DE68902057T3

DE68902057T3 - Verfahren zur Elimination von steroiden Verbindungen, die in einer Substanz von biologischer Herkunft enthalten sind.

Info

Publication number: DE68902057T3
Application number: DE68902057T
Authority: DE
Inventors: Jean Courregelongue; Jean-Pierre Maffrand
Original assignee: Asterol International
Current assignee: Corman SA
Priority date: 1988-01-22
Filing date: 1989-01-20
Publication date: 1998-04-09
Anticipated expiration: 2009-01-21
Also published as: FR2626145A1; NZ227678A; JPH078206B2; ATE78134T1; CA1333908C; EP0326469B1; DE68902057T2; ES2034656T3; EP0326469B2; GR3005275T3; AU627708B2; GR910300110T1; EP0326469A1; AR241849A1; IE890181L; FR2626145B1; AU2844989A; DE68902057D1; DE326469T1; JPH01252259A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von in Substanzen biologischen Ursprungs enthaltenen Steroidverbindungen.
Unter Steroidverbindungen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden in der Hauptsache die Sterine in nichtverestertem Zustand oder in veresterter Form sowie die von ihrer Oxidation herrührenden Moleküle verstanden.
Es ist bekannt, daß die Sterine, die 3-β-Hydroxysteroide darstellen, biologischen Ursprung haben. Aus diesem Grund sind solche Verbindungen in zahlreichen Substanzen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs enthalten.
In aus tierischem Material hergestellten Fettstoffen macht Cholesterin, das in der Hauptsache in nichtveresterter Form vorliegt, 98 % der Sterine aus. Von J.P. WOLFF (im Manuel d'Analyse des Corps Gras, Azoulay, Ed., Paris, 1968) wurden die in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Steringehalte angegeben, die in mg pro 100 g Fett in rohem Zustand angegeben sind:
Im Gegensatz dazu sind die Fette pflanzlichen Ursprungs besonders cholesterinarm. Sie enthalten jedoch andere Sterine in einer Menge, die je nach ihrem Ursprung variiert, aber signifikant ist (80 - 1200 mg auf 100 g, nach J.P. WOLFF, supra). Von diesen Sterinen, die im folgenden Phytosterine genannt werden, sind zu nennen: β-Sitosterin, Campesterin, Stigmasterin, Brassicasterin, Δ&sup7;-Stigmasterin, Δ&sup7;-Campesterin, Δ&sup5;-Avenasterin, Δ&sup7;-Avenasterin, Δ&sup7;&supmin;&sup9;-Stigmastadienol, Fucosterin und Ergosterin, welche die Hauptsterine der wichtigsten, für Ernährungszwecke verwendeten Pflanzenöle darstellen.
In diesem Zusammenhang sind ferner die Vogeleier zu nennen, bei denen die Sterinfraktion des Eigelbs im wesent lichen Cholesterin enthält. Cholesterin stellt ferner etwa 5 % der Gesamtlipide des Hühnereis dar; es liegt hier zu 84 % in nichtveresterter Form und zu 16 % in veresterter Form vor.
Es ist ferner bekannt, daß in den genannten Fetten oder in Eiern Steroidketone nachgewiesen werden können, die von der Oxidation der Sterine herrühren und im folgenden Sterone genannt werden (vgl. V.P. FLANAGAN et al., Journal of Lipid Research, 16, 1975, 97-101).
Darüber hinaus sind noch weitere Sterinderivate zu nennen, deren Vorliegen festgestellt wurde (G. MAERKER, J.A.O.C.S., No. 3, 1987, 388-392; S.W. PARK et al., Journal of Food Science, 51, No. 5, 1986, 1380-1381; J.M. LUBY, Journal of Food Science, 51, No. 4, 1986, 908-911), ganz besonders in für Nahrungszwecke verwendeten Fritierbädern nach mehrfacher Verwendung; hierbei handelt es sich um durch Sauerstoff oxidierte Derivate, die Hydroxygruppen aufweisen.
Die Fette tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sind Gegenstand zahlreicher Anwendungen, da sie sich für zahlreiche Anwendungsgebiete eignen. Ihre Behandlung kann beispielsweise zu industriell hergestellten Produkten wie Butter, die im Mittel 225 bis 350 mg Cholesterin pro 100 g enthält (J.P. WOLFF, supra), zu Speiseölen, wie sie üblicherweise für die menschliche Ernährung vorgesehen sind, oder etwa zu Schokolade führen. Ebenso bekannt ist die Bedeutung von Eiern für die Herstellung von Nahrungsmittelprodukten.
Epidemiologische Untersuchungen (Lipid Research Clinics Program, The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trials, J. Amer. Med. Ass., 1984, 251, 351-374) erwiesen eine positive Korrelation zwischen erhöhten Cholesteringehalten im Plasma und cardiovasculären Erkrankungen.
Darüber hinaus wird für möglich gehalten, daß die Hydroxygruppen enthaltenden oxidierten Derivate des Cholesterins bei bestimmten Erkrankungen beim Menschen eine Rolle spielen, beispielsweise bei der Bildung von Atheromflecken (S.K. PENG et al., Atherosclerosis, 54, 1985, 121-133) sowie bei der Cancerogenese. Die Sterone könnten ferner auch mit dem Auftreten cardiovasculärer Erkrankungen in Zusammenhang stehen.
Diese Feststellungen lassen die Notwendigkeit erkennen, ein Abtrennungsverfahren anzugeben, mit dem die Menge an Sterinen und ihren Derivaten, die in Substanzen biologischen Ursprungs enthalten sind, die als solche zu Speisezwecken dienen oder deren Behandlung zu Nahrungsmittelprodukten führt, in signifikanter Weise verringert werden kann.
In dieser Hinsicht wurden bereits zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, von denen jedoch keine zu einem wirklich zufriedenstellenden Verfahren führte: Die Fällung mit Digitonin, die Extraktion mit einem Lösungsmittel, die im Fett toxische Rückstände hinterlassen kann, sowie schließlich die Absorption an Säulen und die Mikrodestillation stellen Verfahren dar, die nur schwierig in technischem Maßstab durchzuführen sind, da sie mit einem hohen apparativen Aufwand und komplexen und aufwendigen Handhabungen verbunden sind.
In EP-A-256 911 (EP-Anmeldung 87 401709.8) ist von der Anmelderin ein Verfahren zur Abtrennung von in Fetten tierischen Ursprungs enthaltenem Cholesterin beschrieben, das auf dem Inkontaktbringen des verflüssigten Fettes mit einem Cyclodextrin unter einer nichtoxidierenden Atmosphäre beruht, wobei 30 min bis 10 h bei einer Temperatur gerührt wird, die zwischen der Schmelztemperatur des Fettes und 80 ºC liegt, und so verfahren wird, daß sich Komplexe zwischen Cholesterin und Cyclodextrin bilden können, worauf die Komplexe in Wasser übergeführt und aus der wäßrigen Phase abgetrennt werden.
Der Anmelderin ist es nun im einzelnen gelungen, ein neues Verfahren anzugeben, das sich allgemein im technischen Maßstab einsetzen läßt und die mindestens teilweise Abtrennung der Sterine und ihrer Derivate erlaubt, die in Substanzen biologischen Ursprungs enthalten sind. Dieses Verfahren eignet sich für zahlreiche Anwendungsfälle. Es erlaubt insbesondere die Herstellung von Lebensmitteln mit verringertem Gehalt an Sterinen und davon abgeleiteten Molekülen; es erlaubt ferner noch zusätzlich die Gewinnung entsprechender Mengen von Sterinen und davon abgeleiteter Moleküle, die ihrerseits in geeigneter Weise behandelt werden können, um daraus Steroide, hauptsächlich Steroid hormone, herzustellen, die als Wirkstoffe für entsprechende Medikamente verwendet werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren nützt die inhärente Fähigkeit der Cyclodextrine zur Bildung von Einschlußkomplexen mit bestimmten organischen Molekülen aus.
Die Cyclodextrine stellen cyclische Oligosaccharide dar, die aus Glucopyranoseeinheiten bestehen, die untereinander mit einer α-(1T4)-glucosidischen Bindung verknüpft sind. Sie weisen eine hydrophobe Tasche auf, welche die Bildung von Einschlußkomplexen durch Einlagerung von Molekülen erlaubt. Die Toxizität der Cyclodextrine wurde ebenfalls untersucht; dabei wurde festgestellt, daß die orale Verabreichung dieser Cyclodextrine bei Ratten und Hunden keinerlei toxische Wirkung hat (J. SZEJTLI, Molecular Entrapment and Release Properties of Drugs by Cyclodextrins, in Controlled Drug Bioavailability, Vol 3; V.F. SMOLEN and L.A. BALL, ed. 1985 J. WILEY, p. 365; W. SAENGER, Angew. Chem. Ed. Engl., 1980, 19 344).
Die Cyclodextrine werden gegenwärtig im wesentlichen zur Komplexierung von Pesticiden verwendet. Darüber hinaus wurden auch andere Anwendungen beschrieben, insbesondere die Verwendung zur Extraktion freier Fettsäuren aus Pflanzenölen (J. SZEJTLI, Die Nahrung, 29 (1985) 9, 911-924); ihre Verwendung zur Extraktion von Sterinen und deren Derivaten wurde allerdings bisher nicht in Betracht gezogen.
Der Erfindung liegt entsprechend die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Abtrennung von in Substanzen biologischen Ursprungs enthaltenen Steroidverbindungen anzugeben. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige oder verflüssigte Substanz in wäßrigem Medium mit einem Cyclodextrin in Kontakt gebracht wird, wobei dieser Kontakt unter Rühren derart lange durchgeführt wird, daß sich Komplexe zwischen den Steroidverbindungen und dem Cyclodextrin bilden können, und die gebildeten Komplexe anschließend abgetrennt werden, wobei die Anwendung des Verfahrens zur Abtrennung von Cholesterin aus Fetten tierischen Ursprungs unter einer nichtoxidierenden Atmosphäre bei einer Kontaktzeit von 30 min bis 10 h ausgeschlossen ist.
Nach einer ersten Ausführungsform wird das Cyclodextrin in freier Form eingesetzt; es kann sich dabei um ein kristallin-amorphes Pulver oder um eine wäßrige Lösung handeln.
Die Phase der Komplexbildung erfordert ein wäßriges Reaktionsmedium, um eine Dispergierung der Komplexe zu ermöglichen. Es ist allerdings auch möglich, diesen Verfahrensschritt so durchzuführen, daß das Cyclodextrin und die zu behandelnde Substanz ohne Zusatz von Wasser in Kontakt gebracht werden, allerdings unter der Bedingung, daß diese Substanz ihrerseits Wasser enthält.
Wenn die zu behandelnde Substanz in Form eines entwässerten Pulvers, wie beispielsweise Eipulver, vorliegt, ist entsprechend ein Zusatz von Wasser unerläßlich. Schließlich ist festzustellen, daß es, wenn die zu behandelnde Substanz ein bei normaler Temperatur festes Fett ist, günstig ist, sie vor dem Inkontaktbringen mit dem Cyclodextrin durch eine geeignete thermische Behandlung zu verflüssigen.
Der Kontakt wird vorzugsweise bei einer Temperatur in der Nähe von 40 ºC durchgeführt. Die Temperatur kann im Bereich von 20 bis 40 ºC liegen, eignet sich jedoch dann nicht für die Behandlung einer bei normaler Temperatur festen Substanz, die eine vorherige Erwärmung erfordert, um sie in den flüssigen Zustand überzuführen; darüber hinaus ist die Reaktionsgeschwindigkeit dann niedriger. Die Temperatur kann auch über 40 ºC liegen und sogar 80 ºC erreichen. Dabei liegt es im Belieben des Fachmanns, eine entsprechende Temperatur auszuwählen, die nicht zu einer unerwünschten Veränderung der zu behandelnden Substanz führt.
Die Kontaktzeit, die für den Schritt der Komplexbildung erforderlich ist, ist sehr variabel. Dabei ist klar, daß sie insbesondere von der Menge der in dem zu behandelnden Stoff enthaltenen Steroidverbindungen und dem Prozentsatz der abzutrennenden Steroidverbindungen abhängt. Sie kann mehrere Stunden erreichen. Eine Kontaktzeit von 5 h ist besonders geeignet. Der Kontakt wird ferner durch Rühren erleichtert, das vorteilhaft während der gesamten Phase der Komplexbildung aufrechterhalten wird.
Vorzugsweise wird β-Cyclodextrin verwendet, das aus sieben Glucopyranoseeinheiten besteht. Derivate des β-Cyclodextrins, wie 2,6-Di-0-methyl-β-cyclodextrin, 2,3,6-Tri-0methyl-β-cyclodextrin sowie andere Cyclodextrine, wie etwa α-Cyclodextrin, deren Abmessungen ebenfalls die Bildung von Einschlußkomplexen erlauben, können ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden.
Die angewandten Mengen an Cyclodextrin können im Bereich von 0,5 bis 30 Masse-%, bezogen auf die Menge der bei ihrer Behandlung abzutrennenden Substanz, betragen. Der Mengenanteil an einzusetzendem Cyclodextrin hängt von der Konzentration der Sterine und Sterinderivate, der zu behandelnden Substanz und der angestrebten Abtrennausbeute ab.
Gemäß anderen Ausführungsformen dieser Verfahrensphase der Komplexbildung wird Flüssigchromatographie an einer festen Phase angewandt, auf der Cyclodextrin aufgepfropft ist, oder es werden vernetzte oder modifizierte Cyclodextrine geeigneterweise eingesetzt.
Die bei dieser ersten Verfahrensphase gebildeten Einschlußkomplexe zwischen den Sterinmolekülen und ihren Derivaten und den Molekülen des Cyclodextrins werden anschließend nach einem physikalischen Verfahren abgetrennt. Zentrifugieren bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 8000 hat sich als besonders geeignet erwiesen. Die Komplexe finden sich im Bodensatz, woraus sie gewonnen werden können. Wenn die zu behandelnde Substanz ein Fettkörper ist, weist der Überstand zwei Phasen auf, eine Ölphase, die sich über einer wäßrigen Phase befindet, in der das überschüssige, freigebliebene Cyclodextrin vorliegt. Dieser Überschuß kann abgetrennt werden, insbesondere durch fraktionierte Kristallisation.
Die Steroidverbindungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Substanzen biologischen Ursprungs abgetrennt werden können, sind unveresterte Sterine, veresterte Sterine, unabhängig von der Länge der Kohlenstoffkette (4 bis 26 C-Atome) und unabhängig vom Ungesättigtheitsgrad (0 bis 6 Doppelbindungen) der Fettsäure, sowie die davon abgeleiteten Moleküle, hauptsächlich nach Oxidation. Von diesen Molekülen sind insbesondere Sterone, wie Δ&sup4;-Cholesten-3-on und Δ3,5-Cholestadien-7-on, sowie Derivate, die Hydroxygruppen aufweisen, wie Cholestan-3β,5,6β-triol, zu nennen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Behandlung sämtlicher Substanzen biologischen Ursprungs. Es eignet sich insbesondere zur Behandlung von Fetten und Ölen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sowie von Produkten auf Eibasis.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt schließlich auch die Abtrennung von mindestens 80 % der Sterine und ihrer Derivate, die in einer zu behandelnden Substanz enthalten sind, wobei der Prozentsatz der abgetrennten Sterine und Sterinderivate insbesondere von ihrem Mengenanteil in der betreffenden Substanz abhängt. Die Ausbeute kann ferner dadurch verbessert werden, daß die gleiche Behandlung der Substanz ein zweites Mal und ggfs. anschließend noch ein drittes Mal durchgeführt wird, wobei weiteres Cyclodextrin zugesetzt wird.
Die Erfindung betrifft ferner, entsprechend einem zweiten Aspekt, an Sterinen und ihren Derivaten abgereicherte Substanzen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.

BEISPIEL 1

Behandlung von Produkten auf Eibasis zur Verringerung des Cholesteringehalts
Zur Behandlung wurden drei hinsichtlich ihrer physikochemischen Struktur unterschiedliche Ausgangsmaterialien herangezogen:
- Eigelb in Pulverform (vertrieben durch Avicole Breton CECAB, Delaunay, Frankreich),
- frisches Eigelb, das aus ganzen Eiern als Ganzes isoliert worden war (Eier aus dem Handel von Poitou Oeufs, Frankreich),
- ganze frische Eier (im Handel durch Poitou Oeufs, Frankreich).

Verfahrensweise

Die Proben wurden so hergestellt, daß 40 g destilliertes Wasser zu 10 g Material (Eigelbpulver und frische ganze Eier) bzw. 60 g destilliertes Wasser zu 10 g Material (frisches Eigelb) zugegeben wurden.
Jede so hergestellte und homogenisierte Probe wurde mit β-Cyclodextrin (im Handel durch Société ROQUETTE) in Form eines kristallin-amorphen Pulvers versetzt. Für jedes Material wurden vier Proben verwendet; das β-Cyclodextrin (β-CD) wurde jeweils in einer solchen Menge zugegeben, daß das Massenverhältnis von β-CD und dem Material 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25 bzw. 0,30 betrug (vgl. Tabelle I).
Nach Rühren auf einer Mischplatte wurden die Proben in einen auf 40 ºC geregelten Behälter gebracht und darin 5 h auf dieser Temperatur gehalten.
Für jedes Material wurde eine Probe, die zu Vergleichszwecken diente, einer Behandlung unterzogen, die sich von der oben beschriebenen nur darin unterschied, daß kein β- Cyclodextrin zugesetzt wurde.
Jede Probe wurde dann bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 8000 zentrifugiert. Dabei wurde ein Bodensatz erhalten, der die zwischen dem β-Cyclodextrin und dem Cholesterin gebildeten Komplexe enthielt; darüber befand sich ein Überstand.
Der im Überstand der Zentrifugierung verbliebene Cholesteringehalt wurde nach dem Verfahren von C.S.J. SHEN et al. (Enzymatic determination of cholesterol in egg yolk - J. Assoc. 0ff. Anal. Chem., 65, No. 5, 1982, 1222-1224) bestimmt.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben, in der zu jeder Probe das Verhältnis β-CD/Material angegeben ist.
Die Ergebnisse zeigen, daß das Inkontaktbringen von 10 g Eigelbpulver mit 40 g destilliertem Wasser und 1 g β-Cyclodextrin eine Verringerung des anfänglichen Cholesteringehalts um 26 % mit einer einzigen Extraktion erlaubte.
Bei diesen Versuchen gelang es, den Cholesteringehalt im Fall des Eigelbpulvers um 74 %, im Fall des frischen Eigelbs um 57 % und im Fall der ganzen frischen Eier um 83 % zu verringern. TABLELE I

BEISPIEL 2

Behandlung eines raffinierten Sonnenblumenöls

Zu den Versuchen wurde im Handel befindliches Öl der Marke LESIEUR verwendet.

Verfahrensweise

Es wurden zwei Proben hergestellt. Für jede Probe wurden 10 g Öl mit destilliertem Wasser (10 g) und anschließend mit β-Cyclodextrin (ROQUETTE) in Form eines kristallinamorphen Pulvers versetzt, und zwar in einer Menge von 500 mg bei einer Probe (im folgenden Probe β-CD/Material = 0,05) und in einer Menge von 1 g bei der anderen Probe (im folgenden Probe β-CD/Material 0,10).
Nach Rühren auf einer Mischplatte wurden die Proben in einen auf 40 ºC geregelten Behälter gebracht und darin 5 h auf dieser Temperatur gehalten.
Die Proben wurden dann bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 8000 zentrifugiert. Dabei wurde ein Bodensatz erhalten, der die zwischen dem β-Cyclodextrin und den Sterinen gebildeten Komplexe enthielt und über dem sich ein Überstand befand. Der Überstand bestand aus einer wäßrigen Phase und einer darüber befindlichen Ölphase. Die Ölphase wurde gewonnen.
Eine zu Vergleichszwecken dienende Probe wurde einer Behandlung unterzogen, die sich von der oben genannten Behandlung nur darin unterschied, daß kein β-Cyclodextrin zugesetzt wurde.
Der Gesamtgehalt der Ölphase an Sterinen wurde nach dem Standardverfahren zur Bestimmung der Gesamtsterine in Ölen und Fetten nach dem Verfahren der Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée (M. NAUDET et al. - Revue Francaise des Corps gras, No. 4, Avril 1986, 167-170) bestimmt.

Ergebnisse

Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt; sie sind auf die Werte an β-Sitosterin bezogen, da β-Sitosterin das Hauptsterin des Sonnenblumenöls darstellt. TABELLE II
Aufgrund der Ergebnisse ist festzustellen, daß 82 % der insgesamt anfänglich im Öl enthaltenen Sterine abgetrennt werden konnten.

BEISPIEL 3

Behandlung eines mit einem Sterinester versetzten Fettes

Prinzip

Es wird ein Fett behandelt, das mit Cholesterinstearat in einer solchen Menge versetzt ist, daß die äquivalente Cholesterinmasse 9 bis 15-fach höher ist als die Cholesterinmasse, die "natürlicherweise" in diesem Fett enthalten ist.

Verfahrensweise

Es werden vier Proben hergestellt, wobei für jede Probe handelsübliches Cholesterinstearat von SIGMA in einer Menge von etwa 30 mg für zwei der Proben (Versuch 1 und Vergleichsversuch 1) und in einer Menge von etwa 50 mg für die beiden anderen Proben (Versuch 2 und Vergleichsversuch 2) in 10 g wasserfreiern Milchfett gelöst werden, das seinerseits 2 mg Cholesterin enthält und zuvor verflüssigt wurde.
Jede der beiden für die Versuche 1 und 2 hergestellten Proben wird mit 10 g destilliertem Wasser und β-Cyclodextrin (im folgenden als β-CD bezeichnet, in Form eines kristallin-amorphen Pulvers (ROQUETTE) in einer Menge von 503 mg für die eine Probe (Versuch 1) und in einer Menge von 768 mg für die andere Probe (Versuch 2) versetzt.
Nach Rühren auf einer Mischplatte werden die vier Proben in einen auf 40 ºC geregelten Behälter gebracht und darin 5 h auf dieser Temperatur gehalten.
Die Proben werden anschließend bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 8000 zentrifugiert. Es wird ein Bodensatz erhalten, der die zwischen β-Cyclodextrin und Cholesterinstearat oder Cholesterin gebildeten Komplexe enthält und oberhalb dessen sich ein Überstand befindet. Der Überstand umfaßt eine wäßrige Phase, über der sich eine Ölphase befindet.
Die Ölphase wird gewonnen und anschließend verseift. Das Cholesterin gelangt in den nicht verseifbaren Teil, in dem es nach einem enzymatischen Verfahren mit Hilfe eines von Boehringer Mannheim unter der Referenz-Nr. 139-050 kommerzialisierten Diagnostikkits quantitativ bestimmt wird. TABELLE III

BEISPIEL 4

Behandlung eines Fettes, das oxidierte Sterinderivate enthält

Verfahrensweise

Ein wasserfreies Milchfett wird mehreren Erhitzungszyklen (150 ºC - 1 h) unterzogen, zwischen denen auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen wird.
10 g des so hergestellten Fettes (im folgenden als gebrauchtes Fett bezeichnet) werden nach vorherigem Verflüssigen mit 10 g Wasser und 500 mg β-Cyclodextrin in Form eines kristallin-amorphen Pulvers (ROQUETTE) versetzt.
Nach Rühren auf einer Mischplatte werden diese Probe sowie eine in gleicher Weise behandelte zweite Probe, die jedoch nicht mit β-Cyclodextrin versetzt wurde und als Vergleichsprobe dient, in einen auf 40 ºC geregelten Behälter gebracht und darin 5 h auf dieser Temperatur gehalten.
Die beiden Proben werden dann bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 8000 zentrifugiert. Es wird ein Bodensatz erhalten, der die zwischen den oxidierten Sterinderivaten und β-Cyclodextrin gebildeten Komplexe enthält und oberhalb dessen sich ein Überstand befindet. Der Überstand umfaßt eine wäßrige Phase, über der sich eine Ölphase befindet.
Die Ölphase wird verseift.
Die nicht verseifbaren Fraktionen werden durch Dünnschichtchromatographie nach dem von J.M. LUBY (Journal of Food Science, 51, Nr. 4, 1986, 904-907) beschriebenen Verfahren analysiert.

Ergebnisse

Auf der Platte für die der Vergleichsprobe entsprechende Fraktion wird das Vorliegen von zwei Flecken festgestellt, die zwei Oxidationsprodukten des Cholesterins entsprechen. Diese beiden Flecken werden auch bei der Fraktion gefunden, die der Probe entsprechen, die aus dem behandelten Fett hergestellt wurde, jedoch ist ihre Intensität sehr verringert.

BEISPIEL 5

Behandlung eines ein Steron enthaltenden Fettes

Verfahrensweise

Es wird wasserfreies Milchfett eingesetzt, das zuvor der Einwirkung eines Bakterienstamms unterzogen wurde, der eine extrazelluläre Cholesterinoxidase biosynthetisiert, und das 240 mg Δ&sup4;-Cholesten-3-on auf 100 g enthält (im folgenden als MGLA-B10 bezeichnet).
Es werden zwei Proben (Versuche 1 und 2) hergestellt. Für jede Probe werden 10 g dieses Fettes mit 10 g Wasser und 500 mg β-Cyclodextrin in Form eines kristallin-amorphen Pulvers (ROQUETTE) versetzt.
Nach Rühren auf einer Mischplatte werden die beiden Proben sowie zwei weitere Proben, die in gleicher Weise, jedoch ohne Zusatz von β-Cyclodextrin, hergestellt worden waren, bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 8000 zentrifugiert. Es wird ein Bodensatz erhalten, der die mit β-Cyclodextrin gebildeten Einschlußkomplexe enthält Lind über dem sich ein Überstand befindet. Der Überstand umfaßt eine wäßrige Phase sowie eine darüber befindliche Ölphase.
Die Ölphase wird gewonnen; 2 g davon werden entnommen und in ein Gemisch von Methanol und Methylenchlorid (so/so, V/V) eingebracht. Das Volumen der so hergestellten Lösung A wird mit dem gleichen Gemisch auf 100 ml aufgefüllt. Man erhält so eine Lösung B, die durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert wird.
Es werden eine Stahlsäule von 25 cm Länge und 4,6 mm Innendurchmesser, die Spherisorb-RP-18-Gel enthält (anwendungsfertige Säule vom Typ D 5 ODS 2, im Handel von Phase Sep unter der Bezeichnung 820 019) sowie eine Vorsäule von 1,5 cm Länge und 3,2 mm Innendurchmesser verwendet, die eine C18-Phase von 7 µm (anwendungsfertige Säule, vertrieben von Touzart et Matignon unter der Bezeichnung 014 380 12) verwendet.
Es wird eine Probe in einer Menge von 20 µl der Lösung B eingespritzt. Die Elution erfolgt mit einer mobilen Phase, die aus 95 Volumteilen Methanol und 5 Volumteilen Methylenchlorid besteht und 15 min bei einem Durchsatz von 1,0 ml/min zirkulieren gelassen wird. Das Δ&sup4;-Cholesten-3-on ergibt einen Hauptpeak mit einer Retentionszeit von etwa 13 min. Die Elution wird fortgeführt, um ein Waschen der stationären Phase und ihre Rückkehr zum anfänglichen Gleichgewicht zu ermöglichen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt. TABELLE IV
Es wird festgestellt, daß bei beiden Versuchen mehr als 80 % des Sterons abgetrennt werden konnten.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung von Cholesterin, das in Substanzen biologischen Ursprungs enthalten ist, die unter Fettstoffen tierischen Ursprungs und Produkten auf Eibasis ausgewählt sind, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige oder verflüssigte Substanz in wäßrigem Medium mit einem Cyclodextrin in Kontakt gebracht wird, wobei der Kontakt unter Rühren derart lange durchgeführt wird, daß sich Komplexe zwischen dem Cholesterin und dem Cyclodextrin bilden können, und die gebildeten Komplexe anschließend abgetrennt werden, unter Ausschluß seiner Anwendung zur Abtrennung von Cholesterin aus Fettstoffen tierischen Ursprungs unter einer nichtoxidierenden Atmosphäre bei einer Kontaktzeit von 30 min bis 10 h.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt bei einer Temperatur von höchstens 80 ºC durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kontakt bei 40 ºC 5 h vorgenommen wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß β-Cyclodextrin verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz biologischen Ursprungs ein Fettstoff tierischen Ursprungs ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz biologischen Ursprungs ein Produkt auf Eibasis ist.