DE69632684T2

DE69632684T2 - Verfahren zur herstellung von zubereitungen mit verzögerter freisetzung

Info

Publication number: DE69632684T2
Application number: DE69632684T
Authority: DE
Inventors: Kayoko Osaka-shi OKAMOTO; Yutaka Kobe-shi YAMAGATA; Yasutaka Kobe-shi IGARI; Masafumi Takarazuka-shi MISAKI
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-06-27
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2016-06-27
Also published as: DE69632684D1; CA2224381A1; WO1997001331A2; ATE268591T1; AR005275A1; JP2008273982A; EP0835101B1; AU6242096A; EP0835101A2; WO1997001331A3; US6267981B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, die ein bioabbaubares Polymermetallsalz und ein bioaktives Polypeptid umfaßt, und auf ein Verfahren zu deren Herstellung.
Stand der Technik
Es ist bekannt, daß bioaktive Polypeptide oder ihre Derivate in vivo eine Vielfalt pharmakologischer Aktivitäten zeigen. Einige dieser Polypeptide werden durch Verwenden von Escherichia coli, Hefen, Tierzellen oder Wirtstieren wie etwa Hamster mittels der kürzlich entwickelten Gentechnik und Zelltechnologie in großem Maßstab hergestellt und der medizinischen Verwendung zugeführt. Diese bioaktiven Polypeptide müssen jedoch wegen der im allgemeinen kurzen biologischen Halbwertszeit häufig verabreicht werden. Die wiederholten Injektionen stellen für Patienten eine bedeutende physische Belastung dar. Zum Überwinden dieses Nachteils sind verschiedene Versuche unternommen worden, bioaktive Polypeptide umfassende Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung zu entwickeln.
Die EP-461 630 offenbart Herstellungstechniken des Standes der Technik für Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung, die für eine verstärkte Wirksamkeit des Einschlusses wasserlöslicher, bioaktiver Peptide ausgelegt sind. Diese Zubereitungen werden aus einer Öl/Wasser-Emulsion (O/W) erhalten, das das Lösen eines wasserlöslichen, bioaktiven Polypeptids, eines bioabbaubaren Polymers und eines Fettsäuresalzes in einem organischen Lösungsmittel umfaßt.
Obschon verschiedene Versuche zum Herstellen einer Zubereitung mit verzögerter Freisetzung unternommen wurden, die Bioaktivität bioaktiver Polypeptide wie zuvor angeführt zu erhalten, gibt es keine klinisch zufriedenstellende Zubereitung mit verzögerter Freisetzung mit einem wirkungsvollen Einschluß eines bioaktiven Polypeptids in ein bioabbaubares Polymer und einem Unterdrücken der Anfangsfreisetzung, einer konstanten Langzeitfreisetzung des Wirkstoffs und so weiter.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben ausgedehnte Untersuchungen zum Lösen der vorstehenden Probleme unternommen und fanden, daß Zubereitungen mit verzögerter Freisetzung durch Dispergieren eines bioaktiven Polypeptids in einem ein bioabbaubares Polymer, das vorher in ein Metallsalz umgewandelt wurde, enthaltenden organischen Lösungsmittel und Unterziehen der sich daraus ergebenden Dispersion dem Formgeben unerwartete, ausgezeichnete Eigenschaften wie etwa eine überraschende Verstärkung des Einschlusses bioaktiver Polypeptide, eine Unterdrückung der übermäßigen Anfangsfreisetzung der Polypeptide, eine gleichbleibende Langzeitfreisetzung und so weiter aufweisen. Die vorliegende Erfindung ist nach weiterer, auf den vorstehenden Befunden beruhender Ausarbeitung entwickelt worden.
Die vorliegende Erfindung ist daher gerichtet auf:

(1) ein Verfahren zum Herstellen einer Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, das das Dispergieren eines bioaktiven Polypeptids in einem ein bioabbaubares Polymermetallsalz enthaltenden organischen Lösungsmittel und Unterziehen der sich daraus ergebenden Dispersion dem Formgeben umfaßt.
(2) ein Verfahren gemäß (1), wobei das Metallsalz ein mehrwertiges Metallsalz ist,
(3) ein Verfahren gemäß (1), wobei das Metallsalz aus der aus einem Zinksalz und einem Calciumsalz bestehenden Gruppe ausgewählt ist,
(4) ein Verfahren gemäß (1), wobei das organische Lösungsmittel ein Gemisch aus halogenierten Kohlenwasserstoffen und Acetonitril oder Alkoholen ist,
(5) ein Verfahren gemäß (4), wobei das Mischungsverhältnis der halogenierten Kohlenwasserstoffe zu Acetonitril oder den Alkoholen bei dem organischen Lösungsmittel im Bereich von etwa 40 : 1 bis etwa 1 : 1 (Volumen/Volumen) liegt,
(6) ein Verfahren gemäß (1), wobei das bioaktive Polypeptid ein Hormon ist,
(7) ein Verfahren gemäß (6), wobei das Hormon ein Insulin ist,
(8) ein Verfahren gemäß (6), wobei das Hormon ein Wachstumshormon ist,
(9) ein Verfahren gemäß (1), wobei das bioaktive Polypeptid ein Cytokin ist,
(10) ein Verfahren gemäß (9), wobei das Cytokin ein Interferon ist,
(11) ein Verfahren gemäß (1), wobei das bioabbaubare Polymer ein aliphatischer Polyester ist,
(12) ein Verfahren gemäß (11), wobei der aliphatische Polyester ein α-Hydroxycarbonsäurepolymer ist,
(13) ein Verfahren gemäß (11), wobei der aliphatische Polyester ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer ist,
(14) ein Verfahren gemäß (13), wobei das Zusammensetzungsverhältnis (Mol.-%) Milchsäure/Glykolsäure des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers etwa 100/0 bis etwa 40/60 ist und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers etwa 3000 bis etwa 20000 ist,
(15) ein Verfahren gemäß (1), wobei die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung ein teilchenförmiges Erzeugnis ist,
(16) ein Verfahren gemäß (15), wobei die durchschnittliche Teilchengröße des teilchenförmigen Erzeugnisses etwa 0,1 μm bis etwa 300 μm beträgt,
(17) ein Verfahren gemäß (1), wobei die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung für eine Injektion bestimmt ist,
(18) eine Dispersion, die ein bioaktives Polypeptid umfaßt, das in einem ein bioabbaubares Polymermetallsalz enthaltenden organischen Lösungsmittel dispergiert ist,
(19) eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, die durch das Verfahren gemäß (1) hergestellt wurde,
(20) eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung gemäß (19), bei der der Metallgehalt des bioabbaubaren Polymermetallsalzes etwa 0,01 bis etwa 10 Gew.-% beträgt,
(21) eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung gemäß (19), bei der die Konzentration des bioaktiven Polypeptids etwa 0,001 bis etwa 30% (Gew./Gew.) beträgt und
(22) eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung gemäß (19), bei der das bioaktive Polypeptid ein Wachstumshormon ist, und so weiter.

Das bioabbaubare Polymer der vorliegenden Erfindung weist eine niedrige Wasserlöslichkeit auf oder ist wasserunlöslich und schließt aliphatische Polyester, z. B. Homopolymere oder Copolymere, die aus einer oder mehr Arten α-Hydroxycarbonsäuren (z. B. Glykolsäure, Milchsäure, 2-Hydroxybuttersäure, Valin, Leucin usw.), Hydroxydicarbonsäuren (z. B. Äpfelsäure usw.), Hydroxytricarbonsäuren (z. B. Citronensäure usw.) oder ihren Gemischen synthetisiert wurden; Poly-α-cyanacrylester, z. B. Poly(methyl-α-cyanacrylat), Poly(ethyl-α-cyanacrylat), Poly(butyl-α-cyanacrylat) usw. und Aminosäurepolymere, z. B. Poly(γ-benzyl-L-glutamat) usw. oder ihre Gemische ein. Die Polymerisationsart für diese bioabbaubaren Polymeren kann jede Random-, Block- oder Pfropfpolymerisationstechnik sein.
Die bevorzugten bioabbaubaren Polymeren sind aliphatische Polyester, z. B. Homopolymere oder Copolymere, die aus einer oder mehr Arten α-Hydroxycarbonsäuren (z. B. Glykolsäure, Milchsäure, 2-Hydroxybuttersäure usw.), Hydroxydicarbonsäuren (z. B. Äpfelsäure usw.) und Hydroxytricarbonsäuren (z. B. Citronensäure usw.) oder ihren Gemischen synthetisiert wurden, und so weiter.
Unter den vorstehend angeführten aliphatischen Polyestern sind die aus einer oder mehr Arten α-Hydroxycarbonsäuren synthetisierten Homopolymeren und Copolymeren hinsichtlich der Bioabbaubarkeit und Bioverträglichkeit bevorzugt.
Besonders bevorzugte aliphatische Polyester sind Copolymere, die aus zwei oder mehr Arten α-Hydroxycarbonsäuren synthetisiert wurden. Weiterhin können diese Copolymeren als Gemische verwendet werden.
Wenn die α-Hydroxycarbonsäuren chirale Verbindungen sind, können sie von irgendeiner D-, L- und DL-Konfiguration sein. Es ist bevorzugt, daß das Verhältnis der D/L-Konfiguration (Mol.-%) im Bereich von etwa 75/25 bis etwa 25/75 liegt. Bevorzugter ist eine Hydroxycarbonsäure, bei der das Verhältnis der D/L-Konfiguration (Mol.-%) im Bereich von etwa 60/40 bis etwa 30/70 liegt.
Ein Beispiel des vorstehend angeführten α-Hydroxycarbonsäurepolymers ist ein Milchsäurepolymer (hierin nachstehend manchmal als „Polymilchsäure" bezeichnet.
Das α-Hydroxycarbonsäurecopolymer schließt Polymere von Glykolsäure mit den anderen α-Hydroxycarbonsäuren wie etwa Milchsäure und 2-Hydroxybuttersäure ein.
Bevorzugte α-Hydroxycarbonsäurecopolymere sind Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäurecopolymer.
Ein besonders bevorzugtes α-Hydroxycarbonsäurecopolymer ist ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer.
Die Polymilchsäure kann entweder von der D-Konfiguration oder L-Konfiguration oder ein Gemisch sein; eine mit einem D/L-Konfigurationsverhältnis (Mol.-%) von etwa 75/25 bis etwa 20/80 ist bevorzugt. Bevorzugter ist eine Polymilchsäure, bei der das Verhältnis der D-/L-Konfiguration (Mol.-%) im Bereich von etwa 60/40 bis etwa 25/75 liegt. Am bevorzugtesten ist eine Polymilchsäure, bei der das Verhältnis der D-/L-Konfiguration in dem Bereich von etwa 55/45 bis etwa 25/75 liegt.
Die Polymilchsäure weist bevorzugt ein nachstehend definiertes Gewichtsmittel des Molekulargewichts von etwa 1500 bis etwa 10000 auf. Bevorzugter ist eine Polymilchsäure mit einem Gewichtsmittel des Molekulargewichts von etwa 2000 bis etwa 8000. Besonders bevorzugt ist eine Polymilchsäure mit einem Gewichtsmittel des Molekulargewichts von etwa 3000 bis etwa 6000. Die Dispersität (Gewichtsmittel des Molekulargewichts/Zahlenmittel des Molekulargewichts) der Polymilchsäure liegt bevorzugt in dem Bereich von etwa 1,2 bis etwa 4,0 und bevorzugter in dem Bereich von etwa 1,5 bis etwa 3,5.
Die Polymilchsäure kann durch in der EP-172 636 (z. B. durch dehydratisierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators oder durch dehydratisierende Polykondensation in Gegenwart eines anorganischen, festen Säurekatalysators) beschriebene Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden. Die bevorzugte Polymilchsäure wird durch dehydratisierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators hergestellt.
Das Zusammensetzungsverhältnis (Milchsäure/Glykolsäure, Mol.-%) in dem Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer ist vorzugsweise etwa 100/0 bis etwa 40/60, bevorzugter etwa 90/10 bis etwa 45/55 und am bevorzugtesten etwa 60/40 bis etwa 40/60. Das Gewichtsmittel des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers ist bevorzugt etwa 3000 bis etwa 20000 und bevorzugter etwa 4000 bis etwa 15000. Die Dispersität (Gewichtsmittel des Molekulargewichts/Zahlenmittel des Molekulargewichts) des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers ist vorzugsweise etwa 1,2 bis etwa 4,0 und bevorzugter etwa 1,5 bis etwa 3,5.
Die Milchsäure-Glykolsäure-Copolymeren können durch die bekannten, in der EP-172 636 beschriebenen Verfahren (z. B. dehydratisierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators oder durch dehydratisierende Polykondensation in Gegenwart eines anorganischen, festen Säurekatalysators) hergestellt werden. Das bevorzugte Copolymer ist ein durch dehydratisierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators hergestelltes.
In der vorliegenden Erfindung können zwei Arten Milchsäure-Glykolsäure-Copolymeren, die sich im Zusammensetzungsverhältnis und Gewichtsmittel des Molekulargewichts unterscheiden, im Gemisch in jedem Verhältnis verwendet werden. Das typische Beispiel ist ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer, bei dem das Zusammensetzungsverhältnis Milchsäure/Glykolsäure (Mol.-%) etwa 75/25 ist und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts etwa 6000 ist. Ein weiteres Beispiel ist ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer, bei dem das Zusammensetzungsverhältnis Milchsäure/Glykolsäure (Mol.-%) etwa 50/50 ist und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts etwa 4000 ist. Das bevorzugte Gewichtsverhältnis des Gemisches ist etwa 25/75 bis etwa 75/25.
Das Zusammensetzungsverhältnis des 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymers ist etwa 10 bis etwa 75 Mol.-% Glykolsäure und die restlichen Mol.% 2-Hydroxybuttersäure, bevorzugter etwa 20 bis etwa 75 Mol.-% Glykolsäure und bevorzugter etwa 30 bis etwa 70 Mol.-% Glykolsäure. Das Gewichtsmittel des 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymers ist vorzugsweise etwa 2000 bis etwa 30000 und bevorzugter etwa 3000 bis etwa 20000. Das besonders bevorzugte Gewichtsmittel des Molekulargewichts des Copolymers ist etwa 4000 bis etwa 15000. Die Dispersität (Gewichtsmittel des Molekulargewichts/Zahlenmittel des Molekulargewichts) des 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymers ist vorzugsweise etwa 1,2 bis etwa 4,0 und bevorzugter etwa 1,5 bis etwa 3,5.
2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymeren können durch die bekannten, in der EP-172 636 beschriebenen Verfahren (z. B. dehydratisierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators oder durch dehydratisierende Polykondensation in Gegenwart eines anorganischen, festen Säurekatalysators) hergestellt werden. Das bevorzugte Copolymer ist ein durch dehydratisierende Polykondensation in Abwesenheit eines Katalysators hergestelltes.
Die Glykolsäurecopolymeren (z. B. Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer, 2-Hydroxybuttersäure-Glykolsäure-Copolymer usw.) können im Gemisch mit Polymilchsäure verwendet werden. Wenn das Glykolsäurecopolymer in Kombination mit Polymilchsäure verwendet wird, kann das Verhältnis Glykolsäurecopolymer/Polymilchsäure (Gew.-%) zum Beispiel etwa 10/90 bis etwa 90/10 betragen. Das bevorzugte Verhältnis ist etwa 20/80 bis etwa 80/20 und das bevorzugteste Verhältnis ist etwa 30/70 bis etwa 70/30.
Die in dieser Beschreibung verwendeten Ausdrücke „Gewichtsmittel des Molekulargewichts" und „Zahlenmittel des Molekulargewichts" bedeuten das Polystyroläquivalent des Molekulargewichtsmittels und das Zahlenmittel des Molekulargewichts der Probe, das durch Gelpermeationschromatographie (GPC) unter Ver wenden von 9 Polystyrolstandards mit Gewichtsmitteln des Molekulargewichts von 120000, 52000, 22000, 9200, 5050, 2950, 1050, 580 und 162 bestimmt wurde. Diese Bestimmungen können mittels einer GPC-Säule KF804L × 2 (Showa Denko K. K.), einem RI Monitor L-3300 (Hitachi, Ltd.) und Chloroform als mobiler Phase durchgeführt werden.
In der vorliegenden Erfindung weisen die durch die dehydratisierende Polykondensationsreaktion in Abwesenheit eines Katalysators synthetisierten bioabbaubaren Polymeren am Ende freie Carboxygruppen auf.
Derartige bioabbaubare Polymeren mit freien Carboxygruppen am Ende weisen einen engen Zusammenhang zwischen dem durch titrimetrische Endgruppenbestimmung ermittelten Zahlenmittel des Molekulargewichts und dem durch GPC-Bestimmung unter Verwenden von Polystyrolstandards mit bekanntem Molekulargewicht wie vorstehend beschrieben bestimmten Zahlenmittel des Molekulargewichts auf.
Durch das Endgruppenbestimmungsverfahren kann das Zahlenmittel des Molekulargewichts auf die folgende Weise bestimmt werden.
Etwa 1 g bis 3 g bioabbaubares Polymer werden in einem Lösungsmittelgemisch aus Aceton (25 ml) und Methanol (5 ml) gelöst und die Carboxygruppen in der Lösung werden rasch mit 0,05 N alkoholischer Kaliumhydroxidlösung mittels Phenolphthalein als Indikator unter Rühren bei Raumtemperatur (etwa 0 bis etwa 30°C) titriert. Das Zahlenmittel des Molekulargewichts wird durch die folgende Gleichung berechnet.
Zahlenmittel des Molekulargewichts durch Endgruppenbestimmung = 20000 (A/B)
A: Massengewicht (g) bioabbaubares Polymer
B: bis zum Erreichen des Endpunkts zugesetzte Menge (ml) 0,05 N alkoholische KOH-Lösung
Im Falle eines bioabbaubaren Polymers mit freien Carboxygruppen am Ende, das aus einer oder mehreren Arten α-Hydroxysäuren durch dehydratisierende Poly kondensation in Abwesenheit eines Katalysators synthetisiert wurde, wird zwischen dem durch GPC-Bestimmung ermittelten Zahlenmittel des Molekulargewichts und dem durch Endgruppenbestimmung ermittelten Zahlenmittel des Molekulargewichts ein enger Zusammenhang gefunden. Im Gegensatz dazu wird im Falle eines bioabbaubaren Polymers, das aus dem cyclischen Dimer einer α-Hydroxysäure durch das Verfahren der ringöffnenden Polymerisation unter Verwenden eines Katalysators hergestellt wurde, mit im wesentlichen keinen freien Carboxygruppen am Ende gefunden, daß das durch Endgruppenbestimmung gefundene Zahlenmittel des Molekulargewichts beträchtlich höher als das durch GPC gefundene Zahlenmittel des Molekulargewichts ist. Wegen dieses Unterschieds kann ein bioabbaubares Polymer mit freien Carboxygruppen am Ende leicht von einem bioabbaubaren Polymer ohne freie Carboxygruppen am Ende unterschieden werden.
Während das durch die Endgruppenbestimmung gefundene Zahlenmittel des Molekulargewichts ein absoluter Wert ist, ist das durch GPC-Bestimmung gefundene Zahlenmittel des Molekulargewichts ein relativer Wert, der von vielen Veränderlichen wie etwa analytischen Verfahren und Bedingungen (z. B. die Typen mobile Phase und Säule, Bezugsstandard, Wahl der Schlitzbreite, Wahl der Grundlinie usw.) abhängt, und ist daher kaum zu verallgemeinern. Es besteht jedoch ein enger Zusammenhang zwischen dem durch Endgruppenbestimmung gefundenen Zahlenmittel des Molekulargewichts und dem durch GPC-Bestimmung gefundenen Zahlenmittel des Molekulargewichts, wenn der aus der Endgruppenbestimmung gefundene Wert innerhalb des Bereichs etwa des 0,5- bis etwa 2,0fachen des durch die GPC-Bestimmung gefundenen Werts liegt. Der bevorzugte Bereich ist etwa das 0,8- bis etwa 1,5fache. Daß das durch Endgruppenbestimmung gefundene Zahlenmittel des Molekulargewichts „beträchtlich höher" als das durch GPC-Bestimmung gefundene Zahlenmittel des Molekulargewichts ist, bedeutet, daß der durch Endgruppenbestimmung gefundene Wert mehr als etwa das zweifache des durch GPC-Bestimmung gefundenen Werts ist.
In der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Polymeren die, die eine enge Beziehung zwischen dem durch Endgruppenbestimmung gefundenen Zahlenmittel des Molekulargewichts und dem durch GPC-Bestimmung gefundenen Zahlenmittel des Molekulargewichts zeigen.
Die Metallsalze, die zum Umwandeln eines bioabbaubaren Polymers in sein Metallsalz verwendet werden können, sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie in vivo keine schlechten Einflüsse ausüben. Das Metallsalz schließt ein durch ein einwertiges Metall wie etwa Alkalimetalle (z. B. Natrium, Kalium usw.) oder Erdalkalimetalle (z. B. Calcium, Magnesium usw.) oder ein mehrwertiges Metall wie etwa Zink(II), Eisen(II, III), Kupfer(II), Zinn(II, IV) und Aluminium(II, III) mit einer anorganischen Säure oder einer organischen Säure gebildetes Salz ein.
Das Metall ist vorzugsweise ein mehrwertiges Metall und bevorzugter Erdalkalimetalle und Zink. Besonders bevorzugte Metalle sind Calcium und Zink.
Anorganische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, schließen einen Halogenwasserstoff (z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure), Schwefelsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure und so weiter ein.
Organische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, schließen aliphatische Carbonsäuren und aromatische Säuren ein. Bevorzugte aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische C_1-9-Carbonsäuren, z. B. aliphatische Monocarbonsäuren, aliphatische Dicarbonsäuren und aliphatische Tricarbonsäuren. Die aliphatischen Carbonsäuren können gesättigt oder ungesättigt sein.
Die aliphatischen Monocarbonsäuren schließen gesättigte, aliphatische C_1-9-Monocarbonsäuren (z. B. Kohlensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Valeriansäure, Capronsäure, Önanthsäure, Caprylsäure, Pelargonsäure, Caprinsäure usw.) und ungesättigte, aliphatische C_2-9-Carbonsäuren (z. B. Acrylsäure, Propiolsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure, Isocrotonsäure usw.) ein.
Die aliphatischen Dicarbonsäuren schließen gesättigte, aliphatische C_2-9-Dicarbonsäuren (z. B. Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Pimelinsäure usw.) und ungesättigte, aliphatische C_2-9-Dicarbonsäuren (z. B. Maleinsäure, Fumarsäure, Citraconsäure, Mesaconsäure usw.) ein.
Die aliphatischen Tricarbonsäuren schließen gesättigte, aliphatische C_2-9-Tricarbonsäuren (z. B. Tricarballylsäure, 1,2,3-Butantricarbonsäure usw.) ein.
Die vorstehend angeführten aliphatischen Carbonsäuren können außerdem 1 oder 2 Hydroxygruppen aufweisen. Anschauungsbeispiele sind Glykolsäure, Milchsäure, Glycerinsäure, Tartronsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Citronensäure und so weiter.
Bevorzugte aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische Monocarbonsäuren. Bevorzugtere aliphatische Carbonsäuren sind aliphatische C_2-9-Monocarbonsäuren. Besonders bevorzugt sind gesättigte, aliphatische C_2-3-Monocarbonsäuren. Die bevorzugteste aliphatische Carbonsäure schließt Essigsäure ein.
Aromatische Säuren, die bei der Metallsalzbildung verwendet werden können, schließen Benzoesäure, Salicylsäure und Phenolsulfonsäure ein.
Das Metallsalz des bioabbaubaren Polymers kann auch durch Verwenden des Acetylacetonats oder Oxids der vorstehend angeführten mehrwertigen Metalle erhalten werden. Bevorzugte Metalldonoren dieses Typs sind Zinkacetylacetonat und Zinkoxid.
Metallsalze, die zum Umwandeln eines bioabbaubaren Polymers in sein Metallsalz verwendet werden können, sind vorzugsweise die durch ein mehrwertiges Metall mit einer organischen oder anorganischen Säure (hierin nachstehend als mehrwertiges Metallsalz bezeichnet) gebildeten Salze.
Mehrwertige Metallsalze, die verwendet werden können, schließen Zinksalze mit einer anorganischen Säure, z. B. Zinkhalogenide (z. B. Zinkchlorid, Zinkbromid, Zinkiodid, Zinkfluorid), Zinksulfat, Zinknitrat, Zinkthiocyanat usw., Zinksalze mit einer organischen Säure, z. B. Zinksalze einer aliphatischen Carbonsäure (z. B. Zinkcarbonat, Zinkacetat, Zinkglykolat, Zinklactat, Zinktartrat usw.), aromatische Zinksalze (z. B. Zinkbenzoat, Zinksalicylat, Zinkphenolsulfonat usw.), Calciumsalze mit einer anorganischen Säure, z. B. ein Calciumhalogenid (z. B. Calciumchlorid, Calciumbromid, Calciumiodid, Calciumfluorid usw.), Calciumsulfat, Calciumnitrat, Calciumthiocyanat usw., Calciumsalze mit einer organischen Säure, z. B. ein Calciumsalz einer aliphatischen Carbonsäure (z. B. Calciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumpropionat, Calciumoxalat, Calciumtartrat, Calciumlactat, Calciumcitrat, Calciumgluconat usw.) und aromatische Calciumsalze (z. B. Calciumbenzoat, Calciumsalicylat usw.) ein.
Das bevorzugte mehrwertige Metallsalz schließt Zinkacetat und Calciumacetat ein.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten bioaktiven Polypeptide schließen bioaktive Polypeptide mit Molekulargewichten von etwa 1000 bis etwa 50000, vorzugsweise etwa 5000 bis etwa 40000 ein.
Die repräsentative Aktivität des bioaktiven Peptids in der vorliegenden Erfindung ist die hormonelle Aktivität. Die bioaktiven Polypeptide können natürliche Produkte, synthetische Produkte, halbsynthetische Produkte und ihre Derivate sein. Die Wirkungsweise des bioaktiven Polypeptids kann agonistisch oder antagonistisch sein.
Das bioaktive Polypeptid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließt Peptidhormone, Cytokine, Blutbildungsfaktoren, verschiedene Wachstumsfaktoren und Enzyme ein.
Die bioaktiven Polypeptidhormone schließen Insulin, Wachstumshormon, natriuretische Peptide, Gastrin, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), Luteinisierungshormon (LH), Follikelstimulierendes Hormon (FSH), humanes Choriongonadotropin (HCG) und Motilin ein. Die bevorzugten Hormone sind Insulin und Wachstumshormon.
Die bioaktiven Polypeptidcytokine schließen Lymphokine und Monokine ein. Die Lymphokine schließen Interferone (alpha, beta und gamma) und Interleukine (IL-2 bis IL-12) ein. Die Monokine schließen Interleukin-1 (IL-1) und den Tumornekrosefaktor ein. Das bevorzugte Cytokin ist ein Lymphokin und bevorzugter Interferon. Das besonders bevorzugte Cytokin ist Interferon-α.
Die Blutbildungsfaktoren als bioaktives Polypeptid schließen Erythropoietin, Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), Thrombopoietin, aus Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor und Megakaryozytenverstärker ein.
Die Wachstumsfaktoren als bioaktives Polypeptid schließen basische und saure Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF) und ihre Familien (z. B. FGF-9), Nervenwachstumsfaktor (NGF) und seine Familie, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (z. B. IGF-1, IGF-2 usw.) und Knochenmorphogeneseprotein (BMP) und Familie ein.
Die Enzyme als bioaktives Polypeptid schließen Superoxiddismutase (SOD), Gewebeplasminogenaktivator (TPA) und Kallikrein ein.
Wenn das bioaktive Polypeptid ein Metall enthält, ist der Metallgehalt des bioaktiven Polypeptids in der vorliegenden Erfindung vorzugsweise nicht größer als 0,1%, bevorzugter nicht größer als 0,01% und am bevorzugtesten nicht größer als 0,001%. Somit sind im wesentlichen metallfreie, bioaktive Polypeptide für die vorliegende Erfindung am besten geeignet. Kristallines Insulin enthält zum Beispiel üblicherweise kleine Mengen Schwermetalle wie etwa Zink, Nickel, Kobalt und Cadmium. 0,4% (Gew./Gew.) Zink enthaltendes Insulin liegt als stabiles Hexamer vor und scheint bei der Wechselwirkung mit dem bioabbaubaren Polymermetallsalz verhältnismäßig inert zu sein.
Nötigenfalls können die in dem bioaktiven Polypeptid auftretenden Metalle zuvor durch bekannte Verfahren aus dem Polypeptid entfernt werden. Zum Beispiel umfaßt ein bekanntes Verfahren das Dialysieren einer wäßrigen Salzsäurelösung von Insulin gegen Wasser oder eine wäßrige Ammoniumacetatlösung und Lyophilisieren des Dialysats unter Liefern amorphen Insulins mit minimalem Metallgehalt.
In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß andere Additive als das bioabbaubare Polymermetallsalz in der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung kein Metallsalz bilden.
Das bioabbaubare Polymermetallsalz in der vorliegenden Erfindung kann durch Emulgieren und Dispergieren einer wäßrigen Lösung oder festen Form eines Metallsalzes in einer Lösung eines bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel unter Herstellen einer Wasser/Öl- (W/O) oder Öl/Wasser-Emulsion (O/W) oder einer organischen Lösung oder Suspension eines ein Metallsalz enthaltenden bioabbaubaren Polymers hergestellt werden. Die sich daraus ergebenden Substanzen werden gewaschen und getrocknet oder einem In-Wasser-Trocknungsverfahren, Phasentrennungsverfahren, Sprühtrocknungsverfahren oder dergleichen unter Waschen und Trocknen unterzogen. Das Metallsalz, das nicht an der Bildung eines Salzes mit dem bioabbaubaren Polymer in diesem Verfahren beteiligt ist, wird vorzugsweise entfernt.
Das vorstehend angeführte organische Lösungsmittel weist vorzugsweise einen 120°C nicht überschreitenden Siedepunkt auf. Derartige organische Lösungsmittel schließen halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff usw.), Alkohole (z. B. Ethanol, Methanol usw.), Acetonitril und so weiter ein. Diese Lösungsmittel können auch als Gemisch verwendet werden. Die bevorzugten organischen Lösungsmittel sind Dichlormethan und Acetonitril. Besonders bevorzugt ist Dichlormethan.
Der Metallgehalt des bioabbaubaren Polymermetallsalzes ist vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 10% (Gew./Gew.), bevorzugter etwa 0,05 bis etwa 7% (Gew./Gew.) und am bevorzugtesten etwa 0,1 bis etwa 5% (Gew./Gew.). Der Metallgehalt eines bioabbaubaren Polymermetallsalzes kann durch Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt werden.
Verfahren zum Herstellen eines bioabbaubaren Polymermetallsalzes (z. B. In-Wasser-Trocknungsverfahren, Phasentrennungsverfahren und Sprühtrocknungsverfahren) werden nachstehend beschrieben.
(A) In-Wasser-Trocknungsverfahren (Wasser/Öl/Wasser- oder W/O/W-Verfahren)
Bei diesem Verfahren wird das bioabbaubare Polymer zuerst in einem organischen Lösungsmittel unter Herstellen einer Lösung eines organischen Lösungsmittels (hierin nachstehend manchmal als Ölphase bezeichnet) gelöst. Die Kon zentration des bioabbaubaren Polymers in dieser Lösung eines organischen Lösungsmittels wird geeigneterweise entsprechend dem Molekulargewicht des Polymers und der Art des verwendeten organischen Lösungsmittels gewählt. Zum Beispiel kann die Konzentration des bioabbaubaren Polymers in dem organischen Lösungsmittel etwa 0,01 bis etwa 90% (Gew./Gew.), vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 80% (Gew./Gew.) und bevorzugter etwa 1 bis etwa 70% (Gew./Gew.) sein. Als interne wäßrige Phase wird eine wäßrige Metallsalzlösung verwendet. Die Metallsalzkonzentration kann von etwa 10 bis etwa 90% (Gew./Vol.) und vorzugsweise etwa 20 bis etwa 80% (Gew./Vol.) betragen. Die Metallsalzkonzentration hängt jedoch von der Löslichkeit des Metallsalzes in Wasser ab. Die vorstehende wäßrige Metallsalzlösung wird in der Lösung des bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel unter Liefern einer W/O-Emulsion dispergiert und emulgiert. Das Volumenverhältnis der wäßrigen Lösung der Metallsalze in der Lösung des bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel ist etwa 1 : 1000 bis etwa 1 : 1, bevorzugt etwa 1 : 100 bis etwa 1 : 2 und am bevorzugtesten etwa 1 : 50 bis etwa 1 : 3. Die Emulgierung kann durch herkömmliche Emulgierungsverfahren wie etwa mittels eines Turbinenmischers, eines Homogenisators oder dergleichen bewerkstelligt werden.
Die auf diese Weise erhaltene W/O-Emulsion wird anschließend einer wäßrigen Phase (die äußere wäßrige Phase) unter Ergeben einer W/O/W-Emulsion zugefügt. Anschließend wird das Ölphasen-Lösungsmittel unter Liefern des gewünschten bioabbaubaren Polymermetallsalzes abgedampft. Das Volumen der äußeren wäßrigen Phase kann aus dem Bereich von zum Beispiel etwa dem 1- bis 10000fachen Volumen der Ölphase gewählt werden. Der bevorzugte Bereich ist etwa das 2- bis etwa 5000fache und der bevorzugteste Bereich ist etwa das 5- bis etwa 2000fache. Die Verdampfung des Lösungsmittels kann durch gemeinhin angewendete Verfahren einschließlich des Verfahrens, bei dem das Lösungsmittel unter normalem oder allmählich verringertem Druck unter Rühren mittels eines Propellerrührers oder Magnetrührers usw. verdampft wird und des Verfahrens, bei dem das Lösungsmittel verdampft wird, während die Höhe des Vakuums mittels eines Rotationsverdampfers eingestellt wird, und so weiter bewerkstelligt werden.
Der äußeren wäßrigen Phase kann ein Emulgator zugesetzt werden. Der Emulgator kann irgendeine Substanz sein, die stabile W/O/W-Emulsionen liefern kann. Beispiele derartiger Emulgatoren schließen anionische Tenside, nichtionische Tenside, Polyoxyethylen-Rizinusölderivate, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Carboxymethylcellulose, Lecithin, Gelatine, Hyaluronsäure und so weiter ein. Der bevorzugte Emulgator ist Polyvinylalkohol. Mehrere Emulgatoren in Kombination können ebenfalls in der äußeren wäßrigen Phase verwendet werden. Die Konzentration des Emulgators bezogen auf die äußere wäßrige Phase kann aus dem Bereich von etwa 0,001 bis etwa 20% (Gew./Gew.) gewählt werden. Der bevorzugte Bereich ist etwa 0,01 bis etwa 10% (Gew./Gew.) und der noch mehr bevorzugte Bereich ist etwa 0,05 bis etwa 5% (Gew./Gew.).
Ein Metallsalz, das dem in der inneren wäßrigen Phase enthaltenen Metallsalz ähnlich oder davon verschieden ist, kann der äußeren wäßrigen Phase ebenfalls zugesetzt werden. In derartigen Fällen wird vorzugsweise ein Fettsäuremetallsalz in einer solchen Menge zugesetzt, daß die Konzentration des Metallsalzes in der äußeren wäßrigen Phase etwa 0,01 bis 20% (Gew./Gew.) oder vorzugsweise etwa 0,1 bis 10% (Gew./Gew.) beträgt. Durch sorgfältige Wahl der Konzentration des Metallsalzes in der äußeren wäßrigen Phase kann die Überführung des in der inneren wäßrigen Phase verwendeten Metallsalzes aus dem bioabbaubaren Polymer in die äußere wäßrige Phase verhindert werden.
Das auf diese Weise hergestellte bioabbaubare Polymermetallsalz wird durch Zentrifugieren oder Filtration isoliert, mehrmals mit destilliertem Wasser zum Entfernen des Emulgators und anderer Abscheidungen von der Salzoberfläche gewaschen, anschließend in destilliertem Wasser erneut dispergiert und lyophilisiert.
(B) In-Wasser-Trocknungsverfahren (O/W-Verfahren)
Bei diesem Verfahren wird zuerst eine Lösung des bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel wie bei Verfahren (A) hergestellt.
Anschließend wird das Metallsalz zugefügt und in der Lösung des bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel dispergiert oder gelöst. Das Verhältnis von Metallsalz zu bioabbaubarem Polymer (in Gewicht) ist etwa 5 : 1 bis etwa 1 : 100, vorzugsweise etwa 2 : 1 bis etwa 1 : 50 und bevorzugter etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 10.
Die auf diese Weise erhaltene Lösung eines organischen Lösungsmittels wird anschließend in eine wäßrige Phase gegossen und mittels eines Turbinenmischers oder dergleichen wird eine O/W-Emulsion hergestellt. Anschließend wird das Ölphasen-Lösungsmittel wie bei Verfahren (A) unter Liefern des bioabbaubaren Polymermetallsalzes verdampft. Das Volumen der wäßrigen Phase beruht auf dem Volumen der Ölphase und wird aus dem Bereich von zum Beispiel etwa dem 1- bis etwa 10000fachen Volumen der Ölphase oder bevorzugt etwa dem 2- bis etwa 5000fachen ausgewählt. Der bevorzugteste Bereich ist etwa das 5- bis etwa 2000fache.
Wie bei Verfahren (A) kann dieser wäßrigen Phase ein Emulgator zugesetzt werden.
Der wäßrigen Phase kann ein Metallsalz zugesetzt werde, das dem Metallsalz, das in der Ölphase dispergiert oder gelöst ist, ähnlich oder davon verschieden ist.
Das auf diese Weise hergestellte bioabbaubare Polymermetallsalz wird wie bei Verfahren (A) abgetrennt, gewaschen und lyophilisiert.
(C) Phasentrennungsverfahren (Koazervationsverfahren)
Zur Herstellung eines bioabbaubaren Polymetallsalzes durch dieses Verfahren wird ein Koazervierungsmittel allmählich der in Verfahren (A) verwendeten W/O-Emulsion oder der in Verfahren (B) verwendeten, das Metallsalz enthaltenden Lösung des bioabbaubaren Polymers in dem organischen Lösungsmittel unter Rühren zum Ausfällen und Verfestigen des bioabbaubaren Polymermetallsalzes zugefügt. Die verwendete Menge des Koazervierungsmittels beruht auf dem Volumen der W/O-Emulsion oder der Lösung des bioabbaubaren Polymers in dem organischen Lösungsmittel. Das verwendete Volumen ist etwa das 0,01- bis etwa 1000fache des Volumens der W/O-Emulsion oder der organischen Lösung des bioabbaubaren Polymers, vorzugsweise etwa das 0,05fache bis etwa 500fache und bevorzugter etwa das 0,1- bis etwa 200fache.
Das Koazervierungsmittel kann eine Substanz sein, die einer der Kategorien Polymere, Mineralöle oder Pflanzenöle angehört, die mit dem zum Lösen des bioabbaubaren Polymers verwendeten organischen Lösungsmittel mischbar sind, in denen das bioabbaubare Polymer aber nicht merklich löslich ist. Typische Beispiele sind Silikonöl, Sesamöl, Sojabohnenöl, Maisöl, Baumwollsamenöl, Kokosnußöl, Leinsamenöl, Mineralöl, n-Hexan, n-Heptan und so weiter. Die Koazervierungsmittel können in einer Kombination zweier oder mehrerer Arten verwendet werden.
Das auf diese Weise hergestellte bioabbaubare Polymermetallsalz wird durch Filtration isoliert und wiederholt mit Heptan oder dergleichen zum Entfernen des Koazervierungsmittels gewaschen. Das Salz wird anschließend wie bei Verfahren (A) gewaschen und lyophilisiert.
Bei der Herstellung eines bioabbaubaren Polymermetallsalzes durch das In-Wasser-Trocknungsverfahren oder Koazervierungsverfahren kann zum Verhindern einer Agglomeration der Teilchen ein Antiausflockmittel zugesetzt werden. Antiausflockmittel, die verwendet werden können, schließen wasserlösliche Polysaccharide wie etwa Mannit, Lactose, Glucose und Stärken (z. B. Maisstärke), Hyaluronsäure und ihr Alkalimetallsalz, Glycin, ein Protein wie etwa Fibrin, Kollagen und ein anorganisches Salz wie etwa Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat und so weiter ein.
(D) Sprühtrocknungsverfahren
Zur Herstellung eines bioabbaubaren Polymermetallsalzes durch dieses Verfahren wird entweder eine aus einer wäßrigen Lösung des Metallsalzes und einer Lösung des bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel hergestellte W/O-Emulsion oder eine Lösung oder Suspension des das Metallsalz enthaltenden bioabbaubaren Polymers in einem organischen Lösungsmittel über eine Düse in die Trockenkammer eines Sprühtrockners unter Verflüchtigen des organischen Lösungsmittels in feine Tröpfchen in sehr kurzer Zeit gesprüht und es wird ein feines bioabbaubares Polymermetallsalz erzeugt. Beispiele der vorstehend angeführten Düse sind eine Doppelfluiddüse, eine Druckdüse und Drehscheibendüse. Eine wäßrige Lösung des vorstehend beschriebenen Antiausflockmittels kann auch über eine weitere Düse versprüht werden, um die Agglomeration eines bio abbaubaren Polymermetallsalzes mit der W/O-Emulsion oder der Lösung des organischen Lösungsmittels oder Suspension des das Metallsalz enthaltenden bioabbaubaren Polymers zu verhindern. Das auf diese Weise hergestellte bioabbaubare Polymermetallsalz wird wie bei Verfahren (A) gewaschen und nötigenfalls weiter dem Entfernen von Wasser und organischem Lösungsmittel unter Erhitzen und verringertem Druck unterzogen.
Die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung der vorliegenden Erfindung kann durch Dispergieren eines bioaktiven Polypeptids in einem das bioabbaubare Polymermetallsalz enthaltenden organischen Lösungsmittel und Unterziehen der sich daraus ergebenden Dispersion dem Formgeben hergestellt werden. Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann bei dem vorstehend beschriebenen (A) In-Wasser-Trocknungsverfahren (W/O/W-Verfahren), (B) In-Wasser-Trocknungsverfahren (O/W-Verfahren), (C) Phasentrennungsverfahren (Koazervierungsverfahren), (D) Sprühtrocknungsverfahren oder irgendeiner Abänderung davon angewendet werden. Das organische Lösungsmittel in der Lösung des organischen Lösungsmittels ist vorzugsweise ein Lösungsmittel mit einem Siedepunkt, der nicht höher als 120°C ist. Ein derartiges organisches Lösungsmittel schließt unter anderem halogenierte Kohlenwasserstoffe (z. B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff usw.), Alkohole (z. B. Ethanol, Methanol, 1,4-Butandiol, 1,5-Pentandiol usw.) und Acetonitril ein. Jedes Lösungsmittel kann zusammen als Gemisch verwendet werden. Wenn ein einziges organisches Lösungsmittel eingesetzt werden soll, ist Dichlormethan oder Acetonitril besonders bevorzugt. Wenn ein Gemisch organischer Lösungsmittel eingesetzt werden soll, ist eine Kombination aus einem halogenierten Kohlenwasserstoff (z. B. Dichlormethan) mit Acetonitril oder einem Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol usw.) bevorzugt. In vielen Fällen ist eine Kombination aus Dichlormethan mit Acetonitril besonders bevorzugt. Das Verhältnis (in Volumen) des halogenierten Kohlenwasserstoffs zu entweder Acetonitril oder Alkohol ist etwa 40 : 1 bis etwa 1 : 1 und vorzugsweise etwa 20 : 1 bis etwa 1 : 1.
Das Herstellungsverfahren für eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung wird nun unter Verwenden von Mikrokapseln als Beispiel beschrieben.
(i) In-Wasser-Trocknungsverfahren (W/O/W-Verfahren)
Bei diesem Verfahren wird zuerst eine Lösung des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in einem organischen Lösungsmittel wie vorstehend bei Verfahren (A) beschrieben hergestellt. Die Konzentration des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in der Lösung des organischen Lösungsmittels hängt vom Typ und Molekulargewicht des bioabbaubaren Polymermetallsalzes und dem Typ des organischen Lösungsmittels ab. Das Verhältnis des bioabbaubaren Polymermetallsalzes zu dem organischen Lösungsmittel kann zum Beispiel etwa 0,01 bis etwa 80% (Gew./Gew.) sein und ist vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 70% (Gew./Gew.) und am bevorzugtesten etwa 1 bis etwa 60% (Gew./Gew.). Für die innere wäßrige Phase wird eine wäßrige Lösung des bioaktiven Polypeptids verwendet. Die Konzentration des bioaktiven Polypeptids in der wäßrigen Lösung kann zum Beispiel etwa 0,1% (Gew./Vol.) bis etwa 500% (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 1% (Gew./Vol.) bis etwa 400% (Gew./Vol.) und bevorzugter etwa 10% (Gew./Vol.) bis etwa 300% (Gew./Vol.) betragen. Dieser wäßrigen Lösung können ein pH-Einstellungsmittel (z. B. Essigsäure, Salzsäure, Natriumhydroxid usw.), Stabilisatoren (z. B. Serumalbumin, Gelatine usw.) und/oder Konservierungsmittel (z. B. p-Hydroxybenzoesäureester usw.) zugesetzt werden. Die auf diese Weise erhaltene wäßrige Lösung wird in der Lösung des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in einem organischen Lösungsmittel unter Liefern einer W/O-Emulsion dispergiert.
Das Verhältnis (Vol./Vol.) der wäßrigen Lösung des bioaktiven Polypeptids zur Lösung des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in einem organischen Lösungsmittel ist etwa 1 : 1000 bis etwa 1 : 1, bevorzugt etwa 1 : 100 bis etwa 1 : 5 und bevorzugter etwa 1 : 50 bis etwa 1 : 5. Die auf diese Weise erhaltene W/O-Emulsion wird anschließend unter Ergeben einer W/O/W-Emulsion in eine wäßrige Phase (äußere wäßrige Phase) gegossen und das Lösungsmittel in der Ölphase wird unter Liefern von Mikrokapseln verdampft. Der äußeren wäßrigen Phase kann ein Emulgator zugesetzt werden. Der Emulgator kann jede Substanz sein, die allgemein eine stabile W/O/W-Emulsion liefern kann. Insbesondere können anionische Tenside, nichtionische Tenside, Polyoxyethylen-Rizinusöl-Derivate, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Carboxymethylcellulose, Lecithin, Gelatine, Hyaluronsäure usw. eingesetzt werden. Der bevorzugte Emulgator ist Polyvinylalkohol. Zwei oder mehr Arten Emulgatoren können in Kombination verwendet werden. Die Konzentration des Emulgators bezogen auf die äußere wäßrige Phase wird aus einem Bereich von etwa 0,001% (Gew./Gew.) bis etwa 20% (Gew./Gew.), vorzugsweise etwa 0,01% (Gew./Gew.) bis etwa 10% (Gew./Gew.) und bevorzugter etwa 0,05% (Gew./Gew.) bis etwa 5% (Gew./Gew.) ausgewählt. Ein Metallsalz, sei es dasselbe wie das der inneren wäßrigen Phase zugesetzte Salz oder ein unterschiedliches Salz, kann der äußeren wäßrigen Phase zugesetzt werden. Bei diesem Verfahren wird vorzugsweise ein Fettsäuremetallsalz zugefügt, so daß die Metallsalzkonzentration der äußeren wäßrigen Phase etwa 0,01% bis etwa 20% (Gew./Gew.) und vorzugsweise etwa 0,1% bis etwa 10% (Gew./Gew.) ist. Durch Ändern der Metallsalzkonzentration der äußeren wäßrigen Phase kann das in der inneren wäßrigen Phase verwendete Metallsalz daran gehindert werden, aus dem bioabbaubaren Polymer in die äußere wäßrige Phase zu wandern.
Die auf diese Weise hergestellten Mikrokapseln werden durch Zentrifugieren oder Filtration isoliert, zum Entfernen des Emulgators und anderer Ablagerungen von der Kapseloberfläche wiederholt mit Wasser gewaschen, anschließend in destilliertem Wasser oder dergleichen erneut dispergiert und lyophilisiert. Anschließend werden nötigenfalls restliches Wasser und organisches Lösungsmittel in den Mikrokapseln durch Erhitzen unter verringertem Druck weiter entfernt. Die Mikrokapseln werden bei einer Temperatur nicht unter der Glasübergangstemperatur des bioabbaubaren Polymers und nicht so hoch, daß sie eine Aggregation der Mikrokapseln verursacht, erhitzt. Die Erhitzungstemperatur wird bevorzugt innerhalb des Bereichs von der Glasübergangstemperatur des bioabbaubaren Polymers bis etwa 30°C höher als die Glasübergangstemperatur des bioabbaubaren Polymers gewählt. Hier ist die Glasübergangstemperatur als die Zwischenglasübergangstemperatur definiert, die mittels eines Differentialscanningkalorimeters bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 10 oder 20°C je Minute bestimmt wurde.
(ii) In-Wasser-Trocknungsverfahren (O/W-Verfahren)
Bei diesem Verfahren wird zuerst eine Lösung des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in einem organischen Lösungsmittel auf dieselbe Weise wie bei Verfahren (A) hergestellt. Die Konzentration des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in dem organischen Lösungsmittel kann der bei Verfahren (i) beschriebenen ähnlich ein. Der auf diese Weise erhaltenen Lösung des bioabbaubaren Polymermetallsalzes in einem organischen Lösungsmittel wird zum Herstellen einer das bioabbaubare Polymermetallsalz und bioaktive Peptid enthaltenden Lösung oder Suspension eines organischen Lösungsmittel ein bioaktives Polypeptid zugefügt und gelöst oder dispergiert. Das Gewichtsverhältnis des bioaktiven Polypeptids zu dem bioabbaubaren Polymermetallsalz kann zum Beispiel etwa 1 : 1000 bis etwa 1 : 1, vorzugsweise etwa 1 : 200 bis etwa 1 : 5 und bevorzugter etwa 1 : 100 bis etwa 1 : 5 sein.
Diese, das bioabbaubare Polymermetallsalz und bioaktive Polypeptid enthaltende Lösung eines organischen Lösungsmittels wird zum Herstellen einer O/W-Emulsion in eine wäßrige Phase gegossen. Das Lösungsmittel in der Ölphase wird anschließend unter Liefern von Mikrokapseln abgedampft.
Die auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln werden wie bei Verfahren (i) isoliert, gewaschen und lyophilisiert. Danach können die Mikrokapseln zum Entfernen restlichen Wassers und organischen Lösungsmittels wie bei Verfahren (i) unter verringertem Druck erhitzt werden.
(iii) Phasentrennungsverfahren
Bei der Herstellung von Mikrokapseln durch dieses Verfahren wird derselben wie bei Verfahren (i) verwendeten W/O-Emulsion oder derselben wie bei Verfahren (ii) verwendeten Lösung des bioabbaubaren Polymermetallsalzes und bioaktiven Polypeptids in einem organischen Lösungsmittel ein Koazervierungsmittel unter Rühren auf dieselbe Weise wie bei Verfahren (C) unter Liefern ausgefällter und verfestigter Mikrokapseln allmählich zugefügt.
Die auf diese Weise hergestellten Mikrokapseln werden isoliert und zum Entfernen des Koazervierungsmittels und freien bioaktiven Polypeptids wie bei Verfahren (C) gewaschen. Anschließend werden nötigenfalls das restliche Wasser und organische Lösungsmittel in den Mikrokapseln durch Erhitzen unter verringertem Druck in derselben Weise wie bei Verfahren (i) entfernt.
Bei der Herstellung von Mikrokapseln durch das In-Wasser-Trocknungsverfahren oder Phasentrennungsverfahren kann ein Antiausflockmittel zum Verhindern des Agglomerierens von Teilchen wie bei Verfahren (C) zugesetzt werden.
(iv) Sprühtrocknungsverfahren
Bei der Herstellung von Mikrokapseln durch dieses Verfahren wird dieselbe wie bei Verfahren (i) verwendete W/O-Emulsion oder dasselbe wie bei Verfahren (ii) verwendete, das bioabbaubare Polymermetallsalz und bioaktive Polypeptid enthaltende Lösung eines organischen Lösungsmittels über eine Düse in derselben Weise wie bei Verfahren (D) unter Liefern von Mikrokapseln versprüht.
Nötigenfalls werden die auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln zum Entfernen restlichen Wassers und organischen Lösungsmittels wie bei Verfahren (i) unter verringertem Druck erhitzt.
Bei der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß die Wirksamkeit des Einschlusses eines bioaktiven Polypeptids in ein bioabbaubares Polymer über 50% ist.
Die Konzentration des von der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung in der vorliegenden Erfindung umfaßten bioaktiven Polypeptids ist zum Beispiel etwa 0,001 bis etwa 30% (Gew./Gew.), vorzugsweise etwa 0,02 bis 20% (Gew./Gew.), bevorzugter etwa 0,1 bis etwa 10% (Gew./Gew.) und am bevorzugtesten etwa 0,5 bis etwa 5% (Gew./Gew.).
Die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung kann in Form von Mikrokapseln oder in verschiedenen Dosierungsformen wie etwa nicht-orale Zubereitungen (z. B. eine intramuskulär, subkutan oder viszeral injizierbare oder per Dauerkatheter verabreichbare Zubereitung; eine nasal, rektal oder über die Uterusschleimhaut verabreichbare Zubereitung) oder orale Zubereitungen (z. B. Kapseln wie etwa eine harte Kapsel und weiche Kapsel, feste Zubereitungen wie etwa als Granulat und Pulver, flüssige Zubereitungen wie etwa eine Suspension) verabreicht werden.
Die besonders bevorzugte Zubereitung mit verzögerter Freisetzung ist eine Injektion. Zum Herstellen einer Injektion unter Verwenden der vorstehend erhaltenen Mikrokapseln können die Mikrokapseln mit einem Dispergiermittel (z. B. Tenside wie etwa Tween 80, HCO-60, Polysaccharide wie etwa Carboxymethylcellulose, Natriumalginat, Natriumhyaluronat, Protaminsulfat, Polyethylenglykol 400 usw.), einem Konservierungsmittel (z. B. Methylparaben, Propylparaben usw.), einem Isotoniemittel (z. B. Natriumchlorid, Mannit, Sorbit, Glucose usw.) und einem Lokalanästhetikum (z. B. Xylocainhydrochlorid, Chlorbutanol usw.) unter Liefern einer wäßrigen Suspension formuliert werden oder mit einem Pflanzenöl (z. B. Sesamöl, Maisöl usw.) oder einem Gemisch davon mit einem Phospholipid (z. B. Lecithin) oder Mittelkettenfettsäuretriglyceriden (z. B. Migriol 812) unter Liefern einer Ölsuspension dispergiert werden.
Wenn die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung Mikrokapseln darstellt, sind die Mikrokapseln bevorzugt feine Teilchen. Die Größe der Mikrokapseln für eine injizierbare Suspension kann aus dem die Erfordernisse für den Dispersionsgrad und den Durchgang durch die zur Injektion verwendete Nadel befriedigenden Bereich ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die Mikrokapselteilchengröße innerhalb des Bereichs von etwa 0,1 bis etwa 300 μm, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 150 μm und bevorzugter etwa 2 bis etwa 100 μm liegen.
Verfahren zum Herstellen von Mikrokapseln als sterile Zubereitungen schließen das Verfahren, bei dem das gesamte Herstellungsverfahren steril ist, das Verfahren, bei dem Gammastrahlen als Sterilisierungsmittel verwendet werden und ein Verfahren ein, bei denen ein Antiseptikum während des Herstellungsverfahren zugesetzt wird, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung kann sicher bei Säugern (z. B. Menschen, Rind, Schwein, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten, Kaninchen usw.) mit niedriger Toxizität verwendet werden.
Die spezielle Anwendung der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung schwankt mit der Art der bioaktiven Polypeptide.
Die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung ist zum Beispiel zum Verhindern oder Behandeln von Diabetes, wenn Insulin als bioaktives Polypeptid verwendet wird, einer Wachstumshormon-Hyposekretion und Turner-Syndrom, wenn ein Wachstumshormon verwendet wird, Virushepatitis (z. B. Hepatitis Typ C, HBe Antigen-positive, aktive Hepatitis) und Krebs (z. B. Nierenkarzinom, multiples Myelom usw.), wenn Interferon-α verwendet wird, Anämie (z. B. Anämie während einer Nierendialyse), wenn Erythropoietin verwendet wird, Neutropänie (z. B. bei einer Zytostatikatherapie) und Infektionen, wenn G-CSF verwendet wird, Krebs (z. B. Hämangioendotheliom), wenn IL-2 verwendet wird, Geschwür des Magen-Darm-Trakts, wenn FGF-9 verwendet wird, seniler Demenz und Neuropathie, wenn NGF verwendet wird, Thrombose, wenn TPA verwendet wird, und Krebs, wenn Tumornekrosefaktor verwendet wird, brauchbar.
Die Dosierung der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung ist die wirksame Konzentration des bioaktiven Polypeptids in vivo, obschon die Dosierung mit dem Typ des bioaktiven Polypeptids, der gewünschten Freisetzungsdauer, der Zielkrankheit, der zu behandelnden Tierart und anderen Faktoren schwankt.
Wenn die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung eine Formulierung mit einwöchiger Wirkung ist, kann die Dosierung des bioaktiven Polypeptids aus dem Bereich von etwa 0,0001 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht je Erwachsener ausgewählt werden. Eine bevorzugtere Dosierung kann geeigneterweise aus dem Bereich von etwa 0,0005 bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht ausgewählt werden. Die bevorzugte Verabreichungshäufigkeit der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung kann geeigneterweise aus einmal wöchentlich bis einmal alle zwei Wochen in Abhängigkeit vom Typ des bioaktiven Polypeptids, der Dosierungsform, der Freisetzungsdauer, der Zielkrankheit, der zu behandelnden Tierart und anderen Faktoren gewählt werden.
Wenn zum Beispiel Insulin das in der Zubereitung mit verzögerter Freisetzung enthaltene bioaktive Polypeptid ist, kann die Dosierung für einen erwachsenen Diabetiker üblicherweise aus dem Bereich von etwa 0,001 bis etwa 1 mg (als aktiver Bestandteil)/kg Körpergewicht und bevorzugt aus dem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,2 mg/kg Körpergewicht bei der auf wöchentlicher Grundlage zu verabreichenden Dosierungsform ausgewählt werden. Im Falle des Wachstumshormons wird die Dosierung für einen Patienten mit hypophysärem Zwergenwuchs aus dem Bereich von etwa 0,004 mg bis etwa 4 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise etwa 0,04 mg bis etwa 0,8 mg/kg Körpergewicht als aktiver Bestandteil ausgewählt und wird vorzugsweise in einwöchigen Abständen verabreicht. Wahlweise kann die Dosierung aus einem Bereich von etwa 0,008 mg bis etwa 8 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise etwa 0,08 mg bis etwa 1,6 mg/kg Körpergewicht zur Verabreichung alle 2 Wochen ausgewählt werden.
Die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung wird vorzugsweise bei Raumtemperatur oder in der Kälte gelagert. Bevorzugter wird die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung in der Kälte gelagert. „Raumtemperatur" bedeutet 15° bis 25°C und „Kälte" bedeutet eine Temperatur unter 15°C.
Beste Ausführungsweise der Erfindung
Die folgenden Bezugsbeispiele und Ausführungsbeispiele sind zum genaueren Beschreiben der vorliegenden Erfindung bestimmt und sollten nicht als den Erfindungsumfang begrenzend aufgefaßt werden.
Bezugsbeispiel 1
4 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 6000) wurden in 4 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1 ml 438 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und das Gemisch wurde in einem Laboratoriumshomogenisator unter Herstellen einer W/O-Emulsion gerührt. Diese Emulsion wurde in 800 ml 0,1% (Gew./Vol.) wäßrige Polyvinylalkohollösung (PVA) gegossen, deren Temperatur auf 18°C voreingestellt worden war und mittels eines Turbinenhomomischers wurde eine W/O/W-Emulsion hergestellt. Anschließend wurde bei dieser bei Raumtemperatur gerührten W/O/W-Emulsion das Dichlormethan unter Herstellen eines Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes abgedampft. Dieses Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz wurde durch Zentrifugieren (etwa 1000 Upm) isoliert und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 600 ml destilliertem Wasser gewaschen und unter Liefern eines Pulvers aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz lyophilisiert. Der durch Atomabsorptionsspektrometrie gemessene Zinkgehalt dieses Salzes war 1,36% (Gew./Gew.).
Bezugsbeispiel 2
4 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.-%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 10000) wurden in 4 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1,5 ml 292 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und das Gemisch wurde in einem Laboratoriumshomogenisator unter Herstellen einer W/O-Emulsion gerührt. Diese Emulsion wurde auf dieselbe Weise wie in Bezugsbeispiel 1 unter Liefern eines Pulvers aus dem Milchsäure- Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz behandelt. Der durch Atomabsorptionsspektrometrie gemessene Zinkgehalt dieses Salzes war 1,1% (Gew./Gew.).
Bezugsbeispiel 3
4 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 15000) wurden in 4 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1,5 ml 292 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und das Gemisch wurde in einem Laboratoriumshomogenisator unter Herstellen einer W/O-Emulsion gerührt. Diese Emulsion wurde auf dieselbe Weise wie in Bezugsbeispiel 1 unter Liefern eines Pulvers aus dem Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz behandelt. Der durch Atomabsorptionsspektrometrie gemessene Zinkgehalt dieses Salzes war 0,99%.
Bezugsbeispiel 4
1 g rekombinantes Humaninsulin (Wako Pure Chemical Industries, Zinkgehalt 0,35%) wurde in 200 ml 0,01 N Chlorwasserstofflösung gelöst. Anschließend wurde die vorstehende Lösung mittels einer semipermeablen Membran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 6000 (Spectrapor^TM 7 MWCO 1000, Spectrum Medical Industries, USA) gegen 10 l 0,01 N Chlorwasserstofflösung 3 Mal dialysiert. Das Dialysat wurde einmal gegen 30 l 0,2 M wäßrige Ammoniumacetatlösung, und einmal 30 l destilliertes Wasser weiter dialysiert und anschließend lyophilisiert. Der Zinkgehalt des lyophilisierten Insulinpulvers war geringer als 0,0001% (Gew./Gew.).
Bezugsbeispiel 5
8 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 6000) wurden in 8 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1,5 ml 292 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und mittels eines Laboratoriumshomogenisators wurde eine W/O-Emulsion hergestellt. Dieser Emulsion wurden 1800 ml 0,1% (Gew./Vol.) wäßrige Polyvinylalkohollösung zugefügt, die auf 18°C voreingestellt worden war, und mittels eines Turbinenhomogenisators wurde eine W/O/W-Emulsion hergestellt. Diese Emulsion wurde wie in Bezugsbeispiel 1 unter Liefern eines pulverförmigen Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes behandelt. Der durch Atomabsorpti onsspektrometrie gemessene Zinkgehalt dieses Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes war 1,15%.
Bezugsbeispiel 6
8 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 6000) wurden in 8 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1,5 ml 292 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und mittels eines Laboratoriumshomogenisators wurde eine W/O-Emulsion hergestellt. Diese Emulsion wurde wie in Bezugsbeispiel 4 unter Liefern eines pulverförmigen Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes behandelt. Der durch Atomabsorptionsspektrometrie gemessene Zinkgehalt dieses Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes war 1,24%.
Bezugsbeispiel 7
8 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 15000) wurden in 8 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1,2 ml 292 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und mittels eines Laboratoriumshomogenisators wurde eine W/O-Emulsion hergestellt. Diese Emulsion wurde wie in Bezugsbeispiel 4 unter Liefern eines pulverförmigen Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes behandelt. Der durch Atomabsorptionsspektrometrie gemessene Zinkgehalt dieses Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes war 0,96% (Gew./Gew.).
Bezugsbeispiel 8
8 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 8000) wurden in 8 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 1,5 ml 292 mg/ml wäßrige Zinkacetatlösung zugefügt und mittels eines Laboratoriumshomogenisators wurde eine W/O-Emulsion hergestellt. Diese Emulsion wurde 1800 ml 0,1%iger (Gew./Vol.) wäßriger Polyvinylalkohollösung zugefügt, die auf 18°C voreingestellt worden war, und mittels eines Turbinenhomogenisators wurde eine W/O/W-Emulsion hergestellt. Anschließend wurde unter Rühren der W/O/W-Emulsion bei Raumtemperatur das Lösungsmittel Dichlormethan unter Ergeben eines Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes abgedampft. Dieses Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz wurde durch Zentrifugieren (etwa 1000 Upm) gesammelt und der Über stand wurde verworfen. Das Salz wurde zweimal mit 1200 ml destilliertem Wasser gespült. Dieses Verfahren wurde ein zweites Mal wiederholt und die zweite Menge wurde mit der ersten Menge vereinigt und das Gemisch wurde unter Liefern von 11,8 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz in Pulverform lyophilisiert. Wie durch Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt war der Zinkgehalt dieses Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes 1,19% (Gew./Gew.).
Beispiel 1
900 mg des in Bezugsbeispiel 1 erhaltenen Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes wurden in 1 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 100 mg in Bezugsbeispiel 4 hergestelltes, lyophilisiertes, Zn-freies Insulinpulver zugefügt und das Gemisch wurde in einem Laboratoriumshomomischer unter Herstellen einer sowohl das Insulin als auch das Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz enthaltenden Lösung eines organischen Lösungsmittels gerührt. Diese Lösung eines organischen Lösungsmittels wurde in 800 ml 0,1%ige (Gew./Vol.) wäßrige Polyvinylalkohollösung (PVA) gegossen, die auf 18°C voreingestellt worden war, und mittels eines Turbinenhomogenisators wurde eine O/W-Emulsion hergestellt. Während die O/W-Emulsion bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Dichlormethan anschließend unter Liefern von Mikrokapseln abgedampft. Die Mikrokapseln wurden durch Zentrifugieren (etwa 1000 Upm) isoliert und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 600 ml destilliertem Wasser gespült und unter Liefern von 520 mg pulverförmiger, insulinhaltiger Mikrokapseln lyophilisiert.
Beispiel 2
900 mg des in Bezugsbeispiel 2 hergestellten Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes wurden in 1 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 100 mg in Bezugsbeispiel 4 erhaltenes, lyophilisiertes, Zn-freies Insulinpulver zugefügt und das Gemisch wie in Beispiel 1 unter Liefern von 450 mg pulverförmiger, insulinhaltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 3
900 mg des in Bezugsbeispiel 3 hergestellten Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes wurden in 1,5 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 100 mg in Bezugsbeispiel 4 erhaltenes, lyophilisiertes, Zn-freies Insulinpulver zugefügt und das Gemisch wie in Beispiel 1 unter Liefern von 503 mg pulverförmiger, insulinhaltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 4
950 mg des in Bezugsbeispiel 1 hergestellten Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes wurden in 1,5 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurde das Pulver aus 8 Gläschen (128 IE) humanem Wachstumshormon (Genotropin^TM 16 IE/Ampulle, Sumitomo Pharmaceutical Company Limited) zugefügt und das Gemisch wurde wie in Beispiel 1 unter Liefern von 500 mg Wachstumshormon-haltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 5
950 mg des in Bezugsbeispiel 5 hergestellten Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes wurden in 1,5 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 50 mg lyophilisiertes Pulver von humanem Wachstumshormon zugefügt und das Gemisch wurde wie in Beispiel 1 unter Liefern von 517 mg pulverförmiger, Wachstumshormon-haltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 6
950 mg des in Bezugsbeispiel 3 hergestellten Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes wurden in 3 ml Dichlormethan gelöst. Dieser Lösung wurden 50 mg lyophilisiertes Pulver von humanem Wachstumshormon zugefügt und das Gemisch wurde wie in Beispiel 1 unter Liefern von 415 mg pulverförmiger, Wachstumshormon-haltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 7
475 mg des in Bezugsbeispiel 6 erhaltenen Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes und 475 mg Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.-%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 6000) wurden in 1,5 ml eines Gemisches aus Dichlormethan und Ethanol (Dichlormethan/Ethanol = 2/1 (Vol./Vol.)) gelöst. Dieser Lösung wurden 50 mg lyophilisiertes Pulver aus humanem Wachstumshormon zugefügt und das Gemisch wurde wie in Beispiel 1 unter Liefern von 249 mg pulverförmiger, Wachstumshormon-haltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 8
475 mg des in Bezugsbeispiel 7 erhaltenen Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes und 475 mg Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer (Milchsäure/Glykolsäure = 50/50 (Mol.-%), Gewichtsmittel des Molekulargewichts 15000) wurden in 3 ml Dichlormethan/Ethanol (2/1, Vol./Vol.) gelöst. Dieser Lösung wurden 50 mg lyophilisiertes Pulver aus humanem Wachstumshormon zugefügt und das Gemisch wurde wie in Beispiel 1 unter Liefern von 447 mg pulverförmiger, Wachstumshormon-haltiger Mikrokapseln behandelt.
Beispiel 9
2,12 g in Bezugsbeispiel 8 erhaltenes Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz wurden in 3,45 ml Dichlormethan gelöst. Anschließend wurden 160 mg in Bezugsbeispiel 4 erhaltenes lyophilisiertes, zinkfreies Insulinpulver 2 ml Dichlormethan zugefügt und unter Herstellen einer Insulinsuspension 5 Minuten beschallt. Dieser Suspension wurde die vorstehende Dichlormethanlösung des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes (entsprechend 1,84 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz) zugefügt. Das Gemisch wurde mit einem Wirbelrührer und anschließend mit einem Laboratoriumshomogenisator unter Ergeben einer Lösung eines organischen Lösungsmittels behandelt, die sowohl Insulin als auch Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz enthielt. Dieser Lösung eines organischen Lösungsmittels wurden 2000 ml einer 0,1%igen (Gew./Vol.) wäßrigen, 1,4% Zinkacetatdihydrat enthaltenden Polyvinylalkohollösung, die auf 18°C voreingestellt worden war, zugefügt und mittels eines Turbinenhomomixers wurde eine O/W-Emulsion hergestellt. Während die O/W-Emulsion bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Dichlormethan anschließend unter Liefern von Mikrokapseln abgedampft. Die Mikrokapseln wurden durch Zentrifugieren (etwa 1000 Upm) isoliert und der Überstand wurde verworfen. Die Mikrokapseln wurden zweimal mit 1200 ml destilliertem Wasser gespült und nach der Zugabe von 250 mg Mannit wurden sie unter Liefern von 1,53 g pulverförmiger, insulinhaltiger Mikrokapseln lyophilisiert.
Beispiel 10
1,06 g in Bezugsbeispiel 8 erhaltenes Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz wurden in 2,3 ml Dichlormethan/Acetonitril (10/1, Vol./Vol.) gelöst. Anschließend wurden 80 mg in Bezugsbeispiel 4 erhaltenes lyophilisiertes, zinkfreies Insulin pulver 1 ml Dichlormethan/Acetonitril (10/1, Vol./Vol.) zugefügt und unter Herstellen einer Insulinsuspension 5 Minuten beschallt. Dieser Suspension wurde die vorstehende Dichlormethanlösung des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalzes (entsprechend 0,92 g Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz) zugefügt und das Gemisch wurde mit einem Wirbelrührer und weiter mit einem Laboratoriumshomogenisator unter Ergeben einer Lösung eines organischen Lösungsmittels behandelt, die sowohl Insulin als auch das Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer-Zinksalz enthielt. Dieser Lösung eines organischen Lösungsmittels wurden 1000 ml einer 0,1%igen (Gew./Vol.) wäßrigen, 0,7% Zinkacetatdihydrat enthaltenden Polyvinylalkohollösung, die auf 18°C voreingestellt worden war, zugefügt und mittels eines Turbinenhomomixers wurde eine O/W-Emulsion hergestellt. Während die O/W-Emulsion bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde das Dichlormethan anschließend unter Liefern von Mikrokapseln abgedampft. Die Mikrokapseln wurden durch Zentrifugieren (etwa 1000 Upm) isoliert und der Überstand wurde verworfen. Die Mikrokapseln wurden zweimal mit 600 ml destilliertem Wasser gespült, gefolgt von der Zugabe von 100 mg Mannit und der Lyophilisierung unter Liefern von 0,734 g pulverförmiger, insulinhaltiger Mikrokapseln lyophilisiert.
Versuchsbeispiel 1
147 mg in Beispiel 1 hergestellte, insulinhaltige Mikrokapseln wurden in 1,75 ml Dispersionsmedium (Mannit 5% (Gew./Vol.), Carboxymethylcellulose 0,5% (Gew./Vol.), Tween 20 0,1% (Gew./Vol.), mit Essigsäure auf pH 6,8 eingestellt) dispergiert. Ein Anteil von 0,5 ml (Insulingehalt 100 E) dieser Dispersion wurde unter Etherbetäubung subkutan in den Rücken Streptozocin-induzierter, hypoglykämischer Ratten injiziert. Aus der Schwanzvene wurde fortlaufend Blut abgenommen und das Serum wurde abgetrennt. Die Insulinkonzentration in jeder Serumprobe wurde durch einen Enzymimmuntest unter Anwenden des Zwei-Antikörper-Sandwichverfahrens bestimmt. Als Kontrolle wurden Insulinlösung und Novolin^TM U (Novo-Nordisk, Dänemark), eine handelsmäßige Insulinzubereitung mit verzögerter Wirkung (die beide das Äquivalent von 100 E Insulin enthielten) verabfolgt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 dargestellt. Danach war die Seruminsulinkonzentration bei der mit den Insulin-Zink enthaltenden Mikrokapseln behandelten Gruppe verglichen mit der Insulinlösung und Novolin^TM U bedeutend gut erhalten, was zeigt, daß die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte, verzögerte Dosierungsform verbesserte verzögerte Freisetzungseigenschaften aufweist.
Tabelle 1 Zeitlicher Verlauf der Blutinsulinkonzentration nach der Verabreichung verschiedener Insulinzubereitungen
Versuchsbeispiel 2
261 mg in Beispiel 6 hergestellte, Wachstumsfaktor enthaltende Mikrokapseln wurden in 1,75 ml Dispersionsmedium gelöst. Ein Anteil von 0,5 ml (3 mg Wachstumshormon entsprechend) dieser Dispersion wurde unter Etherbetäubung subkutan in den Rücken von Ratten injiziert. Als Kontrolle wurde eine Lösung von Wachstumshormon (3 mg Wachstumshormon entsprechend) ähnlich verabfolgt. Aus der Schwanzvene wurde fortlaufend Blut abgenommen und das Serum wurde abgetrennt. Die Konzentration des Wachstumshormons in jeder Serumprobe wurde durch einen Radioimmuntest (Ab Bead HGH, Eiken Kagaku) bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. Danach wurde die Serumkonzentration des Wachstumshormons bei der Gruppe mit den Wachstumshormon/Zink enthaltenden Mikrokapseln verglichen mit der Gruppe mit der Wachstumshormonlösung bedeutend länger aufrecht erhalten, was eine hervorragende verlängerte Wirkung nahelegt, die für die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Dosierungsform mit verzögerter Freisetzung kennzeichnend ist.
Versuchsbeispiel 3
211 mg in Beispiel 7 hergestellte, Wachstumsfaktor enthaltende Mikrokapseln wurden in 1,75 ml Dispersionsmedium gelöst. Ein Anteil von 0,5 ml (3 mg Wachstumshormon enthaltend) dieser Dispersion wurde subkutan in den Rücken mit Ether betäubter Ratten injiziert. Aus der Schwanzvene wurde fortlaufend Blut abgenommen und das Serum wurde abgetrennt. Die Konzentration des Wachstumshormons in jeder Serumprobe wurde durch einen Radioimmuntest (Ab Bead HGH, Eiken Kagaku) bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt. Danach wurde die Serumkonzentration des Wachstumshormons bei der Gruppe mit den Wachstumshormon/Zink enthaltenden Mikrokapseln verglichen mit der Gruppe mit der Wachstumshormonlösung bei einer ausgeprägten Unterdrückung übermäßiger Anfangsfreisetzungen bedeutend länger aufrecht erhalten, was daher eine hervorragende verlängerte Wirkung nahelegt, die für die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Dosierungsform mit verzögerter Freisetzung kennzeichnend ist.
Tabelle 2 Zeitlicher Verlauf der Blutwachstumshormonkonzentration nach der Verabfolgung verschiedener Wachstumshormonzubereitungen
Versuchsbeispiel 4
236,6 mg in Beispiel 9 erhaltene, insulinhaltige Mikrokapseln wurden in 1,75 ml Dispersionsmedium gelöst. Ein Anteil von 0,5 ml (100 E Insulin enthaltend) dieser Dispersion wurde subkutan in den Rücken mit Ether betäubter Ratten injiziert. Aus der Schwanzvene wurde fortlaufend Blut abgenommen und das Serum wurde abgetrennt. Die Insulinkonzentration in jeder Serumprobe wurde durch einen enzymverknüpften Immunsorbenstest bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. Danach wurde die Seruminsulinkonzentration bei der Grup pe mit den Insulin/Zink enthaltenden Mikrokapseln verglichen mit der Gruppe mit der Insulinlösung bei deutlicher Hemmung übermäßiger Anfangsfreisetzungen bedeutend länger aufrecht erhalten, was eine hervorragende verlängerte Wirkung nahelegt, die für die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Dosierungsform mit verzögerter Freisetzung kennzeichnend ist.
Versuchsbeispiel 5
216,4 mg in Beispiel 10 erhaltene, insulinhaltige Mikrokapseln wurden in 1,75 ml Dispersionsmedium gelöst. Ein Anteil von 0,5 ml (100 E Insulin enthaltend) dieser Dispersion wurde subkutan in den Rücken mit Ether betäubter Ratten verabfolgt. Aus der Schwanzvene wurde fortlaufend Blut abgenommen und das Serum wurde abgetrennt. Die Insulinkonzentration in jeder Serumprobe wurde durch einen enzymverknüpften Immunsorbenstest bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt. Danach wurde die Seruminsulinkonzentration bei der Gruppe mit den Insulin/Zink enthaltenden Mikrokapseln verglichen mit der Gruppe mit der Insulinlösung bei deutlicher Hemmung übermäßiger Anfangsfreisetzungen bedeutend länger aufrecht erhalten, was eine hervorragende verlängerte Wirkung nahelegt, die für die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Dosierungsform mit verzögerter Freisetzung kennzeichnend ist.
Tabelle 3 Zeitlicher Verlauf der Blutinsulinkonzentration nach Verabreichung verschiedener Insulinzubereitungen
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Zubereitung mit verzögerter Freisetzung mit einer erhöhten Einschlußrate für bioaktive Polypeptide, gehemmten frühen, übermäßigen Freisetzungen nach der Verabreichung und konstanter Freisetzungskinetik über einen langen Zeitraum bereitgestellt werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, das das Dispergieren eines bioaktiven Polypeptids in einem ein bioabbaubares Polymermetallsalz enthaltenden organischen Lösungsmittel und Unterziehen der sich daraus ergebenden Dispersion dem Formgeben umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Metallsalz ein mehrwertiges Metallsalz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Metallsalz aus der aus einem Zinksalz und einem Calciumsalz bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das organische Lösungsmittel ein Gemisch aus halogenierten Kohlenwasserstoffen und Acetonitril oder Alkoholen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Mischungsverhältnis der halogenierten Kohlenwasserstoffe zu Acetonitril oder den Alkoholen bei dem organischen Lösungsmittel im Bereich von etwa 40 : 1 bis etwa 1 : 1 (Volumen/Volumen) liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das bioaktive Polypeptid ein Hormon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Hormon ein Insulin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Hormon ein Wachstumshormon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das bioaktive Polypeptid ein Cytokin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das Cytokin ein Interferon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das bioabbaubare Polymer ein aliphatischer Polyester ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der aliphatische Polyester ein α-Hydroxycarbonsäurepolymer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der aliphatische Polyester ein Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Zusammensetzungsverhältnis (Mol.-%) Milchsäure/Glykolsäure des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers etwa 100/0 bis etwa 40/60 ist und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts des Milchsäure-Glykolsäure-Copolymers etwa 3000 bis etwa 20000 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung ein teilchenförmiges Erzeugnis ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die durchschnittliche Teilchengröße des teilchenförmigen Erzeugnisses etwa 0,1 μm bis etwa 300 μm beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zubereitung mit verzögerter Freisetzung für eine Injektion bestimmt ist.
Dispersion, die ein bioaktives Polypeptid umfaßt, das in einem ein bioabbaubares Polymermetallsalz enthaltenden organischen Lösungsmittel dispergiert ist.
Zubereitung mit verzögerter Freisetzung, die durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellt wurde.
Zubereitung mit verzögerter Freisetzung gemäß Anspruch 19, bei der der Metallgehalt des bioabbaubaren Metallsalzes etwa 0,01 bis etwa 10 Gew.-% beträgt.
Zubereitung mit verzögerter Freisetzung gemäß Anspruch 19, bei der die Konzentration des bioaktiven Polypeptids etwa 0,001 bis etwa 30% (Gew./Gew.) beträgt.
Zubereitung mit verzögerter Freisetzung gemäß Anspruch 19, bei der das bioaktive Polypeptid ein Wachstumshormon ist.