschern bestätigt worden, die vorgeschlagen haben, daß solche Hyaluronidase-Zubereitungen als toxisches Reizmittel eingesetzt werden, um experimentell induzierte Revaskularisierung des Auges in tierischen Toxizitätsmodellen zu verursachen. Siehe hierzu An Experimental Model of Preretinal Neovascularization in the Rabbit; Antoszyk, A.N., Gottleib, J.L., Casey, R.C., Hatchell, D.L., und Machemer, R., Invest Ophthalmol Vis Sci 32:1, 46-51 (1991).
Leider war früher nicht bekannt, ob die berichteten therapeutischen Wirksamkeiten und Toxizitäten von Hyaluronidase universell für alle Hyaluronidase-Zubereitungen gelten oder ob solche Wirksamkeiten und/oder Toxizitäten nur für Hyaluronidase-Zubereitungen gelten, die bestimmte Trägersubstanzen enthalten, oder für Hyaluronidase-Enzyme, die von spezifischen Quellen abgeleitet sind. Das ist eine wichtige Überlegung angesichts der Tatsache, daß die Reinheit und Charakterisierung (z. B. Verteilung des Molekülgewichts) der verschiedenen im Stand der Technik eingesetzten Hyaluronidase-Zubereitungen unterschiedlich sein kann, und zwar in Abhängigkeit von der Quelle der Hyaluronidase und der Lösungsmittel und/oder von anderen Formulierungskomponenten, mit denen die Hyaluronidase kombiniert wird.
iv. Reinheit und Charakterisierung von Hyaluronidase-Zubereitungen, die früher für die ophthalmische Verabreichung verwendet wurden
Der Ausdruck "Hyaluronidase" wird allgemein verwendet, um eine Gruppe von Endo-β-glucuronidase-Enzymen zu beschreiben, die bestimmte Mucopolysaccharide wie etwa Hyaluronsäure depolymerisieren. Myer, K. et al., The Enzymes; Vol. 4, 2nd Ed., S. 447, Academic Press, Inc., New York (1960).
Hyaluronidase verursacht die Hydrolyse der Endo-N-acetylhexosaminsäurebindungen von Hyaluronsäure und der Chondroitinsulfatsäuren A und C primär zu Tetrasaccharidresten.
Signifikante Anhaltspunkte weisen darauf hin, daß Hyaluronidase-Enzyme, die von verschiedenen Quellen stammen, in bezug auf die Molekülgewichtsverteilung der Enzyme und spezifische enzymatische Witksamkeiten unterschiedlich sind. Eine solche Variabilität der Molekülgewichtsverteilung und der spezifischen enzymatischen Wirksamkeit sind beachtenswerte Überlegungen angesichts der Tatsache, daß Hyaluronidase-Enzyme aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden können, was Rindertestikel, Schaftestikel, bestimmte Bakterien wie Streptomyces und bestimmte Invertebraten wie Blutegel umfaßt.
Von der Wydase^®-Hyaluronidase-Zubereitung wird berichtet, daß sie für verschiedene klinische und experimentelle Anwendungen bereits auf die Augen von Säugern aufgebracht wurde, was die Behandlung von Glaukom und die Unterstützung der Verflüssigung des Glaskörpers bei Vitrektomievorgängen umfaßt, bei denen der Glaskörper aus dem Auge entfernt wird.
Von einigen Hyaluronidase-Zubereitungen ist zwar berichtet worden, daß sie erwünschte therapeutische Wirkungen zeigen, wenn sie in das Auge injiziert oder topisch auf das Auge aufgebracht werden, die potentielle Toxizität von Hyaluronidase und/oder des Konservierungsmittels Thiomersal geben jedoch Anlaß zu Sorge in bezug auf die Sicherheit einer routinemäßigen klinischen Verabreichung solcher Zubereitungen durch intraokulare Injektion.
Es besteht also auf diesem Gebiet ein Bedarf für die Formulierung und Entwicklung einer neuen Hyaluronidase-Zubereitung, die dem Auge in Dosismengen verabreicht werden kann, die ausreichen, um optimale therapeutische Wirkungen hervorzubringen, jedoch keine okulare Toxizität verursachen.
Außerdem besteht angesichts der oben erörterten Probleme im Zusammenhang mit der Langsamkeit der natürlichen Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper ein Bedarf für Erforschung und Entwicklung neuer Methoden und Verfahren zur Beschleunigen der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper des Auges, um so eine transvitreale Betrachtung des Augenhintergrunds einschließlich der Retina zu ermöglichen, ohne daß es notwendig ist, den Glaskörper zu entfernen (d. h. ohne Total- oder Teilvitrektomie).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung gibt die Verwendung einer Hyaluronidase-Lösung bei der Herstellung eines Medikaments zum Beschleunigen der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper des Auges eines Säugers an, wobei beim Kontakt mit dem Glaskörper eine Menge an Hyaluronidase wirksam ist, um die Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper zu beschleunigen.
Ferner ist gemäß der vorliegenden Erfindung die Zubereitung eine verbesserte, Thiomersal-freie Hyaluronidase-Zubereitung, die zur Verabreichung auf das oder in dem Auge als therapeutisches Mittel zur Behandlung verschiedener krankhafter Störungen geeignet ist, was, ohne darauf beschränkt zu sein, die Beschleunigung der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper in Übereinstimmung mit der Einblutungs-Beseitigungsmethodik der vorliegenden Erfindung umfaßt. Diese Hyaluronidase-Zubereitung der vorliegenden Erfindung weist ein Hyaluronidase-Enzym auf, das im wesentlichen keine Hyaluronidase-Moleküle hat, die Molekulargewichte von mehr als 100.000, zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 haben. Die bevorzugte Hyaluronidase der vorliegenden Erfindung kann aus Rindertestikeln gewonnen werden und in wäßriger Lösung mit Mengen an Laktose und Phosphat kombiniert sein, um eine Thiomersal-freie wäßrige Hyaluronidase-Lösung für die intraokulare Injektion zu ergeben.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus dem Studium und Verständnis der nachstehenden genauen Beschreibung, der beigefügten Zeichnungen und der angegebenen Beispiele.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Elektrophoresegel mit Bahnen 1-6, wobei die Bahnen bezeichnen: 1) Molekulargewicht-Standards von 31.000 bis 200.000, 2) Schaf-Hyaluronidase (ACS), 3) Rinder-Hyaluronidase Typ VI-S, 4) Schaf-Hyaluronidase Typ V, 5) Rinder-Hyaluronidase Typ IV-S und 6) Rinder-Hyaluronidase Typ I-S.
2 ist eine Tabelle, in der die zymografisch bestimmten, Hyaluronsäure lysierenden, gelatinolytischen und caseinolytischen Wirksamkeiten der Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit Rinder-Hyaluronidasen der Typen VI-S, IV-S und I-S und Schaf-Hyaluronidase vom Typ V zusammengefaßt sind;
3 ist eine Tabelle, in der die toxischen Wirkungen von intravitrealen Einzeldosis-Injektionen von BSS, BSS + Thiomersal, Hyaluronidase (ACS) und Hyaluronidase Wydase^® in Kaninchen entsprechend dem folgenden Beispiel I zusammengefaßt sind;
4 ist eine Tabelle, in der die Wirksamkeit der intravitrealen Einzeldosis-Hyaluronidase (ACS) in Kaninchen entsprechend dem folgenden Beispiel II zusammengefaßt ist;
5 ist eine Tabelle, in der die Sicherheit und Wirksamkeit von Vielfachdosen von intravitrealer Hyaluronidase (ACS) in Kaninchen entsprechend dem folgenden Beispiel III zusammengefaßt sind; und
6 ist eine Tabelle, in der die Wirksamkeit von Einzeldosis-Hyaluronidase ACS bei der Beseitigung von Einblutungen bei Human-Patienten mit diabetischer Retinopathie entsprechend dem folgenden Beispiel IV zusammengefaßt ist.
GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die folgende genaue Beschreibung und die begleitenden Beispiele dienen nur der Beschreibung und Erläuterung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung und sollen den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken.
i. Enzymatische Methode zur Beschleunigung der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper des Auges
Gemäß der Erfindung hat die Anmelderin festgestellt, daß Hyaluronidase, wenn sie mit dem Glaskörper nach einer Einblutung in diesen in Kontakt gebracht wird, die Rate beschleunigt, mit der das hämorrhagische Blut aus dem Glaskörper beseitigt wird.
In dieser Hinsicht hat die Anmelderin eine Methode zum Beschleunigen der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper des Auges entwickelt, wobei diese Methode allgemein den Schritt aufweist, daß Hyaluronidase mit dem Glaskörper in einer Menge in Kontakt gebracht wird, die wirksam ist, um die Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper zu beschleunigen. Diese Methode der Beseitigung der Einblutung kann ohne jegliche Vitrektomie oder andere chirurgische Maßnahmen oder Entfernen des Glaskörpers durchgeführt werden, wodurch die potentiellen Risiken und Komplikationen vermieden werden, die mit solchen Vitrektomie-Verfahren einhergehen.
Die bevorzugte Verabreichungsroute dieses eine Einblutung beseitigenden Enzyms ist die intraokulare Injektion, wobei eine injizierbare Lösung, die das die Einblutung beseitigende Enzym enthält, durch eine Nadel direkt in den Glaskörper zu injizieren ist, der sich in der hinteren Augenkammer befindet. Alternativ kann das die Einblutung beseitigende Enzym der vorliegenden Erfindung auch auf jeder anderen geeigneten Verabreichungsroute (z. B. topisch) verabreicht werden, die in einer hinreichenden Verteilung des Enzyms zu dem Glaskörper resultiert, so daß die gewünschte Wirkung der Beseitigung der Einblutung verursacht wird.
Die bevorzugte injizierbare Lösung des die Einblutung beseitigenden Enzyms kann zusätzlich zu dem die Einblutung beseitigenden Enzym bestimmte inaktive Bestandteile enthalten, die bewirken, daß die Lösung im wesentlichen isotonisch ist und einen pH-Wert hat, der zur Injektion in das Auge geeignet ist. Eine solche Injektionslösung kann ursprünglich zu einem Trockenzustand lyophilisiert und anschließend vor dem Gebrauch rekonstituiert werden.
ii. Eine bevorzugte Hyaluronidase-Zubereitung zur ophthalmischen Verabreichung
Eine allgemeine Formulierung für eine injizierbare Thiomersal-freie Hyaluronidase-Zubereitung der vorliegenden Erfindung ist in der Tabelle I wie folgt gezeigt:
Tabelle I Allgemeine Formulierung
Diese Formulierungsbestandteile werden zuerst in keimfreiem Wasser gelöst, sterilfiltriert und anschließend zu einer Trockenzusammensetzung lyophilisiert. Die lyophilisierte Zusammensetzung wird für die spätere Rekonstitution vor dem Gebrauch in ausbalancierter Salzlösung verpackt. Eine solche ausbalancierte Salzlösung enthält typischerweise: 0,64 % Natriumchlorid, 0,075 % Kaliumchlorid, 0,048 % Calciumchloriddihydrat, 0,03 Magnesiumchloridhexahydrat, 0,39 % Natriumacetattrihydrat, 0,17 % Natriumcitratdihydrat, Natriumhydrid/Salzsäure zur pH-Einstellung und Wasser für die Injektion qs 100 %.
Der Ausdruck "Hyaluronidase ACS" beschreibt im vorliegenden Zusammenhang eine bevorzugte Hyaluronidase, die frei von Hyaluronidase-Molekulargewichtsfraktionen über 100.000, zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 ist. Eine solche Hyaluronidase kann von Schaftestikeln gewonnen werden und ist im Handel erhältlich von Calbiochem Biochemicals, P.O. Box 12087, La Jolla, Ca 92039-2087. Die Anmelderin hat festgestellt, daß diese spezifische Molekulargewichtsverteilung der Hyaluronidase ACS in einer geringeren ophthalmischen Toxizität als andere Hyaluronidase-Zubereitungen resultiert, während sie gleichzeitig eine erwünschte therapeutische Wirksamkeit in einer Reihe von opthalmischen Anwendungen zeigt.
1 zeigt ein Elektrophoresegel (10 % SDS-PAGE), das die Molekulargewichtsverteilung der bevorzugten Hyaluronidase ACS im Vergleich mit der Molekulargewichtsverteilung von Hyaluronidasen vom Rindertyp VI-S, IV-S und I-S und vom Schaftyp V demonstriert, die von Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri 63178, erhalten waren. Standardisierte Mengen (d. h. äquivalente Einheiten von Hyaluronidase-Wirksamkeit) jedes Enzyms wurden in jede Bahn (Bahnen 2-6) des in 1 gezeigten Elektrophoresegels geladen. Bahn 1 des in 1 gezeigten Elektrophoresegels enthält Molekulargewichtsmarker bei 200.000, 116.000, 97.400, 66.000, 45.000 bzw. 31.000. Die in 1 gezeigten Bahnen 2 bis 6 des Elektrophoresegels enthalten die jeweiligen getesteten Hyaluronidase-Zubereitungen wie folgt:

BAHN WAS SICH IN DER BAHN BEFINDET

2 Hyaluronidase ACS

3 Rinder-Hyaluronidase Typ VI-S

4 Schaf-Hyaluronidase Typ V

5 Rinder-Hyaluronidase Typ IV-S

6 Rinder-Hyaluronidase Typ IS
Bahn 2 zeigt, daß die Molekulargewichtsverteilung der Hyaluronidase ACS Molekulargewichtsfraktionen von 97.400, 50.000 (ungefähr) und 45.000 (ungefähr) aufweist, aber offensichtlich keine Molekulargewichtsfraktionen über 100.000, zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 hat.
Die Bahnen 3, 4, 5 und 6 des Elektrophoresegels von 1 zeigen, daß alle getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen der Typen VI-S, IV-S und I-S und die Schaftestikel-Hyaluronidase vom Typ V von der Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung dahingehend verschieden sind, daß sie Molekulargewichtsfraktionen zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000 aufweisen. Ferner wiesen drei (3) der vier (4) getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen (d. h. die Typen VI-S, IV-S und I-S) Hyaluronidase-Molekulargewichtsfraktionen über 100.000 auf.
Zusätzlich wurden Zymogramme erstellt, um die relativen lysierenden Wirksamkeiten von standardisierten Mengen (d. h. äquivalenten Einheiten der Hyaluronidase-Wirksamkeit) der oben beschriebenen Hyaluronidase ACS, der Typen VI-S, V, IV-S und I-S Rinder-Hyaluronidasen auf Hyaluronsäure, Gelatine und Casein zu vergleichen. Unter Bezugnahme auf 2 sind die spezifischen Methoden, nach denen jedes dieser Zymogramme erstellt wurde, die folgenden:
Zymogramm für gelatinolytische Wirksamkeit

GELATINE – 1 mg/ml Gelatine; 10 % Polyacrylamid; über Nacht Puffer = 50 mM Tris HCl, 5 mM CaCl₂, 0,05 % Triton X-100 pH 7,5; Anfärbung Coomassie-Blau; Entfärben 10 % Essigsäure/50 % Methanol.

Zymogramm für Caseinolytische Wirksamkeit

CASEIN – 4 mg/ml; 15 % Polyacrylamid; über Nacht Puffer = 50 mM Tris/HCL, 5 mM CaCl₂ und 0,05 % Triton X-100 pH 7,5; Anfärbung Coomassie-Blau; Entfärben 10 % Essigsäure/50 % Methanol.

Zymogramm für Hyaluronsäure-Lysierungswirksamkeit

HYALURONSÄURE – 2 mg/ml, 10 % Polyacrylamid; über Nacht Puffer=phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4; Anfärbung 0,5 % Alzianblau in 3 % Essigsäure; Entfärben 10 % Essigsäure/50 % Methanol.

Die Ergebnisse dieser Hyaluronsäure-, Gelatine- und Casein-Zymogramme sind in der Tabelle von 2 zusammengefaßt. Dabei ist zu beachten, daß die bevorzugte Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung keine Hyaluronsäure lysierenden Molekulargewichtsfraktionen über ungefähr 100.000 hat, wogegen jede der getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen (d. h. Typen VI-S, IV-S und I-S) Hyaluronsäure lysierende Molekulargewichtsfraktionen über 100.000 enthielt.
Ebenso hatte die Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung keine gelatinolytischen Molekulargewichtsfraktionen zwischen ungefähr 60.000 und 100.000, wogegen jede der getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen gelatinolytische Molekulargewichtsfraktionen zwischen ungefähr 60.000 und 100.000 aufwies.
Außerdem hatte die Hyaluronidase ACS der vorliegenden Erfindung keine caseinolytischen Molekulargewichtsfraktionen über ungefähr 45.000, wogegen jede der getesteten Rindertestikel-Hyaluronidasen (d. h. Typen VI-S, IV-S und I-S) und Schaftestikel-Hyaluronidase (Typ V) tatsächlich caseinolytische Molekulargewichtsfraktionen über ungefähr 45.000 enthielt.
Die spezifische Molekulargewichtsverteilung und das spezifische Enzymaktivitätsprofil der bevorzugten Hyaluronidase (ACS) der vorliegenden Erfindung und/oder der Ausschluß von Thiomersal aus ihrer Formulierung führt zu einer Hyaluronidase-Zubereitung, die für das Auge nichttoxisch ist, wenn sie in Dosismengen verabreicht wird, bei denen andere Hyaluronidase-Zubereitungen toxische Wirkungen verursachen würden.
Zum Gebrauch in den nachstehend aufgeführten Beispielen wurde die bevorzugte Hyaluronidase ACS in einer Thiomersal-freien Formulierung nach der Methode und der allgemeinen hier beschriebenen und in der Tabelle I gezeigten Formulierung hergestellt. Insbesondere wurde die in den folgenden Beispielen verwendete Hyaluronidase gemäß der speziellen Formulierung hergestellt, die in der folgenden Tabelle II angegeben ist.
Tabelle II Spezifische Formulierung
Wie in den folgenden Beispielen beschrieben wird, kann die spezifische bevorzugte Formulierung als Hyaluronidase ACS, die in der obigen Tabelle II angegeben ist, direkt in die hintere Kammer des Auges in Dosismengen injiziert werden, die erwünschte therapeutische Wirkungen hervorbringen, was die erfindungsgemäße Beseitigung der Einblutung im Glaskörper einschließt, jedoch nicht notwendigerweise darauf beschränkt ist, und zwar ohne eine signifikante Toxizität für das Auge oder damit zusammenhängende anatomische Strukturen zu verursachen.
Beispiel I
Ophthalmische Toxizität von Thiamersal, Hyaluronidase (ACS) und Hyaluronidase (Wydase^®) in Kaninchen
Zweiundfünfzig (52) gesunde Kaninchen des Typs New Zealand Cross (26 männliche, 26 weibliche Tiere) mit einem Gewicht zwischen 1,5 kg und 2,5 kg wurden zur Identifizierung einzeln markiert und einzeln in Hängekäfigen untergebracht. Die Tiere erhielten handelsübliches pelletisiertes Kaninchenfutter auf täglicher Basis, und Leitungswasser war ad libitum verfügbar.
Die Tiere wurden in dreizehn Gruppen von je vier Tieren aufgeteilt (2 männliche, 2 weibliche). Zwei Tiere in jeder Gruppe (1 männliches, 1 weibliches) wurden für die vor der Behandlung erfolgende Fotografie des Augenhintergrunds und die Fluorescein-Angiographie ausgewählt.
Die Aufnahme des Augenhintergrunds erfolgte durch Fixieren der Tiere und Sichtbarmachung des Sehnervs, der retinalen Arkaden und des Fundus mit einer KOWA^® RC-3 Funduskamera, die mit Kodak Gold 200 ASA Film bestückt war.
Für die Fluorescein-Angiographie erfolgte eine 1,5-ml-Injektion einer 2 % sterilen Fluoresceinlösung durch die Randohrvene. Ungefähr 30 Sekunden nach der Injektion war das Fluorescein bei Lokalisierung des Sehnervs, der Retinalgefäße und des Fundus sichtbar.
Am folgenden Tag wurde jedes Tier durch i.v. Verabreichung einer Kombination aus 34 mg/kg Ketaminhydrochlorid und 5 mg/ml Xylazin anästhesiert. Die Augelider wurden mit einem Lidspekulum zurückgezogen, und die Augen wurden mit einer Iod-Providon-Waschlösung desinfiziert.
Experimentelle Behandlungen entweder mit ausbalancierter Salzlösung (BSS), BSS + Thiomersal, Hyaluronidase (Wydase^®) oder Hyaluronidase (ACS) wurden mittels Injektion verabreicht unter Verwendung einer 1 cm³ Tuberkulin-Spritze mit einer daran angebrachten 30 G Nadel von 0,5 inch. Die bei diesem Beispiel verwendete Hyaluronidase-(ACS)-Lösung war frei von Thiomersal und bildete die spezifische bevorzugte Hyaluronidase-ACS-Formulierung, die in der obigen Tabelle I angegeben ist.

Die jeder Tiergruppe verabreichten Versuchsbehandlungen waren wie folgt:

Gruppe #	Behandlung
1	BSS
2	BSS + 0,0075 mg Thiomersal
3	BSS + 0,025 mg Thiomersal
4	Hyaluronidase (Wydase) 1 IE
5	Hyaluronidase (Wydase) 15 IE
6	Hyaluronidase (Wydase) 30 IE
7	Hyaluronidase (Wydase) 50 IE
8	Hyaluronidase (Wydase 150 IE
9	Hyaluronidase (ACS) 1 IE
10	Hyaluronidase (ACS) 15 IE
11	Hyaluronidase (ACS) 30 IE
12	Hyaluronidase (ACS) 50 IE
13	Hyaluronidase (ACS) 150 IE

An dem auf die Injektionen folgenden Tag (Tag 1) wurden die 26 Tiere, die der Fundusfotografie und Fluorescein-Angiographie unterzogen worden waren, unter Anwendung derselben Methoden wie für die Untersuchung vor der Dosisgabe beobachtet.
Am Tag 2 nach den Injektionen wurden die 13 männlichen Kaninchen, welche die Fundusfotographie und Fluorescein-Angiographie vor der Dosisgabe und am Tag 1 erhalten hatten, sowie die 13 weiblichen Kaninchen, die nicht für die Fotografie ausgewählt waren, mit einem Medikament auf der Basis von Natriumpentobarbital getötet. Die Augen wurden dann chirurgisch entfernt und in eine Fixierlösung aus 2,5 % Glutaraldehyd mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit pH 7,37 verbracht.
Alternativ wurde ein zufällig ausgewähltes Kaninchen mittels Pentobarbital-Injektion getötet, dann jedoch durch intrakardiale Injektion der Glutaraldehydlösung in den linken Ventrikel fixiert, um die Wirkung des Fixiervorgangs auf die histologischen Ergebnisse in den ausgeschälten Augen zu bestimmen.
Am Tag 7 wurden die 13 weiblichen Kaninchen, die vorher fotografiert und der Angiographie unterzogen worden waren, den gleichen Beobachtungen unterzogen, wobei die vorher beschriebenen Methoden angewandt wurden.
Die verbliebenen 26 Tiere wurden wie oben beschrieben 7 Tage nach der Dosisgabe getötet. Die Augen wurden auf die gleiche Weise fixiert wie die am Tag 2 fixierten Augen. Auch hier wurde ein zufällig ausgewähltes Kaninchen dem gleichen, oben für das vorher zufällig ausgewählte Tier beschriebenen intrakardialen Fixiervorgang mit Glutaraldehyd unterworfen.
Die Augen der in diesem Beispiel behandelten Tiere wurden makroskopisch und mikroskopisch auf Anzeichen einer auf die Behandlung zurückgehenden Toxizität untersucht. Eine Tabelle, in der eine Zusammenfassung der histologischen Anzeichen von Toxizität oder Nichttoxizität in jeder Behandlungsgruppe angegeben ist, ist in 3 angeführt. Insgesamt waren die Augen der mit BSS behandelten Kontrollgruppe am Tag 2 und Tag 7 nach Dosisgabe frei von Toxizität.
Die Augen der Tiere der Gruppe Nr. 2, die mit BSS + Thiomersal (0,0075 mg) behandelt worden waren, waren am Tag 2 frei von Toxizität, zeigten jedoch Anzeichen, daß ein Zusammenbruch der Blut-Netzhaut-Schranke am Tag 7 stattfand.
Die Tiere der Gruppe Nr. 3, die mit BSS + Thiomersal (0,025 mg) behandelt wurden, zeigten am Tag 2 und Tag 7 nach der Dosisgabe starke behandlungsbedingte toxische Wirkungen.
Die Tiere der Gruppe Nr. 4, die mit Wydase^® in der Dosis 1 IE behandelt wurden, waren an den Tagen 2 und 7 frei von Toxizität, aber die Augen der Tiere in den Gruppen Nr. 5 bis 8, die mit Wydase^® in Dosismengen zwischen 15 IE und 150 IE behandelt wurden, zeigten allgemein dosisbezogene toxische Wirkungen an den Tagen 2 und 7 nach Dosisgabe.
Die Augen der Tiere in den Gruppen Nr. 9 bis 13, die mit Hyaluronidase (ACS) in Dosierungen zwischen 1 IE und 150 IE behandelt wurden, waren an den Tagen 2 und 7 nach Dosisgabe frei von Anzeichen toxischer Wirkungen.
Es wird somit gefolgert, daß Thiomersal und die Thiomersal enthaltende Wydase^®-Formulierung tatsächlich toxische Wirkungen in den Augen von Kaninchen bei den untersuchten Dosismengen verursachen, daß jedoch Hyaluronidase (ACS) bei diesen Tieren in den getesteten Dosismengen keine toxischen Wirkungen verursachte.
Die Ergebnisse der Untersuchungen, die am Tag 7 durchgeführt wurden, sind in 3 zusammengefaßt. Wie 3 zeigt, wurden signifikante toxische Wirkungen am Tag 7 in den Augen von Kaninchen beobachtet, die mit BSS plus Thiomersal (0,0075 mg) und Hyaluronidase (Wydase) behandelt wurden, und zwar bei allen Dosismengen zwischen 1 IE und 150 IE. Im Gegensatz dazu wurden in den Augen von Tieren, deren Behandlung mit Dosismengen von 1 bis 50 IE Hyaluronidase (ACS) erfolgte, keine toxischen Wirkungen beobachtet.
BEISPIEL II
Sicherheit und Wirksamkeit von Hyaluronidase (ACS), die intravitreal in die Augen von Kaninchen injiziert wurde
Bei diesem Beispiel wurden 12 gesunde Kaninchen des Typs New Zealand Cross zum Zweck der Identifizierung markiert und einzeln in Hängekäfigen untergebracht. Die Tiere erhielten handelsübliches pelletisiertes Kaninchenfutter auf täglicher Basis, und Leitungswasser war unbegrenzt verfügbar.
Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in vier (4) Behandlungsgruppen von je drei (3) Tieren aufgeteilt.
Zuerst wurden die Augen jedes Tiers durch Weittropfen mit 1-2 Tropfen von 10 % Tropicanid untersucht, gefolgt von makroskopischer Untersuchung, indirekter Ophthalmoskopie unter Verwendung einer 20 dpt-Linse und Spaltlampenuntersuchung der hinteren Anatomie des Auges.
Nach der Eingangsuntersuchung der Augen der Tiere wurde in jedes Auge jedes Tiers 100 μl oder 10 μl Blut intravitreal injiziert.
Am Tag 2 erhielten die Tiere jeder Behandlungsgruppe eine einzelne intravitreale Injektion von entweder BSS oder Hyaluronidase (ACS) in das rechte Auge entsprechend dem nachstehende Behandlungsplan:
Die bei diesem Versuch eingesetzte Hyaluronidase(ACS)-Zubereitung war die bevorzugte Formulierung, die oben beschrieben und in Tabelle II angegeben ist.
An den Tagen 3, 5, 7, 14 und 21 wurden die Augen jedes Tiers erneut mit der Spaltlampe untersucht, um die Hornhaut, die hintere Kammer und die Iris zu bewerten. Außerdem wurden die Augen jedes Tiers mit 10 % Tropicamid-Lösung weitgetropft, und die Retina wurde mittels indirekter Ophthalmoskopie mit einer 20 dpt-Linse untersucht.
In 4 ist die beobachtete Wirksamkeit von Hyaluronidase (ACS) bei der Beseitigung der Einblutung zusammengefaßt. Im allgemeinen enthielt das linke Auge (unbehandelt) jedes Tiers in jeder Behandlungsgruppe trüben Glaskörper und einige Blutgerinnsel infolge der Blutmenge, die injiziert worden war. Die rechten Augen der mit BSS behandelten (Kontroll-)Tiere der Gruppe A enthielten ebenfalls trüben Glaskörper und etwas Blutgerinnsel, wogegen die rechten Augen von allen mit Hyaluronidase behandelten Tieren in den Behandlungsgruppen B bis D Glaskörper enthielten, der klar war und durch den hindurch die transvitreale Visualisierung der Retina möglich war. Ferner erschienen die Netzhäute der rechten Augen aller Tiere in den Behandlungsgruppen B bis D normal und frei von behandlungsbedingter Toxizität.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß intravitreal verabreichte Hyaluronidase (ACS) in Einzeldosen von 25 bis 75 IE wirksam war, um die Rate zu beschleunigen, mit der Blut aus den Augen der behandelten Tiere beseitigt wurde, und ferner, daß solche Einzeldosen von Hyaluronidase (ACS), die bei diesem Experiment verabreicht wurden, keine sichtbaren toxischen Wirkungen in den Augen der Kaninchen verursachten, die bei diesem Experiment behandelt wurden.
Die Beobachtungen, die auf jede Dosis folgten, waren gleichbleibend und sind in 5 zusammengefaßt. Im allgemeinen enthielt das linke (unbehandelte) Auge jedes Tiers in jeder Behandlungsgruppe trüben Glaskörper und einige Blutgerinnsel infolge der Blutmenge, die injiziert worden war. Die rechten Augen der mit BSS behandelten (Kontroll-)Tiere der Gruppe A enthielten ebenfalls trüben Glaskörper und etwas Blutgerinnsel, wogegen die rechten Augen sämtlicher Tiere in den Behandlungsgruppen B bis E (d. h. der mit Hyaluronidase (ACS) behandelten Tiere) klaren Glaskörper enthielten, durch den hindurch die transvitreale Visualisierung der Retina möglich war. Ferner erschienen die Netzhäute der rechten Augen aller Tiere in den Behandlungsgruppen B bis D normal und frei von behandlungsbedingter Toxizität, und zwar auch nach einer Vielzahl von Dosen der Hyaluronidase ACS.
Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, daß intravitreal verabreichte Hyaluronidase (ACS) in Einzeldosen von 25 bis 75 I.E. x 4 wirksam war, um die Rate zu beschleunigen, mit der Blut aus den Augen von Kaninchen beseitigt wurde, und ferner, daß diese Dosismengen von Hyaluronidase ACS keine erkennbaren toxischen Auswirkungen in den Augen der behandelten Kaninchen verursachten, und zwar auch nach vier (4) aufeinanderfolgenden Dosen von Hyaluronidase ACS, die in Intervallen von 2 Wochen verabreicht wurden.
BEISPIEL III
Wirksamkeit von Hyaluronidase (ACS) bei der Beseitigung von Einblutungen bei Menschen
Bei diesem Experiment wurden sechs (6) Human-Patienten (5 Männer, 1 Frau), die sich mit intravitrealer Einblutung zeigten, mit einzelnen intravitrealen Injektionen von Hyaluronidase (ACS) in Dosismengen von 50 bis 200 I.E. behandelt.
Die bei diesem Experiment verabreichte Hyaluronidase (ACS) wurde nach der oben beschriebenen und in Tabelle II angegebenen bevorzugten Formulierung zubereitet.
Sämtliche bei diesem Experiment behandelten Patienten hatten eine Vorgeschichte von diabetischer Retinopathie, und es wurde festgestellt, daß sie intravitreale Einblutungen unterschiedlicher Dauer hatten. Bei jedem Patienten war die im Glaskörper vorhandene Blutmenge ausreichend, um eine Betrachtung der Retina mit funduskopischen Standardeinrichtungen zu verhindern.
Jeder Patient empfing eine einzige intravitreale Injektion von Hyaluronidase (ACS). Vier (4) Patienten empfinden eine Dosis von 50 I.E., ein (1) Patient erhielt eine Dosis von 70 I.E., und ein Patient erhielt eine Dosis von 200 I.E.
Die beobachteten Ergebnisse dieses Experiments sind in 6 zusammengefaßt.
Bei den sechs (6) in diesem Beispiel behandelten Patienten wurde der die Einblutung aufweisende Glaskörper ausreichend klar, um innerhalb von 6 bis 16 Tagen nach der einzigen intravitrealen Injektion der Hyaluronidase (ACS) eine transvitreale Betrachtung der Retina zu ermöglichen. Es wurde subjektiv festgestellt, daß diese Klärung des Glaskörpers deutlich rascher als diejenige auftrat, die ohne Hyaluronidase-Behandlung bei diesen Patienten zu erwarten gewesen wäre.
Die vorstehende genaue Beschreibung, die Beispiele und die begleitenden Figuren beschreiben die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte derzeit bevorzugte Ausführungsformen. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist ersichtlich, daß zahlreiche Abweichungen von den beschriebenen speziellen Ausführungsformen und Formulierungen vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

Verwendung einer Lösung bei der Herstellung eines Medikaments zum Beschleunigen der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper des Auges eines Säugers, wobei das Medikament intravitreal zu verabreichen ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie Hyaluronidase enthält, die definitionsgemäß die Hydrolyse der Endo-N-acetyl-Hexosaminsäurebindungen von Hyaluronsäure bewirkt, wobei die Lösung folgendes ist: (a) frei von Thimerosal und (b) im wesentlichen ohne Hyaluronidase-Molekulargewichtsfraktionen über 100.000, zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000, bestimmt durch 10 % SDS-PAGE-Elektrophorese.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, die Hyaluronidasedosis 1 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 1 bis 50 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 25 bis 75 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 25 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 50 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 70 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 200 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidasedosis 10 bis 300 I.E. ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung in Form einer Einzeldosis ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung in Form einer Mehrfachdosis ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung ferner die Bestandteile Lactose und Phosphat aufweist.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestandteile in sterilem Wasser gelöst, steril filtriert und zu einer trockenen Zusammensetzung lyophilisiert sind.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die trockene Zusammensetzung in einer im Gleichgewicht befindlichen Salzlösung gelöst ist.
Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, die im Gleichgewicht befindliche Salzlösung eine Lösung zur Injektion ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hyaluronidase testikuläre Schafhyaluronidase ist.
Verwendung einer Lösung bei der Herstellung eines Medikaments zum Beschleunigen der Beseitigung von hämorrhagischem Blut aus dem Glaskörper des Auges eines Säugers, wobei das Medikament intravitreal nicht als ein Zusatz bei einer Vitrektomie zu verabreichen ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie Hyaluronidase enthält, die definitionsgemäß die Hydrolyse der Endo-N-acetyl-Hexosaminsäurebindungen von Hyaluronsäure bewirkt, wobei die Lösung folgendes ist: (a) frei von Thimerosal und (b) im wesentlichen ohne Hyaluronidase-Molekulargewichtsfraktionen über 100.000, zwischen 60.000 und 70.000 und unter 40.000, bestimmt durch 10 % SDS-PAGE-Elektrophorese.