DE60313163T2

DE60313163T2 - Immunogene zusammensetzungen

Info

Publication number: DE60313163T2
Application number: DE60313163T
Authority: DE
Inventors: T.E.V. GlaxoSmithKl CABEZON SILVA; Jonathan H. GlaxoSmithKl Stevenage ELLIS; C.M.G. GlaxoSmithKl GERARD; Paul A. GlaxoSmithKl Stevenage HAMBLIN; R.M. GlaxoSmithKl PALMANTIER; C. GlaxoSmithKl VINALS Y DE BASSOLS
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Glaxo Group Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; Glaxo Group Ltd
Priority date: 2002-06-11
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2023-06-07
Also published as: ATE359295T1; EP1511768A1; AR040178A1; UY27840A1; CA2487831A1; ES2285174T3; US20060147477A1; DK1511768T3; KR20050010040A; PT1511768E; PL374534A1; AU2003246411A1; RU2004135541A; NO20045148L; EP1511768B1; PE20040554A1; BR0311732A; NZ537125A; TW200400970A; MXPA04012443A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionspartner, die als immunologische Fusionspartner als Expressionsverstärker wirken, und bevorzugt Fusionspartner mit beiden Funktionen. Die Erfindung betrifft auch Fusionsproteine, die sie enthalten, ihre Herstellung, ihre Verwendung in Impfstoffen und ihre Verwendung in Medikamenten. Insbesondere werden Fusionspartner bereitgestellt, die eine sogenannte Cholin-Bindungsdomäne 45enthalten, zum Beispiel Fusionen, die LytA aus Streptococcus pneumoniae oder das Pneumokokken-Phage-CP1-Lysozym (CPL1) umfassen, worin die Cholin-Bindungsdomäne modifiziert ist, um ein heterologes T-Helferepitop einzuschließen. Es wird gezeigt, daß solche Fusionspartner die Expressionsstärke des daran gebundenen heterologen Proteins verbessern und auch einen besonderen Nutzen finden, wenn sie an schwach immunogene Proteine oder Peptide fusioniert sind, die ansonsten nützlich als Impfstoffantigene sind. Insbesonders sind solche Fusionspartner nützlich in Konstrukten, die Selbstantigene umfassen, zum Beispiel tumorspezifische oder gewebespezifische Antigene.
Hintergrund der Erfindung
Streptococcus pneumoniae synthetisiert eine N-Acetyl-L-alanin-Amidase, LytA, ein Autolysin, das spezifisch das Peptidoglycangerüst der Zellwand abbaut, was schließlich zur Zelllyse führt. Seine Polypeptidkette hat zwei Domänen. Die N-terminale Domäne ist verantwortlich für die katalytische Aktivität, wohingegen die C-terminale Domäne von LytA verantwortlich für die Affinität zu Cholin und zur Verankerung in der Zellwand ist. Diese C-terminale Domäne ist dafür bekannt, an Cholin und Cholin-Analoga zu binden, und wird auch an tertiäre Amine wie DEAE (Diethylaminoethyl) binden, die herkömmlich in der Chromatographie verwendet werden.
LytA ist ein Protein mit 318 Aminosäuren, und der C-terminale Teil umfaßt ein Tandem aus sechs unvollständigen Repeats mit 20 oder 21 Aminosäuren und einem kurzen terminalen COOH-Schwanz. Die Repeats befinden sich in den folgenden Positionen:

R1: 177-191
R2: 192-212
R3: 213-234
R4: 235-254
R5: 255-275
R6: 276-298

Von diesen Repeats wird vorhergesagt, daß sie in einer beta-Turn-Konformation sind. Der C-Terminus ist verantwortlich für das Binden von Cholin. In gleicher Weise ist der C-Terminus von CPL1 verantwortlich für die Bindungsaffinität, und die aromatischen Reste im Repeat tragen zu einer solchen Bindung bei. Diese Proteine wurden als Affinitätsmarker für eine schnelle Reinigung verwendet (Sanchez Puelles, Eur. J. Biochem. 1992, 203, 153-9).
Andere Proteine mit einer Cholin-Bindungsdomäne wurden ebenfalls in Streptococcus pneumoniae untersucht.
Eines davon, PspA (oder Pneumokokkenoberflächenprotein A), ist ein Virulenzfaktor (J. Yother und Briles (1992), J. Bacteriol. 174(2), S. 601). Dieses Protein ist antigen und immunogen. Es hat eine C-terminale Domäne, die aus 10 Repeats mit 20 Aminosäuren besteht, homolog mit den Repeats von LytA.
CbpA (oder Cholin-Bindungsprotein A) ist an der Anhaftung des Pneumococcus an menschlichen Zellen beteiligt (Rosenow et al. (1997), Mol. Microbiol. 25(5), S. 819). Es zeigt 10 Repeats mit 20 Aminosäuren in der C-terminalen Domäne, die fast identisch mit denjenigen von PspA sind.
LytB und LytC haben eine unterschiedliche modulare Organisation gegenüber den oben genannten Proteinen, da sich ihre Cholin-Bindungsdomäne, die aus 15 bzw. 11 Repeats aufgebaut ist, am N-terminalen Ende befindet, nicht am C-terminalen Ende (P. Garcia, Mol. Microbiol. (1999), 31 (4), S. 1275 und P. Garcia et al. (1999), Mol. Microbiol: 33(1), S. 128). Ein Sequenzverghleich zeigt, daß LytB Glucosamidaseaktivität besitzt. LytC zeigt eine Aktivität vom Lysozymtyp in vitro. Zusätzlich wurden drei als PepA, PepB und PepC bezeichnete Gene 1995 kloniert. Obwohl ihre Funktion unbekannt ist, besitzen diese Gene ebenfalls eine variable Anzahl von Repeats, die homolog zu denjenigen von LytA sind.
In ihrem Infektionszyklus synthetisieren Phagen Mureinhydrolasen, die ihre Passage in das Bakterium erleichtern. Diese Hydrolasen besitzen eine Cholin-Bindungsdomäne. Die Muramidase CPL1 des Phagen Cp-1 wurde gut untersucht. Sie zeigt 6 Repeats mit 20 Aminosäuren am C-Terminus, die an der spezifischen Erkennung von Cholin beteiligt sind (J.L. Garcia, J. Virol. 61 (8), S. 2573-80; (1987) und E. Garcia, Proc. Natl. Acad. Sci. (1988), S. 914). Ein Vergleich der LytA- und CPL1-Repeats ermöglicht es, eine anfängliche Übereinstimmung dieser Repeats vorzunehmen.
Die Mureinhydrolasen der Phagen Dp-1 (P. Garcia et al. (1983), J. Gen. Microbiol. 129 (2), S. 489), Cp1-9 (P. Garcia et al. (1989), Biochem. Biophys. Res. Commun. 158(1), S. 251), HB-3 (Romero et al. 1990, J. Bacteriol. 172 (9), S. 5064-5070) und EJ-1 (Diaz (1992), J. Bacteriol. 174 (17), S. 5516) zeigen ebenfalls die Eigenschaften von Cholin-Bindungsdomänen.
Diese Eigenschaft wird auch vom Lysozym geteilt, das durch CP-1 codiert wird, einen Pneumokokken-Phagen. WO 99/10375 beschreibt unter anderem humane Papillomavirus-Proteine E6 oder E7, die an einen His-Marker und den C-terminalen Teil von LytA (hier C-LytA) gebunden sind, und die Reinigung der Proteine durch differentielle Affinitätschromatographie. WO 99/40188 beschreibt unter anderem Fusionsproteine, die MAGE-Antigene mit einem His-Schwanz und einem C-LytA-Teil am N-Terminus des Moleküls umfassen.
Es wurde jetzt überraschend festgestellt, daß erfindungsgemäße Fusionspartner bei Fusion an ein heterologes Protein in der Lage waren, die Immunogenität der daran gebundenen heterologen Proteine zu steigern. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß die Expressionstärke der daran gebundenen heterologen Proteine gesteigert werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt entsprechend in einer bevorzugten Ausführungsform einen verbesserten immunologischen Fusionspartner bereit, der auch als Expressionsverstärker wirken kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend umfaßt die vorliegende Erfindung ein Fusionspartnermolekül, das eine Cholin-Bindungsdomäne oder ein Fragment davon oder ein Analogon davon und ein heterologes promiskes T-Helferepitop, bevorzugt ein promiskes MCH-Klasse II T-Epitop, umfaßt. Der Fusionspartner zeigt die Fähigkeit, als immunologischer Fusionspartner oder als Expressionsverstärker und bevorzugt sowohl als immunologischer Partner als auch als Expressionsverstärker zu wirken. Ein promiskes T-Helferepitop ist ein Epitop, das an mehr als ein MCH-Klasse II-Allel bindet, bevorzugt an mehr als 3 MHC-Klasse II-Allele. Insbesondere können solche Epitope eine T- Helfer-Zellreaktion in großen Anzahlen von Individuen hervorrufen, die diverse MHC-Haplotypen exprimieren. Gegebenfalls kann das Fusionsprotein seine Fähigkeit zur Bindung an Cholin bewahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Cholin-Bindungseinheit aus dem C-Terminus von LytA. Bevorzugt umfassen das C-LytA oder die Derivate wenigstens vier Repeats aus einem beliebigen der Repeats R1 bis R6, die in 1 dargestellt sind (SEQ ID NO:1 bis 6). In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich C-LytA über die Aminosäuren 177-298, was einen Teil des ersten Repeats und die vollständigen fünf anderen enthält.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Fusionspartner wie hier definiert bereitgestellt, der ferner ein heterologes Protein umfaßt. Das heterologe Protein kann an den Fusionspartner entweder chemisch konjugiert oder fusioniert sein. Bevorzugt ist das heterologe Protein ein Tumorassoziiertes Antigen oder ein immunogenes Fragment davon.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, die die wie hier definierten Proteine codiert. Es wird ebenfalls ein Expressionsvektor bereitgestellt, der die Nukleinsäure umfaßt, und ein mit der Nukleinsäure und dem Vektor transformierter Wirt.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Protein oder eine Nukleinsäuresequenz wie hier beschrieben und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, Verdünnungsstoff oder Träger umfaßt. Bevorzugt umfaßt die immunogene Zusammensetzung ferner einen Th-1-induzierenden Hilfsstoff.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die immunogene Zusammensetzung oder das Protein oder die Nukleinsäuren zur Verwendung in der Medizin bereit. Insbesondere wird ein Protein oder eine Nukleinsäure der Erfindung in der Herstellung eines Medikaments zum Hervorrufen einer Immunreaktion in einem Patienten oder zur Verwendung in der Behandlung oder Prophylaxe von infektiösen Krankheiten oder Krebskrankheiten bereitgestellt.
Die Erfindung sieht ferner Verfahren zur Behandlung eines Patienten vor, der an einer infektiösen Krankheit oder einer Krebserkrankung leidet, insbesondere Karzinom der Brust, der Lunge (insbesondere nichtkleinzelliges Lungenkarzinom), kolorektal, Eierstock, Prostata, Magen und anderweitig GI (gastrointestinal), durch Verabreichung einer sicheren und wirksamen Menge einer Zusammensetzung oder Nukleinsäure wie hier beschrieben.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung wie hier beschrieben bereit, durch Vermischen einer Nukleinsäure oder eines Proteins der Erfindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, Verdünnungsstoff oder Träger.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hier beschrieben hat in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die modifizierte Cholin-Bindungsdomäne (Fusionspartner) eine Fähigkeit, als Expressionsverstärker zu wirken, wobei das resultierende Fusionsprotein in einer höheren Ausbeute in einer Wirtszelle im Vergleich mit dem unfusionierten Protein exprimiert werden wird, bevorzugt mit einer Ausbeute, die mehr als ca. 100% (2-fach höher) oder 150% oder mehr ist, gemäß Messung durch SDS-PAGE, gefolgt von Coomassie-Blue-Anfärbung oder Silber-Anfärbung, gegebenenfalls gefolgt von Gelabtastung. Die modifizierte erfindungsgemäße Cholin-Bindungsdomäne besitzt ebenfalls die Fähigkeit, als immunologischer Partner zu wirken, wobei das resultierende Fusionsprotein mit einem heterologen Protein stärker immunogen in einem Wirt im Vergleich mit dem unfusionierten heterologen Protein sein wird.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die modifizierte Cholin-Bindungsdomäne die Fähigkeit, als immunologischer Fusionspartner zu wirken, was den Erhalt einer gesteigerten Immunreaktion mit dem Fusionsprotein im Vergleich mit dem heterologen Protein allein erlaubt.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die modifizierte Cholin-Bindungsdomäne eine duale Funktion mit der Fähigkeit, sowohl als immunologischer Fusionspartner als auch als Expressionsverstärker zu wirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammt die Cholin-Bindungsdomäne aus dem C-Terminus von LytA. Bevorzugt umfassen das C-LytA oder Derivate wenigstens zwei Repeats, bevorzugt wenigstens vier Repeats. In diesem Zusammenhang bezeichnen C-LytA-Derivate eine Variante von C-LytA gemäß der vorliegenden Erfindung, das heißt Varianten, die sowohl die Fähigkeit, als immunologischer Partner als auch als Expressionsverstärker zu wirken, bewahrt haben. Bevorzugte Varianten schließen zum Beispiel Peptide ein, die eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Identität, bevorzugt wenigstens 90% Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95% Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99% Identität mit jedem der in 1 dargestellten Repeats R1 bis R6 (SEQ ID NO:1 bis 6) umfassen, oder ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der in 1 dargestellten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:1 bis 8) umfaßt.
Entsprechend wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Fusionspartnerprotein bereitgestellt, das eine modifizierte Cholin-Bindungsdomäne und ein heterologes promiskes T-Helferepitop umfaßt, worin die Cholin-Bindungsdomäne aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgendes umfaßt:

a) die C-terminale Domäne von LytA wie in SEQ ID NO:7 dargestellt;
b) die Sequenz von SEQ ID NO:8;
c) eine Peptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Identität, bevorzugt wenigstens 90% Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95% Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99% Identität mit einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis 6 umfaßt;
d) eine Peptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7 oder SEQ ID NO:8 umfaßt.

In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich C-LytA über die Aminosäuren 177-298, was einen Teil des ersten Repeats und die kompletten fünf anderen wie in 1 dargestellt umfaßt.
Die zweite Komponente des Fusionspartners, das heterologe T-Zellepitop, ist bevorzugt aus der Gruppe von Epitopen ausgewählt, die an eine Anzahl von Individuen binden werden, die mehr als ein MHC II-Molekül in Menschen exprimieren. Zum Beispiel sind Epitope, die spezifisch erwogen werden, P2- und P30-Epitope aus Tetanustoxoid, Panina-Bordignon, Eur. J. Immunol. 19 (12), 2237 (1989). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das heterologe T-Zell-Epitop P2 oder P30 aus Tetanustoxin.
Das P2-Epitop hat die Sequenz QYIKANSKFIGITE und entspricht den Aminosäuren 830-843 des Tetanustoxins. Das P30-Epitop (Reste 947-967 von Tetanustoxin) hat die Sequenz FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE. Die FNNFTV-Sequenz kann gegebenenfalls deletiert sein. Andere universelle T-Epitope können aus dem Circumsporozoit-Protein aus Plasmodium falciparum stammen – insbesondere die Region 378-398 mit der Sequenz DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS (J. Alexander (1994), Immunity 1(9), S. 751-761). Ein anderes Epitop stammt aus dem Masernvirus-Fusionsprotein mit den Resten 288-302 mit der Sequenz LSEIKGVIVHRLEGV (C.D. Partidos, 1990, J. Gen. Virol. 71(9), 2099-2105). Noch ein anderes Epitop stammt aus dem Hepatitis B-Virus-Oberflächenantigen, insbesondere die Aminosäuren mit der Sequenz FFLLTRILTIPQSLD. Ein anderer Satz von Epitopen stammt aus Diphterietoxin. Vier dieser Peptide (Aminosäuren 271-290, 321-340, 331-350, 351-370) kartieren innerhalb der T-Domäne von Fragment B des Toxins, und die verbleibenden 2 kartieren in der R-Domäne (411-430, 431-450):

PVFAGANYAAWAVNVAQVI
VHHNTEEIVAQSIALSSLMV
QSIALSSLMVAQAIPLVGEL
VDIGFAAYNFVESIINLFQV
QGESGHDIKITAENTPLPIA
GVLLPTIPGKLDVNKSKTHI
(R. Raju, D. Navaneetham, D. Okita, B. Diethelm-Okita, D. McCormick, B.M. Conti-Fine (1995), Eur. J. Immunol. 25: 3207-14).

Das heterologe T-Epitop ist bevorzugt an C-LytA fusioniert, das wenigstens 4 Repeats enthält, bevorzugt die Repeats 2-5 einschließlich. Ein oder mehrere nachfolgende Repeats können gegebenenfalls an den C-Terminus des T-Epitops fusioniert sein. Alternativ ist das heterologe T-Epitop vorzugsweise zwischen zwei konsekutiven Repeats von C-LytA inseriert, das insgesamt wenigstens 4 Repeats enthält, oder inseriert in eines der Repeats von C-LytA, das insgesamt wenigstens 4 Repeats enthält. Besonders bevorzugt enthält das C-LytA 6 Repeats und das heterologe Epitop ist innerhalb und zu Beginn des sechsten Repeats von C-LytA inseriert.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner in anderen Aspekten Fusionsproteine bereit, die wenigstens ein Polypeptid wie oben beschrieben umfassen, sowie Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren, typischerweise in der Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen, zum Beispiel Impfstoffzusammensetzungen, die einen physiologisch akzeptablen Träger und/oder ein Immunstimulans umfassen. So kann ein Selbstprotein oder anderes schwach immunogenes Protein an entweder das N- oder C-terminale Ende des resultierenden Fusionspartners fusioniert sein. Alternativ kann das Selbstprotein oder schwach immunogene Protein in den Fusionspartner inseriert sein. In einer optionalen Ausführungsform können ein Histidin-Marker oder wenigsten vier, bevorzugt mehr als 6 Histidinreste an das alternative Ende des schwach immunogenen Proteins fusioniert sein. Dies würde es dem Protein erlauben, durch Affinitätschromatographieschritte gereinigt zu werden, da ein Histidinschwanz, der typischerweise wenigstens vier, bevorzugt sechs oder mehr Reste umfaßt, an Metallionen bindet und deshalb für die Metall-immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) geeignet ist. Typische Konstrukte würden deshalb umfassen:

– schwach immunogenes Protein – C-LytA-Repeats_1-4 – P₂-Epitop (inseriert in oder ersetzend C-LytA-Repeat₅) – C-LytA-Repeat₆.
– C-LytA-Repeats_1-4 – P₂-Epitop (inseriert in oder ersetzend C-LytA-Repeat₅) – C-LytA-Repeat₆ – schwach immunogenes Protein.
– schwach immunogenes Protein – C-LytA-Repeats_2-5 – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₆);
– C-LytA_2-5 – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₆) – schwach immunogenes Protein;
– schwach immunogenes Protein – C-LytA-Repeats_1-5 – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₆);
– C-LytA-Repeats_1-5 – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₆) – schwach immunogenes Protein;
– schwach immunogenes Protein – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₁) – C-LytA-Repeats_2-5;
– P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₁) – C-LytA-Repeats_2-5 – schwach immunogenes Protein;
– schwach immunogenes Protein – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₁) – C-LytA-Repeats_2-6;
– P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₁) – C-LytA-Repeats_2-6 – schwach immunogenes Protein;
– schwach immunogenes Protein – C-LytA-Repeat₁ – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₂) – C-LytA-Repeats_3-6;
– C-LytA-Repeat₁ – P₂-Epitop (inseriert in C-LytA-Repeat₂) – C-LytA-Repeats_3-6 – schwach immunogenes Protein; worin "inseriert in" jeden Ort im Repeat bedeutet, zum Beispiel zwischen Rest 1 und 2 oder zwischen 2 und 3 etc.

Das promiske T-Helferepitop kann in eine Repeatregion inseriert sein, zum C-LytA-Repeats_2-5 – C-LytA-Repeat 6a – P₂-Epitop – C-LytA-Repeat 6b, worin das P2-Epitop im sechsten Repeat inseriert ist (siehe 2).
In anderen bevorzugten Ausführungsformen kann das C-terminale Ende von CPL1 (C-CPL1) als Alternative zu C-LytA verwendet werden.
Alternativ kann das P2-Epitop in den obigen Konstrukten durch andere promiske T-Epitope ersetzt werden, zum Beispiel P30. In einer Ausführungsform der Erfindung sind zwei oder mehr promiske Epitope Teil des Fusionskonstrukts. Es ist jedoch bevorzugt, die Fusionspartner so klein wie möglich zu halten, wodurch die Anzahl von potentiell wechselwirkenden CD8+- und B-Epitopen beschränkt wird. Daher ist der Fusionspartner bevorzugt nicht größer als 100-140 Aminosäuren, bevorzugt nicht größer als 120 Aminosäuren, typischerweise etwa 100 Aminosäuren.
Das Antigen, an das der Fusionspartner fusioniert ist, kann aus bakteriellen, viralen, Protozoen-, pilzlichen oder Säuger-, einschließlich humanen, Quellen sein.
Die Fusionspartner der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt an ein Selbstantigen wie an ein Tumor-assoziiertes oder gewebespezifisches Antigen wie diejenigen für Prostata-, Brust-, kolorektalen, Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Eierstock-, Nieren- oder Melanomkrebs fusioniert. Fragmente der Selbst- oder Tumorantigene werden ausdrücklich als an den Fusionspartner der Erfindung fusioniert erwogen. Typischerweie wird das Fragment wenigstens 20, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 100 zusammenhängende Aminosäuren der Sequenz voller Länge enthalten. Typischerweise werden solche Fragmente frei von einer oder mehreren Transmembrandomänen sein oder können N-terminale oder C-terminale Deletionen mit ca. 3, 5, 8, 10, 15, 20, 28, 33, 50, 54 Aminosäuren aufweisen. Solche Fragmente werden, wenn sie geeignet präsentiert werden, Immunreaktionen erzeugen können, die das Protein voller Länge erkennen. Besonders illustrative Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen eine Sequenz von wenigstens 10 zusammenhängenden Aminosäuren, bevorzugt 20, besonders bevorzugt 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 Aminosäureen eines Tumor-assoziierten oder gewebespezifischen Proteins, das an den Fusionspartner fusioniert ist.
Die Polypeptide der Erfindung sind immunogen, d.h. sie reagieren detektierbar in einem Immuntest (wie einem ELISA- oder T-Zell-Stimulationstest) mit Antiseren und/oder T-Zellen aus einem Patienten mit Criptoexprimierendem Krebs. Die Durchmusterung auf immunogene Aktivität kann unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Techniken durchgeführt werden. Zum Beispiel können solche Durchmusterungen unter Verwendung von Verfahren wie denjenigen durchgeführt werden, die beschrieben werden in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. In einem illustrativen Beispiel kann ein Polypeptid an einem festen Träger immobilisiert und mit Patientenseren in Kontakt gebracht werden, um die Bindung von Antikörpern in den Seren mit dem immobilisierten Polypeptid zu erlauben. Ungebundene Seren können dann entfernt und gebundene Antikörper unter Verwendung von zum Beispiel ¹²⁵I- markiertem Protein A detektiert werden. Wie der Fachmann erkennen würde, sind immunogene Teile von Tumor-assoziiertem oder tumorspezifischem Antigen ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Ein "immunogener Teil" wie hier verwendet ist ein Fragment, das selbst immunologisch reaktiv gegenüber den B-zellen und/oder T-Zell-Oberflächenantigen-Rezeptoren ist (d.h. spezifisch daran bindet), die das Polypeptid erkennen. Immunogene Teile können allgemein unter Verwendung wohlbekannter Techniken identifiziert werden, wie zum Beispiel mit denjenigen, die zusammengefaßt werden in Paul, Fundamental Immunology, 3. Auflage, 243-247 (Rauen Press, 1993) und darin zitierten Verweisen. Solche Techniken schließen die Durchmusterung von Polypeptiden auf die Fähigkeit zur Reaktion mit antigenspezifischen Antikörpern, Antiseren und/oder T-Zellinien oder -klonen ein. Wie hier verwendet sind Antiseren und Antikörper "antigenspezifisch", falls sie spezifisch an ein Antigen binden (d.h. mit dem Protein in einem ELISA oder anderen Immuntest reagieren und nicht detektierbar mit unverwandten Proteinen reagieren). Solche Antiseren und Antikörper können wie hier beschrieben und unter Verwendung wohlbekannter Techniken hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein immunogener Teil eines Polypeptids ein Teil, der mit Antiseren und/oder T-Zellen in einer Stärke reagiert, die nicht substantiell weniger als die Reaktivität eines Polypeptids voller Länge ist (z.B. in einem ELISA und/oder T-Zell-Reaktivitätstest). Bevorzugt ist die Stärke der immunogenen Aktivität des immunogenen Teils wenigstens ca. 50%, bevorzugt wenigstens ca. 70% und am meisten bevorzugt größer als ca. 90% der Immunogenität des Polypeptids voller Länge. In manchen Fällen werden bevorzugte immunogene Teile identifiziert werden, die eine Stärke der immunogenen Aktivität von mehr als derjenigen des entsprechenden Polypeptids voller Länge haben, zum Beispiel mit mehr als ca. 100% oder 150% oder mehr immunogener Aktivität.
In bestimmten anderen Ausführungsformen können illustrative immunogene Teile Peptide einschließen, in denen eine N-terminale Leitsequenz und/oder Transmembrandomäne deletiert wurden. Andere illustrative immunogene Teile werden eine kleine N- und/oder C-terminale Deletion enthalten (z.B. ca. 1-50 Aminosäuren, bevorzugt ca. 1-30 Aminosäuren, besonders bevorzugt ca. 5-15 Aminosäure), relativ zum reifen Protein.
Exemplarische Antigene oder daraus stammende Fragmente schließen MAGE 1, MAGE 3 und MAGE 4 oder andere MAGE-Antigene wie die in WO 99/40188 offenbarten, PRAME ( WO 96/10577 ), BAGE, RAGE, LAGE 1 ( WO 98/32855 ), LAGE 2 (auch bekannt als NY-ESO-1, WO 98/14464 ), XAGE (Liu et al., Cancer Res., 2000, 60:4752-4755; WO 02/18584 ), SAGE und HAGE ( WO 99/53061 ) oder GAGE (Robbins und Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, S. 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (eingereicht 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, S. 293) ein. Tatsächlich werden diese Antigene in einer großen Reihe von Tumortypen wie Melanom, Lugenkarzinom, Sarkom und Blasenkarzinom exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Prostataantigene verwendet, wie Prostata-spezifisches Antigen (PSA), PAP, PSCA, (PNAS 95(4) 1735-1740, 1998), PSMA oder das als Prostase bekannte Antigen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Prostataantigen P501S oder ein Fragment davon. P501S, auch als Prostein bezeichnet (Xu et al., Cancer Res. 61, 2001, 1563-1568), ist als SEQ ID NO:113 aus WO 98/37814 bekannt und ist ein Protein mit 553 Aminosäuren. Immunogene Fragmente und Teile davon, die wenigstens 20, bevorzugt 50, besonders bevorzugt 100 zusammenhängende Aminosäuren umfassen, wie sie in der oben bezeichneten Patentanmeldung offenbart werden, werden spezifisch von der vorliegenden Erfindung erwogen. Bevorzugte Fragmente werden in WO 98/50567 (PS108-Antigen) und als Prostatakrebs-assoziiertes Protein (SEQ ID NO:9 aus WO 99/67384 ) offenbart. Andere bevorzugte Fragmente sind die Aminosäuren 51-553, 34-553 oder 55-553 des P501S-Proteins voller Länge. Insbesondere werden die Konstrukte 1, 2 und 3 (siehe 2, SEQ ID NOs:27-32) ausdrücklich erwogen und können in Hefesystemen exprimiert werden, zum Beispiel können DNA-Sequenzen, die solche Polypeptide codieren, in einem Hefesystem exprimiert werden.
Prostase ist eine Prostata-spezifische Serinprotease (trypsinartig), 254 Aminosäuren lang, mit einer konservierten Serinprotease-katalytischen Triade H-D-S und einer Amino-terminalen Prä-Propeptidsequenz, was eine potentielle sekretorische Funktion anzeigt (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Linas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serin protease with prostate restricted expression", Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Ein mutmaßlicher Glycosylierungsort wurde beschrieben. Die vorhergesagte Struktur ist sehr ähnlich anderen bekannten Serinproteasen, was zeigt, daß das reife Polypeptid zu einer einzelnen Domäne faltet. Das reife Protein ist 224 Aminosäuren lang, wobei gezeigt wurde, daß ein A2-Epitop natürlich gereift wird. Die Prostase-Nukleotidsequenz und abgeleitete Polypeptidsequenzen und Homologe werden offenbart in Ferguson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) und in WO 98/12302 (und auch im entsprechenden erteilen Patent US 5,955,306 ), WO 98/20117 (und auch in den entsprechenden erteilten Patenten US 5,840,871 und US 5,786,148 ) (Prostata-spezifisches Kallikrein) und WO 00/04149 (P703P).
Andere Prostata-spezifische Antigene sind bekannt aus WO 98/37418 und WO/004149 . Ein weiteres ist STEAP (PNAS 96, 14523, 14528 7-12, 1999).
Andere, im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung nützliche Tumorassoziierte Antigene schließen ein: Plu-1 (J. Biol. Chem. 274 (22), 15633-15645, 1999), HASH-1, HASH-2 (M. Alders et al., Hum. Mol. Genet. 1997, 6, 859-867), Cripto (Salomon et al. Bioessays 199, 21, 61-70, US-PS 5,654,140 ), CASB616 ( WO 00/53216 ), Criptin ( US 5,981,215 ). Zusätzlich umfassen Antigene, die besonders relevant für Impfstoffe in der Therapie von Krebs sind, auch Tyrosinase, Telomerase, P53, NY-Br1.1 ( WO 01/47959 ) und Fragmente davon, wie sie in WO 00/43420 offenbart werden, B726 ( WO 00/60076 , SEQ ID NOs:469 und 463; WO 01/79286 , SEQ ID NOs: 474 und 475); P510 ( WO 01/34802 , SEQ ID NO:537 und 538) und Survivin.
Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich in Kombination mit Brustkrebs-Antigenen wie Her-2/neu, Mammaglobin ( US-PS 5,668,267 ), B305D ( WO 00/61753 , SEQ ID NOs: 299, 304, 305 und 315) oder denjenigen, die offenbart werden in WO 00/52165 , WO 99/33869 , WO 99/19479 , WO 98/45328 . Her-2/neu-Antigene werden unter anderem in US-PS 5,801,005 offenbart. Bevorzugt umfaßt das Her-2/neu die gesamte extrazelluläre Domäne (umfassend ungefähr die Aminosäuren 1-645) oder Fragmente davon und wenigstens einen immunogenen Teil oder die gesamte intrazelluläre Domäne von etwa den C-terminalen 580 Aminosäuren. Insbesondere sollte der intrazelluläre Teil die Phosphorylierungsdomäne oder Fragmente davon umfassen. Solche Konstrukte werden in WO 00/44899 offenbart. Ein besonders bevorzugtes Konstrukt ist als ECD-PhD bekannt, ein zweites ist als ECD deltaPhD bekannt (siehe WO 00/44899 ). Das Her-2/neu wie hier verwendet kann aus Ratte, Maus oder Mensch stammen.
Bestimmte Tumorantigene sind kleine Peptidantigene (d.h. weniger als ca. 50 Aminosäuren). Diese Antigene können chemisch mit dem modifizierten Cholin-Bindungsprotein der vorliegenden Erfindung konjugiert werden.
Exemplarische Peptide schließen von Mucin abgeleitete Peptide ein, wie zum Beispiel MUC-1 (siehe zum Beispiel US 5,744,144 ; US 5,827,666 ; WO 88/05054 , US 4,963,484 ). Spezifisch erwogen werden aus MUC-1 abgeleitete Peptide, die wenigstens eine Repeat-Einheit des MUC-1-Peptids umfassen, bevorzugt wenigstens zwei solcher Repeats, und die durch den SM3-Antikörper erkannt werden ( US 6,054,438 ). Andere, aus Mucin abgeleitete Peptide schließen das Peptid aus MUC-5 ein.
Alternativ ist das Antigen ein Interleukin wie IL13 und IL14, die bevorzugt sind, oder das Antigen kann ein Selbstpeptidhormon sein, wie zum Beispiel Gonadotrophinhormon-freisetzendes Hormon voller Länge (GnRH, WO 95/20600 ), ein kurzes, 10 Aminosäuren langes Peptid, das nützlich in der Behandlung von vielen Krebsarten oder in der Immunkastration ist.
Andere tumorspezifische Antigene, die zur Kopplung mit dem modifizierten Cholin-Bindungsprotein der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ohne Beschränkung tumorspezifische Ganglioside wie GM2 und GM3 ein.
Die kovalente Kopplung des Peptids an modifiziertes Cholin-Bindungsprotein kann in einer allgemein fachbekannten Weise durchgeführt werden. So ist es zum Beispiel zur direkten kovalenten Kopplung möglich, ein Carbodiimid, Glutaraldehyd oder (N-[γ-Maleimidobutyryloxy]succinimidester zu verwenden, wobei übliche handelsübliche heterobifunktionelle Linker wie CDAP und SPDP verwendet werden (unter Verwendung der Herstelleranweisungen). Nach der Kopplungsreaktion kann das Immunogen leicht mittels eines Dialyseverfahrens, eines Gelfiltrationsverfahrens, eines Fraktionierungsverfahrens etc. isoliert und gereinigt werden.
Das Antigen kann auch aus Quellen abgeleitet werden, die pathogen für Menschen sind, wie zum Beispiel: humanes Immunschwächevirus HIV-1 (wie tat, nef, reverse Transkriptase, gag, gp120 und gp160), humane Herpes simplex-Viren wie gD oder Derivate davon oder unmittelbares frühes Protein wie ICP27 aus HSV1 oder HSV2, Cytomegalovirus (speziell human) (wie gB oder Derivate davon), Rotavirus (einschließlich lebend-abgeschwächter Viren), Epstein-Barr-Virus (wie gp350 oder Derivate davon), Varizella-Zoster-Virus (wie gpI, II und IE63), oder aus einem Hepatitisvirus wie Hepatitis B-Virus (zum Beispiel Hepatitis B-Oberflächenantigen oder ein Derivat davon), Hepatitis A-Virus, Hepatitis C-Virus und Hepatitis E-Virus, oder aus anderen viralen Pathogenen wie Paramyxoviren: respiratorisches Synzytialvirus (wie F- und G-Proteine oder Derivate davon), Parainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus, humane Papillomaviren (zum Beispiel HPV6, 11, 16, 18, ...), Flaviviren (z.B. Gelbfiebervirus, Denguevirus, zeckenbürtiges Enzephalitisvirus, Japanisches Enzephalitisvirus) oder Grippevirus (ganzes lebendes oder inaktiviertes Virus, Spaltgrippevirus, kultiviert in Eiern oder MDCK-Zellen, oder ganze Grippevirosomen (wie beschrieben von R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) oder gereinigte oder rekombinante Proteine davon wie HA-, NP-, NA- oder M-Proteine oder Kombinationen daraus), oder abgeleitet aus bakteriellen Pathogenen wie Neisseria spp., einschließlich N. gonorrhea und N. meningitidis (zum Beispiel Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, Transferrin-bindende Proteine, Lactoferrin-bindende Proteine, Pilc, Adhäsine); S. pyogenes (zum Beispiel M-Proteine oder Fragmente davon, C5A-Protease, Lipoteichonsäuren), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp., einschließlich M. catarrhalis, auch bekannt als Branhamella catarrhalis (zum Beispiel Adhäsine und Invasine mit hohem und niedrigem Molekulargewicht); Bordetella spp., einschließlich B. Pertussis (zum Beispiel Pertactin, Pertussistoxin oder Derivate davon, filamentöses Hämagglutinin, Adenylatcyclase, Fimbrien), B. parapertussis und B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., einschließlich M. tuberculosis (zum Beispiel ESAT6, Antigen 85A, -B oder -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp., einschließlich L. pneumophila; Escherichia spp., einschließlich enterotoxischem E. coli (zum Beispiel Kolonisierungsfaktoren, hitzelabiles Toxin oder Derivate davon, hitzestabiles Toxin oder Derivate davon), enterohämorrhagisches E. coli, enteropathogenes E. coli (zum Beispiel Shigatoxin-artiges Toxin oder Derivate davon); Vibrio spp., einschließlich V. cholera (zum Beispiel Choleratoxin oder Derivate davon); Shigella spp., einschließlich S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp., einschließlich Y. enterocolitica (zum Beispiel ein Yop-Protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp., einschließlich C. jejuni (zum Beispiel Toxine, Adhäsine und Invasine) und C. coli; Salmonella spp., einschließlich S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., einschließlich L. monocytogenes; Helicobacter spp., einschließlich H. pylori (zum Beispiel Uresse, Catalase, vakuolisierendes Toxin); Pseudomonas spp., einschließlich P. aeruginosa; Staphylococcus spp., einschließlich S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., einschließlich E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., einschließlich C. tetani (zum Beispiel Tetanustoxin und Derivate davon), C. botulinum (zum Beispiel Botulinumtoxin und Derivate davon), C. difficile (zum Beispiel Clostridiumtoxine A oder B und Derivate davon); Bacillus spp., einschließlich B. anthracis (zum Beispiel Botulinumtoxin und Derivate davon); Corynebacterium spp., einschließlich C. diphtheriae (zum Beispiel Diphtherietoxin und Derivate davon); Borrelia spp., einschließlich B. burgdorferi (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (zum Beispiel OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., einschließlich E. equi und der Verursacher der humanen granulozyti schen Ehrlichiose; Rickettsia spp., einschließlich R. rickettsii; Chlamydia spp., einschließlich C. trachomatis (zum Beispiel MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. pneumoniae (zum Beispiel MOMP, Heparin-bindende Proteine), C. psittaci; Leptospira spp., einschließlich L. interrogans; Treponema spp., einschließlich T. pallidum (zum Beispiel die seltenen Außenmembranproteine), T. denticola, T. hyodysenteriae; oder abgeleitet aus Parasiten wie Plasmodium spp., einschließlich P. falciparum; Toxoplasma spp., einschließlich T. gondii (zum Beispiel SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., einschließlich E. histolytica; Babesia spp., einschließlich B. microti; Trypanosoma spp., einschließlich T. cruzi; Giardia spp., einschließlich G. lamblia; Leshmania spp., einschließlich L. major; Pneumocystis spp., einschließlich P. carinii; Trichomonas spp., einschließlich T. vaginalis; Schisostoma spp., einschließlich S. mansoni, oder abgeleitet aus Hefe wie Candida spp., einschließlich C. albicans; Cryptococcus spp., einschließlich C. neoformans.
Andere bevorzugte spezifische Antigene für M. tuberculosis sind zum Beispiel Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 und hTCCl ( WO 99/51748 ). Proteine für M. tuberculosis schließen auch Fusionsproteine und Varianten davon ein, worin wenigstens zwei, bevorzugt drei Polypeptide von M. tuberculosis zu einem größeren Protein fusioniert sind. Bevorzugte Fusionen schließen ein: Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI ( WO 99/51748 ).
Die am meisten bevorzugten Antigene für Chlamydia schließen zum Beispiel das Protein mit hohem Molekulargewicht (HWMP) ( WO 99/17741 ), ORF3 ( EP 366 412 ) und mutmaßliche Membranproteine (Pmps) ein. Andere Chlamydia-Antigene der Impfstofformulierung können aus der in WO 99/28475 beschriebenen Gruppe ausgewählt werden.
Bevorzugte bakterielle Antigene stammen aus Streptococcus spp., einschließlich S. pneumoniae (zum Beispiel Kapselpolysaccharide und Konjugate davon, PsaA, PspA, Streptolysin, Cholin-bindende Proteine) und das Proteinantigen Pneumolysin (Biochem. Biophys. Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342) und mutierte entgiftete Derivate davon ( WO 90/06951 ; WO 99/03884 ). Andere bevorzugte bakterielle Antigene stammen aus Haemophilus spp., einschließlich H. influenzae Typ B (zum Beispiel PRP und Konjugate davon), nicht-typisierbares H. influenzae, zum Beispiel OMP26, Adhäsine mit hohem Molekulargewicht, P5, P6, Protein D und Lipoprotein D, und Fimbrin und Fimbrin-abeleitete Peptide ( US 5,843,464 ) oder Varianten mit multiplen Kopien oder Fusionsproteine davon.
Derivate von Hepatitis B-Oberflächenantigen sind allgemein fachbekannt und schließen unter anderem die in EP-A-414 374 ; EP-A-0 304 578 und EP 198-474 beschriebenen PreS1, PreS2 S-Antigene ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das HBV-Antigen HBV-Polymerase (Ji Hoon Jeong et al., 1996, BBRC 223, 264-271; H.J. Lee et al., Biotechnol. Lett. 15, 821-826). In einem anderen bevorzugten Aspekt ist das Antigen innerhalb der Fusion ein HIV-1-Antigen, gp120, speziell bei Expression in CHO-Zellen. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Antigen gD2t wie oben definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Fusionen ein aus dem humanen Papillomavirus abgeleitetes Antigen (HPV 6a, 6b, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68), insbesondere diejenigen HPV-Serotypen, die als verantwortlich für Genitalwarzen betrachtet werden (HPV 6 oder HPV 11 und andere), und die für Gebärmutterhalskrebs verantwortlichen HPV-Viren (HPV16, HPV17 und andere).
Geeignete HPV-Antigene sind E1, E2, E4, E5, E6, E7, L1 und L2. Besonders bevorzugte Formen von prophylaktischen oder therapeutischen Fusionen für Genitalwarzen umfassen L1-Partikel oder Kapsomere und Fusionsproteine, die ein oder mehrere Antigene umfassen, die aus den HPV 6- und HPV 11-Proteinen E6, E7, L1 und L2 ausgewählt sind.
Die am meisten bevorzugten Formen von Fusionsprotein sind: L2E7, wie in WO 96/26277 offenbart, und Protein D(1/3)-E7, offenbart in GB 9717953.5 ( PCT/EP98/05285 ).
Ein bevorzugter HPV-Impfstoff für die Prophylaxe oder Therapie von zervikaler Infektion oder zervikalem Krebs kann HPV 16- oder 18-Antigene umfassen. Zum Beispiel L1- oder L2-Antigenmonomere oder L1- oder L2-Antigene, zusammen präsentiert als ein virusartiges Partikel (VLP), oder das Li-Protein, allein präsentiert in einem VLP oder einer Kapsomerstruktur. Solche Antigene, virusartigen Partikel und Kapsomere sind als solche bekannt. Siehe zum Beispiel WO 94/00152 , WO 94/20137 , WO 94/05792 und WO 93/02184 .
Zusätzliche frühe Proteine können allein oder als Fusionsproteine eingeschlossen werden, wie zum Beispiel E7, E2 oder bevorzugt E5; besonders bevorzugte Ausführungsformen dafür schließen ein VLP ein, das L1E7-Fusionsproteine umfaßt ( WO 96/11272 ). Besonders bevorzugte HPV 16-Antigene umfassen die frühen Proteine E6 oder E7 in Fusion mit einem Protein D-Träger unter Bildung von Protein D-E6- oder -E7-Fusionen aus HPV 16 oder Kombinationen daraus; oder Kombinationen von E6 oder E7 mit L2 (WO 96/26277).
Alternativ können die frühen Proteine E6 und E7 aus HPV 16 oder 18 in einem einzelnen Molekül präsentiert werden, bevorzugt einer Protein-D-E6/E7-Fusion. Andere Fusionen enthalten gegebenenfalls eines oder beide E6- und E7-Proteine aus HPV 18, bevorzugt in Form eines Protein D-E6- oder Protein D-E7-Fusionsproteins oder eines Protein D-E6/E7-Fusionsproteins. Fusionen können Antigene aus anderen HPV-Stämmen umfassen, bevorzugt aus den Stämmen HPV 31 oder 33.
Erfindungsgemäße Fusionen umfassen Antigene, die aus Parasiten stammen, die Malaria verursachen. Zum Beispiel schließen bevorzugte Antigene aus Plasmodia falciparum RTS,S und TRAP ein. RTS ist ein Hybridprotein, das im wesentlichen den gesamten C-terminalen Teil des Circumsporozoit-(CS)-Proteins von P. falciparum umfaßt, gebunden über vier Aminosäuren des preS2-Teils des Hepatitis B-Oberflächenantigens an das Oberflächen-(S)-Antigen des Hepatitis B-Virus. Seine vollständige Struktur wird in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/EP92/02591 offenbart, veröffentlicht als WO 93/10152 unter Beanspruchung der Priorität der GB-Patentanmeldung Nr. 9124390.7 . Bei Expression in Hefe wird RTS als Lipoproteinpartikel erzeugt, und bei Coexpression mit dem S-Antigen aus HBV erzeugt es ein als RTS,S bekanntes gemischtes Partikel. TRAP-Antigene werden in der internationalen Patentanmeldung PCT/GB89/00895 beschrieben, veröffentlicht als WO 90/01496 . Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Fusion, in der die antigene Zubereitung eine Kombination aus den RTS,S- und TRAP-Antigenen umfaßt. Andere Plasmodia-Antigene, die wahrscheinlich Kandidaten als Komponenten der Fusion sind, sind P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 und ihre Analoga in Plasmodium spp.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Polynukleotid bereit, das den erfindungsgemäßen Fusionspartner codiert. Die Erfindung betrifft ferner ein Polynukleotid, das mit der hier in 1 bereitgestellten Polynukleotidsequenz hybridisiert (SEQ ID NO:9 bis 16). In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung speziell Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit dem hier beschriebenen Polynukleotid hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen" eine Hybridisierung, die nur auftritt, falls es wenigstens 95% und bevorzugt wenigstens 97% Identität zwischen den Sequenzen gibt. Ein spezifisches Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die folgendes umfaßt: 50% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 20 μg/ml von denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA, gefolgt von Spülen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei ca. 65°C. Die Hybridisierungs- und Spülbedingungen sind allgemein bekannt und werden exemplarisch dargestellt in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), insbesondere Kapitel 11. Die Lösungshybridisierung kann auch mit den durch die Erfindung bereitgestellten Polynukleotidsequenzen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Polynukleotid bereit, daß das Polypeptid codiert, das den erfindungsgemäßen Fusionspartner umfaßt, fusioniert an ein ein tumorassoziiertes Antigen oder Fragment davon. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung Polynukleotidsequenzen vor, die ein Fusionspartnerprotein codieren, das eine Cholin-Bindungsdomäne und ein heterologes promiskes T-Helferepitop umfaßt, bevorzugt worin die Cholin-Bindungsdomäne aus dem C-Terminus von LytA stammt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die C-LytA-Einheit der Polynukleotide gemäß der Erfindung wenigstens vier Repeats einer beliebigen aus SEQ ID NO:9-14, besonders bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO:15, noch mehr bevorzugt die Sequenz SEQ ID NO:16. In anderen verwandten Ausführungsformen sieht die vorliegende Erfindung Polynukleotidvarianten mit substantieller Identität mit den hier in SEQ ID NOs:9-16 offenbarten Sequenzen vor, zum Beispiel mit denjenigen, die wenigstens 70% Sequenzidentität, bevorzugt wenigstens 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder eine höhere Sequenzidentität umfassen, verglichen mit einer Polynukleotidsequenz dieser Erfindung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren z.B. durch BLAST-Analyse unter Verwendung von Standardparametern. In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Polynukleotid wie beansprucht ferner ein heterologes Protein.
Solche Polynukleotidsequenzen können in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden. Vektoren können bereitgestellt werden, die das modifizierte Cholin-bindende Protein der Erfindung codieren und die einen geeigneten Restriktionsort enthalten, in den eine DNA inseriert werden kann, die ein schwach immunogenes Protein codiert, um ein Fusionsprotein zu erzeugen. In anderen Ausführungsformen der Erfindung können Polynukleotidsequenzen oder Fragmente davon, die Polypeptidfusionen der Erfindung codieren, in rekombinanten DNA-Molekülen zur Ausrichtung der Expression eines Polypeptids in geeigneten Wirtszellen verwendet werden. Aufgrund der inhärenten Degeneriertheit des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche oder eine funktionelle Äquivalente Aminosäuresequenz codieren, hergestellt werden, und diese Sequenzen können zur Klonierung und Expression eines gegebenen Polypeptids verwendet werden.
Wie die Fachleute verstehen werden, kann es vorteilhaft in manchen Fällen sein, Polypeptid-codierende Nukleotidsequenzen zu erzeugen, die nicht-natürlich vorkommende Codonen besitzen. Der DNA-Code besitzt 4 Buchstaben (A, T, C und G) und verwendet diese zum Buchstabieren von "Codonen", die die Aminosäuren der in den Genen eines Organismus codierten Proteine darstellen. Die lineare Sequenz von Codonen entlang des DNA-Moleküls wird zur linearen Sequenz von Aminosäuren in den durch diese Gene codierten Proteinen übersetzt. Der Code ist hochgradig degeneriert, wobei 61 Codonen für die 20 natürlichen Aminosäuren codieren und drei Codonen "Stopp"-Signale darstellen. So wird für die meisten Aminosäuren durch mehr als ein Codon codiert – tatsächlich wird für mehrere durch vier oder mehr unterschiedliche Codonen codiert.
Wenn mehr als ein Codon verfügbar ist, um für eine gegebene Aminosäure zu codieren, wurde beobachtet, daß die Codon-Verwendungsmuster von Organismen hochgradig nicht zufällig sind. Unterschiedliche Arten zeigen eine unterschiedliche Betonung in ihrer Codonauswahl, und ferner kann die Verwendung von Codonen deutlich unterschiedlich in einer einzelnen Art zwischen Genen sein, die mit hohen und niedrigen Stärken exprimiert werden. Diese Betonung unterscheidet sich in Viren-, Pflanzen-, Bakterien- und Sängerzellen, und einige Arten zeigen eine stärkere Betonung weg von einer zufälligen Codonenauswahl als andere. Zum Beispiel sind Menschen und andere Säuger weniger stark unausgewogen als bestimmte Bakterien oder Viren. Aus diesen Gründen gibt es eine signifikante Wahrscheinlichkeit, daß ein in E. coli exprimiertes Sängergen oder ein in Sängerzellen exprimiertes virales Gen eine unangemessene Verteilung von Codonen für eine effiziente Expression haben wird. Es wird angenommen, daß die Gegenwart von Clustern von Codonen in einer heterologen DNA-Sequenz, die selten im Wirt beobachtet werden, in dem die Expression erfolgt, vorhersagend für geringe heterologe Expressionsgrade in diesem Wirt ist.
Als Ergebnis können Codonen, die von einem besonderen prokaryontischen (zum Beispiel E. coli oder Hefe) oder eukaryontischen Wirt bevorzugt werden, optimiert werden, d.h. ausgewählt werden zur Erhöhung der Rate der Proteinexrpression, zur Erzeugung eines rekombinanten RNA-Transkripts mit wünschenswerten Eigenschaften, wie zum Beispiel einer Halbwertszeit, die länger als diejenige eines Iranskripts ist, das aus der natürlich vorkommenden Sequenz erzeugt wird, oder zur Optimierung der Immunreaktion in Menschen. Der Prozeß der Codonoptimierung kann jede Sequenz einschließen, erzeugt entweder manuell oder durch Computersoftware, worin einige oder alle der Codonen der nativen Sequenz modifiziert werden. Mehrere Verfahren wurden veröffentlicht (Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; WO98/34640). Ein bevorzugtes Verfahren gemäß dieser Erfindung ist das Syngene-Verfahren, eine Modifikation des Calcgene-Verfahrens (R.S. Hale und G. Thompson (Protein Expression and Purification, Bd. 12, S. 185-188 (1998)).
Entsprechend hat die DNA-Sequenz des Proteins in einer bevorzugten Ausführungsform einen RSCU-Wert ("Relative synomons codon useage" (ebenfalls bekannt als Codon Index, CI)) von wenigstens 0,65 und weniger als 85% Identität mit der entsprechenden Wildtypregion.
Dieser Prozeß der Codonoptimierung und die resultierenden Konstrukte sind vorteilhaft, da sie einige oder alle der folgenden Vorzüge haben können: 1) Verbesserung der Expression des Genprodukts durch Ersetzen von seltenen oder nicht häufig verwendeten Codonen durch häufiger verwendete Codonen, 2) Entfernung oder Einschluß von Restriktionsenzymorten zur Erleichterung der Klonierung stromabwärts und 3) Reduzierung des Potentials für eine homologe Rekombination zwischen der Insertsequenz im DNA-Vektor und genomischen Sequenzen und 4) Verbesserung der Immunreaktion in Menschen durch Hervorrufen einer zellulären und/oder Antikörper-Reaktion (bevorzugt von beiden Reaktionen) gegen das Zielantigen. Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen vorteilhaft reduziertes Rekombinationspotential, aber exprimieren mit wenigstens dem gleichen Grad wie die Wildtypsequenzen. Aufgrund der Natur des vom SynGene-Programm verwendeten Algorithmus zur Erzeugung einer Codon-optimierten Sequenz ist es möglich, eine äußerst hohe Anzahl unterschiedlicher Codon-optimierter Sequenzen zu erzeugen, die eine ähnliche Funktion durchführen werden. Kurz gesagt werden die Codonen unter Verwendung eines statistischen Verfahrens zugeordnet, um ein synthetisches Gen mit einer Codonhäufigkeit zu ergeben, die näher an derjenigen ist, die natürlich in hochexprimiertem E. coli und humanen Genen gefunden wird. Kurz gesagt werden die Codonen unter Verwendung eines statistischen Verfahrens zugeordnet, um ein synthetisches Gen mit einer Codonhäufigkeit zu ergeben, die näher an derjenigen ist, die natürlicherweise in hochexmprimierten humanen Genen wie β-Actin gefunden wird. Illustrativ, obwohl ohne Beschränkung, werden Beispiele für geeignete Codon-optimierte Sequenzen in SEQ ID NOs:19-22 und SEQ ID NOs:24-26 angegeben.
In den Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung ist das Codonverwendungsmuster von demjenigen verändert, das typisch für das Zielantigen ist, um stärker die Codonbetonung eines hochexprimierten Gens in einem Zielorganismus darzustellen, zum Beispiel humanes β-Actin. Der "Codon-Verwendungskoeffizient" ist ein Maß dafür, wie nahe das Codonmuster einer gegebenen Polynukleotidsequenz demjenigen einer Zielart ähnelt. Codonhäufigkeiten können aus Literaturquellen für die hochexprimierten Gene vieler Arten abgeleitet werden (siehe z.B. Nakamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). Die Codonhäufigkeiten für jedes der 61 Codonen (ausgedrückt als die Anzahl von Auftritten auf 1000 Codonen der ausgewählten Klasse von Genen) werden für jede der 20 natürlichen Aminosäuren normalisiert, so daß der Wert für das am häufigsten verwendete Codon für jede Aminosäure auf 1 eingestellt ist und die Häufigkeiten für die weniger üblichen Codonen skaliert sind, so daß sie zwischen Null und 1 liegen. Somit wird jedem der 61 Codonen ein Wert von 1 oder darunter für die hochexprimierten Gene der Zielart zugeordnet. Zur Berechnung eines Codonverwendungskoeffizienten für ein spezifisches Polynukleotid, relativ zu den hochexprimierten Genen der Art, wird der skalierte Wert für jedes Codon des spezifischen Polynukleotids notiert, und der geometrische Mittelwert all dieser Werte wird herangezogen (durch Dividieren der Summe der natürlichen Logarithmen dieser Werte durch die Gesamtanzahl von Codonen und Berechnung des umgekehrten Logarithmus). Der Koeffizient wird einen Wert zwischen 0 und 1 haben, und je höher der Koeffizient ist, desto mehr Codonen im Polynukleotid sind häufig verwendete Codonen. Falls eine Polynukleotidsequenz einen Codonverwendungskoeffizienten von 1 hat, sind alle Codonen "häufigste" Codonen für hochexprimierte Gene der Zielart.
Erfindungsgemäß wird das Codonverwendungsmuster des Polynukleotids vorzugsweise Codonen ausschließen, die <10% der Codonen darstellen, die für eine besondere Aminosäure verwendet werden. Ein relativer synonymer Codonverwendungswert (RSCU) ist die beobachtete anzahl von Codonen, geteilt durch die erwartete Anzahl, falls alle Codonen für die Aminosäure gleich häufig verwendet würden. Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt Codonen mit einem RSCU-Wert von weniger als 0,2 in hochexmprimierten Genen des Zielorganismus ausschließen. Ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung wird allgemein einen Codon-Verwendungskoeffizienten für hochexprimierte humane Gene von mehr als 0,6, bevorzugt von mehr als 0,65, am meisten bevorzugt von mehr als 0,7 haben. Codon-Verwendungstabellen für Menschen können auch in Genbank gefunden werden.
Im Vergleich hat ein hochexprimiertes beta-Actingen einen RSCU-Wert von 0,747.

Die Codon-Verwendungstabelle (Tabelle) für Homo sapiens ist nachfolgend dargestellt: Tabelle 1. Codonverwendung für humane (hochexprimierte) Gene 1/24/91 (human_high.cod)

Aminosäure	Codon	Anzahl	/1000	Anteil
Gly	GGG	905,00	18,76	0,24
Gly	GGA	525,00	10,88	0,14
Gly	GGT	441,00	9,14	0,12
Gly	GGC	1867,00	38,70	0,50

Glu	GAG	2420,00	50,16	0,75
Glu	GAA	792,00	16,42	0,25
Asp	GAT	592,00	12,27	0,25
Asp	GAC	1821,00	37,75	0,75

Val	GTG	1866,00	38,68	0,64
Val	GTA	134,00	2,78	0,05
Val	GTT	198,00	4,10	0,07
Val	GTC	728,00	15,09	0,25

Ala	GCG	652,00	13,51	0,17
Ala	GCA	488,00	10,12	0,13
Ala	GCT	654,00	13,56	0,17
Ala	GCC	2057,00	42,64	0,53

Arg	AGG	512,00	10,61	0,18
Arg	AGA	298,00	6,18	0,10
Ser	AGT	354,00	7,34	0,10
Ser	AGC	1171,00	24,27	0,34

Aminosäure	Codon	Anzahl	/1000	Anteil
Lys	AAG	2117,00	43,88	0,82
Lys	AAA	471,00	9,76	0,18
Asn	AAT	314,00	6,51	0,22
Asn	AAC	1120,00	23,22	0,78

Met	ATG	1077,00	22,32	1,00
Ile	ATA	88,00	1,82	0,05
Ile	ATT	315,00	6,53	0,18
Ile	ATC	1369,00	28,38	0,77

Thr	ACG	405,00	8,40	0,15
Thr	ACA	373,00	7,73	0,14
Thr	ACT	358,00	7,42	0,14
Thr	ACC	1502,00	31,13	0,57

Trp	TGG	652,00	13,51	1,00
End	TGA	109,00	2,26	0,55
Cys	TGT	325,00	6,74	0,32
Cys	TGC	706,00	14,63	0,68

End	TAG	42,00	0,87	0,21
End	TAA	46,00	0,95	0,23
Tyr	TAT	360,00	7,46	0,26
Tyr	TAC	1042,00	21,60	0,74

Leu	TTG	313,00	6,49	0,06
Leu	TTA	76,00	1,58	0,02
Phe	TTT	336,00	6,96	0,20
Phe	TTC	1377,00	28,54	0,80

Ser	TCG	325,00	6,74	0,09
Ser	TCA	165,00	3,42	0,05
Ser	TCT	450,0	9,33	0,13
Ser	TCC	958,00	19,86	0,28

Aminosäure	Codon	Anzahl	/1000	Anteil
Arg	CGG	611,00	12,67	0,21
Arg	CGA	183,00	3,79	0,06
Arg	CGT	210,00	4,35	0,07
Arg	CGC	1086,00	22,51	0,37

Gln	CAG	2020,00	41,87	0,88
Gln	CAA	283,00	5,87	0,12
His	CAT	234,00	4,85	0,21
His	CAC	870,00	18,03	0,79

Leu	CTG	2884,00	59,78	0,58
Leu	CTA	166,00	3,44	0,03
Leu	CTT	238,00	4,93	0,05
Leu	CTC	1276,00	26,45	0,26

Pro	CCG	482,00	9,99	0,17
Pro	CCA	456,00	9,45	0,16
Pro	CCT	568,00	11,77	0,19
Pro	CCC	1410,00	29,23	0,48

Eine DNA-Sequenz, die die Fusionsproteine oder das modifizierte Cholin-bindende Protein der vorliegenden Erfindung codiert, kann unter Verwendung von Standard-DNA-Synthesetechniken synthetisiert werden, wie zum Beispiel durch enzymatische Ligation, wie beschrieben von D.M. Roberts et al., Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, durch chemische Synthese, durch enzymatische Polymerisation in vitro oder durch PCR-Technologie unter Verwendung zum Beispiel einer hitzestabilen Polymerase oder durch eine Kombination dieser Techniken.
Die enzymatische Polymerisation von DNA kann in vitro unter Verwendung einer DNA-Polymerase wie DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) oder Taq-Polymerase in einem geeigneten Puffer durchgeführt werden, der die Nukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthält, nach Bedarf bei einer Temperatur von 10-37°C, allgemein in einem Volumen von 50 μl oder weniger. Die enzymatische Ligation von DNA-Fragmenten kann unter Verwendung einer DNA-Ligase wie T4-DNA-Ligase in einem geeigneten Puffer wie 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl₂, 0,01 M Dithiothreit, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP und 10 mg/ml Rinderserumalbumin bei einer Temperatur von 4°C bis Umgebungstemperatur durchgeführt werden, allgemein in einem Volumen von 50 μl oder weniger. Die chemische Synthese des DNA-Polymers oder der Fragmente kann durch herkömmliche Phosphotriester-, Phosphat- oder Phosphoramiditchemie unter Verwendung von Festphasentechniken wie durch diejenigen durchgeführt werden, die beschrieben werden in "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments – A Laboratory Manual" (Hrsg. H.G. Gassen und A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), oder in anderen wissenschaftlichen Veröffentlichungen, z.B. M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat und R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat und W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci und M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus und H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; und H.W.D. Mathes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
Das Verfahren der Erfindung kann durch herkömmliche rekombinante Techniken durchgeführt werden, wie zum Beispiel beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Insbesondere kann das Verfahren die folgenden Schritte umfassen:

i) Herstellen eines replizierbaren oder integrierenden Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle ein DNA-Polymer exprimieren kann, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Protein oder ein immunogenes Derivat davon codiert,
ii) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor,
iii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers zur Erzeugung des Proteins erlauben; und
iv) Gewinnen des Proteins.

Der Begriff "Transformieren" wird hier verwendet, um die Einführung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle zu bezeichnen. Dies kann zum Beispiel durch Transformation, Transfektion oder Infektion mit einem geeigneten Plasmid oder viralen Vektor unter Verwendung von z.B. herkömmlichen Techniken erreicht werden, wie sie beschrieben werden in Genetic Engineering; Hrsg. S.M. Kingsman und A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. Der Begriff "transformiert" oder "Transformante" wird hier nachfolgend die resultierende Wirtszelle bezeichnen, die das Fremdgen von Interesse enthält und exprimiert.
Die Expressionsvektoren sind neu und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Die replizierbaren Expressionsvektoren können erfindungsgemäß durch Spalten eines mit der Wirtszelle kompatiblen Vektors zur Bereitstellung eines linearen DNA-Segments mit einem intakten Replikon und durch Kombinieren des linearen Segments mit einem oder mehreren DNA-Molekülen, die zusammen mit dem linearen Segment das gewünschte Produkt codieren, wie zum Beispiel das DNA-Polymer, das das Protein der Erfindung codiert, oder ein Derivat davon, unter ligierenden Bedingungen hergestellt werden.
So kann das DNA-Polymer nach Wunsch vorgebildet oder während der Konstruktion des Vektors gebildet werden.
Die Wahl des Vektors wird zum Teil durch die Wirtszelle bestimmt werden, die prokaryontisch oder eukaryontisch sein kann, aber bevorzugt E. coli-, Hefe- oder CHO-Zellen sein wird. Geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren ein. Expressionsund Klonierungsvektoren enthalten bevorzugt einen selektierbaren Marker, so daß nur die Wirtszellen, die den Marker exprimieren, unter selektiven Bedingungen überleben werden. Selektionsgene schließen ohne Beschränkung dasjenige ein, das ein Protein codiert, das Resistenz gegen Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin verleiht. Expressionsvektoren enthalten auch Kontrollsequenzen, die kompatibel mit dem ausgewählten Wirt sind. Zum Beispiel schließen Expressionskontrollsequenzen für E. coli und allgemein für Prokaryonten Promotoren und Ribosombindungsorte ein. Promotorsequenzen können natürlich vorkommend sein, wie das β-Lactamase- (Penicillinase) (Weissman 1981, Interferon 3 (Hrsg. L. Gresser)), Lactose-(lac) (Chang et al., Nature, 1977, 198: 1056) und Tryptophan- (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res., 1980, 8, 4057) und das lambda-abgeleitete P_L-Promotorsystem. Zusätzlich funktionieren auch synthetische Promotoren, die nicht in der Natur vorkommen, als bakterielle Promotoren. Dies ist beispielsweise der Fall für den synthetischen tac-Hybridpromotor, der aus Sequenzen der trp- und lac-Promotoren abgeleitet ist (De Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 21-26). Diese Systeme sind besonders geeignet mit E. coli.
Hefe-kompatible Vektoren tragen auch Marker, die die Selektion von erfolgreichen Transformanten durch Verleihen von Prototrophie für auxotrophe Mutanten oder Resistenz gegen Schwermetalle für Stämme vom Wildtyp erlauben. Expressionskontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren für glycolytische Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 7, 149), PHO5-Gen, das saure Phosphatase codiert, CUP1-Gen, ARG3-Gen, GAL- Genpromotoren und synthetische Promotorsequenzen ein. Andere Kontrollelemente, die in der Hefeexpression nützlich sind, sind Terminatoren und mRNA-Leitsequenzen. Die 5'-codierende Sequenz ist besonders nützlich, da sie typischerweise ein Signalpeptid codiert, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, die die Sezernierung des Proteins aus der Zelle ausrichten. Geeignete Signalsequenzen können durch Gene für sezernierte Hefeproteine codiert werden, wie das Hefe-Invertasegen und das a-Faktor-Gen, saure Phosphatase, Killertoxin, das alpha-Paarungsfaktorgen und kürzlich die heterologe Inulinase-Signalsequenz, die aus dem INU1A-Gen von Kluyveromyces marxianus stammt. Geeignete Vektoren wurden zur Expression in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae entwickelt.
Eine Vielzahl von P. pastoris-Expressionsvektoren sind auf Basis verschiedener induzierbarer oder konstitutiver Promotoren verfügbar (Cereghino und Cregg, FEMS Microbiol. Rev. 2000, 24:45-66). Zur Erzeugung von cytosolischen und sezernierten Proteinen enthalten die am häufigsten verwendeten P. pastoris-Vektoren den sehr starken und eng regulierten Alkoholoxidase-(AOX1)-Promotor. Die Vektoren enthalten auch das P. pastoris Histidinoldehydrogenase-(HIS4)-Gen zur Selektion in his4-Wirten. Die Sezernierung von Fremdprotein erfordert die Gegenwart einer Signalsequenz, und die S. cerevisiae Präpro-alpha-Paarungsfaktor-Signalsequenz wurde weithin und erfolgreich im Pichia-Expressionssystem verwendet. Expressionsvektoren werden in das P. pastorisGenom zur Maximierung der Stabilität von Expressionsstämmen integriert. Wie in S. cerevisiae stimuliert die Spaltung eines P. pastoris-Expressionsvektors innerhalb einer vom Wirtsgenom geteilten Sequenz (AOX1 oder HIS4) homologe Rekombinationsereignisse, die effizient die Integration des Vektors auf diesen genomischen Locus ausrichten. Allgemein kann ein rekombinanter Stamm, der multiple integrierte Kopien einer Expressionskassette enthält, mehr heterologes Protein als ein Einzelkopiestamm liefern. Der effektivste Weg zum Erhalt von Transformanten mit hoher Kopiezahl erfordert die Transformation eines Pichia-Empfängerstamms durch die Sphäroplastentechnik (Cregg et al. 1985, Mol.Cell.Biol. 5: 3376-3385).
Die Herstellung des replizierbaren Expressionsvektors kann herkömmlich mit geeigneten Enzymen zur Restriktion, Polymerisation und Ligation der DNA durch Verfahren durchgeführt werden, die zum Beispiel in Maniatis et al., oben zitiert, beschrieben werden.
Die rekombinante Wirtszelle wird erfindungsgemäß durch Transformieren einer Wirtszelle mit einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung unter transformierenden Bedingungen hergestellt. Geeignete transformierende Bedingungen sind herkömmlich und werden zum Beispiel beschrieben in Maniatis et al., oben zitiert, oder in "DNA-Cloning", Bd. II, D.M. Glover, Hrsg., IRL Press Ltd., 1985.
Die Wahl der transformierenden Bedingungen hängt von der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle ab. Zum Beispiel wird oben die In-vitro-Transformation unter Verwendung eines lebenden viralen Vektors als transformierendes Mittel für die Polynukleotide der Erfindung beschrieben. Die bakterielle Transformation eines Wirtes wie E. coli kann durch direkte Aufnahme der Polynukleotide (die Expressionsvektoren sein können, die die gewünschte Sequenz enthalten) erfolgen, nachdem der Wirt mit einer CaCl₂-Lösung (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) oder mit einer Lösung, die eine Mischung aus Rubidiumchlorid (RbCl), MnCl₂, Kaliumacetat und Glycerin umfaßt, und dann mit 3-[N-Morpholino]-propan-sulfonsäure, RbCl und Glycerin behandelt wurde, oder durch Elektroporation. Die Transformation von niederen eukaryontischen Organismen wie Hefezellen in Kultur durch Direktaufnahme kann zum Beispiel unter Verwendung des Verfahrens von Hinnen et al. durchgeführt werden (Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75:1929-1933). Sängerzellen in Kultur können unter Verwendung der Calciumphosphat-Copräzipitation der Vektor-DNA auf die Zellen transformiert werden (Graham & Van der Eb, Virology 1978, 52, 546). Andere Verfahren zur Einführung von Polynukleotiden in Sängerzellen schließen die Dextran-vermittelte Transfektion, die Polybren-vermittelte Transfektion, die Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung des Polynukleotids (der Polynukleotide) in Liposomen und die direkte Mikroinjektion der Polynukleotide in Kerne ein.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf eine Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäure, die das Protein der Erfindung codiert, oder einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist.
Das Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die Expression des DNA-Polymers erlauben, wird herkömmlich durchgeführt, wie zum Beispiel beschrieben in Maniatis et al. und "DNA Cloning", oben zitiert. So wird die Zelle bevorzugt mit Nährmittel versorgt und bei einer Temperatur unterhalb 50°C, bevorzugt zwischen 25 und 42°C, besonders bevorzugt zwischen 25 und 35°C, am meisten bevorzugt bei 30°C kultiviert. Die Inkubationszeit kann von einigen Minuten bis zu einigen Stunden gemäß dem Anteil des Polypeptids in der bakteriellen Zelle gemäß Bewertung durch SDS-PAGE oder Western-Blot variieren.
Das Produkt kann durch herkömmliche Verfahren gemäß der Wirtszelle und gemäß der Lokalisierung des Expressionsprodukts (intrazellulär oder sezerniert in das Kulturmedium oder in das Zellperiplasma) gewonnen werden. So kann die Wirtszelle, wenn sie bakteriell ist, wie zum Beispiel E. coli, zum Beispiel physikalisch, chemisch oder enzymatisch lysiert und das Proteinprodukt aus dem resultierenden Lysat isoliert werden. Wenn die Wirtszelle aus Säugetier stammt, kann das Produkt allgemein aus dem Nährmedium oder aus zellfreien Extrakten isoliert werden. Wenn die Wirtszelle eine Hefe wie Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris ist, kann das Produkt allgemein aus lysierten Zellen oder aus dem Kulturmedium isoliert und dann weiter unter Verwendung herkömmlicher Techniken gereinigt werden. Die Spezifität des Expressionssystems kann durch Western Blot oder durch ELISA unter Verwendung eines gegen das Polypeptid von Interesse gerichteten Antikörpers bewertet werden.
Herkömmliche Proteinisolationstechniken schließen die selektive Präzipitation, Adsorptionschromatographie und Affinitätschromatographie, einschließlich einer monoklonalen Antikörper-Affinitätssäule, ein. Wenn die Proteine der vorliegenden Erfindung mit einem Histidinschwanz (His-Tag) exprimiert werden, können sie leicht durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Ionenmetall-Affinitätschromatographiesäule (IMAC) gereinigt werden. Das Metallion kann jedes geeignete Ion sein, zum Beispiel Zink, Nickel, Eisen, Magnesium oder Kupfer, aber ist bevorzugt Zink oder Nickel. Bevorzugt enthält der IMAC-Puffer Detergens, bevorzugt ein anionisches Detergens wie SDS, besonders bevorzugt ein nichtionisches Detergens wie Tween 80 oder ein zwitterionisches Detergens wie Empigen BB, da dies zu geringeren Mengen von Endotoxin im Endprodukt führen kann.
Weitere chromatographische Schritte schließen zum Beispiel einen Q-Sepharose-Schritt ein, der entweder vor oder nach IMAC-Säule durchgeführt werden kann. Bevorzugt ist der pH im Bereich von 7,5 bis 10, besonders bevorzugt von 7,5 bis 9,5, optimalerweise zwischen 8 und 9.
Die Proteine der Erfindung können somit gemäß dem folgenden Protokoll gereinigt werden. Nach der Zellaufbrechung können die das Protein enthaltenden Zellextrakte in einem Tris-Puffer mit pH 8,5, der Harnstoff (z.B. 8,0 M) und SDS (mit zum Beispiel 0,5 bis 1%) enthält, solubilisiert werden. Nach Zentrifugieren kann der resultierende Überstand dann auf eine IMAC (Nickel) Sepharose FF-Säule geladen werden, die mit Tris-Puffer von pH 8,5 äquillibriert ist. Die Säule kann dann mit einem viel Salz enthaltenden Puffer (z.B. 0,75-1,5 M NaCl, 15 mM pH 8,5 Tris-Puffer) gespült werden. Die Säule kann dann gegebenenfalls erneut mit Phosphatpuffer ohne Salz gespült werden. Die Proteine der Erfindung können aus der Säule mit einer Imidazol-haltigen gepufferten Lösung eluiert werden. Die Proteine können dann einem zusätzlichen chromatographischen Schritt wie einer Anionenaustauscherchromatographie (zum Beispiel Q-Sepharose) unterworfen werden.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden entweder löslich in einer flüssigen Form oder in einer lyophilisierten Form, die die bevorzugte Form ist, bereitgestellt. Es wird allgemein erwartet, daß jede humane Dosis 1 bis 1000 μg Protein und bevorzugt 30-300 μg Protein umfassen wird. Das Reinigungsverfahren kann auch einen Carboxyamidierungsschritt einschließen, durch den das Protein zuerst in Gegenwart von Glutathion reduziert und dann in Gegenwart von Iodacetamid carboxymethyliert wird. Dieser Schritt bietet den Vorteil der Kontrolle der oxidativen Aggregation des Moleküls mit sich selbst oder mit Wirtszell-Proteinverunreinigungen durch kovalente Verbrückung mit Disulfidbindungen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische und immunogene Zusammensetzungen bereit, die ein Protein der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfassen. Eine bevorzugte Impfstoffzusammensetzung umfaßt wenigstens ein erfindungsgemäßes Protein. Das Protein weist bevorzugt geblockte Thiol-Gruppen auf und ist hochgereinigt, zum Beispiel weist weniger als 5% Wirtszellkontamination auf. Ein solcher Impfstoff kann gegebenenfalls ein oder mehrere andere Tumorassoziierte Antigene und Derivate enthalten. Zum Beispiel schließen geeignete andere assoziierte Antigene Prostase, PAP-1, PSA (Prostata-spezifisches Antigen), PSMA (Prostata-spezifisches Membranantigen), PSCA (Prostata-Stammzellantigen) und STEAP ein.
In einer anderen Ausführungsform umfassen illustrative immunogene Zusammensetzungen, wie zum Beispiel Impfstoffzusammensetzungen, der vorliegenden Erfindung DNA, die ein oder mehrere der Fusionspolypeptide wie oben beschrieben codiert, so daß das Fusionspolypeptid in situ erzeugt wird. Wie oben festgestellt, kann das Polynukleotid mit jedem einer Vielzahl von Übertragungssystemen verabreicht werden, die den Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Tatsächlich sind zahlreiche Genübertragungstechniken allgemein fachbekannt, wie zum Beispiel diejenigen, die beschrieben werden von Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, und in darin zitierten Verweisen. Geeignete Polynukleotidexpressionssysteme werden natürlich die notwendigen regulatorischen DNA-Regulations sequenzen zur Expression in einem Patienten enthalten (wie einen geeigneten Promotor und ein Terminationssignal). Alternativ können bakterielle Übertragungssysteme die Verabreichung eines Bakteriums (wie Bacillus-Calmette-Guerrin) beinhalten, das einen immunogenen Teil des Polypeptids auf seiner zelloberfläche exprimiert oder ein solches Epitop sezerniert.
Deshalb werden in bestimmten Ausführungsformen Polynukleotide, die die hier beschriebene immunogene Polypeptide codieren, in geeignete Säuger-Wirtszellen zur Expression unter Verwendung eines beliebigen einer Anzahl bekannter Systeme auf Virusbasis eingeführt. In einer illustrativen Ausführungsform liefern Retroviren eine zweckmäßige und wirksame Plattform für Genübertragungssysteme. Eine ausgewählte Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann in einen Vektor inseriert und in retroviralen Partikeln unter Verwendung von fachbekannten Techniken verpackt werden. Das rekombinante Virus kann dann isoliert und auf einen Probanden übertragen werden. Eine Anzahl von illustrativen retroviralen Systemen wurde beschrieben (z.B. US-PS 5,219,740 ; Miller und Rosman (1989), BioTechniques 7:980-990; A.D. Miller (1990), Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; und Boris-Lawrie und Temin (1993), Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
Zusätzlich wurden eine Anzahl illustrativer Systeme auf Adenovirus-Basis beschrieben. Anders als Retroviren, die in das Wirtsgenom integrieren, dauern Adenoviren extrachromosmal fort, wodurch die mit der Insertionsmutagenese assoziierten Risiken minimiert werden (Haj-Ahmad und Graham (1986) J. Virol. 27:267-274; Bett et al. (1993), J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994), Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994), J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994), Gene Therapy 1:51-58: K.L. Berkner (1988), BioTechniques 6:616-629; und Rich et al. (1993), Human Gene Therapy 4:461-476). Da Menschen manchmal durch übliche humane Adenovirus-Serotypen wie AdHu5 infiziert werden, hat ein signifikanter Anteil der Population eine neutralisierende Antikörperreaktion auf das Adenovirus, die wahrscheinlich die Immunreaktion gegen ein heterologes Antigen in einem System auf rekombinanter Impfstoffbasis beeinflussen wird. Nicht-humane Primaten-Adenovirusvektoren wie das Schimpansen-Adenovirus 68 (AdC68, Fitzgerald et al. (2003), J. Immunol 170(3): 1416-22) mögen ein alternatives adenovirales System ohne den Nachteil einer vorbestehenden neutralisierenden Antikörperreaktion bieten.
Verschiedene Adeno-assoziierte Virus-(AAV)-Vektorsysteme wurden ebenfalls zur Polynukleotidübertragung entwickelt. AAV-Vektoren können leicht unter Verwendung von allgemein fachbekannten Techniken konstruiert werden. Siehe z.B. US-PSen 5,173,414 und 5,139,941 : WO 92/01070 und WO 93/03769 ; Lebkowski et al. (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990), Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); B.J. Carter (1992), Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; N. Muzyczka (1992), Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; R.M. Kotin (1994), Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling und Smith (1994), Gene Therapy 1:165-169; und Zhou et al. (1994), J. Exp. Med. 179:1867-1875.
Zusätzliche virale Vektoren, die nützlich zur Übertragung der Nukleinsäuremolküle, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, durch Gentransfer sind, schließen diejenigen ein, die aus der Pockenfamilie von Viren stammen, wie Vakziniavirus und Vogelpockenvirus. Beispielsweise können Vakziniavirus-Rekombinanten, die die neuen Moleküle extrahieren, wie folgt konstruiert werden. Die DNA, die ein Polypeptid codiert, wird zuerst in einen geeigneten Vektor inseriert, so daß sie benachbart zu einem Vakziniapromotor ist und Vakzinia-DNA-Sequenzen wie die Sequenz, die Thymidinkinase (TK) codiert, flankiert. Dieser Vektor wird dann zur Transfektion von Zellen verwendet, die gleichzeitig mit Vakzinia infiziert werden. Eine homologe Rekombination dient zur Insertion des Vakziniapromotors plus des Gens, das das Polypeptid von Interesse codiert, in das virale Genom. Die resultierende TK^–-Rekombinante kann durch Kultivieren der Zellen in Gegenwart von 5-Bromdesoxyuridin und Picken von dagegen resistenten viralen Plaques selektiert werden.
Ein Vakzinia-basiertes Infektions/Transfektionssystem kann zweckmäßig verwendet werden, um die induzierbare, transiente Expression oder Coexpression eines oder mehrerer der hier beschriebenen Polypeptide in Wirtszellen eines Organismus bereitzustellen. In diesem besonderen System werden Zellen zuerst in vitro mit einer Vakziniavirus-Rekombinante infiziert, die die Bakteriophage T7-RNA-Polymerase codiert. Diese Polymerase zeigt eine ausgezeichnete Spezifität, indem sie nur Matrizen transkribiert, die T7-Promotoren tragen. Nach der Infektion werden die Zellen mit dem Polynukleotid oder den Polynukleotiden von Interesse transfiziert, angetrieben durch einen T7-Promotor. Die im Cytoplasma aus der Vakziniavirus-Rekombinante exprimierte Polymerase transkribiert die transfizierte DNA zu RNA, die dann zu Polypeptid durch die Translationsmaschinerie des Wirtes translatiert wird. Das Verfahren liefert eine hochgradige, transiente, cytoplasmatische Produktion großer Mengen von RNA und ihrer Translationsprodukte. Siehe z.B. Elroy-Stein und Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87:6743-6747; Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126.
Alternativ können auch Vogelpockenviren wie die Geflügelpocken- und Kanarienpockenviren zur Übertragung der codierenden Sequenzen von Interesse verwendet werden. Rekombinante Vogelpockenviren, die Immunogene aus Säugerpathogenen exprimieren, sind dafür bekannt, schützende Immunität zu verleihen, wenn sie an Nicht-Vogelarten verabreicht werden. Die Verwendung eines Vogelpockenvektors ("Avipox") ist besonders wünschenswert bei Menschen und anderen Säugerarten, da Mitglieder der Vogelpockengattung sich nur produktiv in anfälligen Vogelarten vermehren können und deshalb nicht infektiös in Säugerzellen sind. Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Vogelpockenviren sind fachbekannt und setzen die genetische Rekombination ein, wie oben in bezug auf die Produktion von Vakziniaviren beschrieben. Siehe z.B. WO 91/12882 , WO 89/03429 und WO 92/03545 .
Jeder einer Anzahl von Alphavirus-Vektoren kann ebenfalls zur Übertragung von Polynukleotidzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wie zum Beispiel diejenigen Vektoren, die in US-PSen 5,843,723 , 6,015,686 , 6,008,035 und 6,015,694 beschrieben werden. Bestimmte Vektoren auf Basis der Venezolanischen Pferdeenzephalitis (VEE) können auch verwendet werden, für die illustrative Beispiele in US-PSen 5,505,947 und 5,643,576 gefunden werden können.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch durch eine Anzahl von Wegen wie intramuskulär, subkutan, intraperitoneal oder intravenös übertragen werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Polynukleotid als "nackte" DNA verabreicht/übertragen, zum Beispiel wie beschrieben in Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 und zusammengefaßt von Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Auftragen der DNA auf biologisch abbaubare Perlen gesteigert werden, die effizient in die Zellen transportiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung intradermal übertragen. Insbesondere wird die Zusammensetzung mittels Verabreichungstechniken mit einer Genpistole (insbesondere Partikelbombardierung) übertragen, die die Auftragung des Vektors auf eine Perle (z.B. aus Gold) beinhalten, die dann unter Hochdruck in die Epidermis verabreicht wird, wie zum Beispiel beschrieben in Haynes et al., J. Biotechnology 44: 37-42 (1996).
In einem illustrativen Beispiel kann eine durch Gas angetriebene Partikelbeschleunigung mit Vorrichtungen wie denjenigen erreicht werden, die von Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) und Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI) hergestellt werden, für die einige Beispiele beschrieben werden in US-PSen 5,846,796 ; 6,010,478 ; 5,865,796 ; 5,584,807 ; und in EP-PS 500 799 . Dieser Ansatz bietet einen nadelfreien Übertragungsansatz, in dem eine trockene Pulverformulierung aus mikroskopischen Teilchen, wie zum Beispiel Polynukleotid, auf einer hohe Geschwindigkeit in einem Heliumgasstrom beschleunigt wird, der durch eine tragbare Vorrichtung erzeugt wird, wodurch die Partikel in ein Zielgewebe von Interesse, typischerweise die Haut, getrieben werden. Die Partikel sind vorzugsweise Goldperlen mit einem Durchmesser von 0,4-4,0 μm, besonders bevorzugt 0,6-2,0 μm, wobei das DNA-Konjugat darauf aufgetragen ist und diese dann in einer Kartusche oder Kassette zum Einlegen in die "Genpistole" umhüllt sind.
In einer verwandten Ausführungsform schließen andere Vorrichtungen und Verfahren, die nützlich zur gasgetriebenen nadelfreien Injektion von Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sein können, diejenigen ein, die von Bioject, Inc. (Portland, OR) bereitgestellt werden, für die einige Beispiele beschrieben werden in US-PSen 4,790,824 ; 5,064,413 ; 5,312,335 ; 5,383,851 ; 5,399,163 ; 5,520,639 und 5,993,412 .
Es ist möglich, die immunogene Komponente, die die Nukleotidsequenz umfaßt, die das antigene Peptid codiert, auf einmaliger Basis oder wiederholt zu verabreichen, zum Beispiel 1- bis 7-mal, bevorzugt 1- bis 4-mal, in Intervallen zwischen ca. 1 Tag und ca. 18 Monaten. Jedoch wird dieses Behandlungsschema in Abhängigkeit von der Größe des Patienten, der Krankheit, die behandelt wird/vor der geschützt wird, der verabreichten Menge der Nukleotidsequenz, dem Verabreichungsweg und anderen Faktoren signifikant variiert werden, die einem fachmännischen medizinischen Praktiker ersichtlich sein würden.
Es ist deshalb ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, die Verwendung eines Proteins oder einer DNA, die das Protein codiert, wie hier beschrieben, in der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zum Hervorrufen einer Immunreaktion in einem Patienten vorzusehen. Bevorzugt soll die Immunreaktion durch sequentielle Verabreichung i) des Proteins, gefolgt von der DNA-Sequenz; oder ii) der DNA-Sequenz, gefolgt vom Protein hervorgerufen werden. Besonders bevorzugt wird die DNA-Sequenz auf biologisch abbaubare Perlen aufgetragen oder über einen Partikelbombardierungsansatz übertragen. Noch mehr bevorzugt ist das Protein mit Hilfsstoff versetzt, bevorzugt mit einem TH-1-induzierenden Hilfsstoff, bevorzugt mit einer Hilfsstofformulierung auf CpG/QS21-Basis.
Die Vektoren, die die Nukleotidsequenzen umfassen, die antigene Peptide codieren, werden in solchen Mengen verabreicht, wie sie prophylaktisch oder therapeutisch wirksam sein werden. Die zu verabreichende Menge ist allgemein im Bereich von 1 pg bis 16 mg, bevorzugt 1 pg bis 10 μg für die Partikel-vermittelte Übertragung und 10 μg bis 16 mg für andere Wege des Nukleotids pro Dosis. Die genaue Menge kann beträchtlich in Abhängigkeit vom Gewicht des zu immunisierenden Patienten und dem Verabreichungsweg variieren.
Geeignete Techniken zur Einführung des nackten Polynukleotids oder Vektors in einen Patienten schließen auch die topische Anwendung mit einem geeigneten Träger ein. Die Nukleinsäure kann topisch auf die Haut oder auf Schleimhautoberflächen durch zum Beispiel intranasale, orale, intravaginale oder intrarektale Verabreichung verabreicht werden. Das nackte Polynukleotid oder der nackte Vektor kann zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vorhanden sein. Die DNA-Aufnahme kann weiter durch Verwendung von Erleichterungsmitteln wie Bupivacain, entweder separat oder eingeschlossen in der DNA-Formulierung, erleichtert werden. Andere Verfahren zur Verabreichung der Nukleinsäure direkt an einen Empfänger schließen Ultraschall, elektrische Stimulation, Elektroporation und Microseeding, das in US 5,697,901 beschrieben wird, ein.
Die Aufnahme von Nukleinsäurekonstrukten kann durch mehrere bekannte Transfektionstechniken gesteigert werden, zum Beispiel durch diejenigen, die die Verwendung von Transfektionsmitteln einschließen. Beispiele für diese Mittel schließen kationische Mittel, zum Beispiel Calciumphosphat und DEAE-Dextran, und Lipofectants, zum Beispiel Lipfectam und Transfectam, ein. Die Dosierung der zu verabreichenden Nukleinsäure kann verändert werden.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine und codierenden Polypeptide können auch als pharmazeutische/immunogene Zusammensetzung formuliert werden, zum Beispiel als Impfstoff. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung deshalb auch eine pharmazeutische/immunogene Zusammensetzung bereit, die ein Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfaßt. Entsprechend wird auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzung bereitgestellt, das das Vermischen des Fusionsproteins der Erfindung oder des codierenden Polynukleotids mit einem geeigneten Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine werden bevorzugt wenigstens 80% rein, besonders bevorzugt 90% rein bereitgestellt, wie durch SDS-PAGE visualisiert. Bevorzugt erscheinen die Proteine als einzelne Bande gemäß SDS-PAGE.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design" ("The Subunit and adjuvant approach" (Hrsg. M.F. Powell & M.J. Newman), (1995), Plenum Press New York). Die Verkapselung in Liposomen wird von Fullerton beschrieben, US-PS 4,235,877 .
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine und codierenden Polynukleotide werden bevorzugt in der Impfstofformulierung der Erfindung mit Hilfsstoff versetzt. Bestimmte Hilfsstoffe sind kommerziell erhältlich, wie zum Beispiel Freundsches unvollständiges Adjuvans und komplettes Adjuvans (Difco Laborstories, Detroit, MI); Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, Inc. Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); Aluminiumsalze wie Aluminiumhydroxidgel (Alaun) oder Aluminiumphosphat; Salze von Calcium, Eisen oder Zink; eine unlösliche Suspension von acyliertem Tyrosin; acylierte Zucker; kationisch oder anionisch derivatisierte Polysaccharide; Polyphosphazene; biologisch abbaubare Mikrokügelchen; Monophosphoryllipid A und Quil A. Cytokine wie GM-CSF, Interleukin-2, -7, -12 und andere ähnliche Wachstumsfaktoren können auch als Hilfsstoffe verwendet werden.
Innerhalb bestimmter Ausführungsformen der Erfindung ist die Hilfsstoffzusammensetzung bevorzugt eine, die eine Immunreaktion vorherrschend von Th1-Typ induziert. Hohe Menge von Cytokinen vom Th1-Typ (z.B. IFN-γ, TNFα, IL-2 und IL-12) neigen dazu, die Induzierung von Zell-vermittelten Immunreaktionen gegen ein verabreichtes Antigen zu begünstigen. Im Gegensatz neigen hohe Mengen von Cytokinen vom Th2-Typ (z.B. IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10) dazu, die Induktion von humoralen Immunreaktionen zu begünstigen. Nach Anwendung eines Impfstoffs wie hier bereitgestellt wird ein Patient eine Immunreaktion stützen, die Reaktionen vom Th1- und Th2-Typ einschließt. Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform, in der eine Reaktion vorherrschend vom Th1-Typ ist, wird die Menge der Cytokine vom Th1-Typ in einem stärkeren Ausmaß zunehmen als die Menge der Cytokine vom Th2-Typ. Die Mengen dieser Cytokine können leicht unter Verwendung von Standardtests bestimmt werden. Für eine Übersicht über die Familien von Cytokinen siehe Mosmann und Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.
Bevorzugte TH-1-induzierende Hilfsstoffe werden aus der Gruppe von Hilfsstoffen ausgewählt, die 3D-MPL, QS21, eine Mischung aus QS21 und Cholesterol und ein CpG-Oligonukleotid oder eine Mischung aus zwei oder mehr der Hilfsstoffe umfaßt. Bestimmte bevorzugte Hilfsstoffe zum Hervorrufen einer Reaktion vorherrschend vom Th1-Typ schließen zum Beispiel eine Kombination aus Monophosphoryllipid A, bevorzugt 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A, zusammen mit einem Aluminiumsalz ein. MPL^®-Hilfsstoffe sind von Corixa Corporation erhältlich (Seattle, WA; siehe z.B. US-PSen 4,436,727 ; 4,877,611 ; 4,866,034 und 4,912,094 ). CpG-haltige Oligonukleotide (in denen das CpG-Dinukleotid unmethyliert ist) induzieren auch eine vorherrschend Th1-Reaktion. Solche Oligonukleotide sind wohlbekannt und werden zum Beispiel beschrieben in WO 96/02555 , WO 99/33488 und US-PSen 6,008,200 und 5,856,462 . Immunstimulatorische DNA-Sequenzen werden auch beschrieben, zum Beispiel von Sato et al., Science 273:352, 1996. Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff umfaßt ein Saponin wie Quil A oder Derivate davon, einschließlich QS21 und QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escin; Digitonin; oder Gypsophila- oder Chenopodium quinoa-Saponine. Andere bevorzugte Formulierungen schließen mehr als ein Saponin in den Hilfsstoffkombinationen der vorliegenden Erfindung ein, zum Beispiel Kombinationen aus wenigstens zweien der folgenden Gruppe, die QS21, QS7, Quil A, β-Escin oder Digitonin umfaßt.
Alternativ können die Saponin-Formulierungen mit Impfstoffträgern kombiniert werden, die aus Chitosan oder anderen polykationischen Polymeren, Polylactid- und Polylactid-co-Glycolid-Partikeln, Poly-N-acetylglucosamin-basierter Polymermatrix, Partikeln, die aus Polysacchariden oder chemisch modifizierten Polysacchariden zusammengesetzt sind, Liposomen und Lipid-basierten Partikeln, Partikeln, die aus Glycerinmonoestern zusammengesetzt sind, etc. zusammengesetzt sind. Die Saponine können auch in Gegenwart von Cholesterol zur Bildung von teilchenförmigen Strukturen wie Liposomen oder ISCOMSs formuliert werden. Außerdem können die Saponine zusammen mit einem Polyoxyethylenether oder -ester in entweder einer nicht-teilchenförmigen Lösung oder Suspension oder in einer teilchenförmigen Struktur formuliert werden, wie zum Beispiel ein paucillamelares Liposom oder ISCOM. Die Saponine können auch mit Exzipienten wie Carbopol^® zur Erhöhung der Viskosität formuliert werden oder können in einer Trockenpulverform mit einem Pulverexzipienten wie Lactose formuliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das Hilfsstoffsystem die Kombination aus einem Monophosphoryllipid A und einem Saponinderivat ein, wie zum Beispiel die Kombination aus QS21 und 3D-MPL^®-Hilfsstoff, wie beschrieben in WO 94/00153 , oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, in der QS21 mit Cholesterol abgeschreckt ist, wie in WO 96/33739 beschrieben. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol. Eine andere, besonders bevorzugte Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL^®-Hilfsstoff und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion einsetzt, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Ein anderes gesteigertes Hilfsstoffsystem beinhaltet die Kombination aus einem CpG-haltigen Oligonukleotid und einem Saponin-Derivat, insbesondere die Kombination aus CpG und QS21, wie in WO 00/09159 und in WO 00/62800 offenbart. Bevorzugt umfaßt die Formulierung zusätzlich eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine immunogene Zusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein umfaßt und ferner D3-MPL, ein Saponin, vorzugsweise QS21, und ein CpG-Oligonukleotid umfaßt, gegebenenfalls formuliert in einer Öl-in-Wasser-Emulsion.
Zusätzliche illustrative Hilfsstoffe zur Verwendung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung schließen Montanid ISA 720 (Seppic, Frankreich), SAF (Chiron, CA, Vereinigte Staaten), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), die SBAS-Reihe von Hilfsstoffen (z.B. SBAS-2 oder SBAS-4, erhältlich von SmithKline Beecham, Rixensart, Belgien), Detox (Enhanzyn^®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) und andere Aminoalkylglucosaminid-4-phosphate (AGPs), wie die in den anhängigen US-Patentanmeldungen Nrn. 08/853,826 und 09/074,720 beschriebenen, deren Offenbarungen hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt wird, und Polyoxyethylenether-Hilfsstoffe, wie die in WO 99/52549A1 beschriebenen, ein.
Andere bevorzugte Hilfsstoffe schließen Hilfsstoffmoleküle der allgemeinen Formel (I) ein: HO(CH₂CH₂O)_n-A-R, worin n 1-50 ist, A eine Bindung oder -C(O)- ist, R C_1-50-Alkyl oder Phenyl-C_1-50-alkyl ist. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Impfstoffformulierung, die einen Polyoxyethylenether der allgemeinen Formel (I) umfaßt, worin n zwischen 1 und 50 ist, bevorzugt 4-24, am meisten bevorzugt 9; die R-Komponente C_1-50 ist, bevorzugt C_4-20-Alkyl und am meisten bevorzugt C₁₂-Alkyl, und A eine Bindung ist. Die Konzentration der Polyoxyethylenether sollte im Bereich von 0,1-20% sein, bevorzugt von 0,1-10% und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,1-1%. Bevorzugte Polyoxyethylenether werden aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Polyoxyethylen-9-laurylether, Polyoxyethylen-9-stearylether, Polyoxyethylen-8-stearylether, Polyoxyethylen-4-laurylether, Polyoxyethylen-35-laurylether und Polyoxyethylen-23-laurylether. Polyoxyethylenether wie Polyoxyethylenlaurylether werden im Merck-Index beschrieben (12. Auflage, Eintrag 7717). Diese Hilfsstoffmoleküle werden in WO 99/52549 beschrieben. Der Polyoxyethylenether gemäß der obigen allgemeinen Formel (I) kann nach Wunsch mit einem anderen Hilfsstoff kombiniert werden. Zum Beispiel ist eine bevorzugte Hilfsstoffkombination bevorzugt mit CpG, wie in der anhängigen GB-Patentanmeldung 9820956.2 beschrieben.
Es ist eine Ausführungsform der Erfindung, daß die Antigene, einschließlich Nukleinsäurevektor, der Erfindung mit immunstimulatorischem Mittel verwendet werden. Bevorzugt wird das immunstimulatorische Mittel zur gleichen Zeit wie die Antigene der Erfindung verabreicht, und in bevorzugten Ausführungsformen werden sie zusammen formuliert. Es ist eine andere Ausführungsform der Erfindung, daß das Antigen und immunstimulatorische Mittel (oder umgekehrt) sequentiell an gleichen oder benachbarten Orten verabreicht werden, zeitlich getrennt durch Zeiträumen von 0-100 Stunden. Solche immunstimulatorischen Mittel schließen ohne Beschränkung ein: synthetische Imidazochinoline wie Imiquimod [S-26308, R-837] (Harrison et al., Vaccine 19: 1820-1826, 2001); und Resiquimod [S-28463, R-848] (Vasilakos et al., Cellular Immunology 204: 64-74, 2000); Schiffsche Basen von Carbonylen und Aminen, die konstitutiv auf Antigen-präsentierenden Zell- und T-Zelloberflächen exprimiert werden, wie Tucaresol (J. Rhodes et al., Nature 377: 71-75, 1995), Cytokin-, Chemokin- und costimulatorische Moleküle als entweder Protein oder Peptid, einschließlich beispielsweise proinflammatorischer Cytokine wie Interferon, GM-CSF, IL-1-alpha, IL-1-beta, TGF-alpha und TGF-beta, Th1-Induktoren wie Interferon-gamma, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 und IL-21, Th2-Induktoren wie IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13, und andere Chemokin- und costimulatorische Gene wie MCP-1, MIP-1-alpha, MIP-1-beta, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 und CD40L, andere immunstimulatorische Zielliganden wie CTLA-4 und L-Selectin, Apoptosestimulierende Proteine und Peptide wie Fas, (49), synthetische Lipidbasierte Hilfsstoffe wie Vaxfectin (Reges et al., Vaccine 19; 3778-3786, 2001), Squalen, alpha-Tocopherol, Polysorbat 80, DOPC und Cholesterol, Endotoxin, [LPS], (B. Beutler, Current Opinion in Microbiology 3: 23-30, 2000); CpG-Oligo- und Dinukleotide (Y. Sato et al., Science 273 (5273): 352-354, 1996; H. Hemmi et al., Nature 408: 740-745, 2000) und andere potentielle Liganden, die Toll-Rezeptoren zur Erzeugung von Th1-induzierenden Cytokinen anregen, wie synthetische mykobakterielle Lipoproteine, mykobakterielles Protein p19, Peptidoglycan, Teichonsäure und Lipid A.
Andere geeignete Hilfsstoffe schließen CT (Choleratoxin, Untereinheiten A und B) und LT (hitzelabiles Enterotoxin aus E. coli, Untereinheiten A und B), Hitzeschockprotein-Familie (HSPs) und LLO (Listeriolysin O; WO 01/72329 ) ein.
Wenn das immunstimulatorische Mittel ein Protein ist, kann das Mittel entweder als Protein oder als Polynukleotid, das das Protein codiert, verabreicht werden.
Andere geeignete Übertragungssysteme schließen Mikrokügelchen ein, in denen das antigene Material in biologisch abbaubaren Polymeren/Mikrokügelchen aufgenommen oder damit konjugiert ist, so daß das antigene Material mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger vermischt und als Impfstoff verwendet werden kann. Der Begriff "Mikrokügelchen" wird allgemein eingesetzt, um kolloidale Partikel zu beschreiben, die im wesentlichen kugelförmig sind und einen Durchmesser im Bereich von 10 nm bis 2 mm haben. Mikrokügelchen, die aus einem sehr großen Bereich von natürlichen und synthetischen Polymeren hergestellt werden, haben Anwendung in einer Vielzahl biomedizinischer Anwendungen gefunden. Dieses Übertragungssystem ist besonders vorteilhaft für Proteine mit kurzen Halbwertszeiten in vivo, was multiple Behandlungen zur Bereitstellung von Wirksamkeit erfordert, oder die instabil in biologischen Flüssigkeiten sind oder nicht vollständig im Magen-Darm-Trakt wegen ihrer relativ hohen Molekulargewichte absorbiert werden. Mehrere Polymere wurden als Matrix zur Proteinfreisetzung beschrieben. Geeignete Polymere schließen Gelatine, Collagen, Alginate und Dextran ein. Bevorzugte Übertragungssysteme schließen biologisch abbaubare Poly(DL-milchsäure) (PLA), Poly(lactid-co-glycolid) (PLG), Poly(glykolsäure) (PGA), Poly(ε-caprolacton) (PCL) und Copolymere wie Poly(DL-milchsäure-co-glycolsäure) (PLGA) ein. Andere bevorzugte Systeme schließen heterogene Hydrogele wie Poly(etherester)-Multiblock-Copolymere ein, die Strukturblöcke auf Basis von hydrophilem Poly(ethylenglykol) PEG) und hydrophobem Poly(butylenterephthalat) (PBT) enthalten, oder Poly(ethylen glycol)terephthalat/Poly(butylenterephthalat) (PEGT/PBT) (Sohier et al., Eur. J. Pharm. and Biopharm., 2003, 55, 221-228). Systeme sind bevorzugt, die eine anhaltende Freisetzung für 1 bis 3 Monate bereitstellen, wie PLGA, PLA und PEGT/PBT.
Es ist möglich, die immunogene oder Impfstoffzusammensetzung auf einmaliger Basis zu verabreichen oder vorzugsweise wiederholt zu verabreichen, so häufig wie notwendig, zum Beispiel 1- bis 7-mal, bevorzugt 1- bis 4-mal, in Intervallen zwischen ca. 1 Tag und ca. 18 Monaten, bevorzugt einem Monat. Diesem kann sich gegebenenfalls eine Dosierung in regelmäßigen Intervallen zwischen 1 und 12 Monaten für einen Zeitraum bis zum Rest des Lebens des Patienten anschließen. In einer bevorzugten Ausführungsform erhält der Patient das Antigen in unterschiedlichen Formen in einem "Prime Boost"-Schema. So wird beispielsweise das Antigen, das Fusionsprotein, zuerst als Protein-Hilfsstoff-basierte Formulierung und dann anschließend als DNA-basierter Impfstoff verabreicht. Dieser Verabreichungsmodus ist bevorzugt. Der bevorzugte Hilfsstoff ist eine Kombination aus einem CpG-haltigen Oligonukleotid und einem Saponin-Derivat, insbesondere die Kombination aus CpG und QS21 wie in WO 00/09159 und in WO 00/62800 offenbart. Die Aufnahme von nackter DNA kann durch Auftragen der DNA auf biologisch abbaubare Perlen erhöht werden, die effizient in die Zellen transportiert werden. Alternativ kann die DNA über einen Partikelbombardierungsansatz übertragen werden, zum Beispiel durch gasgetriebene Partikelbeschleunigung mit Vorrichtungen wie denjenigen, die von Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxfort, UK) und Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI) hergestellt werden, wie hier gelehrt. Dieser Ansatz liefert einen nadelfreien Übertragungsansatz, in dem eine trockene Pulverformulierung aus mikroskopischen Partikeln, wie Polynukleotid- oder Polypeptidpartikeln, auf eine hohe Geschwindigkeit in einem Heliumgasstrom beschleunigt wird, der durch eine tragbare Vorrichtung erzeugt wird, wodurch die Partikel in ein Zielgewebe von Interesse getrieben werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der DNA-basierte Impfstoff zuerst verabreicht werden, gefolgt von der Protein-Hilfsstoffbasierten Formulierung. Noch eine andere Ausführungsform wird die Übertragung des DNA-Konstrukts mittels spezialisierter Übertragungsvektoren betreffen, bevorzugt mittels eines viralen Systems, am meisten bevorzugt mittels Adenovirus-basierter Systeme. Andere geeignete Virus-basierte Systeme der DNA-Übertragung schließen Systeme auf retroviraler, lentiviraler, adeno-assoziierter viraler, Herpes-viraler und Vakziniaviraler Basis ein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform können die Protein-Hilfsstoff-Basisformulierung und der DNA-basierte Impfstoff an benachbarten oder überlappenden Orten coverabreicht werden. Abhängig von der Natur der DNA-Impfstofformulierung kann dies durch Vermischen der DNA- und Protein-Hilfsstofformulierungen vor der Verabreichung oder durch gleichzeitige Verabreichung der DNA- und Protein-Hilfsstofformulierung erreicht werden.
Das Behandlungsschema wird signifikant in Abhängigkeit von der Größe und Art des betreffenden Patienten, der verabreichten Menge des Nukleinsäureimpfstoff und/oder der Proteinzusammensetzung, dem Verabreichungsweg, der Wirksamkeit und Dosis etwaiger als Hilfsstoff verwendeter Verbindungen und anderen Faktoren variiert werden, die einem fähigen medizinischen Pratiker ersichtlich sein würden.
Innerhalb weiterer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Stimulation einer Immunreaktion in einem Patienten bereit, bevorzugt einer T-Zellreaktion in einem menschlichen Patienten, umfassend das Verabreichen einer hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung. Der Patient kann von Lungen- oder Dickdarmkrebs oder kolorektalem Krebs oder Brustkrebs befallen sein, wobei in diesem Fall die Verfahren die Behandlung für die Krankheit bereitstellen, oder der Patient, der als mit einem Risiko für eine solche Krankheit behaftet betrachtet wird, kann prophylaktisch behandelt werden.
Innerhalb weiterer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Inhibierung der Entwicklung eines Krebes in einem Patienten bereit, umfassend das Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung wie oben aufgeführt an einen Patienten. Der Patient kann zum Beispiel von Sarkom-, Prostata-, Eierstock-, Blasen-, Lungen-, Dickdarm-, kolorektalem oder Brustkrebs befallen sein, wobei in diesen Fällen die Verfahren eine Behandlung für die Krankheit bereitstellen, oder der Patient, der als mit einem Risiko für eine solche Krankheit behaftet betrachtet wird, kann prophylaktisch behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner innerhalb anderer Aspekte Verfahren zur Entfernung von Tumorzellen aus einer biologischen Probe bereit, umfassend das Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit T-Zellen, die spezifisch mit einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung reagieren, worin der Schritt des Inkontaktbringens unter Bedingungen und für eine ausreichende Dauer durchgeführt wird, um die Entfernung von Zellen, die das Protein exprimieren, aus der Probe zu erlauben.
Innerhalb verwandter Aspekte werden Verfahren zur Inhibierung der Entwicklung eines Krebes in einem Patienten bereitgestellt, umfassend das Verabreichen einer biologischen Probe, die wie oben beschrieben behandelt wurde, an einen Patienten.
Verfahren werden ferner bereitgestellt, innerhalb anderer Aspekte, zur Stimulation und/oder Vermehrung von T-Zellen, die spezifisch für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung sind, umfassend das Inkontaktbringen von T-Zellen mit einem oder mehreren aus: (i) einem Polypeptid wie oben beschrieben; (ii) einem Polynukleotid, das ein solches Polypeptid codiert; und/oder (iii) einer Antigen-präsentierenden Zelle, die ein solches Polypeptid exprimiert; unter Bedingungen und für eine Dauer, die ausreichend sind, um die Stimulation und/oder Vermehrung von T-Zellen zu erlauben. Isolierte T-Zellpopulationen, die T-Zellen wie oben beschrieben hergestellt umfassen, werden ebenfalls bereitgestellt.
Innerhalb weiterer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Inhibierung der Entwicklung eines Krebses in einem Patienten bereit, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge einer T-Zellpopulation wie oben beschrieben an einen Patienten. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zu Inhibierung der Entwicklung eines Krebses in einem Patienten bereit, umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkubieren von CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen, die aus einem Patienten mit einem oder mehreren aus den folgenden isoliert sind: (i) einem hier offenbarten Polypeptid; (ii) einem Polynukleotid, das ein solches Polypeptid codiert; und (iii) einer Antigen-präsentierenden Zelle, die ein solches Polypeptid exprimiert; und (b) Verabreichen einer wirksamen Menge der vermehrten T-Zellen an den Patienten und dadurch Inhibieren der Entwicklung eines Krebses im Patienten. Vermehrte Zellen können vor der Verabreichung an den Patienten kloniert werden, müssen aber nicht.
Gemäß einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird eine hier beschriebene immunogene Zusammensetzung an einen Wirt über ein Antigenpräsentierende Zellen (APCs) übertragen, wie dentritische Zellen, Makrophagen, B-Zellen, Monozyten und andere Zellen, die manipuliert sein können, um effiziente APCs zu sein. Solche Zellen können genetisch modifiziert sein, aber brauchen nicht, um die Kapazität zur Präsentation des Antigens zu erhöhen, die Aktivierung und/oder Bewahrung der T-Zellreaktion zu verbessern, Antitumorwirkungen als solche aufzuweisen und/oder immunologisch mit dem Empfänger kompatibel zu sein (d.h. ein übereinstimmender HLA-Haplotyp). APCs können allgemein aus beliebigen aus einer Vielzahl biologischer Flüssigkeiten und Organe isoliert werden, die Tumor- und peritumorale Gewebe einschließen, und können autologe, allogene, syngene oder xenogene Zellen sein.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden dendritische Zellen oder Vorläufer davon als Antigen-präsentierende Zellen. Dentritische Zellen sind hochpotente APCs (Banchereau und Steinman, Nature, 392:245-251, 1998), und es wurde gezeigt, daß sie wirksam als physiologischer Hilfsstoff zur Hervorrufung von prophylaktischer oder therapeutischer Antitumorimmunität sind (siehe Timmerman und Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999). Allgemein können dendritische Zellen auf Basis ihrer typischen Form (sternförmig in situ, mit deutlichen cytoplasmatischen Prozessen (Dendriten), die in vitro sichtbar sind), ihrer Fähigkeit, Antigene mit hoher Effizienz aufzunehmen, zu verarbeiten und zu präsentieren, und ihrer Fähigkeit, naive T-Zellreaktionen zu aktivieren, identifiziert werden. Dentritische Zellen können natürlich manipuliert werden, um spezifische Zelloberflächenrezeptoren oder Liganden zu exprimieren, die nicht üblicherweise auf dendritischen Zellen in vivo oder ex vivo gefunden werden, und solche modifizierten dentritischen Zellen werden von der vorliegenden Erfindung erwogen. Als Alternative zu dentritischen Zellen können mit sezernierten Vesikeln Antigen-beladene dendritische Zellen (als Exosome bezeichnet) in einem Impfstoff verwendet werden (siehe Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).
Dendritische Zellen und Vorläufer können aus peripherem Blut, Knochenmark, Tumor-infiltrierenden Zellen, peritumorales Gewebe infiltrierenden Zellen, Lymphknoten, Milz, Haut, Nabelschnurblut oder jedem anderen geeigneten Gewebe oder jeder anderen geeigneten Flüssigkeit erhalten werden. Zum Beispiel können dendritische Zellen ex vivo durch Zugabe einer Kombination von Cytokinen wie GM-CSF, IL-4, IL-13 und/oder TNFα zu Kulturen von Monozyten differenziert werden, die aus peripherem Blut geerntet wurden. Alternativ können CD34-positive Zellen, aus aus peripherem Blut, Nabelschnurblut oder Knochenmark geerntet wurden, zu dendritischen Zellen durch Zugabe von Kombinationen aus GM-CSF, IL3, TNFα, CD40-Ligand, LPS, flt3-Ligand und/oder anderen Verbindungen, die die Differenzierung, Reifung und Vermehrung von dendritischen Zellen induzieren, zum Kulturmedium differenziert werden.
Dendritische Zellen werden herkömmlich als "unreife" und "reife" Zellen kategorisiert, was eine einfach Möglichkeit zur Unterscheidung zwischen zwei gut charakterisierten Phänotypen erlaubt. Jesoch sollte diese Nomenklatur nicht als Ausschluß aller möglichen intermediären Differenzierungsstadien aufgefaßt werden. Unreife dendritische Zellen werden als APC mit einer hohen Fähigkeit zur Antigenaufnahme und -verarbeitung gekennzeichnet, was mit der hohen Expression von FCγ-Rezeptor und Mannoserezeptor korreliert. Der reife Phänotyp ist typischerweise durch eine geringere Expression dieser Marker, aber eine hohe Expression von Zelloberflächenmolekülen gekennzeichnet, die für die T-Zellaktivierung verantwortlich sind, wie Klasse I und Klasse II MHC, Adhäsionsmoleküle (z.B. CD54 und CD11) und costimulatorische Molekül (z.B. CD40, CD80, CD86 und 4-1BB).
APCs können allgemein mit einem Polynukleotid der Erfindung (oder einem Teil oder einer anderen Variante davon) transfiziert werden, so daß das codierte Polypeptid oder ein immunogener Teil davon auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Eine solche Transfektion kann ex vivo erfolgen, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die solche transfizierten Zellen umfaßt, kann dann für therapeutische Zwecke wie hier beschrieben verwendet werden. Alternativ kann ein Genübertragungsträger, der auf eine dendritische oder andere Antigen-präsentierende Zelle abzielt, an einen Patienten verabreicht werden, was zu Transfektion führt, die in vivo erfolgt. In vivo- und ex vivo-Transfektion von dendritischen Zellen kann zum Beispiel allgemein unter Verwendung aller fachbekannten Verfahren durchgeführt werden, wie zum Beispiel mit denjenigen, die in WO 97/24447 beschrieben werde, oder mit dem Genpistolenansatz, beschrieben von Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997. Die Antigenbeladung von dendritischen Zellen kann durch Inkubieren von dendritischen Zellen oder Vorläuferzellen mit dem Tumorpolypeptid, DNA (nackt oder mit einem Plasmidvektor) oder RNA erreicht werden, oder mit Antigen-exprimierenden rekombinanten Bakterien oder Viren (z.B. Vakzinia-, Geflügelpocken-, Adenovirus- oder Lentivirusvektoren). Vor der Beladung kann das Polypeptid kovalent mit einem immunologischen Partner konjugiert werden, der T-Zellhilfe liefert (z.B. ein Trägermolekül). Alternativ kann eine dendritische Zelle mit einem nicht-konjugierten immunologischen Partner gepulst werden, separat oder in Gegenwart des Polypeptids.
Definitionen
Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung werden Verfahren zur Analyse von Kennzeichensequenzen oder Ketten, insbesondere genetischen Sequenzen oder codierten Proteinsequenzen. Bevorzugte Verfahren zur Sequenzanalyse schließen zum Beispiel Verfahren der Sequenzhomologieanalyse ein, wie Identität- und Ähnlichkeitsanalyse, DNA-, RNA- und Proteinstrukturanalyse, Sequenzaufbau, kladistische Analyse, Sequenzmotivanalyse, Bestimmung des offenen Leserasters, Nukleinsäure-Basenzählung, Codon-Verwendungsanalyse, Nukleinsäure-Basenzurechtstuzung und sequenzierende Chromatogrammpeakanalyse ein.
Ein computerbasiertes Verfahren wird zur Durchführung der Homologieidentifikation bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die folgenden Schritte: Bereitstellen einer ersten Polynukleotidsequenz, die die Sequenz eines Polynukleotids der Erfindung in einem computerlesbaren Medium umfaßt; und Vergleichen der ersten Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie. Ein computerbasiertes Verfahren wird ebenfalls zur Durchführung der Homologieidentifikation bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Bereitstellen einer ersten Polypeptidsequenz, die die Sequenz eines Polypeptids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polypeptidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
"Identität", wie es fachbekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, gemäß Bestimmung durch Vergleich der Sequenzen. Auf diesem Gebiet bedeutet "Identität" auch den Grad der Sequenzverwandtheit zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, gemäß Bestimmung durch die Übereinstimmung zwischen Ketten solcher Sequenzen. "Identität" kann leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, die ohne Beschränkung diejenigen einschließen, die beschrieben werden in Computational Molecular Biology, A.M. Lesk, Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D.W. Smith, Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil 1, A.M. Griffin und H.G. Griffin, Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heine, Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux, Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; und H. Carillo und D. Lipman, SIAM J. Applied Math. 48: 173 (1988). Verfahren zur Bestimmung von Identität werden geschaffen, um die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen zu ergeben. Außerdem sind Verfahren zur Identitätsbestimmung in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen codifiziert. Computerprogrammverfahren zur Bestimmung von Identität zwischen zwei Sequenzen schließen ohne Beschränkung das GAP-Programm im GCG-Programmpaket (J. Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (S.F. Altschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)) und FASIA (Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)) ein. Die BLAST-Familie von Programmen ist öffentlich erhältlich von NCBI und anderen Quellen (BLAST Manual, S. Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; S. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann auch zur Identitätsbestimmung verwendet werden.
Parameter für den Polypeptid-Sequenzvergleich schließen die folgenden ein:

Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970),
Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992)
Lückenstrafe: 8
Lückenlängenstrafe: 2

Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich erhältlich als das "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Die zuvorgenannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keiner Strafe für die Endlücken).
Parameter für den Polynukleotidvergleich schließen die folgenden ein:

Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970),
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlübereinstimmungen = 0,
Lückenstrafe: 50
Lückenlängenstrafe: 3

Verfügbar als das "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Dies sind die Standardparameter für Nukleinsäurevergleiche.
Eine bevorzugte Bedeutung für "Identität" für Polynukleotide und Polypeptide, je nach Fall, wird nachfolgend unter (1) und (2) bereitgestellt.

(1) Polynukleotidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polynukleotid ein, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100%igen Identität mit jeder der Referenz- Sequenzen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 umfaßt, worin die Polynukleotidsequenz identisch mit jeder der Referenzsequenzen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO: 16 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Nukleotidveränderungen im Vergleich zur Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den terminalen 5'- oder 3'-Positionen der Referenznukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl an Nukleotidveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Nukleotiden in einem beliebigen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 durch die ganze Zahl, die die prozentuale Identität definiert, geteilt durch 100, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleotiden in einem beliebigen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 bestimmt wird, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl der Nukleotidveränderungen ist, x_n die Gesamtanzahl an Nukleotiden in einem beliebigen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 ist, y 0,50 für 50%, 0,60 für 60%, 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85%, 0,90 für 90%, 0,95 für 95%, 0,97 für 97% oder 1,00 für 100% ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_n abgerundet wird. Veränderungen der Polynukleotidsequenz, die die Polypeptide aus einer beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 codieren, können Unsinn-, Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das durch das Polynukleotid nach solchen Veränderungen codierte Polypeptid verändern. Beispielsweise kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit jeder der Referenzsequenzen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 sein, d.h. sie kann zu 100% identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Nukleinsäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100% Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Nukleinsäuredeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den terminalen 5'- oder 3'-Positionen der Referenzpolynukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleinsäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl der Nukleinsäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Nukleinsäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 durch die ganze Zahl, die die prozentuale Identität definiert, geteilt durch 100, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleinsäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 bestimmt, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl der Nukleinsäureveränderungen ist, x_n die Gesamtanzahl an Nukleinsäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:9 bis SEQ ID NO:16 ist, y z.B. 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85% etc. ist, das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_n abegrundet wird.
(2) Polypeptidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das ein Polypeptid mit wenigstens einer 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100%igen Identität mit der Polypeptidreferenzsequenz aus einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 umfaßt, worin die Polypeptidsequenz identisch mit einer beliebigen der Referenzsequenzen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzpolypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen kann, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl der Aminosäureveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtanzahl von Aminosäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 durch die ganze Zahl, die die prozentuale Identität definiert, geteilt durch 100, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Aminosäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 bestimmt, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl der Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtanzahl der Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y 0,50 für 50%, 0,60 für 60%, 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85%, 0,90 für 90%, 0,95 für 95%, 0,97 für 97% oder 1,00 für 100% steht und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_a abgerundet wird.

Beispielsweise kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz aus einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 sein, das heißt sie kann zu 100% identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100% Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenzpolypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen erfolgen können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl der Aminosäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtanzahl an Aminosäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 durch die ganze Zahl, die die prozentuale Identität definiert, geteilt durch 100, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der gesamten Anzahl an Aminosäuren in einer beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 bestimmt, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl der Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtanzahl der Aminosäuren in einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO:8 ist, y zum Beispiel 0,70 für 70%, 0,80 für 80%, 0,85 für 85% etc. ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor dem Subtrahieren von x_a abgerundet wird.
Figurenbeschreibungen
1: Sequenzangaben für C-LytA. Jedes Repeat wurde auf Basis von sowohl multipler Sequenzangleichung als auch Sekundärstrukturvorhersage unter Verwendung der folgenden Angleichungsprogramme definiert: 1) MatchBox (E. Depiereux et al. (1992), Comput. Applic. Biosci. 8:501-9); 2) ClustalW (J.D. Thompson et al. (1994), Nucl. Acid Res. 22:4673-80); Block-Maker (S. Henikoff et al. (1995), Gene 163:S.17-26).
2: CPC und native Konstrukte (SEQ ID NOs:27-36)
3: Schematische Struktur von CPC-p501 His-Fusionsprotein, exprimiert in S. cerevisiae
4: Primärstruktur von CPC-P501 His-Fusionsprotein (SEQ ID NO:41)
5: Nukleotidsequenz von CPC P501 His(pRIT 15201) (SEQ ID NO:42)
6: Klonierungsstrategie zur Erzeugung von Plasmid pRIT 15201
7: Plasmidkarte von pRIT 15201
8: Vergleichende Expression von CPC P501 und P501 in S. cerevisiae Stamm DC 5
9: Erzeugung von CPC-P501S His (Y1796) im kleinen Maßstab. 9A stellt die Antigenproduktivität gemäß Abschätzung durch SDS-PAGE mit Silberanfärbung dar; 9B stellt die Antigenproduktivität gemäß Abschätzung durch Western Blot dar.
10: Reinigungsschema von durch Y1796 erzeugtem CPC-P501-His.
11: Muster von CPC P501 His-gereinigtem Protein (4-12% Novex Nu-Page Polyacrylamid vorgegossene Gele).
12: Native P501S-Sequenz voller Länge (SEQ ID NO:17)
13: Sequenz der CPC-P501S-Expressionskassette von JNW735 (SEQ ID NO:18)
14: Zwei Codon-optimierte P501S-Sequenzen (SEQ ID NO:19-20)
15: Zurückmanipulierte Codon-optimierte Sequenz 19 (SEQ ID NO:21)
16: Zurückmanipulierte Codon-optimierte Sequenz 20 (SEQ ID NO:22)
17: Die Ausgangssequenz zur Optimierung von CPC (SEQ ID NO:23)
18: Repräsentative Codon-optimierte CPC-Sequenzen (SEQ ID NO: 24-25)
19: Manipulierte Codon-optimierte CPC-Sequenz (SEQ ID NO:26)
20: P501S-CPS-Fusionskandidatkonstrukte und Sequenzen (SEQ ID. NOs: 37-40 & 45-48)
21: Western-Blot-Analyse von CHO-Zellen nach transienter Transfektion mit P501S (JNW680), CPC-P501S (JNW735) und leerer Vektorkontrolle.
22: Anti-P501S-Antikörperreaktionen nach Immunisierung am Tag 0, 21 & 42 mit pVAC-P501S (JNW680, Mäuse B1-9) oder leerem Vektor (pVAC, Mäuse A1-6). Eine Vorblutentnahme erfolgte am Tag -1. Anschließende Blutentnahmen erfolgten an den Tagen 28 und 49 (Mäuse A1-3, B1-3) und 56 (Mäuse A4-6, B4-9). Alle Seren wurden mit einer 1/100-Verdünnung untersucht. Die Ergebnisse für die pVAC-immunisierten Mäuse wurden Bemittelt. Alle Ergebnisse für die individuellen pVAC-P501S-immunisierten Mäuse sind gezeigt. Als Positivkontrolle sind Seren aus Adeno-P501S-immunisierten Mäusen (Corixa Corp., verdünnt 1/100) eingeschlossen.
23: Peptidbibliotheksdurchmusterung unter Verwendung von C57BL/6-Mäusen, immunisiert am Tag 0, 21, 42 und 70 mit pVAC-P501S (JNW680). Alle Peptide wurden in einer Endkonzentration von 50 μg/ml verwendet. Peptide 1-50 sind überlappende 15-20-mere, erhalten von Corixa. Peptide 51-70 sind vorhergesagte 8-9-mere Kb- und Db-Epitope und wurden von Mimotopes (GB) geordert. Proben 71-72 und 73-78 sind DMSO-Kontrollen bzw. Kontrollen ohne Peptid. Diagramm A zeigt die IFN-γ-Reaktionen, während Diagramm B die Il-2-Reaktionen zeigt. Zur Verwendung in anschließenden Immuntests ausgewählte Peptide sind schwarz gezeigt.
24: Zelluläre Reaktionen gemäß ELISPOT am Tag 77 nach PMID-Immunisierung am Tag 0, 21, 42 und 70 mit pVAC-P501S (INW680, B6-9) und pVAC leer (A4-6). Peptide 18, 22 & 48 wurden mit 50 μg/ml verwendet. CPC-P501S-Protein wurde mit 20 μg/ml verwendet. Diagramm A zeigt die IFN-γ-Reaktionen, während Diagramm B die IL-2-Reaktionen zeigt.
25: Vergleich von P501S und CPC-P501S. Zelluläre Reaktionen wurden durch IL-2 ELISPOT unter Verwendung von Peptid 22 (10 μg/ml) am Tag 28 gemessen. Mäuse wurden durch PMID am Tag 0 und 21 mit pVAC leer (Kontrolle), pVAC-P501S (JNW680) und CPC-P501S (JNW735) immunisiert.
26: Immunreaktion (Lymphproliferation an Milzzellen) nach Proteinimmunisierung mit CPC-P501S.
27: Auswertung der Immunreaktion auf unterschiedliche CPC-P501S-Konstrukte. Zelluläre Reaktionen wurden durch IL-2-ELISPOT am Tag 28 gemessen. Mäuse wurden durch PMID am Tag 0 und 21 mit p7313, d.h. leer (Kontrolle), JNW735 und CPC-P501S-Konstrukten (JNW770, 771 und 773) immunisiert.
28: MUC-1 CPC-Sequenzen (SEQ ID NOs: 49 & 50)
29: ss-CPC-MUC-1-Sequenzen (SEQ ID NOs: 51 & 52)
Die Erfindung wird weiter durch Verweis auf die folgenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1: Herstellung des rekombinanten Hefestamms Y1796, der P501-Fusionsprotein exprimiert, das ein C-LytA-P2-C-LytA (CPC) als Fusionspartner enthält
1. Proteinkonstruktion
Die Struktur des Fusionsproteins C-P2-C-p501 (alternativ als CPC-P501 bezeichnet) zur Expression in S. cerevisiae ist in 3 gezeigt. Diese Fusion enthält die C-terminale Region von Gen LytA (Reste 187 bis 306), in die das P2-Fragment von Tetanustoxin (Reste 830-843) inseriert wurde. Das P2-Fragment wird zwischen die Reste 277 und 278 von C-Lyt-A plaziert. Dem C-LytA-Fragment, das die P2-Insertion enthält, folgen P501 (Aminosäurereste 51 bis 553) und der His-Schwanz.
Die Primärstruktur des resultierenden Fusionsproteins hat die in 4 beschriebene Sequenz, und die der obigen Proteinkonstruktion entsprechende codierende Sequenz ist in 5.
2. Klonierungsstrategie zur Erzeugung eines Hefeplasmids, das CPC-P501 (51-553)-His-Fusionsprotein exprimiert

– Das Ausgangsmaterial ist der Hefevektor pRIT15068 ( GB-Patentanmeldung 0015619.0 ).
– Dieser Vektor enthält den Hefe-Cupl-Promotor, die Hefe-alpha-Präprosignal-codierende Sequenz und die codierende Sequenz, die den Resten 55 bis 553 von P501S entspricht, gefolgt vom His-Schwanz.
– Die in 6 umrissene Klonierungsstrategie schließt die folgenden Schritte ein:
a) Der erste Schritt ist die Insertion der P2-Sequenz (Codon-optimiert zur Hefeexpression) im Raster in die C-lytA-codierende Sequenz. Die C-lytA-codierende Sequenz wird vom Plasmid pRIT 14662 ( PCT/EP99/00660 ) beherbergt. Die Insertion erfolgt unter Verwendung eines Adapters, der durch zwei als P21 und P22 bezeichnete komplementäre Oligonukleotide gebildet wird, in das zuvor durch NcoI geöffnete Plasmid pRIT 14662. Die Sequenz von P21 und P22 ist: P21 5' catgcaatacatcaaggctaactctaagttcattggtatcactgaaggcgt 3' P22 3' gttatgtagttccgattgagattcaagtaaccatagtgacttccgcagtac 5' Nach Ligation und Transformation von E. coli und Charakterisierung der Transformante wird das als pRIT 15199 bezeichnete Plasmid erhalten.
b) Der zweite Schritt ist die Herstellung von C-lytA-P2-C-lytA-DNA-Fragment durch PCR-Amplifikation. Die Amplifikation wird unter Verwendung von pRIT15199 als Matrize und der als C-LytANOTATG und C-LytA- aa55 bezeichneten Oligonukleotide durchgeführt. Die Sequenz beider Oligonukleotide ist: C-LytANOTATG =5'aaaaccatggcggccgcttacgtacattccgacggctcttatccaaaagacaag 3' C-LytA-aa55 =5'aaacatgtacatgaacttttctggcctgtctgccagtgttc 3' Das amplifizierte Fragment wird mit den Restriktionsenzymen NcoI und AflIII zur Erzeugung der jeweiligen kohäsiven Enden behandelt.
c) Der nächste Schritt ist die Ligation des obigen Fragments mit Vektor pRIT 15068 (größtes nach NcoI-Behandlung erhaltenes Fragment) zur Erzeugung der kompletten Fusionsprotein-codierenden Sequenz. Nach Ligation und E. coli-Transformation wird das als pRIT15200 bezeichnete Plasmid erhalten. In diesem Plasmid enthält der verbleibende besondere NcoI-Ort das ATG, das für das Startcodon codiert.
d) Im nächsten Schritt wird ein NcoI-Fragment, das den CUP1-Promotor und einen Teil von 2μ-Plasmidsequenzen enthält, aus Plasmid pRIT 15202 hergestellt. Plasmid pR2T 15202 ist ein Hefe 2μ-Derivat, das den CUP1-Promotor mit einem NcoI-Ort bei ATG enthält (ATG-Sequenz: AAACC ATG).
e) Das aus pRIT 15202 isolierte NcoI-Fragment wird an pRIT 15200, zuvor mit NcoI geöffnet, in der richtigen Orientierung in einer solchen Weise ligiert, daß der pCUP1-Promotor auf der 5'-Seite der codierenden Sequenz ist. Dies führt zur Erzeugung des fertigen, als pRIT 15201 bezeichneten Expressionsplasmids (siehe 7).

3. Herstellung des rekombinanten Hefestamms Y1796 (RIX4440)
Das Plasmid pRIT 15201 wird zur Transformation des S. cerevisiae-Stamms DC5 (ATCC 20820) verwendet. Nach Selektion und Charakterisierung der Hefetransformanten, die das Plasmid pRIT 15201 enthalten, wird ein als Y1796 bezeichneter rekombinanter Hefestamm, der das CPC-P501-His-Fusionsprotein exprimiert, erhalten. Das Protein nach Reduktion und Carboxyamidierung wird isoliert und durch Affinitätschromatograhie (IMAC) gereinigt, gefolgt von Anionenaustauschchromatographie (Q Sepharose FF).
Beispiel II
In einer analogen Weise können Proteinkonstrukte wie in 2 gezeigt unter Verwendung der darin gezeigten, entsprechenden DNA-Sequenzen exprimiert werden. Insbesondere entspricht der Hefestamm SC333 (Konstrukt 2) dem Y1796-Stamm, aber exprimiert P501_55-553 ohne den CPC-Fusionspartner. Hefestamm Y1800 (Konstrukt 3) entspricht dem Y1796-Stamm, aber umfaßt zusätzlich das native Sequenzsignal für P501S (Aminosäure 1-34), während Hefestamm Y1802 (Konstrukt 4) die alpha-Präsignalsequenz stromaufwärts der CPC-P501S-Sequenz umfaßt. Hefestamm Y1790 (Konstrukt 5) exprimiert ein P501S-Konstrukt, dem CPC fehlt und das die alpha-Präpro-Signalsequenz aufweist.
Beispiel III. Herstellung von gereinigtem CPC-P501
1. Herstellung von CPC-P501S-HIS (Y1796) im kleinen Maßstab
Für Y1796 in mit Histidin ergänztem Minimalmedium wird die Expression in der logarithmischen Phase durch Zugabe von CuSO₄ im Bereich von 100 bis 500 μM induziert, und die Kultur wird bei 30°C gehalten. Die Zellen werden nach 8 oder 24 h Induktion geernetet. Kupfer wird gerade vor der Verwendung hinzugegeben und nicht zuvor mit dem Medium vermischt.

Für die SDS-PAGE-Analyse wird die Extraktion der Hefezellen in Citrat-Phosphat-Puffer, pH 4,0 + 130 mM NaCl durchgeführt. Die Extraktion wird mit Glasperlen für eine kleine Zellmenge und mit einer French-Presse für eine höhere Zellmenge durchgeführt und dann mit Probenpuffer vermischt und durch SDS-PAGE analysiert. Die Ergebnisse der vergleichenden Analyse an SDS-PAGE der unterschiedlichen Konstrukte sind in 8 dargestellt und nachfolgend in Tabelle 2 zusammengefaßt. Wie in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt wird, ist der Expressionsgrad der Kultur viel höher für den Y1796-Stamm im Vergleich zur Expressionsstärke des Elternstamms SC333, eines Stammes, der das entsprechende P501S-His ohne CPC-Partner exprimiert. In gleicher Weise beeinflußt die Gegenwart einer Signalsequenz (alpha-prä) nicht die oben erörterten Ergebnisse: die Expressionsstärke der Kultur ist viel höher für den Y1802-Stamm im Vergleich mit der Expressionsstärke des entsprechenden Stammes Y1790, eines Stammes, der das entsprechende P501S-His ohne CPC-Partner exprimiert. Tabelle 2

Rekom-binanter Stamm	Plasmid	Pro-motor	Signalsequenz	Fusions-Partner	P501 Aminosäuresequenzen	Expres sions-stärke
SC333	Ma333	CUP1	-	-	55-553-His	θND
Y1796	pRIT 15201	CUP1	-	CPC	51-553-His	+++
Y1802	pRIT 15219	CUP1	α-prä	CPC	51-553-His	++++
Y1790	pRIT 15068	CUP1	α-präpro	-	55-553-His	+

CPC = clyta-P2-clyta
ND = nicht detektierbar, selbst im Western Blot
+ = detektierbar im Western Blot
+++/++++ = detektierbar im Western Blot und sichtbar in mit Silber angefärbten Gelen

2. Fermentation von Y1796 (RIX4440) im größeren Maßstab
100 μl des Arbeitsansatzes werden auf festem Medium ausgebreitet und für ca. 24 h bei 30°C kultiviert. Diese feste Vorkultur wird dann zum Impfen einer flüssigen Vorkultur in Schüttelflaschen verwendet. Diese flüssige Vorkultur wird für 20 h bei 30°C kultiviert und in einen 20 l- Fermenter überführt. Die Zulauffermentation schließt eine Wachstumsphase von ca. 44 h und eine Induktionsphase von ca. 22 h ein.
Die Kohlenstoffquelle (Glucose) wurde zur Kultur durch kontinuierliche Zufuhr hinzugegeben. Die Restglucosekonzentration wurde sehr niedrig gehalten (≤50 mg/l), um die Ethanolerzeugung durch Fermentation zu minimieren. Dies wurde durch Begrenzen der Entwicklung des Mikroorganismus durch beschränkte Glucosezufuhrrate erreicht. Am Ende der Wachstumsphase wird der CUP1-Promotor durch Zugabe von CuSO₄ induziert, um das Antigen zu erzeugen.
Die Abwesenheit von Verunreinigungen wurde durch Impfen von 10⁶ Zellen in Standard-TSB- und -THI-Fläschchen überprüft, die mit Nystatin ergänzt und für 14 Tage bei 20-25°C bzw. 30-35°C inkubiert wurden. Wie erwartet wurde kein Wachstum beobachtet.
3. Antigencharakterisierung und -produktivität
Zellhomogenate wurden durch French-Pressen von Fermentationsproben hergestellt, die zu unterschiedlichen Zeiten während der Induktionsphase geerntet wurden, und durch SDS-PAGE und Western-Blot analysiert. Es wurde gezeigt, daß der Großteil des Proteins von Interesse sich in der unlöslichen Fraktion befand, die aus dem Zellhomogenat nach Zentrifugieren erhalten wurde. Die SDS-PAGE- und Western Blot-Analysen, die in den nachfolgenden Figuren gezeigt sind, wurden an den Pellets durchgeführt, die nach Zentrifugieren dieser Zellhomogenate erhalten wurden.
8A und B zeigen die Kinetik der Antigenproduktion während der Induktionsphase für Kultur PRO127. Es scheint, daß keine Antigenexpression während der Wachstumsphase erfolgte. Die spezifische Antigenproduktivität scheint von Beginn der Induktionsphase an bis zu 6 h zuzunehmen, und blieb dann relativ stabil bis zum Ende. Aber die volumetrische Produktivität erhöhte sich um einen Faktor 1,5 bis 2 aufgrund von Biomasseanreicherung, die während des gleichen Zeitraums beobachtet wurde. Die Antigenproduktivität wurde auf ca. 500 mg pro Liter Fermentationsbouillon durch Vergleich der gereinigten Referenz des Antigens und der Rohextrakte an SDS-PAGE mit Silberanfärbung (9A) und WB-Analysen unter Verwendung eines Anti-P501S-Antikörpers abgeschätzt (ein muriner Ascite, gerichtet gegen P501S Aminosäuren 439-459, verwendet mit einer Verdünnung von 1/1000) (9B).
Beispiel IV. Reinigung von CPC-P501 (51-553)-His-Fusionsprotein, erzeugt von Y1796
Nach dem Zellaufbruch ist das Protein mit der Pelletfraktion assoziiert. Eine Carbamidomethylierung des Moleküls wurde im Verfahren eingeführt, um mit der oxidativen Aggregation des Moleküls mit sich selbst oder mit Wirtszeil-Proteinverunreinigungen durch kovalente Verbrückung mit Disulfidbindungen zurechtzukommen. Die Verwendung von Detergentien wurde ebenfalls notwendig, um den hydrophoben Charakter dieses Proteins (12 Trans-Membrandomänen vorhergesagt) zu handhaben.
Das Reinigungsverfahren, entwickelt für den Maßstab von 1 l Kultur mit OD (optische Dichte) 120, ist in 10 beschrieben. Alle Arbeitsschritte werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Gemäß dem DOC-TCA-BCA-Proteintest ist die globale Reinigungsausbeute 30-70 mg gereinigtes Antigen/l Kultur mit OD 120. Die Ausbeute ist mit dem Expressionsgrad der Kultur verbunden und ist höher im Vergleich mit der Reinigungsausbeute des Elternstamms, der unfusioniertes P501S-His exprimiert. Der Proteintest wird wie folgt durchgeführt: Proteine werden zuerst unter Verwendung von TCA (Trichloressigsäure) in Gegenwart von DOC (Desoxycholat) ausgefällt und dann in einem alkalischen Medium in Gegenwart von SDS gelöst. Die Proteine reagieren dann mit BCA (Bicinchoninsäure) (Pierce) unter Bildung eines löslichen violetten Komplexes, der eine hohe Extinktion bei 562 nm besitzt, die proportional zur in der Probe vorhandenen Proteinmenge ist. SDS-PAGE-Analyse von 3 gereinigten Ansäzten (11) zeigt keinen Unterschied bei reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen (vgl. Bahnen 2, 3 und 4 gegenüber Bahnen 5, 6 und 7). Das Muster besteht aus einer Hauptbande bei 20 kDa, einer Verschmierung mit höherem Molekulargewicht und schwachen Abbaubanden. Alle Banden werden durch einen spezifischen monoklonalen Anti-P501S-Antikörper detektiert.
Beispiel V. Impfstoffherstellung unter Verwendung von CPC-P501S-His-Protein
Das Protein aus Beispiel 3 oder 4 kann zu einem Impfstoff formuliert werden, der QS21 und 3D-MPL in einer Öl-in-Wasser-Emulsion enthält.
1. Impfstoffherstellung
Das Antigen, hergestellt wie in Beispiel 1 bis 3 gezeigt, ein C-LytA-P2-P501S-His. Als Hilfsstoff umfaßt die Formulierung eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL) und QS21 in einer Öl/Wasser-Emulsion. Das Hilfsstoffsystem SBAS2 wurde zuvor in WO 95/17210 beschrieben.
3D-MPL: ist ein Immunstimulans, das aus dem Lipopolysaccharid (LPS) des Gram-negativen Bakteriums Salmonella minnesota stammt. MPL wurde desacyliert, und ihm fehlt eine Phosphat-Gruppe an der Lipid-A-Einheit. Diese chemische Behandlung reduziert drematisch die Toxizität, während die immunstimulierenden Eigenschaften bewahrt werden (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry erzeugt und liefert MPL ans SB-Biologicals. Von SmithKline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben gezeigt, daß 3D-MPL in Kombination mit verschiedenen Trägern die zelluläre Immunität sowohl vom humoralen als auch vom TH1-Typ stark steigert.
QS21: ist ein natürliches Saponinmolekül, das aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja saponaria Molina extrahiert wird. Eine zur Trennung der individuellen Saponine von den Rohextrakten der Rinde entwickelte Reinigungstechnik erlaubte die Isolierung des besonderen Saponins QS21, das ein Triterpenglycosid ist, das stärkere Hilfsstoffaktivität und geringere Toxizität im Vergleich mit der Stammkomponente zeigt. Es wurde gezeigt, daß QS21 MHC Klasse I beschränkte CTLs gegen mehrere Untereinheiten-Ags aktiviert sowie die Ag-spezifische Lymphozytenproliferation stimuliert (Kensil, 1992). Aquila (zuvor Cambridge Biotech Corporation) erzeugt und liefert QS21 an SB-Biologicals.
Bei SmithKline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben eine klare synergistische Wirkung der Kombinationen von MPL und QS21 in der Induzierung von zellulären Immunreaktionen vom sowohl humoralen als auch TH1-Typ gezeigt.
Die Öl/Wasser-Emulsion ist aus einer organischen Phase, die aus 2 Ölen (einem Tocopherol und Squalen) hergestellt ist, und einer wäßrigen Phase von PBS, die Tween 80 als Emulgator enthält, zusammengesetzt. Die Emulsion umfaßte 5% Squalen, 5% Tocopherol, 0,4% Tween 80 und besaß eine durchschnittliche Teilchengröße von 180 nm und ist als SB62 bekannt (siehe WO 95/17210 ).
Bei SmithKline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben nachgewiesen, daß die Zugabe dieser O/W-Emulsion zu 3D-MPL/Q21 (SBAS2) die immunstimulatorischen Eigenschaften des letzteren gegen verschiedene Untereinheitantigene weiter steigert.
2. Herstellung von Emulsion SB62 (2-faches Konzentrat)
Tween 80 wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zum Erhalt einer 2%igen Lösung in PBS gelöst. Zur Bereitstellung von 100 ml von zweifacher Konzentratemulsion werden 5 g DL-alpha-Tocopherol und 5 ml Squalen zum sorgfältigen Vermischen verwirbelt. 90 ml PBS/Tween-Lösung werden hinzugegeben und sorgfältig vermischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritze geleitet und schließlich unter Verwendung einer Microfluidics-Vorrichtung M110S mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von ca. 180 nm.
3. Formulierungen
Eine typische Formulierung, die 3D-MPL und QS21 in einer Öl/Wasser-Emulsion enthält, wird wie folgt durchgeführt: 20 μg-25 μg C-LytA P2-P501S werden in 10-fach konzentriertem PBS pH 6,8 und H₂O verdünnt, vor der aufeinanderfolgenden Zugabe von SB62 (50 μl), MPL (20 μg), QS21 (20 μg), gegebenenfalls umfassend CpG-Oligonukleotid (100 μg) und 1 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel. Die Menge jeder Komponente kann nach Bedarf variieren. Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt.
Beispiel VI. Codon-optimierte P501S-Sequenzen
1. Erzeugung der rekombinanten Kontrollplasmide
P501S-Sequenz voller Länge wurde in pVAC (Thomsen, Immunology, 1998; 95:510P105) kloniert, wodurch das Expressionsplasmid JNW680 erzeugt wurde. SEQ ID NO:17 stellt die humane P501S-Expressionskassette im Plasmid JNW680 dar und ist in 12 veranschaulicht. Die Proteinsequenz von SEQ ID NO:17 ist im Einbuchstabenformat gezeigt, wobei die Start- und Stoppcodons fettgeschrieben gezeigt sind. Die Kozak-Sequenz ist durch die Doppelkreuzsymbole hervorgehofen. Der Codonverwendungsindex der humanen P501S-Sequenz (SEQ ID NO:17) beträgt 0,618, berechnet durch das SynGene-Programm.
SynGene-Programm
Grundsätzlich werden die Codonen unter Verwendung eines statistischen Verfahrens zugewiesen, um ein synthetisches Gen mit einer Codonhäufigkeit zu ergeben, die näher an derjenigen ist, die natürlich in hochexmprimierten E. coli- und humanen Genen gefunden wird.
SynGene ist eine aktualisierte Version des als Calcgene bezeichneten Visual Basic-Programms, das von R.S. Hale und G. Thompson geschrieben wurde (Protein Expression and Purification, Bd. 12, S. 185-188 (1998)). Für jeden Aminosäurerest in der ursprünglichen Sequenz wurde ein Codon auf der Basis der Wahrscheinlichkeit zugeordnet, mit der es in hochexprimierten E. coli-Genen erscheint. Einzelheiten des Calcgene-Programms, das unter Microsoft Windows 3.1 läuft, können von den Autoren erhalten werden. Weil das Programm ein statistisches Verfahren einsetzt, um Codonen dem synthetischen Gen zuzuweisen, sind nicht alle resultierenden Codonen die am häufigsten verwendeten im Zielorganismus. Vielmehr wird der Anteil der häufig und nicht häufig verwendeten Codonen des Zielorganismus in der synthetischen Sequenz durch Zuordnen von Codonen in den richtigen Anteilen widergespiegelt. Da es keine feste und schnelle Regel gibt, die ein besonderes Codon einer besonderen Position in der Sequenz zuordnet, wird das Programm jedoch bei jedem Mal, bei dem es läuft, ein anderes synthetisches Gen ergeben – obwohl jedes das gleiche Codonverwendungsmuster haben wird und jedes die gleiche Aminosäuresequenz codieren wird. Falls das Programm mehrere Male für eine gegebene Aminosäuresequenz und einen gegebenen Zielorganismus läuft, werden verschiedene unterschiedliche Nukleotidsequenzen erzeugt werden, die sich in der Anzahl, dem Typ und der Position von Restriktionsorten, Intron-Spleißsignalen etc. unterscheiden können, von denen einige unerwünscht sein können. Der Fachmann wird eine geeignete Sequenz zur Verwendung in der Expression des Polypeptids auf der Basis dieser Merkmale auswählen können.
Da die Codonen zufällig auf statistischer Basis zugeordnet werden, ist es außerdem möglich (obwohl vielleicht unwahrscheinlich), daß zwei oder mehr Codonen, die relativ selten im Zielorganismus verwendet werden, in großer Nähe gehäuft sein könnten. Es wird angenommen, daß solche Cluster die Translationsmaschinerie verwirren können und zu besonders niedrigen Expressionsraten führen können, so daß der Algorithmus zur Auswahl der Codonen im optimierten Gen etwaige Codonen mit einem RSCU-Wert von weniger als 0,2 für hochexprimierte Gene ausschließt, um die zufällige Auswahl etwaiger seltener Gencluster zu verhindern. Die Verteilung der verbleibenden Codonen wird dann gemäß den Häufigkeiten für hochexprimiertes E. coli zugewiesen, um eine Gesamtverteilung innerhalb des synthetischen Gens zu ergeben, die typisch für solche Gene (Koeffizient = 0,85) und auch für hochexprimierte humane Gene (Koeffizient = 0,50) ist.
Syngene (Peter Ert1, unveröffentlicht), eine aktualisierte Version des Calcgene-Programms, erlaubt den Ausschluß von seltenen Codonen in optionaler Weise und wird auch zur Zuordnung von Codonen gemäß dem Codonhäufigkeitsmuster von hochexprimierten humanen Genen verwendet.
Die Sequenz der CPC-P501S-Kassette, kloniert aus dem Vektor pRIT15201 (siehe 7) in pVAC, wodurch Plasmid JNW735 erzeugt wird, ist in SEQ ID NO:18 dargestellt und in 13 veranschaulicht. Diese Sequenz ist identisch mit der pRIT15201-Sequenz mit der Ausnahme der Entfernung des His-Markers und der Addition einer Kozak-Sequenz (GCCACC) und geeigneter Restriktionsenzymorte. Die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:18 ist im Einbuchstabenformat gezeigt, die Start- und Stoppcodons sind in Fettschrift gezeigt. Die umrahmten Reste sind das P2-Helferepitop von Tetanustoxoid. Die unterstrichenen Reste sind der Clyta-Reinigungsmarker. Die Kozak-Sequenz ist durch die Doppelkreuzsymbole hervorgehoben.
2. Erzeugung der rekombinanten Plasmide mit P501S-Codon-optimierten Sequenzen
Obwohl der Codonkoeffizientenindex (CI) der nativen P501S-Sequenz bereits hoch ist (0,618), ist es möglich, den CI-Wert weiter zu erhöhen. Dies wird zwei potentielle Vorzüge haben – die Verbesserung der Antigenexpression und/oder Immunogenität und die Reduzierung der Möglichkeit zur Rekombination zwischen dem P501S-Vektor und genomischen Sequenzen.
Unter Verwendung des Syngene-Programms wurde eine Auswahl (SEQ ID NO:19 bis SEQ ID NO:20) der Codon-optimierten Sequenzen erhalten (14). Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt einen Vergleich des Codonkoeffizientenindex für die Ausgangs-P501S-Sequenz und die zwei repräsentativen Codon-optimierten Sequenzen, ausgewählt auf Basis eines geeigneten Restriktionsenzymortprofils und eines guten CI-Index. Tabelle 3-Vergleich der Codonkoeffizientenindizes von zwei Codonoptimierten P501S-Genen

Sequenz Codonkoeffizientenindex (CI)

P501S 0,618

SEQ ID NO:19 0,725

SEQ ID NO:20 0,755
3. Weitere Auswertung der Codon-optimierten Sequenzen
Sequenz SEQ ID NO:19
Obwohl SEQ ID NO:19 einen guten CI-Index hat (0,725), enthält es ein Dublett von seltenen Codonen in den Aminosäurepositionen 202 und 203. Diese Codonen wurden manuell durch häufigere Codonen durch Veränderung der DNA-Sequenz von TTGTTG zu CTGCTG substituiert. Zur Erleichterung der Klonierung und Expression wurden Restriktionsenzymorte und eine Kozak-Sequenz hinzugefügt. Die fertige manipulierte Sequenz (SEQ ID NO:21) ist in 15 gezeigt. Das Syngene-Programm wurde zur Fragmentierung dieser Sequenz in Oligonukleotide mit einer minimalen Überlappung von 19-20 Basen verwendet. Deshalb zeigt 15 die zurückmanipulierte P501S-Codon-optimierte SEQ ID NO:19. Restriktionsenzymorte sind unterstrichen, die Kozak-Sequenz ist fett geschrieben, die zurückmanipulierte DNA-Sequenz zur Entfernung eines seltenen Codondubletts ist umrahmt.
Unter Verwendung eines zweistufigen PCR-Protokolls wurden die überlappenden Primer, erzeugt durch das Syngene-Programm, zuerst unter Verwendung eines PCR-Konstruktionsprotokolls (nachfolgend ausgeführt) zusammengebaut. Die Konstruktionsreaktion erzeugt eine diverse Population von Fragmenten. Das korrekte Fragment voller Länge wurde unter Verwendung des PCR-Gewinnungsprotokolls und der terminalen Primer gewonnen/amplifiziert. Das resultierende PCR-Fragment wurde aus einem Agarosegel ausgeschnitten, gereinigt, mit NheI und XhoI beschränkt und in pVAC kloniert. Positive Klone wurden durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert und durch doppelsträngige Sequenzierung bestätigt. Dies erzeugt Plasmid JNW766, das aufgrund der fehlerbehafteten Natur des PCR-Prozesses eine einzelne stille Mutation enthielt (C zu T in Position 360 von SEQ ID NO:21).
1. Konstruktionsreaktion – PCR-Bedingungen, generisches Protokoll
Reaktionmischung (Gesamtvolumen = 50 μl):

– 1x Reaktionspuffer (Pfx oder Proofstart)
– 1 μl Oligo-Sammlung (gleiche Mischung aus allen überlappenden Oligonukleotiden)
– 0,5 mM dNTPs
– DNA-Polymerase (Pfx oder Proofstart, 2,5-5U)
– +/– 1 mM MgSO₄
– +/– 1x Verstärkerlösung (Pfx-Verstärkung oder Proofstartpuffer Q)
1. 94°C für 120 s (nur Proofstart)
2. 94°C für 30 s
3. 40°C für 120 s
4. 72°C für 10 s
5. 94°C für 15 s
6. 40°C für 30 s
7. 72°C für 20 s + 3 s/Zyklus
8. Cyclieren zu Schritt 5, 25-mal
9. Halten bei 4°C

2. Gewinnungsreaktion – PCR-Bedingungen (generisches Protokoll)
Reaktionsmischung (Gesamtvolumen = 50 μl):

– 1x Reaktionspuffer (Pfx oder Proofstart)
– 5-10 μl Konstruktionsreaktionsmischung
– 0,3-0,75 mM dNTPs
– 50 pmol Primer (5'-terminaler Primer, Sense-Orientierung)
– 50 pmol Primer (3'-terminaler Primer, Antisense-Orientierung)
– DNA-Polymerase (Pfx oder Proofstart, 2,5-5U)
– +/– 1 mM MgSO₄
– +/– 1x Verstärkerlösung (Pfx-Verstärker oder Proofstartpuffer Q)
1. 94°C, 120 s (nur Proofstart)
2. 94°C, 45 s
3. 60°C, 30 s
4. 72°C, 120 s
5. Cyclieren zu Schritt 2, 25-mal
6. 72°C, 240 s
7. Halten bei 4°C

Sequenz SEQ ID NO:20
Obwohl SEQ ID NO:20 einen sehr guten CI-Index hat (0,755), wurde festgestellt, daß es ein Dublett von seltenen Codonen in den Aminosäurepositionen 131 und 132 enthielt. Diese Codonen wurden manuell gegen häufigere Codonen durch Veränderung der DNA-Sequenz von TTGTTG zu CTGCTG substituiert. Zur Erleichterung der Klonierung wurde ein interner BamHI-Ort durch Mutieren von G zu C entfernt (siehe das doppelt unterstrichene Nukleotid in 16). Zur Erleichterung der Klonierung und Expression wurden Restriktionsenzymorte und eine Kozak-Sequenz hinzugefügt. Die fertige manipulierte Sequenz (SEQ ID NO:22) ist in 16 gezeigt. Das Syngene-Programm wurde zur Fragmentierung dieser Sequenz in Oligonukleotide mit einer minimalen Überlappung von 19-20 Basen verwendet. 16 zeigt deshalb die zurückmanipulierte P501S-Codon-optimierte Sequenz 20 (SEQ ID NO:22). Restriktionsenzymorte sind unterstrichen, die Kozak-Sequenz ist fett geschrieben, zurückmanipulierte DNA-Sequenz zur Entfernung eines selten Codondubletts ist eingerahmt und eine stumme Punktmutation zur Entfernung eines BamHI-Orts ist doppelt unterstrichen.
Unter Verwendung eines ähnlichen zweistufigen PCR-Protokolls zu dem oben beschriebenen wurde P501S-Fragment voller Länge amplifiziert und in pVAC kloniert. Positive Klone wurden durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert und durch doppelsträngige Sequenzierung bestätigt. Dies erzeugte Plasmid JNW764. Die Sequenz der P501S-codierenden Kassette ist in 16 gezeigt (SEQ ID NO: 22).
DNA-Sequenzähnlichkeit
Paarabstände nach Angleichtung durch das (gewichtete) ClustaIV-Verfahren sind der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt. Die nachfolgende Tabelle 4 zeigt die prozentuale Ähnlichkeit zwischen der humanen Ausgangs-P501S-Sequenz und den zwei Codon-optimierten Sequenzen SEQ ID NO:21 und 22, die zur weiteren Untersuchung ausgewählt wurden. Die Daten bestätigen, daß die Codon-optimierten DNA-Sequenzen ca. 80% ähnlich zur ursprünglichen P501S-Sequenz sind. Tabelle 4

SEQ ID NO: % Ähnlichkeit mit Ausgangs-P501S-Sequenz

21 79,6

22 79,4
Beispiel VII. Codon-optimierte CPC-Sequenzen
1. Ansatz
Da die ursprüngliche CPC-Sequenz ursprünglich zur optimalen Expression in Hefe geschaffen wurde, beschreibt dieser Abschnitt das Verfahren der Codon-Optimierung zur humanen Expression.
2. Sequenzkonstruktion
Die Ausgangssequenz für die Optimierung von CPC ist in 17 gezeigt (SEQ ID NO:23). Diese stammt völlig aus pRIT15201 und enthält die gesamte codierende Sequenz von CPC plus vier Aminosäuren aus P501S zur Erleichterung der Klonierung stromabwärts. Unter Verwendung des Syngene-Programms wurde eine Selektion von Codon-optimierten Sequenzen erhalten, aus denen repräsentative Sequenzen in 18 gezeigt sind (SEQ ID NO: 24-25). Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt einen Vergleich des Codonkoeffizientenindex für die Ausgangs-CPC-Sequenz und die zwei repräsentativen Codon-optimierten Sequenzen. Tabelle 5. Codonkoeffizientenindizes für zwei CPC-optimierte Sequenzen

Sequenz Codonkoeffizientenindex (CI)

Ursprüngliches CPC = SEQ ID NO:23 0,506

SEQ ID NO:24 0,809

SEQ ID NO:25 0,800
Zusätzlich zur Codonoptimierung wurden alle Sequenzen auch auf Restriktionsenzymklonierungsorte durchmustert. Auf Basis des höchsten CI-Wertes und eines vorteilhaften Restriktionsenzymortprofils wurde SEQ ID NO:24 zur Konstruktion ausgewählt. Zur Erleichterung der Klonierung und Expression wurden 5'- und 3'-Klonierungsorte hinzugefügt, und eine Kozak-Sequenz (GCCACC) wurde 5' des einleitenden ATG-Startcodons inseriert. Diese manipulierte Sequenz ist in 19 gezeigt (SEQ ID NO:26). Diese Sequenz schließt vier Aminosäuren von P501S (eingerahmt), Restriktionsenzymklonierungsorte (NheI und XhoI, unterstrichen), eine Kozak-Sequenz (fett geschrieben), ein Stoppcodon (kursiv) und 4 bp von flankierender irrelevanter DNA zur Erleichterung der Klonierung ein. Das Syngene-Programm wurde zur Fragmentierung dieser Sequenz zu 50- bis 60-meren Oligonukleotiden mit einer minimalen Überlappung von 18-20 Basen verwendet. Unter Verwendung eines ähnlichen zweistufigen PCR-Protokolls zu dem oben beschriebenen wurde das korrekte Fragment gewonnen/amplifiziert und in pVAC kloniert. Positive Klone wurde durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert und die Sequenz unter Erzeugung von Vektor JNW759 verifiziert.
4. DNA-Ähnlichkeit
Paarabstände nach Angleichung mit ClustaIV (gewichtet) sind in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt. Die Tabelle zeigt die prozentuale Ähnlichkeit auf der DNA-Ebene zwischen der Ausgangssequenz von CPC und der Codonoptimierten Sequenz und bestätigt, daß die Codon-optimierten Sequenzen ca. 80% ähnlich mit der ursprünglichen CPC-Sequenz sind. Tabelle 6

Sequenz SEQ ID NO:: % Ähnlichkeit mit Ausgangs-CPC-Sequenz

24 80,2

25 81,6
Beispiel VIII. Konstruktion des P501S-Fusionskandidaten Alle im nachfolgend gezeigten Schema gezeigten Kandidaten sind Codonoptimiert und werden unter Verwendung überlappender PCR-Methodik aus Plasmiden JNW764 und INW759 als Matrizen (SEQ ID NO:22 bzw. SEQ ID NO:26) konstruiert und in den Expressionsvektor p7313-ie kloniert.
Die vier nachfolgend schematisch gezeigten Kandidaten beruhen auf CPC-P501S. Codon-optimiertes CPC-P501S ist Konstrukt A. Kandidaten B, C und D schließen auch die Sequenz ein, die die N-terminalen 50 Aminosäuren von P501S codiert, positioniert entweder am N-Terminus von CPC-P501S (Konstrukt D), am C-Terminus von CPC-P501S (Konstrukt C) oder zwischen CPC und P501S (Konstrukt B). Eine schematische Darstellung der Konstrukte ist in 20 angegeben. Die Nukleotid- und Proteinsequenzen für jedes der vier Konstrukte in in SEQ ID NO:37-40 für die Nukleotidsequenzen und SEQ ID NO:45-48 für die entsprechenden Polypeptidsequenzen gezeigt. In den Konstrukten A, C und D codiert das unterstrichene Codon vorzugsweise Tyrosin (entweder TAC oder TAT), aber die Nukleotidsequenz kann verändert werden, um Threonin zu codieren (entweder ACA, ACC, ACG oder ACT). In Konstrukt B codiert das unterstrichene Codon vorzugsweise Threonin (entweder ACA, ACC, ACG oder ACT), aber die Nukleotidsequenz kann verändert werden, um Tyrosin zu codieren (entweder TAC oder TAT). In allen Konstrukten wird die codierende Sequenz von entsprechenden Restriktionsenzymklonierungsorten (in diesem Fall NotI und BamHI) und einer Kozak-Sequenz unmittelbar stromaufwärts des einleitenden ATG flankiert. Die nachfolgende Tabelle 7 zeigt die Plasmididentifizierung für die oben erläuterten Konstrukte: Tabelle 7

Konstrukt Aminosäure im unterstrichenen Codon Sequenz des Codons Plasmid ID

A Tyrosin TAC JNW771

B Threonin ACA JNW773

B Tyrosin TAC JNW770

C Tyrosin TAC JNW777

D Tyrosin TAC JNW769
Die zellulären Reaktionen nach Immunisierung mit p7313-ie (leerer Vektor), pVAC-P501S (JNW735), JNW770, JNW771 und JNW773 wurden durch ELISPOT nach einer primären Immunisierung durch PMID am Tag 0 und drei Auffrischungen am Tag 21, 42 und 70 bewertet. Tests wurden 7 Tag nach der Auffrischung durchgeführt. 27 zeigt, daß gute IL-2 ELISPOT-Reaktionen in mit JNW770, JNW771 und JNW773 immunisierten Mäusen detektiert wurden.
Beispiel IX. Immunogenitätsexperimente unter Verwendung von Partikelvermittelten intradermalen Übertragungsstudien (PMID)
P501A voller Länge bei Übertragung durch eine Partikel-vermittelte intradermale Übertragung (PMID) erzeugt gute Antikörper- und zelluläre Reaktionen. Diese Daten zeigen, daß die PMID ein sehr wirksamer Übertragungsweg ist. Außerdem bestätigt der Vergleich von P501S und CPC-P501S, daß CPC-P501S eine stärkere Immunreaktion gemäß Bestimmung durch Peptid-ELISPOT induziert.
1. Materialien und Methoden
1.1 Kutane Genimmunisierung mit Genpistole
Plasmid-DNA wurde auf Goldperlen mit 2 μm Durchmesser unter Verwendung von Calciumchlorid und Spermidin präzipitiert. Beladene Perlen wurden auf Tefzel-Schlauch wie beschrieben aufgetragen (Eisenbraum et al., 1993; Pertmer et al., 1996). Die Partikelbombardierung wurde unter Verwendung des Accell-Genübertragungssystems durchgeführt ( WO 95/19799 ). Für jedes Plasmid wurden weibliche C57BL/6-Mäuse an den Tagen 0, 21, 42 und 70 immunisiert. Jede Verabreichung bestand aus zwei Bombardierungen mit DNA/Gold, was eine Gesamtdosis von ca. 4-5 μg Plasmid lieferte.
1.2. ELISPOT-Tests für T-Zellreaktionen auf das P5O1S-Genprodukt
a) Herstellung von Milzzellen
Milzorgane wurden aus immunisierten Tieren an den Tagen 7-14 nach der Auffrischung erhalten. Die Milzorgane wurden durch Mahlen zwischen Glasplatten zur Erzeugung einer Zellsuspension verarbeitet. Rote Blutkörperchen wurden durch Ammosniumchloridbehandlung lysiert, und Trümmer wurden unter Zurücklassen einer feinen Suspension von Milzzellen entfernt. Die Zellen wurden auf eine Konzentration von 8 × 10⁶/ml in komplettem RPMI-Medium zur Verwendung in ELISPOT-Tests resuspendiert.
b) Durchmusterung der Peptidbibliothek
Eine Peptidbibliothek, die eine Mehrheit der P501s-Sequenz abdeckt, wurde von Corixa Corp. erhalten. Die Bibliothek enthielt 50 15-20-mere Peptide, die für 4-11 Aminosäuren überlappten. Die Peptide sind mit 1 bis 50 numeriert. Zusätzlich wurde ein Vorhersageprogramm (H.G. Rammensee et al.: Immunogenetics, 1999, 50: 213-219) (http://syfpeithi.bmiheidelberg.com/) zur Vorhersage mutmaßlicher Kb- und Db-Epitope aus der P501S-Sequenz verwendet. Die zehn besten Epitope für Kb und Db wurden von Mimotopes (GB) bestellt und in der Bibliothek eingeschlossen. Zur Durchmusterung der Peptidbibliothek wurden Peptide in einer Endkonzentration von 50 μg/ml (ca. 25-50 μM) in IFNγ- und IL-2-ELISPOTS unter Verwendung des nachfolgend beschriebenen Protokolls verwendet. Für IFNγ-ELISPOTS wurde IL-2 zu den Tests mit 10 ng/ml hinzugegeben. Die für die Durchmusterung verwendeten Milzzellen wurden am Tag 84 aus C57BL/6-Mäusen enthommen, die am Tag 0, 21, 42 und 70 immunisiert wurden. Drei Peptide wurden aus der Bibliotheksdurchmusterung identifiziert – Peptide 18 (HCRQAYSVYAFMISLGGCLG), 22 (GLSAPSLSPHCCPCRARLAF) und 48 (VCLAAGITYVPPLLLEVGV). Diese Peptide wurden anschließend in den ELISPOT-Tests verwendet.
c) ELISPOT-Test
Platten wurden mit 15 μg/ml (in PBS) Ratte-Anti-Maus-INFγ oder Ratte-Anti-Maus-IL-2 (Pharmingen) beschichtet. Die Platten wurden über Nacht bei +4°C beschichtet. Vor der Verwendung wurden die Platten dreimal mit PBS gespült. Milzzellen wurden zu den Platten mit 4 × 10⁵ Zellen/Vertiefung hinzugegeben. In der Bibliotheskdurchmusterung identifizierte Peptide wurden erneut von Genemed Synthesis bestellt und mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml verwendet. CPC-P501S-Protein (GSKBio) wurde im Test mit 20 μg/ml verwendet. ELISPOT-Tests wurden in Gegenwart von entweder IL-2 (10 ng/ml), IL-7 (10 ng/ml) oder ohne Cytokin durchgeführt. Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung betrug 200 μl. Peptid-stimulierte Zellen enthaltende Platten wurden für 16 Stunden in einem befeuchteten 37°C-Inkubator inkubiert.
e) Entwicklung von ELISPOT-Testplatten
Zellen wurden aus den Platten durch einmaliges Spülen mit Wasser (mit 10 Minuten Tränken, um die Lyse der Zellen sicherzustellen) und dreimaliges Spülen mit PBS entfernt. Biotin-konjugiertes Ratte-Anti-Maus-INFγ oder IL-2 (Pharmingen) wurde mit 1 μg/ml in PBS hinzugegeben. Die Platten wurden unter Schütteln für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS vor Zugabe von Streptavidin alkalischer Phosphatase (Caltag) mit einer 1/1000-Verdünnung gespült. Nach drei Spülungen in PBS wurden Flecken durch Inkubation mit BCICP-Substrat (Biorad) für 15-45 min aufgezeigt. Das Substrat wurde unter Verwendung von Wasser abgespült, und man ließ die Platten trocknen. Flecken wurden unter Verwendung eines von Brian Hayes, Asthma Cell Biology-Einheit, GSK, entwickelten Bildanalysesystems gezählt.
1.3. ELISA-Test auf Antikörper gegen das P501S-Genprodukt
Serumproben wurden aus den Tieren durch Venenpunktion an den Tagen -1, 28, 49 und 56 erhalten und auf Gegenwart von Anti-P501S-Antikörpern getestet. Ein ELISA wurde unter Verwendung von Nunc Maxisorp-Platten durchgeführt, die über Nacht bei 4°C mit 0,5 μg/ml von CPC-P501S-Protein (GSKBio) in Natriumbicarbonatpuffer beschichtet wurden. Nach Spülen mit TBS-Tween (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, enthaltend 0,05% Tween 20) wurden die Platten mit Blockierungspuffer (3% BSA in TBS-Tween- Puffer) für 2 h bei Raumtemperatur geblockt. Alle Seren wurden mit einer 1:100 Verdünnung für 1 h bei RT in Blockierungspuffer inkubiert. Die Antikörperbindung wurde unter Verwendung von HRP-konjugierten Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulinen (#P0260, Dako) mit einer 1:2000 Verdünnung in Blockierungspuffer detektiert. Die Platten wurden erneut gespült und gebundenes Konjugat unter Verwendung von Fast OPD-Färbungsreagentien (Sigma, GB) detektiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3M Schwefelsäure angehalten und das OPD-Produkt durch Messung der Extinktion bei 490 nm quantifiziert.
1.4. Transiente Transfektionstests
Humane HP501S-Expression aus verschiedenen DNA-Konstrukten wurde durch transiente Transfektion der Plasmide in CHO-Zellen (Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters) nach Western Blotting an Gesamtzellprotein analysiert. Die transienten Transfektionen wurden mit dem Transfectam-Reagens (Promega) gemäß Herstelleranleitung durchgeführt. Kurz gesagt wurden Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen mit 5 × 10⁴ CHO-Zellen pro Vertiefung in 1 ml DMEM-Komplettmedium (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin 100 IU/ml, Streptomycin 100 μg/ml) geimpft und für 16 Stunden bei 37°C inkubiert. 0,5 μg DNA wurden zur 25 μl von 0,3 M NaCl (ausreichend für eine Vertiefung) hinzugegeben, und 2 μl Transfectam wurden zu 25 μl von Milli-Q hinzugegeben. Die DNA- und Transfectam-Lösungen wurden vorsichtig vermischt und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert. Während dieses Inkubationsschrittes wurden die Zellen einmal in PBS gespült und mit 150 μl serumfreiem Medium (DMEM, 2 mM L-Glutamin) bedeckt. Die DNA-Transfectam-Lösung wurde zu den Zellen getropft, die Platte vorsichtig geschüttelt und bei 37°C für 4-6 Stunden inkubiert. 500 μl DMEM-Komplettmedium wurden hinzugegeben und die Zellen für weitere 48-72 Stunden bei 37°C inkubiert.
2. Western-Blot-Analyse von CHO-Zellen, die transient mit P501S-Plasmiden transfiziert wurden
Die transient transfizierten CHO-Zellen wurden mit PBS gespült und mit einer Versene (1:5000)/0,025% Trypsinlösung zur Übertragung der Zellen in Suspension behandelt. Nach Trypsinisierung wurden die CHO-Zellen pelletiert und erneut in 50 μl PBS suspendiert. Ein gleiches Volumen von 2x NP40-Lysepuffer wurde hinzugegeben und die Zellen auf Eis für 30 Minuten inkubiert. 100 μl von 2x TRIS-Glycin-SDS-Probenpuffer (Invitrogen), der 50 mM DTT enthielt, wurden hinzugegeben und die Lösung für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. 1-20 μl Probe wurden auf ein 4-20%iges TRIS-Glycin-Gel mit 1,5 mm (Invitrogen) geladen und bei konstanter Spannung (125 V) für 90 Minuten in 1x TRIS-Glycin-Puffer (Invitrogen) elektrophoretisch behandelt. Ein vorangefärbter Breitbandmarker (New England Biolabs, #P7708S) wurde zur Größenbewertung der Proben verwendet. Nach Elektrophorese wurden die Proben auf Immobilon-P PVDF-Membran (Millipore) übertragen, vorbenetzt in Methanol, unter Verwendung eines Xcell III-Blot-Moduls (Invitrogen), mit 1x Transferpuffer (Invitrogen), der 20% Methanol enthielt und mit einer konstanten Spannung von 25 V für 90 Minuten. Die Membran wurde über Nacht bei 4°C in TBS-Tween (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, enthaltend 0,05% Tween 20) geblockt, das 3% getrocknete Magermilch enthielt (Marvel). Der primäre Antikörper (10³) wurde 1:1000 verdünnt und mit der Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach umfassendem Spülen in TBS-Tween wurde der sekundäre Antikörper (HRP-konjugierte Kaninchen-anti-Maus-Immunglobuline (#P0260, Dako)) mit 1:2000 in TBS-Tween, das 3% getrocknete Magermilch enthielt, verdünnt und mit der Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach umfassendem Spülen wurde die Membran mit Supersignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Pierce) für 5 Minuten inkubiert. Überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt und die Membran zwischen zwei Bahnen aus Klebeband versiegelt und für 1-30 Minuten mit Hyperfilm ECL-Folie (Amersham-PharmaciaBiotech) in Kontakt gebracht.
3. Erzeugung der humanen P501S-Expressionskassette voller Länge
Der Ausgangspunkt für die Konstruktion einer P501S-Expressionskassette war das Plasmid pcDNA3.1-P501S (Corixa Corp.), das ein pcDNA3.1-Gerüst (Invitrogen) aufweist, das eine humane P501S-cDNA-Kassette voller Länge enthält, kloniert zwischen die EcoRI- und NotI-Orte. Dieser Vektor wird auch als JNW673 bezeichnet. Die Gegenwart von P501S wurde durch Fluoreszenzsequenzierung bestätigt. Die Sequenz der cDNA-Kassette wird durch die NCBI/Genbank-Sequenz (Eingangs-Nr. AY033593) angegeben. Humanes P501S wurde aus JNW673-Matrizen-DNA PCR-amplifiziert, mit XbaI und SalI beschränkt und in die NheI/XhoI-Orte von pVAC kloniert, um den Vektor JNW680 zu erzeugen. Die korrekte Orientierung des Fragments relativ zum CMV-Promotor wurde durch PCR und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Sequenz der Expressionskassette ist in 12 gezeigt (SEQ ID NO: 17). Zur Konstruktion einer CPC-P501S-Expressionskassette wurde CPC-P501S aus dem Vektor pRIT15201 (siehe 7) PCR-amplifiziert, mit XbaI und SalI beschränkt und in die NheI- und XhoI-Orte von pVAC kloniert, wodurch Plasmid JNW735 erzeugt wurde. Die korrekte Orientierung wurde durch PCR und Sequenzierung bestätigt. Die Sequenz der CPC-P501S-Expressionskassette ist in 13 gezeigt (SEQ ID NO:18).
4. Expression von humanem P501S aus den Plasmiden JNW680 und JNW735
Die P501S-Expressionsplasimde wurden transient in CHO-Zellen transfiziert und ein Gesamtzelllysat wie in den Methoden beschrieben hergestellt. Ein Western Blot eines Gesamtzelllysats identifizierte einzelne Banden mit ca. 55 kDa und 62 kDa für Proben, die mit JNW680 bzw. JNW735 transfiziert wurden (21). Dies stimmt mit den vorhergesagten Molekulargewichten von 59,3 kDa und 63,3 kDa für P501S bzw. CPC-P501S überein. Die Addition des CPC-Markers beeinflußt die Expression von P501S nicht nachteilig.
5. Ergebnisse
5.1. Antikörperreaktionen auf humanes P501S nach PMID-Immunisierung
Die Antikörperreaktionen nach Immunisierung mit pVAC (leerer Vektor) und pVAC-P501S (JNW680) wurden durch ELISA nach einer primären Immunisierung durch PMID am Tag 0 und drei Auffrischungen am Tag 21 und Tag 42 und Tag 70 bewertet. 22 zeigt die Antikörperreaktionen aus Seren, die am Tag -1, Tag 28 und Tag 49 (Mäuse A1-3, B1-3) und Tag 56 (Mäuse A4-6, B4-9) entnommen wurden. Obwohl es einige nicht-spezifische Reaktionen auf den leeren Vektor pVAC gab, wurden Reaktionen auf das P501S-Konstrukt in 5 von 9 Mäusen beobachtet.
5.2. Identifizierung von neuen T-Zellepitopen aus humanem P501S in C57BL/6-Mäusen durch Duchmusterung einer P501S-Peptidbibliothek
Nach Immunisierung mit JNW680 (pVAC-P501S) durch PMID am Tag 0 und drei Auffrischungen am Tag 21 und Tag 42 und Tag 70 wurden ELISPOT-Tests am Tag 84 durchgeführt. Peptide aus der P501S-Bibliothek wurden mit 50 μg/ml Endkonzentration untersucht. Aus dieser anfänglichen Durchmusterung wurde festgestellt, daß drei Peptide die INFγ- und/oder IL-2-Sekretion stimulieren. Peptide 18, 22 und 48 (23). Diese Peptide wurden in anschließenden zellulären Tests verwendet.
5.3 Zelluläre Reaktionen auf pVAC-P501S (JNW680) nach PMID-Immunisierung
Die zellulären Reaktionen nach Immunisierung mit pVAC (leerer Vektor) und pVAC-P501S wurden durch ELISPOT nach einer primären Immunisierung durch PMID am Tag 0 und drei Auffrischungen am Tag 21, 42 und 70 bewertet. Die Tests wurden 7 Tage nach der Auffrischung durchgeführt. Zwei unterschiedliche Testbedingungen wurden verwendet: 1) Peptide 18, 22 und 48, identifiziert in der Peptidbibliotheksdurchmusterung, verwendet mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml, und 2) CPC-P501S-Protein, verwendet mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml. 24A zeigt, daß, obwohl es keine P501S-spezifischen Reaktionen auf den leeren Vektor gab (A4-6), das pVAC-P501S-Konstrukt spezifische INF-γ-Reaktionen gegen Peptide 18 und 22 in allen Mäusen (B6-9) induzierte, während eine Maus (B7) auch eine IFN-γ-Reaktion gegen Peptid 48 zeigte. 24B zeigt, daß alle Mäuse spezifische IL-2-Reaktionen gegen Peptide 18, 22 und 48 zeigten. Außerdem zeigten pVAC-P501S-immunisierte Mäuse (B6-9) auch moderate IL-2-Reaktionen gegen CPC-P501S, wohingegen die mit leerem Vektor immunisierten Mäuse (A4-6) keine Reaktionen zeigten.
5.4. Vergleich der zellulären Reaktionen gegen P501S und CPC-P501S nach PMID-Immunisierung
Die zellulären Reaktionen nach Immunisierung mit pVAC (leerer Vektor), pVAC-P501S (JNW680) und CPC-P501S (JNW735) wurden durch ELISPOT nach einer primären Immunisierung durch PMID am Tag 0 und Auffrischungen am Tag 21 und 42 bewertet. Die Tests wurden 7 Tage nach der Auffrischung durchgeführt. Zwei unterschiedliche Testbedingungen wurden verwendet: 1) Peptide 18, 22 und 48, identifiziert in der Peptidbibliotheksdurchmusterung, verwendet mit einer Endkonzentration von 50 μg/ml, und 2) CPC-P501S-Protein, verwendet mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml. 25 zeigt, daß am Tag 28 CPC-P501S gute IL-2-Reaktionen gegen 10 μg/ml von Peptid 22 induzierte, während es keine P501S-spezifischen Reaktionen gegen weder den leeren Vektor noch das pVAC-P501S gab. Diese Ergebnisse wurden auch unter Verwendung von CPC-P501S-Protein zur Restimulation der Milzzellen beobachtet. Am Tag 49 (nach der 2. Auffrischung) waren die durch P501S und CPC-P501S induzierten Reaktionen äquivalent. Diese Daten legen nahe, daß die Addition des CPC-Markers die Kinetik und/oder Stärke der Reaktion gegen P501S verbessert.
Beispiel IX. Immunitätsexperimente in Mäusen unter Verwendung von P501S-Protein + Hilfsstoffstudien
1. Konstruktion und Hilfsstofformulierung
Die durch Impfung unter Verwendung des rekombinanten gereinigten CPC-P501S-Proteins, formuliert in Hilfsstoffen, induzierte Immunreaktion wird in Experimenten charakterisiert, die in Mäusen durchgeführt werden. Gruppen von 5 bis 10 acht Wochen alten weiblichen C57BL6-Mäusen werden 2- bis 6-mal intramuskulär in 2-wöchigen Intervallen mit 10 μg des CPC-P501S-Proteins geimpft, formuliert in unterschiedlichen Hilfsstoffsystemen. Das verabreichte Volumen entspricht 1/10 einer Humandosis (50 μl). Die Serologie (Gesamt-Ig-Reaktion) und zelluläre Reaktion (T-Zell-Lymphproliferation und Cytokinerzeugung) werden an Milzzellen 6-14 Tage nach der letzten Impfung unter Verwendung von Standardprotokollen analysiert, wie beschrieben in C. Gérard et al., 2001, Vaccine 19, 2583-2589.
Die Daten eines repräsentativen Experiments sind gezeigt. Es schloß 5 Gruppen von 8 weiblichen C57BL/6-Mäusen ein, die 4 intramuskuläre Injektionen von CPC-P501 (10 μg) + Hilfsstoff (A, B, C) an den Tagen 0, 14, 28, 42 erhielten. Beispiel V liefert ein experimentelles Protokoll, wie die Formulierungen durchzuführen sind. Kurz gesagt sind die Hilfsstofformulierungen wie folgt (Mengen für eine Dosis von 100 μl angegeben):

– Hilfsstoff A: QS21 (10 μg), MPL (10 μg) und CpG7909 (100 μg), hergestellt gemäß dem in WO 00/62800 offenbarten Verfahren;
– Hilfsstoff B: Formulierung aus QS21 (20 μg), MPL (20 μg), CpG7909 (100 μg) und 50 μg SB62 Öl-in-Wasser-Emulsion ( WO 95/17210 );
– Hilfsstoff C: Formulierung aus QS21 (10 μg), MPL (10 μg), CpG7909 (100 μg) und 10 μl SB62 Öl-in-Wasser-Emulsion ( WO 99/12565 ).

2. Serologie
Die durch Impfung induzierte Ig-Gesamtreaktion wurde durch ELISA unter Verwendung von entweder CPC-P501 oder RAl2-P501 (C-Terminus, das eine trunkierte Form des P501-Proteins ist, entsprechend dem C-Terminus des Proteins, fusioniert an seinem N-Terminus an ein aus TB stammendes Protein RAl2; Ra12 stammt aus MTB32A-Antigen, beschrieben in Skeiky et al., Infection and Immun. (1999)67:3998-4007) gemessen.
Die mit Hilfsstoff versetzten CPC-P501S-Proteine ergeben eine gute Antikörperreaktion nach Impfung.
3. Zelluläre Reaktion
3.1. Lymphproliferation
7 Tage nach der letzten Impfung wurde die Lymphproliferation an Milzzellen individuell durchgeführt. 2 × 10⁵ Milzzellen wurden 4-fach in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen in RPMI-Medium ausplattiert, das 1% normales Mäuseserum enthielt. Nach 72 Stunden Restimulation mit entweder Immunogen (CPC-P501) oder trunkiertem Protein (RAl2-P501) in unterschiedlichen Konzentrationen wurde 1 μCi 3H-Thymidin (Amersham 5 Ci/ml) hinzugegeben. Nach 16 Stunden wurden die Zellen auf Filterplatten geerntet. Aufgenommene Radioaktivität wurde in einem β-Zähler gezählt. Die Ergebnisse werden in CPM oder als Stimulationsindizes* (geometrischer Mittelwert CPM in Kulturen mit Antigen/geometrischer Mittelwert CPM in Kulturen ohne Antigen) ausge drückt. Restimulation mit ConA (2 μg/ml) als Positivkontrolle wurde als Positivkontrolle eingeschlossen.
Wie in 26 gezeigt wird, wird eine P501-spezifische Lymphproliferation in der Milz aller Gruppen von Mäusen beobachtet, die das mit Hilfsstoff versetzte Protein nach In-vitro-Restimulation mit entweder Immunogen oder einem anderen P501-Protein, das in einem Expressionssystem (E. coli) hergestellt wurde, beobachtet, was anzeigt, daß T-Zellen in vivo durch die Impfung vorbereitet wurden.
3.2. IFNγ-Produktion, gemessen durch intrazelluläre Anfärbung von Milzzellen
Dendritische Knochenmarkszellen (BMDC), erhalten nach Kultur von Mäuse-PBL für 7 Tage in Gegenwart von GMCSF.
7 Tage nach der letzten Impfung werden Milz- oder PBL-Zellen aufgefangen und eine Zellsuspension hergestellt. 10⁶ Zellen (1 Sammlung pro Gruppe) wurden für +/– 18 h mit 10⁵ BMDC inkubiert, gepulst über Nacht mit 10 μg/ml von entweder CPCp-501-Protein oder RAl2. Nach Behandlung mit dem 2.4.G.2-Antikörper wurden Milzzellen mit fluoreszierenden Anti-CD4- und -CD8-Antikörpern (Anti-CD4-APC und ein Anti-CD8PerCP) angefärbt. Nach einem Permeabilisierungs- und Fixierungsschritt wurden die Zellen mit einem fluoreszierenden Anti-INFγ-FITC-Antikörper angefärbt.
In mit CPC-P501 in unterschielichem Hilfsstoff geimpften Mäusen wird gezeigt, daß sowohl CD4- als auch CD8-T-Zellen INFγ als Reaktion auf DC erzeugen, gepulst mit entweder dem Immunogen oder dem C-terminalen p501, hergestellt in E. coli (wie gezeigt durch intrazelluläre Anfärbung von Milz und PBLs). Es gibt eine 4-10-fache Zunahme des Prozentwertes der Zellen, die dieses Cytokin herstellen, in den Gruppen, die das mit Hilfsstoff versetzte CPC-P501S erhalten, verglichen mit dem Protein allein, und es wird gezeigt, daß 0,1 bis 10% der CD4- oder CD8-T-Zellen INFγ erzeugen.
Diese Daten erlauben die Schlußfolgerung, daß das mit Hilfsstoff versetzte CPC-P501-Protein immunogen in Mäusen ist. Sowohl eine P501-spezifische humorale als auch zelluläre Reaktion, einschließlich INFγ-Erzeugung durch CD4- und CD8-T-Zellen, kann nach mehrfacher intramuskulärer Impfung mit CPC P501 in Hilfsstoffen detektiert werden.
Beispiel X. CPC-MUC-1-Konstrukte und Sequenzen
Die CPC-Sequenz wird aus Nukleotid SEQ ID NO:28 entnommen. Die MUC1-Sequenz ist aus der Genbank-Datenbank erhältlich (Eingangs-Nr. NM_002456).
1. MUC-1-CPC-Konstrukt
Aufgrund der Gegenwart einer Signalsequenz in MUC1, die posttranslational abgespalten wird, wurde das CPC-Motiv am C-Terminus plaziert. Die resultierende MUC-1-CPC-DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO:xx (28A) und die entsprechende MUC1-CPC-Proteinsequenz in SEQ ID NO:yy (28B) dargestellt.
2. ss-CPC-MUC1-Konstrukt
Aufgrund der Gegenwart einer Signalsequenz in MUC1, die posttranslational abespalten wird, wurde die MUC1-Signalsequenz durch eine heterologe Leitsequenz (aus der schweren Kette von Humanimmunoglobulin) ausgetauscht, und das CPC-Motiv wurde zwischen die heterologe Leitsequenz und die MUC1-Sequenz inseriert, was eine als ss-CPC-MUC1 bezeichnete Sequenz erzeugte, wie in 29 dargestellt. Sequenzprotokoll

Claims

Fusionspartnerprotein, das eine Cholin-Bindungsdomäne und ein heterologes promiskes T-Helferepitop umfaßt.
Fusionspartnerprotein gemäß Anspruch 1, worin die Cholin-Bindungsdomäne der C-Terminus von LytA oder ein Derivat davon ist, worin das Derivat des C-Terminus von LytA sowohl die Fähigkeit zur Funktion als immunologischer Partner als auch als Expressionsverstärker bewahrt.
Fusionspartnerprotein gemäß Anspruch 2, worin das C-LytA oder Derivat davon wenigstens vier Repeats aus einem beliebigen aus SEQ ID NO:1 bis 6 umfaßt.
Fusionspartnerprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Cholin-Bindungsdomäne aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgendes umfaßt: a) die C-terminale Domäne von LytA wie in SEQ ID NO: 7 dargestellt; oder b) die Sequenz von SEQ ID NO: 8; oder c) eine Peptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85% Identität, bevorzugt wenigstens 90% Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95% Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97-99% Identität mit einem beliebigen aus SEQ ID NO: 1 bis 6 umfaßt; oder d) eine Peptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 8 umfaßt.
Fusionsprotein, das ein Fusionspartnerprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein heterologes Protein umfaßt.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 5, worin das heterologe Protein chemisch an den Fusionspartner konjugiert ist.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 5 oder 6, worin das heterologe Protein aus einem Organismus stammt, der aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: humanes Immundefizienzvirus HIV-1, humane Herpes simplex-Viren, Cytomegalovirus, Rotavirus, Epstein-Barr-Virus, Varicella Zoster-Virus, aus einem Hepatitisvirus wie Hepatitis B-Virus, Hepatitis A-Virus, Hepatitis C-Virus und Hepatitis E-Virus, aus respiratorischem Synzytialvirus, Parainfluenzavirus, Masernvirus, Mumpsvirus, humane Papillomaviren, Flaviviren oder Influenzavirus, aus Neisseria spp., Moraxella spp., Bordetella spp., Mycobaterium spp., einschließlich M. tuberculosis; Escherichia spp., einschließlich enterotoxisches E. coli; Salmonella spp.; Listeria spp.; Helicobacter spp.; Staphylococcus spp.; einschließlich S. aureus, S. epidermidis; Borrelia spp.; Chlamydia spp., einschließlich C. trachomatis, C. pneumoniae; Plasmodium spp., einschließlich P. falciparum; Toxoplasma spp., Candida spp.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 5 oder 6, worin das heterologe Protein ein Tumor-assoziiertes Protein oder gewebespezifisches Protein oder immunogenes Fragment davon ist.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 8, worin das heterologe Protein oder Fragment davon ausgewählt ist aus MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2, SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, Prostein, P501S, HASH2, Cripto, B726, NY-BR1.1, P510, MUC-1, Prostase, STEAP, Tyrosinase, Telomerase, Survivin, CASB616, P53 oder her 2 neu.
Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, das ferner einen Affinitätsmarker mit wenigstens 4 Histidinresten umfaßt.
Nukleinsäuresequenz, die ein Protein gemäß Anspruch 1 bis 10 codiert.
Expressionsvektor, der eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 11 umfaßt.
Wirtszelle, die mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 11 oder mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 12 transformiert ist.
Immunogene Zusammensetzung, die ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 11 und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfaßt.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, die zusätzlich einen TH-1-induzierenden Hilfsstoff umfaßt.
Immunogene Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, worin der TH-1-induzierende Hilfsstoff aus der Gruppe von Hilfsstoffen ausgewählt ist, die 3D-MPL, QS21, eine Mischung aus QS21 und Cholesterol, ein CpG-Oligonukleotid oder eine Mischung aus zwei oder mehreren der Hilfsstoffe umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, das das Vermischen des Fusionsproteins gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10 oder des codierenden Polynukleotids gemäß Anspruch 11 mit einem geeigneten Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, das das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 13 unter Bedingungen, die ausreichend zur Herstellung des Fusionsproteins sind, und das Gewinnen des Fusionsproteins aus dem Kulturmedium umfaßt.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder DNA-Sequenz gemäß Anspruch 11 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 11 in der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zum Hervorrufen einer Immunreaktion in einem Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 20, worin die Immunreaktion durch aufeinanderfolgende Verabreichung i) des Proteins, gefolgt von der DNA-Sequenz; oder ii) der DNA-Sequenz, gefolgt vom Protein hervorgerufen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 21, worin die DNA-Sequenz auf biologisch abbaubaren Perlen aufgetragen ist oder über einen Partikelbombardierungsansatz übertragen wird.
Verwendung gemäß Anspruch 21 oder 22, worin das Protein mit Hilfsstoff versetzt ist.
Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 11 in der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur immuntherapeutischen Behandlung eines Patienten, der an Krebs leidet oder dafür anfällig ist.
Verwendung gemäß Anspruch 24, worin der Krebs Prostatakrebs, Darmkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs oder Melanom ist.