TW200400970A - Immunogenic compositions - Google Patents

Description

200400970 玫、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關融合體配對，其 亡I主B j无作兄疫融合體配對， 无作表現加強子，及較好是有二 政nn L θ 刀月匕 < 融合體配對。本 每月也疋有關含彼之融合蛋白質， , . m ^灰去’在疫苗及醫 术奴用途。特別是提出含有所謂 厂配對，如融合體含有來自肺炎鏈球菌之或 球菌噬菌體CP1溶菌酶（CPL1)，並中fg A 奴a ; 千膽鹼結合功能部位經修 可。括—個異源的厂輔助細胞抗原決定部位。此融合體 配對已示出可改善與之黏附之異源蛋白質之表現水平，且 當融合至可另外充作疫苗抗原之免疫原性較差之蛋白質或 肽時特別有利用價值。較特別地，此融合體配對可應用於 含有自體-抗原之構築，如腫瘤特異的或組織特異的抗原。 【先前技術】 肺炎鏈球菌可合成Ν乙醯基_L_丙胺酸醯胺酶，一 種自落素，其可特異地降解細胞壁之肽聚醣骨架，最終導 致細胞溶解。其多肽鏈有二個功能部位。NH力能部位 負責催化活性，而LytA之C-末端功能部位負責與膽鹼之親 和力’及勾附至細胞壁。已知此。_末端功能部位可與膽鹼 及膽鹼類似物結合，且也可與三級胺結合，如常用於層析 之DEAgp乙基胺基乙基）。

LytA是一種318胺基酸之蛋白質，且c·末端部份含2〇或21 個胺基酸之六個不完全重複子之縱列，及一個短的c〇〇H_ 末端尾部。重複子位在以下位置：

85702 200400970 R1 ： 177-191 R2 : 192-212 R3 : 213-234 R4 : 235-254 R5 : 255-275 R6 : 276-298 這些重複子預計呈β-轉構型。C-末端負責與膽鹼結合。 另外’ CPL1之C -末端負貴結合親和力，且在重複子中之芳 族殘基負責此結合功能。這些蛋白質已被充作親和力標幟 以供快速純化（Sanchez Puelles, Eur J Biochem. 1992, 203 153-9)。 其他具有膽鹼-結合功能部位之蛋白質，在肺炎鏈球菌中 也有所研究。 其一，PspA(或肺炎球菌表面蛋白質a)，是一種具毒力之 因子（Yother J and Briles (1992) J Bacteriol 174 (2) p 601)。 此蛋白質具抗原性及免疫原性。其有一個由1 0個20胺基酸 重複子組成之C-末端功能部位，與LytA重複子類似。

CbpA(或膽鹼-結合蛋白質A)涉及肺炎球菌與人類細胞之 黏附（Rosenow et al (1997) Mol Microbiol 25(5) p 819)。已示 出在C-末端功能部位中i〇個2〇胺基酸重複子和pSpA的幾乎 相同。—

LytB及LytC具有與上述蛋白質不同的調控結構，因其膽 鹼-結合功能部位分別由1 5個重複子及1 1個重複子組成，係 位在 N-末端而非 C-末端（Garcia P Mol Microbiol (1999) 31(4) 85702 200400970 pl275 及 Garcia P et al (1999) Mol Microbiol 33(1) P128)。序 列比車父則顯示LytB有葡糖醯胺酶活性。LytC則示出試管内 之洛菌細-式活性。另外，稱為pepA ’ PepB及pepC的三個基 因則在1995年已被選殖。雖然其功能未知，此三個基因也 有與LytA類似的不同數目的重複子。 在其感染週期，噬菌體合成胞壁質水解酶，有助於其通 透至細菌内。這些水解酶具有膽鹼-結合功能部位。噬菌體 Cp-Ι之胞壁質酶（CPL1)已被充分研究。其中6個20胺基酸之 重複子位在C-末’涉及與膽驗特異的確認（Garica j. l. J.

Virol 61(8) p2573-80; (1987)及 Carcia E Prol Natl Acad Sci (1988)p914)。由LytA及CPL1重複子之比較，可使這些重複 子最初之一致性可製成。 嗤菌體Dp-1之胞壁質水解酶（Garcia P et al (1983) J Gen Microbiol 129(2) p489 > Cpl-9 (Garcia P et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 158(1) p251 - HB-3 Romero et al 1990 J Bacteriol 172(9) p 5064-5070)^ EJ-1 Diaz (1992) J Bacteriol 174(17) p 5516)，也示出膽鹼-結合功能部位之特性。 此特性也為CP-1 ’ 一種肺炎球菌噬菌體所編碼之溶菌酶 所共有。WO 99/10375特別描述人類乳頭狀瘤病毒蛋白質E6 或E7連接至LytA之His標幟及C-末端部位（在此稱C-LytA)， 且經由1別親和力層析法純化蛋白質。W〇 99/401 88特別描 述含有MAGE抗原加上His尾及在分子Ν·末端有c_LytA部份 之融合蛋白質。 目前頃驚訏地發現，依據本發明之融合體配對，當與異 85702 200400970 源蛋白質融合時可加強所黏附之異源蛋白質之免疫原性。 也發現’ t可加強與之黏附之異㈣白質之表現水平。本 4月口此楗出一種經改吾的免疫融合體配對之較佳具體實 例’其也可充作表現加強子。 【發明内容】 因此本發明包括一種融合體配對分子，其包括膽鹼結合 功能邵位或其片段或其類似物，及異源的混雜T輔助細胞抗 原夬疋部位，較好是混雜的MHC 1；[類τ_抗原決定部位。該 融合體配對有可充作免絲合體"或充作表現加強子的 犯力，且較好有免疫配對及表現加強子二者之能力。混雜 的τ辅助細胞抗原決定邵位是可與一個以上廳C Η類對偶 基因結合之抗原決定部位，較好是3個MHC II類對偶基因。 特別地此抗原決定部位在可表現各種MHc單一型式之大量 個中可§秀出輔助τ細胞反應。視所需，融合蛋白質可保有 其與膽鹼結合之能力。 在—較佳具體實例中，膽鹼結合部位係衍自LytA之C末 續。較好C-LytA或衍生物含有如圖1所示（SEQ ID ΝΟ:1至6) 之任重複子R1至R6之至少4個重複子。在最佳具體實例 中，C-LytA自胺基酸177_298延伸，其含有第一重複子之部 份及其他5個重複子之全部。 在本發明之另一方面，在此提出如此中定義之融合體配 對，其進一步含—種異源蛋白質。異源蛋白質可化學共軛 或可稠合至融合體配對。較好異源蛋白質是與腫瘤有關之 抗原或其免疫原片段。 85702 200400970 在本發明〈另—方面，在此提出編碼如此中定義之蛋白 ^之核&L序列。在此也提出含有該核酸之表現載體，及為 該核酸或載體轉形之宿主。 在本發明〈另—方面，在此提出一種免疫原組合物，其 含如此中所述之蛋白質或核酸序列，及醫藥上可接受之賦 形劑，稀釋劑或載劑。較好’免疫原性組合物進一步含Th_ 1 誘導性佐劑。 又在另一具體實例，本發明提出免疫原性組合物或蛋白 質及核酸可用於醫藥上。特言之，在此提出本發明之蛋白 質或核酸，可製成藥物以誘生病人之免疫反應，或可用於 治療或預防感染性疾病或癌症。 本發明進一步提出治療罹患有感染性疾病或癌症患者之 方法’特別是乳房’肺（特別是非-小細胞肺癌）、結腸直腸， 卵巢，前列腺’胃及其他GI(胃腸道）之腫瘤，此方法係投 予安全且有效劑量之此中所述之組合物或核酸。 又在另一具體實例中，本發明提出產製如此中所述之免 疫原組成物之方法’此方法包括混合本發明之核酸或蛋白 質與醫藥上可接受之賦形劑，稀釋劑或載劑。 【實施方式】 如此中所述，本發明的一個具體實例是經修飾的膽鹼結 合功能部位（融合體配對）’其具有充作表現加強子之能力， 且所生成之融合蛋白質和未融合蛋白質比較下，可以較高 產率在宿主細胞中表現，較好產率高於約1 00%(2倍以上高 出）或150%或以上，此可由SDS-PAGE測度繼之以考馬式藍 85702 •10- 200400970 染色或銀染色，視所需再加上凝膠之掃描。依據本發明的 經修飾的膽鹼結合功能部位也具有充作免疫配對之能力， 且所生成之融合蛋白質加上異源蛋白質和未融合之異源蛋 白質比較，前者在宿主中更具免疫原性。 在本發明另一具體實例中，經修飾的膽鹼結合功能部位 有充作免疫融合體配對之能力，使融合蛋白質和單獨異源 蛋白質比較下前者可得加強之免疫反應。 又在較佳具體貪例中’經修飾的膽驗結合功能部位具 有可充作免疫融合體配對及表現加強子之雙重功能。 在本發明較佳具體實例中，膽鹼結合部份係衍生自LytA 之C末鮞。較好c-LytA或衍生物含有至少二個重複子，較好 至少四個重複子。在本文中，c_LytA衍生物指依據本發明 之C-LytA變型，且保有充作免疫配對及表現加強子二種能 力。較佳的變型包括如其胺基酸序列與圖1所示之重複子R1 至R6任一者有至少85%同質性，較好至少9〇%同質性，又較 好至少95%同質性，更好至少97_99%同質性（Seq iD N〇:1 至6)之肽’或所含之胺基酸序列與圖1所示之胺基酸序列有 至少15，20，30，40，50或1〇〇個連續的胺基酸之肽（SEq ID ΝΟ:1 至 8)。 因此’在本發明一個方面是提出融合體配對蛋白質，其 含經修_的膽鹼結合功能部位及異源的雜混T辅助細胞抗 原決定部位’其中膽驗結合功能部位選自下列各組，包括： a) LytA之C-末端功能部位，如SEq ID n〇:7所示； b) SEQ ID N〇:8之序列； 85702 -11 - 200400970 c) 一段肽序列，其胺基酸序列與SEQ ID NO: 1至6任一者有 至少85%同質性，較好至少90%同質性，又較好至少95% 同質性，最好至少97-99%同質性； d) 一段肽序列，其所含之胺基酸序列與SEQ ID N0:7或SEQ ID NO:8之胺基酸序列有至少15，20，30，40，50或100 個連續的胺基酸。 在一個最佳具體實例中，C-LytA由胺基酸177-298延伸， 其含有部份的第一重複子及完全的其他五者，如圖1所示。 融合體配對的第二組份，異源的T-細胞抗原決定部位較 妤選自可與許多個體結合之抗原決定部位群，此個體可在 人類中表現一個以上的MHC II分子。例如，特指之抗原決 定部位為來自破傷風類毒素之P2及P30抗原決定部位， Panina-Bordignon Eur. J. Immunol 19(12)，2237 (1989)。在一 個較佳具體實例中，異源的T -細胞抗原決定部位是來自破 傷風類毒素之P2或P30。 P2抗原決定部位具有序列QYIKANSKFIGITE，且相當於 破傷風毒素之胺基酸830-843。P3 0抗原決定部位（破傷風毒 素殘基 947-967)具有序列 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE。 FNNFTV序歹1J可視所需冊1除。其他通常的T抗原決定部位可 衍生自惡性癔原蟲（Plasmodium falciparum)之彎曲子孢子蛋 白質（circumsporozoite)-特別是有序列 DIEKKIAKMEKASS VFNVVNS之區域 378-398(Alexander J. (1994) Immunity 1(9)， p 75 1 -761)。另一抗原決定部位係衍自麻疹病毒融合蛋白 質，具有序列LSEIKGVIVHRLEGV之殘基288-302處 85702 -12 - 200400970

(Partidos CD，1990, J, Gen. Virol 71(9) 2099-2105)。又另一 抗原決定部位係衍自B型肝炎表面抗原，特別是具有序列 FFLLTRILTIPQSLD之胺基酸。另一抗原決定部位組衍自白 喉毒素。這些肽類中有四者（胺基酸271-290，321-340， 33 1 -350，35 1-370)定輿圖在毒素B片段之T功能部位，另2 者定舆圖在R功能部位（4 1 1-430，43卜450): PVFAGANYAAWAVNVAQVI VHHNTEEIVAQSIALSSLMV QSIALSSLMVAQAIPLVGEL VDIGFAAYNFVESII NLFQV QGESGHDIKITAENTPLPIA GVLLPTIPGKLDVNKSKTHI (Raju R., Navaneetham D., Okita D., Diethelm-Okita B., McCormick D., Conti-Fine B. M. (1995) Eur. J. Immunol. 25: 3207-14) 〇 異源的T -抗原決定部位較好稠合至含有至少4個重複 子’較好包括2-5個重複子之C-LytA。接下來一個以上的重 複子可視所需稠合至T-抗原決定部位的C-末端。另外，異 源的T-抗原決定部位較好嵌入含有共至少4個重複子之 C-LytA二個相繼重複子之間，或嵌入含有共至少4個重複子 之C-LytA重複子之一内。又較好，C-LytA含有6個重複子， 且異源的抗原決定部位嵌入C-LytA第六個重複子之内及之 啟始處。 在另一方面，本發明進一步提出融合蛋白質，其含至少 85702 -13 - 200400970 一個如上述之多肽，以及編碼此融合蛋白質之多核苷酸’ 通常呈醫藥組合物型式’如疫苗组合物，並含有生理上可 接受之載劑及/或免疫刺激劑。因此，自體-蛋白質或其他 免设原性不良蛋白質’可融合至所生成之融合體配對之N 或C任一末端。另外，自體蛋白質或免疫原性不良的蛋白質 可嵌入融合配體内。在一個視所需具體實例中，組胺酸標 幟玟至少4個，較好超過6個組胺酸殘基，可融合至免疫原 性不良蛋白質之另一末端。如此蛋白質可利用親和力層析 步¥純化，因為組胺酸尾部，通常含有至少4個，較好6個 以上殘基，可結合至金屬離子，因此適合固化有金屬之金 屬離子親和力層析（IMAC)。 因此典型的構築包括： -免疫原性不良的蛋白質_C_LytA重複子抗原決定 部位（寂入或取代C-LytA重複子5)_C-LytA重複子6 _ C-LytA重複子W-P2抗原決定部位（嵌入或取代c_LytA 重複子5)-C-LytA重複子6_免疫原性不良的蛋白質 免疫原性不良的蛋白質_C_LytA重複子2 5_p2抗原決定 部位（嵌入C-LytA重複子6内） • C-LytA2.54-P2抗原決定部位（嵌入c_LytA重複子6卜免疫 原性不良的蛋白質 •免疫原性不良蛋白質C_LytA重複子Μ-ρ〗抗原決定部位 -丧入C-LytA重複子6 -C-LytA重複子nP2抗原決定部位_嵌入c_LytA重複子6_ 尤疫原性不良的蛋白質 85702 14 200400970 -免疫原性不良的蛋白質-Pi抗原決定部位嵌入C-LytA重 複子i-C-LytA重複子2 5 -P2柷原決定部位嵌入C-LytA重複子「c-LytA重複子2_5-免疫原性不良的蛋白質 -兄疫原性不良的蛋白質·Ρ2抗原決定部位嵌入C-LytA重 複子rC-LytA重複子2.6 '?2抗原決定部位嵌入C_LytA重複予「C-LytA重複子2.6-免疫原性不良的蛋白質 _免疫原性不良的蛋白質-C-LytA重複子「P2抗原決定部 位嵌入C-LytA重複子^C-LytA重複子3·6 -c-LytA重複子i-P2抗原決定部位嵌入c_LytA重複子2_ C-LytA重複子3·6_免疫原性不良的蛋白質； 其中”兹入”表示在任何位置嵌入重複子，如介於第丨及之殘 基間’或介於2及3之間等。 混雜的T輔助細胞抗原決定部位可嵌入重複子區域内，如 C-LytA重複子2.5_C-LytA重複子κι抗原決定部位_c_LytA 重複子α，其中P2抗原決定部位嵌入第六個重複子（見圖Μ ^ 在另一具體實例中，CPL12C—末端（c_cpL1)也充作另— C-LytA 〇 另外’在以上構築中之P2抗原決定部位可以另外的混雜T 抗原決定部位，如P30取代。在本發明的具體實例中，二個 以上的混雜抗原決定部位為融合構築的一部份。然而，融 合配體儘可能保持愈小愈好，因此可限制可能會干擾CD8 + 及B抗原決定部位之數目。因此融合體配對較好不超過 85702 •15- 200400970 100-1 40個胺基酸，較好不超過12〇個胺基酸，典型為約ι〇〇 個胺基酸。 融合體配對所融合之抗原可來自細菌，病毒，原生動物， 真菌或哺乳動物，包括人類來源。 本發明之融合體配對較好融合至自體抗體，如與腫瘤相 關或組織特異的抗原，如前列腺，乳房，結腸直腸，肺， 胰襄’卵巢，腎臟或黑色素瘤癌。該自體或腫瘤抗原之片 段’可明白地用於融合至本發明之融合配體。通常片段可 含有至少20個，較好50，又較好1 〇〇個全長序列之連續胺基 酸。通常此片段可缺乏一個以上的穿膜功能部位，或可在 N-末端或 C-末端有約3，5，8，10，15，20，28, 33，50, 54個胺基奴之刪除。此片段當適當地存在時，可產生可確 認全長蛋白質之免疫反應。本發明特別可說明之多肽包括 至少10個連續胺基酸之序列，較好2〇個，又較好3〇，4〇， 50 ’ 60，70，80，90 ’ 100 ’ 110，120，130，14〇，15〇，16〇， 1 70 ’ 180個胺基酸之腫瘤相關或组織特異蛋白質稠合至融 合||配對。 本發明之多肽具免疫原性，即，其可在免疫分析法中（如 ELISA或T-細胞刺激分析）與來自有隱性表現癌症之患者之 抗血清及/或T-細胞’可偵測地反應。利用精藝者熟知之技 術可進行免疫活性之篩選。例如，此種篩選法可利用Had〇w and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988所述的進行。在一個說明實例中， 多肽可固化在固相載體上’與病人血清接觸，以人血'、土中 85702 -16- 200400970 之抗體與經固化之多肽結合。未結合之血清再移除，而結 合上之抗體利用12)1_標記之蛋白質A偵測。如精藝者所確認 的’腫瘤相關的或腫瘤特異抗原之免疫原部份，也包括在 本發明中。如此中所用的”免疫原部份"是一片段，其本身 可與辨識多肽之B-細胞及/或T-細胞表面抗原受體發生免 疫反應（特異性結合）。免疫原部份通常可利用熟知之技術鑑 足’如 Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven press，！ 993)及此中參考文獻所综合的。此技術包括 針對與抗原-特異的抗體，抗血清及/或Τ-細胞株或純系反應 之邊力來篩選多肽。如此中所用的’抗血清及抗體，若可 與抗原特異地結合即為"抗原特異的"（即其可在ELISA中 與蛋白質反應’或其他的免疫分析法，且與不相關蛋白質 不會可測及地反應）。此抗血清及抗體可如此中所述地製 備’且利用熟知的技術。在一個較佳具體實例中，多肽之 免疫原部份是可與抗血清及/或T-細胞反應之部份，其水平 貫質上並不少於全長多肽之反應性（如在ELIS A及/或T-細 胞反應性分析中）。較好，免疫原部份之免疫原活性水平至 少約50°/〇，較好至少約70%且最好大於約全長多肽免疫原性 之90°/。。在某些例子中，可鑑定出較佳的免疫原部份，其 免疫原活性水平大於相當的全長多肽之活性，如有約1〇〇0/〇 或1 5 0 %或以上之免疫原活性。 在其他某些具體實例中，可供說明之免疫原部份包括其 N-末端領導子序列及/或穿膜功能部位已被刪去之肽。其他 可供說明之免疫原邵份相較於成熟蛋白質，含小的N-及/或 85702 -17- 200400970 C-末端刪除（如約1-50個胺基酸’較好約1-30個胺基酸’更 好約5 -1 5個胺基酸）。 供示範之抗原或由彼衍生之片段包括MAGE 1 ’ MAGE 3 及MAGE 4或其他MAGE抗原，如在WO 99/40188中所指示’ PRAME (WO 96/10577)，BAGE，RAGE，LAGE l(WO 98/3 285 5)，LAGE 2(也知為 NY-ESO-卜 WO 98/14464)，XAGE (Liu et al, Cancer Res, 2000, 60:4752-4755 ； WO 02/18584) SAGE，及 HAGE (WO 99/53061)或 GAGE (Robbins and

Kawakami, 1996，Current Opinions in Immunology 8，pps 628-636 ； Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997年陳述）；C〇rreale et al. (1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293。確 實這些抗原可在各樣腫瘤型式中表現，如黑色素瘤’肺癌’ 肉瘤及膀胱癌。 在較佳具體實例中，利用到前列腺抗原，如前列腺特異 抗原（PSA)，PAP，PSCA (PNAS 95(4)，1735-1 740，1998)， P S Μ A或已知為前列腺酶之抗原。 在一特佳具體實例中，前列腺酶抗原是P5 01S戒其片段。 P501S ’ 也稱為前列素（prostein)(Xu et al.，Cancer Res· 61， 2001，1563-1 568)，是 WO 98/37814 中 SEQ ID N〇:113 ’ 且是

553胺基酸之蛋白質。免疫原片段及其部份含有炱少20個’ 較好5〇個，又較好100個連續的胺基酸，如以上參考專利中 所揭示，且特別為本發明所涵蓋。較佳的片段揭示於WO 98/50567(PS108抗原）且為與前列腺癌有關之蛋白質（SEQ 85702 • 18 · 200400970 ID N〇:9於WO 99/67384)。其他較佳的片段為全長？5018蛋 白質之胺基酸5 1 -5 5 3，34-5 53或5 5-5 53。特別地，構築1，2 及3(見圖2’ SEQIDNOs:27-32)明白地被企求，且可在酵母 系統中表現，如編碼此多肽之DNA序列可在酵母系統中表 現。 前列腺酶（prostase)是一種前列腺-特異的絲胺酸蛋白酶 (類-胰蛋白酶），長254個胺基酸，有固有的絲胺酸蛋白酶催 化三元H-D-S ’及一段胺基-末端前-原肽序列，顯示出潛在 的分A#*(P.Nelson,LuGan，C.Ferguson，P.Moss，R. Linas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of. prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad· Sci· USA (1999) 96, 31 14-3119)。推想的糖基化作用位 置已有描述。所預測的結構和其他已知的絲胺酸蛋白酶極 類似’顯示’成熟的多肽可折疊成單一功能部位。成熟的 蛋白質長224個胺基酸，有一個A2抗原決定部位顯示可自然 地處理修飾。前列腺酶核誓酸序列及所推衍之多肽序列及 同系物，揭示於Ferguson et al· (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3 1 14-3119)及國際專利案No. WO 98/12302(及相當 的專利案US 5，955,306)，WO 98/201 1 7(及相當的專利案US 5,840,871及US 5,786，148)(前列腺-特異的激肽釋放酶 (kallikrein))及 WO 00/04149(P703P)。 其他前列腺特異抗原，可知自WO 98/37418，及WO/ 004149。另一者是 STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)。 85702 -19- 200400970 可用於本發明内容中其他有用的腫瘤相關抗原包括： Plu-1 J Biol. Chem 274(22) 15633-15645, 1999, HASH-1 - HASH-2(Alders, M. et al., Hum. Mol. Genet. 1997, 6, 859-867) 5 Cripio (Salomon et al. Bioessays 199, 21 61-70, US Pat. 5654140) ^ CASB616(WO 00/53216) - Criptin(US 5,981,215) 〇 另外，和癌症治療中之疫苗特別相關的抗原也包括酪胺酸 酶，端粒 i每，P53，NY-Brl.l (WO 01/47959)及其片段，如 在 WO 00/43420中所述，B726(WO 00/60076, SEQ ID nos 469 及 463 ; WO 01/79286，SEQ ID nos 474及 475)，P510 (WO 01/34802 SEQ ID nos 537及 538)及存活素（survivin)。 本發明也可組合以乳癌抗原，如Her-2/neu，mammaglobin (US Pat. 5668,267) > B305D(WO 00/61753 SEQ ID nos 299 > 304，305及 315)，或揭示於 WO 00/521 65，WO 99/33869， WO 99/19479，WO 98/45328。Her-2/neu抗原尤其在US Pat. 5,801,005 中揭示。較好，Her-2/neu包括完整的細胞外功能 部位（含有約胺基酸1 - 6 4 5)或其片段，及至少是免疫原邵份 或整個細胞外功能部位大約是C-末端580個胺基酸。特別 地，細胞外部份應包括磷酿化作用功能部位或其片段。此 構築揭示於WO 00/44899。特佳的構築已知為ECD-PhD，第 二者為 ECD deltaPhD(見 WO 00/44899)。此處所用的 Her-2/neu可衍生自大鼠’老鼠或人類。 某些腫瘤抗原為小的肽抗原（即少於約50個胺基酸）。這些 抗原可化學地共輛至本發明經修飾的膽驗結合蛋白質。 供示範的肽包括黏液素（Mucin)衍生之肽，如MUC-1 (見如 85702 -20- 200400970 US 5,744,144, US 5,827,666； W〇 88/05054- US 4,963,484)° 特別包括有MUC -1衍生之肽，其含至少一個丨肽重複 子單位，較好至少二個此重複子，且可為SM3抗體所確認 (US 6,054,438)。其他黏液素衍生之肽包括來自MUC_5之肽。 另外，孩抗原是間白素，如IL丨3及IL丨4，其為較佳。或 者孩柷原可為自體肽激素，如全長的促性腺激素釋放激素 (GnRH，WO 95/20600) ’ 一種1〇胺基酸短的肽，可用於治療 冰夕癌症’或應用於免疫消除作用（丨mmunocastration)。 其他適於偶合以本發明經修飾的膽鹼結合蛋白質之腫瘤 -特異抗原包括神經節苷脂，但不限於腫瘤特異的，如GM2 及 GM3。 肽共價偶合至經修飾的膽鹼結合蛋白質，可以技藝中熟 知之方式進行。因此如為了直接共價偶合，可利用碳化醯 亞胺’戊二駿或（Ν_[γ_馬來醯亞胺基丁醯氧基]琥珀醯亞胺 酷’利用一般商品化之異雙官能連接子，如Cdap及SPDP(利 用處商操作指示）。在偶合反應之後，免疫原可利用透析方 法、凝膠過濾方法，分級分離方法等純化。 抗原也可由對人類具致病性之來源所衍生，如人類免疫 缺失病毒HIV-1(如tat，nef，反轉錄酶，gag, §{312〇及印16〇) ’ 人類單純疱疹病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白質， 如ICP27來自HSV1或HSV2，巨細胞病毒（(esp人類）（如gB或 其衍生物）’輪狀病毒！(包括活的減毒病毒），EB病 毒（如gp350或其衍生物），vz病毒（如gpl，II及IE63)，或來 自肝炎病毒如B型肝炎病毒（如b型肝炎表面抗原或其衍生

85702 -21 - 200400970 物）’ A型肝炎病毒’ c型肝炎病毒及e型肝炎病毒’或來自 其他病毒病原體’如副黏病毒屬：呼吸道合胞病毒（如F及G 蛋白質或其衍生物），副流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒， 人類乳頭狀瘤病毒（如HPV6，11，16，1 8，...），黃病毒屬（如 更熱病病毒，登革熱病毒，蜱媒介的腦炎病毒，日本腦炎 病毒）或流感病毒（完全活的或失活的病毒，分裂流感病毒 (split influenza virus)，生長在蛋中或MDCK細胞，或完全的 病毒脂蛋白體（如R· Gluck, Vaccine, 1992，10, 915-920所 述）或其經純化的或重組體蛋白質，如HA，NP，ΝΑ或Μ蛋 白質或其組合），或衍生自細菌病原體，如奈瑟氏球菌屬 (Neisseria spp)包括淋病奈瑟氏球菌（N. g〇norrhea)及腦膜炎 奈瑟氏球菌（N. meningitides)(如莢膜多醣及其軛物，鐵傳遞 蛋白-結合蛋白質’乳鐵蛋白結合蛋白質，pilc，黏著素 (adhesins));化膿性葡萄球菌（s· py〇genes)(如μ蛋白質或其 片段’ C5A蛋白酶’脂磷壁酸類广無乳鏈球菌（s. agalactiae) ，變異鏈球菌（S. mutans);杜氏嗜血菌（Η· ducreyi);莫拉氏 菌屬（Moraxella spp.)’包括黏膜炎莫拉氏菌（M catarrhalis) 也知為黏膜炎布蘭漠球菌（Branharnella catarrhalis)(如高及 低分子量黏著素及侵入素（invasins));博德特氏菌屬 (Bordetella spp)，包括百口咳博德特氏菌（B. pertussin)(如百 口咳黏附素（pertactis)，百口咳毒素或其衍生物，絲狀血球 &疋集素，腺甘& 化酶，細毛（fimbriae))，副百曰咳博棟特 氏菌（B. Parapertussis)及支氣管炎博德特氏菌（B. bronchiseptica) ’ 幺枝才干每屬（Mycobacterium spp.)，包括結 85702 -22- 200400970 核分枝桿菌（M. tuberculosis)(如 ESAT6，抗原 85A，-B或-C)， 牛分枝桿菌（M. bovis)，麻瘋分枝桿菌（M leprae)，鳥分枝 桿菌（M. avium)，副結核分枝桿菌（M. paratubercul〇sis)，齒 垢分枝桿菌（Μ. Smegmatis);退伍軍人病桿菌（Legi〇nella spp，）包括嗅肺性退伍軍人病菌（L. pneumophila);埃希氏 菌屬（Escherichia sPP)，包括腸毒性埃希氏菌（如群落化因 子，熱不安定型毒素或其衍生物，熱安定性毒素或其衍生 物）’勝出血性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌（如類志賀氏毒 素（毒素或其衍生物）；弧菌屬（Vibri〇 spp)包括霍亂弧菌（v. cholera)(如霍亂毒素或其衍生物）；志賀氏菌屬（shigdia spp)，包括索氏志.賀氏菌（s. sonnei)，痢疾志賀氏菌（s· dysenteriae)，弗氏志賀氏菌（s. flexnerii);耶爾森氏菌屬 (Yersinia spp)’包括小腸結腸炎耶爾森氏菌（γ· enter〇c〇ntica) (如Y〇P蛋白質），鼠疫耶爾森氏菌（Y. pestis)，假結核耶爾森 氏菌（Y. psendotuberculosis);彎曲桿菌屬（Campyi〇bacter SPP)，包括空腸.彎曲桿菌（C.jejuni)(如毒素，黏著素及侵入 素）及大腸彎曲桿菌C· coli);沙門氏菌屬（Salm〇nena spp)， 包括傷塞沙門氏菌（S. typhi)，副傷寒沙n氏菌（s.叫咐咖） ’緒霍亂沙門氏菌（S. ch〇leraesuis)，腸炎沙門氏菌（s· enteriUdis);利斯特氏菌屬（心心spp )，包括單核細胞增 生利斯 '特氏菌（L. m〇n〇Cyt〇genes);螺桿菌屬（HeHc〇bacter spp)，包括幽門螺桿菌（H. pylori)(如脲酶，催化酶，空泡化 毒素）；假單胞菌屬（Pseudomonas spp)，包括銅綠假單胞菌 (P. aeruginosa);葡萄球菌屬（staphyi〇c〇ccus spp·)，包括金 85702 -23 - 200400970 汽色葡萄球菌（S. aureus) ’表皮葡萄球菌（s. epidermidis); 腸球菌屬（Enterococcus spp.)，包括糞腸球菌（ε· faecalis) ’ 屎腸球菌（E. faecium);梭菌屬（Clostridium spp.)，包括破傷 風梭菌（C. tetani)(如破傷風毒素及其衍生物），肉毒梭菌（c. botulinum)(如肉毒毒素及其衍生物），艱難梭菌（c· difficile) (如板囷毒素A或B及其衍生物）；芽抱桿菌（Bacillus spp.)， 包括炭疽芽跑桿菌（B. anthracis)(如肉毒毒素及其衍生 物）；棒桿菌屬（Corynebacterium spp·)，包括白喉棒样菌（C. diphtheriae)(如白喉毒素及其衍生物）；疏螺旋體屬（Borrelia SPP) ’ 包括鮑氏疏螺旋體（Β· burgdorferi)(如 OspA，OspC， DbpA，DbpB) ’ 格氏疏螺旋體（B. garinii)(如 OspA，OspC， DbpA，DbpB)，費氏疏螺旋體（B. afzelii)(如 OspA，OspC， DbpA ’ DbpB) ’ 安氏疏螺旋體（B. andersonii)(如 OspA， OspC，DbpA，DbpB) ’ 赫氏疏螺旋體（b. hermsii);埃里希 氏菌屬（Ehrlichia spp.)，包括馬埃里希氏菌（e. equi)及人類 粒性細胞埃里希氏病之作用物；立克次氏體屬（Rickettsia spp)，包括立氏立克次氏體rickettsii);衣原體屬 (Chlamydia spp·)’ 包括砂眼衣原體（c. trachomatis)(如 MOMP ’肝素-結合性蛋白質），肺炎衣原體（C. pneumoniae) (如MOMP ’肝素-結合性蛋白質），鸚鵡熱衣原體（c. psittaci);鈎端螺旋體屬（Leptospira spp.)，包括問號鈎端螺 旋體（L_ interrogans);密螺旋體屬（Trep〇nema Spp·)，包括蒼 白密螺旋體（T. pallidum)(如罕見的外膜蛋白質），齒垢密螺 旋體（T. denticola) ’ 豚痢疾密螺旋體（T. hyodysenteriae);或 85702 -24- 200400970

母寄生蟲所衍生，如瘧原蟲（Plasmodium spp.) ’包括惡性瘧 原蟲（P. falciparum);弓形體屬（Toxoplasma spp.) ’ 包括鼠弓 形體（T. gondii)(如 SAG2，SAG3，Tg34);内阿米巴屬 (Entamoeba spp.)，包括溶組織内阿米巴（E. histolytica);巴 貝蟲屬（Babesia spp.)，包括田鼠巴貝蟲（B. microti);錐蟲 (Trypanosoma spp·)，包括克氏錐蟲（T. cruzi);賈第鞭毛蟲 (Giardia spp.)，包括蘭氏賈第鞭毛蟲（G. lamblia);利什曼原 蟲（Leshmania spp.)，包括主利什曼原蟲（L. major);肺囊蟲 屬（pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊蟲（P. carinii);毛滴蟲 屬（Trichomonas spp.)，包括陰道毛滴蟲（T. vaginalis) ·’ 裂體 吸蟲（Schisostoma spp·)，包括曼氏裂體吸蟲（S. mansoni)’ 或可衍生自酵母，如假絲酵母（Candida spp.)，包括白假絲 酵母（C. albicans);隱球酵母（Cryptococcus spp·)，包括新型 隱球酵母（C. neoformans)。

可應用於結核分枝桿菌（M. tuberculosis)之其他較佳的特 異抗原如：Tb Ral2，Tb H9 ’ Tb Ra35，Tb38-1 ’ Erd 14， DPV，MTI，MSL，mTTC2 及 hTCCl (WO 99/51748)。用於結 核分枝桿菌之蛋白質也包括其融合蛋白質及變型，其中結 核分枝桿菌至少二個，較好三個多肽融合至較大蛋白質 上。較佳的融合蛋白質包括· Ral2-TbH9-Ra35 ’ Erdl4-DP'V-MTI > 'DPV-MTI-MSL ’ Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2 ， Erdl4-DPV-MTI-MSL ’ DPV-MTI-MSL-mTCC2 ’ TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)。 用於衣原體之最佳抗原包括如高分子量蛋白質（HWMP) 85702 -25 - 200400970 (WO 99/17741)，0RF3(EP 3 66 412)及推想的膜蛋白質 (Pmps)。疫苗調和物其他的衣原體抗原可選自w〇 99/28475 中所述之各組。 較佳的細菌抗原衍自鏈球菌屬，包括肺炎鏈球菌（如莢膜 多醣及其共輛物，PsaA，PspA，鏈球菌溶血素，膽驗_結合 蛋白貝）及蛋白質抗原肺炎細胞落素（Pneumolysin) (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25，337-342)，及其突變的去毒型衍 生物（WO 90/06951 ; WO 99/03884)。其他較佳的細菌抗原 可衍生自嗜血菌屬’包括B型流感嗜血菌（如PRP及其共軛 物）’未定型之流感嗜血菌，如OMP26，高分子量黏著素， P5，P6，蛋白質D及脂蛋白D，及細毛素（fimbrin)及由細毛 素衍生之肽（US 5,843,464)或其多套數變體或融合蛋白質。 B型肝炎表面抗原衍生物為技藝中熟知的，尤其包括 PreSl，preS2 S 抗原，如歐洲專利案 EP_a_414 374 ; Ep_A_ 〇 304 578及EP. 198-474所述。在一較佳例中，HBV抗原是 HBV 聚合酶（ji Hoon Jeong et al, 1996, BBRC 223, 264-271 ; Lee，H. J. et al，Biotechnol. Lett. 15, 821-826)。在另一較佳 方面’尤其當在CHO細胞中表現時，融合體内之抗原是 HIV-1抗原，gpi20。在進一步實例中，抗原包括如上定義 之 gD2t : 在本發明一較佳具體實例中’，融合體含有由人類乳頭狀 瘤病毒衍生之抗原（HPV6a，6b，11，16, 18, 3卜33 , 35， Μ’ 45’ 51，52’ 56’ 58, 59及68)，特別是和生殖器疣有 85702 -26- 200400970 關之HPV血清型（HPV 6或HPV 11及其他）及和子宮頸癌有 關之HPV病毒（HPV 16，HPV 18及其他）。 適合白勺 HPV：|尤原為：El，E2，E4，E5，E6，E7，L1 及 L2。 特佳的生殖器疣預防或治療性融合體含有L 1粒子或殼粒 (capsomers)，且融合蛋白質包括一個以上選自HPV 6及HPV 11蛋白質E6，E7，L1及L2之抗原。 最佳的融合體蛋白質型式為L2E7，如WO 96/26277所揭示 及蛋白質 D(l/3)-E7，如 GB 9717953.5 所揭示（PCT/EP 98/05285)。 較佳的HPV子宮頸感染或癌症之預防或治療性疫苗組成 物，可含有HPV 16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體或L1 或L2抗原可以類病毒粒子（VLP)型式一起呈現，或L1單獨蛋 白質，以VLP或殼粒結構單獨呈現。此抗原，類病毒粒子 及殼粒本身是已知的。如見WO 94/00152，W0 94/20137， WO 94/05792及 WO 93/02184。 另外早期蛋白質可單獨地包括或呈融合蛋白質型式，如 E7，E2或較好是E5 ;此中特佳具體實例包括含有L1E7融合 蛋白質之VLP(WO 96/1 1272)。特佳的HPV 16抗原包括早期 蛋白質E6或E7，並融合以蛋白質D載劑，以自HPV 16形成 蛋白質D-E6或E7融合體，或其組合；或E6或E7與L2之组合 (WO 96/26277)。 另外HPV 16或18早期蛋白質E6及E7，可呈單一分子或較 好是蛋白質D-E6/E7融合體。其他融合體可視所需含有來自 HPV 18任一 E6及E7或二者蛋白質，較好呈蛋白質D-E6或蛋 85702 -27- 200400970 白質D-E7融合蛋白質或蛋白質D E6/E7融合蛋白質。融合體 可含有來自其他HPV株之抗原，較好來自HPV 3 1或3 3株。 依據本發明之融合體含有由瘧疾寄生蟲衍生之抗原。例 如惡性瘧原蟲所得之較佳抗原包括RTS，S及TRAP。RTS是 一種混種蛋白質，其實質上含惡性瘧疾原蟲週子胞子蛋白 質（CS)所有C-末端部份，並經由B型肝炎表面抗原preS2部 份的4個胺基酸，鏈結至B型肝炎病毒表面（S)抗原上。其完 全的結構在 International Patent Application No. PCT/EP 92/02591中揭示，在WO 93/10152發表，並申請UK專利NO. 9124390.7中之權利。當在酵母中表現時，RTS以脂蛋白粒 子型式產生，且當與HBV S抗原共表現時，可產生稱之為 RTS,S之混合粒子。TRAP抗原述於國際案NO. PCT/GB 89/00895，在WO 90/01496發表。本發明較佳具體實例是其 中抗原製劑包括有RTS，S及TRAP抗原組合之融合體。其他 是融合體組份可能候選者之瘧原蟲抗原有惡性癔原蟲 MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2， Sequestrin > PfEMPl > Pf332 > LSA1 > LSA3 > STARP > SALSA > PfEXP卜 Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfsl6，Pfs48/45，Pfs230 及其在瘧原蟲中之類似物。 本發明也提出可編碼本發明融合體配對之聚核苷酸。本 發明進一步是有關可與此中圖1所示之聚核苷酸序列雜交 之聚核苷酸（SEQ ID NO:9至16)。在此方面，本發明尤其是 有關在迫切條件下可與此中所述之聚核苷酸雜交之聚核苷 酸。如此中所用的，”迫切條件”及”迫切的雜交條件”表示雜 85702 -28- 200400970 交反應僅發生在序列間之同質性至屮Q<〇/、 土 t j «丨王土少95%之時，且較好至 少9 7 %。迫切雜交條件的一個特洗眘 竹沐賞例是在以下溶液中以 4YC培育-夜：50%甲賴’ 5xssc⑽福額，15_ 檸檬酸三鈉），50 mM磷酸鈉（pH 76)，5χ登哈氏溶液 (Denhardfs) ’ 10%硫酸右旋醣及2〇微克/毫升之經變性剪切 過之鼓魚、精子DNA，繼之在〇.1χ咖，約饥下洗絡雜交 載體。雜交及洗條條件為熟知的，且示範於s_b_k，^ M.， Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Eduion! CoW Spring Harbor，N. Y.，（19δ9)特別是其中的第㈣。溶 液雜交也可以本發明提供之聚核苷酸序列來使用。 本發明也提出編碼多肽之聚核誓酸，其中含有依據本發 明之融合體配對，並稠合至與腫瘤有關之抗原或其片段。 特K ’本發明提出編碼融合體配對蛋白質之聚核苷酸序 列，其中含膽鹼結合功能部位及異源混雜的τ輔助細胞抗原 決定部位’較好其巾的㈣部位係衍自Ly^C 末端。在一較佳具體實例中，依據本發明之聚核甞酸c_LytA 部份，包括SEQ ID NOAH任何至少四個重複子，又較好 包括SEQ !D N0:15之序列，又較好是seq m N〇:i6之序 列。在其他相關具體實例中，本發明提出聚核錢變型， 具有與此中在SEQIDN0s:9_16所揭示序列實質之同質性， 如利用傳統方法，如在標準參數下之BLAST分析，與本發 明聚核苷酸序列比較’有至少70%序列同質性，較好至少 96%，97%，98% 或 99% 以 75% > 8〇〇/0 , 8 5% » 90% > 95% 上°又進一步具體實例中，如所申請專利之聚核苷酸可進 6Θ 6 85702 -29- 200400970 一步包括異源蛋白質。 此聚核苷酸序列可嵌入適合的表現載體，並在適合的宿 主中表現。可提供載體’其編碼本發明經修飾的膽鹼結合 蛋白貝，且其含有適合的限制位置，使編碼免疫原性蛋白 質（DNA可被嵌入以產生融合蛋白質。在本發明其他具體 貫例中，編碼本發明多肽融合體之聚核甞酸序列或其片 段，可嵌入重组DNA分子内以指令多肽在適合宿主細胞中 之表現。由於遺傳密碼固有之簡併性，也可產生實質上編 碼相同或功能上相當胺基酸序列之其他dna序歹卜且這些 序列可用來選殖及表現特定之多肽。 甘敗汴丹，非自 然生成密碼子之多月太，在某些例子中是有益的。DNA密碼 有續字母（A，T，C及G)，且使用彼等以判讀三字褐”密碼 子"，其代表在有機體基因中所編碼之蛋白質胺基酸^著 Γ分子之直線密碼子序列，可轉譯成為這些基因所編碼 a白質中《胺基酸直線序列。密碼具高度簡併性，有川固 密碼子指導合成2〇個天然胺基酸，且3個密碼子代表，，停止" 忒唬。因此，大多數胺基酸係為—個 事實上右卞夕& ^ ;, 上的进碼子所編碼- 只上有4夕為四種以上不同密碼子所編碼。 =一個密碼子用於指導合成特定胺基酸時 之密碼子使用型式是高庋非任意的。 屬 在其密碼子選擇上有不同的傾、向， 種屬 在單-種屬但有高及低表現水平之：二密碼予之利用 同。此傾向在病毒，植物，細菌二I:是顯… 用礼勤物細胞中是不同 85702 -30- uy/υ 的，且某些種屬相較於他 碼子選用的。例士口，人劣 有μ的傾向是遠離任意密 病主強列 錢其他哺乳動物相較某些細菌或 病主…成 基於此’哺乳動物在“Π中表現或 病母基因在哺乳動物中表現，基於有 = :: =有可能的。咸信，在異™ :: 碼子群乏存在（其在欲發 衣現又佰王中罕可觀察得到）可 作為在值主中異源表現水平很低之指示。 因此^特定原核細胞（如E.c〇Ii或酵母）或真核細胞宿主 所選用之舍碼予可更漆 ； 』更臻疋吾，即加以選擇以增加蛋白質表 現率’以產生有欲求特性之重組體rna轉錄子，如較自然 發生序列產生之轉錄子有更長之半衰期，或使在人類中之 免疫反應更绿完善。密碼子更療完善之過程可包括任何的 ㈣’由手動或電腦軟體所產生’其中天然序列之密碼子 有某些或全邵均被修飾。已發表過許多方法（Nakamuaetd.，

Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215 ; W0 98/34640)。 依據本發明一較佳方法是Syngene方法，是方法之 邊化（R. S. Hale and G Thompson (Protein Expression and Purification Vol. 12 pp. 185.1 88 (1998))。 因此，在一較佳具體實例中，蛋白質之dna序列具有至 0.65之RSCU(相對同義密碼子用法ReiauVe Synomons Codon useage(也知為密碼子指數c〇d〇n Index CI))，且與相 當的野生型區域有少於85%之同質性。 此密碼子最佳化過程及所生成之構築，因以下某些或全 4優點因而疋有益的· 1)將罕見或少用密碼子以較常用密 85702 -31 - 200400970 碼子取代，可改進基因產物之表現，2)移去或納入限制位 置’以促進下游之選殖’及3)減少DNa載體中嵌入子序列 及基因體序列間同質重組作用之可能性及4)經由提高拮抗 標的抗原之細胞及/或抗體反應（較好二種反應），可改進人 骨豆之冗疫反應。本發明序列有益地有較低的重組可能性， 但表現水平和野生型序列至少可達相同水平。SynGene程式 產生最佳密碼子序列所用之互除法本質，因此產生極大量 但有類似功能之最佳密碼子序列是可能的。簡言之，利用 統計方法指定密碼子，所生成之合成基因其密碼子頻率和 在高度表現基因中天然所見的還接近，如卜肌動蛋白。適 當的最佳密碼子序列可供說明實例，然不予以限制，示於 SEQ ID N〇s:19-22及 SEQ ID N〇S:24-26。 在本發明之聚核苷酸中，密碼子用法型式與傳統標的抗 原不同，更接近地代表尚度表現基因在標的有機體中之密 碼子傾向，如人類β-肌動蛋白。，，密碼子用法係數"（"c〇d〇n usage coefficient”是特定聚核苷酸序列之密碼子型式多類 似標的物之測度。密碼子頻率可針對許多種屬之高度表現 基因衍自各文獻來源（如見Nakamura et al. Nucieic Acids

Research 1996, 24:214-215)。61個密碼子各自之密碼子頻率 (以所選定之基因種類每1000個密碼子之發生次數表示）針 對2〇個天然胺基酸各自常規化，如此將各胺基酸最常用密 碼子之數值定在丨，且較不常用密碼子之頻率分級於零及i 之間。因&’61個密碼子各自之數值針對標的種屬高度表 現基因，定為1以下。為了計算出特異聚核菩酸之密碼子使 85702 -32- 用/系數，相較於該種屬高度表現基因，要提及特異 酉父各密碼子之等級數值，邗接田π 士 Λ甘 寺.'及職越料有這些數值 (將這些數值之天狹對數信她知办、，， /、 <尺…对数值總和除以密碼子總數，並取反 數值）。係數數值在零及1之間， 、 一 〈间且係數愈鬲則聚核苷酸中 (密碼子有更多的常用密碼子。若聚m序列之密碼子 使用係數是i,則對標的種屬之高度表現基因而言，所有的 密碼子均為”最常用”密碼子。 依據本發明，聚核苷酸之密碼子使用型式較好排除特定 胺基酸作用之<1〇%之密碼子。相對同義密碼子用法（Rscu) 值是密碼子觀察數值除以預期數值，此係當胺基酸之所有 密碼子均有同等之頻率時而言。本發明之聚核苷酸在標的 有機體之高度表現基因中，較好排除RSCU值少於0.2之密碼 子。本發明之聚核苷酸，針對高度表現之人類基因，通常 有大於0.6之密碼子使用常數，較好是大於0.65，又最好是 大於0.7。用於人類之密碼子使用表也可見於Genbank。 比較而言，高度表現之β肌動蛋白基因具0.747之RSCU。 用於人類之密碼子使用表（表1)示於下： 表1.用於人類（高度表現）基因之密碼子用法1/24/91(人類 high.cod) 胺基酸 密碼子 次數 /1000 部份 Gly - GGG 905.00 18.76 0.24 Gly GGA 525.00 10.88 0.14 Gly GGT 441.00 9.14 0.12 Gly GGC 1867.00 38.70 0.50 85702 -33- 200400970

Glu GAG 2420.00 50.16 0.75 Glu GAA 792.00 16.42 0.25 Asp GAT 592.00 12.27 0.25 Asp GAC 1821.00 37.75 0.75 Val GTG 1866.00 38.68 0.64 Val GTA 134.00 2.78 0.05 Val GTT 198.00 4.10 0.07 Val GTC 728.00 15.09 0.25 Ala GCG 652.00 13.51 0.17 Ala GCA 488.00 10.12 0.13 Ala GCT 654.00 13.56 0.17 Ala GCC 2057.00 42.64 0.53 Arg AGG 512.00 10.61 0.18 Arg AGA 298.00 6.18 0.10 Ser AGT 354.00 7.34 0.10 Ser AGC 1171.00 24.27 0.34 Lys AAG 2117.00 43.88 0.82 Lys AAA 471.00 9.76 0.18 Asn AAT 314.00 6.51 0.22 Asn AAC 1120.00 23.22 0.78 Met ATG 1077.00 22.32 1.00 lie ATA 88.00 1.82 0.05 lie ATT 315.00 6.53 0.18 85702 -34 - 200400970 lie ATC 1369.00 28.38 0.77 Thr ACG 405.00 8.40 0.15 Thr ACA 373.00 7.73 0.14 Thr ACT 358.00 7.42 0.14 Thr ACC 1502.00 31.13 0.57 Trp TGG 652.00 13.51 1.00 End TGA 109.00 2.26 0.55 Cys TGT 325.00 6.74 0.32 Cys TGC 706.00 14.63 0.68 End TAG 42.00 0.87 0.21 End TAA 46.00 0.95 0.23 Tyr TAT 360.00 7.46 0.26 Tyr TAC 1042.00 21.60 0.74 Leu TTG 313.00 6.49 0.06 Leu TTA 76.00 1.58 0.02 Phe TTT 336.00 6.96 0.20 Phe TTC 1377.00 28.54 0.80 Ser TCG 325.00 6.74 0.09 Ser TCA 165.00 3.42 0.05 Ser TCT 450.00 9.33 0.13 Ser TCC 958.00 19.86 0.28 Arg CGG 611.00 12.67 0.21 85702 - 35 -

Arg CGA 183.00 3.79 0.06 Arg CGT 210.00 4.35 0,07 Arg CGC 1086.00 22.51 0.37 Gin CAG 2020.00 41.87 0.88 Gin CAA 283.00 5.87 0.12 His CAT 234.00 4.85 0.21 His CAC 870.00 18.03 0.79 Leu CTG 2884.00 59.78 0.58 Leu CTA 166.00 3.44 0.03 Leu CTT 238.00 4.93 0.05 Leu CTC 1276.00 26.45 0.26 Pro CCG 482.00 9.99 0.17 Pro CCA 456.00 9.45 0.16 Pro CCT 568.00 11.77 0.19 Pro CCC 1410.00 29.23 0.48 200400970 編碼本發明融合蛋白質或經修飾的膽鹼結合蛋白質之 DNA序列，可利用標準的DNA合成技術合成，如D. M. Roberts et al.於 Biochemistry 1985，24, 5090-5098所述，化 學合成，試管内酵素聚合化作用或PCR技術，利用如熱穩 定性聚合酶或這些技術之組合。 DNA酵素性聚合化作用可於試管内利用DNA聚合酶來進 行，如DNA聚合酶I(Klenow片段）或Taq聚合酶，於含有依所 需之核Ϋ三磷酸dATP，dCTP，dGTP及dTTP之適合緩衝溶 液中，溫度在10°C -37°C，通常體積在50微升以下。DNA片 85702 -36- 200400970 段之酵素性連接可利用DNA連結酶來進行，如T4 DNA連接 酶，於適合的緩衝溶液中，如0.05 M Tris (pH 7.4)，0.01 Μ MgCl2，0.01 Μ二硫異亦絲蕩醇，1 mM亞精胺，1 mM ATP 及0.1毫克/毫升牛血清白蛋白，溫度為4°C至環境溫度，通 常體積少於50微升。DNA聚合物或片段之化學合成可利用傳 統的磷酸三醋，磷酸S旨或胺基亞磷酸醋化學，利用固相技 術，如在'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments-A Laboratory Manual' (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) > 或在其他科學刊物 上，如M.J. Gait，H.W.D. Matthes，M. Singh, B.S. Sproat，and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers,

Journal of the American Chemical Society, 198 1, 103, 3 185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D. Matthes et al.，EMBO Journal, 1984，3，801。 本發明方法可以傳統的重組體技術進行，如述於Maniatis et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1 982-1 989。 特言之，方法包括以下步驟： i)製備可於宿主細胞中表現DNA聚合物之可複製或嵌入 85702 -37- 200400970 之表現載體，其中包括一段核苷酸序列，其可編碼蛋白質或 其免疫原衍生物； ii) 以該載體轉形宿主細胞； iii) 在可令該DNA聚合物表現之條件下培養該經轉形的宿 主細胞以產生該蛋白質；及 iv) 回收該蛋白質。 所謂”轉形”如此中所用的表示將外來的DNA引入宿主細 胞内。此點可利用適合質體或病毒載體之轉形，轉感或感染 而完成，例如在下列所述之傳統技術：Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A. J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988。而”經轉形的”或”轉形 子”下文應用至含有及表現重點外來基因之所生成之宿主 細胞。 表現載體是新穎的，且也構成本發明一部份。 可複製之表現載體可利用本發明製備，將與宿主細胞相 容之載體解離，生成有完整複製子之直線DNA片段，將該 直線片段與一個以上的DNA分子混合，其加上該直線片段可 編碼欲求產物，如編碼本發明蛋白質之DNA聚合物，此在連 接條件下完成。 因此，DNA聚合物可依所欲求的，在載體構築之下進行或 形成。— 載體之選擇部份由宿主細胞所決定，其可為原核或真核， 但較好是E. coli，酵母或CH0細胞。適合的載體包括質體， 噬菌體，黏接質體及重組體病毒。表現及選殖載體較好含 85702 •38- 200400970 有可篩選之標幟’如此僅有可表現標幟之宿主細胞可在篩 選條件下存活。選擇基因包括所編碼之蛋白質可提供對氨 节青霉素’四環素或康黴素抗性者，但不限於此。表現載 骨豆也可含有與所指定宿主相容之控制序列。如，用於E. coli ’且較常是於原核細胞’之表現控制序列包括啟動子及 核糖體結合位置。啟動子序列可自然生成，如β_内醯胺酶（青

Μ 素自母）（Weissman 1981，In Interferon 3(ed. L. Gresser)，乳 糖（lac)(Chang et al. Nature 1977，198:1056)及色胺酸（trp) (Goeddel et al. Nucl. Acids Res. 1980, 8, 4057)及 λ-衍生之 PL 啟動子系統。此外’在自然下不會發生之合成啟動子也可 作用如細菌啟動子。如應用於由trp及lac啟動子序列衍生之 合成的混雜啟動予之例時。（De Boer et al.，Pr〇c. Natl Acad

Sen· USA 1983, 80, 21-26)。這些系統特別適用於E. c〇n。 酵母可相容載體也攜有可供轉形子成功篩選之標幟，即 將原質營養傳予營養缺陷突變株，或在野生株上有對重金 屬 < 抗性。用於酵母載體之表現控制序列包括糖解酵素之 啟動子（Hess et al·，J. Adv. Enzyme Reg. 1968, 7，149)，PH05 基因編碼酸式磷酸酶，CUP1基因，ARG3基因，gal基因啟 動子及合成的啟動子序列。可用於酵母表現的其他控制元 件有終結子及mRNA領導子序列。y編碼序列特別有用，因 /、通¥ '篇碼由疏水性胺基酸組成之訊號肽，其可指令蛋白 貝細胞足分泌。適合的訊號序列可由所分泌之酵素蛋白質 =基因所編碼，如酵母轉化酶基因及a-因子基因，酸磷酸 酶，殺手毒素，α_配對因子基因及近來由馬克斯克魯維酵 85702 -39- 200400970 母（kluyveromyces marxianus)之INUl A基因衍生之異源菊於 酶訊號序列。已發展出可供巴斯德畢赤酵母及釀酒酵母中 表現之適合的載體。 依據各種可誘導或原構性啟動子，可運用各樣的巴斯德 畢赤酵母表現載體（Cereghino and Cregg，FEMS Microbiol.

Rev. 2000, 24:45-66)。於產製胞液及分泌型蛋白質時，最常 用的巴斯德畢赤酵母載體含極強及緊密調控之乙醇氧化酶 (AOX1)啟動子。載體也含有巴斯德畢赤酵母組織胺醇去氫 酶（HIS4)基因，可供在his4宿主中篩選。外來蛋白質之分泌 需有訊號序列之存在，且釀酒酵母原前α配對因子訊號序列 已被廣泛且成功地應用於畢赤酵母表現系統中。表現載體 嵌入巴斯德畢赤酵母基因體内，使表現株之穩定性達最 佳《如同在釀酒酵母般，巴斯德畢赤酵母表現載體在宿主 基因體共有之序列内（A0XUtHIS4)解離，可刺激同質重組 作用，其使載體可有效率地對準至基因體區位内而整合。 瓜而δ，含有多個表現匣整合套组之重组體株，可較單 套株可生<更為異源之蛋白質。為#高套組轉形予之最有 政方式，而賴原生質球狀體技術行畢赤酵母受株之轉形作 用（Cregg et al” 1985, M〇1_ CeU 則〇1 5:3376_3385)。 可设製表現載體足製備’可利用dNa限制，聚合化作用 及連接乏適合酵素’以如Maniatis al·上示之步驟，以傳 統方式進行。 "重組宿主細胞之製備，依據本發明，係以本發明之可複 製表現載體轉形宿主細胞，㈣形條件下而成。適合的轉 85702 •40· 200400970 形條件是傳統的，且述於如Man.iatis et al，上示，或"dna

Cloning" Vol. II，D.M. Glover ed.，IRL Press Ltd, 1985。 轉形條件之選擇依欲轉形之宿主細胞而定。例如，本發 明聚核苷酸利用活的病毒載體為轉形劑之活體内轉形作用 述於上。宿王如E. coli之細菌轉形作用，可在宿主先經caCl2 溶液處理後（Cohen et al.，proc. Nath Acad. Sci.，1973, 69, 211 0)或以含有氯化铷（RbCi)，MnCi2，醋酸鉀及甘油之混合 物疋落液，再以3-[N-嗎福啉基卜丙烷_磺酸，Rbc】及甘油處 理，經？R核％•鉍之直接攝入而成（其可為含有欲求序列之表 現載體）’或經由電泳脈動。以直接攝入方式，將較低等真 核有機體轉形，如在培養中之酵母細胞，可經Hinnenetal. 之方法芫成（Proc. Natl. Acad· Sci. 1978, 75:1929- 1933)。培 養中之哺乳動物細胞，可利用載體DNA之磷酸鈣共沉澱方 法轉形至細胞内（Graham & Van der Eb，Vir〇lc)gy 1978, 52, 546)。將聚核苷酸引入哺乳動物細胞的其他方法包括由葡 聚醣調介之轉感作用，：?0以131^116調介之轉感作用，原生質 體融合，電泳脈動，聚核苷酸包膠至脂質體内及聚核苷酸 直接微量注入核内。 本發明也延伸至以編碼本發明蛋白質或本發明可複製表 現載體之核酸所轉形之宿主細胞。 在可含DNA聚合物表現之條件下培養所轉形之宿主細 胞，可傳統上依如ManiatiSetal.及上述之” DNAC1〇ning„所 述進行。因此，細胞供以營養品，並在低於5 〇。匸下培養， 較好在25。(：及42。(：之間，又較好在25r及3rc之間，最好

85702 -41 - 200400970 在3〇t下。培育時間可由數分鐘變化至數小時，依在細菌 細胞中多肽之比例而定，可由撕細或西方墨點來評 估。 產物可由傳統方法回收，依宿主細胞及依表現產物之所 在而定(細胞外或分泌至細胞培養基，或分泌至細胞週圍 因此，當宿主細胞是細菌時，如E.c〇H，其可物理化，化庳 地或酵素地溶解，且蛋白質產物自所生成之溶胞產物中: 離。當宿主細胞是哺乳動物時，產物通常分離自營養基或 :·’、萃取物。宿王細胞當是酵母，如釀酒酵母或巴斯 L畢杀酵母’產物通常可自溶解之細胞或自培養基中分 離’再進-步以傳統技術純化。表現系統之特異性可由西 万墨點或EUSA，利用直接拮抗重點多肽之抗體評估之。 傳、.无的蛋白貝分離技術包括選擇性沉殿作用" 析及親和力層析，包括單株抗體親和力管柱。當本發明; 白質加有組胺酸尾部下表 而被容易料m 其可經親和力層析 (IMAC)o T利用離子金屬親和力層析管柱 ’離子’可為任何適合的離子如鋅，鎳，鐵， 鎂：或銅，但妨杯g y』 劑，較好Μ離^ 較好1_緩衝溶液含有去污 劑，如τ_ηδΛ ’如sds’較好是非離子性去污 並可^ 或兩性離子去污劑，如Emplgen BB，因 其可使終產物之内毒素水平較低。 管柱之：：：析步驟包括如Q_Sephar°se步驟，其可在IMAC 視所需==㈣㈣㈣·咖嫩咖， 85702 •42- 200400970 本八:明《蛋白質因此可依以下步驟純化。在細胞瓦解 …有蛋白質之細胞萃取物可溶解於含有 及叫例如由㈣請）之pH8.5Tns緩衝溶液中。離心） 後，生成的上清液可填加至已先用PH 8.5 Tris緩衝溶液平衡 (IMAC(鎳）Sepha職FF管柱。管柱再以含高鹽之緩衝溶液 洗 U如 0.75-1.5 m NaC1，15 mM ρΗ 8_5，加緩衝溶液）。 管柱再以無鹽之磷酸鹽緩衝溶液洗滌。本發明蛋白質可以 含有味嗤之緩衝溶液自管柱中溶離。蛋白質再接受額外的 層析步驟’如陰離子交換層析（如Q Sephar〇se)。 本敖明蛋白質可以在液體型式中可溶地提供，或呈冷凍 乾燥型4，後者較佳。通常可預期I人類劑量可含有工至 1000微克的蛋白質，且較好30_3⑽微克。純化過程也包括 羧基酿胺化作用步驟，其中蛋白質在縠胱甘肽存在下先還 原，再於碘乙醯胺存在下羧甲基化。此步驟可提供控制分 子氧化聚集之優點，係指經由雙硫键共價橋分子本身或分 子與宿主細胞蛋白質摻雜物之氧化聚集。 本發明也提供含有本發明蛋白質，於醫藥上可接受賦形 剑中之醫藥及免疫组成物。較佳的疫苗组成物至少含有依 據本發明之一種蛋白質。該蛋白質較好有經阻斷的硫醇 基，且經咼度純化，如宿主細胞掺雜物少於5%。此疫苗可 視所需_含有一種以上其他與腫瘤相關之抗原及衍生物。 如’其他適合的相關抗原包括前列腺酶，PAP_ 1，PS A(前列 腺特異抗原），PSMA(前列腺-特異的膜抗原），psCA(前列腺 幹細胞抗原），STEAP。 85702 -43- 200400970 在另一具體實例中，本發明供說明之免疫原組成物，如 疫苗组成物’含有編碼如上述一種以上融合多肽之DNA， 如此可於原位產生融合多肽。如上示，聚核苷酸可在各樣 精蟄者已知之遞送系統中任一者内投予。確實，許多基因 遞送技術是技藝中熟知的，如Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198，1998及此中之技術所述。 適合的聚核：y：酸表現系統，當然含有可在病人中表現之必 要的調控DNA序列（如適合的啟動子及終結訊號）。另外， 細菌遞送系統可涉及細菌之投予（如卡介苗BaciUus Calmette-Guerrin)其可在細胞表面表現多肽之免疫原部份 或分泌出此抗原決定部位。 因此’在某些具體實例中，編碼此中所述之免疫原多肽 之聚核菩酸’利用各種已知之病毒為基礎系統，引入適合 的哺乳動物宿主細胞内以表現之。在一個說明之具體實例 中’反轉錄病毒可提供合宜且有效的平台以供基因遞送系 統。所選定之編碼本發明多肽之核芬酸序列，可嵌入載體 内並利用技藝中已知之技術包裝在反轉錄病毒粒子内。重 組體病毒可再分離並遞送至個體内。可供說明之反轉錄病 毒系統’有許多已有所描述（如，u s. Pat. N〇. 5,219,740 ; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990； Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14 ； Scarpa et al. (1991) Virology 1 80:849-852 ； Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 90.8033-8037;及Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:i〇2_i〇9 〇 85702 -44 - 200400970 此外，許多可供說明之腺病毒_為基礎之系統也已有所描 述。和反轉錄病毒不同的，其可整合至宿主基因體，腺病 毒存在於染色體外，因此可減少嵌入突變有關之危險性 (Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-274 ； Bett et al. (1993) J. Virol. 67:591 1-5921 ； Mittereder et al. (1994)

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Human Gene Therapy 4:461-476)。由於人類有時可為—般人 類腺病毒血清型，如AdHu5所感染，大部份的人會有對該 腺病毒之中和抗體反應，其似乎可達成對重組體疫苗為基 礎之系統中異源抗原之免疫反應。非人類之靈長類腺病毒 載體’如黑猩猩腺病毒 68(AdC68，Fitzgerald et al. (2003) J. Immunol 170(3):1416-22))可提供不同的腺病毒系統，但無 預存之中和性抗體反應之缺點。 針對聚核苷酸遞送，也已發展出各種與腺體有關之病毒 (AAV)載體系統。AAV載體可利用技藝中熟知之技術容易地 構染’如見 U.S. Pat. Nos. 5,173,414及 5,139,941 ; International Publication Nos. WO 92/01070及 WO 93/03769 ; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996； Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) ； Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 ；

Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol, and Immunol. 1 58:97-129 ； Kotin, R. M. (1994) Human Gene -45 - A2 ) 85702 200400970

Therapy 5:793-801 ； Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169 ； and Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 1 79:1867-1 875。 經由基因轉移可遞送編碼本發明多肽之核酸分子之額外 的病母載禮包括由痘病毒科衍生者’如牛痘病毒及禽痘病 母。經由實例，可如下構築表現新穎分子之牛痘病毒重組 子扁碼夕肽之DN A先嵌入適合的載體内，如此其可鄰接 牛痘苗啟動子及兩侧按以牛痘苗DNA序列，如編碼胸苷激 酶（TK)之序列。此載體再用來轉感細胞，其同時為牛痘苗 所感染。同質重組可將牛痘苗啟動子加上編碼重點多肽之 基因一起嵌入病毒基因體内。生成之TK.sup.㈠重組子之篩 選則是在5-溴去氧尿嘧啶核甞存在下培養細胞’並排出對 彼具抗性之病毒唾菌斑。 以牛痘田為基礎之感染/轉感系統，可合宜地用於有機體 佰王細胞中，提供上述一個以上多肽可誘導且瞬時之表現 或共表現。在此特殊系統中，細胞先以編碼噬菌體丁7 rna 聚合酶之牛痘苗病毒重組子感染。此聚合酶呈現絕妙的特 異性，因其僅轉錄攜有T7啟動子之模板。在感染之後，細 胞在Τ7啟動子驅動之下，以重點之聚核甞酸轉感。由牛痘 田病母重組子表現在胞質中之聚合酶，可將DNA轉感成為 RNA，其再經由宿主之轉譯機制轉譯成多肽。此方法使大 量的RNA及其轉譯產物可有高水平且瞬時之胞質内產製， 如見 Elroy-Stein and Moss’ Pr〇c· NaU. Acad % USA (199〇) 87:6743-6747 ； Fuerst et al. Pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 85702 -46- 200400970 83:8122-8126 〇 另外，禽痘病毒，如禽痘病毒及金絲雀痘病毒，也可用 來遞送重點之編碼序列。可表現哺乳動物病原菌免疫原之 重組體禽痘病毒，當投予至非禽類時已知可提供保護性免 疫力。在人類及其他哺乳動物種類中特別企求使用禽痘載 體’因為禽痘屬成負只會在易感染之禽類中產製性複製， 因此在哺乳動物細胞中是無感受力的。產製重組體禽症病 毒之方法是技藝中已知的，且就牛痘苗病毒之產製而言可 應用上述之基因重组，如見W0 9丨/12882 ; w〇 89/〇3429及 WO 92/03545 〇 α病毒載體許多成員中任一者均可用來遞送本發明之聚 核苷酸組成物，如述於1；.8.?此1^〇3.5,843,723;6,〇15,686; 6,008,035及6,015,694。某些以委内瑞拉馬腦脊髓炎（vee) 為基礎之載體也可採用。其說明實例可見u.s. Pat. N〇s. 5,505,947及 5,643,576。 本發明組成物可以許多路徑遞送，如肌内，皮下，腹膜 内或靜脈内。 本發明的另一具體實例中，聚核苷酸以"裸露„的DN A型 式被投予 / 遞送，如 Ulmer etal.，Science 259:1745-1749, 1993 及 Cohen，Science 259:1691-1692, 1993 所總覽。裸露 DNAi 攝入可由DNA塗佈在可生物降解之珠粒上而增加，其可被 有效率地運送至細胞内。在一較佳具體實例中，组成物由 皮内遞送。特言之’組成物利用基因鎗（特殊的粒子撞擊） 投藥技術遞送’其中係將載體塗佈在珠粒上（如金），再於高 85702 47- 200400970 壓下投予表皮；如Haynes et al.，J. Biotechnology 44:37-42 (1996)所述。 在一個說明實例中’可以裝置達成由氣體-驅動之粒子加 速作用’如 Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford UK)及 Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI)所製造白勺，其中某些 實例述於US Pat. Nos_ 5,846,796 ; 6,010,478 ; 5,865,796 ; 5,5 84,807及£??31.如.0500 799。此途徑提供一個無針之遞 送途徑’其中顯微粒子之乾粉調和物，如聚核：y：酸，經由 手動式裝置產生之氘氣氣套内被加速至高速，將粒子推進 至重點標的組織’通常是皮膚。粒子較好是0.4 — 4.0微米之 金珠粒，較好是0.6-2.0微米直徑，且DNA共軛物再塗佈於 其上，之後關閉在匣内以裝置成，，基因鎗”。 .在一個相關具體實例中，可用於本發明组成物以氣體驅 動之無針注射之其他裝置及方法包括由Bi0ject，Inc. (Portland，OR)所提供的，其中某些實例描述於u.s. pat. N〇s. 4,790,824 , 5,064,413 ； 5,3 12,335 ； 5,383,851 ； 5,399,163 ； 5,520,639及 5,993,412 中。 對於含有編碼抗原肽之核苷酸序列之免疫原组份，有可 能以單次基礎（once off basis)投予或可重複投藥，如i至7 次，較好1至4次’間隔約1天至約丨8個月。然而，此療程可 依據病人體型，欲治療/保護拮抗之疾病，所投予之核苷酸 序列之量，投藥路徑，精於醫學實務者顯而易知之其他因 素而有顯著的變化。 因此本發明的另一方面是提出如此中所述，蛋白質或編 85702 -48- 碼該蛋白質之DNA製成免疫組成物，於病人中誘生免疫反 應之應用。較好可由依序投予下列而誘生免疫反應，〇該蛋 白質繼之該DNA序列；或ii)該DNA序列繼之該蛋白質。較 好DNA序列係塗佈在可生物降解之珠粒上，或經由粒子撞 擊途徑遞送。又較好蛋白質加有佐劑，較好是丁^^丨誘導佐 劑’較好是以CpG/QS2 1為基礎之佐劑調和物。 含有編碼抗原性肽之核苷酸序列之載體，以在預防上或 治療上有效之劑量下投予。所投予之量通常在丨微微克至16 毫克之間，較好丨微微克至1〇微克於粒子_調介之遞送，及 10微克至16毫克供其他路徑為每劑量下之核苷酸量。確實 之劑量依據欲免疫病人之體重及投藥路徑而有相當大的變 化。 將裸露的聚核苷酸或載體引入病人之適合技術也包括在 週合溶媒下之局部施用。核酸可局部投予至皮膚或至黏膜 表面，如採鼻内，口服，陰道内或肛門内投藥。裸露的聚 核苷酸或載體可與藥學上可接受之賦形劑一起呈現，如磷 紅«·.’爰衝之食鹽水（PB s)。使用促進劑可進一步促進dnA之 攝入’如丁略卡因（buPivacaine)，或分別地或納入DNA調和 物中。核酸直接投予至受者之其他方法包括：超音波，電 刺激’電泳脈動及微量種入，其述於US 5,697,901。 核酸構築之攝入可以許多已知之轉感技術加強之，如包 括使用轉感作用物。這些作用物之實例包括陽離子性作用 物 如磷酸鈣及DEAE-Dextran及脂感劑，如脂感胺 (lipofectam)及轉感胺（transfectam)。所投予之核酸劑量可予 85702 -49 - 200400970 以變化。 本發明之融合蛋白質及編碼的多肽也可調和成醫藥/免 疫組成物，如充作疫苗。因此本發明也提出含有本發明融 合蛋白質於醫藥上可接受賦形劑中之醫藥/免疫組成物。因 此也提出本發明免疫組成物之製法，此方法包括將本發明 之融合蛋白質或編碼的聚核苷酸摻和以適合的佐劑，稀釋 · 劑或其他醫藥上可接受之載劑。 本發明的融合蛋白質，以SDS PAGE具象化較好有至少 — 80%純度，又較好90%純度。較好蛋白質以SDS PAGE知呈 ® 單一帶狀。 疫苗製劑通常述於 Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)。包膠在脂質體内由Fullerton述於 US Pat. 4,235,877 ° 本發明之融合蛋白質及編碼的聚核苷酸，較好佐以在本 發明之疫苗調和物中。某些佐劑是買得到，如Freund's φ Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI) ； Merck Adjuvant 65 (Merck and _

Company, Inc., Rahway, NJ) ； AS-2(SmithKline Beecham, .

Philadelphia，PA);鋁鹽，如氫氧化鋁凝膠（明礬）或磷酸鋁； 鈣，鐵友鋅鹽；乙醯化酪胺酸之不溶性懸液；乙醯化糖類； 陽離子或陰離子衍生之多醣；聚磷腈；可生物降解之微球； 單鱗醯化之脂質A及quil A。細胞動素’如GM-CSF ’間白 素-2，-7，-12及其他類似的生長因子，也可充作佐劑。 85702 -50- 200400970 在本發明某些具體實例中’佐劑組成物較好是可誘生主 要為Thl型之免疫反應者。高水平之Thl-型細胞動素（如 IFN-γ，TNFct，IL_2及IL_12)對所投予之抗原有誘生細胞調 介之免疫反應之傾向。相反的，高水平之Th2_型細胞動素 (如IL-4，IL-5，IL-6及IL-10)則有誘生體液免疫反應之傾 向。應用此中提供之疫苗後，病人可維持包括Th丨_及Th2_ 型免疫反應。在主要是Th 1 -型反應之較佳具體實例中，丁卜1 _ J細胞動素水平增加之程度更甚於Th2_型細胞動素水平。 這些細胞動素水平可利用標準分析法容易地評估。關於細 胞動素族之總覽’見 Mosmann and Coffman, Ann. Rev, Immunol. 7:145-173，1989 〇 較佳的TH-1誘導佐劑選自包括：3D_mpl，QS2卜QS21 及膽固醇之混合物及CpG寡核苷酸，或二種以上該佐劑之 混合物。誘生主要是Th 1 -型反應之某些較佳佐劑包括如單 磷醯基脂質A，較好是3-去-〇-醯化的單磷醯基脂質a，加上 銘鹽之組合。MPL®佐劑可見自 Corixa Corporation (Seattle, WA ;見如 US Pat. Nos. 4,436,727 ; 4,877,611 ; 4,866,034及 4,912,094)。含有CpG之寡核苷酸（其中CpG二核苷酸未甲基 化）也可誘生主要的Thl反應。此種寡核：y：酸是熟知的，且 述於如 WO 96/02555，WO 99/33488及US Pat. Nos. 6,008,200 及5,856^462。免疫刺激性DNA序列也由如Sato et al.述於 Science 273:3 5 2, 1996。另一較佳佐劑包括皂素，如quuA， 或其付生物’包括 QS21 及 QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.，Framingham, ΜΑ);七葉皂嘗（Escin);洋地黃皂：y：或石 -51 - 85702 200400970 竹或藜（Gypsophila或Chenopodium quinoa)息素。其他較佳 之調和物包括在本發明佐劑組合中一種以上的皂素，如由 ’ QS7 ’ QuU a ’ β_七葉皂苷或洋地黃皂苷組成之群中 至少二者之組合。 另外’皂素調和物可組合以由脫乙醯殼多糖或其他聚陽 離子性聚合物’聚内交酯及聚内交酯-共-乙交酯粒子組成之 疫田洛媒’以聚_Ν乙醯基葡糖胺-為基礎之聚合物基質， 由多醣或化學修飾之多醣組成之粒子，脂質體及以脂質-為 基礎之粒子，由甘油單酯组成之粒子等。皂素也可在膽固 醇存在下调和以形成微粒結構，如脂質體或isC〇Ms。再 者，皂素可與聚氧乙烯醚或酯一起調和，在非微粒之溶液 或懸液中，或呈微粒結構如paucilamelar脂質體或ISC0M。 ·〇素也可與職形劑調和，如carb〇p〇iR，以增加黏度，或可 «周和成乾粉型式加有散劑賦形劑，如乳糖。 在個車父佳具體實例中，佐劑系統包括單磷醯基脂質a 與4素衍生物之組合’如QS21及3D_MpL®佐劑之組合，如 WO 94/00153中所述，或較不具反應性之組成物，其中QS21 以膽固醇所中止，如w 〇 9 6 / 3 3 7 3 9中所述。其他較佳的調和 物包括油水乳劑及生育醇。另—應用Qs2i、3D_MpL⑧佐劑 及生同％於油水乳劑之特佳佐劑調和物，述於W〇 95八^ 〇 中。 ' 、另ϋ的佐劑系統涉及含CpG寡核荅酸及包素衍生物 °特別是CpG及QS21之組合，如WO 00/091 59及WO 〇〇/62_中所述。較好調和物另外含有油水乳劑及生育醇。 85702 •52- 200400970 又在另一進一步實例中，本發明提出含有本發明融合蛋 白質之免疫組成物，且進一步含有D3-MPL，皂素較好是 QS2 1及CpG寡核苷酸，視所需調和在油水乳劑中。 可用於本發明醫藥組成物之另外可說明佐劑包括： Montanide ISA 720(Seppic, France) > SAF(Chiron, California, United States) ’ ISCOMS (CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS 的佐 劑系列（如 SBAS-2 或 SBAS-4，可購自 SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium) > Detox(Enhanzyn®)(Corixa, Hamilton, MT) ’ RC-529(Corixa, Hamilton, MT)及其他胺基烷基胺基葡 糖誓4-鱗酸g旨（AGPs) ’如述於共有的U.S. Patent. Application Serial Nos. 08/853,826 及 09/074,720，其揭示已全文列為本 案參考，及聚氧乙埽醚佐劑，如在WO 99/52549A1中所述。 其他較佳的佐劑包括通式⑴之佐劑分子：H〇(CH2CH20)n-A-R，其中η是1-50，A是一鍵或-C(O)-，R是Cmo烷基或苯 基C 1-5〇烷基。在本發明一個具體實例中包括疫苗調和物， 含有通式⑴之聚氧乙烯醚，其中η是1及50之間，較好4-24， 最好是9; R組份是Cwq，較好C4-C2G烷基且最好是C12烷基， 且A是一鍵。聚氧乙晞醚之濃度應在o.uo%範圍内，較好 0· 1 -10% ’且最好〇. 1 _ 1 %。較佳的聚氧乙晞醚選自以下各 組.聚氧乙埽-9-月桂基鍵’聚氧乙烯-9-硬脂基_，聚氧乙 晞-8-硬脂基醚’聚氧乙晞_4_月桂基醚，聚氧乙烯_35-月桂 基酸及ic氧乙- 23 -月桂基醚。如聚氧乙晞月桂基酸之聚氧 乙烯醚類，述於Merck index(第12版，77Π)。這些佐劑分子 述於WO 99/52549。依據上式⑴之聚氧乙烯醚，若欲求時，

85702 -53 - 200400970 可與另外的佐劑混合。如，較佳的佐劑組合是與CpG，如 所共有之UK專利案GB 9820956.2所述。 本發明的一個具體實例是本發明的抗原，包括核酸載體 可充作免疫刺激劑。較好免疫刺激劑與本發明之抗原同時 投予’而在較佳具體實例中是調和在一起。本發明另一具 體實例是抗原及免疫刺激劑（或反之亦然）依序在相同或鄰 近位置投予’時間可分隔0-1 00小時期間。此免疫刺激劑包 括下列’但不限於此合成的味σ坐峻P林，如imiqUjm〇ci [S-26308，R-837]，（Harrison, et al.，Vaccine 19:1820-1826, 2001 ;及 resiquimod [S-28463，R-848](Vasilakos，et al·, Cellular Immunology 204:64-74, 2000 ;羰基及胺類之 Schiff 鹼，其可在抗原呈現細胞及T-細胞表現原構地表現，如 tucaresol (Rhodes’ J. et al.，Nature 377..71-75, 1995)，細胞動 素’化學動素及輔刺激分子，可為蛋白質或肽，包括促發 炎細胞動素’如干擾素，GM-CSF，IL-lct，IL-Ιβ，TGF，a 及 TGF-β，Thl誘生劑如 γ干擾素，il-2，IL-12，IL-15，IL-18 及 IL-21 ’ Th2誘生劑如 IL-4，IL-5，IL-6，IL-10 及 IL-13 及 其他化學動素及輔刺激基因，如MCP-1，ΜΙΡ-1α，ΜΙΙΜβ， RANTES，TCA-3 ’ CD80 ’ CD86及CD40L，其他免疫刺激性 標的配體如CTLA-4及L-凝集素（L-Selectin)，細胞凋亡刺激 性蛋白質及肽，如Fas，（49)，以合成脂質為基礎之佐劑，如

Vaxfectin(Reyes et al·，Vaccine，19:3778-3786，2001)，角装 烯，α-生育醇’聚山梨醇酯80，d〇PC及膽固醇，内毒素， [LPS]，（Beutler，B.，Current Opinion in Microbiology 3:23-30, • 54 - 85702 200400970 2000) ; CpG 寡-及二核甘酸（Sato, Y. et al” Science 273 (5273): 352-354, 1996 ； Hemmi, H. et al., Nature. 408:740-745, 2000) 及其他可能的配體，其可啟動Toll受體產生Th 1 -誘生性細胞 動素，如合成的霉菌脂蛋白，霉菌蛋白質p 19，肽聚醣，墙 壁酸及脂質A。 其他適合的佐劑包括CT(霍亂弧菌毒素，亞單位A及B)及 LT(熱不安定内毒素，得自E. coli，亞單位A及B)，熱休克 蛋白質族（HSPs)及LLO(李斯特菌溶素Ο ; WO 01/72329)。 當免疫刺激劑是蛋白質時，作用物可以蛋白質或編碼蛋 白質之聚核苷酸型式投予。 其他適合的遞送系統包括微球，其中抗原物質納入或共 輛至可生物降解之聚合物/微球，如此抗原物質可與適合的 藥用載劑混合，充作疫苗使用。”微球” 一般用於描述膠態 粒子，其實質上為球狀且有10毫微米至2毫米之直徑。由各 種天然及合成聚合物製成之微球，可應用於各種生物醫學 應用上。此遞送系統對於在活體内有短半衰期且需多次處 理才可提供效力之蛋白質，或在生物流體中不穩定，或因 分子量相當高不易自胃腸道完全吸收之蛋白質尤其有益。 已知許多聚合物可充作蛋白質釋出之基質。適合的聚合物 包括明膠，膠原蛋白，藻酸鹽，葡聚糖。較佳之遞送系統 包括可— 生物降解之聚（DL-乳酸）（PLA)，聚（交酯-共-乙交 酯）（PLG)，聚（乙醇酸）（PGA)，聚（ε-己内醋）（PCL)及共聚物 聚（DL-乳酸-共-乙醇酸）(PLGA)。其他較佳系統包括異源水 凝膠，如聚（醚酯）多塊共聚物，含有以親水性聚-(乙二 85702 -55 - 200400970 醇）（PEG)及疏水性聚（對苯二甲酸丁二酯）（pBT)或聚（乙二 b )-對苯一曱酸酯/聚（_對苯二甲酸丁二醋）（PEGT/pBT)為 基礎之重複嵌段（Sohier et al· Eur. J. Pharm and Biopharm， 2003，55，221-228)。可提供持續釋出達丨至3個月之較佳系 統，如 PLGA，PLA及 PEGT/PBT。

免疫或疫苗組成物之投予也可採單次基礎（〇nce 0ff basis)，或較好可重複投予，依所需投予多次，如1及7次之 間，較好1及4次之間’間隔约1天及約丨8個月之間，較好1 個月。此可視所需繼以丨至12個月間規律間隔之給藥，時間 長達病人的餘生。在一個較佳具體實例中，病人在”最初第 二次注射”primeboost”療程中接受不同型式之抗原。因此抗 原，融合蛋白質，先以蛋白質為佐之基礎調和物型式投予， 再依序以DNA為基礎之疫苗投予。此投予模式較佳。較佳 佐劑是含CpG寡核茹酸及皂素衍生物之組合，特別是CpG及 QS21之組合’如 WO 00/09159 及W0 00/62800所述。裸露DNA 之攝入可由DNA塗覆在可生物降解之珠粒上而增加，其可 有效地轉運至細胞内。另外，DNA可經由粒子撞擊途徑遞 送，如由氣體-驅動之粒子加速，利用的裝置如powderject

Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)及 Powderject Vaccines Inc. (Madison，WI)所出品及此中所教示的。此途徑提供一個無 針之遞送途徑’其中顯微粒子之乾粉調和物，和聚核甚酸 或多肽粒子’在由手動裝置產生之氘氣氣套内加速至高 速，將粒子推進至重點之標的組織内。 在另一較佳具體實例中，以DNA為基礎之疫苗可先投 85702 -56- 200400970 予，繼之以蛋白質為佐之基礎調和物。又另一具體實例中， DN Α構築利用特殊化之遞送載體遞送，較好利用病毒系 統’又最好是以腺病毒為基礎之系統。其他DNa遞送中適 合的病毒為基礎系統包括反轉錄病毒，慢病毒，腺體-有關 (病毒’疱疹病毒及牛痘苗_病毒為基礎之系統。 在另較佳具體貫例中，蛋白質為佐之基礎調和物及 DNA為基礎疫苗可在相鄰或重複部位上共同投予。依^^八 疫苗調和物本質而定，此可在投藥前將DNA及蛋白質為佐 之調和物先混合，或同時投予DNA及蛋白質為佐調和物而 成。 療程可有顯著的變化，依據相關病人之體型及種屬，所 投丁足核酸疫苗及/或蛋白質组成物之含量，投藥路徑，所 使用的任何佐劑化合物之強度及劑量及精於醫學實務人士 熟知之其他因素。 在進一步方面，本發明提供刺激病人免疫反應之方法， 較好是人類患者之丁細胞反應，此方法包括投予上述之醫藥 組成物。病人可能罹患肺或結腸癌或乳癌，其中該方法可 對疾病提供治療方法，或對此疾之高危險群病人可做預防 上之治療。 在進步方面，本發明提出抑制病人癌症發展之方法， 方去I括對病人投予如上示之醫藥組成物。病人可能罹 患有如肉瘤’前列腺癌’卵巢癌，膀胱癌，肺癌，結腸癌， 結腸直腸癌或乳癌，其中方法可提供對疾病之治療，或對 此疾之高危險群病人可做預防上之治療。 85702 -57- 本發月進#在其他方面提出自生物檢品中移去腫瘤細 胞《万法，此万法包括將生物檢品與可與本發明多肤特異 反應之T細胞㈣’其中接觸進行之條件及充份時間使表現 該蛋白質之細胞可自檢品中移去。 在相關方面，提出抑制癌症在病人中發展之方法，此方 法包括對病人投予如上述之生物檢品。 在其他方面，進一步提出刺激及/或擴大與本發明多肽特 兴之T細胞之方法，此方法包括將丁細胞與下列一者以上接 觸⑴如上述之多肽’（U)編碼此多肽之聚核苷酸及/或（出) 可表現此多肽之抗原呈現細胞；所在之條件及時間足以刺 激及/或擴大T細胞。也提出含有如上述製備之τ細胞之經分 離的T細胞族群。 在進一步方面，本發明提出抑制病人癌症發展之方法， 此方法包括對病人投予有效劑量之如上述T細胞族群。 本發明進一步提出抑制病人癌症發展之方法，此方法包 括：⑷將自病人分離的CD4 +及/或CD8+ 丁細胞與下列一者 以上共培百：⑴此中揭示之多肽；（丨〇編碼此多肽之聚核苷 fel及（111)可表現此多肽之抗原_呈現細胞；及（b)對病人投予 有效劑量之增殖的T細胞，由是抑制病人癌症之發展。增殖 之細胞可，但未必要，在投予至病人先前被選殖。 依據本發明另一具體實例’此中所述之免疫原组成物經 由抗原呈現細胞（APCs)遞送至宿主，如樹突細胞，巨嗤細 胞’ B細胞’單核球及其他可經遺傳操作成有效APCs之細 胞。此細胞可，但未必要’經遺傳操作以增加呈現抗原之 85702 -58- 200400970 能力，以改進T細胞反應之活化作用及/或維持，使 抗-腫瘤作用及/或在免疫上可與受者相容（即符合之Η以單 型）。APCs通常可自各樣生物流體及器官中任—者所分離 包括腫瘤及腫瘤旁之組織，…是自體，同種，同基因 或異種細胞。 ' 本發明某些較佳具體實例是使用樹突細胞或其先祖為抗 原-呈現細胞。樹突細胞為高度強力之ApCs(Banchereau

Steinman，Nature，392:245_251，m8)且已示出有充作有效 的生理性佐劑，誘生預防性或治療性抗腫瘤免疫力（見 Timmerman and Levy，Arm. Rev· Med. 5〇:5〇7_529, 1999)。一 般而言，樹突細胞之鑑定係基於其典型外形（在原位放射 狀，有顯著的胞$突出（樹突）於試管内明示出來），其可高 效率吸收，處理及呈現抗原之能力及其活化天然7細胞反應 之能力。樹突細胞當然可經遺傳操作表現出特異的細胞_表 面受體或配體’此非樹哭細胞於活體内或活體外常可見 的’且此經修飾之樹突細胞包含在本發明内。和樹突細胞 不同的’經分泌而填加有小囊抗原之樹突細胞（稱為外來體） 也可用於疫苗内。（見 Zitvogel et al.，Nature Med. 4:594-600, 1998) 〇 樹突細胞及先祖細胞可得自周邊血液，骨髓，腫瘤-浸潤 細胞’腫瘤旁組織-浸潤細胞，淋巴結，脾，皮膚，臍帶血 或其他任何適合的組織或流體。例如，樹突細胞可於活體 外經細胞動素之混合物，如GM-CSF，IL-4，IL-13及/或TNFa 加自由周邊血回收之單核細胞培養物而分化。另外，自周 85702 -59- 200400970 邊血液，臍帶血或骨髓回收之CD34陽性細胞，其分化成樹 突細胞可在培養基中加入可誘導樹突細胞分化，成熟及增 殖之 GM-CSF，IL-3，TNFa，CD40 配體，LPS，flt3g 己體及 / 或其他化合物而成。 樹突細胞可合宜地分類成"不成熟的"及”成熟的M細胞，其 使二種明確定義之表型有更簡易之區分方式《然而，此命 名不應包括分化所有可能的中間階段。不成熟樹突細胞特 徵為APC，有高的抗原吸收及處理能力，此符合Fcr受體及 甘露糖受體之高表現。成熟表型之典型特徵為這些標幟表 現較低，但負責T細胞活化之細胞表面分子，如I及II類 MHC，黏附分子（如CD54及CD Π)及輔刺激性分子（如 CD40，CD80，CD86及4-1BB)則有高的表現。 APCs通常以本發明之聚核苷酸（或其部份或其他變型）的 轉感，如此，所編碼之多肽，或其免疫原部份可在細胞表 面表現。此轉感作用可於活體外發生，且含有此經轉感細 胞之醫藥組成物可再應用於治療目的，如此中所述。另外， 可將對準樹突或其他抗原呈現細胞之基因遞送溶·媒投予至 患者，造成發生在活體内之轉感作用。樹突細胞之活體内 及活體外轉感作用，通常可利用技藝中已知之任何方法進 行，如WO 97/24447所述，或基因鎗途徑，如Mahvi et al.， Immunology and cell Biology 75:456-460，1997所述。樹突細 胞之抗原填加可由樹突細胞或先祖細胞與腫瘤多肽， DNA(裸露的或在質體載體内）或RNA共培育而成；或與抗原 -呈現重組體細菌或病毒（如牛痘，禽痘’腺病毒或慢病毒載 85702 -60- 姐）。填加之前，多肽可Α /、h共輕至可提供Τ細胞辅助之免 疫配對上（如載劑分子）。另外 ^ 树太細胞可追加以未共輛之 兄疫配對，分別地或在多肽存在下。 定義 序段之方法，特別是遺傳 列分析之較佳方法包括如 —性（identity)及相似度 白質結構分析，序列組合， 本發明也提出分析特色序列或 序列或所編碼之蛋白質序列。序 序列同質性分析方法，如同 (similarity)分析，DNA，RNA及蛋 分支（CladiSUC)分# ’序列基序（則叫分#，開放讀譯架構 決定，核酸驗基點召，密碼子用法分析，核酸驗基修正及 定序層析峰分析。 提供以電腦為基礎之方法，以進行同質性鑑定。此方法 包括以下步驟：在電腦可讀媒體上提供含有本發明聚核苷 酸序列；第一聚核苷酸序列；及將該第一聚核苷酸序列與 至少一個第二聚核芸酸或多肽序列比較以鑑定同質性。 "同一性"如技藝中已知的，是一個以上多肽序列或二個 以上聚核茹酸序列間之相互關係，如例子中可由序列之比 較而決定。在技藝中，，，同一性"也表示多肽或聚核甞酸序 列間序列關聯程度’如例子中可由此序列段間之配合度決 定。”同一性”可以已知方法容易地計算，包括述於下列者 但亦不限於此：Computational Molecular Biology，Lesk A Μ ed., Oxford University, Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic

Press，New York，1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, 85702 -61 - 200400970

Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987 ；及 Sequence Analysis

Primer, Gibskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991 ;及 Carillo, H.,及 Lipman, D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073 (1988)。決定同一性之方法經設計可 使受試序列間有最大的配合。再者’決定同一性之方法可 在可公開取用之電腦程式中編成典。決定二序列間同一性 之電腦程式方法包括下列，但不限於此：在GCG套裝程式 中之 GAP程式（Devereux，J.，et al·，Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)) ’ BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F, et al.，J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)及 FASTA(Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988)。程 式之BLAST族可公開取自NCBI及其他來源（BLAST Manual， Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894； Altschul，S·，et al.，J. Mol. Biol· 215:403-410(1990)。熟知之 Smith Waterman演算法也可用於決定同一性。 用於多肽序列比較之參數包括下列： 演算法（algorithm) : Needleman and Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970) 比較矩陣（comparison matrix) : BLOSSUM62，來自 Henikoff and Henikoff,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)。 間隙罰點（gap penalty) : 8 85702 -62- 200400970 間隙長度罰點：2 以這些參數所採用之程式，係以”gap"程式公開取自 Genetics Computer Group, Madison WI。上述參數為狀比車六 時之欠缺參數（於末端間隙無罰點）。 用於聚核苷酸比較之參數包括下列： 演算法：Needleman and Wunsch，J. Mol Biol. 48:443-453 (1970) 比較矩陣：匹配=+1〇，失配=〇 間隙罰點：50 間隙長度罰點：3 可以 gap 私式得自 Genetics c〇mputer G_p，职。 這些為核版比較之欠缺參數。 關於聚核：y：酸及多肽，”同一性"之較佳定義示於下 (2)中。 ⑴聚核#酸具體實例進-步包括'經分離的聚核芬酸，^ 中所含之聚核^:酸序列與SEQ m N〇:9至卿⑴N〇⑹ 4考序列有至少 5〇,6(3,7()，8(),85,9()，95,97或1(^ 同-性’其中孩聚核答酸序列可與SEQ id耻9至卿^ Ν0:16任一參考序列相同，或可含有某些整數數目料以 變化’此與參考序列比較而言，其中該變化選自由至少一 個核苷酸之刪除，置換（包括 枯锝支及顛換）或嵌入組成之群 且其中該變化可發生在表考 丄 /亏核甘鉍序列芡5,或3,末端位 置，或這些末端位置間任何 了所在，或在參考序列核：y：酸严曰ε 個別配置，或在參考序列Λ. 斤q内—個以上連續基團中，且其中 85702 -63· 200400970 該核签酸變化數目可由SEQIDNO:9至SEQIDNO:16任一 者中核甘酸總數乘以界定同一性百分率之整數，再除以 100’之後再自SEQIDNO:9至SEQIDNO:16中任一者核¾： 酸總數中扣除此積值，或： ηη^χη-(χη·γ), 其中n"是核苷酸變化之數目，χη是在SEQIDNO:9至SEQID N0:16任一者中核苷酸之總數，y是0.50於50%，0.60於60%， 〇.70於 70% ’ 〇·80於 80%，0.85於 85%，0.90於 90%，0.95於 95。/。’ 0.97於97%或1·〇〇於1〇〇%，且•是乘法算子符號，且 其中及y任何的非整數之積，在自Xn扣除前，先捨入至最 近整數。編碼SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:8任一多肽之聚核 菩酸序列之變化，可在此編碼序列中生成無意義，誤義或 和碼穴變’由是在此變化後可改變為聚核苷酸所編碼之多 月太。 經由貫例’本發明之聚核苷酸序列與Seqidn〇:9至SEQ ID N〇:16任—參考系列可以是相同的，即可100%相同，或 與參考序列比較下可包括特定整數數目核酸之變化，如此 同性百分率少於1 00%同一性。此變化選自由至少一個核 酸刪除，置換，包括轉換及顛換，或嵌入組成之群中，且 /、中β麦化發生在參考聚核苷酸序列之5，或3，末端位置，或 k些末端位置間任何一處，在參考序列核酸間個別配置或 在4考序列内一個以上連續基團中。特定同一性百分率之 杉酸又化數目，可由在SEQIDN0:9至SEQIDNO:16任一者 中之核自X總數，乘以明定同一性百分率之整數，再除以 85702 •64· 200400970 100’之後再自SEQIDNO:9至SEQIDNO:16中任一者核酸 總數中扣除該積值，或： ηπ^Χπ-(Χη·γ), 其中ηη是核酸變化之數’ χη是SEQIDNO:9至SEQIDNO:16 任一者中核酸之總數，y是如0.70之於70%，0.80於80%，〇·85 於85%等，•是乘法算子符號，且其中、及y任何非整數之 積’在自xn扣除前先捨入至最近整數。 (2)多肽具體實例進一步包括所含之多肽與seq id NO: 1 至SEQ ID NO:8任一多肽參考序列有至少5〇，6〇，7〇，8〇， 85，90 ’ 95 ’ 97或100%同一性之多肤，其中該多肽序列可 與SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:8任一參考序列相同，或是與 參考序列比較下可包括某些整數數目胺基酸的變化，其中 該變化選自由至少一個胺基酸刪除，置換（包括保留性及非 保留性置換），或嵌入组成之群中’且其中該變化發生在參 考多肽序列胺基-或幾_基_末端位置處，或在參考序列這些末 端位置間任何所在’可在個別胺基酸中配置或在一個以上 連續基團中’且其中該胺基酸變化數目可由在SEq ID NO: 1 至SEQ ID NO:8任一者之胺基酸整數數目乘以明定同一性 百分率之整數，再除以1〇〇，之後自SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:8任一者中胺基酸總數中再扣除該積值，或： naSxa-(xa.y)， 其中na是胺基酸變化之數目，Xa是在SEq ID n〇:2中胺基酸 總數 ’ y 是 0.50於 5 0°/。，0.60於 60%，0.70於 70%，0.80於 80%， 0.85於 85% ’ 〇.9〇於 90%，0.95於 95%，0.97於 97%或 1.00於 85702 -65- 200400970 100%’且•是乘法算子符號，且其中、及7任何非整數之積， 於自\3扣除之前先捨入至最近整數。

經由實例，本發明之多肽序列可與SEQIDN0:1至SEQID N〇:8任—者之參考序列相同，即可有100%相同，或其和參 考序列比較下可含有某些整數數目之胺基酸變化，如此同 一性百分率少於100%同一性。此變化選自由至少一個胺基 酸刪除，置換（包括保留性及非保留性置換）或嵌入組成之群 中，且其中該變化可發生在參考多肽序列之胺基-或羧基_ 末端位置，或這些末端位置之間任何所在，可個別在參考 序列胺基酸間配置，或在參考序列内一個以上連續基團 中。欲決定特定同一性百分率下胺基酸變化之數目，可將 在SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:8任一者中胺基酸之總數乘以 明定同一性百分率之整數再除以1〇〇，之後自由SEQ m ΝΟ:1至SEQIDNO:8任一者胺基酸總數中扣除該積值，或： na^xa-(xa»y), 其中na是胺基酸變化之數目，Xa是在SEq ID N〇:丨至SEQ ID NO:8任一者中胺基酸之總數’ y是如〇.7〇於7〇0/。，〇 8〇於 80% ’ 0.85於85%等’且•是乘法算子符號，且其中心及^任 何非整數之積在自Xa扣除前先捨入至最近整數。 本發明將參照以下實例進一步描述。 fJLLL.製備重Μ體酵母抶Y1796，其可砉規P501融合蛋白 ij-A.含有 C-LytA-P2-C-LvtA(CPC)為融会艚 十 1 ·-蛋白質設計 欲在釀酒酵母中表現之融合蛋白質C-P2-C-p50 1 (另外稱 85702 -66 - 200400970 勿CPC-P5 01)之結構示於圖3。此融合體含有基因LytA之C-末端區（187至306殘基），其中嵌有破傷風毒素之P2片段 (830-843殘基）。P2片段置於C-Lyt-A之殘基277及278之間。 含有P2嵌入之C-lytA片段之後是P501(胺基酸殘基51至553) 再之為His尾部。 所生成融合蛋白質之一級結構具有圖4所述之序列，且相 當於上述蛋白質設計之編碼序列示於圖5。 2-產生可表現CPC-P501(5 1-553)-His融合蛋白質之酵母質 體之選殖策略 • 起始物質是酵母載體？1111'15068(115：專利案0015619.0) • 此載體含有酵母Cup 1啟動子，酵母α前原訊號編號序列 及相當於P501S之殘基55至553之編碼序列，繼之為His 尾。 • 總覽於圖6之選殖策略包括以下步驟： a)第一步驟是將P2序列（用於酵母表現之最佳化的密碼子） 於架構中嵌入，於C-lytA編碼序列内。C-lytA編碼序列為質 體pRIT 14662所有（PCT/EP 99/00660)。此嵌入利用二個稱之 為P21及P22之互補寡核苷酸所形成之承接子進行，嵌入先 前以Ncol打開之pRIT 14662質體内 P21及P22之序列是： P21 5' catgcaatacatcaaggctaactctaagttcattggtatcactgaaggcgt 3' P22 3' gttatgtagttccgattgagattcaagtaaccatagtgacttccgcagtac 5' 在連接，E. coli轉形及轉形子鑑定後，可得質體命名為 pRIT 15 199。 85702 -67- 200400970 b) 第二步驟是以PCR擴大作用製備C-lytA-P2-C-lytA DNA 片段。擴大作用利用pRIT 15199為模板’及命名為 C-LytANOTATG及C-LytA-aa55之寡核站酸進行。二段寡核 苷酸序列為：

C-LytANOTATG =5' aaaaccatggcggccgcttacgtacattccgacggctcttatccaaaagacaag 3' C-LytA-aa55=5' aaacatgtacatgaacttttctggcctgtctgccagtgttc 3' 經擴大片段以限制酶Ncol及Afl III處理，以產生個別的不 齊端。 c) 下一步驟是將上片段與載體pRIT 15068(NcoI處理後較 大的片段）連接產生完全的融合蛋白質編碼序列。在連接及 E. coli轉形後，可得質體命名為pRIT 15200。在此質體中留 下之獨特Ncol位置含有可指導合成起始密碼子之ATG。 d) 在下一步驟，自質體pRIT 15202中製備含有CUP1啟動子 及部份2μ質體序列之Ncol片段。質體pRIT 15202是一種酵 母2μ衍生物，含有CUP1啟動子且在ATG上有Ncol位置（ATG 序列：AAACC ATG)。 e) 分離自pRIT 15202之Ncol片段，與先前已用Ncol打開之 pRIT 15200在正確方向下連接，此方式下pCUPl啟動子位在 編碼序列之V侧。此可生成最終之表現質體，命名為pRIT 15201(見圖 7)。 3-製備重組體酵母株Y1796(RIX4440) 質體pRIT 15201可用來轉形釀酒酵母株DC5(ATCC 20820)。在選擇及鑑定含有質體pRIT 15201之酵母轉形子之 85702 -68- 200400970 後，可得一重组體酵母株，命名為Y1 796，其可表現CPC-P50 1 -His融合蛋白質。在還原及羧醯胺化作用後，蛋白質以 親和力層析（IMAC)繼之以陰離子交換層析（Q Sepharose FF) 分離及純化。

實例II 在如圖2之類似融合蛋白質，可利用此中所示之相當的 DNA序列表現。特言之’酵母株SC333(構築2)相當於Y1796 株，但表現缺乏CPC融合體配對之Ρ50 1 55·553。酵母株 Υ1800(構築3)相當於Υ1796株，但另外含有供P501S之天然 序列訊號（aal-aa34)，同時酵母株Υ1802(構築4)在 CPC-P501S序列上游含有α前訊號序列。酵母株丫179〇(構築 5)可表現缺乏CPC之P501S構築，且仍有α前原訊號序列。 受_例ΠΙ :製備純化的ΓΡΓ_ΐ><:ηι 小規模產製 CPC-P501S HIS(Y1796) Y1796,在加有組胺酸之最低營養要求培養基中生長，加 入100至500 μΜ之CuS〇4可誘使其在對數期中表現，培養物 維持在贼下。S至Μ小時之誘導後可回收細胞。在使用前 才加入酮，且事先不與培養基混合。 於SDS PAGE分析中，酵母細胞在加有13〇祕NaC^pH 4·〇檸檬酸磷酸酯緩衝溶液中進行萃取。萃取之進行，於少 I時使用玻璃珠，而較大量時使驗eneh壓榨機，接著與樣 品緩衝液混合並以SDS_PAGE分析。不同構築在sds p縦 比較分析結果示於圖8，並综合於下表2。如下表1所示，培 養物之表現水平在Υ1796株較高於母株sc333之表現水 85702 -69- 200400970 平，此株可表現相當的P5 01 S-His但缺乏CPC配對。另夕卜’ 訊號序列（α前）之存在並不影響上述討論：培養物之表現水 平在Υ1802株較高於相當株Υ1790之表現水平，此株可表現 相當的P501S-His，但缺乏CPC配對。 表2 重組體株 質體 啟動子 訊號肽 缺合體配 對 P501 aa序列 表現水平 SC333 Ma333 CUP1 55-553-His ©ND Y1796 pRIT 15201 CUP 1 _ CPC 51-553-His +++ Y1802 pRIT 15219 CUP 1 a pre CPC 51-553-His ++++ Y1790 pRIT 15068 CUP 1 a prepro 55-553-His + CPC=clyta P2 clyta ND=未測及，甚至在西方墨點 + =在西方墨點中可測及 +++/++++=在西方墨點可測及，且銀染凝膠中可觀察到 2-Y1 796(RIX4440)大規模之醱酵 100微升之操作菌種塗佈在固態培養基中，並於30°C下生 長約24小時。此固態預培養物再用於接種至震盪燒瓶之液 態預培養物中。此液態預培養物在30°C下生長20小時，再 轉移至20升醱酵槽内。添料批次鏺酵包括約44小時之生長 期及約22小時之謗導期。 竣源（葡萄糖）以連續輸注方式添加至培養中。殘留的葡萄 糖濃度維持相當低（550毫克/升）以使醱酵產生之乙醇減至 最低。可了解此是由有限的葡萄糖填料速率來限制微生物 85702 -70- 200400970 足發展。於生長期末了，加入〇1^〇4誘導(：1；{)1啟動子以產 生抗原。 檢查有無污染物，可將100細胞培育在標準的TSB及TH1 小舐内，其中添加制黴菌素並培育於20_25它及30_35。〇下分 別歷1 4天。如所預期的並無生長現象。 3 -拉原特性鑑定及凑_ i 將在誘導期不同時間點回收之醱酵樣品，經由壓 縮製成細胞勻漿物’並以SDS_PAGE及西方墨點分析。可示 出，重點蛋白質主要部份位在細胞句漿物離心後之不溶部 份。由下示之SDS-PAGE及西方墨點分析明白，是位在細胞 勻漿物離心後所得之團塊中。 圖8AU示出培養物刚127在誘導期間，抗原產製之動 力學。在生長期似乎無抗原表現之發生。特異抗原之產製 力似乎在誘導期之初開始增加，達到6小時，再保持十分穩 足直丨末了仁春知生產力因在相同時期中可觀察到生物 團塊< 累知，’ 1.5至2倍率之增加。抗原生產力據估計每 升撥酵肉汁約毫克，其係，經由以銀染SDS-PAGE(圖9A) 及以抗抗體（針對P5()1S aa 439* 459之老藏腹水以 1/1000之稀釋倍數使用）進行WB分析之經純化的抗原參考 品與粗製萃取物比較而得（圖9B)。

打破細胞後，蛋白質與團塊部份結合。在方法中引入 子之脲基·甲基化作用 乂巧士 μ )鈔應付分子與本身或分子與 85702 -71 - 200400970 I蛋白貝摻雜物經二硫鍵共價橋接之氧化聚集問題。 為了處理此蛋白f之疏水性特性（預計有12個穿膜功能部 位）也需使用去污劑。 針對1升規模且OD(光密度）120之培養物所發展之純化策 略述於圖10。所有的操作均在室溫（RT)進行。 依據DOCTCABCA蛋白質分析，整個之純化產率是每升 OD i 20培養物有毫{的，經純化抗原。此產率聯合培養 物之表現水平，且和表現未融合之p5〇ls_ms之母株純化產 率比較下係較高的。 如下進行蛋白質分析：蛋白質先在D〇c(去氧膽酸鹽）存在下 以TCA(三氯醋酸）沉澱，再於SDS存在下溶於鹼性介質中。 蛋白為再與BCA(雙辛可寧酸bicinchoninic acid)(Pierce)反 應，形成可溶性紫色複合物，其在562毫微米波長下有高吸 光度’此與樣品中蛋白質含量成比例。 三组純化物質之SDS-PAGE分析（圖u)顯示在還原及未還原 條件下並無差異（參見第2，3及4列相對於5，6及7列）。型式 包括在70kDa有一個主帶，較高“…處有斑點及一些淺色降 解的帶。所有帶經特異的抗P501S單株抗體均可測及。 用CPC-P501S His蛋白皙制所迨挤 貫例3或4之蛋白質可調和成含有qS2 1及3d_mpl於油水 乳劑中乏疫苗。 1--疫苗製備 如實例1至3所示產生抗原C-LytA-P2-P501S His。至於佐 劑’ 1周和物中含有3份de-O-乙醯化之單磷醯基脂質a (3D- 85702 •72- 200400970 MPL)及QS2 1於油/水乳劑之混合物。佐劑系統SBAS2，先前 述於 WO 95/17210。 - 3D-MPL :是由革蘭氏陰性菌明尼蘇達沙門氏菌 (Salmonella minnesota)之脂多醣（LPS)所衍生之免疫刺激 劑。MPL已被去醯化’並在脂質a部份缺乏一個磷酸基。此 化學處理可劇烈地減低毒性，並保有免疫刺激特性（尺⑻， 1986)。Ribi Immunochemistry 產生及供應 MPL 至 SB_ Biologicals °

在 Smith Kline BeechamBiologicals進行的實驗，3D-MPL 混合以各種溶媒’可大大地加強體液型及ΤΗ 1型細胞免疫 力。 QS21 :是一種天然皂素分子’萃取自南美石鹼樹（Quillaja saponaria Molina)之樹皮。發展出純化技術，可自樹皮粗製 萃取物中分離個別的皂素，並分離出特殊皂素，qS2 1，為 一種三莊糖苷，與其母組份比較下有較強之佐劑活性及較 低的毒性。已示出QS21可活化MHC I類受制之CTLs成許多 亞早位Ags ’也可刺激Ag特異的淋巴增殖（Kensil，1992)。 Aquila(正式名為 Cambridge Biotech Corporation)產生及供應 QS21 至 SB-Biologicals。 在 SmithKline Beecham Biologicals進行的實驗已證明， MPL&QS21組合，在誘生體液型及TH1型細胞免疫反應上 有清楚之協同作用。 油/水乳劑由二種油（生育醇及角鯊烯）製成之有機相及含 有吐溫80為乳化劑之pb S水相所組成。乳劑含5 %角鯊烯， 85702 -73 - 200400970 5%生育醇’ 0.4°/。吐溫80，且平均粒子大小為ι80毫微米， 已知為 SB62(見 WO 95/17210)。 - 在SmithKline Beecham Biologicals進行之實驗已證明，此 0/W乳劑附屬至3D-MPL-QS2 1 (SBAS2)可進一步增加後者 结沉各種亞早位抗原之免疫刺激特性。 2. -乳劑SB62之製備（2倍濃度）： 吐溫80溶於磷酸鹽緩衝之食鹽水（pbS)中，生成在PBS中 之2%溶液。為生成1 〇〇毫升二倍濃縮乳劑，將5克Dl α生育 醇及5毫升角鯊晞渦旋以充份混合。加入9〇毫升PBS/Tween 溶液’並充份混合。生成之乳劑再通過注射器，最後利用 Μ110 S微量流化機器以微量流化之。生成之油滴有約18 〇毫 微米之大小。 3. -調和物： 如下進行含有j D - Μ P L及Q S 21於油/水乳劑中之典型調和 物.將20微克-25微克C-LytA Ρ2-Ρ501 S稀釋在1 〇倍濃縮之 PBS pH 6.8及H20中，再依序加入SB62(50微升），MPL(20 微克）’ QS2 1 (20微克），視所需含有CpG寡核^:酸（1〇〇微克） 及1微克/毫升之硫柳采（thiomersal)為保藏劑。各組份之量 依所需地變化。所有的培育均在室溫下攪動方式進行。 實例VI.密碼子-最佳化之P501S庠列 1 ·-對照ί組子質體之產生： 全長的 Ρ50 1 S序列選殖至 pVAC 内（Thomsen, lmmun〇1〇gy， 1998; 95:51OP105)，可產生表現質體 JNW680。SEQ ID NO: 17代表在質體JNW680中之人類P501S表現匣，且於圖12中 85702 -74· 200400970 說明。SEQ iD NO·· 1 7之蛋白質序列以單字母型式示出，起 始及停止密碼子以粗體罕示出。Kozak序列以#字符號示 出。人類P501S序列之密碼子使用指數（Seq iD N〇:17)是 0.618 ’由SynGene程式求得。 基本而言’密碼子是利用統計方法所分配，所生成之合 成基因，其密碼子頻率接近高表現E.c〇n及人類基因在自然 下所見者。

SynGene是 Visual Basic程式 _Calcgene之更新版，由 R. s. Hale^G Thompson^ (Protein Expression and Purification :〇l. 12PP. l85_188 (1998))。對於原始序列各胺基酸殘基， 密碼子依據其在高度表現之E. c〇u基因中出現之可能性為

成之密碼子並非全部是標的有機體最 内容可由作者處取得。 基因之密碼子，所生成

此每次程序均可產生不同的合成基

插入子剪接訊號等可能有益，其 精藝者可就這些特色基礎選出適 85702 -75- 合的序列用於多肽之表現。 再者，由於密碼子係在統計基礎上任意地分配，因此可 月匕（雖然可能未必有的）二個以上極罕用於標的有機體之密 碼子會極靠近的聚集。咸信此聚集會使轉譯機制混亂，且 造成特別低之表現速率，因此在最佳化基因中選用密碼 子，於高度表現基因中應排除RSCU值少於〇.2之任何密碼 子，以避免不幸選出任何罕見密碼子群。其餘密碼子之分 佈再依據高度表現之E. c〇li之頻率配置，使合成基因内有整 體分佈，此為此基因典型所有（係數=〇·85)，且也針對高度 表現之人類基因（係數=0.5〇)。

Syngene(Peter ErU，未發表），是以卜以狀程式之更新版 本，視所需排除罕見密碼子，且也可用來依據高度表現之 人類基因密碼子頻率型式而配置密碼子。 CPC-P501S匣之序列自載體pRIT 152〇1(見圖7)選殖至 PVAC，由是產生質體JNW735,此示出SEQIDN〇:18並於圖 13中說明。此序列和卩幻丁以“丨序列相同，除了移去出“叹 及加入Kozak序列（GCC ACC)及適合的限制酶位置。id NO: 1 8之胺基酸序列以單字母型式示出，起始及停止密碼子 以粗體字示出。加框之殘基是破傷風類毒素之？2輔助子抗 原決定部位。底下劃線之殘基為Clyta純化標幟。Kozak序列 以#字铎號表示。 2 ·-產製有P 5 0 1 S金碼子最佳化序列之重組體質體： 雖然P501S夭然序列之密碼子係數指數（cj)已很高 (0_618) ’仍可進步增加值。此有二個可能的益處-可改 85702 -76- 200400970 善抗原之表現及/或免疫原性’且可減少P5(MS載體及基因 體序列間重組之可能性。 _ 利用Syngene程式’可對最佳化序列取得密碼子之選用原 則（SEQ ID NO:19至 SEQ ID NO:20)(圖 14)。下表3示出起始 的P 5 01 S序列及二個代表性密碼子最佳化序列，密碼子係數 指數之比較，依據適合的限制酶位置概況及好的CI指數為 基礎所選擇。 表3 -二個密碼子最佳化P501S基因之密瑪子係崩·指赵叱衿 序列 密碼子係數指數(CI) P501S 0.618 SEQ ID NO: 19 0.725 SEQ ID NO:20 0.755 3 ·密碼-最佳化序列之進一步評估 序列 SEQ ID NO:19 雖然SEQ ID NO:19有好的CI指數（0.725)，其在胺基酸位 置202及203處有二個罕見密碼子。這些密碼子以較頻繁密 ❿ 碼子手動置換’即將DNA序列由TTGTTG變化成CTGCTG。 為了促進選殖及表現’加入限制酶位置及Kozak序列。最終 — 經遺傳操作之序列（SEQ ID NO:21)示於圖15。使用Syngene 程式將此序列片段成寡核甞酸，有最低程度19 - 2 0個驗基之 重疊。因此’圖1 5示出經再遺傳操作之p5〇 1 S密碼子最佳化 SEQ ID NO: 1 9。限制酶位置底下劃線，Kozak序列粗體字表 示’移去罕見密碼子對之再遺傳操作DN A序列則框出。 利用二步式PCR策略，由Syngene程式產生之重疊引子先 85702 -77- 200400970 利用PCR組合策略（下述）組合。組合反應可產生各樣的片段 族群。正確的全長片段利用PCR回收策略及末端引子回收/ 擴大。生成之PCR片段自瓊脂糖凝膠中切出，純化’以Nhel 及Xhol限制水解之，再選殖至pVAC内。以限制酶分析鑑定 陽性純系，並由雙股定序證實之。此可產生質體JNW766， 其由於PCR過程中之錯誤-俯平（error-prone)本質，含有一個 單一沉默突變（SEQ ID N0:21，360位置由C至T)。 1.組合反應-PCR條件，一般策略 反應混合物（總量=50微升）： -lx反應緩衝溶液（Pfx或Proofstart) -1微升Oligo匯集（所有重疊寡物等量混合） -0.5 mM dNTPs -DNA聚合酶（Pfx:或Proofstart，2.5-5單位） -+/- 1 mM MgS〇4 -+/- 1 x加強子溶液（Pfx加強子或Proofstart緩衝溶液Q) 1. 94°C 歷 120秒（僅 Proofstart) 2. 94°C 歷 30秒 3. 40°C 歷 120秒 4. 72°C 歷 10秒 5. 94°C 歷 15秒 6. 40°C 歷 30秒 7. 72°C歷20秒+3秒/循環 8. 循環至第5步驟，25次

9. 保持在4°C 85702 -78- 200400970 2.回收反應-PCR條件（一般策略） 反應混合物（總量=5 0微升）： -lx反應緩衝溶液（Pfx或Proofstart) -5-10微升組合反應混合物 -0.3-0.75 mM dNTPs -50微微莫耳引子（5’末端引子，意識方向） -50微微莫耳引子（3'末端引子，反意識方向） -DNA聚合酶（Pfx或ProofstaΓt，2.5-5單位） -+/- 1 mM MgS04 -+/- lx:加強子溶液（Pfx加強子或Proofstart緩衝溶液Q) 1. 94°C 歷 120秒（僅 Proofstart) 2. 94°C 歷 45秒 3. 60°C 歷 30秒 4. 72°C 歷 120秒 5. 循環至第2步驟，25次 6. 72°C 歷 240秒 7. 保持在4°C下 序列 SEQ ID NO:20

雖然SEQ ID NO:20有極佳的CI指數（0.755)，可注意到其 在胺基酸位置131及132處有一罕見密碼子對。這些密碼子 以較頻繁密碼子手動置換，即將DNA序列由TTGTTG變化成 CTGCTG。為促進選殖，將G突變成C可移去内部之BamHI 位置（見圖16底下劃雙線之核苷酸）。為可促進選殖及表現， 加入限制酶位置及Kozak序列。最終經遺傳操作之序列（SEQ 85702 -79- 200400970 ID NO:22)示於圖16。使用Syngene程式將此序列片段成寡核 苷酸，有最低程度19-20個鹼基之重疊。 — 因此圖16示出經再遺傳操作P501S密碼子最佳化序列 20(SEQ ID NO:22)。限制酶位置底下劃線，Kozak序列加粗 體字，移去罕見密碼對之再遺傳操作DNA序列加框，而移 去BamHI之沉默點突變底下劃雙線。 利用和上述類似的二步式PCR策略，可擴大及選殖全長 的P501S片段至pVAC内。以限制酶分析鑑定陽性純系，並 由雙股定序證實之。如此生成質體JNW764。P501S編碼匣 之序列示於圖16(SEQ ID NO:22)。 D N A序列相似性 經ClustalV(稱重）方法排列後之配對距離示於下表4。下 表4示出起始的人類P501S序列及二個密碼子最佳化序列 SEQ ID ΝΟ··21及22(其為進一步研究而選出）間之相似性百 分率。數據證實，密碼子最佳化DNA序列與原先P501S序列 有約80°/。相似。 表4 SEQ ID NO: 與起始P501S序列之相似度(％) 21 79.6 22 79.4 實例VII.密碼子-最佳化CPC序列 1 ·-入口 由於原先的CPC序列最初設計是為在酵母中有最佳表 現，此文描述為於人類表現而最佳化密碼子之過程。 85702 -80- 200400970 2.-序列設計 cpc最佳化之起始序列示於圖n(SEQ ID n〇:23)。此完全 何生自pRIT 15201 ’且含CPC整個編碼序列，加上卩5013四 個胺基酸，以促進下游之選殖。利用Syngene程式，可得一 绐碼#又最佳化之序列，其中代表性序列示於圖^ 8(SEq NO:24-25)。表5示出起始的CPC序列及二個代表性密碼子最 佳化序列之密碼子係數指數。 表5二個CPC最佳化序列之密碼子係數指數 序列 密碼子係數指數(CI) 原先CPC=SEQ ID NO:23 0.506 SEQ ID NO:24 0.809 SEQ IDNO:25 0.800 除了密碼子最佳化之外，均對所有序列進行限制酶選殖 位置之篩選。在最高CI值及有益之限制酶位置概況之基礎 上，選出SEQ ID NO:24以構築之。為了促進選殖及表現， 加上5'及3'選殖位置，並在起始的ATG起始密碼子5，嵌入 Kozak序列（GCCACC)。此經遺傳操作之序列示於圖19(SEq ID NO:26)。此序列包括P501S四個胺基酸（框出），限制酶選 殖位置（Nhel及Xhol，底下劃線），Kozak序列（加粗），停止 密碼子（斜體字）及4 bp鄰接不相關之DNA，以促進選殖。 使用Syngene程式使此序列片段化成50-60成員之寡核答 酸，最低程度之重疊為18-20個驗基。 利用類似上述之二步式PCR策略，正確片段可回收/擴 大’並選殖至pVAC内。以限制酶分析鑑定陽性純系，且序 85702 -81 - 200400970 列證實產生出載體JNW 759。 4.-DNA相似度 - 經排列ClustalV(稱重）之配對距離示於下表6。表中示出 起始序列CPC及密碼子最佳化序列間在DNA層次之相似度 百分率，並且證實密碼子最佳化序列和原先CPC序列有約 8 0〇/〇相似。 表6 SEQ ID NO: 與起始CPC序列之相似度(％) 24 80.2 25 81.6 實例VIII.構築P501S融合體候選者 所有示於下圖式之候選者均為密碼子最佳化者，並利用 重疊的PCR方法構築，以質體JNW764及JNW759為模板（分 別是SEQ ID NO:22及SEQ ID NO:26)，並選殖至表現載體 p7313 ie 。 以下以圖式示出之四個候選者係以CPC-P50 IS為基礎。密 碼子最佳化CPC-P501S是構築A。候選者B，C，D也包括編 碼P501SN末端50個胺基酸之序列，或定位在CPC-P501S之 N末端（構築D)，CPC-P501S之C末端（構築C)或介於CPC及 P501S之間（構築B)。構築圖式代表示於圖20。 四種構築各自之核苷酸及蛋白質序列，於核苷酸序列示 於SEQ ID NO:3 7-40，且SEQ ID NO:45-48為相當的多肽序 列。於構築A，C及D，底下劃線之密碼子優先編碼酵胺酸（或 TAC或TAT)，但核：y：酸序列可改變以編碼蘇胺酸（或AC A， 85702 -82- 200400970 ACC，ACG或ACT)。在構築B，底下劃線之密碼子優先編 碼蘇胺酸（ACA，ACC，ACG或ACT) ’但核甞酸序列可改變 以編碼酪胺酸（或TAC或TAT)。在所有構築中’編碼序列鄰 接適合的限制酶選殖位置（在此例子中，為NotI及BamHI) ’ 且Kozak序列緊接在起始ATG之上游。下表7示出以上構築 之質體確認。 表7 構築 底下劃線密碼子之胺基酸 密碼子序列 質體確認 A 酪胺酸 TAC JNW771 B 蘇胺酸 ACA JNW773 B 酪胺酸 TAC JNW770 C 酪胺酸 TAC JNW777 D 酪胺酸 TAC JNW769 以 p7313-ie(空載體），pVAC-P501S(JNW735)，JNW770 ’ JNW771及JNW773免疫接種後之細胞反應以ELISP〇丁評 估，繼之在第0天PMID之初次免疫接種，及在第21 ’ 42及 70天之三次追加。追加注射後7天進行分析。圖27示出，以 JNW770，JNW771及JNW773免疫之老鼠，可測及有良好的 IL-2 ELISPOT反應。 實例IX.利用蛀子-調介之古内i廉送（PMID)研究之免疫原 性實驗 全長的P501S，當以粒子調介之皮内遞送（PMID)遞送時可 產生良好的抗體及細胞反應。這些數據證明，PMID是極有 效之遞送路徑。再者，P501S及CPC-P501S之比較證實 85702 -83- 200400970 CPC-P501S以肽EUSPOT決定知可誘生較強的免疫反應。 1.-材料及方法 一 1.1皮膚的基因鎗免疫接種 貝旺D N A利用鼠化弓及亞精胺，沉殿至2微米直徑之金株 上。加料之珠粒塗佈在Tefzel管上’如所述（Eisenbraum et al, 1993; Pertmer et al, 1996)。利用Accell基因遞送系統進行粒 子撞擊（PCT WO 95/19799)。於各質體，雌性C57BL/6老鼠 在第0’ 21 ’ 42及70天時免疫接種。各次投藥包括dna/金 的二次撞擊’可生成約4 - 5微克總劑量之質體。 1.2.以ELISPOT分析對P501S基因產物之T細胞反應 a) 脾細胞之製備 脾取自追加注射7-14天後之經免疫動物。脾之處理是在 玻片間磨碎產生細胞懸液。紅血球細胞以氣化铵處理溶解 之，再移去殘屑留下脾細胞細碎之懸液。細胞以8χ 1 〇6/毫升 濃度再懸浮於RPMI完全培養基中，以應用於ELISPOT分析 中 〇 b) 肽庫之篩選 涵蓋大部份P501S序列之肽庫可得自CorixaCorp。此庫含 有50個15-20成員之肽，有4-11個胺基酸肽之重疊。肽編號 1-50。此外，使用預測程式（H-G. Rammensee, et al.: Immunogenetics, 1999, 50:2 13-219)(http://s vfpeithi.bin i- heidelberg.com/)以自P501 S序列中預測推想的Kb及Db表 型。十個最佳的Kb及Db抗原決定部位購自Mimotopes (UK)，且包括在此庫中（肽5 1-70)。於肽庫篩選時，肽之使 85702 -84- 200400970 用最終濃度為50微克/毫升（約25-50 μΜ)於IFNy及IL-2 ELISPOTS，利用下述之策略。於IFNy ELISPOTS，IL-2以 10毫微克/毫升加至分析中。篩選用之脾細胞取自C57BL/6 老鼠第84天，其在第0, 21，42及70天時免疫接種。自庫篩 選中可鑑定出三個肽-肽1 8(HCRQAYSVYAFMISLGGCLG) ，22(GLSAPSLSPHCCPCRARLAF)及 48(VCLAAGITYVPPLL LEVGV)。接下來這些肽用於ELISPOT分析。 c)ELISPOT 分析 盤内塗佈以15微克/毫升（於PBS中）大鼠抗老鼠IFNy或大 鼠抗老鼠IL-2(Pharmingen)。盤在+4°C下塗佈一夜。使用 前，盤以PBS洗三次。脾細胞以4χ 105細胞/孔洞加入盤内》 自庫篩選中4藍定之肽再購自Genemed Synthesis，且使用之 最終濃度為50微克/毫升。用於此分析中之CPC-P501S蛋白 質（GSKBio)為20微克/毫升。ELISPOT分析在IL-2(10毫微克 /毫升），IL-7(10毫微克/毫升）或無細胞動素下進行。各孔洞 之總量為200微升。含有以肽刺激細胞之盤，在潮濕的37°C 培育箱中培育16小時。 e)ELISPOT分析盤之展開 細胞以水（浸入1 0分鐘以確實溶解細胞）洗一次，再以PBS 洗三次，以自盤中移出。經生物素共軛之大鼠抗老鼠IFNg 或IL-2(Pharmingen)以1微克/毫升於PBS加入。盤在震i下 培育2小時，於室溫下。盤再以PBS洗三'次，再加入1/1000 稀釋之鏈抗生物素蛋白鹼性磷酸酶（Caltag)。以PBS洗三次 後’與BCICP受質（Biorad)共培育1 5-45分鐘可顯示出點。利 85702 -85 - 200400970 用水洗去受質’再令盤乾燥。利用Brian Hayes, Asthma Cell Biology unit, GSK之影像分析系統計數點數。 — 1 ·3 .相對於P5 0 1 S基因產物之抗體以ELJS A分析 血清樣品得自動物，係在第_ 1，2 8，49及56天時由靜脈 牙刺而仔並刀析抗- P50 1 S4几體存在與否。以]Siunc Maxisorp 盤進行ELISA ’盤先以0.5微克/毫升cpC_P501S蛋白質 (GSKBio)於碳酸氫鈉緩衝溶液在4艺下塗佈一夜。以TBS_ 吐溫洗滌後（Tris-緩衝食鹽水，pH 7.4含有0.05%吐溫20)， 盤以阻斷緩衝溶液（3% BSA於TBS-吐溫緩衝溶液）在室溫下 2小時以阻斷之。所有血清均以！ ： 1⑽稀釋在阻斷緩衝溶液 中，於RT下培育1小時。利用HRP-共軛之兔子抗-老鼠免疫 球蛋白（#P0260 ’ Dako)以1 : 2000稀釋在阻斷緩衝溶液中可 偵測抗體之結合。盤再次洗滌，已結合之共軛物利用Fast OPD呈色試劑（Sigma，UK)偵測。反應加3M硫酸中止之，且 OPD產物由490毫微米吸光度之偵測定量之。 1.4.瞬時轉感分析 人類P501 S表現自各種DNA構築，可由質體瞬時轉感至 CHO(中國倉鼠卵）細胞，再以總細胞蛋白質之西方墨點吸潰 分析。瞬時轉感依廠商準則以Transfectam試劑（Promega)進 行。簡言之，24孔洞之組織培養盤每孔洞中種入5χ 1 〇4 CHO 細胞於i毫升DMEM完全培養基（DMEM，10% FCS，2 mM L-穀胺醯胺，青黴素100 IU/毫升，鏈霉素1〇〇微克/毫升）並在 3 7°C下培育16小時。0.5微克DNA加至25微升0·3MNaCl(足 供l孔洞），且2微升Transfectam加至25微升Milli-Q。DNA及 85702 -86- 200400970

Transfectam溶液緩衝混合，並在室溫下培育1 5分鐘。在此 培育步驟中，細胞以PBS洗一次，再覆以1 50微升無血清之 培養基（DMEM，2 mM L-毅胺酿胺）。DNA-Transfectam溶液 逐滴加至細胞中，盤緩和震盪並在37°C下培育4-6小時。加 入500微升DMEM完全培養基，細胞再於37°C下培育48-72 小時。 2.以P501S質體瞬時轉感之CHO細胞之西方墨點分析 瞬時轉感之CHO細胞以PBS洗滌，再以Versene(l : 5000)/ 0.025%胰蛋白酶溶液處理，以將細胞轉移至懸液内。經胰 蛋白酶化作用後，將CHO細胞成團塊再懸浮於50微升PBS 中。加入等量2x NP40溶解緩衝溶液，細胞再置冰上培育30 分鐘。加入含有50 mM DTT之100微升2x TRIS-甘胺酸SDS 樣品緩衝容液（Invitrogen)，且溶液加熱至95 °C歷5分鐘。 1-20微升樣品填加至4-20% TRIS-甘胺酸凝膠1.5毫米 (Invitrogen)，再於 lx TRIS-甘胺酸緩衝溶液中（Invitrogen) 以正常電壓（125 V)電泳90分鐘。以預先染色之寬範圍標幟 (New-England Biolabs，#P7708S)定出樣品之尺寸。電泳後， 樣品轉移至Immobilon-P PVDF膜（Miliipore)，在甲醇中預沾 濕，利用 Xcell III Blot Module (Invitrogen)，lx轉移緩衝溶 液（Invitrogen)含有20%甲醇，及25V之固定電壓歷9〇分鐘。 膜在4°C，以TBS-Tween(Tris-緩衝的食鹽水，pH 7.4，含有 0.05% Tween 20)含有3%乾燥之脫脂乳（Marvel)阻斷一夜。 一次抗體（10E3)以1 : 1000稀釋，並與膜在室溫下培育1小 時。經過在TBS-Tween中充份洗務後，二次抗體（HRP-共輛 85702 -87- 200400970 之兔子抗-老鼠免疫球蛋白（#P〇260，Dako))以1 : 2000稀釋 在含有3%乾燥的脫脂乳之TBS-Tween中，並與膜在室溫卞 共培育1小時。經充份洗滌後’膜與Supersignal West Pico 化學發光受質（Pierce)共培育5分鐘。移去過量的液體，且膜 封在二片黏附膜内，再曝於Hyperfilm ECL底片（Amersham-PharmaciaBiotech)歷卜 30 分鐘。 3. 產生全長的人類P501S表現匣 構築P501S表現匣之起點是質體pcDNA3.1-P501S(Corixa Corp)，其具有pcDNA3.1骨架（Invitrogen)其中全長的人類 P501S cDNA匣選殖在EcoRI及Notl位置之間。此載體也稱為 JNW673。P501S之存在可以螢光定序證實。cDNA匣之序列 由NCBI/Genbank序列示出（編號AY033593)。人類P501S自 JNW673模板DNA行PCR擴大，以Xbal及Sail限制水解之， 再選殖至pVAC之Nhel/Xhol位置内，可產生載體JNW680。 片段相較於CMV啟動子之正確方向可由PCR及DNA定序證 實。表現匣之序列示於圖12(SEQ ID NO:17)。 為構築CPC-P501S表現匣，CPC-P501S自載體pRIT152(H行 PCR擴大（見圖7)，以Xbal及Sail限制水解，再選殖至PVAC 之Nhel及Xhol位置内，產生質體JNW735。正確的方向可以 PCR及定序證實。CPC-P501S表現匣之序列示於圖13(SEQ IDNO:18)。

4. 自質體JNW680及JNW735表現人類P501S P501S表現質體瞬時轉感至CHO細胞，再如方法所述製備 總溶胞產物。總溶胞產物之西方墨點分析，可分別鑑定出 85702 -88- 200400970 樣品為JNW680及JNW735轉感的約55 kDa及62 kDa之單一 帶（圖21)。此分別符合對P501S及CPC-P501S 59.3 kDa及63r3 kDa預測之分子量。CPC標幟之加入並不會有害地影響 P501S之表現。 5.結果 5.1. PMID免疫接種後對人類P5 01S之抗體反應 以pVAC(空載體）及pVAC-P501S(JNW680)免疫接種後之 抗體反應以ELISA分析評估，此係在第0天以PMID初次免疫 泰 接種，及在第21，42及70天時三次追加注射後進行。圖22 示出於第-1，28，49(老鼠Al-3，B1-3)及第56天（老鼠A4-6， B4-9)取得之血清之抗體反應。雖然對pVAC空載體有某些非 -特異的反應，但在9隻老鼠中5隻仍可觀察到對P501S構築 之特異反應。 5.2. 經由P501S肽庫篩選，自C57BL/6老鼠之人類P501S中鑑 定新穎的T細胞抗原決定部位 JNW680(pVAC-P501S)經 PMID在第 0 天及第 21，42 及 70 天 籲 三次追加注射免疫接種後，於第84天進行ELISPOT分析。 _ 得自P501S庫之肽，在50微克/毫升終濃度下測—試。由此最 . 初篩選，頃發現三種肽可刺激IFNy及/或IL-2之分泌。即肽 . 18，22及48(圖23)。三種肽可用於接續的細胞分析。 5.3. PMrD免疫接種後對pVAC-P501S(JNW680)之細胞反應 以pVAC(空載體）及pVAC-P501S免疫接種後之細胞反 應，經第0天PMID初次免疫接種，及第21，42及70天三次 追加後，以ELISPOT分析評估。分析在追加後7天進行。使 85702 -89 - 200400970 用二種不同的分析條件：1)肽18 ’ 22及48以50微克/毫升終 濃度在肽庫篩選中鑑定及2)CPC-P501S蛋白質以20微克/毫 升終濃度使用。圖24A示出雖然對空載體（A4-6)並無P501S-特異的反應，PVAC-P501S構築在所有老鼠中（B6-9)可誘生 對肽18及22特異的IFN-γ反應，同時有-老鼠（B7)也顯出對肽 48之IFN-γ反應。圖24B顯示，所有的老鼠對肽18，22及48 均顯出特異的IL-2反應。再者，經pVAC-P501S免疫之老鼠 (B6-9)對CPC-P501S顯出中度的IL-2反應，而接種以空載體 之老鼠（A4-6)則無反應。 5_4· PMID免疫接種後，對P501S及CPC-P501S細胞反應之比 較 以 pVAC(空載體），PVAC-P501S(JNW680)及 CPC-P501S (JNW735)免疫接種後之細胞反應，在pmid於第〇天初次免 疫接種’及第21及42天追加後以ELISPOT評估。分析在追 加注射便7天進行。使用二種不同的分析條件：1)肽1 8，2 2 及48以50微克/毫升終濃度在肽庫篩選中鑑定，及2)cpc_ P501S蛋白質以20微克/毫升終濃度使用。圖25示出，在第 28天時，CPC-P501S可對10微克/毫升之肽22誘生良好的 IL-2反應，而對空載體或pVAC_P5〇ls任一者均無”。弘特 異的反應。利用CPC-P5〇1S蛋白質再剌激脾細胞也可觀察到 這些結果。在第49天（第二次追加注射後），由p5(Hs&cpc· P501S誘生之反應是相當的。這些數據建議，添加μ標幡 可改善對P501S反應之動力學及/或幅度。 85702 -90- 200400970 1. 設計及佐劑調和物 利用重組體純化的CPC-P501S蛋白質調和在佐劑免疫接 種所誘生之免疫反應以在老鼠中進行之實驗鑑知。將丨〇群 中的5群’ 8週大雌性C5 7BL6老鼠免疫接種1〇微克CPC-P501 S蛋白質於不同的佐劑系統，於皮下注射2_6次，間隔2 週°所投予之量相當於人類劑量的1 /1 〇th(5〇微升）。 在脾細胞上分析血清學（總Ig反應）及細胞反應（T細胞淋 巴增殖及細胞動素產製），係在最後一次免疫接種後6_丨4天 利用如Gerard, C. et al，2001, Vaccine 19, 2583-2589所述之 標準策略進行。 示出一個代表性實驗之數據。其中包括8組C57B1/6雌性 老鼠中的5組’在第〇，14，28，42天時接受4劑CPC P501 (1 〇 微克）+佐劑之肌内注射（A ’ B ’ C)。實例V提出如何進行調 和物之實驗策略。簡言之，佐劑調和物如下（所給予之劑量 針對10 0微升1劑）： -佐劑 A : QS21(10 微克），MPL(10 微克）及 CpG7909(100 微克），依WO 00/62800所述之方法製作， -佐劑 B : QS21(20微克）’ MPL(20微克），CpG7909(100 微克）及50微升SB62油/水乳劑之調和物（WO 95/17210); -佐劑 C : QS21(l〇微克）’ MPL(10微克），CpG7909(100 微克）及10微升SB62油/水乳劑之調和物（WO 99/12565)。 2. 血清學 由免疫接種誘生之總Ig反應，利用CPC-P501或RA12-P501 行ELIS A測度之（c，指P501蛋白質之經截斷型式，相當於蛋 85702 -91 - 200400970 白質之C末端稠合在其N末端，而TB衍生的蛋白質RA.l 2-

Ral2係衍生自 MTB32A抗原’述於 Skeiky et al.，Infection a rrd

Immun, (1999)，67:3998-4007)。 加有佐哲彳之CPC-P501S蛋白$在免疫接種後可生成良好的 抗體反應。 3 細胞反應 3.1 ·淋巴增殖作用 最後一次免疫後7天’淋巴增殖作用在脾細胞上個別進 _ 行。2.1 0e5脾細胞分成四份塗佈於96孔洞微量盤，於含有1 % ❿ 正常老鼠血清之RPMI培養基中。以免疫原（CPC-P501)或經 截斷之蛋白質（RA12 P501)在不同濃度下再刺激72小時後， 加入1微居里3H胸苷（Amersham 5居里/毫升）。16小時後，細 胞回收至過濾盤。納入之放射活性以β計數儀計數。結果以 CPM或刺激指數*(以抗原在培養物中之幾何平均CpM/無抗 原培養物中之幾何平均CPM)表示。 以ConA(2微克/毫升）再刺激之陽性對照組納入以為陽性 _ 對照組。 如圖26所示’在所有接受經佐劑蛋白質老鼠组別中，以 免疫原或在其他表現系（E. coli)中製成之其他ρ5〇ι蛋白質 . 於試管内再刺激後’均可於脾臟中觀察到p5〇丨特異的淋巴 增殖作甩，顯示T細胞經免疫接種已於活體内被啟動。 3.2 由脾細胞細胞内染色偵測IFNg之產製 老鼠PBL在GMCSF存在下培養7天後，可得骨髓樹突細胞 (BMDC)。 85702 -92- 200400970 最後一次免疫後7天，收集脾或PBL再製備細胞懸液。l〇e6 細胞（每組一個匯集）與10e5 BMDC共培育+/_18小時’與㈧ 微克/毫升CPC P5 01蛋白質或RA12追加一夜。 經2.4 G.2抗體處理後，脾細胞以具螢光之抗CD4及CD8 抗體（抗CD4-APC及抗CD8PerCP)染色。經滲透化及固定步 驟後，細胞以具螢光之抗IFNg-FITC抗體染色。 以CPC P501在不同佐劑下免疫接種之老鼠，CD4及CD8 T 細胞均可反應DC產生IFNg，其中並追加以免疫原及在E. c〇li上產製之C-term p501(可由脾及PBLs細胞内染色顯 示）。在接受加有佐劑之CPC-P501S之组中，與單獨的蛋白 質比較下，製造此細胞動素之細胞％增加4-10X ’且〇. 1 - 1 〇% 的CD4或CD8 T細胞可產生IFNg。 综合而言，這些數據可結論出加有佐劑之CPCP501蛋白 質在老鼠中具有免疫原性。 在CPC_ P50 1加有佐劑於肌内免疫接種數次後，可測及 P501特異的體液及細胞反應，包括由CD4及CD8 T細胞產生 之 IFNg。 實例X. CPC-MUC-1槿築及庠列 CPC序列取自核苷酸SEQ ID NO:28。 MUC1序列購自Genbank資料庫（編號NM_002456)。 1.MUC1-CPC 構築

由於MUC 1中存在有訊號序列，其於轉譯後解離，CPC基 序置於C-末端。所生成之MUC1-CPC DNA序列示於SEQ ID NO:xx(圖28A) ’且相當的MUC1-CPC蛋白質序列在SEQ ID 85702 -93· 200400970 NO:yy(圖 28B)。 2.SS-CPC-MUC1 構築 — 由於MUC 1中存在有訊號序列’其於轉譯後解離，MUC i 訊號序列以異源的領導子序列（來自人類免疫球蛋白重鏈） 取代’且CPC之基序被嵌入異源領導子序列及MUC 1序列之 間，產生序列稱為ss-CPC-MUCl，如圖29所示。 【圖式簡單說明】 圖1 : C-LytA之序列資料。各重複子利用以下排列程式，在 多重序列排列及二級結構預測為基礎下定義：丨）MatchBox (Depiereux E et al. (1992) Comput Applic Biosci 8:501-9) ； 2)

ClustalW(Thompson JD et al. (1994) Nucl Acid Res 22:4673 -80) ； 3)Block-Maker (Henikoff S et al. (1995) Gene 163:gc 17-26)〇 圖 2 : CPC及天然構築（SEQ ID NO:27-3 6)。 圖3 :在釀酒酵母中表現之CPC-P501 His融合蛋白質之圖式 結構。 圖4 : CPC-P5 01 His融合蛋白質之一級結構（SEQ ID NO:41)。 圖 5 : CPC-P501 His (pRIT15201)之核甞酸序列（SEQIDNO: 42) ° 圖6 :質體pRIT 15201產生之選殖策略。 圖7 : pRIT 15201之質體舆圖。 圖8 : CPC P501及P501在釀酒酵母DC5株之比較表現。 圖9 : CPC-P501S HIS(Y1796)之小規模產製。圖9A代表由銀 染SDS-PAGE所估計之抗原產製力；圖9B代表由西方墨點所 85702 -94- 200400970 估計之抗原產製力。 圖10 :由Y1796產生之CPC-P501-His之純化圖式。 一 圖1 1 ·· CPC P501 His純化之蛋白質型式（4-12% Novex Nu-Page聚丙烯醯胺預切好之凝膠）。 圖12 :天然全長的P501S序列（SEQ ID NO:17)。 圖 13 : JNW73 5之 CPC-P501S表現匣序列（SEQ ID NO:18)。 圖14 :二密碼最佳化之P501S序列（SEQ ID NO:19-20)。 圖15 :經再遺傳操作之密碼最佳化序列19(SEQ ID NO:21)。 圖16 :經再遺傳操作之密碼最佳化序列20(SEQ ID NO:22)。 圖17 : CPC最佳化之起始序列（SEQ ID NO:23)。 圖18 :具代表性之密碼子最佳化CPC序列（SEQ ID NO:24- 25) 。 圖19 :經遺傳操作之CPC密碼子最佳化序列（SEQ ID NO: 26) 。 圖20: P501S CPC融合體候選構築及序列（SEQ ID NOs:37-40 &45-48)。 圖 21 : CHO細胞在以 P501S(JNW680)，CPC-P501S(JNW735) 及空載體對照組瞬時轉感後之西方墨點分析。 圖 22 :在 0，21&42 天以 pVAC-P501S(JNW680，老鼠 B1-9) 或空載體（pVAC ’老鼠A1-6)免疫接種後之抗-P501S抗體反 應。在第-1天採取預先血液。接下來在第28及49天（老鼠 Al-3，B1-3)及第56天（老鼠A4-6，B4-9)再採血。所有血清 均以1 /1 00稀釋測試。以pVAC免疫之老鼠結果予以平均。示 出個別PVAC-P501S免疫老鼠之結果。至於陽性對照組，包 85702 -95- 200400970 括得自Adeno-P501S免疫老鼠之血清（C〇nXa C〇rP ’稀釋 1/100)。 、 ，η，21，42及70天時以 圖23 :肽庫利用C57BL/6老鼠，在第0 . ^ .玫克。所有的肽使用之 pVAC-P501S(JNW680)免疫接種而篩遂之 丨 ^ Eii· 1-50，重叠達 15-20 終濃度為50微克/毫升。得自Corixa的脉1 至 庫決定部位，且得自 mers。肽5 1 -70預測有8-9mer kb及Db机你

Mimotopes(UK)。樣品71·72及73-78分別為應3〇對知、組及 無肽之對照組。Α組示出IFN-γ反應’ 組不出IL_2反應。 可用於接續免疫分析之肽以黑體字杳出。 圖 24 :經 pVAC-P501S(JNW680，B6-9)及 pVAC2 白組（A4_6) 在第0,21，42及70天PMID免疫接種猿，在第77天以EUSP〇T 分析細胞反應。肽18，22&48使用之濃度為50微克/毫升° CPC-P501S蛋白質使用之濃度是20微克/毫升。圖A示出1FN-γ反應，而圖B示出IL-2反應。 圖25 : P501S及CPC-P501S之比較。細胞反應在第28天以肽 22(10微克/毫升）經IL-2 ELISPOT測度。老鼠在第0及21天以 pVAC 空白組（對照用），PVAC-P501S(JNW680)ACPC-P501S (JNW735)PMID 免疫接種。 圖26 :在以CPC-P501S蛋白質免疫接種後之人類反應（在脾 細胞上之淋巴增殖作用）。 圖27:對不同CPC-P5 01S構築之免疫反應評估。細胞反應在 第28天以IL-2 ELISPOT測度。老鼠在第〇及21天，以p7313-ie 空白組（對照組），JNW735 及 CPC-P501S構築（JNW770，771 及773)經PMID免疫接種。 85702 -96- 200400970 圖 28 : MUC-1 CPC序列（SEQ ID NO:49&50)。 圖 29 : ss-CPC-MUC-1序列（SEQ ID NO:5 1&52)。 -97- 85702 200400970 序列表 <110> GlaxoSmithKline Biologicals sa Glaxo Group Ltd <l2〇>免疫組合物 、 <130> B45311 <140 092115540 <141> 2003-06-09 <150> 0213365.0; 0300914.9 <151> 2002-06-11; 2003-01-15 <160> 52 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 15 <212> PRT <213>肺炎鏈球菌 <400 > 1

Gly Trp Gin Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp x 5 l〇 15

<210 > 2 <21i> 21 <212> PRT <213>肺炎鏈球菌 <400> 2

Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr 10 15

Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe 1 5

Tyr Phe Asp Ser Ser 20

<210> 3 <211> 22 <212> PRT <213>肺炎鏈球菌 <400> 3

Lys His Thr Asp Gly Asn Trp 10 15

Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg 1 5

Tyr Trp Phe Asp Asn Ser 20 <21〇> 4 <211> 20 _

<212> PRT <213>肺炎鏈球菌 <4〇0> 4

Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr 1 5 10 15

Phe Asn Glu Glu 20 <210> 5 85702 200400970 <211> 21 <212> PRT <213>肺炎鏈球菌 <400> 5

Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr 15 10 15

Leu Asp Ala Lys Glu <210> 6 <211> 23 <212> PRT I5 <213>肺炎鏈球菌 <400> 6

Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly 15 10 15 20 Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp 20 <210> 7 25 <211> 142

<212> PRT <213>肺炎鏈球菌 <400> 7 30 Gly Trp Gin Lys Asn Asp Thr Gly Tyr Trp Tyr Val His Ser Asp Gly 15 10 15

Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr 20 25 30

Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr 35 35 40 45

Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Th.r Gly 50 55 60

Trp Lys Lys lie Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala 65 70 75 βΟ 40 Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp 85 90 95

Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp 100 105 110

Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg 45 115 120 125

Pro Glu Phe Thr Val Glu Pro Asp Gly Leu lie Thr Val Lys 130 135 140 50 <210> 8

<211> 112 <212> PRT <213>肺炎鏈球菌 55 <400> 8 Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys lie 1 Asn Gly Thr Trp 5 Tyr Tyr Phe Asp Ser 10 Ser Gly Tyr Met Leu 15 Ala Asp 60 Arg Trp Arg 20 Lys His Thr Asp 25 Gly Asn Trp Tyr Trp Phe 30 Asp Asn Ser 35 40 45 85702 200400970

Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr 50 55 60

Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp 65 70 75 80 5 Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met Val Ser Asn Ala 85 90 95

Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp 100 105 110 10 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213 >肺炎鏈球菌 15 <400> 9 ggctggcaga agaatgacac tggctactgg tacgtacatt cagac 45 <210> 10 20 <211> 63

<212> DNA <213>肺炎鏈球菌 <400> 10 25 ggctcttatc caaaagacaa gtttgagaaa atcaatggca cttggtacta ctttgacagt 60 tea 63

<210> 11 <211> 66 30 <212> DNA <213>肺炎鏈球菌 <400> 11 ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag cacacagacg gcaactggta ctggttcgac 60 35 aactca 66

<210> 12 <211> SO <212> DNA 40 <213>肺炎鏈球菌 <400> 12 ggcgaaatgg ctacaggctg gaagaaaatc gctgataagt ggtactattt caacgaagaa 60 45

<210> 13 <211> 63 <212> DNA 5〇 <213>肺炎鏈球菌 <400> 13 ggtgccatga-agacaggctg ggtcaagtac aaggacactt ggtactactt agaegetaaa 60 gaa 63 55 <210> 14

<211> 69 <212> DNA <213>肺炎鏈球菌 60 <400> 14 ggcgccatgg tatcaaatgc ctttatccag teageggaeg gaacaggctg gtactacctc 60 85702 200400970 aaaccagac 69 c210> 15 ^211> 429 :212> DNA :213>肺炎鏈球菌 ίο 15 <400> 15 ggctggcaga gacaagtttg gcagaccgct atggctacag atgaagacag gccatggtat ccagacggaa gtaaaataa agaatgacac agaaaatcaa ggaggaagca 9ct99aa9aa gctgggtcaa caaatgcctt cactggcaga tggctactgg tggcacttgg cacagacggc aatcgctgat gtacaaggac tatccagtca caggccagaa tacgtacatt tactactttg aactggtact aagtggtact acttggtact gcggacggaa ttcacagtag cagacggctc acagttcagg ggttcgacaa atttcaacga acttagacgc caggctggta agccagatgg ttatccaaaa SO ctatatgctt 120 ctcaggcgaa 180 agaaggtgcc 240 taaagaaggc 300 ctacctcaaa 360 cttgattaca 420 429 20 25 30 35 40 45 50 55 <210> 16 <211> 336 <212> DNA <213>肺炎鏈球菌 <400> 16 tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 60 tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 120 aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 180 aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 240 acttggtact acttagacgc taaagaaggc gccatggtat caaatgcctt tatccagtca 300 gcggacggaa caggctggta ctacctcaaa ccagac 336 <210> 17 <211> 1674 <212> DNA <213>智慧人 <400> 17 gccaccatgg tccagaggct gtgggtgagc cgcctgctgc ggcaccggaa agcccagctc 60 ttgctggtca acctgctaac ctttggcctg gaggtgtgtt tggccgcagg catcacctat 120 gtgccgcctc tgctgctgga agtgggggta gaggagaagt tcatgaccat ggtgctgggc 180 attggtccag tgctgggcct ggtctgtgtc ccgctcctag gctcagccag tgaccactgg 240 cgtggacgct atggccgccg ccggcccttc atctgggcac tgtccttggg catcctgctg 300 agcctctttc tcatcccaag ggccggctgg ctagcagggc tgctgtgccc ggatcccagg 360 cccctggagc tggcactgct catcctgggc gtggggctgc tggacttctg tggccaggtg 420 tgcttcactc cactggaggc cctgctctct gacctcttcc gggacccgga ccactgtcgc 480 caggcctact ctgtctatgc cttcatgatc agtcttgggg gctgcctggg ctacctcctg 540 cctgccattg actgggacac cagtgccctg gccccctacc tgggcaccca ggaggagtgc 600 ctctttggcc tgctcaccct catcttcctc acctgcgtag cagccacact gctggtggct 660 gaggaggcag cgctgggccc caccgagcca gcagaagggc tgtcggcccc ctccttgtcg 720 ccccactgct gtccatgccg ggcccgcttg gctttccgga acctgggcgc cctgcttccc 780 cggctgcacc agctgtgctg ccgcatgccc cgcaccctgc gccggctctt cgtggctgag 840 ctgtgcagct ggatggcact catgaccttc acgctgtttt acacggattt cgtgggcgag 900 gggctgtacc agggcgtgcc cagagctgag ccgggcaccg aggcccggag acactatgat 960 gaaggcgttc ggatgggcag cctggggctg ttcctgcagt gcgccatctc cctggtcttc 1020 tctctggtca tggaccggct ggtgcagcga ttcggcactc gagcagtcta tttggccagt 1080 gtggcagctt tccctgtggc tgccggtgcc acatgcctgt cccacagtgt ggccgtggtg 1140 acagcttcag ccgccctcac cgggttcacc ttctcagccc tgcagatcct gccctacaca 1200 ctggcctccc tctaccaccg ggagaagcag gtgttcctgc ccaaataccg aggggacact 12S0 ggaggtgcta gcagtgagga cagcctgatg accagcttcc tgccaggccc taagcctgga 1320 gctcccttcc ctaatggaca cgtgggtgct ggaggcagtg gcctgctccc acctccaccc 1380 gcgctctgcg gggcctctgc ctgtgatgtc tccgtacgtg tggtggtggg tgagcccacc 1440 gaggccaggg tggttccggg ccggggcatc tgcctggacc tcgccatcct ggatagtgcc 1500 85702 • -4- 60 200400970 ttcctgctgt cccaggtggc cccatccctg tttatgggct ccattgtcca gctcagccag 1560 tctgtcactg cctatatggt gtctgccgca ggcctgggtc tggtcgccat ttactttgct 1620 acacaggtag tattfcgacaa gagcgacttg gccaaatact cagcgtaggt cgag 1674 ια 15 20 25 30 35 40 45 50 55

<210> 18 <211> 1947 <212> DNA <213>人工序列 <220>< 2 2 3 >介於肺炎鏈球菌C-LytA，P2 T輔助子抗原決定位及人類 P501S間之混種基因 <400> 18 gccaccatgg cggccgctta cgtacattcc gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 60 aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 120 aggaagcaca cagacggcaa ctggtactgg ttcgacaact caggcgaaat ggctacaggc 180 tggaagaaaa tcgctgataa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 240 tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc catgcaatac 300 atcaaggcta actctaagtt cattggtatc actgaaggcg tcatggtatc aaatgccttt 360 atccagtcag cggacggaac aggctggtac tacctcaaac cagacggaac actggcagac 420 aggccagaaa agttcatgta catggtgctg ggcattggtc cagtgctggg cctggtctgt 480 gtcccgctcc taggctcagc cagtgaccac tggcgtggac gctatggccg ccgccggccc 540 ttcatctggg cacfcgtcctt gggcatcctg ctgagcctct ttctcatccc aagggccggc 600 tggctagcag ggctgctgtg cccggatccc aggcccctgg agctggcact gctcatcctg 660 ggcgtggggc tgctggactt ctgtggccag gtgtgcttca ctccactgga ggccctgctc 720 tctgacccct tccgggaccc ggaccactgt cgccaggcct actctgtcta tgccttcatg 780 atcagtcttg ggggctgcct gggctacctc ctgcctgcca ttgactggga caccagtgcc 840 ctggccccct acctgggcac ccaggaggag tgcctctttg gcctgctcac cctcatcttc 900 ctcacctgcg tagcagccac actgctggtg gctgaggagg cagcgctggg ccccaccgag 960 ccagcagaag ggctgtcggc cccctccttg tcgccccact gctgtccatg ccgggcccgc 1020 ttggctttcc ggaacctggg cgccctgctt ccccggctgc accagctgtg ctgccgcatg 1080 ccccgcaccc tgcgccggct cttcgtggct gagctgtgca gctggatggc actcatgacc 1140 ttcacgctgt tttacacgga tttcgtgggc gaggggctgt accagggcgt gcccagagct 1200 gagccgggca ccgaggcccg gagacactat gatgaaggcg ttcggatggg cagcctgggg 1260 ctgttcctgc agtgcgccat ctccctggtc ttctctctgg tcatggaccg gctggtgcag 1320 cgattcggca ctcgagcagt ctatttggcc agtgtggcag cttfcccctgt ggctgccggt 1380 gccacatgcc tgtcccacag tgtggccgtg gtgacagctt cagccgccct caccgggttc 1440 accttctcag ccctgcagat cctgccctac acactggcct ccctctacca ccgggagaag 1500 caggtgttcc tgcccaaata ccgaggggac actggaggtg ctagcagtga ggacagcctg 1560 atgaccagct tcctgccagg ccctaagcct ggagctccct tccctaatgg acacgtgggt 1620 gctggaggca gtggcctgct cccacctcca cccgcgctct gcggggcctc tgcctgtgat 1680 gtctccgtac gtgtggtggt gggtgagccc accgaggcca gggtggttcc gggccggggc 1740 atctgcctgg acctcgccat cctggatagt gccttcctgc tgtcccaggt ggccccatcc 1800 ctgtttatgg gctccatt:gt ccagctcagc cagtctgtca ctgcctatat ggtgtctgcc 1860 gcaggcctgg gtctggtcgc catttacttt gctacacagg tagtatttga caagagcgac 1920 ttggccaaat actcagcgta ggtcgag 1947 <210> 19 <211> 1662 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>密碼子最佳化人類p5〇1S <400> 19 atggtgcagc ggctctgggt gtgaatctgc tcacattcgg cccctcctgc tggaggtggg cccgtcctgg gcctcgtgtg gagccgcctc ctgcggcatc cctggaggtg tgcctggccg agtcgaggag aagttcatga cgtgcctctc ctcggcagcg gcaaggccca gctcctgctg 60 ccggcatcac ctacgtgccc 120 ccatggtgct gggcattggg 180 cttccgacca ttggcgcggc 240 85702 60 200400970 cggtatggcc gcaggagacc ttcctgatcc ctcgggccgg cttcatctgg ctggctggcc cggcgtgggc gagcgacctg gatctccctg actcgccccc cctcacgtgc 10 15 20 gagctggccc tgctgatcct acgcccctgg aggcactgct tacagcgtgt acgccttcat atcgattggg acaccagcgc ggattgttga cgctcatctt gccgccctgg ggcccaccga gccggccgag tgctgccctt gccgggcccg cctggccttc catcagctgt gttgcagaat gcctaggacg tcctggatgg ctctcatgac cttcaccctg taccaggggg tgccgcgcgc cgagcccggg gtgcgtatgg gctccctggg cctcttcttg gtcatggaca ggctggtgca gcgcttcgga gccttccccg tggctgccgg cgccacctgc agcgccgccc tgaccgggtt caccttctct agcctgtacc atcgcgagaa acaggtgttt gcctccagcg aggacagcct catgacctcc ttccccaacg ggcacgtggg cgccggcggg tgcggggcca gcgcctgcga cgtgagcgtg cgcgtggtgc cgggcagagg catttgtctg ctcagccagg tggccccgtzc cctcttcatg accgcttaca tggtgtccgc tgctggactg gtggtgttcg acaagagcga cctggccaaa gctctgagtc gggctgctgt ctgctggact ttccgggacc ggaggctgcc tatctcggaa gtcgcggcca ggactgagcg cgtaatctgg ctgcggcgcc ttttatacgg acagaggcgc cagtgcgcca acccgggcgg ctctctcact gccctgcaga ctccccaagt ttcctgcctg agtgggctcc cgcgfcggtgg gacctggcca ggctctatcg ggcttggtgg tactccgcct tcggcatcct gccccgatcc tctgcggcca ccgaccattg tgggctacct cacaggagga ccctgttggt ccccgagcct gcgccctcct tgttcgtcgc acttcgtcgg gccgccacta tcagtctggt tgtacctggc cggtggccgt ttctgcctta acagaggcga gccccaagcc tgcccccccc tgggcgagcc tcctcgactc tccagctgtc ctatttattt ga gctgagcctg tcggcccctg ggtgtgcttc ccgccaggcg gctccccgcc atgcctgttc ggccgaggag gagtccacac gcctcggctc tgagttgtgc ggagggcctg cgacgaggga tttctctctg gagcgtggcc ggtcaccgcc caccctggcc caccgggggc cggcgcccct tcctgcgctg caccgaggcc cgccttcctc tcagagcgtc cgccacccag 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1662 25 <210 > <211> <212> <213> <220> <223> 30 20 1S62

DNA 人工序列

密碼子最佳化人類P501S <400> 20 35 atggtgcagc ggctgtgggt gtcccggctg ctgcgccata gaaaggccca gttgctgctg 60 gtgaacctgc tgactttcgg actggaggtg tgcctggctg ccgggatcac gtacgtgccc 120 cccctgctgc tggaggtggg cgtggaggag aagttcatga caatggtgct gggcatcggc 180 cccgtcctgg gcctcgtgtg tgtgcccctc ctcgggagtg cgtccgatca ttggcggggc 240 cgctacggcc gccgcagacc gttcatctgg gccctgagcc tggggatcct gctctctctc 300 40 ttcctgatcc cccgggccgg ctggctggcc ggcctgctgt gtcccgaccc ccgccctctg 3S0 gagctggccc tcctgatcct gggcgtgggc ttgttggact tctgcggcca ggtgtgtttc 420 actcccctgg aggctctgct ctccgacctc ttccgcgacc ccgaccactg taggcaggct 480 tacagcgtgt acgccttcat gatcagtctg gggggatgcc tgggctatct gctgcccgct 540 atcgactggg acaccagcgc cctggccccc tacctgggga ctcaggagga gtgcctgttc 600 45 ggcctgctca ccttgatctt cctgacgtgc gtcgccgcca ccctgctggt ggccgaggag S60 gcggccctgg ggcccaccga gcccgccgag ggcctgagcg ctcccagcct gagcccccat 720 tgcCgcccgt gcagggctag gctcgccttc aggaatctgg gcgctttgct gccccgcctg 780 catcagctgt gctgtcgcat gcctcgcacc ctgcgccgcc tgttcgtcgc tgagctctgt 840 tcctggatgg ccctgatgac gttcaccctc ttctacaccg acttcgtggg ggagggcctg 900 50 taccagggcg tgcccagggc cgagcccggc accgaggcta ggcgccatta cgacgagggc 960 gtcaggatgg gctctctggg cctcttcctg cagtgcgcca tcagtctggt gttctctctg 1020 gtgatggacc ggctggtgca gcgcttcggc acccgggccg tgtacctcgc ctctgtggcg 1080 gctttccccg tcgccgccgg cgcgacctgc ctgtctcatt ctgtcgccgt ggtgaccgcc 1140 agcgccgccc tgaccggctt caccttcagt gcgctccaga ttctgcccta caccctggcg 1200 55 tctctgtacc atcgcgagaa gcaggtgttc ctgcccaagt accgcgggga cacaggggga 1260 gcttcctctg aggacagcct gatgaccagc ttcttgcccg gccccaagcc gggggcccct 1320 ttccccaacg gccatgtcgg ggcgggcggc agcggcctgc tccctccccc ccccgccctg 1380 tgcggcgcta gtgcctgcga cgtgagcgtg cgggtggtgg tgggggagcc caccgaggct 1440 agggtcgtgc ctggccgggg gatctgcctg gacctggcca tcctcgactc cgccttcctg 1500 60 ctctcccagg tggcgcccag cctgttcatg ggcagtatcg tgcagctgag ccagagcgtg 1560 accgcctaca tggtgagcgc cgccggcctg gggttggtgg ccatctactt tgccacccag 1620 85702 200400970 gtcgtgttcg acaagagcga tctcgccaag tatagcgcct ga 1662

<210> 21 <211> 1688 5 <212> DMA <213>人工序列 <220>

<223>密碼子最佳化人類P501S 10 <400> 21 gacggctagc gccaccatgg tgcagcggct ctgggtgagc cgcctcctgc ggcatcgcaa 60 ggcccagctc ctgctggtga atctgctcac attcggcctg gaggtgtgcc tggccgccgg 120 catcacctac gtgccccccc tcctgctgga ggtgggagtc gaggagaagt tcatgaccat 130 15 ggtgctgggc attgggcccg tcctgggcct cgtgtgcgtg cctctcctcg gcagcgcttc 240 cgaccattgg cgcggccggt atggccgcag gagacccttc atctgggctc tgagtctcgg 300 catcctgctg agcctgttcc tgatccctcg ggccggctgg ctggccgggc tgctgtgccc 360 cgatcctcgg cccctggagc tggccctgct gatcctcggc gtgggcctgc tggacttctg 420 cggccaggtg tgcttcacgc ccctggaggc actgctgagc gacctgtCcc gggaccccga 480 20 ccattgccgc caggcgtaca gcgtgtacgc cttcatgatc tccctgggag gctgcctggg 540 ctacctgctc cccgccatcg attgggacac cagcgcactc gccccctatc tcggaacaca 600 ggaggaatgc ctgttcggac tgctgacgct catcttcctc acgtgcgtcg cggccaccct 660 gttggtggcc gaggaggccg ccctggggcc caccgagccg gccgagggac tgagcgcccc 720 gagcctgagt ccacactgct gcccttgccg ggcccgcctg gccttccgta atctgggcgc 780 25 cctcctgcct cggctccatc agctgtgttg cagaatgcct aggacgctgc ggcgcctgtt 840 cgtcgctgag ttgtgctcct ggatggctct catgaccttc accctgtttt atacggactt 900 cgtcggggag ggcctgtacc agggggtgcc gcgcgccgag cccgggacag aggcgcgccg 960 ccactacgac gagggagtgc gtatgggctc cctgggcctc ttcttgcagt gcgccatcag 1020 tctggttttc tctctggtca tggacaggct ggtgcagcgc ttcggaaccc gggcggtgta 1080 30 cctggcgagc gtggccgcct tccccgtggc tgccggcgcc acctgcctct ctcactcggt 1140 ggccgtggtc accgccagcg ccgccctgac cgggttcacc ttctctgccc tgcagattct 1200 gccttacacc ctggccagcc tgtaccatcg cgagaaacag gtgtttctcc ccaagtacag 1260 aggcgacacc gggggcgcct ccagcgagga cagcctcatg acctccttcc tgcctggccc 1320 caagcccggc gcccctttcc ccaacgggca cgtgggcgcc ggcgggagtg ggctcctgcc 1380 35 cccccctcct gcgctgtgcg gggccagcgc ctgcgacgtg agcgtgcgcg tggtggtggg 1440 cgagcccacc gaggcccgcg tggtgccggg cagaggcatt tgtctggacc tggccatcct 1500 cgactccgcc ttcctcctca gccaggtggc cccgtccctc ttcatgggct ctatcgtcca 1560 gctgtctcag agcgtcaccg cttacatggt gtccgctgct ggactgggct tggtggctat 1620 ttatttcgcc acccaggtgg tgttcgacaa gagcgacctg gccaaatact ccgcctgact 1680 40 cgaggcag 1688

<210> 22 <211> 1688 <212> DNA 45 <213>人工序列 <220>

<223>密碼子最佳化人類P501S 50 <400> 22 gacggctagc gccaccatgg tgcagcggct gtgggtgtcc cggctgctgc gccatagaaa 60 ggcccagttg ctgctggtga acctgctgac tttcggactg gaggtgtgcc tggctgccgg 120 gatcacgtac gtgccccccc tgctgctgga ggtgggcgtg gaggagaagt tcatgacaat 180 ggtgctgggc atcggccccg tcctgggcct cgtgtgtgtg cccctcctcg ggagtgcgtc 240 55 cgatcattgg cggggccgct acggccgccg cagaccgttc atctgggccc tgagcctggg 300 catcctgctc tctctcttcc tgatcccccg ggccggctgg ctggccggcc tgctgtgtcc 360 cgacccccgc cctctggagc tggccctcct gatcctgggc gtgggcctgc tggacttctg 420 cggccaggtg tgtttcactc ccctggaggc tctgctctcc gacctcttcc gcgaccccga 480 ccactgtagg caggcttaca gcgtgtacgc cttcatgatc agtctggggg gatgcctggg 540 60 ctatctgctg cccgctatcg actgggacac cagcgccctg gccccctacc tggggactca 600 ggaggagtgc ctgttcggcc tgctcacctt gatcttcctg acgtgcgtcg ccgccaccct 660 85702 200400970 5 10 15 gctggtggcc cagcctgagc tttgctgccc cgtcgctgag cgtgggggag ccattacgac tctggtgttc cctcgcctct cgccgtggtg gccctacacc cggggacaca caagccgggg tccccccccc ggagcccacc cgactccgcc gctgagccag ctactttgcc cgaggcag gaggaggcgg ccctggggcc caccgagccc gccgagggcc tgagcgctcc 720 ccccattgct gcccgtgcag ggctaggctc gccttcagga atctgggcgc 780 cgcctgcatc agctgtgctg tcgcatgcct cgcaccctgc gccgcctgtt 840 ctctgttcct ggatggccct gatgacgttc accctcttct acaccgactt 900 ggcctgtacc agggcgtgcc cagggccgag cccggcaccg aggctaggcg 960 gagggcgtca ggatgggctc tctgggcctc ttcctgcagt gcgccatcag 1020 tctctggtga tggaccggct ggtgcagcgc ttcggcaccc gggccgtgta 1080 gtggcggctt tccccgtcgc cgccggcgcg acctgcctgt ctcattctgt 1140 accgccagcg ccgccctgac cggcttcacc ttcagtgcgc tccagattct： 1200 ctggcgtctc tgtaccatcg cgagaagcag gtgttcctgc ccaagtaccg 1260 gggggagctt cctctgagga cagcctgatg accagcttct tgcccggccc 1320 gcccctttcc ccaacggcca tgtcggggcg ggcggcagcg gcctgctccc 1380 gccctgtgcg gcgctagtgc ctgcgacgtg agcgtgcggg tggtggtggg 1440 gaggctaggg tcgtgcctgg ccgggggatc tgcctggacc tggccatcct 1500 ttcctgctct cccaggtggc gcccagcctg ttcatgggca gtatcgtgca 1S60 agcgtgaccg cctacatggt gagcgccgcc ggcctggggt tggtggccat 1620 acccaggtcg tgttcgacaa gagcgatctc gccaagtata gcgcctgact 1680 1688 20 25 <210> 23 <211> 435 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>介於肺炎鏈球菌C-LytA，P2T輔助子抗原決定部位及少部份人類 P501S51端間之混種基因 30 35 <400> 23 atggcggccg aatggcactt cacacagacg aaaatcgctg aagtacaagg gctaactcta tcagcggacg gaaaagttca c仁tacgtaca ggtactactt gcaactggta ataagtggta acacttggta agttcattgg gaacaggctg tgtac ttccgacggc tgacagttca ctggttcgac ctatttcaac ctacttagac tatcactgaa gtactacctc tcttatccaa ggctatatgc aactcaggcg gaagaaggtg gctaaagaag ggcgtcatgg aaaccagacg aagacaagtt ttgcagaccg aaatggctac ccatgaagac gcgccatgca tatcaaatgc gaacactggc tgagaaaatc 60 ctggaggaag 120 aggctggaag 180 aggctgggtc 240 atacatcaag 300 ctttatccag 360 agacaggcca 420 435 40 <210> 24 <211> 435 <212> DNA <213:人工序列 45 <220><223>介於肺炎鏈球菌C-LytA,P2T辅助子抗原決定部位及少部份人類 P501S 5’端間之混種基因-密碼子最佳化 50 55 <400> 24 atggccgccg aacgggacat' cacaccgacg aagatcgcgg aagtataagg gccaacagca agcgccgacg gagaagttca cctacgtgca ggtactactt gcaactggta acaagtggta acacctggta agttcatcgg gcaccggatg tgtac tagcgacggg cgactcctcc ctggttcgat ctatttcaac ctacctcgac catcaccgag gtactacttg agctacccca ggctacatgc aactcgggag gaggagggcg gccaaggagg ggagtgatgg aagccggacg aggacaagtt tcgccgaccg agatggccac ccatgaagac gcgccatgca tcagcaacgc gcaccctcgc cgagaagatc 60 ctggcggaag 120 cggctggaag 180 cggctgggtg 240 gtatatcaag 300 ctttatccag 360 ggatcggccc 420 <210> 25 <211> 435 85702 60 200400970 5 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>介於肺炎鏈球菌C-LytA，P2 T輔助子抗原決定部位及少部份人類 P501S 5'端間之混種基因-密碼子最佳化 10 15 20 25 30 35 40 45 <400> 25 atggccgccg cctacgtgca cagcgacggg tcctacccaa aggacaagtt cgagaagatc 60 aacggcacgt ggtactattt cgacagcagc ggctacatgc tcgccgatcg ctggcgcaag 120 cacaccgacg ggaactggta ctggttcgac aactctggcg agatggctac ggggtggaag 180 aagatcgccg acaagtggta ctacttcaac gaggagggcg ccatgaagac cgggtgggtg 240 aagtacaagg acacctggta ctacctggac gctaaggagg gcgccatgca gtacatcaag 300 gccaactcga agttcatcgg gatcaccgag ggcgtgatgg tcagtaacgc tttcatccag 360 agcgcggacg gcacaggctg gtattacctg aagcccgatg gcaccctggc ggacagacct 420 gagaaattca tgtac 435 <210> 26 <211> 464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>介於肺炎鏈球菌C-LytA，P2 T輔助子抗原決定部位及少部份人類 P501S 5¾間之混種基因密碼子最佳化 ’ <400> 26 gacggctagc gccaccatgg ccgccgccta cgtgcatagc gacgggagct accccaagga 60 caagttcgag aagatcaacg ggacatggta ctacttcgac tcctccggct acatgctcgc 120 cgaccgctgg cggaagcaca ccgacggcaa ctggtactgg ttcgataact cgggagagat 1ΘΟ ggccaccggc tggaagaaga tcgcggacaa gtggtactat ttcaacgagg agggcgccat 240 gaagaccggc tgggtgaagt ataaggacac ctggtactac ctcgacgcca aggagggcgc 300 catgcagtat atcaaggcca acagcaagtt catcggcatc accgagggag tgatggtcag 360 caacgccttt atccagagcg ccgacggcac cggatggtac tacttgaagc cggacggcac 420 cctcgcggat cggcccgaga agttcatgta ctgactcgag gcag 464 <210> 27 <211> 652 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>介於肺炎鏈球菌C-LytA，P2 T辅助子抗原決定部位及人類 P501S之胺基酸51-553間之混種蛋白質 50 55 <400> 27 Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 15 10 15 Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 85702 -9 - 60 200400970

Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Gly Val 100 105 110

Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 5 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140

Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160

Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 10 165 170 175

Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190

Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 15 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220

Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240

Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 20 245 250 255

Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie 260 265 270

Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 25 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300

Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320

Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 30 325 330 335

Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350

Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 35 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380

Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400

Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 40 405 410 415

Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430

Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 45 Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460

Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480

Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 50 485 490 495

Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510

Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 55 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540

Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560

Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 60 565 570 575

Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu •10- 85702 200400970 580 585 590

Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin Leu Ser 595 600 605 5 10

Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620

Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640

Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 645 650 <210> 28 15 <211> <212> <213>

1959 DNA 人工序列 20 <220>

<223>編碼肺炎鏈球菌C-LytA，P2 T輔助子抗原決定部位及人類 P501S胺基酸51-553間混種蛋白質之DNA

25 30 35 40 45 50 55 <400> 28 atggcggccg aatggcactt cacacagacg aaaatcgctg aagtacaagg gctaactcta tcagcggacg gaaaagttca ctcctaggct tgggcactgt gcagggctgc gggctgctgg ctcttccggg cttgggggct ccctacctgg tgcgtagcag gaagggctgt ttccggaacc accctgcgcc ctgttttaca ggcaccgagg ctgcagtgcg ggcactcgag tgcctgtccc tcagccctgc ttcctgccca agcttcctgc ggcagtggcc gtacgtgtgg ctggacctcg atgggctcca ctgggtctgg aaatactcag cttacgtaca ggtactactt gcaactggta ataagtggta acacttggta agttcattgg gaacaggctg tgtacatggt cagccagtga ccttgggcat tgtgcccgga acttctgtgg acccggacca gcctgggcta gcacccagga ccacactgct cggccccctc tgggcgccct ggctcttcgt cggatttcgt cccggagaca ccatctccct cagtctattt acagtgtggc agatcctgcc aataccgagg caggccctaa tgctcccacc tggtgggtga ccatcctgga ttgtccagct tcgccattta cgggtggaca ttccgacggc tgacagttca ctggttcgac ctatttcaac ctacttagac tatcactgaa gtactacctc gctgggcatt ccactggcgt cctgctgagc tcccaggccc ccaggtgtgc ctgtcgccag cctcctgcct ggagtgcctc ggtggctgag cttgtcgccc gcttccccgg ggctgagctg gggcgagggg ctatgatgaa ggtcttctct ggccagtgtg cgtggtgaca ctacacactg ggacactgga gcctggagct tccacccgcg gcccaccgag tagtgccttc cagccagtct ctttgctaca ccatcaccat tcttatccaa ggctatatgc aactcaggcg gaagaaggtg gctaaagaag ggcgtcatgg aaaccagacg ggtccagtgc ggacgctatg ctctttctca ctggagctgg ttcactccac gcctactctg gccattgact tttggcctgc gaggcagcgc cactgctgtc ctgcaccagc tgcagctgga ctgtaccagg ggcgttcgga ctggtcatgg gcagctttcc gcttcagccg gcctccctct ggtgctagca cccttcccta ctctgcgggg gccagggtgg ctgctgtccc gtcactgcct caggtagtat caccattaa aagacaagtt ttgcagaccg aaatggctac ccatgaagac gcgccatgca tatcaaatgc gaacactggc tgggcctggt gccgccgccg tcccaagggc cactgctcat tggaggccct tctatgcctt gggacaccag tcaccctcat tgggccccac catgccgggc tgtgctgccg tggcactcat gcgtgcccag tgggcagcct accggctggt ctgtggctgc ccctcaccgg accaccggga gtgaggacag atggacacgt cctctgcctg ttccgggccg aggtggcccc atatggtgtc ttgacaagag tgagaaaatc ctggaggaag aggctggaag aggctgggtc atacatcaag ctttatccag agacaggcca ctgtgtcccg gcccttcatc cggctggcta cctgggcgtg gctctctgac catgatcagt tgccctggcc cttcctcacc cgagccagca ccgcttggct catgccccgc gaccttcacg agctgagccg ggggctgttc gcagcgattc cggtgccaca gttcaccttc gaagcaggtg cctgatgacc gggtgctgga tgatgtctcc gggcatctgc atccctgttt tgccgcaggc cgacttggcc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1959

<210> 29 <211> 507 <212> PRT <213>人工序列 -11 - 85702 60 200400970 <220> <223 >人類P501S(胺基酸55-553)融合至6個組胺酸殘基 5 <400> 29

Met Val Leu Gly lie Gly Pro 1 ' 5

Leu Gly Ser Ala Ser Asp His 20 10 Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser 35 lie Pro Arg Ala GLy Trp Leu 50 55

Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu 15 65 70

Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr 85

Phe Axg Asp Pro Asp His Cys 100 20 Met lie Ser Leu Gly Gly Cys 115

Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala 130 135

Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu 25 145 150

Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala 165

Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu 180 30 Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu 195

Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg 210 215

Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu 35 225 230

Phe Val Gly . Glu Gly Leu Tyr 245

Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr 260 40 Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala 275

Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe 290 295

Val Ala Ala Phe Pro Val Ala 45 305 310

Val Ala Val Val Thr Ala Ser 325

Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr 340 50 Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys 355

Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr 370 375

Ala Pro Phe Pro Asn Gly His 55 385 390

Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys 405

Arg Val Val Val Gly Glu Pro 420 60 Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala 435

Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro Leu 10 15

Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Arg 25 30

Leu Gly lie Leu Leu Ser Leu Phe Leu 40 45

Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro Arg 60 工le Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp Phe 75 80

Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp Leu 90 95

Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala Phe 105 110

Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie Asp 120 125

Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu Cys 140 lie Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala Thr 155 160

Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala Glu 170 175

Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg Ala 185 190

Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His Gin 200 205

Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala Glu 220

Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr Asp 235 240

Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro Gly 250 255

Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser Leu 265 270

lie Ser Leu Val Phe Ser Leu Val Met 280 28S

Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala Ser 300

Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His Ser 315 320

Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe Ser 330 335

Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg Glu 345 350

Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala Ser 360 365

Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro Gly 380

Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu 395 400

Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser Val 410 415

Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly Arg 425 430 lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu Ser 440 445 -12· 85702 200400970

Gin Val Ala 450 Ser Val Thr 465 lie Tyr Phe Tyr Ser Ala

Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin Leu Ser Gin 455 460

Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val Ala 470 475 480

Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala Lys 485 490 495

Gly Gly His His His His His His 500 505 ίο

<210> 30 <211> 1524 <212> DNA 15 <213>人工序列 <220>

<223>編碼人類P501S(胺基酸55-553)融合至6個組胺酸殘基之DNA 20 <400> 30 atggtgctgg gcattggtcc agtgctgggc ctggtctgtg tcccgctcct aggctcagcc 60 agtgaccact ggcgtggacg ctatggccgc cgccggccct tcatctgggc actgtccttg 120 ggcatcctgc tgagcctctt tctcatccca agggccggct ggctagcagg gctgctgtgc 180 ccggatccca ggcccctgga gctggcactg ctcatcctgg gcgtggggct gctggacttc 240 25 tgtggccagg tgtgcttcac tccactggag gccctgctct ctgacctctt ccgggacccg 300 gaccactgtc gccaggccta ctctgtctat gccttcatga tcagtcttgg gggctgcctg 360 ggctacctcc tgcctgccat tgactgggac accagtgccc tggcccccta cctgggcacc 420 caggaggagt gcctctttgg cctgctcacc ctcatcttcc tcacctgcgt agcagccaca 480 ctgctggtgg ctgaggaggc agcgctgggc cccaccgagc cagcagaagg gctgtcggcc 540 30 ccctccttgt cgccccactg ctgtccatgc cgggcccgct tggctttccg gaacctgggc 600 gccctgcttc cccggctgca ccagctgtgc tgccgcatgc cccgcaccct gcgccggctc 6β0 ttcgtggctg agctgtgcag ctggatggca ctcatgacct tcacgctgtt ttacacggat 720 ttcgtgggcg aggggctgta ccagggcgtg cccagagctg agccgggcac cgaggcccgg 780 agacactatg atgaaggcgt tcggatgggc agcctggggc tgttcctgca gtgcgccatc 840 35 tccctggtct tctctctggt catggaccgg ctggtgcagc gattcggcac tcgagcagtc 900 tatttggcca gtgtggcagc tttccctgtg gctgccggtg ccacatgcct gtcccacagt 960 gtggccgtgg tgacagcttc agccgccctc accgggttca ccttctcagc cctgcagatc 1020 ctgccctaca cactggcctc cctctaccac cgggagaagc aggtgttcct gcccaaatac 1080 cHag999a-ca ctggaggtgc tagcagtgag gacagcctga tgaccagctt cctgccaggc 1140 40 cctaagcctg gagctccctt ccctaatgga cacgtgggtg ctggaggcag tggcctgctc 1200 ccacctccac ccgcgctctg cggggcctct gcctgtgatg tctccgtacg tgtggtggtg 1260 ggtgagccca ccgaggccag ggtggtticcg ggccggggca tctgcctgga cctcgccatc 1320 ctggatagtg ccttcctgct gtcccaggtg gccccatccc tgtttatggg ctccattgtc 1380 cagctcagcc agtctgtcac tgcctatatg gtgtctgccg caggcctggg tctggtcgcc 1440 45 atttactttg ctacacaggt agtatttgac aagagcgact tggccaaata ctcagcgggt 1500 ggacaccatc accatcacca ttaa 1524 50 55 <210> 31 <211> 685 <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223>人類P501S(胺基酸1-34融合至55-553)融合至6個組胺酸殘基 <400> 31

Met Ala Ala Val Gin Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg 1 5 10 15 60 Lys Ala Gin Leu Leu Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val 20 25 30 -13- 85702 200400970

Cys Leu Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp 35 40 45

Lys Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly 50 55 SO 5 Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr 65 70 75 80

Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala 85 90 95

Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp 10 100 105 110

Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala 115 120 125

Met Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly 工le Thr Glu Gly 130 135 140 15 Val Met Val Ser Asn Ala Phe He Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp 145 150 155 160

Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe 165 170 175

Met Tyr Met Val Leu Gly He Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val 20 180 185 190

Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg 195 200 205

Arg Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser Leu 210 215 220 25 Phe Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp 225 230 235 240

Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly Leu Leu 245 250 255

Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser 30 260 265 270

Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr 275 280 285

Ala Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala 290 295 300 35 工le Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu 305 310 315 320

Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val Ala 325 330 335

Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro 40 340 345 350

Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys 355 360 365

Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro A.rg Leu 370 375 380 45 His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val 385 390 395 400

Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr 405 410 415

Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu 50 420 425 430

Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly 435 440 445

Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu 450 455 460 55 Val Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu 465 470 475 480

Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser 485 490 495

His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr 60 500 505 510

Phe Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His -14· 85702 200400970 5 10 15 20 515 520 525 Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly 530 535 540 Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys 545 550 555 560 Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly 565 570 575 Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val 580 585 590 Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro 595 600 605 Gly Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu 610 615 620 Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin Leu 625 630 635 640 Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu 645 650 655 Val Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu 660 665 670 Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 675 680 685

25 <210> 32 <211> 2058 <212> DNA <213 >人工序列 30 35 40 45 50 55 60 <220> <223>編碼人類P501S(胺基酸1-34融合至55-553)融合至 6個組胺酸殘基之DNA <400> 32 atggcggccg tgcagaggct atgggtatcg agactgctaa gacaccgcaa agctcagttg 60 ttgttggtta acttgttgac cttcgggctg gaagtctgtt tggcggccgc ttacgtacat 120 tccgacggct cttatccaaa agacaagttt gagaaaatca atggcacttg gtactacttt 180 gacagttcag gctatatgct tgcagaccgc tggaggaagc acacagacgg caactggtac 240 tggttcgaca actcaggcga aatggctaca ggctggaaga aaatcgctga taagtggtac 300 tatttcaacg aagaaggtgc catgaagaca ggctgggtca agtacaagga cacttggtac 360 tacttagacg ctaaagaagg cgccatgcaa tacatcaagg ctaactctaa gttcattggt 420 atcactgaag gcgtcatggt atcaaatgcc tttatccagt cagcggacgg aacaggctgg 480 tactacctca aaccagacgg aacactggca gacaggccag aaaagttcat gtacatggtg 540 ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac 600 cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc 660 ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc ggctggctag cagggctgct gtgcccggat 720 cccaggcccc tggagctggc actgctcatc ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc 780 caggtgtgct tcactccact ggaggccctg ctctctgacc tcttccggga cccggaccac 840 tgtcgccagg cctactctgt ctatgccttc atgatcagtc ttgggggctg cctgggctac 900 ctcctgcctg ccattgactg ggacaccagt gccctggccc cctacctggg cacccaggag 960 gagtgcctct ttggcctgct caccctcatc fctcctcacct gcgtagcagc cacactgctg 1020 gtggctgagg aggcagcgct gggccccacc gagccagcag aagggctgtc ggccccctcc 1080 ttgtcgcccc actgctgtcc atgccgggcc cgcttggctt tccggaacct gggcgccctg 1140 cttccccggc tgcaccagct gtgctgccgc atgccccgca ccctgcgccg gctcttcgtg 1200 gctgagctgt gcagctggat ggcactcatg accttcacgc tgttttacac ggatttcgtg 1260 ggcgaggggc tgtaccaggg cgtgcccaga gctgagccgg gcaccgaggc ccggagacac 1320 tatgatgaag gcgttcggat gggcagcctg gggctgttcc tgcagtgcgc catctccctg 1380 gtcttctctc tggtcatgga ccggctggtg cagcgattcg gcactcgagc agtctatttg 1440 gccagtgtgg cagctttccc tgtggctgcc ggtgccacat gcctgtccca cagtgtggcc 1500 gtggtgacag cttcagccgc cctcaccggg ttcaccttct cagccctgca g在tcctgccc 1560 tacacactgg cctccctcta ccaccgggag aagcaggtgt tcctgcccaa ataccgaggg 1620 gacactggag gtgctagcag tgaggacagc ctgatgacca gcttcctgcc aggccctaag 1680

85702 -15 - 200400970 5 10 15 cctggagctc ccttccctaa tggacacgtg ggtgctggag gcagtggcct gctcccacct ccacccgcgc tctgcggggc ctctgcctgt gatgtctccg tacgtgtggt ggtgggtgag cccaccgagg ccagggtggt tccgggccgg ggcatctgcc tggacctcgc catcctggat agtgccttcc tgctgtccca ggtggcccca tccctgttta tgggctccat tgtccagctc agccagtctg tcactgccta tatggtgtct gccgcaggcc tgggtctggt cgccatttac tttgctacac aggtagtatt tgacaagagc gacttggcca aatactcagc gggtggacac catcaccatc accattaa <210> 33 <211> 671 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>肺炎鏈球菌C-LytA蛋白質融合至P2 T輔助子抗原決定部位， 融合至人類P501S(胺基酸55-553)，融合至6個组 胺酸殘基，於酵母α前原(alphaprepro)訊號序列下游 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2058 20 25 30 35 40 45 50 55 <400> 33 Met Ala Ala Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala IS 10 15 Ser Ser Ala Leu Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro 20 25 30 Lys Asp Lys Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser 35 40 45 Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn 50 55 60 Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys 65 70 75 80 He Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr 85 90 95 Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu 100 105 110 Gly Ala Met Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly 工le Thr 115 120 125 Glu Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr 130 135 140 Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu 145 150 155 160 Lys Phe Met Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val 1β5 170 175 Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr 180 185 190 Gly Arg Arg Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu 195 200 205 Ser Leu Phe Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys 210 215 220 Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly 225 230 235 240 Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu 245 250 255 Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser 260 265 270 Val Tyr Ala Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Lea Leu 275 280 285 Pro Ala lie Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr 290 295 300 Gin Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys 305 310 315 320 Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr 85702 -16 - 60 200400970 325 330 335

Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys 340 345 350

Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro 5 355 360 365

Arg Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu 370 375 380

Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu 385 390 395 400 10 Phe Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg 405 410 415

Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg 420 425 430

Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe 15 435 440 445

Ser Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val 450 455 460

Tyr Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys 465 470 475 430 20 Leu Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly 485 490 495

Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gin 工le Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu 500 505 510

Tyr His Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr 25 515 520 525

Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly 530 535 540

Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly 545 550 555 560 30 Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys 565 570 575

Asp Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val 580 585 590

Val Pro Gly Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala 35 595 600 605

Phe Leu Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val 610 615 620

Gin Leu Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu 625 630 635 640 40 Gly Leu Val Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser 645 650 655

Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 660 665 670 45 <210> 34 <211> 2477 <212> DNA <213 >人工序列 50 <220> <223>編碼肺炎鏈球菌C-LytA部份之DNA,融合至P2 T輔助子抗原決定部位，融合至人類P501S(胺基酸55-553), 55 融合至6個组胺酸殘基，於酵母α前原訊號序列下游 <400> 34 tacgtacatt ccgacggctc ttatccaaaa gacaagtttg agaaaatcaa tggcacttgg 60 tactactttg acagttcagg ctatatgctt gcagaccgct ggaggaagca cacagacggc 120 60 aactggtact ggttcgacaa ctcaggcgaa atggctacag gctggaagaa aatcgctgat 180 aagtggtact atttcaacga agaaggtgcc atgaagacag gctgggtcaa gtacaaggac 240 17- 85702 200400970 ίο 15 20 25 30 35 taaagaaggc cgtcatggta accagacgga tgcagtttta ttatccaaaa ctatatgctt ctcaggcgaa agaaggtgcc taaagaaggc cgtcatggta accagacgga gttggaagtt gggcctggtc ccgccgccgg cccaagggcc actgctcatc ggaggccctg ctatgcttca gacaccagtg accctcatct ggccccaccg tgccgggccc tgctgccgca gcactcatga gtgcccagag ggcagcctgg cggctggtgc gtggctgccg ctcaccgggt caccgggaga gaggacagcc ggacacgtgg tctgcctgtg ccgggccggg gtggccccat atggtgtctg gacaagagcg taactctaag 300 agcggacgga 360 aatggcggcc 420 agcggccgct 480 tggcacttgg 540 cacagacggc 600 aatcgctgat 660 gtacaaggac 720 taactctaag 780 agc99^c99a 840 agctggtatt 900 gtacatggtg 960 agccagtgac 1020 cttgggcatc 1080 gtgcccggat 1140 cttctgtggc 1200 cccggaccac 1260 ctgggctacc 1320 acccaggagg 1380 acactgctgg 1440 gccccctcct 1500 ggcgccctgc 1560 ctcttcgtgg 1620 gatttcgtgg 1680 cggagacact 1740 atctccctgg 1800 gtctatttgg 1860 agtgtggccg 1920 atcctgccct 1980 taccgagggg 2040 ggccctaagc 2100 ctcccacctc 2160 gtgggtgagc 2220 atcctggata 2280 gtccagctca 2340 gccatttact 2400 ggtggacacc 2460 2477 acttggtact ttcattggta acaggctggt agatttcctt tacgtacatt tactactttg aactggtact aagtggtact acttggtact ttcattggta acaggctggt acttacgttc ctgggcattg cactggcgtg ctgctgagcc cccaggcccc caggtgtgct tgtcgccagg tcctgcctgc agtgcctctt tggctgagga tgtcgcccca ttccccggct ctgagctgtg gcgaggggct atgatgaagg tcttctctct ccagtgtggc tggtgacagc acacactggc acactggagg ctggagctcc cacccgcgct ccaccgaggc gtgccttcct gccagtctgt ttgctacaca atcaccatca acttagacgc tcactgaagg actacctcaa caatttttac ccgacggctc acagttcagg ggttcgacaa atttcaacga acttagacgc tcactgaagg actacctcaa caccattgtt gtccagtgct gacgctatgg tctttctcat tggagctggc tcactccact cctactctgt cattgactgg tggcctgctc ggcagcgctg ctgctgtcca gcaccagctg cagctggatg gtaccagggc cgttcggatg ggtcatggac agctttccct ttcagccgcc ctccctctac tgctagcagt cttccctaat ctgcggggcc cagggtggtt gctgtcccag cactgcctat ggtagtattt ccattaa gccatgcaat tcaaatgcct acactggcag ttcgcagcat gacaagtttg gcagaccgct atggctacag atgaagacag gccatgcaat tcaaatgcct acactggcag ggtgttgaag tgtgtcccgc cccttcatct ggctggctag ctgggcgtgg ctctctgacc tgatcagtct ccctggcccc tcctcacctg agccagcaga gcttggcttt tgccccgcac ccttcacgct ctgagccggg ggctgttcct agcgattcgg gtgccacatg tcaccttctc agcaggtgtt tgatgaccag gtgctggagg atgtctccgt gcatctgcct ccctgtttat ccgcaggcct acttggccaa acatcaaggc ttatccagtc acaggccaga cctccgcatt agaaaatcaa ggaggaagca gctggaagaa gctgggtcaa acatcaaggc ttatccagtc acaggccaga aaaagttcat tcctaggctc gggcactgtc cagggctgct ggctgctgga tcttccggga tgggggctgc ctacctgggc cgtagcagcc agggcfcgtcg ccggaacctg cctgcgccgg gttttacacg caccgaggcc gcagtgcgcc cactcgagca cctgtcccac agccctgcag cctgcccaaa cttcctgcca cagtggcctg acgtgtggtg ggacctcgcc gggctccatt gggtctggtc atactcagcg 40 45 <210> 35 <211> 595 <212> PRT <213 >人工序列 <220><223>人類P501S(胺基酸55-553)融合至6個組胺酸殘基， 於酵母α前原訊號序列下游 50 55 <400> 35 Met Ser Phe Leu Asn Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala 15 10 15 Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gin lie 20 25 30 Pro Ala Glu Ala Val lie Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp 35 40 45 Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe 50 55 60 lie Asn Thr Thr lie Ala Ser lie Ala Ala hys Glu Glu Gly Val Ser 65 70 75 80 Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val 85702 -18 - 60 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 85 90 95 Leu Gly Leu Val Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp 100 105 110 Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu 115 120 125 Gly lie Leu Leu Ser Leu Phe Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala 130 135 140 Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie 145 150 155 160 Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro 165 170 175 Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg 180 185 190 Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala Phe Met 工le Ser Leu Gly Gly Cys Leu 195 200 205 Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro 210 215 220 Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie 225 230 235 240 Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala 245 250 255 Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser 260 265 270 Pro His Cys Cys Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly 275 280 285 Ala Leu Leu Pro Arg Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr 290 295 300 Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met 305 310 315 320 Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin 325 330 335 Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp 340 345 350 Glu Gly Val Arg Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie 355 360 365 Ser Leu Val Phe Ser Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly 370 375 380 Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala 38S 390 395 400 Gly Ala Thr Cys Leu Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala 405 410 415 Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr 420 425 430 Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr 435 440 445 Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser 450 455 460 Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val 465 470 475 480 Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly 485 490 495 Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr 500 505 510 Glu Ala Arg Val Val Pro Gly Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie 515 520 525 Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met 530 535 540 Gly Ser He Val Gin Leu Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser 545 550 555 560 Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val 565 570 575 85702 •19· 60 200400970

Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His 580 585 590 His His His 595 5 10 15 <210> 36 <211> 1788 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>編碼人類P501S(胺基酸55-553)之DNA，融合至6個 組胺酸殘基，於酵母α前原訊號序列下游 20 25 30 35 40 45 50 55 <400> 36 atgagtttcc tcaattttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agctgctcca 60 gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 12 0 tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 180 gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct 240 ctcgagaaaa gagaggctga agccatggtg ctgggcattg gtccagtgct gggcctggtc 300 tgtgtcccgc tcctaggctc agccagtgac cactggcgtg gacgctatgg ccgccgccgg 360 cccttcatct gggcactgtc cttgggcatc ctgctgagcc tctttctcat cccaagggcc 420 ggctggctag cagggctgct gtgcccggat cccaggcccc tggagctggc actgctcatc 480 ctgggcgtgg ggctgctgga cttctgtggc caggtgtgct tcactccact ggaggccctg 540 ctctctgacc tcttccggga cccggaccac tgtcgccagg cctactctgt ctatgccttc 600 atgatcagtc ttgggggctg cctgggctac ctcctgcctg ccattgactg ggacaccagt 660 gccctggccc cctacctggg cacccaggag gagtgcctct ttggcctgct caccctcatc 720 ttcctcacct gcgtagcagc cacactgctg gtggctgagg aggcagcgct gggccccacc 780 gagccagcag aagggctgtc ggccccctcc ttgtcgcccc actgctgtcc atgccgggcc 840 cgcttggctt tccggaacct gggcgccctg cttccccggc tgcaccagct gtgctgccgc 900 atigccccgca ccctgcgccg gctcctcgtg gctgagctgt gcagctggat ggcactcatg 960 accttcacgc tgttttacac ggatttcgtg ggcgaggggc tgtaccaggg cgtgcccaga 1020 gctgagccgg gcaccgaggc ccggagacac tatgatgaag gcgttcggat gggcagcctg 1080 gggctgttcc tgcagtgcgc catctccctg gtcttctctc tggtcatgga ccggctggtg 1140 cagcgattcg gcactcgagc agtctatttg gccagtgtgg cagctttccc tgtggctgcc 1200 ggtgccacat gcctgtccca cagtgtggcc gtggtgacag cttcagccgc cctcaccggg 1260 ttcaccttct cagccctgca gatcctgccc tacacactgg cctccctcta ccaccgggag 1320 aagcaggtgt tcctgcccaa ataccgaggg gacactggag gtgctagcag tgaggacagc 1380 ctgatgacca gcttcctgcc aggccctaag cctggagctc ccttccctaa tggacacgtg 1440 ggtgctggag gcagtggcct gctcccacct ccacccgcgc tctgcggggc ctctgcctgt 1500 gatgtctccg tacgtgtggt ggtgggtgag cccaccgagg ccagggtggt tccgggccgg 1560 ggcatctgcc tggacctcgc catcctggat agtgccttcc tgctgtccca ggtggcccca 1620 tccctgttta tgggctccat tgtccagctc agccagtctg tcactgccta tatggtgtct 1680 gccgcaggcc tgggtctggt cgccatttac tttgctacac aggtagtatt tgacaagagc 1740 gacttggcca aatactcagc gggtggacac catcaccatc accattaa 1788 <210> 37 <211> 1955 <212> DNA <213 >人工序列 <220> <223>編碼密碼子最佳化人類P501S(胺基酸51-553)之DNA 融合至肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta <400> 37 gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60 agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120 85702 -20- 60 200400970 ίο 15 20 25 30 ggagagatgg 180 ggcgccatga 240 gagggcgcca 300 atggtcagca 360 gacggcaccc 420 gtcctgggcc 4ΘΟ tacggccgcc 540 ctgatccccc 600 ctggccctcc 660 cccctggagg 720 agcgtgtacg 780 gactgggaca 840 ctgctcacct 900 gccctggggc 960 tgcccgtgca 1020 cagctgtgct 1080 tggatggccc ii4〇 cagggcgtgc 1200 aggatgggct 1260 atggaccggc 1320 ttccccgtcg 1380 gccgccctga 1440 ctgtaccatc 1500 tcctctgagg 1560 cccaacggcc 1620 ggcgctagtg 1680 gtcgtgcctg 1740 tcccaggtgg 1800 gcctacatgg I860 gtgttcgaca 1920 accgctggcg ccaccggctg agaccggctg tgcagtatat acgcctttat tcgcggatcg tcgtgtgtgt gcagaccgtt gggccggctg tgatcctggg ctctgctctc ccttcatgat ccagcgccct tgatcttcct ccaccgagcc gggctaggct gtcgcatgcc tgatgacgtt ccagggccga ctctgggcct tggtgcagcg ccgccggcgc ccggcttcac gcgagaagca acagcctgat atgtcggggc cctgcgacgt gccgggggat cgcccagcct tgagcgccgc agagcgatct gaagcacacc gaagaagatc ggtgaagtat caaggccaac ccagagcgcc gcccgagaag gcccctcctc catctgggcc gctggccggc cgtgggcctg cgacctcttc cagtctgggg ggccccctac gacgtgcgtc cgccgagggc cgccttcagg tcgcaccctg caccctcttc gcccggcacc cttcctgcag cttcggcacc gacctgcctg cttcagtgcg ggtgttcctg gaccagcttc gggcggcagc gagcgtgcgg ctgcctggac gttcatgggc cggcctgggg cgccaagtat gacggcaact gcggacaagt aaggacacct agcaagttca gacggcaccg ttcatgtaca gggagtgcgt ctgagcctgg ctgctgtgtc ctggacttct cgcgaccccg ggatgcctgg ctggggactc gccgccaccc ctgagcgctc aatctgggcg cgccgcctgt tacaccgact gaggctaggc tgcgccatca cgggccgtgt tctcattctg ctccagattc cccaagtacc ttgcccggcc ggcctgctcc gtggtggtgg ctggccatcc agtatcgtgc ttggtggcca agcgcctgag ggtactggtt ggtactattt ggtactacct tcggcatcac gatggtacta tggtgctggg ccgatcattg gcatcctgct ccgacccccg gcggccaggt accactgtag gctatctgct aggaggagtg tgctggtggc ccagcctgag ctttgctgcc tcgtcgctga tcgtggggga gccattacga gtctggtgtt acctcgcctc tcgccgtggt tgccctacac gcggggacac ccaagccggg ctcccccccc gggagcccac tcgactccgc agctgagcca tctactttgc gatcc cgataactcg caacgaggag cgacgccaag cgagggagtg cttgaagccg catcggcccc gcggggccgc ctctctcttc ccctctggag gtgtttcact gcaggcttac gcccgctatc cctgttcggc cgaggaggcg cccccattgc ccgcctgcat gctctgttcc gggcctgtac cgagggcgtc ctctctggtg tgtggcggct gaccgccagc cctggcgtct agggggagct ggcccctttc cgccctgtgc cgaggctagg cttcctgctc gagcgtgacc cacccaggtc

35 40 45 50 55 <210> 33 <211> 2045 <212> DNA <213>人工序列 <220><223> 編碼密碼子最佳化人類P501S(胺基酸1-553)之DNA，融合至肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta <400> 38 gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60 agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120 accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180 ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240 agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300 tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360 acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420 tcgcggatcg gcccgagatg gtgcagcggc tgtgggtgtc ccggctgctg cgccatagaa 480 aggcccagtt gctgctggtg aacctgctga ctttcggact ggaggtgtgc ctggctgccg 540 tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt 600 ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg 660 gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc 720 ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct 780 gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg 840 accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg 900 gctatctgct gcccgctatc gactgggaca ccagcgccct ggccccctac ctggggactc 960 aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc 102 0 tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc 1080 ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg 1140

-2i - 85702 60 200400970 cagctgtgct gtcgcatgcc tggatggccc tgatgacgtt cagggcgtgc ccagggccga aggatgggct ctctgggcct atggaccggc tggtgcagcg ttccccgtcg ccgccggcgc gccgccctga ccggcttcac ctgtaccatc gcgagaagca tcctctgagg acagcctgat cccaacggcc atgtcggggc ggcgctagtg cctgcgacgt gtcgtgcctg gccgggggat tcccaggtgg cgcccagcct gcctacatgg tgagcgccgc gtgttcgaca agagcgatct ctttgctgcc ccgcctgcat tcgtcgctga gctctgttcc tcgtggggga gggcctgtac gccattacga cgagggcgtc 5 gtctggtgtt ctctctggtg acctcgcctc tgtggcggct tcgccgtggt gaccgccagc tgccctacac cctggcgtct gcggggacac agggggagct 10 ccaagccggg ggcccctttc ctcccccccc cgccctgtgc gggagcccac cgaggctagg tcgactccgc cttcctgctc agctgagcca gagcgtgacc 15 tctactttgc cacccaggtc gatcc tcgcaccctg cgccgcctgt 1200 caccctcttc tacaccgact 1260 gcccggcacc gaggctaggc 1320 cttcctgcag tgcgccatca 1380 cttcggcacc cgggccgtgt 1440 gacctgcctg tctcattctg 1500 cttcagtgcg ctccagattc 1560 ggtgttcctg cccaagtacc 1620 gaccagcttc ttgcccggcc 1680 gggcggcagc ggcctgctcc 1740 gagcgtgcgg gtggtggtgg 1800 ctgcctggac ctggccatcc 1860 gttcatgggc agtatcgtgc 1920 cggcctgggg ttggtggcca 1980 cgccaagtat agcgcctgag 2040 2045

<210> 39 <211> 2105 20 <212> DNA <213>人工序列 <220 > 25 <223>編碼肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Ltya之 DNA,融合至人類P501S(胺基酸51-553)，融合至 人類P501S(胺基酸1-50)-密碼子最佳化 <400> 39 30 gcggccgcgc caccatggcc gccgcctacg tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca 60 agttcgagaa gatcaacggg acatggtact acttcgactc ctccggctac atgctcgccg 120 accgctggcg gaagcacacc gacggcaact ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg 180 ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt ggtactattt caacgaggag ggcgccatga 240 agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca 300 35 tgcagtatat caaggccaac agcaagttca tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca 360 acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc 420 tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc 480 tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc 540 gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc 600 40 gggccggctg gctggccggc ctgctgtgtc ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc 660 tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg 720 ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg 780 ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg gctatctgct gcccgctatc gactgggaca 840 ccagcgccct ggccccctac ctggggactc aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct 900 45 tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc 960 ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca 1020 gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct 1080 gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc 1140 tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc 1200 50 ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc gccattacga cgagggcgtc aggatgggct 1260 ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc 1320 tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg 1380 ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga 1440 ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc 1500 55 gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc gcggggacac agggggagct tcctctgagg 1560 acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc 1620 atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg 1680 cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg 1740 gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg 1800 60 cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg i860 tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca 1920 -U - 85702 200400970 agagcgatct cgccaagtat agcgccatgg tgcagcggct gtgggtgtcc cggctgctgc 1980 gccatagaaa ggcccagttg ctgctggtga acctgctgac tttcggactg gaggtgtgcc 2040 tggctgccgg gatcacgtac gtgccccccc tgctgctgga ggtgggcgtg gaggagtgag 2100 gatcc 2105 ίο 15 <210> 40 <211> 2105 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>編碼人類P501S(胺基酸1-50)之DNA,融合至肺炎鏈 球菌C-LytAP2輔助子抗原決定部位C-Ltya，融合至人類 P501S(胺基酸51-553)-密碼子最佳4匕 <400> 40 gcggccgcgc caccatggtg cagcggctgt gggtgtcccg gctgctgcgc catagaaagg 60 cccagttgct gctggtgaac ctgctgactt tcggactgga ggtgtgcctg gctgccggga 120 20 tcacgtacgt gccccccctg ctgctggagg tgggcgtgga ggagatggcc gccgcctacg 180 tgcatagcga cgggagctac cccaaggaca agttcgagaa gatcaacggg acatggtact 240 acttcgactc ctccggctac atgctcgccg accgctggcg gaagcacacc gacggcaact 300 ggtactggtt cgataactcg ggagagatgg ccaccggctg gaagaagatc gcggacaagt 360 ggtactattt caacgaggag ggcgccatga agaccggctg ggtgaagtat aaggacacct 420 25 ggtactacct cgacgccaag gagggcgcca tgcagtatat caaggccaac agcaagttca 480 tcggcatcac cgagggagtg atggtcagca acgcctttat ccagagcgcc gacggcaccg 540 gatggtacta cttgaagccg gacggcaccc tcgcggatcg gcccgagaag ttcatgtaca 600 tggtgctggg catcggcccc gtcctgggcc tcgtgtgtgt gcccctcctc gggagtgcgt 660 ccgatcattg gcggggccgc tacggccgcc gcagaccgtt catctgggcc ctgagcctgg 720 30 gcatcctgct ctctctcttc ctgatccccc gggccggctg gctggccggc ct:gctgtgtc 780 ccgacccccg ccctctggag ctggccctcc tgatcctggg cgtgggcctg ctggacttct 840 gcggccaggt gtgtttcact cccctggagg ctctgctctc cgacctcttc cgcgaccccg 900 accactgtag gcaggcttac agcgtgtacg ccttcatgat cagtctgggg ggatgcctgg 960 gctatctgct gcccgctatc gactgggaca ccagcgccct ggccccctac ctggggactc 1020 35 aggaggagtg cctgttcggc ctgctcacct tgatcttcct gacgtgcgtc gccgccaccc 1080 tgctggtggc cgaggaggcg gccctggggc ccaccgagcc cgccgagggc ctgagcgctc 1140 ccagcctgag cccccattgc tgcccgtgca gggctaggct cgccttcagg aatctgggcg 1200 ctttgctgcc ccgcctgcat cagctgtgct gtcgcatgcc tcgcaccctg cgccgcctgt 1260 tcgtcgctga gctctgttcc tggatggccc tgatgacgtt caccctcttc tacaccgact 1320 40 tcgtggggga gggcctgtac cagggcgtgc ccagggccga gcccggcacc gaggctaggc 1380 gccattacga cgagggcgtc aggatgggct ctctgggcct cttcctgcag tgcgccatca 1440 gtctggtgtt ctctctggtg atggaccggc tggtgcagcg cttcggcacc cgggccgtgt 1500 acctcgcctc tgtggcggct ttccccgtcg ccgccggcgc gacctgcctg tctcattctg 1560 tcgccgtggt gaccgccagc gccgccctga ccggcttcac cttcagtgcg ctccagattc 1620 45 tgccctacac cctggcgtct ctgtaccatc gcgagaagca ggtgttcctg cccaagtacc 1680 gcggggacac agggggagct tcctctgagg acagcctgat gaccagcttc ttgcccggcc 1740 ccaagccggg ggcccctttc cccaacggcc atgtcggggc gggcggcagc ggcctgctcc 1800 ctcccccccc cgccctgtgc ggcgctagtg cctgcgacgt gagcgtgcgg gtggtggtgg 1860 gggagcccac cgaggctagg gtcgtgcctg gccgggggat ctgcctggac ctggccatcc 1920 50 tcgactccgc cttcctgctc tcccaggtgg cgcccagcct gttcatgggc agtatcgtgc 1980 agctgagcca gagcgtgacc gcctacatgg tgagcgccgc cggcctgggg ttggtggcca 2040 tctactttgc cacccaggtc gtgttcgaca agagcgatct cgccaagtat agcgcctgag 2100 gatcc 2105 55 <210> 41 <211> 652 <212> PRT <213>人工序列 60 <220>

<223>肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta融合至人類P501S -23- 85702 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 <400> 41 Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 15 10 15 Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Gly Val 100 105 110 Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Ύγτ Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly 工le Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Lieu lie Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430 Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 85702 -24- 60 200400970 5 10 15 20

Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly* Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly* Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560 Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 565 570 575 Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin Leu Ser 595 600 605 Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620 Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala Gly Gly His His His His His His 645 650

25 30 35 40 45 50 55 <210> 42 <211> 1959 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>編碼肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta之DNA， 融合至人類P501S(加上his標幟） <400> 42 atggcggccg cttacgtaca ttccgacggc tcttatccaa aagacaagtt tgagaaaatc 60 aatggcactt ggtactactt tgacagttca ggctatatgc ttgcagaccg ctggaggaag 120 cacacagacg gcaactggta ctggttcgac aactcaggcg aaatggctac aggctggaag 180 aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240 aagtacaagg acacttggta ctacttagac gctaaagaag gcgccatgca atacatcaag 300 gctaactcta agttcattgg tatcactgaa ggcgtcatgg tatcaaatgc cttfcatccag 360 tcagcggacg gaacaggctg gtactacctc aaaccagacg gaacactggc agacaggcca 420 gaaaagttca tgtacatggt gctgggcatt ggtccagtgc tgggcctggt ctgtgtcccg 480 ctcctaggct cagccagfcga ccactggcgt ggacgctatg gccgccgccg gcccttcatc 540 tgggcactgt ccttgggcat cctgctgagc ctctttctca tcccaagggc cggctggcta 600 9cagggctgc tgtgcccgga tcccaggccc ctggagctgg cactgctcatr cctgggcgtg 660 999Ctgctgg acttctgtgg ccaggtgtgc ttcactccac tggaggccct gctctctgac 720 ctcttccggg acccggacca ctgtcgccag gcctactctg tctatgcctt catgatcagt 780 cttgggggct gcctgggcta cctcctgcct gccattgact gggacaccag tgccctggcc 840 ccctacctgg gcacccagga ggagtgcctc tttggcctgc tcaccctcat cttcctcacc 900 tgcgtagcag ccacactgct ggtggctgag gaggcagcgc tgggccccac cgagccagca 960 gaagggctgt cggccccctc cttgtcgccc cactgctgtc catgccgggc ccgcttggct 1020 ttccggaacc tgggcgccct gcttccccgg ctgcaccagc tgtgctgccg catgccccgc 1080 accctgcgcc ggctcttcgt ggctgagctg tgcagctgga tggcactcat gaccttcacg 1140 ctgttttaca cggatttcgt gggcgagggg ctgtaccagg gcgtgcccag agctgagccg 1200 ggcaccgagg cccggagaca ctatgatgaa ggcgttcgga tgggcagcct ggggctgttc 1260 ctgcagtgcg ccatctccct ggtcttctct ctggtcatgg accggctggt gcagcgattc 1320 ggcactcgag cagtctattt ggccagtgtg gcagcttfccc ctgtggctgc cggtgccaca 1380 tgcctgtccc acagtgtggc cgtggtgaca gcttcagccg ccctcaccgg gttcaccttc 1440 tcagccctgc agatcctgcc ctacacactg gcctccctct accaccggga gaagcaggtg 1500

85702 -25- 60 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

ttcctgccca aataccgagg ggacactgga ggtgctagca gtgaggacag cctgatgacc agcttcctgc caggccctaa gcctggagct cccttcccta atggacacgt gggtgctgga ggcagtggcc tgctcccacc tccacccgcg ctctgcgggg cctctgcctg tgatgtctcc gtacgtgtgg tggtgggtga gcccaccgag gccagggtgg Ctccgggccg gggcatctgc ctggacctcg ccatcctgga tagtgccttc ctgctgtccc aggtggcccc atccctgttt atgggctcca ttgtccagct cagccagtct gtcactgcct atatggtgtc tgccgcaggc ctgggtctgg tcgccattta ctttgctaca caggtagtat ttgacaagag cgacttggcc aaatactcag cgggtggaca ccatcaccat caccattaa <210> 43 <211> 553 <212> PRT <213>智慧人 <400> 43 Met Val Gin Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gin Leu Leu Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Ala Gly lie Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Val 35 40 45 Glu Glu Lys Phe Met Thr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly 50 55 60 Leu Val Cys Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly 65 70 75 80 A.rg Tyr Gly Arg Arg Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie 85 90 95 Leu Leu Ser Leu Phe Leu tie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu 100 105 110 Leu Cys Pro Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly 115 120 125 Val Gly Leu Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu 130 135 140 Ala Leu Leu Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala 145 150 155 160 Tyr Ser Val Tyr Ala Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr 165 170 175 beu Leu Pro Ala lie Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu 180 135 190 Gly Thr Gin Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu 195 200 205 Thr Cys Val Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly 210 215 220 Pro Thr Glu Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His 225 230 235 240 Cys Cys Pro Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu 245 250 255 Leu Pro Arg Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg 260 265 270 Arg Leu Phe Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe 275 280 285 Thr Leu Phe Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val 290 295 300 Pro Arg Ala Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly 305 310 315 320 Val Arg Met Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu 325 330 335 Val Phe Ser Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg 340 345 350 Ala Val Tyr Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala 355 360 36S 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1959 85702 -26- 60 200400970 5

Thr Cys Leu Ser His 370 Thr Gly Phe Thr Phe 3Θ5 Ser Leu Tyr His Axg 405

Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser A.la Ala Leu 375 380 Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala 390 395 400 Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly 410 415

Asp Thr Gly Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu 420 425 430 10

Pro Gly Pro Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala 435 440 445 15

Gly Gly Ser Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser 450 455 460 Ala Cys Asp Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala 465 470 475 480 Arg Val Val Pro Gly Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp 485 490 495 20

Ser Ala Phe Leu Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser 500 505 510 He Val Gin Leu Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala 515 520 525 Gly Leu Gly Leu Val Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp 530 535 540 Lys Ser Asp Leu Ala Lys Tyr Ser Ala 545 550 25

<210> 44 <211> 644 <212> PRT 30 <213 >人工序列 <220>

<223>肺炎鏈球菌C-LytAP2輔助子抗原決定部位C-Lyta融合至人類P501S 35 <400> 44

Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 15 10 15

Phe Glu Lys He Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 40 20 25 30

Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45

Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp 50 55 60 45 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80

Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95

Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Gly Val 50 100 105 110

Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125

Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 55 Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160

Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175

Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser Leu Phe 60 180 185 190

Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro -27- 85702 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Sex Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr heu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430 Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460 Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480 Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495 Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560 Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 565 570 575 Arq Glv lie Cvs Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin Leu Ser 595 600 605 Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620 Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640 Lys Tyr Ser Ala <210> 45 <211> 644 85702 -28 - 60 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta融合至人類 P501S(胺基酸51-553)間密碼子最佳化之混種蛋白質 <400> 45 Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp hys 1 5 10 15 Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Tiir Glu Gly Val 100 105 110 Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335 Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365 Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380 Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 385 390 395 400 Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415 85702 -29- 60 200400970

Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430

Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445 5 Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460

Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 465 470 475 480

Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 10 485 490 495

Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510

Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525 15 Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540

Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 545 550 555 560

Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 20 565 570 575

Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590

Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin Leu Ser 595 600 605 25 Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 615 620

Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 625 630 635 640

Lys Tyr Ser Ala 30

<210> 46 <211> 694 35 <212> PRT <213 >人工序列 <220> <223>肺炎鏈球菌C-LytAP2輔助子抗原決定部位C-Lyta融合至人類 P501S(胺基酸1-553)-密碼子最佳化 <400> 46

Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys IS 10 15 45 Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30

Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45

Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp 50 50 55 60

Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80

Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 55 Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Gly Val 100 105 110

Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125

Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Met Val Gin 60 130 135 140

Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala Gin Leu Leu -30- S5702 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 145 150 155 160 Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val Cys Leu Ala Ala Gly 165 170 175 工le Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Vai Glu Glu Lys 180 185 190 Phe Met Thr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys 195 200 205 Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly 210 215 220 Arg Arg Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser 225 230 235 240 Leu Phe Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro 245 250 255 Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly Leu 260 265 270 Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu 275 280 285 Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val 290 295 300 Tyr Ala Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Ala lie Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin 325 330 335 Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val 340 345 350 Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Fro 370 375 380 Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg 385 390 395 400 Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe 405 410 415 Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe 420 425 430 Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala 435 440 445 Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met 450 455 460 Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser 465 470 475 480 Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr 485 490 495 Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu 500 505 510 Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe 515 520 525 Thr Phe Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser leu Tyr 530 535 540 His Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly 545 550 555 560 Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro 565 570 575 Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp 595 600 605 Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val 610 615 620 Pro Gly Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe 625 630 635 640 85702 -31 - 60 200400970 5

Leu Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser 工le Val Gin 545 650 655 Leu Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly 660 ββ5 670 Leu Val Ala lie Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp 675 680 685 Leu Ala Lys Tyr Ser Ala 690 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 <210> 47 <211> 694 <212> PRT <213 >人工序列 <220 ><223>肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta融合至人類P501S(胺基 酸51-553)融合至人類P501S(胺基酸1-50)-密碼子最佳化 <400> 47 Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 15 10 15 Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 35 40 45 Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie Ala Asp 50 55 60 Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly Trp Val 65 70 75 80 Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly Ala Met 85 90 95 Gin Tyr He Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu Gly Val 100 105 110 Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly Trp Tyr 115 120 125 Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys Phe Met 130 135 140 Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys Val Pro 145 150 155 160 Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly Arg Arg 165 170 175 Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser Leu Phe 180 185 190 Leu He Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro Asp Pro 195 200 205 Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly Val Gly Leu Leu Asp 210 215 220 Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu Ser Asp 225 230 235 240 Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val Tyr Ala 245 250 255 Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro Ala lie 260 265 270 Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin Glu Glu 275 280 285 Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val Ala Ala 290 295 300 Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu Pro Ala 305 310 315 320 85702 -32- 60 200400970

Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser beu Ser Pro His Cys Cys Pro Cys Arg 325 330 335

Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg Leu His 340 345 350 5 Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe Val Ala 355 360 365

Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe Tyr Thr 370 375 380

Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gin Gly Val Pro Arg Ala Glu Pro 10 385 390 395 400

Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met Gly Ser 405 410 415

Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser Leu Val 420 425 430 15 Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr Leu Ala 435 440 445

Ser Val Ala A.la Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu Ser His 450 455 460

Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe Thr Phe 20 465 470 475 480

Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr His Arg 485 490 495

Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly Gly Ala 500 505 510 25 Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro Lys Pro 515 520 525

Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser Gly Leu 530 535 540

Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp Val Ser 30 545 550 555 560

Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val Pro Gly 565 570 575

Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe Leu Leu 580 585 590 35 Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser He Val Gin Leu Ser 595 600 605

Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly Leu Val 610 6X5 620

Ala He Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp Leu Ala 40 625 630 635 640

Lys Tyr Ser Ala Met Val Glrx Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg 645 650 655

His Arg Lys Ala Gin Leu Leu Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu 660 665 670 45 Glu Val Cys Leu Ala Ala Gly* lie Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu 675 680 685

Glu Val Gly Val Glu Glu 690 50

<210> 48 <211> 694 <212> PRT <213>人工序列 55 <220> <223>人類P50is(胺基酸1-50)融合至肺炎鏈球菌 C-LytAP2輔助子抗原決定部位C-Lyta，融合至人類 60 P501S(胺基酸51-553)-密碼子最佳化 <400> 48 •33- 85702 200400970 ίο 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Met Val Gin Arg Leu Trp Val Ser Arg Leu Leu Arg His Arg Lys Ala 1 5 10 15 Gin Leu Leu Leu Val Asn Leu Leu Thr Phe Gly Leu Glu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Ala Gly lie Thr Tyr Val Pro Pro Leu Leu Leu Glu Val Gly Val 35 40 45 Glu Glu Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys 50 55 60 Asp Lys Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser 65 70 75 80 Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn Trp 85 90 95 Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys lie 100 105 110 Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr Gly 115 120 125 Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu Gly 130 135 140 Ala Met Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu 145 150 155 160 Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr Gly 165 170 175 Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu Lys 180 185 190 Phe Met Tyr Met Val Leu Gly lie Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Cys 195 200 205 Val Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Asp His Trp Arg Gly Arg Tyr Gly 210 215 220 Arg Arg Arg Pro Phe lie Trp Ala Leu Ser Leu Gly lie Leu Leu Ser 225 230 235 240 Leu Phe Leu lie Pro Arg Ala Gly Trp Leu Ala Gly Leu Leu Cys Pro 245 250 255 Asp Pro Arg Pro Leu Glu Leu Ala Leu Leu lie Leu Gly VaL Gly Leu 260 265 270 Leu Asp Phe Cys Gly Gin Val Cys Phe Thr Pro Leu Glu Ala Leu Leu 275 280 285 Ser Asp Leu Phe Arg Asp Pro Asp His Cys Arg Gin Ala Tyr Ser Val 290 295 300 Tyr Ala Phe Met lie Ser Leu Gly Gly Cys Leu Gly Tyr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Ala lie Asp Trp Asp Thr Ser Ala Leu Ala Pro Tyr Leu Gly Thr Gin 325 330 335 Glu Glu Cys Leu Phe Gly Leu Leu Thr Leu lie Phe Leu Thr Cys Val 340 345 350 Ala Ala Thr Leu Leu Val Ala Glu Glu Ala Ala Leu Gly Pro Thr Glu 355 360 365 Pro Ala Glu Gly Leu Ser Ala Pro Ser Leu Ser Pro His Cys Cys Pro 370 375 380 Cys Arg Ala Arg Leu Ala Phe Arg Asn Leu Gly Ala Leu Leu Pro Arg 385 390 395 400 Leu His Gin Leu Cys Cys Arg Met Pro Arg Thr Leu Arg Arg Leu Phe 405 410 415 Val Ala Glu Leu Cys Ser Trp Met Ala Leu Met Thr Phe Thr Leu Phe 420 425 430 Tyr Thr Asp Phe Val Gly Glu Gly Leu Tyr Gla Gly Val Pro Arg Ala 435 440 445 Glu Pro Gly Thr Glu Ala Arg Arg His Tyr Asp Glu Gly Val Arg Met 450 455 460 Gly Ser Leu Gly Leu Phe Leu Gin Cys Ala lie Ser Leu Val Phe Ser 465 470 475 480 Leu Val Met Asp Arg Leu Val Gin Arg Phe Gly Thr Arg Ala Val Tyr

85702 -34- 200400970 485 490 495 Leu Ala Ser Val Ala Ala Phe Pro Val Ala Ala Gly Ala Thr Cys Leu 500 505 510 Ser His Ser Val Ala Val Val Thr Ala Ser Ala Ala Leu Thr Gly Phe 5 515 520 525 Thr Phe Ser Ala Leu Gin lie Leu Pro Tyr Thr Leu Ala Ser Leu Tyr 530 535 540 His Arg Glu Lys Gin Val Phe Leu Pro Lys Tyr Arg Gly Asp Thr Gly 545 550 555 560 10 Gly Ala Ser Ser Glu Asp Ser Leu Met Thr Ser Phe Leu Pro Gly Pro 565 570 575 Lys Pro Gly Ala Pro Phe Pro Asn Gly His Val Gly Ala Gly Gly Ser 580 585 590 Gly Leu Leu Pro Pro Pro Pro Ala Leu Cys Gly Ala Ser Ala Cys Asp 15 595 600 605 Val Ser Val Arg Val Val Val Gly Glu Pro Thr Glu Ala Arg Val Val 610 615 620 Pro Gly Arg Gly lie Cys Leu Asp Leu Ala lie Leu Asp Ser Ala Phe 625 630 635 640 20 Leu Leu Ser Gin Val Ala Pro Ser Leu Phe Met Gly Ser lie Val Gin 645 650 655 Leu Ser Gin Ser Val Thr Ala Tyr Met Val Ser Ala Ala Gly Leu Gly 660 665 670 Leu Val Ala He Tyr Phe Ala Thr Gin Val Val Phe Asp Lys Ser Asp 25 675 680 685 Leu Ala Lys Tyr Ser Ala 690 30 > > > > 0 12 3 1 111 2 2 2 2 < < < <

49 1971

DNA 人工序列 35 40 <220 > <223>編碼人類MUC-1之DNA融合至肺炎鏈球菌 C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta <400> 49' atgacaccgg gcacccagtc gttacaggtt ctggtcatgc 45 50 gccccggaca acaagccagc gccccggaca ccaggccgcc gccccggaca ccaggccgcc gccccggaca ccaggccggc gccccggaca acaggcccgc gcctcaggct ctgcatcagg 55 tataaacaag ggggttttct gtacaattga ctctggcctt ttcaatcagt ataaaacgga gtgagtgatg tgccatttcc atcgcgctgc fcggtgctggt ctgtgttctg gttgcgctgg cagagaagtt ctctccagcc gccccggcca gtcccagtca gctaccacaa actcctacca acggtacctc tctttctttt cccagcaccg cagtgcccag acagccccgg cggaaccagc ccaggccagc ccccagccag cccttgccag ctctcacctc tcctgtcttt actactacca tcctttcttc aagctctacc ctctactgag ttcaggctcc ttcaggttca cctgggctcc cccgggctcc cccgggctcc cccgggctcc cccgggctcc cttggcgtcc ctcagcttct caagagcact ccatagcacc ctccaatcac tcacatttca agagctgcag gggcctctcc ccgagaaggt agcagcctct tttctctgcc ctgctgctgc ccaggtggag aagaatgctg tccaccactc gctgccacct accaccccgc accgcccccc accgcccccc accgcgcccg accgcccccc accgcccctc actctggtgc ccattctcaa aagactgatg agcacttctc aacctccagt agagacattt aatattaagt accatcaatg cgatataacc cagtctgggg tcctcacagt aaaaggagac tgagtatgac agggacagga ggggacagga cagcccacga cagcccacgg cagcccacgg cagcccacgg cagcccatgg cagtccacaa acaacggcac ttcccagcca ccagtagcac cccagttgtc ttaattcctc ctgaaatgtt tcaggccagg tccacgacgt tgacgatctc ctggggtgcc ccattgtcta gcttacagtt ttcggctacc cagcagcgta tgtcactctg tgtcacctcg tgtcacctca tgtcacctcg tgtcacctcg tgtcacctcg tgtcacctcg tgtcacctcg ctctgccagg ccactctgat tcaccatagc tactggggtc tctggaagat tttgcagatt atctgtggtg ggagacacag agacgtcagc aggctggggc tctcattgcc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 6€0 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 -35- 85702 60 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 tcggctgtct gtcagtgccg ccgaaagaac tacgggcagc tggacatctt tccagcccgg gatacctacc atcctatgag cgagtacccc acctaccaca cccatgggcg ctatgtgccc cctagcagta ccgatcgtag cccctatgag aaggtttctg caggtaatgg tggcagcagc ctctcttaca caaacccagc agtggcagcc acttctgcca acttgatggc ggccgcttac gtacattccg acggctctta tccaaaagac aagtttgaga aaatcaatgg cacttggtac tactttgaca gttcaggcta tatgcttgca gaccgctgga ggaagcacac agacggcaac tggtactggt tcgacaactc aggcgaaatg gctacaggct ggaagaaaat cgctgataag tggtactatt tcaacgaaga aggtgccatg aagacaggct gggtcaagta caaggacact tggtactact tagacgctaa agaaggcgcc atgcaataca tcaaggctaa ctctaagttc attggtatca ctgaaggcgt catggtatca aatgccttta tccagtcagc ggacggaaca ggctggtact acctcaaacc agacggaaca ctggcagaca ggccagaatg a <210> 50 <211> 656 <212> PRT <213>人工序列 <220><223>人類MUC-l融合至肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta <400> 50 Met Thr Pro Gly Thr Gin Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gin Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gin Gly Gin Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gin 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 130 135 140 Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser 145 ISO 155 160 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His 16S 170 175 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 180 185 19〇 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu 195 200 205 Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser Gly Ser 210 215 220 Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser Ala Arg 225 230 235 240 Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser He Pro Ser 245 250 255 His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr Lys Thr 260 265 270 Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu Thr Ser Ser 275 280 285 Asn His Ser Thr Ser Pro Gin Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe 290 295 300 Leu Ser Phe His He Ser Asa Leu Gin Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1971 85702 -36- 60 200400970 305 310 315 320

Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gin Glu Leu Gin Arg Asp lie Ser Glu Met 325 330 335

Phe Leu Gin lie Tyr Lys Gin Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn lie 5 340 345 350

Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gin Leu Thr Leu Ala Phe Arg 355 360 365

Glu Gly Thr lie Asn Val His Asp Val Glu Thr Gin Phe Asa Gin Tyr 370 375 380 10 Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr lie Ser Asp Val Ser 385 390 395 400

Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gin Ser Gly Ala Gly Val 405 410 415

Pro Gly Trp Gly lie Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala 15 420 425 430

Leu Ala 工le Val Tyr Leu lie Ala Leu Ala Val Cys Gin Cys Arg Arg 435 440 445

Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp lie Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His 450 455 460 20 Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro 465 470 475 480

Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn 485 490 495

Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser 25 500 505 510

Ala Asn Leu Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly Ser Tyr Pro 515 520 525

Lys Asp Lys Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser 530 535 540 30 Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Arg Trp Arg Lys His Thr Asp Gly Asn 545 550 555 560

Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys 565 570 575 lie Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala Met Lys Thr 35 530 585 590

Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp Ala Lys Glu 595 - 600 605

Gly Ala Met Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr 610 615 620 40 Glu Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala Asp Gly Thr 625 630 635 640

Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp Arg Pro Glu 645 650 655 45 ,

<210> 51 <211> 2037 <212> DNA <213>人工序列 50 <220> <223>編碼肺炎鏈球菌C-LytA P2輔助子抗原決定部位C-Lyta 之DNA融合至人類MUC-1 55 <400> 51 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtccaaatgg cggccgctta cgtacattcc gacggctctt atccaaaaga caagtttgag 120 aaaatcaatg gcacttggta ctactttgac agttcaggct atatgcttgc agaccgctgg 180 aggaagcaca cagacggcaa ctggtactgg ttcgacaact caggcgaaat ggctacaggc 240 60 tggaagaaaa tcgctgataa gtggtactat ttcaacgaag aaggtgccat gaagacaggc 300 tgggtcaagt acaaggacac ttggtactac ttagacgcta aagaaggcgc catgcaatac 360 -37- 85702 200400970 atcaaggcta actctaagtt cattggtatc actgaaggcg tcatggtatc aaatgccttt 42 0 atccagtcag cggacggaac aggctggtac tacctcaaac cagacggaac actggcagac 480 aggccagaaa tgacaccggg cacccagtct cctttcttcc tgctgctgct cctcacagtg 54 0 cttacagttg ttacaggttc tggtcatgca agctctaccc caggtggaga aaaggagact 60 0 5 tcggctaccc agagaagttc agtgcccagc tctactgaga agaatgctgt gagtatgacc 660 agcagcgtac tctccagcca cagccccggt tcaggctcct ccaccactca gggacaggat 720 gtcactctgg ccccggccac ggaaccagct tcaggttcag ctgccacctg gggacaggat 780 gtcacctcgg tcccagtcac caggccagcc ctgggctcca ccaccccgcc agcccacgat 840 gtcacctcag ccccggacaa caagccagcc ccgggctcca ccgccccccc agcccacggt 900 10 gtcacctcgg ccccggacac caggccgccc ccgggctcca ccgccccccc agcccacggt 960 gtcacctcgg ccccggacac caggccgccc ccgggctcca ccgcgcccgc agcccacggt 1020 gtcacctcgg ccccggacac caggccggcc ccgggctcca ccgccccccc agcccatggt 1080 gtcacctcgg ccccggacaa caggcccgcc ttggcgtcca ccgcccctcc agtccacaat 1140 gtcacctcgg cctcaggctc tgcatcaggc tcagcttcta ctctggtgca caacggcacc 1200 15 tctgccaggg ctaccacaac cccagccagc aagagcactc cattctcaat tcccagccac 1260 cactctgata ctcctaccac ccttgccagc catagcacca agactgatgc cagtagcact 1320 caccatagca cggtacctcc tctcacctcc tccaatcaca gcacttctcc ccagttgtct 1380 actggggtct ctttcttttt cctgtctttt cacatttcaa acctccagtt taattcctct 1440 ctggaagatc ccagcaccga ctactaccaa gagctgcaga gagacatttc tgaaatgttt 1500 20 ttgcagattt ataaacaagg gggttttctg ggcctctcca atattaagtt caggccagga 1560 tctgtggtgg tacaattgac tctggccttc cgagaaggta ccatcaatgt ccacgacgtg 1620 gagacacagt tcaatcagta taaaacggaa gcagcctctc gatataacct gacgatctca 1680 gacgtcagcg tgagtgatgt gccatttcct ttctctgccc agtctggggc tggggtgcca 1740 ggctggggca tcgcgctgct ggtgctggtc tgtgttctgg ttgcgctggc cattgtctat 1800 25 ctcattgcct tggctgtctg tcagtgccgc cgaaagaact acgggcagct ggacatcttt 1860 ccagcccggg atacctacca tcctatgagc gagtacccca cctaccacac ccatgggcgc 1920 tatgtgcccc ctagcagtac cgatcgtagc ccctatgaga aggtttcCgc aggtaatggt 1980 ggcagcagcc tctcttacac aaacccagca gtggcagcca cttctgccaa cttgtag 2037 30 <210> 52 <211> 678 <212> PRT <213 >人工序列 35 <220> - <223>肺炎鏈球菌C-LytAP2輔助子抗原決定部位C-Lyta 融合至人類MUC-1 <400> 52 40 Met Gly Trp Ser Cys lie He Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

Val His Ser Gin Val Gin Met Ala Ala Ala Tyr Val His Ser Asp Gly 20 25 30

Ser Tyr Pro Lys Asp Lys Phe Glu Lys lie Asn Gly Thr Trp Tyr Tyr 45 35 40 45

Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Met Leu Ala Asp Axg Trp Arg Lys His Thr 50 55 60

Asp Gly Asn Trp Tyr Trp Phe Asp Asn Ser Gly Glu Met Ala Thr Gly 65 70 75 80 50 Trp Lys Lys lie Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Phe Asn Glu Glu Gly Ala 85 90 95

Met Lys Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys Asp Thr Trp Tyr Tyr Leu Asp 100 105 110

Ala Lys Glu Gly Ala Met Gin Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie 55 115 120 125

Gly lie Thr Glu Gly Val Met Val Ser Asn Ala Phe lie Gin Ser Ala 130 135 140

Asp Gly Thr Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Pro Asp Gly Thr Leu Ala Asp

145 ISO 155 ISO 60 Arg Pro Glu Met Thr Pro Gly Thr Gin Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu 165 170 175 • 38 - 85702 200400970 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Leu Leu Thr Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser 180 185 190 Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gin Arg Ser Ser Val 195 200 205 Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu 210 215 220 Ser Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gin Gly Gin Asp 225 230 235 240 Val Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr 245 250 255 Trp Gly Gin Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly 260 265 270 Ser Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys 275 280 285 Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala 290 295 300 Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly 305 310 315 320 Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Pro Pro Gly Ser Thr Ala Pro 325 330 335 Ala Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly 340 345 350 Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg 355 360 365 Pro Ala Leu Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala 370 375 380 Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr 385 390 395 400 Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser 405 410 415 工le Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser 420 425 430 Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu 435 440 445 Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gin Leu Ser Thr Gly Val Ser 450 455 460 Phe Phe Phe heu Ser Phe His lie Ser Asn Leu Gin Phe Asn Ser Ser 4β5 470 475 480 Leu Glu A.sp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gin Glu Leu Gin Arg Asp lie 485 490 495 Ser Glu Met Phe Leu Gin lie Tyr Lys Gin Gly Gly Phe heu Gly Leu 500 505 510 Ser Asn lie Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gin Leu Thr Leu 515 520 525 Ala Phe Arg Glu Gly Thr lie Asn Val His Asp Val Glu Thr Gin Phe 530 535 540 Asn Gin Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr lie Ser 545 550 555 560 Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gin Ser Gly 565 570 575 Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly lie Ala Leu heu Val Leu Val Cys Val 580 585 590 Leu Val Ala Leu Ala lie Val Tyr Leu lie Ala Leu Ala Val Cys Gin 595 600 605 Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp lie Phe Pro Ala Arg Asp 610 615 620 Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg 625 630 635 640 Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser 645 6-50 6SS Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala 85702 -39- 60 665 200400970 660 Ala Thr Ser Ala Asn Leu 675 85702 • 40-

Claims (1)

1. 2〇〇4〇〇97〇 拾、申請專利範圍： 1'—種融合體配對蛋白質，其含膽鹼結合功能部位及一異質 的混種T輔助細胞抗原決定部位。 •根據申請專利範圍第1項之融合體配對蛋白質，其中的膽 驗結合功能部位是衍自LytA C末端。 3 .根據申請專利範圍第2項之融合體配對蛋白質，其中的 C-LytA或衍生物含SEQ ID NO: 1至6任一者至少四個重複 子。 4. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之融合體配對蛋白 質’其中的膽鹼結合功能部位選自下列所組成之群： a) LytA之C-末端功能部位，如SEQ ID NO:7所示；或 b) SEQ ID NO:8之序列；或 c) 肽序列’其含與SEQ ID NO: 1至6任一者具至少85%同 一性之胺基酸序列’較好至少90%同一性，又較好至 少95%同一性’最好至少97-99%同一性；或 d) 肽序列’含具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8胺基酸 序列之至少15，20，30 ’ 40，50或100個連續胺基酸 之胺基酸序列。 5. 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之融合體配對蛋白 質，其進一步包括異質蛋白質。 6 ·根據申請專利範圍第5項之融合體蛋白質，其中的異質蛋 白質係化學共輛至融合體配對。 7.根據申請專利範圍第5項之融合體蛋白質，其中的異質蛋 白質衍生自由下列各群選出之有機體：人類免疫缺失病毒 85702 200400970

   HIV-1，人類單純癌珍病毒，巨細胞病毒，輪狀病毒 (Rotavirus)，愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein Barr virus)，水痘 -帶狀疮瘆病毒（Varicella Zoster virus)，來自肝炎病毒，如 B型肝炎病毒，A型肝炎病毒，C型肝炎病毒及E型肝炎病 毒，來自呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial virus)，副 流感病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，人類乳頭狀瘤病毒， 黃病毒或流感病毒，來自奈瑟氏球菌屬（Neisseria spp.) ’ 莫拉氏菌屬（Moraxella spp.)，博德特氏菌屬（Bordetella spp);分枝桿菌屬（Mycobacterium spp·)，包括結核分枝桿 菌（M. tuberculosis);埃希氏菌屬（Escherichia spp·)，包括 腸毒性E. coli ;沙門氏菌屬（Salmonella spp);利斯特氏菌 屬（Listeria spp.);螺桿菌屬（Helicobacter spp);葡萄球菌 屬（staphylococcus spp.)，包括金黃色葡萄球菌（S. aureus)，表皮葡萄球菌（S. epidermidis);疏螺旋體屬 (Borrelia spp.);衣原體屬（Chlamydia spp·)，包括砂眼衣 原體（C· trachomatis)，肺炎衣原體（C. pneumoniae);癔原 蟲（Plasmodium spp·)，包括惡性癌原蟲（P. falciparum);弓 形體屬（Toxoplasma spp.)，假絲酵（Candida spp.)。 8. 根據申請專利範圍第5項之融合體蛋白質，其中的異質蛋 白質是一種與腫瘤有關之蛋白質或組織特異性蛋白質或 其免疫原片段。 9. 根據申請專利範圍第8項之融合體蛋白質，其中的異質蛋 白質或其片段係選自MAGE 1，MAGE 3，MAGE 4， PRAME，BAGE，LAGE 卜 LAGE 2，SAGE，HAGE，XAGE， 85702 200400970 PSA ’ PAP ’ PSCA ’ 前列素（prostein)，P501S，HASH2， Cripto ’ B726，NY-BR1.1，P510，MUC-1，前列腺酶 (prostase) ’ STEAP，路胺酸酶，端粒酶，存活素（survivin)， CASB616，P53 或 her 2 neu ° 10. 根據申請專利範圍第6項之融合體蛋白質，其進一步含有 至少4個組胺酸殘基之親和力標幟。 11. 一種編碼申請專利範圍第1至3項中任一項之蛋白質之核 酸序列。 12. —種含申请專利範圍第11項之核酸序列之表現載體。 13. —種以申請專利範圍第11項之核酸序列，或以申請專利範 圍第1 2項之表現載體所轉形之宿主。 14. 一種免疫組合物’其含申請專利範圍第1至3項中任一項之 蛋白貝或申凊專利範圍第丨1項之DNA序列及醫藥上可接 受之賦形劑。 15. 根據申請專利範圍第14項之免疫組合物，其另外含τη」 誘導性佐劑。 16. 根據申請專利範圍第15項之免疫組合物，其中τΗ_ι誘導 性佐劑選自包括以下之佐劑之群：3D_MPL，qS2卜吸2丄 及膽固醇之混合物，CpG寡核苷酸或二種以上之該佐劑之 混合物。 17. —種根據申請專利範圍第14項之免疫组合物之製法，其包 括將中叫專利範圍第6項之融合體蛋白質或申請專利範圍 第11項之編碼聚核苷酸與適合的佐劑，稀釋劑或其他醫藥 上可接受之載劑摻和。 18. 一種申請專利範圍第1至3項中任-項之融合體蛋白質之 85702 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 製法’其包括在足以產製該融合體蛋白質之條件下培養申 請專利範圍第13項之宿主細胞’並自培養基中回收融合體 蛋白質。 根據申請專利範圍第1至3項中任一項之蛋白質，或根據申 凊專利範圍第11項之DN A序列，其係用於醫學上。 一種申請專利範圍第1至3項中任一項之蛋白質，或申請專 利範圍第11項之DNA序列之用途，其係用於製成免疫组合 物以用於誘生病人之免疫反應。 根據申請專利範圍第2 〇項之用途，其中該免疫反應可依序 投予下列而誘生·· i)該蛋白質繼以該Dna序列；或ϋ)該 DNA序列繼以該蛋白質。 根據申請專利範圍第21項之用途’其中該dna序列係塗佈 在可生物降解之珠粒上或經粒子撞擊途徑遞送。 根據申請專利範圍第21項之用途，其中該蛋白質係加有佐 劑的。 種申凊專利範圍第1至3項中任一項之蛋白質，或申請專 矛·!範圍第11項之DNA序列之用途，其係用於製成免疫組 合物以免疫治療性處理患有或疑似罹患有癌症之病人。 根據申請專利範圍第24項之使用，其中該癌症是前列腺 癌’結腸癌’肺癌，乳癌或黑色素瘤。 種癌症患者之治療方法，其藉由投予安全且有效劑量之 根據申請專利範圍第12項之組合物。 根據申請專利範圍第26項之方法，其中該癌症是前列腺 癌，結腸癌，肺癌，乳癌或黑色素瘤。 85702