DE69423753T2

DE69423753T2 - Polyoximverbindungen und deren herstellung

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Publication number: DE69423753T2
Application number: DE69423753T
Authority: DE
Inventors: Robin Ewart Offord; Keith Rose
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-05-05
Filing date: 1994-05-05
Publication date: 2000-11-02
Anticipated expiration: 2014-05-06
Also published as: PT697891E; US6663869B1; DE69423753D1; GR3033699T3; ES2146649T3; ATE191148T1; CA2162157A1; EP0697891A1; DK0697891T3; JPH08510210A; JP3734828B2; AU686153B2; AU6543894A; EP0697891B1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf homogene Zubereitungen von Polyoximen und auf Zubereitungen von Heteropolyoximen, wobei die benannten Polyoxime Makromoleküle einer definierten Struktur mit einer Mehrzahl von Oximbindungen sind, sowie auf Reagentien und Verfahren für den Aufbau solcher Moleküle.[0001]

Hintergrund

Zwei Verfahren sind herkömmlicherweise zur Herstellung komplexer Polymere wie der Polypeptide verwendet worden. Ein Verfahren beruht auf auf verhältnismässig unkontrollierten Polymerisationsreaktionen, worin monomere Untereinheiten zu grossen Polymeren reagieren. Mit diesem Verfahren können polydisperse Makromoleküle wie Polypeptide und Kunststoffe (Polyethylen oder Nylon) aus monomeren Eesten wie Aminosäuren bzw. kleinen aliphatischen oder aromatischen organischen Molekülen hergestellt werden. Während solche polydisperse Makromoleküle verhältrismässig leicht hergestellt werden können, sind die makroskopischen polymeren Produkte auf der molekularen Ebene nicht homogen, sondern sind Gemische von Polymeren unterschiedlicher Längen und sogar unterschiedlicher Zusammensetzung wie in einem statistischen Copolymer. Ferner ist es wegen der Ähnlichkeit der in derartigen polydispersen Zubereitungen erzeugten Homologen schwierig oder unmöglich, ein einzelnes Produkt hohen Molekulargewichts in reiner Form zu erhalten.[0002]
Das zweite Verfahren, das eingesetzt wurde, um komplexe Makromoleküle zu erhalten, war der sequentielle Aufbau reversibel geschützter Monomeren. Diese Vorgehensweise kann verwendet werden, um Produkte definierter, typischerweise linearer Struktur zu erhalten. Leider ist dieses Verfahren in der Grösse und - am kritischsten - in der Komplexität der herstellbaren Moleküle begrenzt. Zum Beispiel ist die Synthese definierter Polypeptide oder Proteine mit einer Grösse von mehr als etwa 50 bis 80 Aminosäureresten jenseits der Möglichkeiten dieser Technik gewesen. Eine Kondensation von jeweils zwei vorgereinigten, geschützten Polypeptiden ist durch die Unlöslichkeit grosser geschützter Fragmente begrenzt. Folglich ist zum Beispiel die Synthese homogener, linearer Polypeptide nach oben hin auf etwa 100 Aminosäurereste begrenzt.[0003]
Mutter und Mitautoren (Proteins: Structure, Function and Genetics- (1989) 5: 13-21) haben verzweigtkettige Polypeptide durch schrittweise Kopplung geschützter Aminosäuren an eine synthetische, geschützte kunstharzgebundene Peptidmatrize während einer Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert. Entfernung der Schutzgruppen und Spaltung waren erforderlich, um ein lösliches, matrizen-synthetisiertes Protein zu erhalten. Ebenfalls unter Benutzung schrittweiser Festphasen-Peptidsynthese haben Tam und Zavala (J. Immunol. Meth. (1989) 124 : 52-61) verzweigtkettige "Lysinbaum"-Matrizen mit Peptidzweigen aufgebaut, die als multiple Antigenpeptide bezeichnet wurden und im Gefolge nach Entfernung der Schutzgruppen durch HF und Spaltung in löslicher, roher Form erhalten wurden.[0004]
Da in der Polypeptidsynthese verwendete Schutzgruppen allgemein die Löslichkeit des schützbaren Moleküls vernngern, würde die Fähigkeit, ungeschützte Polypeptide zu kondensieren, eine Verbesserung bezüglich des bei Verwendung geschützter Vorstufen auftretenden Löslichkeitsproblems schaffen und die zum Erreichen eines Endprodukts erforderlichen scharfen Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppen minimieren. Jedoch erhebt sich bei Verwendung ungeschützter Vorstufen das scheinbar unüberwindliche Problem der Regiospezifität. Es ist daher versucht worden, durch den Einsatz einer chemoselektiven Ligation eine regiospezifische Kondensation ungeschützter Fragmente zu benutzen.[0005]
Chemoselektive Ligation erfordert den Einsatz von komplementären Paaren reaktiver Gruppen, die in spezifischen Stellungen an den zusammenzufiigenden Vorstufenmolekülen vorhanden sind. Der Einsatz von reaktiven Gruppen mit einer komplementären chemischen Reaktivität wie zum Beispiel einer Thiolgruppe und einer Bromacetylgruppe führt zur Bindungsbildung in regiospezifischer Weise. Chemoselektive Ligationen des Thioltyps sind zum Beispiel verwendet worden, um multi-antigene Peptide herzustellen. Bei einem Versuch, scharfe Verfahren der Schutzgruppenentfernung sowie die Bildung unreiner Produkte zu vermeiden, die durch mögliche sterische Hinderung zwischen eng beabstandeten, wachsenden Peptidarmen während einer schrittweisen Festphasensynthese verursacht werden, haben Drijfhout und Bloemhoff (Int. J. Peptide Protein Res. (1991) 37 : 27-32) eine chemoselektive Kopplung des Thioltyps verwendet, indem sie ein verzweigtes "Octaaminolysinbaum"-Peptid synthetisierten, dessen von der Schutzgruppe befreite Aminogruppen mit geschützten Sulfhydrylgruppen (S-acetylmercaptoacetyl) erweitert waren, um darauffolgend an ein geeignet modifiziertes sulfhydrylhaltiges antigenes Peptid anzukoppeln. Das erhaltene Produkt hatte jedoch der Hochleistungs-Flüssigchromatographie zufolge ungenügende Eigenschaften und war nicht voll charakterisiert. In jüngerer Zeit ist Thiolchemie benutzt worden, um in einer Zweifragmenten-Kondensation ein völlig synthetisches lineares, funktionelles HIV-Proteaseanaloges herzustellen (Schnolzer und Kent (1992) Science 256 : 221-225).[0006]
Leider ist die Thiolchemie nicht völlig spezifisch. Es ist zum Beispiel wohlbekannt, dass Thiolgruppen an Disulfidbindungs-Umsetzungen beteiligt sein können. Ausserdem können Alkylierungsmittel wie Bromacetyl und Maleoyl nicht nur mit einer Thiolgruppe, sondern auch mit anderen nucleophilen Aminosäuregruppen reagieren. Zum Beispiel kann Bromacetyl mit der Thioether-Seitenkette von Methioninresten reagieren und beschränkt somit die Homogenität und/oder Komplexität des gewünschten Produkts.[0007]
Es existiert also eine Notwendigkeit für die Zubereitung und insbesondere die homogene Zubereitung von leicht synthetisierten Makromolekülen definierter Struktur, die stabile Ligationsbindungen aufweisen, sowie für Reagentien und Verfahren, um diese Zubereitungen von Makromolekülen zu erstellen, die eine leichte, schnelle und milde Synthese, im wesentlichen quantitative Ausbeuten, Wandelbarkeit in der Auslegung sowie Anwendbarkeit für den Aufbau unter Verwendung einer Vielfalt biochemischer Verbindungsklassen schaffen. Zusätzlich besteht ein Bedarf für Makromoleküle, insbesondere homogene Makromoleküle, mit definierter Struktur, die für eine gewünschte Aktivität, Löslichkeit, Konformation oder andere, wünschenswerte Eigenschaften ausgelegt werden können; die Komponenten wie Polypeptide oder Oligonucleotide in nichtlinearer, polyvalenter Form aufweisen; die höhere Bindungsaffinität und Spezifität der Wechselwirkung aufweisen; und im Falle homogener Makromoleküle als homogene Zubereitungen verfügbar gemacht werden können. Des weiteren besteht der Bedarf an Bibliotheken von Makromolekülen wie Peptiden oder Oligonucleotiden, die die hier diskutierten Vorteile besitzen. Die vorliegende Erfindung kommt diesen Bedürfnissen nach und schafft ausserdem verwandte Vorteile.[0008]

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFWTDUN

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf homogene Zubereitungen leicht synthetisierter, homogener Makromoleküle und auf leicht synthetisierte heterogene Makromoleküle, wobei die benannten Makromoleküle eine definierte Struktur haben und eine Mehrzahl stabiler Oximbindungen enthalten, sowie auf Reagentien und Verfahren für den schnellen und spezifischen Aufbau solcher Makromoleküle durch chemoselektive Litagion über Oximbildung.[0009]
Die Makromoleküle definierter Struktur umfassen ein organisches Molekül (als Stammmolekül bezeichnet), an das andere Moleküle (als COSMs bezeichnet) angefügt werden, die eine Mehrzahl von Oximbindungen, vorzugsweise zumindest drei, zu einer Mehrzahl eines zweiten organischen Moleküls (COSM) haben. Im Falle von Homopolyoxim-Makromolekülen sind die COSM miteinander identisch. In einer Ausführungsform haben die Oximbindungen gleiche Ausrichtung. Im Falle von Heteropolyoxim-Makromolekülen ist das Stammmolekül an eine Mehrzahl zweiter organischer Moleküle angefügt, wobei sich zumindest eines der an das Stammmolekül angefügten zweiten organischen Moleküle von den anderen angefügten zweiten organischen Molekülen unterscheidet. Ebenfalls vorgesehen sind zwei Reagentien, um diese Moleküle aufzubauen: Stammmoleküle mit einer Mehrzahl oximbildender reaktiver Gruppen und ein zweites organisches Molekül mit einer orthogonalen reaktiven Gruppe, die bei der Oximbindungsbildung zu der oximbildenden orthogonalen reaktiven Gruppe, die im Stammmolekül vorhanden ist, komplementär ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden die zweiten organischen Moleküle wechselweise als komplementäre orthogonale, spezifisch aktive Moleküle ("COSM": complementary orthogonal specifically active molecules) bezeichnet und sind weiter unten definiert. Die Oximbindungen schaffen ein hydrolytisch stabiles Mittel zum Zusammenfügen oligomerer oder makromolecularer Untereinheiten. Die verschiedenen reaktiven Gruppen werden hier als "orthogonale" Gruppen bezeichnet, was bedeutet, dass sie in ihrer Reaktivität zueinander komplementär sind und nicht mit anderen funktionellen Gruppen reagieren, die in den Vorstufen des sich bildenden Makromoleküls vorhanden sind.[0010]
Durch diese Erfindung werden ferner Verfahren bereitgestellt, um diese Moleküle herzustellen, darunter durch parallelen Selbstaufbau, die die chemoselektive Bindung jedes einer Mehrzahl orthogonaler reaktiver Gruppen an einem Stammmolekül mittels Oximbindungsbildung an die zu ihr komplementäre reaktive orthogonale Gruppe umfasst, die an einem von einer Mehrzahl eines zweiten organischen Moleküls vorhanden sind. Das Stammmolekül und die zweiten organischen Moleküle werden vorzugsweise aus Aminosäureresten gebildet. In anderen Ausführungsformen werden die Stammmoleküle und/oder zweiten organischen Moleküle aus Zuckerresten, Nucleinsäureresten und/oder Lipiden gebildet oder umfassen diese zusätzlich.[0011]
Bevorzugte Stammmoleküle werden durch kontrollierte organisch-chemische Synthesen wie Festphasen-Peptidsynthese ("SPPS": solid-phase peptide synthesis) oder gleichwertige Synthesen für Nucleinsäuren oder kohlenhydrathaltige Stammmoleküle dargestellt. Kohlenhydrathaltige Stammmoleküle werden vorzugsweise aus natürlichen oder rekombinierten Quellen isoliert oder auf enzymatischem Wege dargestellt. Homogene Zubereitungen isolierter Peptide oder Proteine (die zum Beispiel durch rekombinierende Mittel dargestellt wurden) eignen sich ebenfalls für Ausführungsformen von Stammmolekülen; solche Moleküle müssen aber so ausgelegt oder gewählt sein, dass sie Reste enthalten, die mit darauffolgender regiospezifischer Modifizierung verträglich sind, um eine Mehrzahl von oximbildenden orthogonalen reaktiven Gruppen zu erhalten, und müssen ausserdem nach der regiospezifischen Modifizierung eine definierte Struktur und erhebliche Homogenität behalten. Entsprechend sind heterogene Glykoprotein-Antikörperzubereitungen, die nachfolgend durch chemische oder enzymatische Oxidation von Zuckerresten modifiziert worden sind, als Stammmolekül-Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nicht geeignet.
[0012] Verfahren der Verwendung dieser Polyoximverbindungen werden ebenfalls zur Verfügung gestellt, darunter der Verwendung als Antigene und Immunogene. Zusammensetzungen, daruanter pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Stoffzusammensetzungen enthalten, werden zur Verfügung gestellt. Baukästen, die die Polyoxime der Erfindung oder Reagentien für ihre Synthese zur Verfügung stellen, werden geschaffen.
[0013] Die Polyoximverbindungen der Erfindung sind verhältnismässig komplexe, synthetisch dargestellte Makromoleküle. Das massereichste Spezies, das bis anhin dargestellt wurde, ist ein Komplex von etwa 20 kDa mit 195 Aminosäureresten, nämlich das Homopolyoxim-Octaoxim, das aus NH2OCH2CO-ELGGGPGAGSLQP- LALEGSLQKR-OH (Seq. ID-Nr.: 10) und O =CH-CO-Gly3-[Lys(COCHO)]7-Gly- OH (Seq. ID-Nr.: 9) gebildet wird. Angesichts dieser Offenbarung wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass mit den schnellen, spezifischen, milden und wandelbaren Verfahren, diese Verbindungen in hoher Ausbeute herzustellen, die durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt werden, noch grössere und komplexere Moleküle nun leicht in homogener und definierter Form zugänglich sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

[0014]
Fig. I zeigt die Struktur des Hexa-TCTP-Polyoxims. Wie angedeutet, ist je ein TCTP-COSM an jede der fünf s-Positionen der Lysinreste in der Stammmolekülstruktur und an die N-Endgruppe der Stammmolekülstruktur angefügt.
Fig. 2 zeigt das Chromatogramm, das durch RP-HPLC eines drei Stunden nach Beginn der Oximierungsreaktion entnommenen Musters erhalten wurde. Peak 1 zeigt die Fraktion an, die ungebundenes TCTP-COSM enthält, während Peak 2 die Fraktion anzeigt, die Hexa-TCTP-Polyoximprodukt enthält.
Fig. 3 zeigt das Chromatogramm, das durch RP-HPLC eines 18 Stunden nach Beginn der Oximierungsreaktion entnommenen Musters enthalten wurde. Peak 1 zeigt die Fraktion an, die ungebundenes TCTP-COSM enthält, während Peak 2 die Fraktion anzeigt, die Hexa-TCTP-Polyoximprodukt enthält.
Fig. 4 ist eine Fotogiafie eines Polyacrylamidgels, die die Wanderung des Hexa- TCTP-Polyoxims zeigt. Bahn 1 sind Proteinstandards, Bahn 2 ist Hexa-TCTP- Polyoxim.
Fig. 5 zeigt ein Massenspektrum, dass durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie des Hexa-TCTP-Polyoxims erhalten wurde. Die senkrechte Achse zeigt die Detektoranzeige als Prozentsatz des vollen Skalenausschlages (% FS: percent fühl-scale); die waagerechte Achse zeigt das Masse-Ladungsverhältnis (M/Z). Die Zahlenwerte an den Peaks geben den WZ-Wert jeder Spezies mit hohem Molekulargewicht an, das mehrere positive Ladungen (Protonen) trägt. Zum Beispiel entspricht der Peak bei M/Z = 1037,6 zehn Protonen (Z = 10). Die Masse (M) der entsprechenden Spezies can als (10) x (1037,6) = 10376 berechnet werden, minus 10 (für die zehn Protonen) ergibt 10366 Atommasseeinheiten (amu: atomic mass units). Die aus allen Signalen berechnete durchschnittliche Masse beträgt 10367,41 ± 1.28. Der theoretische Wert beträgt 10365,49. Ein Trio 2/3000 ESI-Datenerfassungssystem wurde verwendet (gefunden 10367,41 ± 1.28, berechnet 10365,49).
Fig. 6 (Stabilität des 12-meren, mit AOA-12-mer hergestellten Hexaoxims) zeigt Chromatogramme, die mit RP-HPLC des Hexa-TCTP-Polyoxims erhalten wurden, und zwar nach Inkubation, (a) 48 Stunden bei pH 2,1, (b) 24 Stunden bei pH 4,6, und (c) 30,5 Stunden bei pH 7,0. Pfeile zeigen die erwarteten Elutionszeiten für unvollständige Penta-, Tetra- usw. TCTP-Polyoxime; es werden keine partiellen Produkte beobachtet.
Fig. 7 zeigt die Struktur des Hexa-Pep C-Polyoxims. Wie angedeutet, ist je ein Pep C-COSM an jede der fünf E-Positionen der Lysinreste in der Stammmolekülstruktur und an die N-Endgruppe der Stammmolekülstruktur angefügt.
Fig. 8 zeigt das Chromatogramm, das mit RP-HPLC eines 18 Stunden nach Beginn der Oximierungsreaktion entnommenen Musters erhalten wurde. Peak 1 zeigt die Fraktion an, die ungebundenes Pep C-COSM enthält, während Peak 2 die Fraktion anzeigt, die Hexa-Pep C-Polyoximprodukt enthält.
Fig. 9 (ESI-MS des Pep C-Hexaoxims) zeigt ein Massenspektrum, das durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie des Hexa-Pep C-Polyoxims erhalten wurde.
Fig. 10 (ESI-MS des Pep C-Hexaoxims) zeigt ein Massenspektrum, das durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie eines Octa-Pep C-Polyoxims erhalten wurde.
Fig. 11 zeigt die Struktur des Hexa-TCTP-Polyoxims. Wie angedeutet, ist je ein COSM an jede der fünf &epsi;-Positionen der Lysinreste in der Stammmolekülstruktur und an die N-Endgruppe der Stammmolekülstruktur angefügt. Man beachte die Stereochemie der Oximbindungen im Vergleich zu der in Fig. 1 gezeigten Struktur.
Fig. 12A, 12B, 12C und 12D zeigen Massenspektren und berechnete Molekulargewichte, die durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie von vier Oximprodukten erhalten wurden. Fig. 12A zeigt das Spektrum des aus dem Stammmolekül Terephthalaldehyd und dem Peptid NH&sub2;OCH&sub2;CO-Nle-Asp-His- (D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH (ein synthetisches Analoges zum Alpha-Melanocyten stimulierenden Hormons ("MSH") gebildeten Monooxims. Fig. 12B zeigt das Spektrum des aus dem Stammmmolekül Terephthalaldehyd und dem Peptid NH&sub2;OCH&sub2;CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH gebildeten Homo-Polyoxims. Fig. 12C zeigt das Spektrum des aus dem Stammmolekül Terephthalaldehyd und den Peptiden NH&sub2;OCH&sub2;CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH und NH&sub2;OCH&sub2;CO-Lys-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys-Gly-OH (Seq. ID-Nr.: 4) gebildeten Hetero-Polyoxims (Heterodimers). Fig. 12D zeigt das Spekturm des aus dem Stammmolekül Terephthalaldehyd und den Peptiden NH&sub2;OCH&sub2;CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH und NH&sub2;OCH&sub2;-Lys-Leu- Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys-Gly-OH (Seq. ID-Nr.: 13) gebildeten Hetero- Polyoxims (Heterodimers).

EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Definitionen

[0015] Für die Zwecke der Erfindung werden die folgenden Ausdrücke wie folgt definiert:
[0016] Eine "komplementäre orthogonale chemisch reaktive Gruppe" wird als eine eines Paares chemisch reaktiver Gruppen definiert, die chemospezifisch mit dem komplementären Glied des Paares reagiert. Zum Beispiel sind Aminooxyacetyl ("AOA") und Glyoxylyl ("GXL") komplementäre orthogonale chemisch reaktive Gruppen, die unter Bildung einer Oximbindung reagieren.
[0017] Die Bezeichnung "chemoselektiv ligiert" deutet die spezifische Ligation an, die zwischen komplemenären orthogonalen chemisch reaktiven Gruppen auftritt. [0018] "Orthogonal" bezieht sich auf Bedingungen oder Gruppen, die benutzt werden können, ohne andere vorhandene Gruppen oder andere anzuwendende Chemie zu kompromittieren. So sind zum Beispiel im Zusammenhang mit dieser Anmeldung Aminooxyacetylgruppen orthogonal.
[0019] Ein "komplementäres orthogonales spezifisch aktives Molekül" ("COSM") ist ein Molekül, das eine komplementäre orthogonale chemisch reaktive Gruppe und ein spezifisch aktives Molekül oder einen Teil davon enthält. Ein COSM ist teilweise dadurch definiert, dass es eine komplementäre orthogonale chemisch reaktive Gruppe hat, die zu chemoselektiver Ligation an die an einer Stammmolekülstruktur vorhandene komplementäre orthogonale chemisch reaktive Gruppe fähig ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung muss die komplementäre orthogonale chemisch reaktive Gruppe eines COSM ein Glied eines Oximbindungen bildenden reaktiven Paares sein. Der Ausdruck "spezifisch aktiv" deutet an, dass neben seiner komplementären orthogonalen chemischen Reaktivität das COSM auch eine definierte biologische, chemische oder physikalische Aktivität besitzt. Es ist natürlich offenbar, dass eine definierte, inhärente Aktivität eines COSM von der COSM-Struktur selbst her nicht unmittelbar offensichtlich sein mag, bevor Reaktion mit dem Stammmolekül erfolgt, um das makromolekulare Endprodukt zu bilden. Der Ausdruck COSM an sich ist nicht dazu bestimmt, die Natur der zweiten organischen Moleküle einzuschränken, sondern dazu, austauschbar damit verwendet zu werden. Ausserdem kann jede spezifische Aktivität, die mit dem zweiten organischen Molekül verbunden ist, nach Anfügung an das Stammmolekül aktiviert oder realisiert werden.
[0020] "Spezifische biologische Aktivität" bedeutet eine einem besonderen Molekül oder einer besonderen Gruppe dank seiner/ihrer Struktur mitgeteilte biologische Aktivität. Eine spezifische biologische Aktivität kann einem besonderen Molekül oder einer besonderen Gruppe allein eigen sein oder mit den Mitgliedern einer Familie verbunden sein, zu der das besondere Molekül oder die besondere Gruppe gehört.
[0021] Der Fachmann wüsste, dass eine spezifische biologische Aktivität auch an strukturell unähnliche oder nicht verwandte Moleküle oder Gruppen gebunden sein kann, die die gleiche spezifische biologische Aktivität wie ein besonderes Molekül oder eine besondere Gruppe besitzen. Zum Beispiel kann ein anti-idiotypischer Antikörper die gleiche spezifische biologische Aktivität besitzen wie das Antigen, das dazu benutzt wurde, um den Antikörper hervorzubringen, für den der anti-idiotypische Antikörper hervorgebracht worden war, obwohl der anti-idiotypische Antikörper und das Antigen strukturell unähnlich sind.
[0022] "Spezifische chemische Reaktivität" bedeutet eine einem besonderen Molekül oder einer besonderen Gruppe dank seiner/ihrer Struktur mitgeteilte chemische Aktivität. Eine spezifische chemische Aktivität kann einem besonderen Molekül oder einer besonderen Gruppe allein eigen sein oder mit den Mitgliedern einer Familie verbunden sein, zu der das besondere Molekül oder die besondere Gruppe gehört. Wechselweise kann eine spezifische chemische Aktivität mit einer kleinen Anzahl von strukturell unähnlichen oder nicht verwandten Molekülen oder Gruppen verbunden sein, die die gleiche spezifische chemische Aktivität wie ein besonderes Molekül oder eine besondere Gruppe besitzen.
[0023] "Paralleler Aufbau" bedeutet die kontrollierte Vielstellungs-Reaktion, die eintritt, wenn eine Mehrzahl eines zweiten organischen Moleküls (COSM), die einen Typ von orthogonaler chemisch reaktiver Gruppe hat, chemoselektiv mit der komplementären orthogonalen chemisch reaktiven Gruppe der Stammmolekülstruktur ligiert.
[0024] Ein antigenes Molekül schliesst eine Substanz, oft RNA oder ein Peptid, ein, die einen tierischen Organismus anregen kann, Antikörper zu erzeugen, und die sich spezifisch mit den so erzeugten Antikörpern verbinden kann. Ein Antikörper-Antigen- Komplex bedeutet ein molekulares Aggregat, das durch die spezifische Wechselwirkung zwischen Antigenen und Antikörpern gebildet wird.
[0025] Ein Antikörper ist ein Glykoprotein des Globulin-Typs, das in einem tierischen Organismus als Antwort auf die Verabreichung eines Antigens gebildet wird und das fähig ist, sich spezifisch mit dem Antigen zu verbinden. Diese werden auch als Immunglobuline bezeichnet. Antikörperfragmente können eine gewisse Fähigkeit behalten, sich selektiv mit ihrem Antigen oder Hapten zu verbinden. Die Fähigkeit, mit einem Antigen oder Hapten zu binden, wird durch Antigen-Bindungs-Prüfungen bestimmt (siehe z. B. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane, Herausgeber, Cold Spring Harbor, New York (1988), durch Bezugnahme hier aufgenommen). Solche Antikörperfragmente sind zum Beispiel Fab, Fab' und (Fab')&sub2;, sind aber nicht darauf beschränkt. Ein nativer Antikörper ist ein aus einem Tier oder aus einem Zellenstamm von einer Tier oder Hybridtier (Hybridom) isolierter Antikörper.
[0026] Ein Hapten bezieht sich auf den Teil eines Antigens, der mit den Immunprodukten einer Immunantwort reagiert, aber selbst keine Immunantwort induzieren kann, ohne komplex an einen Träger gebunden zu sein, um das vollständige Antigen zu bilden. Metallchelate sind ein Beispiel für Haptene.
[0027] Wie hierin verwendet, bezieht sich "Komplementarität bestimmende Region" (CDR: complementarity determining region) auf Aminosäuresequenzen an entweder der variablen leichten oder der variablen schweren Kettenregion eines Antikörpers, die eine dreidimensionale Schlaufenstruktur bilden, die zur Bildung des antigen- oder hapten-bindenden Ortes beitragen.
[0028] Ein therapeutisches Mittel ist jedes Molekül, das, wenn einem Tier verabreicht, eine Krankheit verhindert oder mildert oder im Tier eine Erkrankung anhält oder mildert. Therapeutische Mittel können Antitumor-Antibiotika, Antivirus- Proteine, Radioisotope, Pharmazeutika oder ein Toxin sein, sind aber darauf nicht beschränkt.
[0029] Ein polyvalentes Molekül ist ein Molekül, das mehr als einen Bindungsort für Wechselwirkung zwischen Molekülen hat. Ein Beispiel für ein polyvalentes Molekül ist ein polyvalentes Immunogen, das multiple Antigene enthält.
[0030] Ein "pharmazeutisch annehmbarer Träger" bedeutet irgend einen unter den genormten pharmazeutischen Trägern wie phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung; Wasser; oder Emulsion wie Öl-in-Wasser-Emulsion; potentiell unter Einschluss verschiedener Arten von Benetzungsmitteln.
[0031] Verabreicht bedeutet, das Subjekt mit einer wirksamen Menge der Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung zu versorgen. Verfahren der Verabreichung an ein Tier sind dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt und schliessen die orale, intravenöse, transkutane und parenterale Verabreichung ein, ohne aber darauf beschränkt zu sein. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im Verlaufe anderer Behandlungen erfolgen. Verfahren, um die wirksamsten Mittel und Dosierungen zu bestimmen, sind dem Fachmann wohlbekannt und ändern sich mit der Verbindung oder Zusammensetzung für die Behandlung, dem Zweck der Therapie und dem zu behandelnden Tier oder Patienten.
[0032] Peptid oder Protein sollen sowohl natürlich vorkommende wie rekombinierte Formen sowie andere, nicht natürlich vorkommende Formen des Peptids oder Proteins bedeuten, die mit dem natürlich vorkommenden Peptid oder Protein genügend übereinstimmen, um den Besitz ähnlicher biologischer oder chemischer Aktivität zu erlauben. Vom Stand der Technik ist bekannt, dass Peptide aus nicht natürlich vorkommenden oder nicht proteinogenen Aminosäureresten gebildet werden können. Des weiteren können, wie vom Stande der Technik wohlbekannt ist, Aminosäurereste über nichtamidische Bindungen miteinander verbunden werden. Peptide oder Proteine können auch Schutzgruppen an jedem der beiden Enden enthalten, die einen in-vivo- Abbau des Peptids oder Proteins verhindern oder auf ein Minimum reduzieren können.
[0033] Eine "homogene Polyoximzusammensetzung" der Erfindung bezieht sich auf eine chemische Zusammensetzung, in der im wesentlichen alle Polyoximmoleküle ein und dieselben chemischen Strukturen haben (im Gegensatz zu einem typischen organischen Polymer, in dem sich die einzelnen Moleküle zumindest in ihrer Länge und oft auch in ihrer spezifischen Struktur unterscheiden, wie in einem statistischen Copolymer). Solche Zusammensetzungen können auch als "selbstidentische" Zusammensetzungen bezeichnet werden, da im wesentlichen alle individuellen Moleküle des Polyoxims miteinander identisch sind. Hier besagt "im wesentlichen alle", dass wenigstens 80% aller Stammmoleküle jeweils die gleiche Anzahl identischer COSMs am Stammmolekül angefügt besitzen. Steigende Reinheitsgrade wie 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8% usw. und bis hin zu 100% sind zunehmend bevorzugte Bedeutungen von "im wesentlichen alle". Wie im verbleibenden Teil der Anteldung diskutiert, sind bei einem Heteropolyoxim nicht alle COSMs an einem einzelnen Stammmolekül identisch, dennoch kann aber die Zusammensetzung homogen im hier definierten Sinne sein. Es lässt sich angesichts der vorliegenden Erfindung leicht einsehen, dass homogene Polyoximzusammensetzungen aus Homopolyoximen oder Heteropolyoximen bestehen können. Zum Beispiel gestattet es der schrittweise Aufbau, bei jedem Schritt ein unterschiedliches COSM einzuführen, um eine homogene Zusammensetzung eines Heteropolyoxims zu schaffen. Heterogene Zubereitungen von Polyoximen können absichtlich dadurch erzeugt werden, dass während eines Oximierungsschrittes eine Mischung verschiedener COSMs eingesetzt wird, zum Beispiel zur Errichtung einer Polyoxim-Peptid-Bibliothek, oder dadurch, dass ein COSM-Gemisch angefügt wird, das aus Molekülen einer homologen Reihe besteht.
[0034] Wie hierin verwendet, bezieht sich "Makromolekül" auf ein organisches Molekül (einschliesslich von Molekülen biologischen Ursprungs sowie von organischen Molekülen mit anorganischen Bestandteilen), das ein Molekulargewicht von wenigstens 2000, vorzugsweise wenigstens 5000 und stärker bevorzugt wenigstens 10000 hat.

Beschreibung

[0035] Diese Erfindung stellt neuartige, polyvalente Moleküle definierter Struktur mit einer Mehrzahl von stabilen Oximbindungen, homogene Zusammensetzungen dieser Moleküle sowie Reagentien und Verfahren für einen raschen und spezifischen Aufbau solcher Moleküle durch chemoselektive Ligation über Oximbildung zur Verfügung. Für die Zwecke dieser Erfindung werden diese Moleküle allgemein als Polyoxime bezeichnet. Sowohl Homopolyoxime wie Heteropolyoxime werden zur Verfügung gestellt. Die Homopolyoximverbindungen umfassen ein organisches Stammmolekül mit einer Mehrzahl von Oximbindungen, vorzugsweise mindestens drei, zu einer Mehrzahl eines zweiten organischen Moleküls. In einer Ausführungsform haben alle Oximbindungen dieselbe Ausrichtung. Die Heteropolyoximverbindungen umfassen ein organisches Stammmolekül mit einer Mehrzahl von Oximbindungen, vorzugsweise mindestens drei, zu einer Mehrzahl von zweiten organischen Molekülen; worin sich zumindest eines der an das Stammmolekül angefügten zweiten organischen Moleküle in seiner chemischen Zusammensetzung von einem anderen, an das Stammmolekül angefügten zweiten organischen Molekül unterscheidet. Stammmoleküle sind organische Moleküle mit einer Mehrzahl einer oximbildenden orthogonalen reaktiven Gruppe, die chemoselektiv mit der zu ihr komplementären orthogonalen reaktiven Gruppe reagieren kann, die an einem beliebigen einer Mehrzahl eines zweiten organischen Molekül vorhanden ist. Homogene Zusammensetzungen von Polyoximen werden durch Reaktion mit Hilfe von Oximbindungsbildung zwischen einer komplementären orthogonalen reaktiven Gruppe an einem Stammmolekül und der zu ihr komplementären orthogonalen reaktiven Gruppe an einem zweiten, spezifisch aktiven Molekül gebildet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Stammmolekülstruktur ein Peptid mit einer aus Aminosäureresten gebildeten Hauptkette. Wie vom Stande der Technik her bekannt, können Peptide, die nicht natürlich vorkommende Aminosäuren oder optische D-Isomeren oder substituierte (zum Beispiel N substitutierte) Aminosäuren, β-Aminosäuren oder dergleichen enthalten, durch chemische Synthese hergestellt werden; Peptide, die ungewöhnliche Aminosäuren enthalten, können durch Rekombinationsmittel erzeugt werden, werden aber gewöhnlich durch chemische Synthese oder postexpressive Modifizierung hergestellt. Die Peptid-Stammmolekülhauptkette umfasst Aminosäurereste mit Seitenkettengruppen, die sich für eine Modifizierung zu oximbildenden komplementären orthogonalen reaktiven Gruppen während der Peptidsynthese eignen. Chemisch reaktive Gruppen, die Oximbindungen mit einer komplementären, chemisch reaktiven Gruppe an einem COSM bilden können, sind an vorzugsweise mindestens drei der Aminosäurereste im Stammmolekül vorhanden. Aminosäurereste können während der Peptidbindungsbildung als modifizierte Monomere, die oximbildende, chemisch reaktive Gruppen enthalten, eingebaut oder nach der Bildung von Peptidbindungen so modifiziert werden, dass sie solche Gruppen enthalten. Als Träger oximbildender Gruppen bevorzugte, gewöhnliche Reste können Reste sein, die in differentiell geschützter Form verfügbar sind, leicht durch herkömmliche Verfahren modifiziert werden können und stabile Abkömmlinge ergeben. Bevorzugt werden Lysin- und Ornithinreste, die sich sehr leicht acylieren lassen und durch reduktive Alkylierung modifiziert werden können, sowie Cysteinreste, die durch Alkylierung oder Disulfidbildung modifiziert werden können. Weniger bevorzugte Reste sind Serin, Threonin, Histidin, Methionin (die sich alkylieren lassen), Tyrosin (das alkyliert werden kann, aber dessen Acylabkömmlinge nicht sehr stabil sind) und Tryptophan (das alkyliert oder acyliert werden kann). Reste können auch danach ausgewählt werden, dass sie erwünschte physikalische oder biologische Eigenschaften wie Abstaüd, Ladung oder Löslichkeit verleihen. Als Träger oximbildender Gruppen ebenfalls bevorzugte Reste sind Homologe dieser Aminosäuren, D- anstelle von L-Isomeren, substituierte (zum Beispiel N substituierte) Abkömmlinge und β-Aminosäuren.
[0036] Im Falle von Heteropolyoximen können alle chemoselektiv ligierten COSM an einem Stammmolekül unabhängig einander gleichen oder voneinander verschieden sein. Andere Ausführungsformen enthalten Stammmoleküle und/oder COSMs, die ganz oder teilweise aus Zuckerresten, Nucleinsäureresten und/oder Lipiden gebildet sind. Es ist aus der Offenbarung dieser Erfindung ersichtlich, dass fast jeder Rest, der ein Baustein für Oligo- oder Makromoleküle ist, dazu benutzt werden kann, um ein COSM oder ein Stammmolekül zu bilden. Angesichts dieser Offenbarung wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass mit den schnellen, spezifischen, milden und wandelbaren Verfahren, diese Verbindungen in hoher Ausbeute herzustellen, noch grössere und komplexere Moleküle nun leicht zugänglich sind.
[0037] In einer Ausführungsform wird das Stammmolekül oder das COSM durch Rekombinationsverfahren ausgelegt und hergestellt oder aus natürlichen Quellen iso liert, während eine oximbildende komplementäre orthogonale reaktive Gruppe wie ein Aldehyd durch selektive, enzymkatalysierte Umkehrproteolysean der C-Endgruppe des Polypeptids oder durch milde Oxidation an einer Serin- oder Threonin- N-Endgruppe stellungsspezifisch gebildet wird. (Siehe zum Beispiel Geoghegan und Mitautoren (Bioconjugate Chem. (1992) 3 : 138-146), Gaertner und Mitautoren (Bioconjugate Chem. (1992) 3 : 262-268), EP 243 929 und WO 90/02 135, die durch Bezugnahme hier aufgenommen werden.) Für seinen Einsatz als ein polyvalentes Stammmolekül weist eine homogene Zubereitung von rekombiniertem oder natürlichem Peptid bevorzugt multiple C- oder N-Endgruppen auf, wie sie in einem Dimer oder Tetramer auftreten würden, um die spezifische Bildung von orthogonal reaktiven Gruppen zu erleichtern. Zum Beispiel kann ein Insulin-Analoges mit einer A-Kette, die kovalent an eine B-Kette gebunden ist, wobei jede Kette ein N-endständiges Serin (oder Threonin) hat, durch regioselektive Oxidation zu einem zweiwertigen Aldehyd- Stammmolekül umgewandelt werden. In einer weiteren Ausführungsform können die C-Endgruppen durch enzymkatalysierte Umkehrproteolyse so modifiziert werden, dass ein Tri- oder Tetraaldehyd-Stammmolekül geschaffen wird. Solche Stammmoleküle unterscheiden sich zumindest in ihrer Grösse und Komplexität vorteilhaft von Peptid-Stammmolekülen, die durch Festphasensynthese hergestellt werden. Wie hierin gelehrt, ist für den Fachmann eine grosse Flexibilität bei der Auslegung und Herstellung von Stammmolekülen und COSMs der gewünschten Sequenz, Struktur und Funktion mit spezifisch platzierten komplementären reaktiven Gruppen verfügbar. Polyoxime und Verfahren für deren Synthese, die in den Laboratorien der gegenwärtigen Erfinder entwickelt worden sind, werden bei Rose (J. Am. Chem. Soc., "Facile synthesis of artificial proteins" ["Leichte Synthese künstlicher Proteine"] (1994) 116 : 30-33, durch Bezugnahme hier aufgenommen) beschrieben.
[0038] Obwohl die bevorzugten Stammmolekül- und COSM-Strukturen typischerweise aus Aminosäureresten gebildet werden, schliessen andere Ausführungsformen aus Zuckerresten, Nucleinsäureresten und/oder Lipiden gebildete Strukturen ein.
[0039] Wenn die Stammmolekül- oder COSM-Struktur ein Peptid ist, dann sind die endständigen chemischen Gruppen normalerweise eine Aminogruppe und eine Carboxylgruppe. Der Fachmann wird wissen, dass diese endständigen Gruppen reaktiv oder nichtreaktiv gemacht werden können. Nichtreaktive Gruppen können nichtreaktiv sein, weil die Gruppe chemisch geschützt ist, aber reaktiv gemacht werden, indem die Gruppe von der Schutzgruppe befreit oder anderweitig modifiziert wird, wie hierin gelehrt und vom Stande der Technik her bekannt. Wechselweise können die endständigen chemischen Gruppen eines Stammmoleküls kovalent an einen Rest innerhalb der Stammmolekülstruktur gebunden werden, um eine zyklische Stammmolekülstruktur zu bilden.
[0040] Diese Erfindung stellt in einer Ausführungsform eine Stammmolekülstruktur zur Verfügung, in der die eine komplementäre reaktive, zur Oximbindungsbildung befähigte Gruppe eine Aminooxygruppe oder eine Aldehydgruppe ist. Bevorzugt werden Aminooxyacetyl- ("AOA") oder Aldehydgruppen wie OHC-CO- oder Glyoxylyl ("GXL"). Tatsächlich kann zusätzliche Struktur (XC in der Formel) benutzt werden, die eine Aldehydgruppe (oder eine Aminooxygruppe) an eine interessierende Struktur anhängt: zum Beispiel OCH-X-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH, worin X einfach -CO- oder eine kompliziertere Struktur sein kann; oder NH&sub2;-O-X- Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH, worin X einfach -CH&sub2;-CO- oder eine kompliziertere Struktur sein kann.
[0041] Wenn Aldehydgruppen am Stammmolekül vorhanden sind, sind die in der zusätzlichen, verbindenden Struktur in Nachbarschaft zur Aldehydfunktion vorhandenen Gruppen nicht kritisch; eine Anforderung an diese Gruppen ist jedoch, dass sie nicht die Bildung der Oximbindung zwischen der Aldehyd- und der zu ihr komplementären Aminooxygruppe stören. Sie sollten nicht zum Nachteil der Aldehydgruppe bevorzugt mit der Aminooxygruppe reagieren noch die Reaktion sterisch hindern oder die reaktiven Gruppen desaktivieren. Die verbindende Gruppe reagiert nicht mit anderen, vorhandenen Funktionen, wenn sie aber dafür ausgelegt ist, dann geschieht das nicht in unerwünschter Weise (zum Beispiel so, dass Produkthomogenität oder -aktivität vermindert würde).
[0042] Die verbindende Gruppe stellt bevorzugt eine nicht reagierende Gruppe dar, darunter substituierte oder nicht substituierte aliphatische oder aromatische Gruppen wie Phenylgruppen oder Cl-Cio-Alkylengruppen, C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylgruppen oder eine Kombination dieser Gruppen, eine Aminosäurekette (wie eine nichtstarre Henkel- oder Schlaufensequenz (siehe zum Beispiel Argos, J. Mol. Biol. (1990) 211: 943-958)) oder eine Nucleotidkette, Zuckerkette, Lipidkette oder Kombination dieser Ketten, und sie kann Heteroatome enthalten.
[0043] Wenn Aminoxygruppen am Stammmolekül vorhanden sind, sind die in der zusätzlichen, verbindenden Struktur in Nachbarschaft zur Aminooxyfunktion vorhandenen funktionellen Gruppen nicht kritisch; eine Anforderung an diese Gruppen ist jedoch, dass sie nicht die Bildung der Oximbindung zwischen der Aminooxy- und der zu ihr komplementären Aldehydgruppe stören. Sie sollten nicht zum Nachtel der Aminooxygruppe bevorzugt mit der Aldehydgruppe reagieren noch die Reaktion sterisch hindern oder die reaktiven Gruppen desaktivieren.
[0044] Die vorstehende, die in der zusätzlichen, verbindenden Struktur in Nachbarschaft zur Aldehydfunktion vorhandenen funktionellen Gruppen oder die an den Stammmolekülen vorhandene Aminooxyfunktion beschreibende Diskussion ist auf die verbindenden Gruppen an den COSM anwendbar.
[0045] Wenn das Polyoxim für antigene oder immunogene Zwecke eingesetzt werden soll, so ist es für den Fachmann offensichtlich, dass verbindende Gruppen ausgewählt werden, die nicht stark immunogen sind. Wenn das Polyoxim zu Bindungszwecken eingesetzt werden soll, dann wird die bevorzugte verbindende Gruppe Eigenschaften wie Bindung, Avidität, Produktstabilität oder Löslichkeit verstärken oder zumindest nicht stören.
[0046] Die verbindende Gruppe kann so gewählt werden, dass sie die hydrolytische Stabilität der Oximbindung verstärkt. Die hydrolytische Stabilität von Oximne wird durch ihre Struktur beeinflusst; Daten deuten darauf hin, dass die Oximstabilität in der Reihenfolge: -CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2; = N-O-CH&sub2; < -NH-CO-CH=N-O-CH&sub2; < -C&sub6;H&sub4;- CH=N-O-CH&sub2;-, ansteigt.
[0047] Die Merkmale einer verbindenden Gruppe gelten auch, wenn Stammmoleküle und COSMs aus Zucker-, Nucleinsäure- oder Lipidresten hergestellt werden.
[0048] Stammmoleküle der Erfindung umfassen ferner wahlweise auch Reste, die nicht in der Lage sind, Oximbindungen mit einem COSM zu bilden. Solche Reste können zwischen den komplementären reaktiven Gruppen genügend Abstand schaffen, damit grosse COSMs untergebracht werden können. Zusätzlich können solche Reste, wenn sie in geeigneter Weise platziert sind, weitere wünschenswerte Merkmale herbeiführen, wie sie für Sequenzen solcher Reste bekannt sind oder bestimmt werden können, darunter - ohne darauf beschränkt zu sein - die Schaffung erwünschter tertiärer Konformation, Konfvrmationszwang, Seitigkeit (wie durch Bildung einer amphipathischen Helix), Gerüstbildung (wie sie durch konstruierte Polypeptid-Minikörper geschaffen wird), erhöhte Löslichkeit, Lipophilität, biologische Aktivität oder Funktion. Beispiele solcher chemisch inerter Reste sind unter anderem - ohne darauf beschränkt zu sein - Aminosäuren, Zucker und Nucleotide. Dem Fachmann sind die verschiedenen Methoden, die sekundäre und sogar die tertiäre Struktur komplexer Moleküle vorherzusagen, wohl vertraut: es sind Verfahren, die dazu eingesetzt werden, Stammmolekül-Ausführungsformen der Erfindung mit der gewünschten Funktionalität auszulegen.
[0049] Wenn die Stammmolekülstruktur ein Peptid umfasst, dann ist dem Fachmann bewusst, dass in Lösung die Peptid-Stammmolekülstruktur eine Konformation besitzt, die teilweise von der Aminosäuresequenz des Peptids abhängt. Solche Information ist nützlich, wenn die optimale Aminosäuresequenz der Peptid-Stammmolekülstruktur für eine spezifische Aufgabe festgelegt werden soll. Zum Beispiel kann eine Peptid- Stammmolekülstruktur, von der vorhergesagt wird, dass sie eine α-Helixstruktur bildet, so synthetisiert werden, dass die Aminosäurereste, die die komplementären orthogonalen, chemisch reaktiven Gruppen enthalten, aus derselben Seite der α-Helix hervorstehen. Nach chemoselektiver Ligation mit einem COSM steht dann die spezifisch aktive Region jedes COSM in derselben Richtung hervor. Der Fachmann kennt weitere Arten von Konformationen, die von spezifischen Peptiden in Lösung angenommen werden, und kann daher Polyoxime synthetisieren, die eine erwünschte tertiäre Struktur besitzen, darunter der erwünschte Abstand zwischen benachbarten COSMs. Zum Beispiel werden bevorzugte synthetische Peptid-Stammmoleküle, Peptid-Entwurfsmethoden und andere synthetische Gesichtspunkte teilweise und in Beispielen durch Altmann und Mutter (Int. J. Biochem. (1990) 22 : 947-956 und darin zitierte Literatur) beschrieben.
[0050] Ein "Lysinbaum", der durch Festphasen-Peptidsynthese gebildet wird, wie von Tam und Zavala veranschaulicht (J. Immunol. Meth. (1989) 124 : 52-61) und durch Bezugnahme hier aufgenommen, eignet sich zur Verwendung bei der Stammmolekülbildung, wenn er, wie hierin beschrieben, so modifiziert wird, dass er oximbildende komplementäre orthogonale reaktive Gruppen enthält, die dieselbe Ausrichtung haben können. Wechselweise kann eine Stammmolekülstruktur von einer Matrize gebildet werden, wie sie für "matrizen-gebautes synthetisches Protein" (TASP: template-assembled synthetic protein) zum Beispiel von Floegel und Mitautoren beschrieben wurde (Biopolymers (1992) 32 : 1283-1310), hier durch Bezugnahme aufgenommen, sofern sie, wie hierin beschrieben, so modifiziert wird, dass sie oximbildende komplementäre orthogonale reaktive Gruppen enthält, die dieselbe Ausrichtung haben können. Mit Aldehyd- oder Aminooxygruppen endständig funktionalisierte Carborods können als zweiwertige Stammmoleküle oder, wechselweise, als COSM dienen. Carborods, die als homogene Moleküle diskreter Länge und definierter Struktur hergestellt werden, können mit spezifischer Endgruppenfunktionalität modifiziert werden. (Siehe Moore, (1993) Nature 361 : 118-119 und darin zitierte Literatur, hier durch Bezugnahme aufgenommen.)
[0051] Wenn das Stammmolekül aus Aminosäuren gebildet wird, kann die Peptidsequenz einer Stammmolekülstruktur durch routinemässige Festphasen-Peptidsynthese ("SPPS") synthetisiert werden, und noch während das Peptid an die feste Phase gebunden ist, kann Boc-aminooxyessigsäure (Boc-AOA: Boc-amino-oxyacetic acid) in einer aktivierten Form wie der N hydroxysuccinimidester zur entstehenden Peptidkette hinzugefügt werden. Zum Beispiel kann die Stammmolekülstruktur aus einem Peptid bestehen, das fünf reaktive Gruppen wie zum Beispiel fünf Lysinreste hat. Boc-AOA-N hydroxysuccinimidester kann mit jeder der &epsi;-Aminogruppen der Lysinreste reagieren, ebenso wie die N-endständige α-Aminogruppe, wenn sie ungeschützt geblieben ist, um die Stammmolekülstruktur zu bilden, die in diesem Beispiel eine &epsi;-AOA-Pentalysinsequenz und eine AOA-Gruppe an der N-Endgruppe enthalten würde, sofern die N-endständige α-Aminogruppe absichtlich acetyliert worden war.
[0052] Wechselweise können Boc-Ser(benzyl)-OH oder Boc-Ser(t-butyl)-OH in einer aktivierten Form wie der N Hydroxysuccinimidester eingesetzt werden, um die komplementäre orthogonale, chemisch reaktive Gruppe an der Stammmolekülstruktur zu bilden. Boc-Serin(benzyl)-N-hydroxysuccinimidester reagiert mit den &epsi;-Aminogruppen der fünf Lysinreste sowie auch, wenn gewünscht, mit der N-endständigen α-Aminogruppe, um ein Vorstufen-Stammmolekül zu bilden, das &epsi;-Ser-Pentalysin und eine N-endständige α-Ser-Gruppe enthält. Durch Behandlung des Vorstufen- Stammmoleküls mit einem milden Oxidationsmittel wie Periodat bei pH 7 werden e-Ser-Pentalysin und, sofern vorhanden, das N-endständige α-Ser zu &epsi;-GXL- Pentalysin bzw. N-endständigem α-GXL umgewandelt, wodurch eine Hexa-GXL- Stammmolekülstruktur erzeugt wird.
[0053] Die Oxidationsreaktion kann unter Benutzung irgend einer 1,2-Diol- oder 1-Amino-2-ol- oder 1-Ol-2-aminoverbindung abgebrochen werden, die eine verhältnismässig freie Rotation um die 1,2-Bindung besitzt, wie zum Beispiel Ethylenglykol. Wechselweise kann die Oxidationsreaktion durch rasche Entfernung des Periodats abgebrochen werden, zum Beispiel durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatography (RP-HPLC: Reverse-Phase High-Performance Liquid Chromatography). Da die Oxidationsreaktion nur mit Serinresten abläuft, die eine primäre Aminogruppe enthalten, werden nur die &epsi;-Serinreste und die Serinreste am N-Ende des Peptids zu Glyoxylyl umgewandelt. Der Fachmann kennt Methoden, um ein N-endständiges Serin gegen OOxidation Oxidation chemisch zu schützen, sofern ein solcher Schutz erwünscht ist.
[0054] Nach der Umwandlung der &epsi;- und α-Serinreste zu GXL-Gruppen kann eine Oximierungsreaktion zwischen der GXL-Starnmmolekülstruktur und komplementären AOA-COSMs bei pH 4,6 unter Bildung eines Polyoxims erfolgen. Oxime bilden sich über einen breiten pH-Bereich, aber bilden sich rasch bei ph-Werten unterhalb von etwa pH 5. Das Ausmass der Polyoximbildung kann durch RP-HPLC verfolgt werden, und die Reaktion kann durch präparative RP-HPLC abgebrochen werden. Das Molekulargewicht der anfallenden Verbindung kann durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie bestimmt werden. Wechselweise kann eine AOA- Stammmolekülstruktur benutzt werden, und eine Oximierungsreaktion kann zwischen der AOA-Stammmolekülstruktur und einer Mehrzahl von COSM mit einer Aldehydgruppe erfolgen.
[0055] Wechselweise wird die Oximierung bei pH unterhalb von 4,6 durchgeführt. Niedrigere ph-Werte können für die Löslichkeit einiger Peptide von Vorteil sein. Ein ph-Wert von 2,1 wird bevorzugt, um die Löslichkeit einiger Peptide, zum Beispiel von Aminooxyacetyl-YREDGVTPYMIFFKDGLEMEK-OH (Seq. ID-Nr.: 12), zu erhöhen. Zusätzlich verläuft die Oximierung bei ph 2,1 viel rascher als bei pH 4,6. Der Fachmann kann das pH-Löslichkeitsprofil eines COSM und eines Stammmoleküls für die Polyoximbildung bestimmen und einen geeigneten pH-Wert für eine spezifische Oximierungsreaktion wählen, wobei die ph-Stabilität der Moleküle während der Oximierungsreaktion berücksichtigt wird.
[0056] Die an der Stammmolekülstruktur vorhandenen komplementären orthogonalen, chemisch reaktiven Gruppen sind nützlich, um ein COSM chemoselektiv an die Stammmolekülstruktur zu ligieren und so ein Polyoxim zu erzeugen. Wenn zum Beispiel die Stammmolekülstruktur AOA-Gruppen und die COSM-Struktur eine Aldehydgruppe wie Glyoxylyl (GXL) enthält, führt Oximierung durch chemoselektive Ligation der komplementären orthogonalen chemischen Gruppen rasch und im wesentlichen quantitativ zur Bildung einer homogenen Zubereitung eines Polyoxims definierter Struktur.
[0057] In Ausführungsformen von Heteropolyoximen, in denen das Stammmolekül potentiell sowohl chemisch reaktive Aldehyd- wie Aminooxygruppen enthält, zum Beispiel sowohl AOA- und GXL-Gruppen, kann eine der Gruppen während der chemoselektiven Ligation eines ersten COSM mit einer orthogonalen, chemisch reaktiven Gruppe, die komplementär zur ungeschützten, oximbildenden Gmppe des Stammmoleküls ist, geschützt werden. Schutzgruppen werden in den Beispielen weiter unten aufgezeigt. Die zweite chemoselektive Ligation kann dann durchgeführt werden, wenn von den geschützten Gruppen der Stammmolekülstruktur die Schutzgruppen entfernt worden sind. Am einfachsten kann eine erste Oximbindung (oder ein erster Satz von Bindungen) vor der Umwandlung von Ser in GXL gebildet werden, woraufhin eine zweite Oximbindung (oder ein zweiter Satz von Bindungen) durch die neugebildeten GXL-Gruppen gebildet werden kann. Die Oximbindung ist bekanntermassen während der Periodat-oxidation von Ser zu GXL stabil. Auf diese Weise können sehr komplizierte Heteropolyoxime gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Stammmolekül ein oder mehrere Lysine mit einem &epsi;-AOA und ein oder mehrere zweite Lysine mit einem &epsi;-Ser, wobei Polyoximsynthese durch eine erste Oximierung über die AOA-Gruppe erfolgt, woraufhin Ser zu GXL oxidiert wird und danach eine zweite Oximierung erfolgt. Wechselweise kann das Stammmolekül in seiner Konformation zu ausgelegt werden, dass eine intramolekulare Oximbildung verhindert wird, und weiterhin können die Konzentration der Stammmoleküle und das Verhältnis von Stammmolekülen zu COSMs so angesetzt werden, dass Stammmolekülpolymerisation auf ein Minimum begrenzt wird.
[0058] Heteropolyoxime können auch erhalten werden, wenn ein Stammmolekül mit einheitlichen reaktiven Gruppen mit einem Gemisch von COSMs (als eine COSM- Population bezeichnet) reagiert.
[0059] In einer weiteren Ausführungsform kann ein Stammmolekül zumindest einen endständigen Stammmolekülrest an eine Reportergruppe oder Linkergruppe angefügt enthalten, typischerweise über eine nicht-oximische Bindung. Die Linker- oder Reportergruppe kann chemoselektiv an die Stammmolekül-Endgruppe ligiert oder wechselweise während der Stammmolekülsynthese addiert werden. Ein Polyoxim mit einer orthogonalen Linkergruppe kann an ein zweites Polyoxim gebunden werden, das deren komplementäre orthogonale Linkergruppe enthält, um ein Polyoximdimer zu ergeben. Mit Ausnahme der komplementären Linkergruppen können die Polyoxime gleich oder verschieden sein.
[0060] Ein individuelles COSMs ist ein organisches Molekül (das einen anorganischen Bestandteil enthalten kann) wie ein Peptid, ein Polypeptid, ein Lipid, ein Oligosaccharid, eine Nucleinsäuresequenz oder eine Kombination dieser Molekülstrukturen. Zweckmässig endständig modifizierte Carborods sind geeignete COSMs. In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt Oximbildung über Aldehydgruppen, die endständig an reduzierenden Zuckern vorhanden sind oder durch milde chemische oder enzymatische Oxidation an Zuckern erzeugt werden. In einer anderen Ausführungsform erfolgt Oximbildung über eine Aldehydgruppe, die durch endständige Oxidation einer Nucleinsäure, wie von Reines und Cantor am Beispiel von RNA beschrieben (Nucleic Acids Res. (1974) 1 : 767-786, hier durch Bezugnahme aufgenommen), oder während der chemischen oder enzymatischen Synthese einer Nucleinsäuresequenz erzeugt wird. Solche Aldehyde sind geeignete komplementäre reaktive Gruppen für Oximbildung.
[0061] In einer Ausführungsform von Homopolyoximen dieser Erfindung ist ein COSM ein Peptid. In einer anderen Ausführungsform ist ein COSM und somit das Polyoxim selbst antigen, vorzugsweise immunogen. In einer Ausführungsform von Heteropolyoximen dieser Erfindung ist wenigstens ein COSM ein Peptid. In einer anderen Heteropolyoxim-Ausführungsform ist wenigstens ein COSM eines Polyoxims und somit das Polyoxim selbst antigen, vorzugsweise immunogen. Antigene Polyoxime sind von Nutzen in vitro und in vivo. In vitro sind antigene Polyoxime zum Beispiel als Reagentien für Immunoassays von Nutzen. In vivo dienen antigene Polyoxime als Immunogene, die zum Beispiel als Impfstoffe von Nutzen sind. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung liefert ein Polyoxim mit einem hapten-artigen oder antigenen Peptid-COSM ein antigenes Molekül mit einer gegenüber dem Peptid allein erhöhten Wertigkeit und erhöhter Immunigenität. Polyvalenz führt allgemein zu stärkerer Bindung und höherer Spezifität der Wechselwirkung, da mehr Berührungspunkte einbezogen sind. Im Falle eines Polyoxims mit Vielfachexemplaren eines Liganden für einen Rezeptor können naheliegende Rezeptoren überbrückt werden, sofern die COSM-Beabstandung und die durch das Stammmolekül gelieferte Orientierung dafür geeignet sind.
[0062] Angesichts der vorliegenden Offenbarung kann ein Fachmann ein COSM gewinnen, das die geeigneten komplementären, chemisch reaktiven Gruppen enthält. Zum Beispiel kann ein spezifisch aktives Molekül wie ein gereinigtes Peptid-COSM durch SPPS synthetisiert werden. Im Gefolge oder während der Synthese des Peptids kann eine eines Paares oximbildender komplementärer orthogonaler, chemisch reaktiver Gruppen unter Verwendung der Methoden, die für die Synthese der Stammmolekülstrukturen beschrieben worden sind, an das Peptid angefügt werden. Andere wohlbekannte Methoden können ebenfalls zur Herstellung von Polypeptidaldehyden eingesetzt werden, zum Beispiel die automatisierte Synthese von Peptid-C-endständigen Aldehyden (siehe zum Beispiel Murphy und Mitautoren, J. Amer. Chem. Soc. (1992) 114 : 3156-3157, durch Bezugnahme hier einbezogen). Oximbildende komplementäre orthogonale, chemisch reaktive Gruppen können sowohl in einer geschützten wie in einer ungeschützten Form angefügt werden. Verfahren, um eine oximbildende komplementäre orthogonale, chemisch reaktive Gruppe an ein COSM anzufügen, schliessen das Anfügen durch eine chemisch reaktive Seitenkettengruppe ein. Zum Beispiel kann eine oximbildende komplementäre orthogonale, chemisch reaktive Gruppe über das S-Atom durch Alkylierung oder Disulfidbildung an ein Cystein enthaltendes COSM angefügt werden. Nach Oximierung ist das COSM dann über seinen Cys-Rest und eine Thioether-Bindung (oder Disulfidbindung) und über eine Oximbindung zum Stammmolekül an ein Stammmolekül gebunden. Bevorzugte Alkylierungsverbindungen sind Alkylhalogenide mit einer angefügten AOA-Gruppe. Bevorzugt sind Br-CH2-CO-NHCH2CH2NH-CO-CH2-O-NH-Boc, wo die AOA- Gruppe geschützt ist und vor einem Oximierungsschritt entfernt werden kann, und Br- CH2-CO-NFICH2CH2NH-CO-CH2-O-NH&sub2;. Ein weiteres Alkylierungsmittel ist Br- CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH-COCH&sub2;ONH-Boc. Die Bromacetylgruppe ist viel reaktiver für Alkylierung der Thiolgruppe, zum Beispiel von Cys-Resten. Weniger bevorzugt ist die Iodacetylgruppe, da sie manchmal zu reaktiv ist und durch Photolyse verloren gehen kann. Weitere Alkylierungsgruppen ausser der Bromacetylgruppe schliessen die Maleoylgruppe ein. Wie hierin gelehrt, sind Beispiele für Linker für die Proteinmodifizierung unter Verwendung dieser Gruppe AOA-Lys(maleoyl-betaalanyl)-OH und Maleoyl-betaalanyl-NHCH&sub2;CH&sub2;NHCOCH&sub2;ONH&sub2;. Obwohl die Maleoylgruppe zur Herstellung makromolekularer Konjugate nützlich ist, hat sie bekanntermassen ernste Stabilitätsprobleme (hydrolytische Ringöffnung) und ist daher weniger nützlich zur Herstellung homogener Polyoxime. Ferner liefert Alkylierung unter Verwendung der Maleoylgruppe einen Linker, der starrer und sperriger als die durch Alkylierung mit der Bromacetylgruppe erzeugte Verbindung und folglich für das Immunsystem deutlicher sichtbar ist. Ein bevorzugter Linker für invivo-Anwendungen ist derjenige, gegen den keine Immunantwort gerichtet ist.
Beispiele für Verbindungen für das Anfügen einer oximbildenden komplementären orthogonalen, chemisch reaktiven Gruppe durch eine Disulfidbindung an die Seitenkette von Cystein sind die Verbindungen, die ein 2-Pyridyl-S-S-Radikal enthalten. Bevorzugte Beispiele sind 2-Pyridyl-S-S-CH2CH2NH-CO-CH2-O-NH- Boc und 2-Pyridyl-S-S-CH2CH2NH-CO-CH2-0-NH2. Die sich ergebenden, Cys enthaltenden Abkömmlinge besitzen eine durch eine Disulfidbindung angefügte Aminooxyacetyl- (oder geschützte Aminooxyacetyl-) gruppe. Die hierin offenbarte Modifikation ist nützlich, um COSMs durch Disulfid- und Oximbindungen über eine Cys-Seitenkette an ein Polyaldehyd-Stammmolekül anzufügen. Bei dieser Art der Anfügung können COSMs, zum Beispiel Peptide, vom Stammmolekül durch Disulfidreduktion freigesetzt werden, ein Prozess, der bekanntermassen im Körper abläuft. Eine solche Freisetzung von nicht modifizierten Peptiden kann eine Immunantwort auf spätere Präsentation des entsprechenden Epitops an das natürliche Pathogen verstärken. Polyoxime weisen verschiedene Vorteile gegenüber kleinen Peptid- (oder Nichtpeptid-) immunogenen auf, weil die kleinen Moleküle typischerweise von Zellen des Immunsystems nicht leicht aufgenommen oder ohne Anfügung an einen Carrier, zum Beispiel ein Protein wie Keyhole-limpet-Hämocyanin als fremd erkannt werden. Das Polyoxim-Stammmolekül oder das Polyoxim selbst können eine wirksame, homogene Präsentation des kleinen Moleküls besorgen und eine Quelle von "Helfer-Epitopen" liefern, um das Immunsystem zu stimulieren. Durch gemeinsame Anbindung mehrerer Exemplare eines kleinen Peptids an ein Stammmolekül wird ein Makromolekül geschaffen, das vom Immunsystem "gesehen" und zur Präsentation und Erkennung durch das Immunsystem verarbeitet wird, u. a. durch Abbau.
[0063] In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung enthält ein Heteropolyoxim sowohl ein bindendes Peptid (bindende Peptide) zur gezielten Einführung (zum Beispiel Somatostatin-Analoge, die an Tumore anbinden, die Somatostatin-Rezeptoren übermässig ausdrücken) wie auch ein cytotoxisches Peptid (cytotoxische Peptide) wie eine Ricin-A-Kette, die nach Internalisierung durch die Zielzelle vom Polyoximkonstrukt freigesetzt wird. Dadurch würde der Prozess des natürlichen Toxins nachgeahmt, wo die Ricin-B-Kette die Zelle bindet, und wo nach Internalisierung des Ricins und Reduktion seiner S-S-Bindungen die Ricin-A-Kette in das Cytoplasma freigesetzt wird und so den Zellentod hervorruft. Wenn die A- und B-Ketten durch eine nicht brechende Bindung verbunden sind, ist die Toxizität (Wirksamkeit) um viele Grössenordnungen vermindert.
[0064] In zusätzlichen Ausführungsformen können Polyoxime in nichtviralen Gentherapie-Abgabesystemen verwendet werden, die freisetzbare Elemente erfordern.
[0065] Die S-S-Bindung stellt eine brechende Bindung dar. Andere brechende Bindungen schliessen Bindungen ein, die von einem spezifischen hydrolytischen Enzym (von Enzymen) am Ort der Wirkung oder Abgabe erkannt werden können, entweder in vitro oder in vivo. Solche, nach dem Stande der Technik bekannte, gegen hydrolytische Enzyme empfindliche Bindungen können wie hierin gelehrt in das Polyoxim eingebaut werden, und schliessen ein, ohne darauf beschränkt zu sein:
Enzym-Nucleotid-Sequenzen, Lipidbindungen, die von einer Lipase erkannt werden, Kohlenhydratbindungen, die von einer Glykosidase erkannt werden, und Peptidbindungen, die von einer Peptidase oder Protease erkannt werden. Zusätzlich zu S-S- Bindungen können brechende Bindungen auf Grund ihrer bevorzugten chemischen Empfindlichkeit (wenn erwünscht, als Funktion der Zeit) gegenüber einer besonderen chemischen oder physikalischen Umgebung (z. B. pH, Temperatur, Gegenwart eines Katalysators, Photolyse), die in vitro oder in vivo vorkommt, ausgewählt werden, zum Beispiel saure Hydrolyse einer Asp-Gly-Peptidbindung. Auf diese Weise kann die Freisetzung eines aktiven COSM an einet definierten Stelle erfolgen, ohne Zell- Internalisierung zu erfordern. Ausführungsformen der Erfindung mit freisetzbaren COSMs können zum Beispiel in äusserlich angewendeten Überzügen oder Materialien eingesetzt werden, die ihre Eigenschaften in Beantwortung einer Veränderung der Umgebung ändern, zum Beispiel ein Schimmelschutzmittel, das einen aktiven fungiciden Bestandteil als Antwort auf die Gegenwart eines Pilzproteins oder -enzyms (oder einer chemischen Veränderung wie zum Beispiel Oxidation) freisetzt. Ausführungsformen mit nicht freisetzbaren COSMs können zum Beispiel in Materialien oder Überzügen eingesetzt werden, die keine zeitabhängige Freisetzung verlangen. Zum Beispiel kann eine wasserfeste Sonnenschutzlotion eine hydrophobe Matrize mit in einer aktiven Form angefügten, UV-blockierenden COSMs enthalten.
[0066] Polyoxim-Ausführungsformen der Erfindung können in verbesserten Kits für diagnostische Zwecke oder als verbesserte Reagentien in Prüfungen, zum Beispiel Bindungsprüfungen wie Immunoassays eingesetzt werden. Zum Beispiel liefern homogene Polyoxim-Zusammensetzungen, die antigene Peptide tragen, eine erhöhte Nachweisempfindlichkeit in Festphasen-Immunoassays. Die grösseren, polyvalenten Polyoxime können leichter an Oberflächen wie die in Immunoassays verwendeten Mikrolochplatten haften.
[0067] Ebenfalls als Ausführungsformen der Erfindung in Betracht gezogen sind verbesserte diagnostische Kits, die Polyoxime enthalten.
[0068] Die Aminooxyacetylgruppe und die Dithiopyridylgruppe können an dem gleichen Peptid-COSM vorhanden sein, wie zum Beispiel in NH&sub2;OCH&sub2;CO-Asp-Cys(S-2- pyridyl)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH&sub2; (Seq. ID-Nr.: 23). Wie hierin festgestellt, wird Oximbildung durch die Gegenwart der 2-Thiopyridyl-Schutzgruppe an den Cys-Seitenketten nicht verhindert. Solche modifizierte Polyoxime haben den zusätzlichen Vorteil, dass die 2-Thiopyridylgruppe, wie hierin gelehrt, zur Anfügung noch weiterer Spezies (COSMs) nützlich ist, und zwar durch Anwendung normaler Thiolchemie (Angriff durch ein Thiol, um unter Verlust von Pyridinthion ein Disulfid zu erhalten, oder Reduktion zu einem Thiol und darauffolgende Alkylierung). In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung können auf Thiole anwendbare Reaktionen mit 2,2'-Dithiodipyridin (auch als 2,2'-Dipyridyldisulfid bekannt) bei Brocklehurst und Little, Biochem. J. (1972) 128 : 471-474, gefunden werden. Diese Reaktionen sind auch auf 4,4-Dipyridyldisulfid anwendbar. Für weitere Ausführungsformen der Erfindung werden Reaktionen mit einem 2-pyridylthioderivatisierten Thiol in Proteinchemie zum Beispiel von Carlsson, J., Drevin, H. und Axen, R. (Biochem. J. (1978) 173 : 723-737) zur Verfügung gestellt. Weitere Ausführungsformen können schwefelhaltige Schutzgruppen mit ähnlichen chemischen Reaktivitäten wie für die oben beschriebenen Verbindungen enthalten. Zusätzliche Ausführungsformen schliessen 2-Thio-5-nitrobenzoesäure und 2-Thio-5 - nitropyridin ein. Ein bevorzugtes Reagens führt zusätzlich zur erwünschten biologischen Aktivität zu einer bequemen Synthese und Produktisolierung. Es ist vorzugsweise ein Reagens, das eine leichte Auftrennung zwischen dem erwünschten abgeleiteten Produkt und dem Reagens und Nebenprodukten ergibt. Die Auswahl des Reagens hängt natürlich auch von den verwendeten Auftrennungsverfahren ab, so dass die Festlegung des genauen Reagens am besten dem makromolekularen Chemiker überlassen wird, der mit der besonderen Labilität und den Anforderungen der verwendeten makromolekularen COSMs vertraut ist. Zum Beispiel führt DTNB eine negative Ladung ein, die in Ionenaustausch-Auftrennungen ausgenutzt werden kann. Für eine Auftrennung durch Umkehrphasen-HPLC werden Reaktionen im kleinen Massstab durchgeführt und schliessen Reagens-Blindversuche sowie eine Kontrollreaktion mit Cystein ein. Um Ergebnisse zu untersuchen, die über Nacht hach automatischem Einspritzen solcher Muster erhalten wurden, wählt man für Anwendungen im präparativen Massstab das Reagens, das die bequemste Auftrennung liefert. Ein bevorzugtes Reagens zum allgemeinen Einsatz und zum Einsatz in einleitenden Untersuchungen ist 2,2'-Dithiodipyridin, das im Handel zum Beispiel von Fluka erhältlich ist.
[0069] COSMs, wie hierin gelehrt, die eine oximbildende komplementäre orthogonale, chemisch reaktive Gruppe und eine zusätzliche reaktive Gruppe wie zum Beispiel 2-Thiopyridyl besitzen, die spezifisch mit einem anderen Nicht-Stammmakromolekül reagieren können, können selbst als Linkergruppen benutzt werden.
Zum Beispiel kann ein COSM, das sowohl eine AOA-Funktion wie auch eine 2- Thiopyridylfunktion besitzt, als eine Linkergruppe für das Anfügen eines weiteren Makromoleküls oder COSM durch Disulfidbindungsbildung mit dem zweiten Makromolekül dienen.
[0070] Ein COSM ist weiter definiert als teilweise aus einem spezifisch aktiven Molekül oder einem Abschnitt davon bestehend. Wie hierin benutzt, deutet der Begriff "spezifisch aktiv" an, dass das COSM neben seiner komplementären orthogonalen chemischen Reaktivität eine definierte biologische, chemische oder physikalische Aktivität hat. Zum Beispiel kann ein COSM als ein Antigen, ein Epitop oder ein Hapten spezifisch aktiv sein. Wechselweise kann ein COSM als ein Rezeptor, wie zum Beispiel eine komplementaritätsbestimmende Region eines Antikörpers, oder als ein Ligand an einem Zelloberflächenrezeptor spezifisch aktiv sein.
[0071] Die oben beschriebene COSM-Alkylierung liefert ein weiteres Verfahren zur Anfügung von einem Makromolekül wie zum Beispiel Antikörperfragmenten an ein Stammmolekül. Durch Reduktion der die schweren Ketten von F(ab')2-Fragmenten verbindenden Disulfidbindungen erzeugte F(ab')-Fragmente von IgG-Antikörpem können alkyliert werden, so dass sie eine oximbildende komplementäre reaktive Gruppe enthalten. In vivo wird das Polyoxim verminderte Lokalisierung in den Nieren haben, was zu einer verminderten Ausscheidungsrate führt. Die Synthese von Verbindungen mit polyvalenten Hetero-Spezifitäten ist nunmehr möglich. Zum Beispiel können Heteropolyoxime unter Benutzung unterschiedlicher Regionen des gleichen IgG-Fragments oder von Regionen von IgGs mit unterschiedlicher Spezifität hergestellt werden. Des weiteren können Antikörper bindende Regionen mit Rezeptoren, Zellen oder andere Liganden bindenden Molekülen kombiniert werden, um polyvalente Antikörper zu schaffen. PCT/US88/03414 und Capon und Mitautoren (Nature (1989) 337 : 525-530; beide durch Bezugnahme hier aufgenommen), die Beispiele für "Immunadhäsine" geben, d. h. für bispezifische Hybridmoleküle, die zum Beispiel eine CD4-Domäne (zur Bindung eines gp 120-Proteins von HIV) an eine konstante Region (Fc) eines IgG mit leichter oder schwerer Kette (um Fc-Rezeptoren phagocytischer Zellen zu binden) gebunden enthalten, liefern einige der unterschiedlichen Spezifitäten, die in einem Polyoxim der Erfindung kombiniert werden können.
[0072] Wie hierin für Peptid-Stammmolekülstrukturen beschrieben, sind Verfahren für das regiospezifische Anfügen oder Modifizieren von C-Enden vermittels enzymkatalysierter Umkehrproteolyse oder N-endständiger Serin- oder Threoninreste (die in den COSM natürlich vorhanden oder künstlich eingebaut worden sind) für COSM- Herstellung anwendbar. Natürliche oder synthetische Polypeptide, die stellungsspezifisch angebrachte Aldehyd- oder Aminooxygruppen tragen, können ebenfalls benutzt werden, wie zum Beispiel von Offord, R. E., in Protein Engineering: A Practical Approach, Seiten 235-251, Rees u. a., Herausgeber (Oxford Press, 1992), hier durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben. Reaktive Gruppen wie Aldehyde können stellungsspezifisch am N-Ende eines rekombinierend abgeleiteten Polypeptids angebracht werden (siehe zum Beispiel Geoghegan und Mitautoren (Bioconjugate Chem. (1992) 3 : 138-146); Gaertner und Mitautoren (Bioconjugate Chem. (1992) 3: 262-268)). Die Kombination von Proteinengineering mit Rekombinationsmethoden und darauffolgender stellungsspezifischer Modifizierung zur Schaffung von COSMs, die in der Lage sind, Oximbindungen zu bilden, ist ein machtvolles Werkzeug zur Auslegung und Herstellung homogener Zubereitungen von Polyoximen mit der gewünschten, definierten Struktur und Aktivität. Es gibt keine Begrenzung für die Grösse der COSMs, da man lediglich ein Stammmolekül herstellt, in dem die reaktiven Gruppen weiter entfernt sind als in den gegenwärtigen Beispielen, um grössere Polypeptid-COSMs unterzubringen. Vom Stande der Technik her bekannte und hier diskutierte Verfahren zur Auslegung der Stammmolekülkonformation können gleichfalls auf die Auslegung von COSM angewendet werden.
[0073] Ein COSM kann auch ein spezifisch aktiver Chelator von Metallionen oder ein Molekül sein, dass zur Bindung eines nachweisbaren Markers nützlich sein. Solche nachweisbaren Marker schliessen Radionucleide, Biotin, Luciferin oder ein Substrat für ein enzymatisches Nachweisverfahren wie 5-Brom-4-chlor-3-indvlylphosphat/Nitrotetrazoliumblau ein, das ein Substrat für alkalische Phosphatase ist (Sambrook und Mitautoren, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2. Auflage (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989), hier durch Bezugnahme aufgenommen). Geeignete metall-chelierende Moleküle schliesseh, ohne darauf begrenzt zu sein, Chelate von EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und Analoge der EDTA ein, wie beschrieben in U. S. Patent Nr. 4 678 667, hier durch Bezugnahme aufgenommen. Solche Analoge sind in der Lage, Komplexe mit Metallionen zu bilden, darunter mit radioaktiven Metallionen, wie beschrieben in U. S. Patent Nr. 4 622 420, hier durch Bezugnahme aufgenommen. COSMs können auch aus anderen Chelatoren wie AOA- Desferrioxamin bestehen, das zum Beispiel 6allium-67 und Gallium-68 cheliert, oder aus AOA-Biocytin, das Biotin in löslicher Form enthält.
[0074] Wenn das Metallion radioaktiv ist, sind solche Polyoxime besonders für die in-vivo-Abbildung oder Behandlung bösartiger Gewebe oder eines Tumors nützlich. Unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung und verfügbaren, öffentlich zugänglichen Wissens wüsste ein Fachmann, wie er für in-vitro-Diagnose und in-vivo- Diagnose und -Behandlung diese COSMs enthaltenden Stammmoleküle aufbauen müsste. Für eine allgemein methodologische Beschreibung siehe zum Beispiel die US-Patentschriften Nr. 5 185 143, 5 011 676, 5 087 616, 4 707 352, S 084 266, 4 918 164, 4 865 835, 4 861 581, 4 659 839, 4 652 440 und 4 444 744, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
[0075] Wie oben bemerkt, ist der parallele Aufbau von Polyoximen durch chemoselektive Ligation das Ergebnis der komplementären orthogonalen chemischen Reaktion zwischen zum Beispiel einer GXL-Gruppe an der Stammmolekülstruktur und einer AOA-Gruppe an dem COSM zur Bildung einer homogenen Zubereitung eines Polyoxims mit einer definierten makromolekularen Struktur. Weitere Ausführungsformen von Polyoximen haben die zu den oben beschriebenen Strukturen umgekehrten komplementären Strukturen, d. h. ein Aminooxy-Stammmolekül und ein aldehydisches zweites organisches Molekül. Diese Strukturen sind besonders dann angezeigt, wenn eine Reihe von aldehydhaltigen Molekülen verfügbar ist (zum Beispiel Zucker). Allgemein bevorzugte Ausführungsformen enthalten aber Aldehyd-Stammmoleküle.
[0076] Die Erfindung schafft auch Verfahren des parallelen Aufbaus, um Polyoxime zu erzeugen, entweder Homo- oder Heteropolyoxime. Wie oben beschrieben, führt chemoselektive Ligation zur Bildung von Polyoximmolekülen, die eine definierte Struktur und definierte Eigenschaften haben. Beispiel 3 demonstriert unerwartete und überraschende Merkmale einer Polyoximbildung durch parallelen Aufbau mit Stammmolekülen einer Wertigkeit von mehr als zwei, darunter eine leichte, schnelle und milde Synthese; im wesentlichen quantitative Ausbeute; und ein offenbares Fehlen sterischer Hinderung. Beispiel 14 demonstriert die Bildung von Heteropolyoximen.
[0077] Andere funktionelle Gruppen mit biologischen Einheiten, aber nicht beschränkt auf eine Reportergruppe (wie Biotin oder einen Chelator für ein Radiometall), einen lipophilen Anker (wie Tripalmitoyl-S-glycerol-Cys) oder eine orthogonale reaktive Linkergruppe (wie Bromacetyl oder ein maskiertes Thiol wie S-Acetylthioacetyl oder S-S-2-Pyridyl), können vor der Oximierung an das Stammmolekül angefügt werden. Stammmoleküle, die Biocytin oder N Acetylcystein enthalten, werden zur Veranschaulichung in Beispielen angeführt. Die modifizierten Stammmoleküle erlauben zusätzliche Flexibilität im Einsatz der Polyoxime, wie zum Beispiel für Impfstoffe oder Biosensoren. Reporter-markierte Ausführungsformen von Polyoximen der Erfindung werden über die Reportergruppe verfolgt. Stabile Polyoxime, die sowohl einen lipophilen Anker als auch eine definierte Molekülstruktur besitzen, sind zum Beispiel für den Einbau des Polyoxims in Membranen nützlich, was die Impfstoffproduktion erhöhen kann, oder in andere lipophile Umgebungen. Die Anfügung der Polyoxime an andere Makromoleküle, aneinander oder an Oberflächen wird durch Ausführungsformen unterstützt, die zur Bildung der gewünschten Bindung eine andere, nicht-oximische orthogonale reaktive verbindende Gruppe haben.
[0078] Die im nachfolgenden Beispiele-Abschnitt beschriebenen zwei- und dreiwertigen Stammmoleküle bewahren Symmetrie. Polyoxime mit Positionsisomeren lassen sich aber herstellen, wenn zum Beispiel H-Gly3-Lys(COCHO)-Lys(COCHO)-Gly-OH (Seq.-ID-Nr.: 11) als ein Stammmolekül eingesetzt wird; in solchen Fällen ist die Umgebung des ersten Lysins nicht mit dem des zweiten identisch. Allgemeiner kann das Stammmolekül absichtlich so synthetisiert werden, um Wechselwirkungen mit einer Zielstruktur zu begünstigen, und braucht keine Symmetrie zu besitzen.
[0079] Zusätzliche Heteropolyoxim-Ausführungsformen der Erfindung werden durch Heteropolyoximbildung hergestellt, die ein Stammmolekül mit vier reaktiven Gruppen benutzen, von denen drei reaktive Gruppen einer Ausrichtung freigesetzt und mit Peptid-COSM zur Reaktion gebracht werden, worauf dann Entfernung der Schutzgruppe der vierten reaktiven Gruppe des Stammmoleküls und die Reaktion mit einem unterschiedlichen COSM folgt.
[0080] Zusätzliche Heteropolyoxim-Ausführungsformen der Erfindung sind COSM- Bibliotheken. Eine bevorzugte Bibliothek wird aus Peptid-COSMs aufgebaut. Polyoxim-Peptid-Bibliotheken können aus einem Stammmolekül und einem Gemisch von Peptid-COSMs (einer COSM-Population) hergestellt werden. Der Peptidanteil jedes COSMs kann mit bekannten Verfahren der Auslegung von normalen linearen Peptidbibliotheken ausgelegt werden. Zum Beispiel geben Jung und Mitautoren (in Solid Phase Synthesis, R. Epton, Hrsg. 1992, Interceptor, Andover, UK, Seiten 222-235) eine kurze Übersicht über die Auslegung, Synthese und Verfahren des Einsatzes von normalen synthetischen linearen Peptidbibliotheken. Peptidsequenzen, die in einer Polyoxim-Peptid-Bibliothek vertreten sein sollen, werden so synthetisiert, dass sie eine reaktive chemische Gruppe enthalten, die komplementär zu zumindest einer oximbildenden, chemisch reaktiven Gruppe an einem Stammmolekül ist. Peptidsequenzen kännen individuell oder in Gemischen synthetisiert werden. Die Peptid- COSMs oder Gemische können individuell oder in Kombination mit einem Stammmolekül zur Reaktion gebracht werden, um eine Polyoximbibliothek zu bilden. Die Peptid-COSMs können auch nacheinander mit einem Stammmolekül zur Reaktion gebracht werden, um definierte Heteropolyoximverbindungen herzustellen. Intermediäre, während der Polyoximherstellung gebildete Polyoxime können isoliert werden. Intermediäre Polyoxime enthalten oximbildende Gruppen, die nicht reagiert haben. Die intermediären Polyoxime können dann mit einem anderen individuellen Peptid-COSM oder einem Peptid-COSM-Gemisch zur Reaktion gebracht werden, um kompliziertere Heteropolyoxim-Bibliotheken aufzubauen. Wenn erforderlich oder erwünscht, können überschüssige Aminooxyverbindungen (oder Aldehyde) entfernt werden, zum Beispiel indem sie vor dem Screening (wie unten beschrieben) oder anderer Verwendung eine Aldehyd- (bzw. Aminooxyacetyl-) gelsäule durchlaufen. Die Polyoximbibliotheken können ähnlich wie nörmale Peptidbibliotheken in iterativen Screeningprozessen eingesetzt werden.
[0081] Zweckmässig ausgewählte Stammmoleküle können als ein "Handteller" wirken, wobei die Peptid-"Finger" dafür bereit sind, sich um eine Zielstruktur herum zu schliessen oder mit dieser in Wechselwirkung zu treten. In verschiedenen Ausführungsformen wird das "Handteller"-Stammmolekül variiert, um den Abstand, die Hydrophilität, die Ladung usw. zu optimieren.
[0082] Wenn wir zur Veranschaulichung eine Bibliothek der genau 400 Dipeptidamide, die aus 20 gewöhnlichen L-Aminosäuren gebildet wurden und alledie Aminooxyacetylgruppe tragen, sowie ein Polyaldehydstammmolekül der Wertigkeit drei betrachten, dann wäre unter Vernachlässigung von Symmetriebetrachtungen die Anzahl möglicher Trioxime, die durch Mischen erhalten werden, 400³ = 6,4 · 10&sup7;.
[0083] Zahlreiche Strategien sind für das Screening synthetischer Peptidbibliotheken entwickelt worden. Bei Verwendung von Polyoxim-Peptid-Bibliotheken ist die Strategie zur Optimierung im wesentlichen wie von Houghten und Mitautoren (Nature (1991) 354 : 84) und Geysen und Mason (Bio. Med. Chemistry Lett. (1993) 3: 397-404) beschrieben, ausser dass dort die Autoren nur lineare Peptide verwenden. Zum Beispiel können 400 Sätze von Peptiden gemacht werden, der erste mit Gly-Gly- Xaa-Xaa-Xaa-Xaa beginnend (Seq.-ID-Nr.: 14), der nächste mit Gly-Ala-Xaa-Xaa- Xaa-Xaa (Seq.-ID-Nr.: 15) usw., so dass alle 20 kodierten Aminosäuren in Position 1 sowie auch in Position 2 vorhanden sind. Die Xaa-Xaa-Xaa-Xaa bezieht sich auf die vier nachfolgenden Positionen, wo alle Aminosäurereste in allen Positionen vorhanden sind. Ein Screening der 400 Muster mit einer geeigneten Prüfung kann zumindest ein Muster als das aktivste identifizieren. Wenn sich zum Beispiel eine Arg-Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- (Seq.-ID-Nr.: 16) Sequenz als die aktivste erweist, dann wird in einer nächsten Screeningrunde Arg-Tyr für die nächsten 400 Muster festgelegt, um Arg-Tyr-Gly-Gly-Xaa-Xaa (Seq.-ID-Nr.: 17), Arg-Tyr-Gly-Ala-Xaa- Xaa (Seq.-ID-Nr.: 18) usw. zu erhalten. Wenn sich nach einem Screening Arg-Tyr- Lys-Glu-Xaa-Xaa (Seq.-ID-Nr.: 19) als die aktivste erweist, dann wird ein letztes Screening mit weiteren 400 Mustern unternommen, die alle mit Arg-Tyr-Lys-Glu beginnen und entweder Gly-Gly, Gly-Ala usw. am C-Ende haben. Ein ähnliches Vorgehen wird für Polyoximbibliotheken gewählt, ausser dass statt der Verwendung von linearen Hexapeptiden diese Peptide vermittels Parallelaufbau und Oximbindungsbildung für die Prüfung an ein Stammmolekül angesetzt werden.
[0084] Die Vorteile beim Einsatz von Polyoximbibliotheken sind unter anderem: 1) Das Stammmolekül kann eine Struktur enthalten, die in einer Prüfung aktiv ist, wodurch der Einsatz geringerer Konzentrationen von Polyoximen in einer Prüfung möglich wird und somit Löslichkeitsprobleme, die sonst ziemlich ernst sein können, auf ein Minimum beschränkt werden; und 2) Polyvalenz führt allgemein zu höherer Bindung und höherer Spezifität der Wechselwirkung, da mehr Kontakte einbezogen sind.
[0085] Stammmoleküle enthalten vorzugsweise chemisch reaktive Aldehydgruppen; jedoch sind andere Ausführungsformen von Polyoxim-Peptid-Bibliotheken, die umgekehrte komplementäre Strukturen, nämlich Aminooxy-Stammmoleküle, haben, besonders angezeigt, wenn eine Reihe von aldehydhaltigen Molekülen (zum Beispiel Zuckern) verfügbar ist.
[0086] In einigen Polyoximbibliotheks-Ausführungsformen kann ein Teil der Polyoximstruktur mit herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden, und Oximierung wird eingesetzt, um zusätzliche Elemente hinzuzufügen, die die für eine Bibliothek interessierenden Sequenzen darstellen.
[0087] Die hierin angeführten Beispiele demonstrieren zur Veranschaulichung die Anfügung nicht identischer Peptid-COSMs an ein Stammmolekül.
[0088] Die Verwendung von mit Aminooxyacetyl- (oder Aldehyd-modifiziertem) Monomethoxy-polyethylenglycol oder anderen homologen Reihen von Polymeren als COSM-Gemisch ermöglicht es, dass ein Polyoxim Heterogenität im Molekül selbst besitzt. Solche Polyoxime werden durch parallelen Aufbau eines Gemischs von Gliedern einer homologen Reihe wie NH&sub2;OCH&sub2;CO-NH-CH&sub2;CHzO(CH&sub2;CH&sub2;O)n- CH&sub2;CH&sub2;OCH&sub3; oder O-CHCH&sub2;O(CH&sub2;CH&sub2;O)n(CH&sub2;CH&sub2;OCH&sub3; oder O=CHCONH- CH&sub2;CH&sub2;O(CH&sub2;CH&sub2;O)nCH&sub2;CEI2OCH&sub3; gebildet, wo n eine ganze Zahl ist. Aldehydisch oder AOA-modifizierte Moleküle einer homologen Reihe können in Polyoximbildung durch parallelen Aufbau eingesetzt werden. Im Zusammenhang mit Proteinmodifizierung erlauben COSM-Ausführungsformen der Erfindung eine Protein- PEGylierung, die die Stabilität, Löslichkeit und Halbwertszeit erhöhen kann. Wechselweise können verschiedene Ketten an ein Stammmolekül angefügt werden, das seinerseits an ein Protein angefügt ist. Obwohl die Produkte dann leicht inhomogen sind, weil die ganze Zahl n eine Reihe von Werten annehmen kann, können die Polyoxime zum Beispiel nützlich sein, um die biologische Halbwertszeit von kleinen Proteinen zu erhöhen oder die Immunogenität von therapeutischen Proteinen zu vermindern.
[0089] In einer gesonderten Ausführungsform ist das Polyoxim weiter dadurch gekennzeichnet, dass es die Fähigkeit hat, eine Immunantwort in einem Tier zu induzieren. Immunogene Polyoxime, die aus einer Stammmolekülstruktur gebildet werden, die kovalent an eine Mehrzahl eines COSM mit immunogenen Eigenschaften gebunden ist, haben die Fähigkeit, im Tier eine Immunantwort zu induzieren. Lediglich zur Veranschaulichung kann ein solches COSM ein Peptid oder ein Polypeptid sein, das einem Hapten, einem Zelloberflächenrezeptor oder dessen Fragment, einem metallchelierenden Mittel oder dem Epitop eines viralen Antigens entspricht. Es gibt viele verschiedene, immunmodulierende Peptid-COSMs, wie zum Beispiel die Peptide, die beschrieben worden sind von Hobbs und Mitautoren (J. ImmunolJ 138 : 2581-2586 (1987)), Antoni und Mitautoren (J. Immunol. 137: 3201-3204 (1986)) und Nencioni und Mitautoren (1 Immunol. 139 : 800-804 (1987)), hier durch Bezugnahme einbezogen. Verschiedene, an Chelierungsmittel angefügte Peptide sind ebenfalls wohl bekannt und sind unter anderem die die Melanocyten stimulierenden Hormonpeptidabkömmlinge (Eur. Pat. Arm. 0 498 771 A2, hinterlegt am 2. März 1992, durch Bezugnahme hier einbezogen). Diese Polyoxime sind in vivo als Impfstoffe und Abbildungsmittel nützlich.
[0090] In einer anderen Ausführungsform können COSMs Nucleinsäuresequenzen sein, die chemoselektiv an ein Stammmolekül ligiert werden können. Nucleobasen können ebenfalls an Peptid- oder Polypeptidsequenzen gekoppelt werden, um eine Polypeptid-Nucleinsäure (PNA: polypeptide-nucleic acid) zu erzeugen, die als ein COSM verwendet und an ein Stammmolekül ligiert werden kann. Wenn in Verbindung mit nachweisbaren Markem wie 32P, Biotin, radiomarkierten Chelatoren oder Enzymen wie alkalischer Phosphatase (oder einem Substrat davon) verwendet, liefern die sich ergebenden Polyoxime hochspezifische und reaktive Nucleinsäuresonden, die in verschiedenen Diagnoseverfahren wie zum Beispiel beim Northem- und Southem-Hybridisierungsassay von Nutzen sind (siehe Sambrook und Mitautoren (1989)).
[0091] In einer gesonderten Ausführungsform hat das Polyoxim eine Mehrzahl eines COSM, das ein Polypeptid mit einer Sequenz ist, die mit der Sequenz einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR: complementarity determining region) eines Antikörpers identisch ist. Wie einem Fachmann geläufig, kann die CDR an ein metallchelierendes Mittel angekoppelt werden, um ein bifunktionelles COSM zu erzeugen, oder das chelierende oder Reportermittel wird wechselweise wie hierin beschrieben an das Stammmolekül angekoppelt. Die CDR-Polyoxime sind in vitro und in vivo nützlich. In vitro können sie in verschiedenen Immunoassays anstelle von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern eingesetzt werden. In vivo sind sie nützlich, um ein Tier passiv zu immunisieren oder eine Krankheit zu diagnostizieren und zu behandeln.
[0092] Polyoxime der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich, um interessierende biologisch aktive Moleküle, die an ein Polyoxim binden können, zu reinigen (für die allgemeine Methodologie siehe zum Beispiel Sambrook und Mitautoren (1989) und Harlow und Lane (1988)).
[0093] Polyoxime können an eine feste Phase wie die Oberfläche eines Siliciumchips, einer Gewebekulturplatte oder eines synthetischen oder natürlichen Harzes angefügt werden. Man kann ein Polyoxim chemoselektiv zum Beispiel unter Verwendung von Thiolgruppen, die vorübergehend mit Thiopyridyl- oder Acetylgruppen geschützt sind, an eine feste Phase ligieren, um eine Thioether- oder Thioester-Bindung zu bilden. Wechselweise können Polyoxime über Lipidankergruppen, die kovalent an den Stammmolekülteil eines Polyoxims angefügt sind, an eine feste Phase wie eine Lipidschicht oder eine Zellmembran angefügt werden. COSMs von an festen Oberflächen haftenden oder angefügten Polyoximen können als Liganden für die Reinigung oder den Nachweis der Gegenwart eines Zielmoleküls, das den COSM-Liganden bindet, verwendet werden. Wenn das COSM über eine brechende Bindung wie eine S-S enthaltende, wie hierin gelehrt, an ein Stammmolekül angefügt ist, kann ein COSM-Ziel-Paar von der Stammmolekül-Oberfläche freigesetzt werden, um Reinigung oder Analyse zu befördern.
[0094] Ein löslicher Komplex zur gezielten Einführung eines biologisch aktiven Moduls in eine Zelle wird ebenfalls durch diese Erfindung zur Verfügung gestellt. Der lösliche Komplex besteht aus einer Stammmolekülstruktur, die an eine Mehrzahl eines biologisch aktiven Moleküls ligiert und mit einem zellspezifischen Bindungsmittel verbunden ist. Wechselweise kann das Stammmolekül an eine Mehrzahl eines zelispezifischen Bindungsmittels ligiert und mit einem biologisch aktiven Molekül verbunden sein. Solche löslichen Komplexe ergeben zell- oder gewebespezifische Abgabesysteme für Zellen, die den passenden Rezeptor ausdrücken. Biologisch aktive Moleküle sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, homogene Antikörper- CDR, Antikörperfragmente, Epitope, Paratope, Nucleinsäuren, spezifisch mit zellulären Rezeptoren reaktive Liganden und zelluläre Rezeptoren sowie deren Fragmente, die noch fähig sind, ihr Zielmolekül spezifisch zu binden. Das biologisch aktive Molekül kann auch ein Peptid sein, an das ein therapeutisches Mittel angefügt ist, zum Beispiel ein Toxin, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein Radioisotop. Für die Zwecke dieser Erfindung ist ein zellenspezifisches Bindungsmittel ein Molekül, das spezifische biologische Moleküle erkennt und bindet. Solche Mittel sind unter anderem, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper, Antikörperfragmente und Zelloberflächenrezeptoren (oder deren biologisch aktive Fragmente). Das zellenspezifische Bindungsmittel kann zum Beispiel ein tumorzellenspezifischer Rezeptor, ein Zelloberflächenrezeptor oder ein Ligand für einen Zelloberflächenrezeptor sein.
[0095] Zusätzlich zu Zusammensetzungen, die nur Polyoxime enthalten, fallen in den Bereich dieser Erfindung auch Zusammensetzungen, die Polyoxime der Erfindung und zumindest einen weiteren Bestandteil enthalten. Ebenfalls einbezogen sind pharmazeutische Zusammensetzungen mit einer therapeutischen Polyoxim-Ausführungsform der Erfindung und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
[0096] Die Zusammensetzungen können in einem Verfahren eingesetzt werden, eine Immunantwort in einem Tier zu induzieren, das daraus besteht, dem Tier eine immunogen wirksame Menge eines wie oben definierten, antigenen Polyoxims in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zu verabreichen. Für die Zwecke dieser Erfindung ist das Tier vorzugsweise ein Wirbeltier wie ein Säugetier, speziell eine Ratte, ein Affe oder ein Mensch. In einer Ausführungsform ist das Tier ein menschlicher Patient. In Abhängigkeit vom antigenen Polyoxim ist die induzierte Immunantwort humorale oder zelluläre Immunität oder beides.
[0097] Die Polyoxime der Erfindung haben verschiedene neuartige Merkmale. Ein neuartiges Merkmal der synthetischen Homo-Polyoximmoleküle dieser Erfindung besteht darin, dass die Polyoximzubereitungen homogen sind. Polyoxime sind polyvalent, stabil in wässriger oder halbwässriger Lösung und können bei Temperaturen von -3ºC bis 50ºC hergestellt werden, am vorteilhaftesten aber bei Zimmertemperatur. Die Polyoxime dieser Erfindung sind in Verbindung mit der spezifischen biologischen Reaktivität und den spezifischen chemischen und physikalischen Reaktivitäten ihrer einzelnen Komponenten von Nutzen.
[0098] Wie hierin nachgewiesen, sind die komplementären reaktiven Gruppen, die miteinander wechselwirken, um eine Oximbindung zwischen Stammmolekül und COSM zu bilden, hochspezifisch. Die hierin gelehrten Oximierungsreaktionen haben volle oder im wesentlichen quantitative Ausbeute des Reaktionsprodukts geliefert. Eine solche komplizierte Molekülbildung erfolgt unter sehr milden Bedingungen. Die Geschwindigkeit ist besonders überraschend unter verdünnten Bedingungen, die oft nützlich sind, um intermolekulare Aggregation oder Reaktionen auf ein Minimum zu reduzieren. Die Oximierungsreaktion kann unbeaufsichtigt erfolgen, so dass ein Selbstaufbau der Polyoxime stattfindet. Polyoxime sind dank der im wesentlichen quantitativen Ausbeute und wegen der typischerweise beträchtlichen Unterschiede zwischen in Spuren vorhandenen Zwischenverbindungen und dem Endprodukt (d. h. der Gegenwart oder Abwesenheit von zumindest einer COSM-Einheit) leicht zu reinigen, so dass Verfahren für ihre Trennung leicht ausgewählt und angewendet werden können. Oximbindungen haben im Vergleich zu Hydrazonen oder dergleichen über einen Bereich von physiologischen Bedingungen hinweg höhere hydrolytische Stabilität. Oximbindungen unterliegen gewöhnlich nicht der enzymatischen Hydrolyse. Daher haben Polyoxime den Vorteil, für Anwendungen, in denen Integrität und Stabilität eines Komplexes wünschenswert sind, besonders geeignet zu sein. Wie in den Beispielen bewiesen, ist die Polyoximierungsreaktion sehr mild und somit zur Herstellung biologischer Makromoleküle, die biologische Aktivität oder Funktion bewahren, hinlänglich vorteilhaft. Die Polyoximchemie verzichtet darauf, einen reversiblen chemischen Schutz von Untereinheiten zu benötigen. Für stellungsspezifische Modifizierung sowohl der Stammmoleküle wie auch der COSMs zum Zwecke der Erzeugung von zur Bildung von Oximbindungen fähigen reaktiven Gruppen ist hier eine hohe Flexibilität geschaffen. Wegen dieser Flexibilität und wegen der Tatsache, dass ein reversibler Schutz nicht notwendig ist, erstreckt sich die Auslegung von Stammmolekülen und COSMs sowohl auf synthetische wie auf natürliche Makromoleküle und deren Abkömmlinge. Das überraschende Fehlen sterischer Hinderung, das hierin demonstriert worden ist (zum Beispiel je ein 23-meres Peptid an jede Seitenkette von sieben aufeinanderfolgenden Lysinresten angefügt), deutet darauf hin, dass komplizierte Moleküle nunmehr konstruiert werden können. In solchen komplizierten Molekülen können die individuellen Fähigkeiten der Untereinheiten verstärkt und vereinigt werden, wobei das Ganze grösser als die Summe der Teile ist. Zum Beispiel können Stammmoleküle so ausgelegt werden, dass die Löslichkeit der Peptide verbessert wird und Peptide in polyvalenten und/oder gebundenen Formen den Rezeptoren, den Antikörpern oder dem Immunsystem eines Tieres dargeboten werden: Aus synthetischen Stammmolekülen und COSMs gebildete Polyoxime haben den zusätzlichen Vorteil, frei von Viren zu sein.
[0099] Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung geliefert.

BEISPIELE

Beispiel 1. Synthese von Peptid-Stammmolekülstrukturen mit chemisch reaktiven Aldehyd- oder Aminooxyacetvlgruppen

Synthese von GXL-Stammmolekülstrukturen

[0100] Peptid-Stammmolekülstrukturen wurden unter Benutzung der Festphasen- Peptidsynthese (SPPS) aufgebaut. Kurz gesagt, wurde unter Benutzung eines Peptid- Synthesizers 430A (Applied Biosystems, Inc.) automatisierte SPPS durchgeführt. Die gewünschte Aminosäurensequenz wurde im Synthesizer programmiert, und die Synthese lief nach dem genannten FMOC-Protokoll ab. Das Anfangshatz war Gly- PAM-Polystyrol (0,5 mmol pro Synthese). Zwei verschiedene Peptidsequenzen wurden synthetisiert: H-Gly&sub3;-[Lys(Boc))&sub5;-Gly-PAM-Harz und H-Gly&sub3;(Lys(Boc)]&sub7;- Gly-PAM-Harz.
[0101] Die Boc-Gruppen wurden mit Trifluoressigsäure (TFA: trifluoroacetic acid) entfernt. Kurz gesagt wurden etwa 15 ml der TFA bei Zimmertemperatur für eine Stunde mit einem Gramm des Harzes inkubiert. Das Muster wurde sodann filtriert, mit Dichlormethan gewaschen und getrocknet. Die freien α- und &epsi;-Aminogruppen wurden unter Verwendung von zwei Äquivalenten aktiven Boc-Ser(benzyl)-N hydroxysuccinimidesters (0,16 M in trockenem DMSO) pro Aminogruppe acyliert. Der scheinbare pH-Wert wurde mit wasserbefeuchtetem pH-Papier gemessen und mit N-Methylmorpholin auf pH 8-9 eingestellt. Das Harz wurde für zwei Stunden gerührt.
[0102] Nach dieser Reaktion zeigte der Standard-Ninhydrintest, dass die Acylierung unvollständig war. Daher wurde das Harz abfiltriert und die Acylierungsreaktion wiederholt, wobei ein scheinbarer pH-Wert von 8-9 mit N-Methylmorpholin aufrechterhalten wurde. Nach dieser Reaktion zeigte der Ninhydrintest, dass die Acylierung im wesentlichen vollständig war. Das Harz wurde abfiltriert, mit DMSO und dann mit Dichlormethan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Reaktion ergab 1,7 g Harz aus 1,3 g H-Gly&sub3;-[Lys(Boc)]&sub5;-Gly-PAM-Harz.
[0103] Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen wurde durch Auflösung des Musters in 17 ml TFA erreicht. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt, dann wurden 1,7 ml Trifluormethansulfonsäure (TFMSA: trifluoromethanesulfonic acid) hinzugefügt. Die Lösung wurde für eine Stunde gerührt, und Peptid wurde mit trockenem Ether ausgefällt. Das Peptid wurde dreimal mit trockenem Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
[0104] Das anfallende Gemisch von Peptid und gespaltenem Harz wurde in 60 ml Wasser wieder aufgeschlämmt. Das Peptid, das wasserlöslich ist, wurde gelöst und die Lösung filtriert. Nach Gefriertrocknung wurde das Filtrat in 50 ml Wasser aufgelöst und in 5-ml-Anteilen mit RP-HPLC (Waters) in einer bei 10 ml/min betriebenen Säule (250 · 21 mm ID Nucleosil 300A 5 um C8) gereinigt. Lösungsmittel A war 0,1% TFA, Lösungsmittel B war 0,1% TFA in 90% Acetonitril.
[0105] Das Peptid wurde isokratisch bei 100% A gereinigt und eluierte kurz nach der Front. Die Säule wurde dann vor der nächsten Einspritzung mit 50% B gewaschen und mit 100% A ins Gleichgewicht gebracht. Das Produkt, H-Ser-Gly&sub3;- (Lys(H-Ser)]&sub5;-Gly-OH (Seq.-ID-Nr.: 7) (Ausbeute 100 mg) eluierte als Einzelpeak in analytischer RP-HPLC (Säule 250 · 4 mm ID, Füllung und Lösungsmittel wie oben) mit 0,6 mllmin, 5 min isokratisch mit 100% A, dann bis 100% B mit einem linearen Gradienten von 2% B pro Minute. Die Retentionszeit des Peptids war 20 min.
[0106] Das gereinigte Peptid wurde mit Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) charakterisiert. Ein Trio-2000-Spektrometer, ausgerüstet mit einem RF-Generator für 3000 amu, wurde eingesetzt (Fisons Instruments, Altrincham, UK).
Die Muster wurden mit 2 ul/min in Wasser/Methanol/Essigsäure (Volumenanteile 49,5/49,5/1) eingegeben. Das Molekulargewicht des Musters wurde zu 1410,12 ± 0,66 Dalton bestimmt, verglichen mit dem erwarteten, berechneten Wert von 1409,56 Dalton.
[0107] Die Seringruppen an der Vorstufen-Stammmolekülstruktur wurden durch Vermischen von 0,2 ml H-Ser-Gly&sub3;-[Lys(H-Ser)]&sub5;-Gly-OH (Seq.-ID-Nr.: 7) (10 mM in Wasser) mit 7,8 ml Imidazol-HCl-Puffer, pH 6,95, unter Hinzufligung von 0,24 ml NaIOa (0,1 M in Wasser) zu chemisch reaktiven Glyoxylylgruppen (GXL) umgewandelt. Das Gemisch wurde rasch gerührt, dann für 5 min bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Oxidationsreaktion wurde durch Hinzufügen von 0,48 ml Ethylenglycol (0,1 M in Wasser) und schnelles Rühren der Lösung beendet. Die Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt und in eine RP-HPLC-Säule (250 · 10 mm ID Nucleosil 300A, 7 um C8) eingespritzt. Die Elution erfolgte bei 4 mumin unter Benutzung von 100% A isokratisch für 5 min. gefolgt von einem linearen Gradienten von 2% B pro Minute zu einer Endkonzentration von 100% B. Das Hexa-GXL- Stammmolekül (Seq.-ID-Nr.: 6) eluierte bei einer Retentionszeit von 16 min.
[0108] Das Lösungsmittel wurde durch Vakuumzentrifugierung ohne Erhitzen entfernt (Speed-Vac, Savant Instruments). Die Reaktion lieferte etwa 1 mg des gereinigten Hexa-GXL-Stammmoleküls, das als Pulver bei -20 ºC aufbewahrt wurde und über mindestens einigep Wochen hinweg stabil war. Ähnliche Methoden wurden benutzt, um Octa-GXL-Stammmolekül (Seq.-ID-Nr.: 9) herzustellen.

Synthese von AOA-Stammmolekülstrukturen

[0109] Wechselweise wurden die Aminogruppen im Peptid-Stammmolekül in AOA- Gruppen umgewandelt, um Poly-AOA-Stammmolekülstrukturen herzustellen. Kurz gesagt, wurde H-Gly&sub3;-Lys&sub5;-Gly-PAM-Harz mit Boc-AOA-N-Hydroxysuccinimidester (0,1 M in trockenem DMSO; 2,5 Äquivalente pro Aminogruppe; 50 ml pro 0,69 g Harz; scheinbarer pH-Wert 8-9 mit N Methylmorpholin) inkubiert. Die Acylierungsreaktion war nach zwei Stunden Inkubation bei Zimmertemperatur beendet, wie durch den Standard-Ninhydrintest ausgewiesen.
[0110] Das Harz wurde abfiltriert, mit DMSO und sodann mit Dichlormethan gewaschen und im Vakuum getrocknet. Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen wurde unter Benutzung einer Lösung mit 7 ml TFA und 0,7 ml TFMSA erreicht. Das Muster wurde mit Ether gefällt, dann in Wasser aufgelöst, filtriert und gefriergetrocknet, wie oben beschrieben.
[0111] Das rohe, gefriergetrocknete Produkt wurde in 4 ml Wasser aufgelöst, und 0,5-ml-Anteile wurden mit der oben beschriebenen 21-mm-Säule bei 10 mumin Durchfluss durch RP-HPLC gereinigt. Nach 5 min Elution bei 100% AS wurde ein Gradient von 1% B/min bis zu einer Endkonzentration von 5% B angelegt, die dann für 20 min aufrechterhalten wurde. Die Säule wurde vor jeder Einspritzung mit 50% B gewaschen und mit 100% A ins Gleichgewicht gebracht.
[0112] Das Hexa-AOA-Stammmolekülprodukt (Seq.-ID-Nr.: 5) eluierte während isokratischer Elution bei 5% B. Das Produkt eluierte als Einzelpeak in analytischer RP-HPLC. Durch ESI-MS wurde die Masse zu 1325,49 ± 0,38 Dalton bestimmt, verglichen mit der berechneten Masse von 1325,4 Dalton. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das Hexa-AOA-Stammmolekül als ein Pulver bei -20ºC aufbewahrt und war über mindestens einige Wochen hinweg stabil. Das Aufbewahrungsgefäss wurde dicht verschlossen gehalten, und flüchtige Aldehyde wurden ferngehalten:

Beispiel 2. Synthese von peptid-komplementären orthogonalen, spezifisch aktiven Molekülen (COSMs)

[0113] Die Peptidkomponente von COSMs wurde unter Verwendung des oben beschriebenen SPPS-Verfahrens synthetisiert. Ein Peptid mit 12 Aminosäuren der Sequenz Lys-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys-Gly (Seq.-ID-Nr.: 1), das den Aminosäureresten 102 bis 112 von menschlichem, translational gesteuertem Tumorprotein (TCTP: translationally controlled tumor protein) mit einem zusätzlichen C-terminalen Glycin entspricht, wurde synthetisiert. Automatisierte Peptidsynthese wurde mit einem Peptidsynthesizer Modell 430A (Applied Biosystems, Inc.) durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, ausser dass ein Sasrin-Harz (Bachem) benutzt wurde und Pmc als Seitenkettenschutz für den Argininrest diente.
[0114] Die α-Aminogruppe des Lysinrests am N-Ende des TCTP-Peptids wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch Inkubieren von 0,33 mmol TCTP-Harz mit Boc- AOA-N Hydroxysuccinimidester in eine α-AOA-Gruppe umgewandelt. Die Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen wurde mit 1,5 ml einer Mischung aus PhenollEthandithiollThioanisollWasser/TFA (0,75 g/0,25 ml/0,5 ml/0,5 ml] 10 ml) ausgeführt. Nach dreistündigem Rühren wurde die Mischung filtriert und das Peptid mit 4 ml kaltem Methyl-tert-butylether gefällt. Der Niederschlag wurde dreimal mit demselben Ether gewaschen und getrocknet.
[0115] Die getrockneten Niederschläge wurden in 15 ml Wasser aufgelöst und in 1,5-ml-Portionen durch RP-HPLC mit der in Beispiel 1 beschriebenen 21-mm-ID- Säule gereinigt. Die Säule wurde eluiert bei 10 ml/min während 5 min mit 100% A, dann mit 1% B/min zu einer Endkonzentration von 9% B, die aufrechterhalten wurde, bis das Produkt eluierte (Retentionszeit etwa 45 min). Die Säule wurde vor jeder Einspritzung mit 50% B gewaschen und mit 100% A ins Gleichgewicht gebracht.
[0116] Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Vakuumzentrifugieren wurde das AOA-TCTP-Muster (Seq.-ID-Nr.: 4) mit ESI-MS charakterisiert. Das Molekulargewicht des Musters wurde zu 1542,57 ± 1,14 Dalton bestimmt, verglichen mit dem erwarteten Wert von 1541,73 Dalton. Die Reaktion lieferte aus 1,3 g AOA-Polypeptidylharz 120 mg AOA-TCTP. Das AOA-TCTP-COSM wurde als Pulver bei - 20ºC aufbewahrt und war mindestens über mehrere Monate hinweg stabil.
[0117] Wechselweise wurde auf einem Peptidsynthesizer Applied Biosystems 430A ein N-terminaler Serinrest an 707 mg (0,17 mmol) des TCTP-Sasrin-Harzes angefügt. Nach Entfernung der FMOC-Gruppe erfolgte Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen wie für das AOA-TCTP-COSM beschrieben. Das Ser-TCTP-Vorstufen- COSM (Seq.-ID-Nr.: 2) wurde durch RP-HpLC (Ausbeute 90 mg) gereinigt und mit ESI-MS charakterisiert. Das Molekulargewicht des Ser-TCTP-Vorstufen-COSM wurde zu 1556,53 ± 1,07 Dalton bestimmt, verglichen mit dem erwarteten Wert von 1555,75 Dalton. Das Ser-TCTP-Vorstufen-COSM wurde als ein Pulver bei -20ºC aufbewahrt und ist unbegrenzt stabil.
[0118] Die Vorstufe wurde in das chemisch reaktive GXL-TCTP (Seq.-ID-Nr.: 3) umgewandelt, indem 1,2 ml der Vorstufe Ser-TCTP-COSM (10 ml in Wasser) zu einer Lösung hinzugefügt wurden, die 6,8 ml Imidazol-HCl-Puffer (50 mM, pH 6,95) und 0,24 ml NaIO&sub4; (0,1 M in Wasser) enthielt, und das Muster rasch vermischt wurde. Nach 5 min bei Zimmertemperatur wurde die Oxidationsreaktion durch Zugabe von 0,48 ml Ethylenglycol (0,1 M in Wasser) beendet. Die Lösung wurde mit Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt, und das GXL-TCTP wurde durch RP-HPLC in der 10-mm-ID- Säule isoliert. Die Elution erfolgte bei 4 ml/min für 5 min mit 100% A, gefolgt von 2% B/min bis zu 100% B. Die Retentionszeit betrug 19 min.
[0119] Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde das GXL-TCTP durch ESI-MS charakterisiert. Das Molekulargewicht des Musters wurde zu 1524,63 ± 0,16 bestimmt, verglichen mit dem erwarteten Wert von 1524,70. Das GXL-TCTP-COSM wurde als ein Pulver bei -20ºC aufbewahrt und war mindestens über mehrere Wochen hinweg stabil.
[0120] Ein Peptid aus 23 Aminosäuren, das den Resten 43 bis 65 der menschlichen Proinsulin C-Peptidsequenz (Pep C) entspricht, wurde unter Benützung des Standard- FMOC-Protokolls ebenfalls mit dem Peptid-Synthesizer 430A von Applied Biosystems synthetisiert. FMOC-Arg(Pmc)-Sasrin-Harz (Bachem) wurde im Massstab von 0,5 mmol eingesetzt. Noch als harzgebundenes Peptid geschützt, wurden 100 mg des Harzes (etwa 20 umol der N-endständigen α-Aminogruppe) mit Boc-AOA- N Hydroxysuccinimidester acyliert, wie oben beschrieben.
[0121] Nach Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen unter Benutzung von 3,5 ml des oben beschriebenen Phenolgemischs wurde das AOA-Pep C-COSM (Seq.-ID-Nr.: 10) durch RP-HPLC gereinigt (Ausbeute 8 mg). Die Molekularmasse des AOA- Pep C-COSM wurde durch ESI-MS zu 2308,56 ± 0,11 Dalton bestimmt, verglichen mit dem berechnten Wert von 2308,576 Dalton. Das AOA-Pep C-COSM wurde wie oben beschrieben aufbewahrt und war über mindestens mehrere Monate hinweg stabil.

Beispiel 3. Parallelaufbau von Hexa-TCTP-Polyoximen durch chemoselektive Ligation von einem Hexa-GXL-Stammmolekül und AOA-TCTP- OSMs

[0122] Parallelaufbau des Hexa-TCTP-Polyoxims wurde durch Hinzufügen von 200 ul AOA-TCTP (Seq.-ID-Nr.: 4) (10 mM in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,6) zu 6,7 ul Hexa-GXL-Stammmolekülstruktur (Seq.-ID-Nr.: 6) (10 mM in Wasser) eingeleitet. Nach dem Vermischen konnte die Oximierungsreaktion bei Zimmertemperatur ablaufen. AOA-TCTP (2 umol) lag in etwa fünffachem molarem Überschuss über das Stammmolekül (67 nmol; etwa 400 nmol GXL-Gruppen) vor. Die Struktur des vorhergesagten Hexa-TCTP-Polyoximprodukts wird in Fig. 1 gezeigt.
[0123] Das Ausmass der chemoselektiven Ligation wurde durch Messung der Bildung des Hexa-TCTP-Polyoxims mittels RP-HPLC unter Benutzung der 4-mm- ID-Säule verfolgt. Elution erfolgte bei 0,6 ml/min für 5 min mit 100% A, gefolgt von einem Gradienten von 2% B/min von 0 bis 100% B. Die Elution des Musters wurde durch Absorption bei 214 nm verfolgt. Chromatogramme, die nach einer Inkubation von 3 h (Fig. 2) und von 18 h (Fig. 3) erhalten wurden, werden gezeigt. Nach 3,5 h Inkubation zeigte der mit einem schwacheren Gradienten analysierte Polyoximpeak ein Gemisch der Tri-, Tetra-, Penta- und Hexaoximformen (Daten nicht gezeigt). Die Bildung des Hexa-TCTP-Polyoxims war im wesentlichen nach einer Inkubation von 18 h beendet.
[0124] Die Reaktion wurde beendet und das Hexa-TCTP-Polyoximprodukt durch präparative RP-HPLC gereinigt. Reaktionsmischungen im präparativen Massstab wurden in 0,5-ml-Portionen in einer 250 · 20 mm ID-Säule gereinigt, die mit Nucleosil 300A 5 um C8 gefüllt war. Elution erfolgte mit 4 ml/min und 100% A für 5 min. gefolgt von einem linearen Gradienten von 1% B/min bis zu einer Endkonzentration von 100% B.
[0125] Überschüssiges AOA-TCTP eluierte mit einer Retentionszeit von 44 min. während das Hexa-TCTP-Polyoximprodukt bei 50 min eluierte. Sowohl das Hexa- TCTP-Polyoximprodukt als auch der Überschuss von AOA-TCTP wurden während der Reinigung gewonnen. Nach Vakuumtrocknung wurde die Ausbeute zu 11 mg Hexa-TCTP-Polyoxim aus 45 mg AOA-TCTP und 1,4 mg Hexa-GXL-Stammmolekül berechnet.
[0126] Das Hexa-TCTP-Polyoxim wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) auf dem Phast-System (Pharmacia) charakterisiert. Proteinmuster wurden auf ein 20-%-Gel aufgegeben, und Elektrophorese wurde bei 15ºC über eine Dauer von 90 Volt-Stunden durchgeführt und durch Silberanfärbung sichtbar gemacht. Molekulargewichts-Vergleichsproteine (Pharmacia) wurden auf parallelen Bahnen mitgefahren, darunter Phosphorylase B (94 kDa), Rinderserumalbumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Carboanhydrase (30 kDa), Trypsin-Inhibitor aus Sojabohnen (20,1 kDa) und α-Lactalbumin (14,4 kDa), wie in Fig. 4 angedeutet.
[0127] Wie in Fig. 4 gezeigt, wanderte das TCTP-Polyoximprodukt als eine Hauptbande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 14 kDa, was über dem vorhergesagten Molekulargewicht von etwa 10 kDa (Kilodalton) liegt. Das höhere Molekulargewicht kommt wahrscheinlich durch die erwartete, ausgestreckte Struktur des Hexa-TCTP-Polyoxims zustande. Die vorhandenen, schwachen Banden mit höherer Beweglichkeit in der Musterbahn sind wahrscheinlich auf teilweise Zersetzung des Musters wegen des Kochens vor Aufgabe auf das Gel zurückzuführen. Die Stabilität des Hexa-TCTP-Polyoxims wird weiter unten erörtert.
[0128] Das Molekulargewicht wurde genauer durch Elektrosprühionisations-Massenspektrometrie bestimmt. Die Molekularmasse des Produkts wurde zu 10367,41 ± 1,28 Dalton bestimmt (Fig. 5), was vorteilhaft mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von 10365,49 Dalton übereinstimmt, das für die chemoselektive Ligation von sechs TCTP-COSMs (Seq.-ID-Nr.: 4) an die Hexa-GXL-Stammmolekülstruktur (Seq.-ID- Nr.: 6) erwartet wird.
[0129] Die Stabilität des Hexa-TCTP-Polyoximprodukts wurde bestimmt, indem das Hexaoxim (0,1 mg/ml) bei Raumtemperatur während 48 h in 0,1% TFA (pH 2,1), während 24 h in 0,1 M Natriumacetat (pH 4,6) oder während 30,5 h in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7.0) inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurden die Muster durch RP-HPLC analysiert. Wie in Fig. 6 zu sehen, war das Hexa-TCTP-Polyoxim stabil, wenn es bei verschiedenen pH-Werten inkubiert wurde.

Beispiel 4 Parallelaufbau von Hexa-Pep C-Polyoximen durch chemoselektive LiaatiorLVOn einem Hexa-GXL-Stammmolekül und AOA-Pep C-COSMs

[0130] Paralleler Aufbau von Hexa-Pep C-Polyoxim wurde eingeleitet, indem 30 ul AOA-Pep C (10 mM in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,6) zu 1 ul Hexa-GXL- Stammmolekülstruktur (10 mM in Wasser) hinzugefügt wurden und die Mischung bei Zimmertemperatur inkubiert wurde. AOA-Pep C (Seq.-ID-Nr.: 10) war in einem fünffachen molaren Überschuss von AOA-Gruppen über die GXL-Gruppen an der Stammmolekülstruktur (Seq.-ID-Nr.: 6) vorhanden. Die Struktur des erwarteten Hexa- Pep C-Polyoxims ist in Fig. 7 gezeigt.
[0131] Das Ausmass der chemoselektiven Ligation wurde durch Messung der Bildung des Hexa-Pep C-Polyoxims mit RP-HPLC in der 4-mm-ID-Säule verfolgt. Elution erfolgte bei 0,6 mumin mit 100% A für 5 min. gefolgt von einem Gradienten von 2% B/min bis zu einer Endkonzentration von 100% B. Fig. 8 zeigt das nach 18 Stunden Inkubation erhaltene Chromatogramm. Wie schon für die Bildung des Hexa- TCTP-Polyoxims beobachtet, war die Bildung des Hexa-Pep C-Polyoxims im wesent nach 18 h Inkubation abgeschlossen. Die Reaktion wurde durch präparative RP-HPLC beendet, wie in Beispiel 3 oben beschrieben.
[0132] Unter Benutzung von Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie wurde, wie oben beschrieben, das Molekulargewicht des Hexa-Pep C-Polyoxims zu 14965,96 ± 1,44 Dalton bestimmt, verglichen mit dem vorhergesagten Wert von 14966,58 Dalton für die Ligation von sechs AOA-Pep C-COSMs an die Stammmolekülstruktur (Seq.-ID-Nr.: 6) (Fig. 9). Zum Vergleich ist ein Elektrosprühionisierungs-Massenspektrum von einem Versuch gezeigt, in dem AOA-Pep C- COSMs (Seq.-ID-Nr.: 10) chemoselektiv mit einer Octa-GXL-Stammmolekülstruktur (Seq.-ID-Nr.: 9) ligiert wurden (Fig. 10). Wiederum war der gemessene Wert von 19916,61 ± 3,05 Dalton mit dem für ein acht Pep C-COSMs enthaltendes Polyoxim erwarteten Wert von 19916, 097 Dalton vergleichbar.

Beispiel 5. Parallelaufbau von Hexa-TCTP-Polyoximen durch chemoselektive Ligation von einem Hexa-AOA-Stammmolekül und GXL-TCTP-COSMs

[0133] Parallelaufbau des Hexa-TCTP-Polyoxims wurde eingeleitet, indem 1 ul Hexa-AOA-Stammmolekülstruktur (10 mM in Wasser) zu einer Mischung aus 180 ul 0,1 M Natriumacetatpuffer von pH 4,6 und 30 ul GXL-TCTP-COSMs (Seg.-ID-Nr.:
3) (10 mM in Wasser) hinzugefügt wurden. Das Muster wurde bei Zimmertemperatur gemischt und inkubiert. GXL-TCTP lag in einem fünffachen molaren Überschuss über die AOA-Gruppen am Stammmolekül (Seq.-ID-Nr.: 5) vor. Die Struktur des erwarteten Hexa-TCTP-Polyoxims ist in Fig. 11 gezeigt; sie ist mit Ausnahme der Stereochemie der Oximbindungen der Struktur in Fig. 1 ähnlich.
[0134] Das Ausmass der chemoselektiven Ligation wurde wie oben beschrieben durch RP-HPLC verfolgt, und die Bildung des Hexa-TCTP-Polyoxims war nach 56 h Inkubation abgeschlossen. Keine weitere Veränderung erfolgte während einer 75- stündigen Überwachungszeit. Die Reaktion wurde beendet und das Hexa-TCTP- Polyoximprodukt wurde durch präparative RP-HPLC gereinigt.
[0135] Das durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie bestimmte Molekulargewicht wurde zu 10365,72 Dalton gefunden, verglichen mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 10365,49 Dalton, das für die Ligation von sechs TCTP- COSMs an die Stammmolekülstruktur erwartet wird. Das gemessene Molekulargewicht ist auch dem Molekulargewicht des in Fig. 1 gezeigten Produkts sehr ähnlich, das zu 10367,41 Dalton bestimmt wurde (siehe Fig. 5).

Beispiel 6. Herstellung eines Polyoxims unter Verwendung eines COSM mit C-terminalem Aldehyd

[0136] Der Protease-Inhibitor Leupeptin (Sigma Chem. Co.), der eine C-terminale Aldehydgruppe enthält, wurde chemoselektiv an eine Hexa-AOA-Stammmolekülstruktur (Seq.-ID-Nr.: 5) ligiert. Zu 1 ul des Hexa-AOA-Stammmoleküls (10 mM in Wasser) wurden 30 ul Leupeptin (10 mM in Wasser) und 180 ul Natriumacetatpuffer (0,1 M, pH 4,6) hinzugefügt. Nach Inkubation der Reaktion für 15 h bei Zimmertemperatur wurden 20 ul der Reaktionsmischung entnommen und, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung des Standardgradienten von 2% B/min von 0% bis 100% B mit RP-HPLC analysiert. Das Hexaleupeptinoxim eluierte bei einer Retentionszeit von 43 min. Die Masse des Hexaleupeptinoxims wurde mit Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie zu 3776,45 ± 0,70 Dalton bestimmt, was vorteilhaft mit dem erwarteten Wert von 3775,66 Dalton übereinstimmt.

Beispiel 7. Immunisierung unter Verwendung des Hexa-COSM-Polyoxims

[0137] Etwa 100 ug des Hexa-COSM-Polyoxims, viz., des in Fig. 1 gezeigten Hexa- TCTP-Polyoximprodukts im vollständigen Freundschen Adjuvans wurden subkutan an je etwa 10 Stellen jedes Tieres einer Gruppe von Kaninchen eingespritzt. In Abständen von etwa vier bis sechs Wochen erhielten die Kaninchen Nacheinspritzungen mit 50 ug des Hexa-COSM-Polyoxims in unvollständigem Freundschem Adjuvans. Etwa je 10 bis 14 Tage nach einer Nacheinspritzung wurden die Kaninchen zur Ader gelassen, und das Blutserum wurde isoliert. Das Serum hatte Kreuzreaktivität gegenüber dem als Antigen verwendeten Hexa-TCTP-Polyoxim. Dem Fachmann wäre bewusst, dass in der Menge des eingesetzten Antigens, der Art des Adjuvans, der Stelle und dem Verfahren der Einspritzung sowie dem Zeitplan der Einspritzungen Abänderungen gemacht werden können (siehe zum Beispiel Harlow und Lane (1988), Kapitel 5). Antiserum von mit Hexa-TCTP-Polyoxim immunisierten Tieren reagierte mit dem Hexa-TCTP-Polyoxim-Antigen. Das Antiserum zeigte keine Kreuzreaktion in einem Immunoblotting-Test, in dem das TCTP-Protein durch s zweidimensionale SDS-PAGE abgetrennt und mit Antiserum, sodann mit markiertem Ziegen-anti-Kaninchenserum geprüft wurde. In ähnlicher Weise führte eine Octa- TCTP-MAP-Struktur zur Erzeugung von Antikörpern gegen das Octa-TCTP-MAP (MAP ist "Multiple Antigenic Peptide" [Vielfach-antigenes Peptid], wie von Tam und Zavala (1989) offenbart), das keine Kreuzreaktion mit TCTP-Protein aufwies, aber im Gegensatz zum Hexa-TCTP-Polyoxim im Immunoblotting-Test durch seine Kreuzreaktion mit der β-Kette von Haptoglobin eine Fehlanzeige lieferte. Antikörper können zum Beispiel durch einen Immunoblotting-Test nachgewiesen und durch im Fach wohlbekannte Verfahren gereinigt werden (siehe zum Beispiel Harlow und Lane (1988), Seiten 178-179 und Kapitel 8).

Beispiel 8. Herstellung eines Polyoxims mit einer signalerzeugenden Gruppe

[0138] Signalerzeugende Gruppen werden an ein COSM oder an eine Stammmolekülstruktur entweder vor oder nach der Oximierungsreaktion angefügt. Unter Verwendung der oben beschriebenen Standardbedingungen für Peptidsynthese wird ein N Hydroxysuccinimidester des Biotins oder ein Boc-Biocytin-N hydroxysuccinimidester an die α-Aminogruppe von H-Gly&sub3;[Lys(Boc-Ser(benzyl)]&sub5;-Gly- PAM-Harz angekoppelt. Wechselweise wird unter Benutzung von im Fach wohlbekannten Methoden (siehe zum Beispiel Rana und Mitautoren, Tetrahedron Lett. 33: 4521-4524 (1992), durch Bezugnahme hier aufgenommen) eine Chelatorgruppe wie FMOC-Lys(EDTA-penta-t-butylester)-OH an eine α-Aminogruppe der Stammmolekülstruktur angekoppelt. Weder Biotin noch EDTA werden durch die Reaktion der Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen, durch die Oxidationsreaktion des GXL-Stammmoleküls oder durch die Oximierungsreaktion der markierten Stammmolekülstruktur mit AOA-COSMs geschädigt. Das anfallende Poly-COSM-Oxim enthält eine amino-endständige Biotin- oder EDTA-Gruppe.

Beispiel 9. AnfüQen von Polyoximen an eine feste Oberfläche

[0139] Chemoselektive Ligation kann eingesetzt werden, um ein Polyoxim an eine feste Oberfläche anzufügen. Zum Beispiel kann ein Polyoxim unter Einsatz von Thiolchemie an eine Oberfläche angefügt werden. Bromacetyl-Gly&sub3;-[Lys(ser)]&sub5; Gly- OH wird durch Standard-Festphasen-Peptidsynthese hergestellt, zum Penta-GXL- Stammmolekül (Seq.-ID-Nr.: 8) oxidiert, mit AOA-COSMs oximiert und durch RP- HPLC gereinigt, wie oben beschrieben.
[0140] Unter Einsatz von fachbekannten Methoden werden Thiolgruppen an Oberflächen angefügt. Ein festes Material mit Aminopropyl-Oberflächengruppen wird zuerst durch Behandlung mit S-Acetylthioessigsäure-N Hydroxysuccinimidester acyliert. Die acylierte Oberfläche wird dann mit verdünntem wässrigem Hydroxylamin behandelt, um die reaktiven Thiolgruppen zu deacylieren und freizulegen. Durch Bildung einer Thioether-Bindung unter milden wässrigen Bedingungen bei pH 4-9 wird das Bromacetyl-Polyoxim an die Thiolgruppen auf der festen Oberfläche angekoppelt. Vorzugsweise wird die Thioetherbildung bei pH 6,5-7,5 ausgeführt (siehe zum Beispiel Brinkley, M., Bioconj. Chem. 3 : 2-13 (1992), durch Bezugnahme hier aufgenommen). Ungebundenes Material wird durch Waschen der Oberfläche ent fernt.

Beispiel 10. Durch verbundene Polyoxime vermitteltes Aneinanderfügen von Zellen

[0141] Unter Einsatz der oben beschriebenen Methoden werden zwei verschiedene Polyoximtypen synthetisiert. Der eine Polyoximtyp enthält COSMs, die ein Tumorantigen erkennen und sich daran anfügen. Der andere Polyoximtyp enthält COSMs, die einen zum Beispiel auf einem Makrophagen, einer T-Zelle oder einer Killerzelle vorhandenen Zelloberflächenrezeptor erkennen und sich daran anheften. Die beiden Polyoximtypen sind so aufgebaut, dass die C-Termini bzw. N-Termini der Stammmolekülstrukturen komplementäre orthogonale, chemisch reaktive Gmppen wie zum Beispiel eine Sulihydryl- und eine Bromacetylgruppe haben.
[0142] Die beiden Polyoximtypen können dann unter milden wässrigen Bedingungen bei pH 4-9 durch Thioetherbildung kovalent miteinander verbunden werden. Vorzugsweise erfolgt die Thioetherbildung bei pH 6,5-7,5. Nach Abschluss der Reaktion werden die Bipolyoxime mit Standardverfahren wie der Gelfiltration oder RP-HPLC gereinigt und eingesetzt, um Zellenhaftung zwischen einer Tumorzelle und Zellen, die die passenden Rezeptoren oder Targetmoleküle enthalten, wie einem Makrophagen, einer T-Zelle oder einer Killerzelle, zu vermitteln. Solche Bipolyoxime werden eingesetzt, um Effektorzellen wie die oben beschriebenen zu einer interessanten Targetzelle wie einer Tumorzelle zu lotsen.
[0143] Dem Fachmann wäre bekannt, dass viele verschiedene Zelloberflächenrezeptoren und Zielmoleküle auf verschiedenen Zellentypen identifiziert worden sind. Entsprechend werden die Bipolyoxime so aufgebaut, dass sie das Aneinanderfügen spezifisch interessierender Zellen vermitteln.
[0144] Der Fachmann würde auch erkennen, dass Bipolyoxime einen ersten COSM- Typ, der eine besondere Zelle erkennt und daran bindet, sowie einen zweiten COSM- Typ, der zum Beispiel dazu dienen kann, an ein Reportermolekül zu binden, enthalten können. Solche Bipolyoxime sind nützlich, um die Gegenwart und den Ort der besonderen Zelle in einer heterogenen Zellenpopulation oder in einem Tier zu erkennen. Wechselweise kann der zweite COSM-Typ an ein Effektormolekül wie Ricin binden, wodurch das Effektormolekül zu der besonderen, interessierenden Zelle hingelenkt wird.

Beispiel 11. Paralleler Aufbau von verschiedenen, dem Melanocvten stimulierenden Hormon analogen Polyoximen

[0145] Synthetische Polypeptide NH&sub2;OCH&sub2;CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys- OH und NH2OCH2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-amid (beide Analoge des Alpha-Melanocyten stimulierenden Hormons ("MSH")) mit einer N-terminalen Aminooxyacylgruppe wurden hergestellt und getrennt mit einem Poly(aldehyd)- Stammmolekül, z. B. Terephthalaldehyd oder OCH-CO-Gly&sub3;-[Lys(COCHO)]&sub5;-Gly- OH (Seq.-ID-Nr.: 6), bei Zimmertemperatur in wässriger Acetatpufferlösung bei pH 4,6 inkubiert. Die Oximierungsreaktionen wurden wie beschrieben mit Umkehrphasen-HPLC verfolgt. Reaktionen mit zwei- und dreiwertigen Aldehyd-Stammmolekülen waren schnell (1 h), während Reaktionen mit sechs- oder achtwertigen Aldehyd-Stammmolekülen länger brauchten (etwa 16 h), jedoch auch nahezu zum Abschluss gelangten. Das Endprodukt wurde in jedem Falle durch Massenspektrometrie charakterisiert. Alle experimentell bestimmten Massen waren in ausgezeichneter Übereinstimmung mit den berechneten Werten. NHOCH2CO-Nle-Asp-His- (D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH und NHOCHCO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lysamid reagierten mit Terephthalaldehyd glatt zu den Homodimeren p-C6H6- [CH=NOCH&sub2;C&sub0;-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH]2 und p-CH4[CH=NO- CH2CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-Amid]2. Ein ESI-MS der -OH-Form ist in Fig. 12B gezeigt. Die Produkte waren im allgemeinen hoch wasserlöslich, obwohl diese Eigenschaft deutlich von der Hydrophilität der eingesetzten Verbindungen abhängen wird. Isomere Spezies wurden durch Polaritätsumkehr der Oximbindung hergestellt.
[0146] Mit HPLC wurde gezeigt, dass die Polyoxime bei Zimmertemperatur und pH- Werten von 2,1, 4,6 und 7,0 über zumindest 24 Stunden hinweg hydrolytisch stabil sind. Die hydrolytische Stabilität der Oximbindung, die sich als von ihrer Struktur beeinflusst erwies, erhöhte sich zufolge den Beobachtungen in der Reihe: -CO-NH- CH2-CH=N-O-CH2 < -NH-CO-CH=N-O-CH2- < -C6H4-CH=N-O-CH2-. Die invivo-Stabilität einer Oximbindung ist somit genügend gross, um Bioverteilungsstudien eines Immunkonjugats in Mäusen und auch klinisch über mehrere Tage hinweg verfolgen zu können. Es wäre natürlich zu erwarten, dass diese künstlichen Proteine ebenso wie natürliche Polypeptide und Proteine einer Desamidierung, Oxidation, mikrobiellem Abbau usw. unterworfen sind.

Beispiel 12. Synthese eines zweiwertieen und eines dreiwerten Aldehyd- Stammmoleküls

[0147] Nitrioessigsäure (Fluka, 64 mg, 1 mmol Carboxylgruppen) wurde mit Ultraschall und leichter Erwärmung in 15 ml DMF aufgelöst. Ein mmol festes N-Hydroxysuccinimid (Fluka) wurde hinzugefügt und gelöst, sodann 1 ml 1M Dicyclohexylcarbodümid (Fluka) hinzugefügt. Kein DCC verblieb nach einer Reaktion über Nacht bei Zimmertemperatur, und die Reaktion wurde filtriert, um etwas ausgefällten DCC-Harnstoff zu entfernen. Zum Filtrat wurden 1,2 mmol Aminoacetaldehyd-diethylacetal (Fluka) hinzugefügt. Nach Reaktion über Nacht wurden zuerst 30 ml 0,1% Trifluoressigsäure, sodann 1 ml 0,1% TFA in 90% Acetonitril und schliesslich 0,6 ml Essigsäure hinzugefügt. Nach gründlicher Vermischung wurde wiederum DCC-Hamstoff durch Filtration durch ein Teflon-Membranfilter entfernt. Das Produkt wurde in 10-ml-Portionen durch präparative HPLC in der schon beschriebenen 250 · 20-mm-Säule gereinigt, die bei 6 mb/min mit dem TFA-System betrieben wurde, die Überwachung erfolgte bei 214 nm. Nach 5 min mit Lösungsmittel A (0,1% TFA) wurde ein linearer Gradient von 2% B/min angelegt (B = 0,1% TFA in 90% Acetonitril). Die Retentionszeit des dreiwertigen Acetals N[CH2-CO- NH-CH2-CH(OEt)2]&sub3; betrug 42 min. die des zweiwertigen Acetals N[CH2-CO-NH- CH2-CH(OEt)2]&sub2;CH2-CO2H betrug 35 min. Die Produkte wurden mit FAB-MS identifiziert: mlz 537 für M+H+ des dreiwertigen Acetals, 422 für M+H+ des zweiwertigen Acetals.
[0148] Nach Entfernung von Lösungsmitteln im Rotationsverdampfer und durch Gefriertrocknung erfolgte Desacetalisierung mit 5% TFA bei 37ºC über eine Zeit von zwei Stunden. Der Trialdehyd zersetzte sich, wenn die 5% TFA-Lösung direkt eingedampft wurde, daher wurde das Produkt N[CH2-CO-NH-CH2-CHO]&sub3; isoliert, indem kleine Portionen (30 ul) in eine präparative Säule eingespritzt wurden, die bei 6 ml-min isokratisch mit Lösung A betrieben wurde; die Säule wurde zwischen den Einspritzungen mit 100% B gewaschen. Die überschüssige TFA von der Entfernung der Schutzgruppen eluierte mit einer Retentionszeit von 11 min. während das Produkt, das Trialdehyd-Stammmolekül, bei 13 min eluierte. Die Trialdehydlösung wurde mit 1 M NaOH auf einen pH-Wert von etwa 3 eingestellt und bei -20ºC aufbewahrt. Das zweiwertige Aldehyd-Stammmolekül wurde in ähnlicher Weise isoliert.

Beispiel 13. Herstellung von asymmetrischen zweiwertigen und symmetrischen dreiwertigen Polyoximen

[0149] Oximierung zwischen dem dreiwertigen symmetrischen Stammmolekül N[CH2-CO-NH-CH2-CHO]&sub3; und dem freien Säure-analogen der Aminooxyacetylalpha-MSH des Beispiels 11 wurde wie früher beschrieben durchgeführt. Mono-, Di- und Trioxime wurden hergestellt. Diese eluierten in analytischer HPLC (250 · 4 mm ID-Säule, 0,6 ml/min. Gradient 2% B/min) mit Retentionszeiten von 32, 35 bzw. 36 min.

Beispiel 14. Synthes eines Acetvl-Cvstein-Stammmoleküls

[0150] FMOC-Cys(Trt)-OSu, 0,2 mmol in 20 ml trockenem DMSO, wurden zu 0,1 mmol H-Gly3-Lys[Boc-Ser(Bzl)-]5-Gly-OCH2-PAM-Harz hinzugefügt. "OSu" deutet die N Hydroxysuccinimid-Esterform an. Nach wenigen Stunden Rühren bei einem scheinbaren pH-Wert von 8 (eingestellt mit N Methylmorpholin) war die Acylierung abgeschlossen, wie durch einen Ninhydrintest nachgewiesen. FMOC wurde mit DMF/Piperidin entfernt, die freigesetzte Aminogruppe wurde mit 5 Äquivalenten Essigsäureanhydrid in DMF unter Einsatz von N Methylmorpholin als Base acetyliert. Die Spaltung/Entfernung der Schutzgruppen verlief wie folgt: zu 100 mg des Harzes wurden 150 ul Thioanisol/Ethandithiol (Volumenverhältnis 2 : 1) hinzugefügt; nach 10 min Rühren bei Zimmertemperatur wurde 1 ml TFA hinzugefügt, und Rühren wurde noch 10 min fortgesetzt; dann wurden 100 ul TFMSA (Trifluormethansulfonsäure) langsam unter kräftigem Rühren zugesetzt und die Reaktion unter Rühren für 25 min ablaufen lassen; kalter Diethylether (10 ml) wurde sodann zugesetzt, um das Peptid auszufällen; nach 1 min Rühren wurde der Niederschlag zusammen mit dem nunmehr abgespaltenen Harz durch Zentrifugieren gewonnen;
rohes Peptid wurde wurde in 0,5 ml TFA aufgelöst, durch ein Teflonfilter abfiltriert, um Harz zu entfernen, dann wiederum mit kaltem Ether ausgefällt. Das Produkt wurde mit HPLC in einer 250 · 4 mm ID-Säule gereinigt, die bei 0,6 mumin mit dem TFA-System betrieben wurde, und zwar mit 1% B/min nach einer anfänglichen Periode von 5 min bei 100% A. Das Produkt eluierte als Hauptpeak bei einer Retentionszeit von 25 min und wurde durch ESI-MS charakterisiert (gefunden 1467,92 ± 0,79, berechnet 1466,62).

Beispiel 15 Herstellung von Heteropolvoximen

[0151] Durch Begrenzung der zu einem polyvalenten Stammmolekül zugesetzten Menge des modifizierten Peptids wurden partielle Reaktionsprodukte rasch gebildet und leicht isoliert. Zum Beispiel reagierte NH&sub2;OCH&sub2; CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg- Trp-Lys-OH glatt mit einem fünffachen Überschuss von Terephthalaldehyd (10- facher Überschuss von Aldehydgruppen) zu OCH-C&sub6;H&sub4;-p-CH=NOCH&sub2;CO-Nle-Asp- His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH, das durch HPLC isoliert und durch ESI-MS (Fig. 12A) charakterisiert wurde. Die Reaktion dieses Monoxims mit einem geringen Überschuss von NH&sub2;OCH&sub2;CO-Lys-Leu-Glu-Glu-GIn-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys-Gly- OH (Seq.-ID-Nr.: 4) führte rasch zu dem erwarteten heterodimeren Oxim p-C&sub6;H&sub4;[CH=NOCH&sub2;CO-Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Lys-OH] [CH=NOCH&sub2;CO- Lys-Leu-Giu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys-Gly-OH], das durch ESI-MS (Fig. 12C) charakterisiert wurde. Ein ähnliches Heterodimeres wurde unter Verwendung von NH&sub2;OCH&sub2;CO-Lys-Leu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys-Gly-OH (Seq.-ID- Nr.: 13) anstelle von NH&sub2;OCH&sub2;CO-Lys-Leu-Glu-Glu-Gln-Arg-Pro-Glu-Arg-Val-Lys- Gly-OH (Seq.-ID-Nr.: 4) hergestellt und ebenfalls durch ESI-MS (Fig. 12D) charakterisiert.

Beispiel 16. Anfügen einer komplementären reaktiven Gruppe an eine Peptid- Cysteinseitenkette durch Alkylierung und darauffolgende Polyoximbildung

[0152] Verbindungen (a) Br-CH2-CO-NHCHCH2NH-CO-CH2-O-NH-Boc und (b) Br-CH&sub2;-CO-NHCH2CH2NH-CO-CH2-O-NH2 wurden wie folgt synthetisiert. Zu 10 mmol Boc-NHOCH2CO-OSu, aufgelöst in 85 ml Ethylacetat, wurden 1,35 ml (20 mmol) Ethylendiamin unter Rühren hinzugefügt. Nach einer Stunde bei Zimmertemperatur wurde ein Niederschlag durch Zentrifugieren, darauffolgend das Lösungsmittel ohne Erhitzen am Rotationsverdampfer entfernt. Der verbleibende klebrige Rückstand wurde in 20 ml 1% Essigsäure aufgenommen. Eine kleine Menge unlöslichen dimeren Materials wurde auf dieser Stufe durch Zentrifugieren entfernt. Die wässrige Lösung wurde in Eis abgekühlt, dann auf eine Dowex-50Wx8 200-400 mesh-Säule (in der H+-Form) aufgegeben, die im voraus mit Wasser ins Gleichgewicht gesetzt worden war, in eine 10-ml-Polypropylen-Einmalspritze eingefüllt und in Eis abgekühlt. Eis wurde eingesetzt, um den Verlust von Boc-Schutzgruppen nach Protonenfreisetzung aus dem Harz während Bindung des Musters zu vermindern. Die Dowex-Säule wurde bei einer Fliessgeschwindigkeit von etwa 0,5 mumin eluiert, und zwar mit einem Gradienten von Pyridin-Acetatpuffer, der dadurch hergestellt wurde, dass eine 40-ml-Kammer mit pH-3,5-Puffer (Pyridin/Essigsäure/Wasser, Volumen verhältnis 10 : 100 : 890) mit einer 40-ml-Kammer mit pH-6,5-Puffer (Pyridin/Essigsäure/Wasser, Volumenverhältnis 250 : 10 : 2250) in Verbindung gesetzt und Lösungsmittel von der pH-3,5-Kammer her abgezogen wurde. Der Säulenablauf wurde durch TLC mit Siliciumdioxidplatten überwacht, und zwar unter Verwendung eines Butan-1-ollEssigsäure/Wasser/Aceton-Systems (Volumenverhältnis: 7 : 2 : 4 : 7) und nachfolgende Anfärbung mit Ninhydrin. Die Zwischenverbindung (c) NH2CH2CH2- NH-CO-CH2-O-NH-Boc war das erste, auf Ninhydrin positiv reagierende Material, das die Säule verliess (Rf war etwa 0,7 in dem obigen System; Rf des Materials ohne Boc war etwa 0,4; Rf von Ethylendiamin war etwa 0,07). Nach Lösungsmittelentfernung am Rotationsverdampfer ohne Erhitzen wurde der Rückstand mit Wasser verdünnt und zu einem farblosen Öl gefriergetrocknet. Die abschliessende Reinigung erfolgte durch präparative Umkehrphasen-HPLC in der 20-mm-Durchmesser-Säule, TFA-System, 5 ml/min. 10 min isokratisch 100% A, gefolgt von einem linearen Gradienten des Lösungsmittels B bis 100% B über eine Zeit von 1 S min. mit Überwachung bei 229 nm. Das gewünschte Material war der einzige Hauptpeak nach der Lösungsmittelfront und hatte eine Retentionszeit von etwa 33 min. Das Zwischenprodukt wurde durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie als (c) identifiziert.
[0153] Eine Lösung von 110 mg der Verbindung (c), aufgelöst in 1 ml DMSO, wurde unter Rühren zu 250 mg BrCH2CO-OSu, aufgelöst in 2 ml DMSO, hinzugefügt. Der scheinbare pH-Wert (gemessen mit einem vorher mit Wasser angefeuchteten MerckpH-Indikatorstreifen) wurde durch Zusatz von 50 ul N Methylmorpholin auf etwa 8 gebracht. Nach 20 min (der pH-Wert fiel auf etwa 4) wurden 25 ml Wasser zugesetzt. Ein kleiner Niederschlag wurde durch Filtrieren entfernt, während das Produkt wie zuvor durch RP-HPLC isoliert wurde. In diesem Falle wurde das Muster in Portionen von etwa 8 ml aufgegeben. Nach einer isokratischen Periode von 5 min bei 100% A wurde ein linearer Gradient von 2% B/min angelegt, während die Überwachung bei 229 nm erfolgte. Das Produkt war der einzige Hauptpeak nach Erscheinen der Lösungsmittelfront und hatte eine Retentionszeit von etwa 41 min. Das Produkt wurde am Rotationsverdampfer und anschliessende Gefriertrocknung isoliert. Die Ausbeute betrug etwa 100 mg. Das durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie als Verbindung (a) charakterisierte Produkt hatte das erwartete Bromisotopenbild in der Umgebung von M+H 355.
[0154] Verbindung (b) wurde durch Entfernung der Boc-Gruppe von Verbindung (a) hergestellt, indem letztere bei Zimmertemperatur und 50 mg/ml während 30 min in Trifluoressigsäure aufgelöst und anschliessend im Hochvakuum getrocknet wurde.
[0155] Verbindungen (a) und (b) wurden zur Alkylierung bei 40 bzw. 50 mg/ml in Wasser aufgenommen. Das Peptid Acetyl-Asp-Cys-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu- Gly-Asp-Pro-His-amid (Seq.-ID-Nr.: 20; ein T-Zellen-Epitop des Influenzavirus, siehe Brown und Mitautoren, J. Virol. (1993) 67 : 2887-2893) wurde mit Standard- FMOC-Methoden auf einem ABI 430A-Synthesizer hergestellt, durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie identifiziert; die gefundene und berechnete Masse betrug 1423,6. Das Peptid wurde zu 1,5 mM in Wasser/Acetonitril (Volumenverhältnis 2 : 1) aufgelöst. Zu 100 ul 0,1% Trifluoressigsäure wurden 20 ul Peptidlösung, 20 ul Reagenslösung (Verbindung (a) oder (b)) und 20 ul 1 M Phosphatpuffer (Gegenion Natrium, pH 7,0) hinzugefügt. Die Reaktionen liefen bei Zimmertemperatur ab. Analytische Umkehrphasen-HPLC mit dem TFA-System erwies eine quantitative Reaktion sowohl mit Verbindung (a) wie mit Verbindung (b) innerhalb von 30 min. nicht umgesetztes Peptid (Retentionszeit 39 min) war abwesend und durch einen neuen Peak entweder bei einer Retentionszeit von 37 min (im Falle der Reaktion mit Verbindung (b)) oder bei einer Retentionszeit von 41 min (im Falle der Reaktion mit Verbindung (a)) ersetzt. Über die nächsten drei Stunden erfolgte keine weitere Reaktion. In Abwesenheit der Reagentien (a) oder (b) wurde das Peptid langsam zum Disulfiddimer oxidiert (etwa 30% über eine Zeit von 6 h). Die Produkte der Alkylierungsreaktionen wurden durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie identifiziert; für das Produkt mit Reagens (a) war die gefundene Masse 1697,0, die berechnete 1696,9; für das Produkt mit Reagens (b) war die gefundene Masse 1596,6, die berechnete 1596,8.
[0156] Im Falle des mit Verbindung (a) alkylierten Polypeptids wurde die Boc- Gruppe durch Standard-TFA-Behandlung vor der Oximierung entfernt. Mit Verbindung (b) alkylierte Polypeptide benötigten diese Behandlung nicht. Reagens (a) empfiehlt sich, wenn das alkylierte Peptid über lange Zeiten aufbewahrt werden muss, während Reagens (b) für den Einsatz bei grossen oder zerbrechlichen Polypeptiden (wie Antikörperfragmenten) empfohlen wird, die eine Behandlung zur Entfernung der Boc-Gruppe nicht leicht intakt überleben.
[0157] Ein weiteres Alkylierungsreagens Br-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH-COCH&sub2;ONH-Boc wurde durch Acylierung von Br-CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH&sub2; (als Hydrobromid von Aldrich, Milwaukee WI erhältlich) mit Boc-AOA-OSu hergestellt. Dieses Alkylhalogenid wurde benutzt, um das oben beschriebene, Cys enthaltende Influenzaviruspeptid zu alkylieren. Sogar bei millimolaren Konzentrationen verliefen die Reaktionen bei Zimmertemperatur sehr langsam.

Beispiel 17. Paralleler Aufbau von Peptiden mit komplementären reaktiven thioethergebundenen Aminooxyacetylgruppen

[0158] Die mit einer über eine Thioetherbrücke an eine Cys-Seitenkette angefügten freien Aminooxyacetylgruppe ausgestatteten Polypeptide wurden in Oximierungsreaktionen eingesetzt, wie oben für Polypeptide mit einer Aminooxyacetylgruppe am N- oder C-Ende beschrieben. Dadurch wird eine Methode geschaffen, Polyoxime zu erzeugen, die ein durch Thioether- und Oximbindungen über eine Cys-Seitenkette mit dem Stammmolekül verbundenes COSM haben. Die Polypeptidabkömmlinge des Beispiels 16 wurden mit den hier beschriebenen Stammmolekülen verwendet, um verschiedene Polyoxime zu erzeugen. Zum Beispiel kann das Tetraoxim zwischen Acetyl-Asp-Cys(CH2CONH-CH2CH2NH-COCH2ONH2)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala- Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-amid (Seq.-ID-Nr.: 21) und dem Stammmolekül GXL- Lys(GXL)-Lys(GXL-Lys(GXL))-Tyr-OH (Seq.-ID-Nr.: 31) gebildet werden. Das Stammmolekül wurde mit den Schritten gebildet, FMOC-Lys(FMOC) an Tyr(tBu)- Sasrinharz anzukoppeln, FMOC zu entfernen, FMOC-Lys(FMOC) erneut anzukoppeln, FMOC zu entfernen, Boc-Ser(tBu) anzukoppeln, zu spalten/Schutzgruppen zu entfernen und Ser zu GXL zu oxidieren. AOA-Lys(AOA)-Lys(AOA-Lys(AOA))- Tyr-OH wurde ebenfalls hergestellt.

Beispiel 18. Anfügung einer reaktiven Gruppe durch eine Disulfidbindung an eine Seitenkette von Cystein

[0159] Verbindungen (d) 2-Pyridyl-S-S-CH2CH2NH-CO-CH2-O-NH-BOC und (e) 2-Pyridyl-S-S-CH2CH2NH-CO-CH2-O-NH2 wurden wie folgt synthetisiert. Cystamin-Dihydrochlorid wurde unter Verwendung von N Methylmorpholin als Base und einem 20%igen Überschuss von aktiven Ester- über Aminogruppen in DMF mit Boc-NI-IOCH2CO-OSu acyliert. Nach Verdünnung mit drei Volumen Wasser wurde das acylierte Produkt in Ethylacetat extrahiert und mit Dichlormethan/Methanol (240 : 10) als Lösungsmittel in einer Kieselgelsäule gereinigt. Das Produkt, Bis(Bocaminooxyacetyl)cystamin, war ein einziger Peak in analytischer HPLC und hatte das erwartete Massenspektrum. Die Disulfidbindung wurde mit einem fünffachen Überschuss von Dithiothreit in 1% Ammoniumbicarbonatlösung reduziert, und das anfallende Boc-Aminooxyacetylcysteamin wurde durch präparative HPLC isoliert. Die Thiolgruppe wurde mit 2,2'-Dithiodipyridine (fünffacher Überschuss in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,6) zu Verbindung (d) umgesetzt, die durch Extraktion mit Diethylether isoliert wurde (zusammen mit überschüssigem Reagens). Ein Zusatz eines kleinen Anteils von Petrolether fällte den grössten Teil des überschüssigen Reagens, während Verbindung (d) in Lösung blieb. Nach Rotationsverdampfung wurde Verbindung (d) durch HPLC gereinigt und durch Elektrosprühionisierungs- Massenspektrometrie charakterisiert (M+H 360,5). Die Umwandlung von Verbindung (d) in Verbindung (e) wurde durch Standardbehandlung mit TFA erreicht (1 h, Zimmertemperatur).
[0160] Verbindungen (d) und (e) reagierten unter milden wässrigen Bedingungen (z. B. Acetatpuffer pH 4,6 oder Phosphatpuffer pH 7 mit niedrigen millimolaren Konzentrationen der Reagentien bei 22ºC; Reaktion war nach 10 min beendet) über die 2-Thiopyridylgruppe glatt mit Cys enthaltenden Peptiden. Verbindungen (d) und (e) wurden zum Beispiel mit den Peptiden Acetyl-Asp-Cys-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu- Leu-Gly-Asp-Pro-His-amid und AOA-Asp-Cys-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly- Asp-Pro-His-amid (Seq.-ID-Nr.: 22) umgesetzt. Acetyl-Asp-Cys(S-CH2CH2NH- COCH2ONH-Boc)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-Amid (Seq.-ID- Nr.: 30) wurde durch RP-HPLC gereinigt und durch Elektrosprühionisierungs- Massenspektrometrie charakterisiert; Masse gefunden 1671,7, Masse berechnet 1671,9. Cys beinhaltet konventionsgemäss ein S. so dass zum Beispiel Cys(S- CH2CH2NHCOCH2ONH-Boc) in der obigen Struktur eine Seitenkette andeutet, die eine Disulfidbindung enthält, die zwischen dem S-Atom von Cys und dem S-Atom von S-CH2CH2NHCOCH2ONH-Boc gebildet ist. Diese Konvention wird durchwegs befolgt. Die anfallenden Peptidabkömmlinge besassen eine durch eine Disulfidbindung angefügte Aminooxyacetyl- (oder geschützte Aminooxyacetyl-) gruppe.
[0161] Die Aminooxyacetylgruppe und die Dithiopyridylgruppe können am selben Peptid-COSM vorhanden sein. Zum Beispiel wurde NH&sub2;OCH&sub2;CO-Asp-Cys(S-2- pyridyl)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH&sub2; (Seq.-ID-Nr.: 23) durch Umsetzung der -SH-Form des AOA-Peptids mit 2,2'-Dithiodipyridin (bei pH 4,6 unter den oben beschriebenen Bedingungen) hergestellt. Das modifizierte Peptid wurde durch HPLC isoliert und gab das erwartete Elektrosprühionisierungs- Massenspektrum. Dieses Peptid-COSM wurde in einer Mischung von 0,1 M Acetatpuffer (Gegenion Natrium) und Acetonitril (Volumenverhältnis 2 : 1) mit einem Tetraaldehyd-Stammmolekül umgesetzt, das wie folgt hergestellt war. Das Stammmolekül wurde mit der von Mutter beschriebenen zyklischen Struktur aufgebaut (Tuchscherer und Mitautoren, in Peptides 1992, Schneider, C. H., und Eberle, A. N., Hrsg., ESCOM, Leiden (1993), Seiten 848-849), die eine Disulfidbindung zwischen den beiden Cys- (C-) Resten enthält: Ac-Cys-Lys-Ala-Lys- Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Cys-NH&sub2; (Seq.-ID-Nr.: 24). Die vier Lys- (K-) Seitenketten dieser Matrizen-Vorstufe wurden unter Standardbedingungen mit Boc-Ser(tBu)-OSu acyliert. Das acylierte Produkt wurde durch HPLC isoliert, und die Boc- und Butylschutzgruppen wurden durch einstündige Behandlung mit TFA bei Zimmertemperatur entfernt. Die TFA wurde im Vakuum ohne Erhitzen entfernt. Die anfallende Stammmolekül-Vorstufe, die einen einzigen Peak in analytischer HPLC und das erwartete Elektrosprühionisierungs-Massenspektrum lieferte, wurde, wie für die früheren Stammmoleküle beschrieben, mit Periodat oxidiert und wiederum durch HPLC isoliert. Nach 16-stündiger Oximierung bei Zimmertemperatur wurde das erwartete Tetraoxim durch HPLC isoliert und durch Elektrosprühionisierungs- Massenspektrometrie charakterisiert: die gefundene Masse war 7479,31, die berechnete 7479,43. Das Polyoxim eluierte nach 45 min von der analytischen Säule, wenn ein Gradient von 2% B/min von 0 bis 100% B angewendet wurde.
[0162] Wie hierin festgestellt, wurde Oximbildung durch die Gegenwart der 2- Thiopyridyl-Schutzgruppe an den Cys-Seitenketten nicht verhindert.

Beispiel 19. CO Ms als Linker

[0163] Die hier hergestellten COSMs können selbst als Linker dienen. Zum Beispiel wurde das AOA-COSM NH&sub2;OCH&sub2;CO-Asp-Cys(S-2-pyridyl)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala- Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH&sub2; (Seq.-ID-Nr.: 23), das sowohl AOA- als auch 2-Thiopyridylfunktionen besitzt, als ein Linker benutzt, um das folgende COSM zu erzeugen, das eine Disulfidbindung zwischen den beiden Cys-Resten hat:

Beispiel 20. Synthese eines dreiwertigen Stammmoleküls mit aromatischen Aldehydgruppen

[0164] Das Stammmolekül
wurde wie folgt synthetisiert. Fünfzig ul Tris(2-aminoethyl)amin (etwa 1/3 mmol; Aldrich Chemical Co.) wurden in 5 ml DMSO aufgelöst und zu 4-Carboxybenzaldehyd-Hydroxysuccinimidester (247 mg, 1 mmol, aufgelöst in 5 ml DMSO) hinzugegeben. Nach 2 h bei Zimmertemperatur wurden 20 ml Wasser zugegeben. Nach weiteren 2 h wurde das Produkt mit 2 · 10 ml Chloroform extrahiert. Die zusammengefassten organischen Phasen wurden mit 10 ml Wasser gewaschen, dann am Rotationsverdampfer eingetrocknet. Die fahl gelbe feste Substanz wurde in 50 ml Wasser mit Ultraschall behandelt, filriert und im Hochvakuum getrocknet, um 94 mg eines leicht verfärbten weissen Pulvers zu ergeben. Das Produkt eluierte als einzige Hauptkomponente in Umkehrphasen-HPLC und wurde durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie als (f) identifiziert: gefundene und berechnete Masse 542 (543 M+H). Eine kleine Verunreinigung (weniger als 10%), die in der HPLC-Spur sichtbar war, wurde als (1) identifiziert, dem eine 4-Carboxybenzaldehydgruppe fehlt (M+H 411), d. h. das Stammmolekül:
[0165] Für einige Anwendungen wurde diese Verunreinigung durch präparative HPLC entfernt. Durch Einsatz von mehr Tris(2-aminoethyl)amin in der obigen Acylierungsreaktion (und der gleichen Menge des aktiven Esters) wurde, wie erwartet, die Bildung von (g) begünstigt, und sie war unter Verwendung des TFA- Systems mit präparativer HPLC leicht zu isolieren.
[0166] Bei Verbindungen (f) und (g) wird erwartet, dass die verwendete Para- Substitution die geringste sterische Hinderung in der Acylierungsreaktion und in der nachfolgenden Oximbildung verursacht. Das zentrale Stickstoffatom dieser Strukturen gewährleistet Wasserlöslichkeit; sogar der Trialdehyd ist bei den eingesetzten millimolaren Konzentrationen löslich.
[0167] Bevorzugte Linker sind jene, die, wie hierin gelehrt, komplementäre reaktive Endgruppen haben, ein homogenes Reaktionsprodukt liefern (ausser wenn, wie unten erörtert, eine homologe Reihe eingesetzt wird) sowie weitere Funktionalitäten liefern (z. B. Löslichkeit oder eine erwünschte dreidimensionale Konformation), aber die gewünschten Reaktionen (sei es Alkylierung, Disulfidbildung oder Oxirnbildung) nicht stören.

Beispiel 21. Unter Verwendung aromatischer Aldehydmatrizen hergestellte Polyoxime

[0168] Polyoxime wurden unter Einsatz der aromatischen Tri- und Dialdehydmatrizen (f) und (g) hergestellt, darunter Oxime mit den aminooxyacetylierten Peptiden, wie oben beschrieben (zum Beispiel mit AOA-Nle-Asp-His-(D)Phe-Arg- Trp-Lys-amid, dem Analogen von Alpha-MSH). Die Reaktionen wurden mit RP- HPLC und Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie verfolgt. Die Polyoxime wurden durch HPLC gereinigt und durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie charakterisiert; alle hatten die erwartete Masse. Es wurde gefunden, dass Verbindungen (f) und (g) Oxime bilden, die gegenüber Hydrolyse besonders widerstandsfähig waren und die auch gegenüber einer Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid (0,3 M) in Essigsäure (0,33 M) widerstandsfähig waren.
[0169] Es ist bekannt, dass das Alpha-MSH-Analoge Nle-Asp-His-(D-Phe)-Arg-Trp- Lys sogar dann an Melanomzellen bindet, wenn es an der Alpha-Aminogruppe modifiziert oder durch diese Gruppe zu einem Homodimeren verbunden ist (Bagutti und Mitautoren, Prog. Histochem. Cytochem. (1992) 26 : 110-118). Die biologische Aktivität von MSH kann zum Beispiel mit einem Melanintest in situ gemessen werden, wobei das Peptid auf die Stimulierung von B16-F1-Melanomzellen geprüft wird (Bagutti 1992).
[0170] Die Bindung und Potenz einiger Polyoximanalogen zum Alpha-Melanocyten stimulierenden Hormon wurde bestimmt. Die relative Bindung im Bindungstest mit Melanomzellen von Mäusen (Bagutti (1992)) bezieht sich auf die durchschnittliche Dissoziationskonstante (Kd) für das natürliche Hormon in seiner vollen Länge, geteilt durch den Kd-Wert für unser Oximanaloges. Die relative Potenz im Melanintest (Bagutti (1992)) bezieht sich auf das Verhältnis der Konzentrationen (die 50% der Höchstwirkung ergeben) des Hormons in seiner vollen Länge und des Analogen. Ergebnisse, die mit dem Analogen von Alpha-MSH, Nle-Asp-His-(D)Phe-Arg-Trp- Lys-amid, erhalten wurden, werden geliefert. Das Bezugs-Monoxim dieses Analogen (mit Acetaldehyd oximiertes Aminooxyacetylpeptid) hat eine relative Bindung von 0,82 und eine relative Potenz von 1,78. Das zwischen dem Aminooxyacetylpeptid und Verbindung (f) gebildete Trioxim hat eine relative Bindung von 4,9 und eine relative Potenz von 0,24. Das zwischen dem Aminooxyacetylpeptid und glyoxal (O=CH- CH=O) gebildete Dioxim hat eine relative Bindung von 3,33 und eine relative Potenz von 3,15.

Beispiel 22. Alk lierung von Antikörperfragmenten und nachfolgende Polyoximbildung

[0171] Verbindung (b) wurde auch eingesetzt, um viel grössere Polypeptide zu alkylieren, darunter F(ab')-Bruchstücke von IgG-Antikörpern, die durch Reduktion der Disulfidbindungen erzeugt wurden, die die schweren Ketten von F(ab')2-Bruchstücken aneinander binden. F(ab')-Bruchstücke des monoklonalen Antikörpers Mab35 wurden mit Standardmethoden hergestellt. Das peptische F(ab')2 wurde mit Cysteamin zum F(ab')SH reduziert, das dann mit Reagens (b) alkyliert und entweder mit Stammmolekül (f) oder (g) unten oximiert wurde. Die Reaktionen wurden (mit oder ohne volle Reduktion mit 10 mM Dithiothreit vor der Analyse) durch SDS-PAGE, Gelfiltrationschromatographie und Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie verfolgt. Das erwartete Dioxim wurde in guter Ausbeute, das Trioxim in geringerer Ausbeute erhalten (wahrscheinlich wegen sterischer Hinderung; eine solche Hinderung ist gewöhnlich geringer, wenn längere Linker benutzt werden). In vivo wird das F(ab')&sub2;-Polyoxim eine geringere Lokalisierung in den Nieren haben, was zu einer verminderten Ausscheidungsrate führt.

Beispiel 23. Reduktion der Oximbindung

[0172] Reduzierte Oximbindungen sind gegenüber Hydrolyse bei neutralen und sauren pH-Werten weniger empfindlich als das nicht konjugierte aliphatische Oxim. Reduktion der Oximbindung erfolgte gemäss einer Methode in Comprehensive Organic Synthesis, Barry M. Trost, Chefredakteur, Band 8, Ian Fleming, Hrsg., Seiten 60-78, Pergamon Press, Oxford (1991). Zwischen nichtkonjugierten alphatischen Gruppen gebildete Oxime, zum Beispiel -CH2-CH=NO-CH2-, liessen sich mit 0,3 M Natriumcyanoborhydrid in 0,33 M Essigsäure bei Zimmertemperatur leicht innerhalb von Minuten bis sehr wenigen Stunden reduzieren. Eine ausgedehnte Behandlung (zum Beispiel über Nacht) führte zu Zersetzung. Das reduzierte Produkt eluierte in Umkehrphasen-HPLC vor dem nicht reduzierten Ausgangsmaterial und wurde durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie identifiziert, die den erwarteten Zuwachs um zwei Masseeinheiten pro reduzierter Oximbindung bestätigte. Das reduzierte Oxim (nunmehr ein N,O-Dialkylhydroxylamin) war gegenüber Hydrolyse bei neutralen und sauren pH-Werten weniger empfindlich als das nicht konjugierte aliphatische Oxim.
[0173] Konjugierte aliphatische Oxime, zum Beispiel -NH-CO-CH=NO-CH2-, liessen sich bei ausgedehnter Behandlung mit Reduktionsmittel nur teilweise reduzieren. Aromatische Oxime, zum Beispiel -C6H4-CH=NO-CH2, liessen sich unter diesen Bedingungen nicht reduzieren. Schärfere Bedingungen sind bekannt (siehe zum Beispiel Comprehensive Organic Synthesis, Barry M. Trost, Chefredakteur, Band 8, Ian Fleming, Hrsg., Seiten 60-78, Pergamon Press, Oxford, 1991), unter denen solche Oxime reduziert werden, und können unter Umständen nützlich sein, obwohl Sorge getragen werden muss, nicht auch andere vorliegende empfindliche Gruppen wie die Indolseitenkette von Tryptophan zu reduzieren. Beispiel 24. Immunogene Polyoxime
[0174] Das T-Zellen-Epitop des Influenzaviruspeptids H-Asp-Cys-Thr-Leu-Ile-Asp- Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH2 (Brown und Mitautoren, J. Virol. (1993) 67:
2887-2893) und das B- und T-Epitop T-Epitope enthaltende C-endständige Peptid H- Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-Met-Arg-Asn-Val- Pro-Glu-Lys-Gln-Thr-OH (Seq.-ID-Nr.: 25; z. B. Jackson, D. C., und Brown, L. E., Peptide Research (1991) 4 : 114-124) wurden als Beispiele für die Herstellung immunogener Peptide verwendet.
[0175] Das Peptid AOA-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr- Gly-Met-Arg-Asn-Val-Pro-Glu-Lys-Gln-Thr-OH (Seq.-ID-Nr.: 26) wurde unter Verwendung der Standard-FMOC-Protokolle und des handelsüblichen FMOC-Thr(tBu)- Sasrin-Harzes (von Bachem AG, Hauptstrasse 144, 4416 Bubendorf, Schweiz) durch automatisierte Festphasensynthese auf einem ABI 430A-Gerät hergestellt. Vor Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen wurde das Peptid am Harz mit BOC- NHOCH2CO-OSu acyliert und wie oben beschrieben aufgearbeitet. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Peptid durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie charakterisiert, und zwar sowohl als das freie Aminooxyacetylpeptid als auch als das durch Inkubation eines Anteiles mit einem kleinen Überschuss von Acetaldehyd bei pH 4,6 und Isolierung des Produktes durch HPLC gebildete Oxim. Die Masse des Acetaldehydoxims wurde zu 2744,46 gefunden und zu 2744,18 berechnet.
[0176] Das oben beschriebene zyklische, auf Ac-Cys-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala- Lys-Cys-NH2 beruhende Stammmolekül wurde zur Polyoximbildung eingesetzt. Es wurde wie beschrieben mit Periodat oxidiert und durch HPLC isoliert. Unter den oben beschriebenen Bedingungen (Acetatpuffer pH 4,6, fünffacher Überschuss des Peptids über alle Glyoxylylgruppen, 16 h, Zimmertemperatur) wurde dann zwischen den (durch Oxidation von Ser-Gruppen an den Lys- (K-) Seitenketten erzeugten) Glyoxylylgruppen und der Aminooxyacetylgruppe des Peptids AOA-Pro-Lys-Tyr- Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-Met-Arg-Asn-Val-Pro-Glu-Lys- Gln-Thr-OH eine parallel aufbauende Oximierung ausgeführt. Das anfallende Tetraoxim wurde durch HPLC isoliert und durch Elektrosprühionisierungs-Massenspektrometrie charakterisiert (gefunden 12097,08, berechnet 12097,04).
[0177] Das Polyoxim, in diesem Falle ein Tetraoxim, wurde im T-Zellen-Ausbreitungstest sowie auch in vivo in Mäusen zum Schutz gegen virale Herausforderung geprüft.
[0178] Unter Einsatz der hierin beschriebenen Methoden wurden auch die folgenden, für Immunogenität nützlichen COSMs hergestellt: AOA-Asp-Cys-Thr-Leu-Ile-Asp- Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH2 (Seq.-ID-Nr.: 22), Ac-Asp-Cys(CH2CH2CH2- NH-AOA)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH2 (Seq.-ID-Nr.: 27), Ac-Asp-Cys(CH2CONHCH2CH2NH-AOA)-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly- Asp-Pro-His-NH2 (Seq.-ID-Nr.: 21) und
[0179] Weitere nützliche COSMs sind: Ac-Asp-Cys*-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu- Gly-Asp-Pro-His-NHCH2CH2NH-AOA (Seq.-ID-Nr.: 28), worin Cys* das S-Carboxamidomethylderivat von Cys ist, Ac-Asp-Cys-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu- Leu-Gly-Asp-Pro-His-NHCH2CHH2NH-AOA (Seq.-ID-Nr.: 29) und
[0180] Ein immunogenes Heterotetraoxim-Polyoxim hat zum Beispiel je zwei Exemplare von AOA-Asp-Cys*-Thr-Leu-Ile-Asp-Ala-Leu-Leu-Gly-Asp-Pro-His-NH2 und AOA-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-Met-Arg-Asn- Val-Pro-Glu-Lys-Gln-Thr-OH, worin Cys* das S-Carboxamidomethylderivat von Cys ist.

Beispiel 25. Homologe Polyoxim-Reihen

[0181] Wenn als COSM-Gemische Aminooxyacetyl- (oder aldehydmodifiziertes) Monomethoxy-polyethylenglycol oder andere homologe Reihen von Polymeren eingesetzt werden, kann ein Polyoxim Heterogenität im Molekül selbst erlangen. Solche Polyoxime werden durch Parallelaufbau eines Gemischs von Mitgliedern einer homologen Reihe wie NH&sub2;OCH&sub2;C&sub0;-NH-CH&sub2;CH&sub2;O(CH&sub2;CH&sub2;O)nCH~CH&sub2;CH&sub2;OCH&sub3;, O- CHCH&sub2;O(CH&sub2;CH&sub2;O)nCH&sub2;CH&sub2;OCH&sub3; oder O =CHCONHCH&sub2;CH&sub2;O(CH&sub2;CH&sub2;O)n- CH&sub2;CH&sub2;OCH&sub3; gebildet, wobei n eine ganze Zahl ist. Aldehyd- und AOA-modifizierte Moleküle einer homologen Reihe können in der Polyoximbildung durch Parallelaufbau eingesetzt werden.
[0182] Die vorliegende Erfindung stellt nunmehr die Mittel zur Verfügung, um rasch Polyoxim-Multimere von biologischen Verbindungen für Screening zu synthetisieren, zum Beispiel MSH, die unterschiedliche Beabstandung, Ladung, Lipophilität, Valenz, Konformationszwänge, Löslichkeit und andere erwünschte physikalische und biologische (zum Beispiel immunologische) Eigenschaften besitzen.

SEQUENZVERZEICHNIS

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Rose, Keith
Offord, Robin
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: POLYOXIME UND DEREN HERSTELLUNG
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 31
(iv) ADRESSE FÜR SCHRIFTVERKEHR:
(A) ADRESSAT: Cooley Godward Castro Huddleson & Tatum
(B) STRASSE: 5 Pato Alto Square
(C) ORT: Pato Alto
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) PLZ:94036
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIENART: Floppy-Disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Freigabe #1.0, Version #1.25
(vi) DERZEITIGE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: PCT-Laufnummer noch nicht zugeteilt
(B) ANMELDEDATUM: WIRD HiERM)T ANGEMELDET
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANWALTS-/VERTRETERDATEN:
(A) NAME: Torchia, Timothy E.
(B) MELDENUMMER: 36 700
(C) ZEICHEN/AKTENNUMMER: ABIC-001 /03WO
(ix) FERNMELDEDATEN:
(A) TELEFON: (415) 843-5481
(β) TELEFAX: (415) 857-0663
(C) TELEX: 380816 CooleyPA

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 1:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 1: Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 2:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) Art: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-1D-NR. 2: Ser Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Val Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 3:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Aminooxyacetyl-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREißUNG: SEQ.-ID-NR. 3: Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 4:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 4: Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 5:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE; 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Gly
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WElTERE ANGABEN: AOA-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 7
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE; 8
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Lys
(ix) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 5: Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys Gly
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 6:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGiE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Gly
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 7
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE:8
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 6: Gly GIy GIy Lys Lys Lys Lys Lys Gly
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 7:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE:5
(D) WEITERE ANGABEN: Serin-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: Serin-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 7
(D) WEITERE ANGABEN: Serin-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 8
(D) WEITERE ANGABEN: Serin-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 9
(D) WEITERE ANGABEN: Serin-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 7: Ser Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 8:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SGHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Bromacetyl-Gly
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SGHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) - LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 7
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 8
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys ·
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 8: Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys G1y
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 9:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Gly
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 7
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 8
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 9
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SGHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 10
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 9: Gly Gly Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 10:

(1) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Glu
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 10: Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15
Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg
20

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 11:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 11: GIy Gly Gly Lys Lys Gly
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 12:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Tyr
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 12: Tyr Arg Glu Asp Gly Val Thr Pro Tyr Met Ile Phe Phe Lys Asp Gly 1 5 10 15
Leu Glu Met Glu Lys
20

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 13:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Lys
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 13: Lys Leu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys Gly
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 14:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 3
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 14: Gly Gly Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 15:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 3
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 15: Gly Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-1D-NR. 16:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 3
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 4
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 16: Arg Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 17:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART; Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE:5
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(xi) SEQUENZBESCHRElBUNG: SEQ.-ID-NR. 17: Arg Tyr Gly Gly Xaa Xaa
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 18:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE:6
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 18: Arg Tyr Gly Ala Xaa Xaa
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 19:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(iii) HYPOTHETISCH: Ja
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCMLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 5
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 6
(D) WEITERE ANGABEN: Jegliche Aminosäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 19: Arg Tyr Lys Glu Xaa Xaa
1 5

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 20:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Acetyl-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D) WEITERE ANGABEN: His-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 20: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 21:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Acetyl-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 2
(D) WEITERE ANGABEN:
Cys(CH2CONH-CH2CH2NH-COCH2ONH2)-
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D) WEITERE ANGABEN: His-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 21: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 22:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE; 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D) WEITERE ANGABEN: His-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 22: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 23:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Steilungs-modifiziert
(B) LAGE: 2
(D) WEITERE ANGABEN: Cys(S-2-pyridyl)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D.) WEITERE ANGABEN: His-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 23: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 24:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(b) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: zyklisch
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Acetyl-Cys
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 10
(D) WEITERE ANGABEN: Cys-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 24: Cys Lys Ala Lys Pro Gly Lys Ala Lys Cys
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 25:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 25: Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met 1 5 10 15
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
20

(2) ANGABEN FÜR SEQ,-ID-NR. 26:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: AOA-Pro
(xi) SEQUENZBESCHRE18UNG: SEQ.-ID-NR. 26: Pro Lys Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr G1y Met 1 5 10 15
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr
20

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 27:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Acetyl-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 2
(D) WEITERE ANGABEN: Cys(CH2CH2CH2NH-AOA)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D) WEITERE ANGABEN: His-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 27: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 28:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEiTERE ANGABEN: Acetyl-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 2
(D) WEITERE ANGABEN: Cys(carboxamidomethyl)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE:13
(D) WEITERE ANGABEN: His-NHCH&sub2;CH&sub2;NH-AOA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 28: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 29:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Acetyl-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D) WEITERE ANGABEN: His-NHCH&sub2;CH&sub2;NH-AOA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 29: Asp Cys Thr Leu Ile Asp Aia Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 30:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: Acetyl-Asp
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stelllungs-modifiziert
(B) LAGE: 2
(D) WEITERE ANGABEN: Cys(S-CH2CH2NHCOCH2ONH-Boc)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 13
(D) WEITERE ANGABEN: His-amid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-lD-NR. 30: Asp Cys Thr Leu IIe Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His
1 5 10

(2) ANGABEN FÜR SEQ.-ID-NR. 31:

(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure-
(D) TOPOLOGIE:linear
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Stellungs-modifiziert
(B) LAGE: 1
(D) WEITERE ANGABEN: GXL-Lys(GXL)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Platz-modifiziert
(B) LAGE: 2
(D) WEITERE ANGABEN: Lys(GXL-Lys(GXL))
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL:
(B) LAGE:
(D) WEITERE ANGABEN:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ.-ID-NR. 31: Lys Lys Tyr 1

Claims

1. Homogene Polyoximzusammensetzung, in der in benannter Zusammensetzung vorliegende Polyoximmoleküle ein erstes organisches Stammmolekül umfassen, das eine Mehrzahl von reaktiven orthogonalen oximbildenden Gruppen besitzt und über eine Mehrzahl von zumindest drei Oximbindungen an die benannte Mehrzahl eines zweiten organischen Moleküls, das eine reaktive orthogonale Gruppe besitzt, gebunden ist, wobei die benannten Oximbindungen durch Reaktion einer reaktiven orthogonalen Gruppe an jedem des benannten zweiten organischen Moleküls mit einer komplementären reaktiven orthogonalen Gruppe an dem benannten ersten organischen Stammmolekül gebildet werden.

2. Zusammensetzung des Anspruchs 1, worin die benannte komplementäre reaktive orthogonale Gruppe an dem benannten Stammmolekül eine Aldehyd- oder eine Aminooxyacetylgruppe umfasst.

3. Zusammensetzung des Anspruchs 1, worin die benannte reaktive orthogonale Gruppe in dem benannten zweiten organischen Molekül Aminooxyacetyl umfasst.

4. Heteropolyoxim mit einem ersten organischen Stammmolekül, das eine Mehrzahl von reaktiven orthogonalen oximbildenden Gruppen besitzt und über eine Mehrzahl von zumindest drei Oximbindungen an eine Mehrzahl von zweiten organischen Molekülen gebunden ist, die eine reaktive orthogonale Gruppe besitzen, wobei die benannten Oximbindungen durch Reaktion einer reaktiven orthogonalen Gruppe an jedem des benannten zweiten organischen Moleküls mit einer komplementären reaktiven orthogonalen Gruppe an dem benannten Stammmolekül gebildet werden.

5. Heteropolyoxim des Anspruchs 4, worin jede Oximbindung die gleiche Ausrichtung hat.

6. Heteropolyoxim des Anspruchs 4, worin zumindest eine am Stammmolekül vorhandene reaktive orthogonale Grsuppe eine Aldehydgruppe umfasst.

7. Heteropolyoxim des Anspruchs 6, worin eine komplementäre reaktive orthogonale Gruppe von zumindest einem des zweiten organischen Moleküls eine Aminooxygruppe ist.

8. Polyoxim des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 4, weiter ein drittes organisches Molekül umfassend, das an das Stammmolekül gebunden und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus metallchelierenden Agentien, erkennbaren Markierungen, lipophilen Ankern und einer chemisch reaktiven, orthogonalen Gruppe besteht, die sich von einer oximbildenden Gruppe unterscheidet.

9. Polyoxim des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 4, worin das benannte zweite organische Molekül ein therapeutisches Mittel oder eine erkennbare Markierung ist.

10. Polyloxim des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 4, worin das benannte Polyoxim immunogen ist.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung, das Polyoxim des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 4 sowie einen pharmazeutisch zulässigen Träger umfassend.

12. Verfahren der In-vitro-Abbildung einer Zelle, die Schritte umfassend, die Zelle unter geeigneten Bedingungen, die die Bildung eines Komplexes zwischen dem abbildenden Agens oder der erkennbaren Markierung und der Objektzelle begünstigen, mit einer nachweisbaren Menge des Polyoxims des Anspruchs 8 oder 9 in Berührung zu bringen und jeden so gebildeten Komplex nachzuweisen.

13. Verfahren zur Herstellung der homogenen Polyoximzusammensetzung nach Anspruch 1, das die Schritte umfasst,

- ein erstes organisches Stammmolekül zu gewinnen, in dem eine Mehrzahl von zumindest drei identischen reaktiven orthogonalen Gruppen vorliegt, die fähig sind, Oximbindungen zu bilden,

- ein zweites organisches Molekül zu gewinnen, in dem eine komplementäre reaktive orthogonale Gruppe vorliegt, die fähig ist, eine Oximbindung mit der benannten reaktiven orthogonalen Gruppe an dem benannten Stammmolekül zu bilden,

- das benannte Stammmolekül unter Bedingungen, die Oximbindungsbildung gestatten, mit einer Menge des benannten zweiten organischen Moleküls in Berührung zu bringen, die für eine vollständige Reaktion zwischen dem benannten zweiten organischen Molekül und der benannten Mehrzahl von reaktiven orthogonalen Gruppen an dem benannten Stammmolekül genügt, und

- das Polyoximprodukt zu isolieren.

14. Verfahren für die Herstellung der Heteropolyoximzusammensetzung nach Anspruch 4, das die Schritte umfasst,

- ein erstes organisches Stammmolekül zu gewinnen, in dem eine Mehrzahl von zumindest drei reaktiven orthogonalen Gruppen vorliegt, die fähig sind, Oximbindungen zu bilden,

ein zweites organisches Molekül zu gewinnen, in dem eine reaktive orthogonale Gruppe vorliegt, die fähig ist, eine Oximbindung mit der zu ihr komplementären reaktiven orthogonalen Gruppe am Stammmolekül zu bilden,

- ein drittes organisches Molekül zu gewinnen, in dem eine reaktive orthogonale Gruppe, vorliegt, die fähig ist, eine Oximbindung mit der zu ihr komplementären reaktiven orthogonalen Gruppe am Stammmolekül zu bilden,

- das Stammmolekül und die zweiten organischen Moleküle unter Bedingungen zu vermischen, die Oximbindungsbildung zulassen,

- das Stammmolekül und die dritten organischen Moleküle entweder gleichzeitig oder sequentiell mit dem vorherigen Vermischungsschritt unter Bedingungen zu vermischen, die Oximbindungsbildung zulassen, und

- das Polyoximprodukt zu isolieren.