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DE60309865T2 - Glycoprotein vi - fc fusions protein zur behandlung von gefässerkrankungen - Google Patents

Glycoprotein vi - fc fusions protein zur behandlung von gefässerkrankungen Download PDF

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DE60309865T2
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collagen
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platelets
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Götz Münch
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunoadhesin, umfassend eine spezifische Glykoprotein-VI-Domäne. Das erfindungsgemäße Immunoadhäsin ist erhältlich durch einen spezifischen Prozess, welcher das Immunoadhäsin in der Form eines Dimers bereitstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch auf die Verwendung des Immunoadhäsins von Glykoprotein VI zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention von intraarterieller Thrombose in einer spezifischen Gruppe von Patienten. Zudem betrifft die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des Immunoadhesinsvon Glykoprotein VI zur Herstellung eines Medikaments für die Vorbeugung und Behandlung von Artheroprogression. Die vorliegende Erfindung betrifft auch auf die Verwendung des Immunoadhesins von Glykoprotein VI für die Herstellung eines Medikaments für die Prävention und Behandlung von chronischem Fortschreiten von Atherosklerose in diabetischen Patienten. Die vorliegende Erfindung betrifft auch in-vitro-Screening-Verfahren nach einem Inhibitor von GPVI-vermittelter Adhäsion von Blutplättchen an aktive intravaskuläre Läsionen.
  • Akute Koronar- oder Karotidsyndrome sind eine bedeutende Todesursache in westlichen Gesellschaften. Sogar im Fall eines anfänglichen Überlebens eines solchen kardiovaskulären Ereignisses leiden viele Patienten an lebensbedrohlichen Komplikationen, wie z.B. intravaskulärer Thrombose, welche zu weiterem myokardialen Infarkt oder Schlaganfall führen.
  • Intravaskuläre Thrombose ist das Ergebnis der Aggregation von Blutplättchen in einem Blutgefäß, wobei die Durchblutung des Gefäßes ernsthaft reduziert oder sogar vollständig inhibiert sein kann. Besonders der Bruch einer atherosklerotischen Plaque löst eine Kaskade von Ereignissen aus, welche in arterieller Thrombose und Ischämie des stromabwärts liegenden Gewebes gipfelt, wobei Krankheiten wie myokardialer Infarkt oder ischämischer Schlaganfall herbeigeführt werden. Die erste Antwort auf eine vaskuläre Verletzung ist die Adhäsion von zirkulierenden Blutplättchen an exponierte, subendotheliale Matrixproteine, was nachfolgende Blutplättchen-Aggregation auslöst. Unter den makromolekularen Bausteinen der subendothelialen Schicht wird fibriläres Kollagen als die am meisten thrombogene Komponente angesehen, da es als ein starker Aktivator von Blutplättchen wirkt und die Blutplättchen-Adhäsion sowohl in vitro als auch in vivo unterstützt (1-3).
  • Die Blutplättchen-Membranproteine von denen berichtet wurde, dass sie mutmaßliche Kollagenrezeptoren sind, können unterteilt werden in solche, welche indirekt mit dem Kollagen durch den kollagengebundenen von-Willebrand-Faktor (vWF) interagieren, eingeschlossen GPIbα und das Integrin απbβ3, und jene, welche direkt mit Kollagen interagieren, eingeschlossen GPVI, das Integren α2β1 und CD36 (als Übersicht dargestellt in (2)). Erst kürzlich ist das Blutplättchen-Glykoprotein VI (GPVI) als der wichtigste Blutplättchen-Kollagenrezeptor identifiziert worden (4). GPVI ist ein 60-65 kDa-Typ1-Transmembran-Glykoprotein, welches zu der Immunoglobulin-Superfamilie gehört (5; 6). Bei menschlichen und Maus-Blutplättchen formt GPVI einen Komplex mit der FcRγ-Kette auf der Zelloberfläche (7; 8). Die Bindung eines Liganden an GPVI löst Tyrosinphosphorylierung des ITAM-Motivs der Fc-Rezeptor-γ-Kette aus, was downstream eine Signalgebung durch die Syk-Kinasen, LAT, SLP-76 und Phospholipase C einleitet (9-13). Blutplättchen defizient in GPVI zeigen einen Verlust von kollageninduzierter Adhäsion und Aggregation in vitro (4; 14). Ähnlich schwächen Funktionsblockierende monoklonale anti-GPVI Antikörper die ex vivo Blutplättchen-Aggregation ab, in Antwort auf Kollagen und kollagenbezogenes Peptid CRP, welches die Kollagen-Dreifachhelix nachahmt (15; 16).
  • Es ist bekannt, dass das Problem von Komplikationen aufgrund der Aggregation von Blutplättchen durch Verabreichen von Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation behandelt werden kann. Bei der Behandlung von akuten Koronarsyndromen verbessern GP-IIb/IIIa-Inhibitoren, wie z.B. ReoPro, signifikant das Ergebnis bei den Patienten. Allerdings zeigte eine kürzliche Meta-Analyse klinischer Studien ein signifikantes Restrisiko bezüglich Tod oder myokardialem Infarkt, trotz optimalem antithrombotischen Eingreifen (Boersma E, Harrington RA, Moliterno DJ, White H, Theroux P, Van de Werf F, de Torbal A, Armstron PW, Wallentin LC, Wilcox RG, Simes J, Califf RM, Topol EJ, Simoons ML. Platelet glycoprotein IIb/IIIa inhibitors in acute coronary syndromes: a metaanalysis of all major randomised clinical trials. Lancet 2002; 359:189-98). Spezifische schwere Nebenwirkungen dieser therapeutischen Verabreichungsweise sind Komplikationen durch Blutungen. Diese traten in 2,4 Prozent der Patienten auf, wobei die schwerste Form von intrakranialen Blutungen in fast 0,1 Prozent der behandelten Patienten auftrat. Eine Vielzahl von mechanischen Mängeln der GP-IIb/IIIa-Rezeptorblockierung wurde aufgezeigt, welche die suboptimale Effektivität und die Nebenwirkungen erklären (Dickfeld T, Ruf A, Pogatsa-Murray G, Muller I, Engelmann B, Taubitz W, Fischer J, Meier O, Gawaz M. Differential antiplatelet effects of various glycoprotein IIb/IIIa antagonists. Thromb Res. 2001; 101:53-64. Gawaz M, Neumann FJ, Schomig A. Evaluation of platelet membrane glycoproteins in coronary artery disease: consequences for diagnosis and therapy. Circulation. 1999; 99:E1-E11).
  • Die Inhibierung der Blutplättchen-Aggregation führt zu einer generellen Beeinträchtigung der Blutplättchen im Hinblick auf Ihre Fähigkeit zu aggregieren. Entsprechend wird nicht nur die unerwünschte Thrombosebildung beeinflusst, sondern auch die generelle Fähigkeit der Blutplättchen Blutungen zu stoppen. Daher führt die Verabreichung von Inhibitoren der Blutplättchen-Aggregation inhärent zu schweren Nebenwirkungen wie Blutungen, was weitere lebensbedrohliche Komplikationen verursachen kann. Diese Nebenwirkungen sind natürlich noch viel problematischer bei Patienten, die an Diabetes leiden.
  • Diabetes ist einer der Hauptrisikofaktoren für Atherosklerose. Zusätzlich begründet Diabetes ein erhöhtes Risiko für lebensbedrohliche Komplikationen und ein Übermaß an Erkrankung bei Patienten, welche akute vaskuläre und insbesondere Koronarsyndrome zeigen. Diabetische Patienten mit instabiler Angina zeigen ein verstärktes Auftreten von Plaque-Ulzeration und intrakoronarer Thrombose verglichen mit nicht diabetischen Patienten. (Biondo-Zoccai GGL; Abbate A; Liuzzo G, Biasucci L: Atherothrombosis, inflammation, and diabetes. J Am Coll Cardiol 41; 1071-1077; 2003).
  • Es wird zunehmend erkannt, dass Blutplättchen ein bedeutender Auslöser für die Progression von Atherosklerose sind. Das Bindeglied zwischen gesteigerter Atheroprogression und gesteigerter Blutplättchen-Empfindlichkeit und Diabetes ist bis jetzt ein ungelöstes Problem. Diabetische Patienten leiden an akuten vaskulären Komplikationen unabhängig vom Grad der Atherosklerose, was auf verschiedene, zur Zeit unbekannte Mechanismen für die Blutplättchen-Aktivierung beim Ablauf der diabetischen, akuten, vaskulären Komplikationen und atherosklerotischen, akuten, vaskulären Komplikationen hinweist.
  • Daher ist es das Problem der Erfindung, ein Medikament bereit zu stellen, welches verwendbar ist zur Verhinderung lebensbedrohlicher Komplikationen nach einem akuten Koronar- oder Karotidsyndrom, während die Fähigkeit zur Blutstillung beibehalten wird.
  • Es ist ein weiteres Problem der vorliegenden Erfindung ein Medikament für die Behandlung oder Prävention von Atheroprogression bereitzustellen.
  • Es ist noch ein weiteres Problem der Erfindung ein Medikament für die Behandlung von Diabetes bereitzustellen, in besonderem Maße von Komplikationen assoziiert mit Diabetes.
  • Es ist ein weiteres Problem der Erfindung ein in-vitro-Screeningverfahren nach Inhibitoren der Adhäsion von Blutplättchen an intravaskuläre Läsionen bereitzustellen.
  • ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die obigen Probleme werden gelöst gemäß den Ansprüchen. Die vorliegende Erfindung stellt den ersten direkten in vivo Beweis bereit, welcher zeigt, dass GPVI wirklich in dem Prozess der Blutplättchen-Rekrutierung, unter physiologischem Scherstress nach vaskulärer Verletzung, grundsätzlich benötigt wird. In verschiedenen Mausmodellen mit endothelialer Denudation beseitigten sowohl Inhibierung als auch Abwesenheit von GPVI nahezu die Blutplättchen-Gefäßwand-Interaktionen und Blutplättchen-Aggregation, wodurch GPVI als der bedeutende, bestimmende Faktor der arteriellen Thrombusbildung identifiziert wurde. Dies zeigt, dass die Inhibierung von GPVI-Liganden-Interaktionen die arterielle Thrombose im Rahmen der Atherosklerose verhindert. Die vorliegende Erfindung benutzt das antithrombotische Potential einer spezifischen löslichen Form von GPVI. Besonders wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, welches die extrazelluläre Domäne des GPVI und ein menschliches N-terminales Fc-Kennzeichen („tag") enthält. Die lösliche Form von humanem GPVI bindet spezifisch an Kollagen, mit hoher Affinität und verminderter Blutplättchenadhäsion, an immobilisiertes Kollagen in vitro und an Stellen vaskulärer Verletzung in vivo. Dementsprechend basiert die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, dass die Voraussetzung für intraarterielle Thrombose als eine akute klinische Komplikation die initiale Adhäsion von Blutplättchen an aktive Läsionen in den Gefäßwänden ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben erkannt, dass Blutplättchen-Adhäsion an subendotheliales Matrixkollagen an einer Läsion der Gefäßwand durch den Glykoprotein-IV-(GPVI)-Rezeptor das Schlüsselereignis für die Bildung von Thrombose darstellt. Die Inhibierung der Adhäsion von Blutplättchen an subendotheliales Matrixkollagen des erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist daher fähig nicht nur die Adhäsion von Blutplättchen an aktive Läsionen zu verhindern, sondern auch die Aggregation von Blutplättchen bei den aktiven Läsionen zu verhindern. Daher kann die Bildung von intravaskulärer Thrombose wirkungsvoll verhindert werden, ohne die generelle Fähigkeit der Blutplättchen zur Aggregation zu beeinträchtigen.
  • Angesichts der Tatsache, dass unterschiedliche Komponenten der subendothelialen Schichten Liganden und Aktivatoren von Blutplättchen sind, wie beispielsweise Laminin, Fibronektin, von-Willebrand-Faktor (vWF) und Kollagen, ist es überraschend, dass der komplexe Prozess der Bildung von Thrombose durch die Inhibierung eines einzigen Blutplättchenrezeptors inhibiert werden kann. Zudem war eine umfangreiche Auswahl von Rezeptoren auf den Blutplättchen durch in vitro Prüfungen vorgeschlagen worden, aber der relevante Rezeptor oder die Rezeptorkombinationen, welche die Adhäsion von Blutplättchen an Läsionen in vivo beeinflussen, war zuvor nicht bekannt gewesen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auch auf der Erkenntnis, dass GPVI ein bedeutender Mediator der Blutplättchen-Aktivität für das Fortschreiten von Atherosklerose ist. Es wird gezeigt, dass die Inhibierung der kollagenvermittelten GPVI-Aktivierung die Atheroprogression in Atherosklerose anfälligen Apo-e-/-Mäusen abschwächt (siehe 16). Zudem wird gezeigt, dass die Blutplättchen von diabetischen Patienten, welche auch anfällig für fortgeschrittene Artherosklerose und vermehrte thrombotische Komplikationen sind, eine erhöhte Expression des GPVI-Corezeptors Fc-Rezeptor zeigen. Daher können Blutplättchen von Diabetikern eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Kollagenstimulation zeigen, was zu den klinisch beobachteten, gesteigerten thrombotischen Komplikationen bei instabiler Angina führt, wobei das Kollagen durch Plaquebruch oder endotheliale Denudation nicht von subendothelialen Gefäßschichten bedeckt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher eine Behandlung der Atheroprogression von Patienten bereit, besonders von Patienten, die an Diabetes leiden. Außerdem stellt die Erfindung ein Medikament zur Behandlung von akuten vaskulären Komplikationen bereit, wie zum Beispiel intravaskulärer Thrombose, insbesondere bei Patienten mit Diabetes. In der Erfindung ist ein Immunoadhäsin Fc-GPVI-nt inbegriffen, welches ein starkes therapeutisches Werkzeug zum Abschwächen von Atheroprogression und gesteigerter Empfindlichkeit von Blutplättchen gegenüber Kollagen mittels des GPVI-Rezeptors darstellt. Daher ist Fc-GPVI-nt ein Medikament zur Behandlung von Atherosklerose, insbesondere für die Behandlung von atherosklerotischen Komplikationen bei Diabetes.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Fusionsprotein bereitgestellt, umfassend:
    • a) einen GPVI-Anteil ausgewählt aus einer extrazellulären Domäne von Glycoprotein VI (GPVI) und einer Variante davon, welche funktionsfähig ist an Kollagen zu binden, und
    • b) einen Fc-Anteil ausgewählt aus einer Fc-Domäne eines Immunglobulins und einer funktionsfähigen konservativen Variante davon,
    wobei die extrazelluläre Domäne oder Variante davon und die Fc-Domäne oder Variante davon durch einen Linker fusioniert sind, welcher durch die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg charakterisiert ist.
  • In einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein durch eine Aminosäuresequenz wie in 7 gezeigt charakterisiert. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein wird erhalten oder ist erhältlich durch
    • (a) Sammeln, 2 Tage nach Infektion, des Kulturüberstandes von Helazellen infiziert mit einem Adenovirus für das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierend für eine Aminosäuresequenz wie in 7 gezeigt;
    • (b) Zentrifugieren (3.800 g, 30 min, 4 °C) des Überstandes von Schritt (a);
    • (c) Filtrieren (0,45 μm) des Überstandes von Schritt (b);
    • (d) Präzipitieren des Immunoadhäsins durch Hinzufügen von 1 vol. Ammoniumsulfat (761 g/l) und Rühren über Nacht bei 4 °C;
    • (e) Pelletieren des Proteins durch Zentrifugation (3.000 g, 30 min, 4 °C);
    • (f) Lösen der pelletierten Proteine von Schritt (e) in 0,1 Vol. PBS und Dialysieren in PBS über Nacht bei 4 °C;
    • (g) Klären der Proteinlösung durch Zentrifugation (3.000 g, 30 min, 4 °C);
    • (h) Laden der Lösung aus Schritt (g) auf eine Protein-A-Säule (HiTrapTM-Protein A HP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden);
    • (i) Waschen der Säule mit Bindungspuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0; 0,02 % NaN3) bis OD280 < 0,01;
    • (k) Eluieren der Fraktionen mit Elutionspuffer (100 mM Glycin pH 2,7)
    • (l) Neutralisieren der eluierten Fraktionen mit Neutralisierungspuffer (1 M Tris/HCl pH 9,0; 0,02 % NaN3);
    • (m) Vereinigen der Fraktionen;
    • (n) Dialysieren der vereinigten Fraktionen in PBS über Nacht bei 4 °C,
    • (o) Aliquotieren des dialysierten Produktes und Einfrieren bei –20 °C.
  • Unter den obigen Bedingungen wird das Fusionsprotein als kovalent verbundenes Dimer einer molekularen Masse von 160 kDa, wie unter nicht-reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE gemessen, erhalten. Die Dimerisierung des Fusionsproteins erfolgt vermutlich durch Interketten-Disulfidbrücken von Cysteinen, in einer spezifischen Domäne in der Nähe des GPVI-Fragments der Aminosäuresequenz wie in 7 gezeigt. Die dimere Natur des Fusionsproteins hängt zumindest von der Anwesenheit einer spezifischen Region zwischen dem Fc-Anteil und dem GPVI-Anteil, wie in 7 enthalten, und dem Herstellungsprozess ab. Ein monomeres Fusionsprotein ist als therapeutisches Mittel in der Praxis nicht verwendbar, da die minderwertigen Bindeeigenschaften eines monomeren Fusionsproteins, verglichen mit dem dimeren Fusionsprotein, um einen ähnlichen Effekt zu erhalten, die Verabreichung des Proteins in einer Menge erforderlich machen würden, welche eine Größenordnung größer ist als die Menge des dimeren Fusionsproteins vgl. 9(e). Die Verabreichung von großen Mengen Protein ist allerdings vom therapeutischen und wirtschaftlichen Standpunkt problematisch, insbesondere bei der Behandlung einer chronischen Krankheit.
  • Das erfindungsgemäße Fusionsprotein ist ein Immunoadhäsin. Es weist ein Segment (a) auf, das die Funktion der extrazellulären Domäne von Blutplättchen GPVI besitzt. Dieses GPVI kann ein Säuger-GPVI sein, bevorzugt ist es menschliches GPVI. Diese Funktion ist bevorzugt Binden an den GPVI-Liganden Kollagen. Für dieses Fusionsprotein kann die gesamte extrazelluläre Domäne von GPVI benutzt werden, oder ein beliebiges Fragment davon, vorausgesetzt diese Fragmente sind fähig an Kollagen zu binden. Eine Variante des Fusionsproteins kann eine Modifikation in einer oder mehreren Aminosäuren dieses Fusionsproteins aufweisen (z.B. Glycosylierung, Phosphorylierung, Acetylierung, Disulfidbrückenbildung, Biotinylierung, chromogene Markierung wie Fluoresceinmarkierung etc.). Bevorzugt ist eine Variante ein Homologes dieses Fusionsproteins. Eine konstruierte Variante kann einfach auf ihre Fähigkeit an Kollagen zu binden getestet werden, indem die hierin offenbarten Verfahren benützt werden. Am meisten bevorzugt wird das Polypeptid der Reste 1 bis 269 von SEQ ID NR: l als Segment (a) verwendet. Allerdings kann dieses Polypeptid auch durch Austauschen ausgewählter Aminosäuren modifiziert werden, oder durch Kürzen dieser Sequenz, ohne diese Funktion zu beseitigen.
  • Segment (b) dieses Fusionsproteins dient zumindest einem der folgenden Zwecke: Sekretion des Fusionsproteins von Zellen, die dieses Fusionsprotein erzeugen, wobei Segment (a) in einer Form (z.B. Faltung oder Aggregationszustand) bereitgestellt wird, funktionsfähig Kollagen zu binden, Affinitätsreinigung dieses Fusionsproteins, Erkennung des Fusionsproteins durch einen Antikörper, Bereitstellen günstiger Eigenschaften für das Fusionsprotein, wenn es als Medikament verwendet wird. Überraschend und am wichtigsten ermöglicht Segment (b) die Erzeugung dieses Fusionsproteins in Säuger-, bevorzugt menschlichen, Zellen und die Sekretion in den Zellüberstand in aktiver Form d.h. in einer Form funktionsfähig an Kollagen zu binden. Segment (b) ist am meisten bevorzugt eine Fc-Domäne eines Immunglobulins. Geeignete Immunglobuline sind IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. IgG und IgA sind bevorzugt. IgGs sind am meisten bevorzugt.
  • Diese Fc-Domäne kann eine vollständige Fc-Domäne oder eine funktionskonservative Variante davon sein. Eine Variante von Fc ist funktionskonservativ, wenn sie mindestens eine der oben aufgelisteten Funktionen von Segment (b) bewahrt. Am meisten bevorzugt ist das Polypeptid der Reste 273 bis 504 von SEQ ID NR: 1. Es ist allerdings Allgemeinwissen, dass solch ein Polypeptid modifiziert oder verkürzt werden kann, ohne seine Funktion zu beseitigen.
  • Die Segmente (a) und (b) des erfindungsgemäßen Fusionsproteins können durch einen Linker verbunden sein. Der Linker der Aminosäuresequenz von 7 (SEQ ID NR: 1) ist Gly-Gly-Arg.
  • Am meisten bevorzugt besitzt dieses Fusionsprotein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 1 (hierin Fc-GPVI-nt genannt).
  • Durch einen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäuresequenz bereitgestellt umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
    • a) die Nukleinsäure von 8 oder eine Variante davon, welche für das gleiche Polypeptid kodiert gemäß der Degeneration des genetischen Codes;
    • b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid, welches mindestens 70 % Sequenzhomologie zu dem Polypeptid kodiert durch 8 aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, umfassend von seinem N-Terminus zu seinem C-Terminus eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder einer Variante davon, welche funktionsfähig ist an Kollagen zu binden, einen Linker mit der Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg und eine Immunglobulin-Fc-Domäne oder eine funktionsfähige konservative Variante davon, welche funktionsfähig ist, einem Protein kodiert durch die Nukleinsäure zu ermöglichen, von einer Zelle sekretiert zu werden in einer Form, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden;
    • c) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid von mindestens 300 Aminosäuren und aufweisend, in der 5'- zu 3'-Richtung, ein erstes Segment kodierend für mindestens 100 Aminosäuren umfassend eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder eine Variante davon, welche funktionsfähig ist an Kollagen zu binden, ein zweites Segment, welches für die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg kodiert und ein drittes Segment, welches für mindestens 200 Aminosäuren kodiert, welches funktionsfähig ist als eine Immunglobulin-Fc-Domäne, welche einem Protein kodiert durch die Nukleinsäure ermöglicht, von einer Zelle sekretiert zu werden, in einer Form, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden.
  • Folglich stellt die Erfindung weiterhin eine Nukleinsäuresequenz bereit kodierend für das erfindungsgemäße Fusionsprotein. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
    • (i) die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 2 oder eine Variante davon, welche für das gleiche Polypeptid kodiert, gemäß der Degeneration des genetischen Codes;
    • (ii) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid, welches mindestens 70 % Sequenzhomologie zu dem Polypeptid kodiert durch SEQ ID NR: 2 aufweist;
    • (iii) eine Nukleinsäure kodierend für ein Popypeptid von mindestens 300 Aminosäuren, wobei ein Segment von mindestens 100 Aminosäuren funktionsfähig ist an Kollagen zu binden und ein Segment von mindestens 200 Aminosäuren funktionsfähig ist als eine Fc-Domäne; und
    • (iv) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für das Fusionsprotein von Anspruch 1.
  • Durch einen weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend ein Immunoadhäsin, welches ein homodimeres Fusionsprotein ist, umfassend eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder eine Variante davon, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden, und eine Fc-Domäne eines Immunglobulins oder ein funktionsfähiger konservativer Bestandteil davon, wobei die extrazelluläre Domäne oder Variante davon und die Fc-Domäne oder funktionsfähige konservative Variante davon durch einen Linker fusioniert sind, wobei dieser Linker die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg aufweist.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Medikament für die Prävention oder Behandlung von intraarterieller Thrombose bereit, enthaltend ein Protein, welches die extrazelluläre Domäne von Glycoprotein VI oder einer Variante davon umfasst, welches funktionsfähig ist an Kollagen zu binden. Bevorzugt ist dieses Protein das erfindungsgemäße Protein. Wenn dieses Medikament dieses Fusionsprotein enthält, umfasst dieses Medikament bevorzugt einen geeigneten Carrier. Dieses Medikament wird bevorzugt parenteral verabreicht, stärker bevorzugt wird es intravenös verabreicht.
  • Wie von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden, stellen GPVI-Kollagen-Interaktionen den bedeutendsten Faktor bei der Blutplättchen-Adhäsion an eine verletzte Gefäßwand dar. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann das Binden von Blutplättchen an blutexponiertes Kollagen in einem vaskulären System durch Blockieren dieses blutexponierten Kollagens, ohne Inhibieren anderer Blutplättchenfunktionen, verhindern.
  • In die vorliegende Offenbarung ist ein Medikament für die Gentherapie einbezogen, welches eine Nukleinsäure enthält, die für dieses erfindungsgemäße Fusionsprotein kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält bevorzugt die oben definierte Nukleinsäuresequenz. Die Nukleinsäure ist bevorzugt in einem Vektor enthalten, bevorzugt in einem viralen Vektor. Vektoren kodierend für das Fusionsprotein können in das vaskuläre System eines Patienten eingebracht werden, in dem z.B. Endothelzellen mit ihnen transduziert werden. Geeignete Vektoren für die Gentherapie sind im Stand der Technik bekannt. Sie können basieren z.B. auf Adenoviren, auf Adeno-assoziierte-Viren, auf Retroviren, oder auf Herpes-Simplex-Viren. Vektoren können für langfristige oder für kurzfristige Expressionen des Fusionsproteins durch transduzierte Zellen angepasst werden, wie der Patient es benötigt. Die Fc-Domäne des Fusionsproteins ermöglicht die Sekretion des Fusionsproteins in aktiver Form durch transduzierte Zellen.
  • Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren eines in vitro Screenings nach Inhibitoren des Bindens von Glycoprotein VI an Kollagen bereit, umfassend
    • (i) Bereitstellen einer Oberfläche, welche Kollagen exponiert;
    • (ii) in Kontakt bringen eines Anteils der Oberfläche mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein unter vorherbestimmten Bedingungen, welche die Bindung des Fusionsproteins an die Oberfläche erlauben;
    • (iii) in Kontakt bringen eines anderen Anteils der Oberfläche mit dem Fusionsprotein in Anwesenheit einer Testverbindung unter Bedingungen wie in Schritt (ii);
    • (iv) Bestimmen der Menge des Fusionsproteins, welches an die Oberfläche in der Abwesenheit und in der Anwesenheit der Testverbindung gebunden ist;
    • (v) Identifizieren einer Testverbindung als Inhibitor, falls das Binden des Fusionsproteins an die Oberfläche vermindert ist in der Anwesenheit der Testverbindung verglichen mit der Abwesenheit der Testverbindung; und
    • (vi) gegebenenfalls Bestimmen des funktionalen Effekts des Inhibitors auf Blutplättchen-Aggregation und/oder Blutplättchen-Aktivierung.
  • Die Oberfläche von Schritt (i) kann eine mit Kollagen beschichtete Glas- oder Plastikoberfläche sein. Die Anteile dieser Oberfläche können die Vertiefungen („wells") einer Titerplatte oder einer Multiwellplatte sein. Eine Oberfläche, welche Kollagen exponiert, kann leicht durch Beschichten einer Glas- oder Plastikoberfläche mit Kollagen, wie in den Beispielen beschrieben, hergestellt werden. Kollagenbeschichtete Platten oder Multiwellplatten sind auch im Handel erhältlich. In Schritt (ii) wird eine vorherbestimmte Menge des Fusionsproteins mit einem ersten Anteil der Oberfläche unter Bedingungen, (besonders pH, Puffer, Temperatur) welche Binden des Fusionsproteins an die Oberfläche erlauben, in Kontakt gebracht.
  • Bevorzugt werden Bedingungen gewählt, welche optimales Binden an die Oberfläche ermöglichen. In Schritt (iii) wird ein anderer Anteil der Oberfläche mit der gleichen Menge Fusionsprotein und unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt (ii) in der Anwesenheit einer vorherbestimmten Menge oder Konzentration einer Testverbindungin Kontakt gebracht. Mehr als eine Menge oder Konzentration einer Testverbindung kann verwendet werden. Diese Bestimmung aus Schritt (iv) umfasst bevorzugt Waschen der Oberflächenanteile, in Kontakt gebracht nach Schritten (ii) und (iiii), ein oder mehrerer Male, um ungebundenes Fusionsprotein zu entfernen. Die Menge gebundenen Fusionsproteins kann dann bestimmt werden z.B. durch Messen der Fluoreszenz eines Fluoreszenzmarkers, (z.B. Fluorescein, Rhodamin etc.) welche an dem Fusionsprotein angefügt ist. Alternativ kann gebundenes Fusionsprotein detektiert werden, in dem ein Antikörper gegen das Fusionsprotein verwendet wird, wobei der Antikörper fluoreszenzmarkiert sein kann. Alternativ kann der Antikörper mit einem Enzym (z.B. alkalische Phosphathase, eine Peroxidase, Luciferase) welches in der Lage ist, ein farbiges oder lumineszentes Reaktionsprodukt zu erzeugen, markiert werden. Am geeignetsten kann das Fusionsprotein mit einer chromogenen Markierung markiert werden, so dass die Markierung ihre Lichtabsorptions- oder Lichtemissionscharakteristiken bei Binden an Kollagen wechselt. In dieser Ausführungsform ist das Abwaschen von ungebundenem Fusionsprotein nicht notwendig.
  • In Schritt (v) können Inhibitoren identifiziert werden. Identifizierte Inhibitoren oder ausgewählte Teile davon können als Leitstrukturen für die Verbesserung des Inhibitors benutzt werden. Solche Leitstrukturen können unter Verwendung chemischer Methoden modifiziert werden und die modifizierten Strukturen können wieder mit diesem Screeeningverfahren getestet werden. Modifizierte Strukturen oder Testverbindungen mit gesteigerten Inhibitionseigenschaften können ausgewählt werden und gegebenenfalls durch chemische Verfahren weiter variiert werden. Auf diese Weise kann eine schrittweise Verbesserung eines Inhibitors erreicht werden. Die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Screeningverfahren identifizierten Inhibitoren sind als mögliche Arzneimittel gegen Thrombose und Arteriosklerose nützlich.
  • In Schritt (vi) kann der funktionale Effekt dieses Inhibitors auf die Blutplättchen-Aggregation oder Blutplättchen-Aktivierung nach den unten beschriebenen Verfahren, z.B. durch intravitale Fluoreszenz-Mikroskopie bestimmt werden. Dieses Screeningverfahren kann im kleinen, mittleren oder großen Maßstab durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl an Testverbindungen, welche getestet werden sollen. Falls viele Testverbindungen getestet werden sollen, (z.B. Bibliotheken chemischer Verbindungen) wird das Screeningverfahren bevorzugt in der Form von High-Throughput Screening (HTS) durchgeführt. Bei HTS wird die Menge an gebundenem Fusionsprotein, bevorzugt durch Benutzen fluoreszenzmarkierten Fusionsproteins, detektiert.
  • Das obige Screeningverfahren kann auch für ein Screening nach Antikörpern, welche das Binden von GPVI an Kollagen inhibieren, insbesondere nach Antikörpern gegen die extrazelluläre Domäne von GPVI angepasst werden. Solch ein Antikörperscreening kann kombiniert werden mit z.B. der Hybridomatechnologie zur Generierung von monoklonalen Antikörpern oder jeder anderen Antikörpergenerierungstechnik, wobei das erfindungsgemäße Fusionsprotein bevorzugt als Antigen verwendet wird. Antikörper in Hybridomazellüberständen können als diese Testverbindungen verwendet werden.
  • Ein Antikörper gegen GPVI kann für die Herstellung eines Medikamentes für die Prävention von Blutplättchen-Adhäsion an exponiertes, subendotheliales Matrix-Kollagen in aktiven, artherosklerotischen Läsionen als initialer Auslöser für akute Koronar- oder Karotidsyndrome verwendet werden. Solche Indikationen können wie unten beschrieben diagnostiziert werden. Bevorzugt ist der Patient weiterhin charakterisiert durch ein Leiden an instabiler atherosklerotischer Plaque. Dieses Medikament wird bevorzugt parenteral verabreicht. Bevorzugt sind diese Antikörper monoklonale Antikörper. Solche Antikörper können z.B. hergestellt werden, indem das erfindungsgemäße Fusionsprotein als Immunogen verwendet wird.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers aus einem nicht-menschlichen Säuger bereit, umfassend das Verwenden eines erfindungsgemäßen homodimeren Fusionsproteins als ein Immunogen.
  • Weiterhin stellt die Erfindung ein Verfahren eines in vitro Screenings nach einem Inhibitor der GPVI vermittelten Adhäsion von Blutplättchen an aktive intravaskuläre Läsionen bereit, wobei dieses Verfahren die Schritte umfasst
    • (i) Bereitstellten einer Oberfläche, welche Kollagen exponiert:
    • (ii) in Kontakt bringen der Oberfläche mit Blutplättchen unter vorherbestimmten Bedingungen, welche eine Adhäsion der Blutplättchen an das Kollagen erlauben;
    • (iii) Messen der Blutplättchen-Adhäsion in Anwesenheit einer Testverbindung; und
    • (iv) Identifizieren der Testverbindung als ein Inhibitor von GPVI, wenn die Adhäsion von Blutplättchen an Kollagen vermindert ist in der Anwesenheit der Testverbindung verglichen mit der Abwesenheit der Testverbindung; und
    • (v) gegebenenfalls Bestimmen des funktionalen Effekts dieses Inhibitors auf Blutplättchenaggregation und/oder Blutplättchenaktivierung.
  • Die Blutplättchen, die in diesem Verfahren verwendet werden sollen, können nach bekannten Arbeitsverfahren isoliert werden (vgl. Beispiel 7). Sie können aus Blut von Säugern wie Mäusen, Ratten, Hasen, Schweinen etc. isoliert werden. Bevorzugt werden sie aus Menschen isoliert. Diese Blutplättchen können markiert werden z.B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie Fluorescein. Die Adhäsion von Blutplättchen an diese Oberfläche kann wie in den Beispielen beschrieben gemessen werden. Die Testverbindungen für dieses Verfahren können kleine organische Moleküle sein. Bevorzugt sind die Testverbindungen für dieses Verfahren Inhibitoren, welche in dem oben beschriebenen Screeningverfahren für Inhibitoren des Bindens von GPVI an Kollagen identifiziert worden sind. Auf diese Weise kann die Anzahl von Verbindungen, die unter Verwendung von Blutplättchen gescreent werden sollen, signifikant reduziert werden und die Wahrscheinlichkeit des Findens von Inhibitoren, welche mit Blutplättchen funktionsfähig sind, kann gesteigert werden.
  • Das erfindungsgemäße Fusionsprotein, welches für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von diabetischen Patienten, wie später in diesem Absatz beschrieben, verwendet wird, ist bevorzugt ein dimeres Fusionsprotein. Um die Möglichkeit einer Dimerisierung bereitzustellen, muss eine Scharnierregion zwischen den Domänen (a) und (b) des Fusionsproteins vorhanden sein. Die Scharnierregion wird benötigt zum Einräumen einer geeigneten Orientierung der Polypeptidketten und zur Ausbildung von Interketten-Disulfidbrücken. Entsprechend muss die Scharnierregion eine ausreichende Länge besitzen und muss Cysteinreste enthalten, bevorzugt mindestens zwei Cysteinreste. Bevorzugt umfasst das Fusionsprotein Reste 1 bis 267 von SEQ ID NR: 1. Das Fusionsprotein wird benutzt für die Behandlung von akuten Komplikationen bei Diabetes oder für die Behandlung von chronischem Fortschreiten von Artherosklerose bei diabetischen Patienten. Bevorzugt ist das Fusionsprotein Fc-GPVI-nt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins bereit, welches die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Sammeln des Kulturüberstandes, 2 Tage nach Infektion, von Helazellen, infiziert mit einem Adenovirus für die Nukleinsäure kodierend für eine Aminosäuresequenz wie in 7 gezeigt;
    • (b) Zentrifugieren (3.800 g, 30 min, 4 °C) des Überstandes aus Schritt (a);
    • (c) Filtrieren (0,45μm) des Überstandes von Schritt (b);
    • (d) Präzipitieren des Immunoadhäsins durch Hinzufügen von 1 Vol. Ammoniumsulfat (761 g/l) und Rühren über Nacht bei 4 °C;
    • (e) Pelletieren der Proteine durch Zentrifugation (3.000 g, 30 min, 4 °C),
    • (f) Lösen der pelletierten Proteine von Schritt (e) in 0,1 Vol. PBS und Dialysieren in PBS über Nacht bei 4 °C;
    • (g) Klären der Proteinlösung durch Zentrifugation (3.000 g, 30 min, 4 °C);
    • (h) Laden der Lösung aus Schritt (g) auf eine Protein-A-Säule (HiTrapTM-Protein A HP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden);
    • (i) Waschen der Säule mit Bindungspuffer (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0; 0,02 % NaN3) bis OD280 < 0,01;
    • (k) Eluieren der Fraktionen mit Elutionspuffer (100 mM Glycin pH 2,7);
    • (l) Neutralisieren der eluierten Fraktionen mit Neutralisierungspuffer (1 M Tris/HCl pH 9,0; 0,02 % NaN3);
    • (m) Vereinigen der Fraktionen;
    • (n) Dialysieren der vereinigten Fraktionen in PBS über Nacht bei 4 °C,
    • (o) Aliquotieren des dialysierten Produktes und Einfrieren bei –20 °C.
  • BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation anschließend an eine vaskuläre Verletzung der Arteria Carotis Communis in C57BL6/J-Mäusen in vivo.
    • (a) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Karotidarterien vor (linke Bilder) und 2 Stunden nach (rechte Bilder) vaskulärer Verletzung. Endotheliale Denudation löst Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation aus, was die Bildung eines blutplättchenreichen Thrombus (unten links) zur Folge hat.
    • (b) Blutplättchen-endotheliale Zellinteraktionen 5 min nach vaskulärer Verletzung wurden untersucht durch in vivo Fluoreszenzmikroskopie der Arteria Carotis Communis in situ (schwarze Säulen). Tiere ohne vaskuläre Verletzung dienten als Kontrollen (nicht ausgefüllte Säulen). Die linken und rechten Bilder fassen jeweils transiente und stabile Blutplättchen-Adhäsion von acht Experimenten pro Gruppe zusammen. Blutplättchen wurden klassifiziert nach ihrer Interaktion mit der endothelialen Zellauskleidung wie beschrieben24 und sind per mm2 der Blutgefäßoberfläche angegeben. Mittelwert ± s.e.m., ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit der Kontrolle, P < 0,05.
    • (c) Blutplättchen-Aggregation anschließend an eine vaskuläre Verletzung wurde bestimmt durch Fluoreszenzmikroskopie in vivo (schwarze Säulen). Tiere ohne vaskuläre Verletzung dienten als Kontrollen (nicht ausgefüllte Säulen). Mittelwerte ± s.e.m., n = 8 jede Gruppe, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit Wildtypmäusen, P < 0,05. Die Mikrophotographien (rechts) zeigen charakteristische in vivo Fluoreszenzmikroskopiebilder bei Kontrolltieren (oberes Bild) oder anschließend an vaskuläre Verletzung (unteres Bild). Weiße Pfeile zeigen adherierte Blutplättchen an.
  • 2 Die Inhibierung von GPVI hebt die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation nach vaskulärer Verletzung auf. (a) Blutplättchen-Adhäsion nach vaskulärer Verletzung wurde bestimmt durch intravitale Videofluoreszenzmikroskopie. Fluoreszente Blutplättchen wurden vorinkubiert mit 50 μg/ml anti-GPVI (JAQ1) Fab-Fragmenten oder Kontroll-Ratten IgG. Blutplättchen ohne mAb-Vorinkubation dienten als Kontrolle. Die linken und rechten Spalten fassen jeweils transiente und stabile Blutplättchen-Adhäsionen zusammen. Mittelwerte ± s.e.m., n = 8 jede Gruppe, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05. (b) stellt den Prozentsatz an Blutplättchen dar, welcher eine irreversible Adhäsion nach initialem Tethering/langsamer Oberflächen-Translokation begründet. (c) Blutplättchen-Aggregation nach vaskulärer Verletzung in vivo. Die Aggregation von Blutplättchen, welche mit Tyrods, nicht-relevantem („irrelevant") Ratten IgG oder anti-GPVI Fab (JAQ1) vorinkubiert worden waren, wurde wie beschrieben durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Mittelwer ± s.e.m., n = 8 jede Gruppe, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied im Vergleich zur Kontrolle, P < 0,05. (d) die Mikrofotografien zeigen charakteristische in vivo Fluoreszenzmikroskopiebilder, welche Blutplättchen-Adhäsion in der Anwesenheit oder Abwesenheit von anti-GPVI-Fab (JAQ1) oder Kontroll-IgG darstellen.
  • 3 Blutplättchen-Adhäsion anschließend an endotheliale Denudation in GPVI-defizienten Mäusen. (a) JAQ1-behandelten Mäusen fehlt GPVI. Obere Spalten: Blutplättchen von Mäusen vorbehandelt mit nicht-relevantem Kontroll-IgG (links) oder anti-GPVI (JAQ1) (rechts) wurden für 10 min bei Raumtemperatur mit FITC-markiertem JAQ1 und PE-markiertem anti-Maus-CD41 inkubiert und direkt auf einem FACScanTM analysiert. Ein charakteristischer Dotblot von 3 Mäusen pro Gruppe ist dargestellt. Unteres Bild: gesamte Blutplättchenlysate aus drei Kontroll IgG- oder JAQ1-behandelten Mäusen wurden unter nicht-reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit FITC-markiertem JAQ1 immungeblottet, gefolgt von einer Inkubation mit HRP-markiertem Hasen-anti-FITC-mAb. (b) Rasterelektronenmikrophotographien von Karotidarterien 2 Stunden nach vaskulärer Verletzung in Kontrolltieren (obere Bilder) oder GPVI-verminderten Mäuse (untere Bilder). Endotheliale Denudation induzierte Blutplättchen-Adhäsion und Blutplättchen-Aggregation in Kontrolltieren. Dagegen hefteten sich nur sehr wenige Blutplättchen entlang der beschädigten Gefäßwand in GPVI-verminderten Mäusen an. Subendotheliale Kollagenfasern sind sichtbar entlang der denudierten Zone. (c) Blutplättchen-Tethering und stabile Blutplättchen-Adhäsion, (d) Übergang vom initialen Tethering zur stabilen Haftung (Prozentsatz an getetherten Blutplättchen) und (e) Blutplättchen-Aggregation anschließend an vaskuläre Verletzung der Arteria Carotis wurde in GPVI-defizienten Mäusen (JAQI-vorbehandelten Mäusen) oder Kontroll-IgG-vorbehandelten Mäusen bestimmt (für Einzelheiten siehe Materialien und Methoden). Die Spalten fassen die Blutplättchen-Adhäsion (transient und stabil) und Blutplättchen-Aggregation in acht Experimenten pro Gruppe zusammen. Mittelwerte ± s.e.m.. Ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit Kontroll-IgG, P < 0,05. (f) Die Mikrofotografien zeigen charakteristische in vivo Fluoreszenzmikroskopiebilder, welche Blutplättchen-Adhäsion in GPVI-defizienten (JAQ1) und Kontroll-IgG-behandelten Mäusen zeigen.
  • 4 Blutplättchen-Adhäsion an die Oberfläche von kollagenbeschichteten Glasdeckgläsern wurde unter physiologischen Flussbedingungen ex vivo berechnet. Linke Spalte: Blutplättchen von Mäusen vorbehandelt mit nicht-relevantem Kontroll-IgG-Immunoadhäsin (Kontrolle) (links) oder anti-GPVI-Immunoadhäsin (Fc-GPVI-nt) (rechts) wurden unter physiologischen Flussbedingungen auf Adhäsion untersucht. Die Anzahl von Blutplättchen wurde bestimmt durch FACS-Zählen der gewaschenen Deckgläser am Ende jedes Experiments. Blutplättchen-Tethering als der erste Schritt der Blutplättchenadhäsion wurde nach 30 Sekunden und stabile Blutplättchen-Adhäsion nach 5 min unter Flussbedingungen beurteilt (für Einzelheiten siehe Beispiel 6). Die Spalten fassen transiente und stabile Blutplättchen-Adhäsion in acht Experimenten pro Gruppe zusammen. Mittelwerte ± s.e.m., ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit Kontroll-IgG, P < 0,05.
  • 5 Die Interaktion von Fc-GPVI-nt mit Kollagen wurde durch einen ELISA-basierten Assay überwacht. Die Adhäsion des Immunoadhäsins Fc-GPVI-nt bestehend aus der extrazellulären Domäne von GPVI und dem Fc-Anteil von IgG an kollagenbeschichteten Platten mit steigenden Konzentrationen von Fc-GPVI-nt (0,5 μg bis 10 μg) wurde ermittelt. Die Bindung wird sichtbar gemacht durch einen zweiten mit Peroxidase markierten Antikörper gerichtet auf den Fc-Teil von Fc-GPVI-nt. Peroxidase wird schließlich durch ELISA detektiert. In diesem charakteristischen Experiment wurde das Binden von Fc-GPVI-nt an Kollagen mit ausreichender Affinität überwacht, welches Sättigung bei μg-Konzentrationen erreichte.
  • 6 Die Interaktion des Fc-GPVI-nt mit Kollagen und die Möglichkeit nach GPVI-Inhibitoren zu screenen wurde dargelegt mit dem inhibitorischen anti-Maus-GPVI Antikörper JAQ 1. Es wird gezeigt, dass die Adhäsion des Immunoadhäsins Fc-GPVI-nt (2 μg/Vertiefung) an kollagenbeschichtete ELISA-Platten spezifisch ist: das leere Immunoadhäsin Fc-nt zeigte kein Binden. Daher stellt dies einen ELISA-basierten Assay für das Screenen nach GPVI-Inhibitoren, mit dem Potential zu high-throughput Durchsatz entwickelt zu werden, bereit.
  • 7 Aminosäuresequenz von Fc-GPVI-nt: SEQ ID NR: 1.
  • 8 DNA-Sequenz des Immunoadhäsins Fc-GPVI-nt: SEQ ID NR: 2. Basen 1 bis 807 kodieren für die extrazelluläre Domäne von GPVI. Basen 817 bis 1515 kodieren für den Fc-Teil des IgGs.
  • 9 Charakterisierung von GPVI-Fc. (a) oberes Bild: Fc-GPVI-nt und Kontroll-Fc mit fehlender extrazellulärer GPVI-Domäne wurden für SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen benutzt. Coomassie-blue-Färbung (links) und Immunoblotting mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-menschlichen Fc-Antikörper (rechts) identifizierten Fc-GPVI-nt mit einer molekularen Masse von ~80 kDa. Mittleres Bild: Immunoblotting von Fc, Fc-GPVI-nt oder menschlichen Blutplättchen unter Benutzen des monoklonalen anti-GPVI- Antikörpers SC4. SC4 detektierte beide, adenoviral expremiertes Fc-GPVI-nt-Fusionsprotein und Blutplättchen-GPVI, aber nicht den Kontroll-Fc. Unteres Bild: molekulare Masse unter reduzierenden (rechts) und nicht-reduzierenden (links) Bedingungen. Während die molekulare Masse von Fc-GPVI-nt unter reduzierenden Bedingungen ungefähr 80 kDa war, wurde das gesamte nt mit 160 kDa unter nichtreduzierenden Bedingungen identifiziert. (b-d) Charakterisierung von Fc-GPVI-nt-Kollagen-Interaktionen. (b) Bindungsassays, welche unterschiedliche Konzentrationen von löslichem Fc-GPVI-nt und immobilisiertem Kollagen (10 μg/ml) verwenden, wurden durchgeführt, um Fc-GPVI-nt-Kollagen-Interaktionen zu definieren. Gebundenes Fc-GPVI-nt wurde durch einen anti-Fc-mAb-Antikörper (Verdünnung 1:10.000) detektiert und ist in Relation zu der bei 10 μg/ml Fc-GPVI-nt beobachteten Bindung angegeben. Fc-GPVI-nt bindet an Kollagen in einer saturierenden Art und Weise. Mittelwert ± s.e.m., n = 6 bei jeder Fc-GPVI-nt-Konzentration, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen zu 0 μg/ml Fc-GPVI-nt, P < 0,05 (c, linkes Bild) zeigt Binden von Fc-GPVI-nt (20 μg/ml) an verschiedene Substrate. Binden von Fc-GPVI-nt an BSA (10 μg/ml) oder vWF (10 μg/ml) ist angegeben als Prozentsatz von GPVI-Dimer-Binden an immobilisiertes Kollagen. Binden von Fc-GPVI-nt erfolgte nicht an BSA oder vWF, was die Spezifität des Fc-GPVI-nt-Bindens belegt. Mittelwerte ± s.e.m., ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit Kollagen, P < 0,05. ((rechtes Bild) stellte Binden von Fc-GPVI-nt (20 μg/ml) oder Fc (20 μg/ml) an immobilisiertes Kollagen (10 μg/ml) dar. Gebundenes Fc-GPVI-nt oder Fc wurde durch anti-Fc-mAb-Antikörper (Verdünnung 1:10.000) detektiert und wurde im Verhältnis zu dem Binden beobachtet mit Fc-GPVI-nt angegeben. Nur Fc-GPVI-nt aber nicht Fc oder anti-Fc-mAb bindet an immobilisiertes Kollagen, Mittelwert ± s.e.m., n = 8 bei jeder Gruppe, ein Stern bezeichnet einen signifikante Unterschied verglichen mit Fc-GPVI-nt-Binden, P < 0,05. (d) Fc-GPVI-nt (20 μg/ml) wurde für 10 min mit unterschiedlichen Konzentrationen an löslichem Kollagen vorinkubiert. Nach Inkubation wurden die Platten gewaschen und Fc-GPVI-nt-Binden wurde durch Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-menschlichen IgG-Antikörper (Verdünnung 1:10.000) detektiert. Fc-GPVI-nt-Binden ist angegeben relativ zum Binden beobachtet in der Abwesenheit von löslichem Kollagen. Lösliches Kollagen inhibiert GPVI-Fc-Dimer-Dimer-Binden an immobilisiertes Kollagen in einer dosisabhängigen Art und Weise. Mittelwert ± s.e.m., n = 3 bei jeder Kollagenkonzentration, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit 0 μg/ml Kollagen, P < 0,05. (e) Der Unterschied der Bindungsaffinität zwischen der monomeren Form des GPVI-Fc- Fusionsproteins und Fc-GPVI-nt wurde in direktem Vergleich beurteilt. Das Binden des Monomers und Dimers wurde beurteilt auf Kollagentyp 1 beschichteten ELISA-Platten. Steigende Konzentrationen von GPVI-Fusionsproteinen banden an Kollagen in einer saturierenden Art und Weise. Hier ist ein Lineweaver Burke Plot zur Affinitätsbestimmung gezeigt (e). Die Affinität des monomeren GPVI-Fusionsproteins war ungefähr 10-fach geringer verglichen mit äquimolaren Konzentrationen der dimeren Fc-GPVI-nt-Form.
  • 10 Fc-GPVI-nt inhibiert CD 62 P-Aktivierung auf humanen Blutplättchen als einen Parameter für die Freisetzung von intrazellulären Transmittersubstanzen aus alpha-Granula durch ansteigende Dosen von Kollagen. Menschliche Blutplättchen wurden aus Gesamtblut isoliert und wurden mit PE-markierten anti-CD 62-Antikörpern inkubiert, (für Einzelheiten siehe Material und Methoden). Fluoreszenz wurde in einem Becton Dickenson FACS-Gerät bestimmt. Gezeigt sind charakteristische Histogramme. Ansteigende Kollagenkonzentrationen von 0 bis 10 μg/ml induzierten eine Verschiebung der Fluoreszenz in Anwesenheit des Kontroll-Fc-Proteins (100 μg/ml; blaue Linie). In Anwesenheit von Fc-GPVI-nt (100 μg/ml; rote Linie) war die Verschiebung der Fluoreszenz und damit CD 62 P-Aktivierung merklich inhibiert.
  • 11 Spezifische Inhibition von Kollagen-vermittelter Blutplättchen-Aggregation und Freisetzung von endogenen Transmittern aus dichten und alpha-Granula durch Fc-GPVI-nt. (a) Menschliche Blutplättchen wurden mit Kontroll-Fc (80 μg/ml) oder Fc-GPVI-nt (80 μg/ml) inkubiert. Aggregation von Blutplättchen wurde mit Kollagen (1 μg/ml) oder ADP (5 μM) oder TRAP (10 μM) induziert und die Aggregation wurde in einem Aggregometer unter rührenden Bedingungen bestimmt (für Einzelheiten siehe Material und Methoden). Dreifachmessungen von n = 5 unterschiedlichen Blutspendern wurden durchgeführt. Die Mittelwerte ± s.e.m. sind in % Aggregation der Kontrollaggregation ohne Fusionsproteine angegeben. (b) ATP-Freisetzung wurde gleichzeitig in den gleichen Proben nach Inkubation mit Kontroll-Fc (80 μg/ml) oder Fc-GPVI-nt (80 μg/ml) gemessen. Die Menge an ATP Freisetzung ist in % der Kontrollen ohne Fusionsprotein angegeben (c) PDGF-Freisetzung wurde in menschlichen Blutplättchen mit einem ELISA-System spezifisch für menschliches PDGF unter basalen Bedingungen und nach Kollagen- (20 μg/ml) -Stimulation bestimmt (Einzelheiten siehe Material und Methoden). Präinkubation mit Kontroll-Fc hatte keinen signifikanten Effekt auf die PDGF-Freisetzung von Kollagen-stimulierten Blutplättchen, wohingegen Fc-GPVI-nt (100 μg/ml) die PDGF-Freisetzung signifikant reduzierte. Die Inhibition der PDGF-Freisetzung trat nicht bei unstimulierten Blutplättchen auf.
  • 12 Fc-GPVI-nt hat keinen signifikanten Effekt auf die Blutungszeit in menschlichem Blut ex vivo. Die Blutungszeit bei menschlichem Blut wurde ex vivo gemessen nach ADP/Kollagenstimulation und Epinephrin-/Kollagen-Stimulation, in einem PFA-100-Gerät. Fc-GPVI-nt (5 und 20 μg/ml) und Fc (5 und 20 μg/ml) verlängerten die Blutungszeit nicht, wohingegen ReoProR in einer therapeutisch relevanten Konzentration (5 μg/ml) unter beiden Bedingungen die Blutungszeit maximal verlängerte. Die Mittelwerte ± s.e.m. von n = 4 Blutspendern mit Dreifachmessungen sind zusammengefasst.
  • 13 Fc-GPVI-nt inhibiert die Blutplättchen-Adhäsion an immobilisiertes Kollagen unter Flussbedingungen. Menschliche Blutplättchen (2 × 108 Zellen/ml) wurden aus Gesamtblut isoliert (für Einzelheiten siehe „Materialien und Methoden"). Platten waren mit immobilisiertem Kollagen (10 μg/ml) oder vWF (10 μg/ml) beschichtet. Blutplättchen-Adhäsion an die beschichteten Platten wurde in einer Parallelplatten-Flusskammer in Anwesenheit von Fc-GPVI-nt oder von Fc, welchem die extrazelluläre GPVI-Domäne fehlte (200 μg/ml), bestimmt. Die Inhibition der Blutplättchen-Adhäsion durch Fc-GPVI-nt ist in % der Kontrolle (Fc-Kontrolle) angegeben. Fc-GPVI-nt schwächte die Blutplättchen-Adhäsion an immobilisiertes Kollagen bei Scherraten von 500 sec–1 und 1.000 sec–1 jeweils signifikant ab. Im Gegensatz dazu beeinflusste Fc-GPVI-nt die Blutplättchen-Adhäsion an immobilisiertem vWF nicht. Mittelwert ± s.e.m., n = 4 bei jeder Gruppe, ein Sternchen bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit Kontroll-Fc, P < 0,05. Die untere Bilder zeigen charakteristische Mikroskopbilder.
  • 14 Fc-GPVI-nt weist günstige Pharmakokinetiken mit einer verlängerten Plasma-Halbwertszeit nach intraperitonealer Injektion in Mäusen in vivo auf. Blutkonzentrationen von Fc-GPVI-nt wurden mit spezifischen anti-Fc-Antikörpern und ELISA bestimmt (für Einzelheiten siehe bitte „Material und Methoden"). (a) Eine einzelne intraperitoneale Injektion von Fc-GPVI-nt (4 μg/g) führte zu rapiden Höchstwerten an Blutkonzentrationen von Fc-GPVI-nt nach ~ 24 h mit langsamer Abnahme von Fc-GPVI-nt Blutkonzentrationen. Die Mittelwert ± s.e.m. von 10 Tieren sind gezeigt. (b) Wiederholte intraperitoneale Verabreichungen (10 μg/g; zweimal wöchentlich) führt zu kontinuierlicher Akkumulierung von Fc-GPVI-nt in Mäusen in vivo über 28 Tage. Die Mittelwerte ± s.e.m. von 6 Tieren sind gezeigt. (c) Eine einzelne intravenöse Dosis-Injektion von 30 μg Fc-GPVI-nt (1 μg/g Körpergewicht), 60 μg (2 μg/g Körpergewicht) und 100 μg Fc-GPVI-nt (3 μg/g Körpergewicht) pro Maus führte zu einem dosisabhängigen Anstieg der Immunoadhesin-Plasmakonzentration. Die Plasmakonzentration bei den zwei höheren Dosen in diesen Mäusen in vivo erreichte verlängerte, erhöhte Spiegel von 5 bis 60 Minuten und nach 24 Stunden, ausreichend für ein wirkungsvolles Kollagen-„Scavenging" und daher wirkungsvolle Inhibition von GPVI-Rezeptor-Aktivation auf Blutplättchen. Die Mittelwerte ± s.e.m. von 5 Tieren sind gezeigt.
  • 15 Effekte von Fc-GPVI-nt auf die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation in vivo. (a) Mäuse (n = 6 pro Gruppe) wurden mit 2 mg/kg oder 4 mg/kg Fc-GPVI-nt iv behandelt. Integrilin-(0,2 mg/kg)-behandelte Mäuse dienten als Positivkontrollen (n = 8). Die Blutungszeiten wurden bestimmt wie beschrieben (siehe „Materialien und Methoden"). Das Fc-GPVI-nt Fusionsprotein steigerte die Schwanzblutungszeiten nicht, verglichen mit den Kontrolltieren. Bei Integrilin-behandelten Mäusen waren die Schwanzblutungszeiten massiv verlängert. **P < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle. (6) Die Inhibierung von GPVI hebt die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation nach vaskulärer Verletzung auf. Die Blutplättchen-Adhäsion nach vaskulärer Verletzung wurde bestimmt durch intravitale Videofluoreszenzmikroskopie. Mäuse wurden mit 1 oder 2 mg/kg Fc-GPVI-nt oder äquimolaren Mengen von Kontroll-Fc vorbehandelt. Die linken und rechten Spalten fassen Blutplättchen-Tethering bzw. stabile Blutplättchen-Adhäsion zusammen. Mittelwert ± s.e.m., n = 5 für jede Gruppe, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen mit Fc, P < 0,05. (c) Effekte von Fc-GPVI-nt auf die Thrombusbildung nach vaskulärer Verletzung in vivo. Die Anzahl von Blutplättchen-Thromben (rechts) und des gesamten Thrombusbereichs (links) wurden wie beschrieben durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Mittelwerte ± s.e.m., n = 5 bei jeder Gruppe, ein Stern bezeichnet einen signifikanten Unterschied verglichen zu Fc, P < 0,05. (d) Die Mikrophotographien zeigen charakteristische in vivo Fluoreszenzmikroskopiebilder, welche die Blutplättchen-Adhäsion in der Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 oder 2 mg/kg Fc-GPVI-nt oder Kontroll-Fc darstellen. Balken bedeuten 50 μm. (e) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Carotis-Arterien 1 h nach vaskulärer Verletzung bei Fc- oder Fc-GPVI-nt-behandelten Tieren. Endotheliale Denudation induzierte Blutplättchen-Adhäsion und Blutplättchen-Aggregation in Fc-behandelten Mäusen. Im Gegensatz dazu hefteten sich nur sehr wenige Blutplättchen entlang der beschädigten Gefäßwand in Fc-GPVI-nt-behandelten Mäusen an. Subendotheliale Kollagenfasern sind sichtbar entlang des denudierten Bereichs. Balken stellen 10 μm dar. (n Fc-GPVI-nt bindet spezifisch an das Subendothel von Carotis-Artieren. Das Binden von Fc-GPVI-nt an das Subendothel wurde an Carotidabschnitten bestimmt, gefärbt mit Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-menschlichen IgG-Antikörper. Karotidarterien erhalten von Fc-behandelten Mäusen dienten als Kontrollen. Fc-GPVI-nt aber nicht Fc-Kontrollprotein wurde am Subendothel detektiert, wie durch die braune Färbung gezeigt. Originalvergrößerung: 100-fach.
  • 16 Fc-GPVI-nt schwächte die Atheroprogression in apo e-/-knockout-Mäusen in vivo signifikant ab. Apo e-/-Mäuse wurden mit Fc-GPVI-nt (4 μg/g) oder Kontroll-Fc (4 μg/g) intraperitoneal für 4 Wochen zweimal wöchentlich behandelt. Atheroprogression wurde post mortem nach Sudanrotfärbung der großen Blutgefäße, um Atherom- und Plaquebildung sichtbar zu machen, untersucht. In Kontrolltieren wurde erhebliche Plaquebildung von Karotidarterien-Präparationen angezeigt durch die rote Farbe, insbesondere in der Verzweigungsregion. In Fc-GPVI-nt-behandelten Tieren war die Artherosklerose in Karotidarterien von apo e-/-Mäusen fast komplett aufgehoben. Gezeigt sind charakteristische, makroskopische ganzvaskuläre Präparationen der Karotidarterien einer apo e-/-Maus nach 4 Wochen Behandlung mit Fc-GPVI-nt (linke Seite) und einer apo e-/-Maus nach 4 Wochen Behandlung mit Kontroll-Fc-Proteinen (rechte Seite).
  • 17 Frisch isolierte Blutplättchen von Patienten, welche an Diabetes Mellitus leiden, zeigen eine reduzierte Expression des Fibrinogenrezeptors (CD61, oben) und eine gesteigerte Expression des Fc-Rezeptors (CD32, mitte) und daher eine gesteigerte Expression von GPVI. Die Korrelation zwischen CD32-Expression und GPVI-Expression (detektiert durch den spezifischen monoklonalen Antikörper 4C9) ist bei menschlichen Blutplättchen gezeigt (unten). Menschliche Blutplättchen wurden aus Gesamtblut von Patienten, welche an Diabetes litten, isoliert, und mit fluoreszenten anti-CD61 und anti-CD32 Antikörpern oder FITC-markierten 4C9 Antikörpern inkubiert. Fluoreszenz wurde in einem Becton Dickenson FACScalibur-Gerät bestimmt. Die Mittelwerte ± s.e.m., n = 111 diabetischen Patienten und von n = 363 Patienten ohne Diabetes sind zusammengefasst. Die Korrelation von CD32-Fluoreszenz und 4C9-Fluoreszenz wurde mit dem Korrelationskoeffizienten r = 0,516 kalkuliert.
  • 18 Aminosäuresequenz eines monomeren Fusionsproteins basierend auf Fc-GPVI-nt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Eine frühere Hypothese deutete an, dass Blutplättchenglycoprotein (GP) Ib-Binden an den von vWF die strömenden Blutplättchen an die verletzte Gefäßwand rekrutiert (Ruggeri, Z.M:. Mechanisms initiating platelet thrombus formation. Thromb. Haemost. 1997; 78, 611-616), wobei subendotheliales fibrilläres Kollagen die stabile Adhäsion und Aktivation von Blutplättchen fördert (van Zanten, G.H. et al. Increased platelet deposition on atherosclerotic coronary arteries. J Clin. Invest 1994; 93, 615-632; Clemetson, K.J. & Clemetson, J.M. platelet collagen receptors. Thromb. Haemost. 2001, 86, 189-197). Allerdings zeigt die vorliegende Erfindung durch in vivo Fluoreszenzmikroskopie der Maus-Karotid-Arterie, dass Inhibierung oder Abwesenheit des bedeutendsten Blutplättchen-Kollagenrezeptors, GPVI, stattdessen die Blutplättchen-Gefäßwand-Interaktionen nach einer endothelialen Erosion aufhebt. Unerwartet reduziert die Inhibition von GPVI das Blutplättchen-Tethering und die Adhäsion an das Subendothel auf um fast 89 %. Weiterhin ist eine stabile Haftung und die Aggregation von Blutplättchen unter diesen Bedingungen nahezu aufgehoben. Das strikte Erfordernis für GPVI in diesen Prozessen wurde in GPVI-defizienten Mäusen bestätigt, wohingegen Blutplättchen auch nicht an die beschädigte Gefäßwand adherieren und aggregieren konnten. Diese Ergebnisse zeigen eine unerwartete Rolle von GPVI bei der Initiation der Blutplättchen-Anlagerung an Stellen vaskulärer Verletzung und identifizieren eindeutig Blutplättchen-Kollageninteraktionen als den bedeutendsten bestimmenden Faktor von arteriellen, Blutplättchen-induzierten, atherosklerotischen Komplikationen.
  • Die Tatsache, dass GPVI allgemein als Rezeptor für das subendotheliale Matrixkollagen wirkt, war beschrieben worden (Moroi M, Jung SM, Okuma M, Shinmyozu K.A patient with platelets deficient in glycoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation and adhesion. J Clin Invest 1989; 84: 1440-1445). Diese Autoren charakterisierten Blutplättchen in vitro, welche von Patienten mit einer GPVI-Rezeptordefizienz stammten. Allerdings war die physiologische Bedeutung der Interaktion von Kollagen und GPVI-Rezeptor in dem in vivo Kontext, und der relative Beitrag des GPVI-Rezeptors zur Adhäsion nach vaskulärer Verletzung, nicht bekannt. Insbesondere war nicht bekannt, dass die Inhibition dieses Rezeptors den Schlüsselschritt in der Bildung von intravaskulärer Thrombose, welcher Blutplättchen-Tethering ist, inhibiert. Die vorliegende Erfindung zeigt den GPVI-Rezeptor als einen essentiellen Rezeptor für die Blutplättchen-Adhäsion an das Subendothel durch die Anlagerung an das subendotheliale Matrixkollagen in vivo. Unter der Vielzahl von anderen Blutplättchen-Oberflächenproteinen wie GP Ib (von Willebrand Rezeptor), dem aIIbβ3-Integrinrezeptor, dem α2β1-Integrin, oder den GPV-Rezeptoren, haben wir überraschend den GPVI-Rezeptor als einen essentiellen Rezeptor identifiziert, welcher Blutplättchen-Adhäsion an die Gefäßwand vermittelt. Da Blutplättchen-Adhäsion der erste und wichtigste Schritt für die Blutplättchen-Aggregation und die intraarterielle Thrombusbildung unter physiologischen Scherstressbedingungen ist, bilden die folgenden schädlichen Effekte, welche zu intraarteriellem Verschluss führen, die funktionelle Basis für die klinischen Syndrome von myokardialem Infarkt oder zerebralem Schlaganfall. In einer chronischen Situation vermehrt die Interaktion von Blutplättchen mit dem Endothel frühe Schritte der Artheriosklerose. Unsere Erfindung zeigte auch zum ersten Mal, dass der GPVI-Rezeptor eine entscheidende Rolle unter der komplexen Vielzahl von etlichen Blutplättchen-Oberflächenproteinen für die initiale Blutplättchen-Adhäsion und für die chronische Blutplättchen-Endothel-Interaktion beim Fortschreiten von Arteriosklerose spielt.
  • WO 01/16321 und WO 01/00810 offenbaren eine DNA und Proteinsequenz des menschlichen GPVI-Rezeptors. Allerdings war die Bedeutung der Blutplättchen-Adhäsion und -Aktivierung durch endotheliale Läsionen nicht vor einem in vivo Hintergrund gezeigt worden.
  • US 6,383,779 offenbart Fusionsproteine von GPVI. Allerdings offenbart diese Referenz kein dimeres Fusionsprotein oder irgendeinen therapeutischen Effekt von GPVI.
  • Kürzlich wurden die unterschiedlichen Phasen der Blutplättchen-Kollagen-Interaktion an künstliches Kollagen in vitro während Perfusionsbedingungen untersucht. (Moroi M, Jung SM, Shinmyozu K, Tzomiyama Y, Ordinas A und Diaz-Ricart M. Analysis of platelet adhesion to collagen-coated surface under flow conditions: the involvement of glycoprotein VI in the platelet adhesion. Blood 1997; 88: 2081-2092). Die Autoren dieser Studie zeigten bereits die Bedeutung der Kollagen-GPVI-Interaktion während Scherstressbedingungen auf. Allerdings konnte die Relevanz des subendothelialen Matrixkollagens für die Adhäsion nicht in dieser künstlichen in vitro Situation studiert werden. Als eine Konsequenz der limitierten Relevanz ihres in vitro Modells kamen die Autoren der oben erwähnten Studie zu der Schlussfolgerung, dass GPVI-Rezeptoren eher in die Blutplättchen-Aktivierung als in die Blutplättchen-Adhäsion an das Endothel involviert sind. Im Gegensatz dazu ist der von Willebrandd GP Ib-Rezeptor signifikant in die Blutplättchen-subendotheliale Interaktion involviert. Diese Autoren konzentrierten alle zur Verfügung stehende Information über Blutplättchen-Kollagen-Interaktion in einem Review der derzeitigen Literatur. Vorher hatten Moroi M und Jung, SM (Platelet receptors for collagen. Thromb. Haemost. 1997; 78: 439-444) Kollagen-Fibrillen-Interaktion mit unterschiedlichen Kollagenrezeptoren auf Blutplättchen für die Adhäsion und Thrombusbildung von Blutplättchen diskutiert. Allerdings nahmen die Autoren keine relevante Rolle für den GPVI-Rezeptor für die Adhäsion in einer klinisch relevanten in vivo Situation an, da sie die Signifikanz der unterschiedlichen Kollagenrezeptoren bei dem Adhäsionsprozess nicht bestätigen konnten.
  • Daher stellt die vorliegende Erfindung eine Lösung für das Problem bereit, das relevante Target für die Blutplättchen-subendotheliale Interaktion und für die Blutplättchen-Adhäsion bereitzustellen, ohne unerwünschte Nebeneffekte von Blutungskomplikationen hervorzurufen. Neben der gut bekannten Kollagen-Blutplättchen-Interaktion durch den GPVI-Rezeptor konnten wir Daten bereitstellen für die Interaktion der nativen subendothelialen Matrix mit Blutplättchen, gemessen durch in vivo Blutplättchen-Adhäsion. Folglich konnten wir die Signifikanz der GPVI-Endothel-Interaktion für die Blutplättchen-Adhäsion als initialen Schritt von intravaskulärer Thrombose bestätigen. Daher löst unsere Erfindung das Problem einer wirksamen anti-Blutplättchen-Wirkstoff-Behandlung für den wichtigen Schritt der Blutplättchen-Adhäsion ohne unerwünschte Nebenwirkungen.
  • Daher besteht das Immunoadhesin aus der extrazellulären Domäne des GPVI-Rezeptors zusammen mit dem Fc-Teil eines IgG-Immunglobulins (Fc-GPVI-nt) fusioniert durch einen Linker, welcher die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg aufweist. Dieses neue Fusionsprotein basiert ungefähr 50 % auf der Original-DNA-Sequenz von GPVI wie zuvor publiziert. Die Proteinstruktur des Immunoadhesins ist neu, da das rekombinante Fusionsprotein kein Membranprotein wie den GPVI-Rezeptor bildet, sondern ein lösliches, immunglobulinartiges Immunoadhesin, abgegeben durch die entsprechende Wirtszelle, darstellt. Dieses Immunoadhesin kann die Liganden-Rezeptor-Interaktion von Kollagen und GPVI blockieren. Unsere Resultate zeigen, dass das Immunoadhesin merkliche Effekte auf die physiologischen Haupt-Funktionen der Blutplättchen, induziert durch Kollagenstimulation besitzt. Die Kollagen-induzierte Aggregation, Adhäsion und die Freisetzungsfunktion kann durch das Immunoadhesin im gleichen Maße wie durch einen spezifischen, monoklonalen Antikörper inhibiert werden, allerdings ist der Mechanismus unterschiedlich: Während der Antikörper die GPVI-Aktivierung durch direktes Binden an die Ligandenbindestelle des GPVI-Rezeptors inhibiert, fängt das Immunoadhesin den GPVI-Liganden Kollagen ab und verhindert somit ligandenvermittelte GPVI-Aktivierung.
  • Das erfindungsgemäße Immunoadhesin ist ein neuer GPVI-Inhibitor. Es hat den Vorteil der selektiven Inhibierung des aktivierten Zweigs von GPVI vermittelten Effekten durch Liganden-Scavenging. Nebeneffekte der Verwendung eines anti-GPVI-Antikörpers, wie Antikörper vermittelte Effekte auf die GPVI-Rezeptor-Internalisierung werden verhindert, wenn ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein anstelle des Antikörpers verwendet wird. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann für die Behandlung von atherosklerotischen Komplikationen verwendet werden, welche durch unstabile, atherosklerotische Plaques mit Plaquebruch oder endothelialer Läsion verursacht werden. Daher dient das Immunoadhesin Fc-GPVI-nt als therapeutischer Inhibitor für Kollagen-vermittelte GPVI-Aktivierung, ohne die intrinsische Aktivität des GPVI-Rezeptors mit dem maßgeblichen Signalsystem zu beeinflussen. Ferner dient das GPVI-Immunoadhesin als ein ideales Epitop für die Antikörperauswahl. Der Fc-Teil erlaubt die bequeme Reinigung des Proteins und einfache Fixierung an Oberflächen, um eine Antikörperselektion in großem Maßstab gegen Antikörperbibliotheken z.B. durch Phage-Display durchzuführen. Die Selektion erlaubt ein selektives Antikörper-Screening nach den relevanten Epitopen, welche dem intakten Protein ähneln, mit einer ähnlichen Struktur wie dem nativen Protein.
  • Letztendlich ist Fc-GPVI-nt ein wichtiges Werkzeug für das Screening nach Inhibitoren der GPVI-Rezeptoraktivierung. Wir haben einen ELISA-basierten in vitro Assay etabliert, welcher die Kollagen-GPVI-Interaktion durch mit Kollagen vorbeschichteten Platten als Ligand simuliert. Dieser Assay kann alternativ ausgeführt werden durch fluoreszenzmarkiertes Fc-GPVI-nt und daher auf high-throughput Format ausgeweitet werden. Dieser Assay ermöglicht das Screening von beidem, inhibitorischen Antikörpern oder kleinen Molekülen, auf ihre Wirksamkeit die GPVI-Funktion durch Fluoreszenzmessung zu inhibieren. Mit diesem zellfreien Screening-Assay ist ein Prototypverfahren für high-throughput ausweitbare Fluoreszenz-Screening-Assays zum Wirkstoff-Testen etabliert worden.
  • Basierend auf die kürzlichen Verbesserungen der Bildgebungstechniken durch intravaskulären Ultraschall oder Kernspin-Resonanzbildgebung ist es möglich, Patienten mit Atherosklerose zu identifizieren, welche gefährdet sind, akute klinische Komplikationen wie akute Koronar- oder Karotidsyndrome zu entwickeln, wobei die Patienten aktive Läsionen als mögliche Ursache für intravaskuläre Thrombose aufweisen.
  • Aktive Läsionen sind charakterisiert durch das Freilegen von subendothelialen Matrix-Kollagenen und Blutplättchen-Aktivierung. Das Auftreten solcher Läsionen kann untersucht werden z.B. durch intravaskulären Ultraschall oder Thermographie (z.B. Fayed and Fuster, Clinical imaging of the high-risk or vulnerable atherosclerotic plaque. Circulation 2001; 89:305-316) oder nukleare Resonanzbildgebung (Helft et al., Progression and Regression of Atherosclerotic Lesions. Circulation 2002; 105:993-998). Solche Läsionen sind sehr wahrscheinlich bei Patienten mit akuten Koronar- oder Karotidsyndromen und das Risiko des Widerauftretens von akuten klinischen Komplikationen wie myokardialem Infarkt oder Schlaganfall ist sehr hoch, stufenweise abnehmend mit zunehmender zeitlicher Distanz von dem ersten Ereignis.
  • Entsprechend ist es möglich, basierend auf die vorliegende Erfindung, Patienten zu behandeln, welche gefährdet sind, Atherosklerose zu bekommen. Um Atheroprogression zu verhindern, wird ein Patient mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein behandelt, um die Interaktion zwischen Blutplättchen und exponiertem, subendothelialen Kollagen zu verhindern. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein blockiert den Liganden für den GPVI-Blutplättchenrezeptor in der Gefäßwand (z.B. Subendothel), so dass eine Interaktion zwischen den Blutplättchen und exponiertem Kollagen inhibiert wird.
  • Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann die Form eines lyophilisierten Pulver haben, welches vor der Verabreichung an einen Patienten in einem pharmazeutisch verträglichen, flüssigen Carrier dispergiert wird. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann also in einer pharmazeutische Zusammensetzungen geeignet für parenterale, im Fall der Behandlung von akuten Komplikationen bevorzugt intraarterielle oder intravenöse, Verabreichung aufgenommen werden. Solche Zusammensetzungen umfassen gewöhnlich das Fusionsprotein und einen pharmazeutisch verträglichen Carrier. Ein pharmazeutisch verträglicher Carrier schließt Lösungsmittel ein, Dispersionsmedien, antibakterielle und antimykotische Mittel und isotonische Mittel, welche mit der pharmazeutischen Verabreichung kompatibel sind. Die vorliegende Erfindung schließt Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung einer chronischen oder akuten cardiovaskulären Erkrankung ein. Solche Verfahren umfassen das Formulieren eines pharmazeutisch verträglichen Carriers mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein. Im Fall der Behandlung einer akuten cardiovaskulären Erkrankung wird die Zusammensetzung bevorzugt intravenös oder intraarteriell verabreicht. Im Fall der Behandlung einer chronischen cardiovaskulären Erkrankung kann die Zusammensetzung auch subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen können weiterhin zusätzliche wirksame Verbindungen enthalten, wie z. B. weitere Polypeptide (wie zum Beispiel Insulin) oder therapeutisch wirksame kleine Moleküle. Daher schließt die Erfindung weiterhin Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutische Zusammensetzung durch Formulieren eines pharmazeutisch verträglichen Carriers mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein und einer oder mehreren zusätzlichen wirksamen Verbindungen wie zum Beispiel Insulin ein. Im Fall der Co-Formulierung des Fusionsproteins und Insulins für die Behandlung von diabetischen Patienten ist es bevorzugt, dass die Dosierungsform eine getrennte Lagerung der verschiedenen Proteine erlaubt, wonach das Mischen der Proteine genau vor oder während der Verabreichung der Zusammensetzung durchgeführt wird. Dementsprechend wird die Applikation durch eine Mehr-Kammer-Spritze in Betracht gezogen. Eine erfindungsgemäße pharmazeutischen Zusammensetzung ist formuliert, um mit dem geplanten parenteralen Verabreichungsweg kompatibel zu sein. Beispiele für parenterale Verabreichungswege schließen z. B. intraarterielle und intravenöse Verabreichung ein. Lösungen oder Suspensionen, welche für parenteral verwendet werden, können ein steriles Lösungsmittel wie zum Beispiel Wasser zur Injektion, Salzlösung, Polyethylenglycole, festgelegte Öle („fixed oils"), Glycerin, Propylenglycol, TWEEN oder andere synthetische Lösungsmittel, antibakterielle Mittel, wie zum Beispiel Benzylalkohol oder Methylparabene, Komplexbildungsmittel, wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure, Antioxidantien, wie beispielsweise Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Puffer, wie beispielsweise Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zum Einstellen der Tonizität, wie beispielsweise Natriumchlorid, Dextrose, Saccharose oder Mannitose, ein. Der pH kann mit Säuren oder Basen eingestellt werden, wie zum Beispiel Hydrochlorsäure oder Natriumhydroxid. Die parenterale Zusammensetzung kann in Ampullen, in Einwegspritzen oder Vielfach-Dosierungsfläschchen (vials) aus Glas oder Plastik eingeschlossen sein. Für die Verwendung zum Einspritzen geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen schließen sterile, wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung von sterilen einspritzbaren Lösungen oder Dispersionen ein. Für die intravenösen Verabreichungen geeignete Carrier schließen physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, oder phosphatgepufferte Saline (PBS) ein. Der Carrier kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, welches zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerol, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol) und geeignete Mischungen davon enthält. Die geeignete Fluidität kann z. B. durch die Verwendung einer Beschichtung, wie zum Beispiel Lezithin, durch die Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen erhalten werden. Ein Schutz vor der Aktivität von Mikroorganismen kann durch zahlreiche antibakterielle und antimykotische Mittel, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal, und Ähnlichem erreicht werden. In vielen Fällen wird es bevorzugt sein, isotonische Mittel, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole, wie beispielsweise Mannit, Sorbit, Natriumchlorid, in die Zusammensetzung einzuschließen. Eine verlängerte Absorption der einspritzbaren Zusammensetzungen kann bewirkt werden durch Einschließen eines Mittels in die Zusammensetzung, welches die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine. Sterile, einspritzbare Lösungen können durch Aufnehmen der wirksamen Verbindung (z. B. einem Polypeptid oder Antikörper) in benötigter Menge, in einem geeigneten Lösungsmittel, mit einem oder einer Kombination der oben aufgezählten Inhaltsstoff(en), wie benötigt, gefolgt von filtrierter Sterilisation hergestellt werden. Generell werden Dispersionen hergestellt indem die wirksame Verbindung in ein steriles Trägerstoff aufgenommen wird, welches ein basisches Dispersionsmedium und die benötigten Inhaltsstoffe aus den oben aufgezählten Inhaltstoffen enthält. Bei sterilen Pulvern für die Herstellung von sterilen, einspritzbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Gefriertrocknen, welche ein Pulver des wirksamen Inhaltsstoffs mit jeglichem zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoff aus einer vorher steril-gefilterten Lösung hiervon ergeben. Es ist insbesondere vorteilhaft, orale oder parenterale Zusammensetzungen in Form von Dosierungs-Einheiten zu formulieren. Eine Form von Dosierungs-Einheiten sind separate Einheiten, welche als einzelne Dosierungen für einen Patienten geeignet sind. Jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge einer wirksamen Verbindung, um den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem benötigten pharmazeutischen Carrier hervorzurufen. Eine therapeutisch wirksame Menge an Fusionsprotein (z. B. eine wirksame Dosierung) für die Behandlung von akuten Komplikationen reicht von 0,05 bis 5 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 0,1 bis 2 mg/kg Körpergewicht, stärker bevorzugt 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht. Eine therapeutisch wirksame Menge Fusionsprotein (z. B. eine wirksame Dosis) für die Behandlung von chronischer Arteroprogression reicht von 0,5 bis 6 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 1 bis 5 mg/kg Körpergewicht, stärker bevorzugt 2 bis 5 mg/kg Köpergewicht. Die Behandlung eines Subjekts mit einer therapeutisch wirksamen Menge des Fusionsproteins kann eine einzelne Behandlung oder kann, bevorzugt, eine Folge von Behandlungen einschließen. In einem bevorzugten Beispiel wird ein Subjekt mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein gegen chronische Arteroprogression im Bereich von 0,5 bis 6 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 1 bis 5 mg/kg Körpergewicht, stärker bevorzugt 2 bis 5 mg/kg Körpergewicht, mindestens zweimal pro Woche behandelt.
  • Verfahren, um die Blutplättchen-Kollagen-Interaktion und Modulation durch Inhibitoren zu untersuchen
  • Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung
  • Die Stimulierung von Blutplättchen-reichem Mäuse-Plasma, mit ansteigenden Konzentrationen von Rinder-Typ-1-Kollagen von 0,2 bis 4 μg/ml, löst eine dosisabhängige Aggregation von 2 bis 95 % und eine dosisabhängige ATP-Freisetzung von 0 bis 1,66 nM ATP-Freisetzung aus. Für die weiteren Experimente wurde eine halb-maximale Kollagen-Konzentration gewählt. Die Inkubation des Blutplättchen-reichen Mäuse-Plasmas mit dem spezifischen Anti-Maus GPVI-Antikörper JAQ 1 (50 μg/ml und 100 μg/ml) hob die Blutplättchen-Aggregation nach Stimulierung mit 2 μg Kollagen/ml (mit 50 μg JAQ 1: 2 +/– 0,7; mit 100 μg JAQ 1: 1,5 +/– 0,3 %) fast vollständig auf. Ferner wurde die ATP-Freisetzung in einer Antikörper-Dosis-abhängigen Weise bis 1,09 nM ATP inhibiert (10 μg Antikörper/ml) oder komplett aufgehoben (50 und 100 μg Antikörper/ml).
  • In ähnlicher Weise hob die Inkubation von Blutplättchen-reichem Mäuse-Plasma mit dem Immunoadhesin für GPVI (Fc-GPVI-nt) (50 μg/ml und 100 μg/ml) fast vollständig die Blutplättchen-Aggregation nach Stimulierung mit 2 μg Kollagen/ml auf (mit 50 μg Fc-GPVI-nt: 2 +/– 0,7; mit 100 μg Fc-GPVI-nt: 1,5 +/– 0,3 %) und die ATP-Freisetzung bis 0 nM ATP.
  • Daher inhibierte das Immunoadhäsin die GPVI-Aktivierung ausreichend durch Scavenging des natürlichen GPVI-Liganden Kollagen. Beide der entscheidenden Blutplättchen Funktionen, sowohl Aggregation als auch Blutplättchen-Freisetzungs-Mechanismus, konnten durch Fc-GPVI-nt beeinflusst werden, wie durch ATP-Freisetzung bestimmt.
  • GPVI-vermittelte Adhäsion unter physiologischen Flussbedingungen (Flusskammer)
  • Die Adhäsion von Blutplättchen unter physiologischen Scher-Bedingungen wurde in einer Flusskammer getestet. Die initiale und die stabile Adhäsion von Bluttplättchen wurde signifikant durch Hinzufügen des Fc-GPVI-nt-Immunoadhesins um 60 % inhibiert (siehe 4).
  • GPVI-Bindungsassay
  • Die Adhäsion von Fc-GPVI-nt an Kollagen-beschichtete Platten wurde in einem ELISA-basierten Fluoreszenz-Assay bestimmt. Das Binden des Immunadhäsins Fc-GPVI-nt stieg dosisabhängig bis zu Sättigungsgraden bei einer Konzentration von 0,2 bis 10 μg Fc-GPVI-nt an (siehe bitte 5). Die Spezifität wurde durch Vergleichen des Bindens von Fc-GPVI-nt mit dem des leeren Immunoadhesins Fc-nt oder der unbeschichteten Plastikoberfläche gezeigt (siehe 6).
  • Verfahren, um Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation bei vaskulärer Verletzung in vivo, als die entscheidenden Schritte bei der Bluttplättchen-Aktivierung bei akuten vaskulären Ereignissen, zu untersuchen
  • Um die biologische Signifikanz von Blutplättchen-Kollagen-Interaktionen, bei den Prozessen der Adhäsion an Läsionen in vivo, zu testen, wurden die Blutplättchen-Gefäßwand-Interaktionen nach vaskulärer Verletzung der Maus-Carotidarterie bestimmt. Eine vaskuläre Verletzung dieser bedeutenden Strombahn kann als Modell für die ersten Schritte von Atheriosklerose, wie zum Beispiel endotheliale Läsionen im frühen Stadium der Atheriosklerose, oder Plaquebruch in späteren Stadien der Atheriosklerose mit dem Freilegen von Kollagen-Fibrillen aus dem Subendothel, dienen. Ferner erlaubt dieses Modell das Studium der nachfolgenden Komplikationen von vaskulärer Verletzung. Kleine endotheliale Verletzungen führen zu der maximalen Aktivierung von Blutplättchen mit den anschließenden Schritten der Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation. In weiteren Schritten können Bluttplättchen-Aggregate zu Embolien aus der Carotidarterie mit darauf folgendem ischämischem zerebralem Schlaganfall führen. Daher dient dieser experimentelle Aufbau als ein bedeutendes in vivo-Modell für eine Subgruppe von Patienten mit instabiler Atherosklerose, welche Plaquebruch und endotheliale Läsionen, die zu akutem Koronarsyndrom und Schlaganfall führen, einschließt.
  • Kräftiges Abbinden der Carotidarterie für 5 Minuten verursacht durchweg einen vollständigen Verlust der endothelialen Zellschicht und löst die Blutplättchen-Adhäsion an der Stelle der Verletzung aus, wie durch Rasterelektronenmikroskopie festgestellt (1a). In vivo-Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um den dynamischen Prozess der Blutplättchen-Akkumulation anschließend an eine vaskuläre Verletzung direkt sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Zahlreiche Blutplättchen werden innerhalb der ersten Minuten nach der endothelialen Denudation an die vaskuläre Wand getethered (4620 ± 205 Blutplättchen/mm2). Nahezu alle Blutplättchen, die den Kontakt mit dem Subendothel aufbauen, weisen zunächst eine langsame Oberflächen-Translokation des „Stopp-Start"-Typus auf (Savage, B., Saldivar, E. & Ruggeri, Z.M. Initiation of platetlet adhesion by arrest onto Fibrinogen or translocation on von Willebrand factor. Cell 1996; 84, 289-297). Während wir einen Übergang von anfänglicher langsamer Oberflächen-Translokation zu irreversibler Blutplättchen-Adhäsion bei 88 % aller Blutplättchen beobachteten (4182 ± 253 Blutplättchen/mm2) (1b), blieb die Blutplättchen-Haftung nur in 12 % transient (543 ± 32 Blutplättchen/mm2). Sobald eine stabile Haftung eingesetzt hat, rekrutieren adherierte Blutplättchen weitere Blutplättchen aus dem Blutkreislauf, was zu Aggregatbildung führt (1c). Ähnliche Charakteristika der Blutplättchen-Rekrutierung werden mit immobilisiertem Kollagen in vitro erhalten. Im Gegensatz dazu werden nur wenige Blutplättchen unter physiologischen Bedingungen an die intakte Gefäßwand getethered (P < 0,05 vs. vaskulärer Verletzung) und nahezu 100 % dieser Blutplättchen werden von der Gefäßwand ohne eine stabile Haftung verdrängt (P < 0,05 vs. Vaskuläre Verletzung, 1a-c).
  • Identifizierung von GPVI als einem neuen und relevanten Zielprotein auf Blutplättchen für die vaskuläre Verletzung in vivo
  • Die hohe Komplexität der Blutplättchen-Gefäßwand-Interaktion, welche eine Vielzahl unterschiedlicher Rezeptoren und Signaltransduktionswege einschließt, macht die in vivo-Inhibition dieses Prozesses sehr schwierig. Neben GPIb-V-I-X und αIIbβ3-Integrin, welche indirekt mit Kollagen durch den von-Willbrand-Faktor (vWF) interagieren, wurden eine große Anzahl von Kollagenrezeptoren auf Blutplättchen identifiziert, einschließlich, am wichtigsten, α2β1-Integrin (Santoro, S.A. Identification of a 160,000 dalton platelet membrane protein that mediates the initial divalent cation-dependent adhesion of platelets to collagen. Cell 1986; 46, 913-920), GPV (Moog, S. et al. Platelet glycoprotein V binds to collagen and participates in platelet adhesion and aggregation. Blood 2001, 98, 1038-1046) und GPVI (Moroi, M., Jung, S.M., Okuma, M. & Shinmyozu, K. A patient with platelets deficient in glycoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation and adhesion. J. C1in. Invest 84, 1440-1445). In mehreren Befunden über unterschiedliche Signalsysteme, welche in vitro eine Rolle spielen, wurde nun auch GPVI diskutiert (Gibbins, J.M., Okuma, M., Farndale, R., Barnes, M. & Watson, S.P. Glycoprotein VI ist he collagen receptor in platelets which underlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptor gamma-chain. FEBS Lett. 1997; 413, 255-259; Nieswandt, B. et al. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J. Exp. Med. 2001; 193, 459-469, Nieswandt, B. et al. Glycoprotein VI but not α2β1 integrin is essential for platelet interaction with collagen. EMBO J 2001; 20, 2120-2130).
  • Um direkt die in vivo-Relevanz von Blutplättchen-Kollagen-Interaktionen bei arterieller Thrombusbildung zu testen, inhibierten oder deletierten wird GPVI in vivo. Der monoklonale Antikörper (mAb) JAQ1 blockiert die Haupt-Kollagen-Bindestelle von Maus-GPVI (Schulte, V. et al. Evidence for two distinct epitopes within collagen for activation of murine platelets. J Biol. Chem. 2001; 276, 364-368) und inhibiert unter hohen Scherflussbedingungen fast restlos die stabile Blutplättchen-Adhäsion an immobilisiertes, fibrilläres Kollagen (Nieswandt, B. et al. Glycoprotein VI but not alpha2beta1 integrin is essential for platelet interaction with collagen. EMBO J 2001; 20, 2120-2130). Um die Signifikanz der GPVI-Kollagen-Interaktionen in dem dynamischen Prozess der Blutplättchen-Adhäsion/-Aggregation bei arterieller Thrombusbildung zu studieren, bekamen Mäuse Gen-identische, Fluoreszenz-markierte Blutplättchen, welche mit JAQ 1-Fab-Fragmenten oder Isotyp-angepasstem Kontroll-IgG vorinkubiert worden waren, und die Carotidverletzung wurde wie unten beschrieben induziert. Sehr unerwartet fanden wir, dass die Inhibierung von GPVI das initiale Blutplättchen-Tethering nach endothelialer Denudation in der Arteria carotis communis um 89 % reduzierte (P < 0,05 vs. Kontroll-IgG, 2a) einem Prozess, von dem geglaubt wurde, dass er hauptsächlich durch GPIbα-Interaktion mit immobilisiertem vWF vermittelt würde (Goto, S., Ikeda, Y., Saldivar, E. & Ruggeri, Z.M. Distinct mechanisms of platelet aggregation as a consequence of different shearing flow conditions. J. Clin. Invest. 1998; 101, 479-486; Sixma, J.J., van Zanten, G.H., Banga, J.D., Nieuwenhuls, H.K. & de Groot, P.G. Platelet adhesion. Semin. Hematol. 1995; 32, 89-98). Außerdem wurde die dauerhafte Blutplättchen-Haftung durch JAQ 1 um 93 % reduziert (2a). Wir beobachteten einen Übergang von initialem Tethering/langsamer Oberflächen-Translokation zu irreversibler Blutplättchen-Adhäsion bei nur 58 % der Blutplättchen, welche einen initialen Kontakt mit der subendothelialen Oberflächen aufbauten (verglichen mit 89 % mit Kontroll-IgG vorbehandelten Blutplättchen, P < 0,05, 2b). Die Aggregation von adhärierten Blutplättchen fehlte fast vollständig nach Vorbehandlung der Blutplättchen mit JAQ1-Fab-Fragmenten, aber nicht bei den Kontrollen (P < 0,05 vs. Kontrolle, 2c und d). Diese Daten zeigten, dass die direkten Blutplättchen-Kollagen-Interaktionen entscheidend für das initiale Blutplättchen-Tethering und die anschließende stabile Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation an Stellen vaskulärer Verletzung sind. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, dass GPVI ein Schlüsselregulator in diesem Prozess ist, während andere Oberflächenrezeptoren, am wichtigsten GPIb-V-IX und α2β1, nicht ausreichen, um in vivo die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation auf dem Subendothel auszulösen.
  • Um die Möglichkeit auszuschließen, dass dieser Effekt auf einer sterischen Beeinträchtigung anderer Rezeptoren basiert, z. B. von GPIb-V-IX, durch oberflächengebundenes JAQ1, generierten wir GPVI-defiziente Mäuse durch Injektion von JAQ1 fünf Tage vor der vaskulären Verletzung. Wie zuvor berichtet, induziert eine solche Behandlung den nahezu vollständigen Verlust von GPVI, z. B. durch Internalisierung und proteolytischen Abbau von GPVI auf zirkulierenden Blutplättchen, was, für mindestens zwei Wochen, zu einem „GPVI-Knock-out"-artigen Phänotyp fuhrt (Nieswandt, B. et al. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J. Exp. Med. 2001; 193, 459-469). Wie in 3a dargestellt, war GPVI am 5. Tag nach der Injektion von 100 μg/Maus-JAQ1 auf Blutplättchen aus JAQ1-behandelten Mäusen nicht detektierbar, aber nicht Kontroll-IgG, während die Oberflächen-Expression und -Funktion aller anderen getesteten Rezeptoren, einschließlich GPIb-V-IX, αIIbβ3, und α2β1, in beiden Mäusegruppen unverändert war, was frühere Ergebnisse bestätigt (Daten nicht gezeigt und Nieswandt, B. et al. Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice. J. Exp. Med. 2001; 193, 459-469).
  • Wie durch Rasterelektronenmikroskopie gezeigt, fehlt die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation nach endothelialer Denudation der Aorta carotis communis nahezu in GPVI-defizienten, aber nicht IgG-vorbehandelten Mäusen (3b). Als Nächstes wurde in vivo Video-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Blutplättchen-Adhäsionsdynamiken anschließend an die vaskuläre Verletzung in GPVI-defizienten Mäusen zu bestimmen (3c bis f).
  • Der Verlust von GPVI reduziert signifikant das Tethering/die langsame Oberflächen-Translokation von Blutplättchen an der Stelle der vaskulären Verletzung (um 83 % verglichen mit IgG-vorbehandelten Mäusen, P < 0,05). Diese GPVI-unabhängige langsame Oberflächen-Translokation benötigt vWF-GPIbα-Interaktion, da sie durch Vorinkubation der Blutplättchen mit Fab-Fragmenten, welche die Funktion haben, mAb gegen GPIbα zu blockieren (p0p/B), aufgehoben wird, was die entscheidende Rolle von GPIbα in diesem Prozess bekräftigt (nicht gezeigt). In Abwesenheit von GPVI ist die stabile Blutplättchen-Adhäsion um, verglichen mit der (IgG-behandelten) Kontrolle, ungefähr 90 % reduziert, während die Aggregation von adherierten Blutplättchen nahezu fehlt (3b-f). Wir sahen den Übergang vom Blutplättchen-Tethering zu der stabilen Blutplättchen-Adhäsion bei nur 58 % aller Blutplättchen, die ursprünglich an die Stelle der Verletzung getethered waren (verglichen mit 89 % der mit Kontroll-mAb-vorbehandelten Blutplättchen, P < 0,05, 3d), was darauf hinweist, dass die GPIBα-abhängige Oberflächen-Translokation nicht ausreicht, um eine stabile Blutplättchen-Adhäsion und anschließende -Aggregation zu fördern.
  • Die starke Inhibierung des Blutplättchen-Tethering durch GPVI-Blockierung war überraschend und wies auf eine vorher nicht erkannte Funktion dieses Rezeptors bei der sehr frühen initialen Phase der stabilen Blutplättchen-Adhäsion an vaskuläre Läsionen hin. Fibrilläres Kollagen ist ein Hauptbestandteil von menschlichen atherosklerotischen Läsionen (Rekhter, M.D. Collagen synthesis in atherosclerosis: too much and not enough. Cardiovasc. Res. 1999; 41, 376-384; Rekhter, M.D. et al. Type I collagen gene expression in human atherosclerosis. Localization to specific plaque regions. Am. J. Pathol. 1993; 143, 1634-1648); gesteigerte Kollagen-Synthese (durch glatte Muskelzellen in der Intima und Fibroblasten) trägt signifikant im Prozess der Atherogenese zur luminalen Verengung bei (Opsahl, W.P., DeLuca, D.J. & Ehrhart, L.A. Accelerated rates of collagen synthesis in atherosclerotic arteries quantified in vivo. Arteriosclerosis 1987; 7, 470-476). Plaquebruch oder Rissbildung (entweder spontan oder nach einer Ballonangioplastie) führt zur Aussetzung von Kollagenfibrillen an vorbeifließendens Blut.
  • Diese Erfindung lehrt zum ersten Mal, dass solche subendothelialen Kollagene der Hauptauslöser der arteriellen Thrombusbildung sind und zeigen eine unerwartete Funktion des Kollagenrezeptors GPVI bei der Blutplättchen-Rekrutierung an die verletzte Gefäßwand. Von den Prozessen des Blutplättchen-Tetherings und der langsamen Oberflächen-Translokation unter Bedingungen von erhöhter Scherung ist bekannt, dass sie stark von der GPIbα-Interaktion mit immobilisiertem vWF abhängen. Diese Interaktion ist allerdings nicht ausreichend, um initiale Blutplättchen-Gefäßwand-Interaktionen in vivo aufzubauen, da zusätzlich funktionsfähiges GPVI benötigt wird (2 und 3). Daher müssen sowohl GPIbα als auch GPVI beide zusammenarbeiten, um Blutplättchen an das Subendothel zu rekrutieren. Während des Blutplättchen-Tetherings kann das Binden von GPVI die Integrine αIIbβ3 und α2β1 von einem Zustand geringer zu einem Zustand hoher Affinität verändern. Beide, αIIbβ3 und α2β1, arbeiten dann zusammen, um eine darauf folgende stabile Haftung von Blutplättchen an Kollagen zu fördern, während αIIbβ3 erforderlich ist für die anschließende Aggregation von adherierten Blutplättchen. Daher stellt die Bindung von GPVI während dem initialen Kontakt zwischen Blutplättchen und subendothelialem Kollagen ein Aktivierungssignal bereit, welches erforderlich ist für die anschließende stabile Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation. Wichtigerweise ist die Besetzung oder das seitliche Clustering von GPIbα (während der GPIbα-abhängigen Oberflächen-Translokation), welche geringe Grade von aIIbβ3-Integrin-Aktivierung in vitro induziert (Kasirer-Friede, A. et al. Lateral clustering of platelet GP Ib-IX complexes leads to up-regulation of the adhesive function of Integrin aIIbβ3. J. Biol. Chem. 2002; Bd. 277: 11949-11956) nicht ausreichend, um die Blutplättchen-Adhäsion in vivo zu fördern.
  • Die Erfindung hat daher einen essentiellen Rezeptor für das Inhibieren von Blutplättchen-Anlagerung an das Subendothel identifiziert. Ein Antikörper, welcher die Interaktion zwischen GPVI mit exponiertem Kollagen blockiert, kann spezifisch alle Hauptphasen der Thrombusbildung inhibieren, z. B. Blutplättchen-Tethering, stabile Adhäsion und Aggregation an die Stellen der arteriellen Verletzung (z. B. während akuter Coronarsyndrome). Der sehr starke Schutz, der erreicht wurde durch die Inhibierung oder die Depletion von GPVI, begründet die Wichtigkeit der selektiven pharmakologischen Modulierung von GPVI-Kollagen-Interaktionen, um den Beginn und das Fortschreiten von pathologischen atherosklerotischen Läsionen zu kontrollieren.
  • Nach Bruch der artherosklerotischen Plaque ist das Aussetzen von subendothelialem Kollagen der Hauptauslöser, der die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation an der Stelle der Verletzung auslöst, gefolgt von arterieller Thrombose (1; 24; 25). Das Blutplättchen-Glycoprotein GPVI, welches kürzlich geklont worden ist (5; 6), wurde durch die Erfindung als der Hauptblutplättchen-Kollagenrezeptor identifiziert (4), welcher die Blutplättchen-Adhäsion sowohl in vitro (22) und unter (patho-)physiologischen Bedingungen in vivo vermittelt (3). Daher verhindert die Inhibierung von GPVI die Blutplättchen-Rekrutierung und arterielle Thrombose in Patienten mit fortgeschrittener Atherosklerose, wie durch die vorliegende Erfindung gezeigt, durch die inhibitorischen Aktivitäten des spezifischen Fusionsproteins Fc-GPVI-nt auf die Blutplättchen-Adhäsion in vitro und in vivo.
  • Das Fc-GPVI-nt-Fusionsprotein wird in HELA-Zellen exprimiert, indem ein adenovirales Expressionssystem verwendet wird um lösliches Fc-GPVI-nt zu erhalten. Die Charakterisierung der löslichen Formen vom GPVI zeigte, dass Fc-GPVI-nt als Dimer mit einer molekularen Masse von ungefähr 160 kDa sekretiert wird. Damit übereinstimmend berichteten Miura und Mitarbeiter kürzlich, dass das GPVI-Fc-Dimer als Dimer vorliegt, in dem zwei GPVI-Fc-Dimer-Moleküle durch durch das Cys in der Fc-Domäne jedes Moleküls gebildete Disulfit-Brücken kreuzvernetzt sind (21). Wichtigerweise wurde nur von der dimeren Form von GPVI, aber nicht von Monomeren der extrazellulären GPVI-Domäne berichtet, dass sie Kollagenbindeaffinität zeigt und die Kollagen-induzierte Blutplättchen-Aggregation abschwächt (21).
  • Bindungsassays wurden durchgeführt um die GPVI-Fc-Dimer-Kollagen-Interaktion zu definieren. Lösliches GPVI bindet an immobilisiertes Kollagen in einer saturierenden Weise. Das Binden des GPVI-Fc-Dimers an fibrilläres Kollagen war hochspezifisch, da es nicht bei immobilisiertem vWF oder BSA auftrat. Weiterhin konnte das GPVI-Binden an immobilisiertes Kollagen durch lösliches Kollagen verhindert werden. Es wurden hohe Konzentrationen von löslichem Kollagen benötigt, um das GPVI-Fc-Dimer-Binden zu blockieren, was darauf hinweist, dass das Fusionsprotein das immobilisierte Kollagen mit hoher Affinität bindet. Entsprechend ist eine hohe Assoziations- und Dissoziationskonstante (KD ungefähr 5,8 × 10–1 M) für die GPVI-Kollagen-Interaktion berichtet worden) (21).
  • Für lösliches Fc-GPVI-nt war früher nachgewiesen worden, dass es die Blutplättchen-Aktivierung und -Aggregation in Antwort auf Kollagen oder Konvulxin, einem Schlangengift, welches an GPVI mit hoher Affinität bindet, abschwächt (6; 21; 27). Abgesehen von der Blutplättchen-Aggregation ist GPVI kritisch in den Prozess der Blutplättchen-Adhäsion an Kollagen einbezogen (3; 22). In der vorliegenden Studie testeten wir daher die Effekte von Fc-GPVI-nt auf die Blutplättchen-Adhäsion unter physiologischen Flussbedingungen in vitro. Wir zeigen, dass lösliches Fc-GPVI-nt dosisabhängig die Blutplättchen-Adhäsion unter geringen und hohen Scherungsbedingungen in vitro inhibiert. Bei Anwesenheit von Fc-GPVI-nt, aber nicht von Kontroll-Fc-Peptid, fehlte die Aggregation von adherierten Blutplättchen nahezu vollständig, was darauf hinweist, dass GPVI zu den Prozessen sowohl der Blutplättchen-Adhäsion als auch der anschließenden Aktivierung durch immobilisiertes Kollagen beiträgt. GPVI überträgt Kollagenantworten (d.h. Adhäsion und Aggregation) in einer Rezeptor-Dichte-abhängigen Weise (22). Entsprechend war berichtet worden, dass eine mehr als 50%-ige Reduktion in der GPVI-Expression transfizierter RBL-2H3-Zellen assoziiert ist mit einem Fehlen von Kollagen-induzierter Aggregation in diesen Zellen (8; 22). Da dessen ungeachtet für eine kleine Proben-Population eine geringe Variabilität in der GPVI-Rezeptor-Dichte berichtet worden war (22), könnte man erwarten, dass die Inhibition von ungefähr 50% der Kollagen-GPVI-Bindungen ausreichend ist, um die Blutplättchen-Rekrutierung an exponiertes Kollagen abzuschwächen. In der vorliegenden Studie wurden Dosen von 1mg/kg Fc-GPVI-nt benötigt, um eine signifikante Inhibierung der Blutplättchen-Adhäsion unter Fluss zu induzieren, was die Auffassung unterstützt, dass vielfältige GPVI-Bindestellen an jeder Kollagen-Fibrille verfügbar sind. Ähnliche Mengen eines Funktions-blockierenden anti-GPVI-Antikörpers wurden benötigt, um eine Blutplättchen-Gefäßwand-Verletzung in vivo abzuschwächen (3).
  • Fibrilläres Kollagen ist ein Hauptbestandteil der normalen Gefäßwand, aber auch von artherosklerotischen Lesionen (28). Bruch oder Rissbildung der artherosklerotischen Plaques führt zu einem Aussetzen von Kollagenfibrillen an zirkulierende Blutplättchen. Wie früher berichtet, sind GPVI-Kollagen-Interaktionen notwendigerweise in die arterielle Thrombusbildung nach vaskulärer Verletzung involviert (3). Wir zeigen hier in vivo- Effekte von löslichem Fc-GPVI-nt auf die Blutplättchen-Rekrutierung nach arterieller Verletzung. Die Endotheliale Denudation wurde durch reversibles Abbinden dieser Karotidarterie induziert, und der dynamische Prozess der Blutplättchen-Anhaftung wurde durch intravitale Videofluoreszenzmikroskopie, wie beschrieben beobachtet (3). Wir zeigen zum ersten Mal in vivo, dass lösliches Fc-GPVI-nt das stabile Blutplättchen-Tethering, die Adhäsion und die Blutplättchen-Aggregation nach endothelialer Denudation abschwächt. Die Inhibierung der Blutplättchen-Rekrutierung durch Fc-GPVI-nt war dosisabhängig. Abgesehen von der Verhinderung der stabilen Haftung von Blutplättchen reduzierte Fc-GPVI-nt signifikant das initiale Blutplättchen-Tethering/die langsame Oberflächen-Translokation an die Stellen der endothelialen Denudation. Wir haben früher gezeigt, dass die Inhibierung von GPIbα oder von GPVI das Blutplättchen-Tethering in einem ähnlichen Ausmaß abschwächt (3), was belegt, dass die GPVI- und GPIbα-Interaktion in Kontakt arbeiten müssen, um das Blutplättchen-Tethering an subendotheliales Kollagen zu fördern (2; 29-31). Vielmehr sind die hohen „on"- und „off"-Geschwindigkeiten, welche für die GPVI-Liganden-Interaktion berichtet werden (22) konsistent mit der Rolle von GPVI als einem Tethering-Rezeptor.
  • Die vorliegende Erfindung identifiziert Fc-GPVI-nt als einen aktiven Bestandteil eines Medikamentes, um die arterielle Thrombose nach einer vaskulärer Verletzung abzuschwächen. Dieses Konzept wird weiterhin belegt durch die Beobachtung, dass Fc-GPVI-nt gezielt, wie durch Immunohistochemie gezeigt, zu dem exponierten Subendothel an der Stelle der vaskulären Verletzung geführt wird. Dies impliziert, dass die Inhibierung von GPVI-Kollagen-Interaktionen wahrscheinlich auf die Stelle der vaskulären Verletzung begrenzt ist, während eine verlangsamte, systemische Inhibierung der Blutplättchen-Funktion durch die erwartete kurze Halbwertszeit von ungebundenem Fc-GPVI-nt limitiert ist. Im Gegensatz dazu führt die Verabreichung von monoklonalen Antikörpern, gerichtet gegen GPVI, unweigerlich zur systemischen Inhibierung von GPVI auf allen zirkulierenden Blutplättchen. Ferner beeinflusste die Fc-GPVI-nt-Verabreichung nicht die Blutplättchenzahl. Im Gegensatz dazu können anti-GPVI mAbs schließlich Immun-Thrombozytopenie oder einen vollständigen Verlust von GPVI auf zirkulierenden Blutplättchen induzieren (14; 32), was ihre Verwendung in der klinischen Praxis erschwert. Dementsprechend wird die Fc-GPVI-nt-Therapie wahrscheinlich mit einem geringeren Risiko für klinische Blutungen verbunden sein, verglichen mit anti-GPVI mAb-basierten Strategien.
  • Die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation an Stellen vaskulärer Verletzung ist entscheidend für die Hemostasis, kann aber zu arteriellem Verschluss im Zusammenhang mit Artherosklerose führen und Krankheiten wie beispielsweise Koronar-Thrombose und myokardialen Infarkt herbeiführen. Die Verwendung von intravenösen GPIIb-IIIa-Rezeptorinhibitoren hat signifikant den klinischen Erfolg von Patienten verbessert, welche einen Koronarstent-Behandlung durchmachen müssen (33-35). Allerdings wurde berichtet, dass schwere Blutungs-Komplikationen das Ergebnis von Patienten behindern, welche mit Abciximab behandelt worden waren (36): Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die Inhibierung von GPVI-Kollagen-Interaktionen durch Fc-GPVI-nt ausreichend war, um die Blutplättchen-Adhäsion sowohl in vitro als auch in vivo signifikant zu reduzieren, allerdings verlängerte die lösliche Form von GPVI die Schwanz-Blutungszeiten nur mäßig. Ähnlich wurden schwache Blutungsstörungen bei Patienten mit GPVI-defizienten Blutplättchen berichtet (37), was darauf hinweist, dass Koagulation und Hämostase, selbst in der vollständigen Abwesenheit von GPVI, effektiv sind. Teilweise kann diese Diskrepanz auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die Inhibierung oder Abwesenheit von GPVI nicht mit der Blutplättchen-Aggregation in Antwort auf andere Blutplättchen-Agonisten als Kollagen interferiert, z.B. ADP, Gewebefaktor („tissue factor") oder Thrombin. Im Gegensatz dazu blockiert die direkte Inhibierung von GPIIb-IIIa z.B. durch 7E3 oder seine humanisierten Derivate die Fibrinogenbindung an Blutplättchen, ein Prozess, welcher für die Blutplättchen-Aggregation essentiell ist und wesentlich die Blutplättchen-Aggregation an die meisten bis jetzt bekannten Blutplättchen-Agonisten abschwächt. Dementsprechend ist die Fc-GPVI-nt-Therapie, verglichen mit anti-GPIIb-IIIa-basierten Strategien, mit einem geringeren Risiko an klinischen Blutungen verbunden.
  • Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung den ersten in vivo-Beweis bereit, dass Fc-GPVI-nt die Blutplättchen-Adhäsion unter Flussbedingungen in vitro, und nach endothelialer Denudation in der Karotidarterie von Mäusen in vivo, abschwächt. Dies belegt weiterhin das Konzept, dass GPVI-Kollagen-Interaktionen eine zentrale Rolle in allen Hauptphasen der Thrombusbildung spielt, z.B. Blutplättchen-Tethering, stabile Adhäsion, und Aggregation an den Stellen der arteriellen Verletzung (z.B. während akuter Koronarsyndrome). Die vorliegende Erfindung belegt weiterhin das Konzept, dass GPVI eine Hauptrolle in dem Fortschreiten von Artherosklerose spielt. Ferner zeigt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal den kausalen Zusammenhang zwischen GPVI und Diabetes.
  • Die Erfindung wird nun in weiteren Einzelheiten beschrieben werden, Bezug nehmend auf die folgenden, spezifischen Beispiele.
  • BEISPIELE
  • Tiere.
  • Spezifische pathogen-freie C57BL6/J-Mäuse wurden von Charles River erhalten (Sulzfeld, Deutschland). Für die Experimente wurden 12 Wochen alte, männliche Mäuse verwendet. Alle experimentellen Arbeitsverfahren, welche an Tieren durchgeführt wurden, waren durch die deutsche Gesetzgebung über den Schutz von Tieren gebilligt.
  • Monoklonale Antikörper.
  • Monoklonale Antikörper (mAb) anti-GPVI (JAQ 1) und anti-GPIbα (p0p/B) und Fab-Fragmente von JAQ und p0p/B wurden wie beschrieben generiert (Bergmeier, W., Rackebrandt, K., Schroder, W., Zirngibl, H. & Nieswandt, B. Structural and functional characterization of the mouse von Willebrand factor receptor GPIb-IX with novel monoclonal antibodies. Blood 2000; 95, 886-893; Nieswandt, B., Bergmeier, W., Rackebrandt, K., Gessner, J.E. & Zierngibl, H. Identificatin of critical antigen-specific mechanism in the development of immune thrombocytopenic purpura in mice. Blood 2000; 96, 2520-2527). Nicht-relevantes Kontroll-Ratten-IgG wurde von Pharmingen (Hamburg, Deutschland) erhalten.
  • Generierung von GPVI-defizienten Mäusen
  • Um Mäuse zu generieren, denen GPVI fehlte, wurden C57BL6/J-Wildtyp-Mäusen 100 μg JAQ1 i.c. injiziert. Die Tiere wurden für die in vivo-Beurteilung der Blutplättchen-Adhäsion am 5. Tag nach der mAb-Injektion verwendet. Das Fehlen der GPVI-Expression auf Blutplättchen wurde durch Western-Blot-Analyse und Durchflusszytometrie verifiziert.
  • Durchflusszytometrie
  • Heparinisiertes Gesamtblut, erhalten von Wildtyp C57BL6/J-Mäusen oder GPVI-verminderten Mäusen wurde 1:30 mit modifiziertem Tyrodes-HEPES-Puffer (134 mM NaCl, 0,34 mM Na2HPO4, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 20 mM HEPES, 5 mM Glucose, und 1 mM MgCl2, pH 6,6) verdünnt. Die Proben wurden mit Fluorophor-markiertem mAb anti-GPVI (JAQ1) und anti-CD41 für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und direkt auf einem FACScanTM (Becton Dickinson) analysiert.
  • Klonieren, virale Expression und Reinigung von löslichem menschlichen- und Maus-GPVI.
  • Um eine lösliche Form von menschlichem GPVI zu generieren, wurde die extrazelluläre Domäne von menschlichem GPVI kloniert und, nach den vorliegenden Beispielen 1 bis 3, an die menschliche Immunglobulin Fc-Domäne fusioniert. Es wurden adenovirale Konstrukte kodierend für das GPVI-Fc-Fusionsprotein oder für Kontroll-Fc hergestellt, um das rekombinante Protein zu generieren. GPVI-Fc und Kontroll-Fc wurden als sekretierte lösliche Proteine exprimiert indem die menschliche HELA-Zelllinie verwendet wurde, um Fehlfaltungen und nicht-Glycosylierung der exprimierten Proteine zu verhindern.
  • Beispiel 1: Klonieren des Immunoadhesins von GP VI (Fc-GPVI-nt)
  • Wir generierten ein Immunoadhesin des GP VI-Rezeptors durch das Generieren eines rekombinanten Fusionsproteins von dem n-terminalen Teil von GP VI – welches die extrazelluläre Domäne von GPVI kodiert – zusammen mit dem Fc-Teil eines IgGs. Der Fc wurde aus einer menschlichen Herz-cDNA-Bibliothek (Clonetech, Palo Alto, CA) durch PCR unter Verwendung des Forwardprimers 5'-cgcggggcggccgcgagt-ccaaatcttgtgacaaaac-3' und des Reversprimers 5'gcgggaagctttcatttacccggagacagggag-3' amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde bei 58 °C Annealingtemperatur und 20 Zyklen mit dem Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Das PCR-Fragment wurde in das Plasmid pADTrack CMV mit NotI/HindIII kloniert und die Sequenz wurde durch Sequenzieren kontrolliert (MediGenomix, Martinsried, Deutschland).
  • Zum Klonieren der extrazellulären Domäne von menschlichem GPVI wurde RNA aus kulivierten Megakaryozyten isoliert (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Hilden, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers und eine reverse Transkription wurde durchgeführt (Omniscript RT Kit; Qiagen) mit 2 μg RNA bei 37 °C über Nacht. 100 ng der Reaktion wurde als Matrize bei einer PCR-Amplifikation des hGPVI mit dem Primer 5'-gcggggagatctaccaccatgtctccatccccgacc-3' und 5'-cgcggggcggccgccgttgcccttggtgtagtac-3' verwendet. Die PCR-Reaktion wurde bei 54 °C Annealingtemperatur und mit 24 Zyklen mit dem Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Das PCR-Fragment wurde in das Plasmid pDA Track CMV Fc mit BgIII/NotI kloniert und die Sequenz wurde durch Sequenzieren überprüft.
  • Konstruktion eines monomeren Fusionsproteins basierend auf Fc-GPVI-nt
  • Das Monomere Fc-Fragment wurde durch PCR unter Verwenden des Primerpaars 5'-cgcggggcggccgcccagcacctgaactcctg-3' und 5'-cgcggggatatctcatttacccggagacagggag-3' und pADTrack CMV gpVI-Fc als Matrize amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde bei 58 °C Annealingtemperatur und mit 20 Zyklen mit dem Expand High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Das Monomere Fc-PCR-Fragment (NotI/EcoRV) und das gpVI-Fragment aus pADTrack CMV gpVI-Fc (BgIII/NotI) wurden wie oben beschrieben kloniert.
  • Beispiel 2: Generierung des Adenoviruses für Fc-GPVI-nt (Ad-Fc-GPVI-nt)
  • Das Plasmid pADTrack CMV Fc-GPVI-nt wurde mit PmeI (New England Biolabs, Beverly, MA) über Nacht linearisiert, dephosphoryliert und gereinigt (GFX DNA and Gel Purification Kit; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Für die Rekombination wurden elektrokompetente E. coli BJ5183 (Stratagene, La Jolla, Kalifornien) kotransformiert mit 1 μg des linearisierten Plasmids und 0,1 μg pAdeasy1 bei 2.500 V, 200 Ω und 25 μFD (E. coli-pulser; Biorad, Heidelberg, Deutschland), ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Kolonien wurden nach Minipräparation der Plasmid-DNA mit PacI überprüft und die positiven Klone wurden in E. coli DH5α retransformiert.
  • Für die Transfektion (Effectene Transfection reagent; Qiagen, Hilden, Deutschland) von 293 Zellen wurde Plasmid-DNA mit PacI verdaut. Die Zellen wurden für 7 Tage kultiviert und durch Kratzen und Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde in Dulbecco's PBS resuspendiert und die Zellen wurden lysiert durch vier wiederholte Einfrier- (–80 °C) und Auftau- (37 °C) -Zyklen. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und das Lysat wurde bei –80 °C gelagert.
  • Für die Plaque-Selektion wurden rekombinante Virus-293-Zellen in Dulbeccos PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur, unter leichter Bewegung, mit verschiedenen Reihen-Verdünnungen von Lysaten der Transfektion, infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen mit Wachstumsmedium enthaltend 0,5 % Agarose (1:1-Mischung von modifiziertem Eagles-Medium 2 ×, Gibco Life Technologies #21935, ergänzt mit 20 % Serum, 2 × Penicillin/Streptomycin, 2 × L-Glutamin und Agarose in Wasser 1 %, Seacam) überschichtet. 5 bis 14 Tage nach der Infektion wurde die Zellschicht auf die Bildung von Plaques kontrolliert, welche dann unter Verwenden einer Pasteurpipette gepickt, in 0,5 ml Dulbeccos PBS resuspendiert und bei –80 °C gelagert wurden. Die Plaques wurden für weitere Amplifikationsrunden auf 293 Zellen verwendet.
  • Konstruktion eines menschlichen GPVI-Fc Monomers, welches stabil CHO exprimiert
  • Die das Monomer exprimierenden Zellen wurden in Übereinstimmung mit Beispiel 2 generiert.
  • Beispiel 3: Fc-GPVI-nt-Protein und Fc-Kontroll-Immunoadhesin Reinigung
  • Der Kulturüberstand von Ad-Fc-GPVI-nt-infizierten Helazellen wurden 2 Tage nach Infektion gesammelt, zentrifugiert (3.800 g, 30 min, 4 °C) und filtriert (0,45 um). Das Immunoadhesin wurde durch Hinzufügen von 1 Vol. Ammoniumsulfat präzipitiert (761 g/l) und über Nacht bei 4 °C gerührt. Die Proteine wurden durch Zentrifugation pelletiert (3.000 g, 30 min, 4 °C) in 0,1 Vol PBS gelöst und in PBS über Nacht bei 4 °C dialysiert. Die Proteinlösung wurde durch Zentrifugation geklärt (3.000 g, 30 min, 4 °C) und auf eine Protein A-Säule geladen (HiTrapTM protein A HP, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden). Die Säule wurde mit Bindepuffer gewaschen (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0; 0,02 % NaN3) bis zu einer OD280 < 0,01 und mit Elutionspuffer (100 mM Glycin pH 2,7) eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden mit Neutralisierungspuffer neutralisiert (1 M Tris/HCl pH 9,0; 0,02 % NaN3), vereinigt, in PBS über Nacht bei 4 °C dialysiert, aliquotiert und bei –20 °C eingefroren.
  • Die molekulare Masse des Fc-GPVI-nt-Proteins betrug unter reduzierenden Bedingungen in der SDS-PAGE ~80 kDa, wie durch Coomassie-Blau-Färbung oder durch Immunoblotten mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-menschlichem Fc-Antikörper oder durch anti-GPVI mAb 5C4 detektiert (1a, unteres und mittleres Bild). Im Gegensatz dazu wurde ein ~ 160 kDa Protein unter nicht-reduzierenden Bedingungen identifiziert (1a, unteres Bild) was die Auffassung unterstützt, dass GPVI-Fc nur als Dimer gewonnen wird (21).
  • Beispiel 4: GP VI-Inhibitor Screening Assay
  • ELISA-Platten (Immulon2 HB, Dynx Technologies, Chantilly, VA) wurden über Nacht bei 4 °C mit einem μg/Vertiefung Kollagen beschichtet (Typ I Rinder; BD Bioscience, Bedford, MA) in 100 μl 50 mM Tris/HCl pH 8,0. Die Platte wurde mit 250 μl/Vertiefung PBS/0,05 % Tween 20 (PBST) zwei Mal gewaschen und mit 250 μl/well Roti-Block (Roth, Karlsruhe, Deutschland) über Nacht blockiert. Die Platte wurde mit 250 μl/Vertiefung PBST zwei Mal gewaschen, 100 μl Fc-GPVI-nt in PBST wurde hinzugefügt (optimal 2 μg/Vertiefung) und die Platte wurde für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 5-fachem Waschen mit 250 μl PBST wurde 100 μl Peroxidase konjugierter Ziegenanti-menschlicher IgG-Antikörper (Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:10.000 hinzugefügt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach wiederholtem Waschen mit 250 μl PBST wurde 100 μl Detektionsreagenz (BM Blue POD Substrate, Roche, Mannheim, Deutschland) hinzugefügt und für 15 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von 100 μl 1 M H2SO4 gestoppt und die Platte wurde bei 450 nm gegen die Referenzwellenlänge 690 nm gemessen. Um nach potentiellen Inhibitoren zu screenen wurden Testverbindungen in 100 μl PBST in verschiedenen Konzentrationen zu der Inkubation hinzugefügt.
  • Beispiel 5: Blutplättchen-Aggregation und Luminometrie
  • Die Blutplättchen-Aggregation ex vivo und in vitro wurde durch optische Aggregometrie in citrierten Blutproben bei 37 °C beurteilt indem ein Zweikanal-Chronolog-Aggregometer (Nobis, Deutschland) verwendet wurde. Blutplättchen-reiches Plasma wurde aus citriertem Gesamtblut durch Zentrifugation hergestellt (200 g für 20 min). Die endgültige Blutplättchenanzahl wurde mit autologem Plasma auf 2 × 108 Blutplättchen/ml eingestellt. Nach Einstellung der Basislinie wurde Kollagen (Typ I, Rinder) von 0,2 bis 4 μg/ml hinzugefügt und die Aggregation wurde für 5 min aufgezeichnet. Gleichzeitig wurde die Freisetzung von ATP unter Verwenden der Firefly Luminometer Methode aufgezeichnet. Die Inkubation mit dem monoklonalen GP VI Antikörper JAQ 1 wurde für 15 min mit 50 μg/ml Antikörper durchgeführt.
  • Beispiel 6: in vitro-Blutplättchen-Adhäsionsassay für die GP VI/Kollagen-Interaktion
  • Aus ACD (20 % Endkonzentration) Blut wurde Blutplättchen-reiches Plasma hergestellt und auf eine Endkonzentration von 108 Blutplättchen/ml mit Hepes-Tyrode (pH 6,5) eingestellt. Objektträger wurden mit Einzelschichten von verschiedener adhäsiver Proteine (Kollagen, vWF) in unterschiedlichen Konzentrationen beschichtet. Perfusionsstudien wurden in einer Perfusionskammer, generiert aus Glasobjektträgern, durchgeführt. Die Perfusion wurde durchgeführt bei Scherraten von 500/s, was einen geringen/mittleren Fluss repräsentiert, und 2.000/s, was eine hohe Scherrate repräsentiert. Die Adhäsion wurde bei 37 °C für 20 Minuten gemessen und dann durch die Kammer gezogen, bei festgesetzten Wandscherraten für 5 Minuten, unter Benutzen einer automatischen Spritzenpumpe. Nach Perfusion wurden die Objektträger vorsichtig mit Hepes-Tyrode gewaschen, und aus der Kammer genommen. Die Objektträger wurden wiederholt mit Hepes-Tyrode gewaschen, um alle adhäsiven Blutplättchen vollständig zu entfernen. Die Blutplättchen in der Suspension wurden quantitativ durch FACS-Messungen analysiert. Die Analyse des funktionalen Status von Blutplättchen wurde weiterhin abgeschätzt durch die Analyse der Oberflächenmarker-Expression (CD 41; CD 61 und CD 62 P) nach dem Standard-Durchflusszytometrie-Protokoll.
  • Beispiel 7: Präparation von Blutplättchen für die intravitale Mikroskopie
  • Blutplättchen (Wildtyp, oder GPVI-defizient) wurden wie beschrieben aus Gesamtblut isoliert (Massberg, S. et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: the role of P-selectin. Blood 1998; 92, 507-515) und mit 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester (DCF) markiert. Die DCF-markierte Blutplättchen-Suspension wurde auf eine Enkonzentration von 200 × 106 Blutplättchen/250 μl eingestellt. Soweit angegeben, wurden die Fluoreszenz-Wildtyp-Blutplättchen mit 50 μg/ml anti-GPVI (JAQ1) Fab-Fragmenten oder anti-GPIbα (p0p/B) Fab-Fragmenten für 10 min vorinkubiert. Anschließend wurden die vorinkubierten Blutplättchen, zusammen mit den Fab-Fragmenten, Wildtyp-Rezipienten Mäusen eingeflößt und die Blutplättchen-Adhäsion wurde vor und nach der Karotidverletzung durch in vivo Videomikroskopie, wie unten beschrieben, abgeschätzt.
  • Beispiel 8: Beurteilung der Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation durch intravitale Mikroskopie.
  • Wildtyp C57BL6/J oder GPVI-defizienten Mäuse wurden anästhesiert durch eine intraperitoneale Injektion einer Lösung von Midazolam (5 mg/kg Körpergewicht, Ratiopharm, Ulm, Deutschland) Medetomidin (0,5 mg/kg Körpergewicht, Pfizer, Karlsruhe, Deutschland) und Fentanyl (0,05 mg/kg Körpergewicht, CuraMed Pharma GmbH, München, Deutschland). Polyethylenkatheter (Portex, Hythe, England) wurden in die rechte Jugularvene implantiert und fluoreszente Blutplättchen (200 × 106/250 μl) wurden intravenös eingeflößt. Die rechte Arteria carotis communis wurde frei präpariert und für 5 min heftig nahe der Karotisgabel abgebunden, um eine vaskuläre Verletzung zu induzieren. Vor und nach der vaskulären Verletzung wurden die fluoreszenten Blutplättchen in situ sichtbar gemacht durch in vivo Videomikroskopie der rechten Arteria carotis communis. Die Blutplättchen-Gefäßwand-Interaktionen wurden unter Verwendung eines Zeiss Axiotech Mikroskops (20 × Wasserimmersionsobjektiv, W 20 ×/0,5; Zeiss) überwacht mit einer 100 W HBO Quecksilberlampe zur Epi-Illumination. Alle aufgezeichneten Bilder wurden ausgewertet unter Verwenden eines computergestützten Bildanalyseprogramms (Cap Image 7,4; Dr. Zeintl, Heidelberg, Deutschland). Transient adherierte Blutplättchen wurden definiert als Zellen, welche ein imaginäres Lot durch das Gefäß mit einer Geschwindigkeit kreuzen, welche signifikant geringer ist als die Mittelachsengeschwindigkeit, ihre Anzahl ist als Zellen pro mm2 endotheliale Oberfläche angegeben. Die Anzahl von adherierten Blutplättchen wurde abgeschätzt durch Zählen der Zellen, welche sich nicht bewegten oder sich nicht innerhalb von 10 Sekunden von der endothelialen Oberfläche lösten. Die Anzahl von Blutplättchen-Aggregaten an den Stellen der vaskulären Verletzung wurde ebenso quantifiziert und ist in mm2 dargestellt.
  • Beispiel 9: Rasterelektronenmikroskopie.
  • Anschließend an die intravitale Videofluoreszenzmikroskopie wurde die Karotidarterie für 1 min mit PBS durchschwemmt (37 °C), gefolgt durch Perfusionsfixierung mit Phosphat-gepuffertem Glutaraldehyd (1 % Vol/Vol). Die Karotidarterie wurde herausgeschnitten, longitudinal geöffnet, und weiter fixiert durch Immersion für 12 Stunden in 1 % PBS-gepuffertem Glutaraldehyd, in Ethanol entwässert und durch kritische-Punkt-Trocknung mit CO2 aufgearbeitet. Anschließend wurden die Karotidarterien-Proben mit dem Lumen exponiert orientiert, mit Kohlenstofffarbe überdeckt, mit Platin spritzbeschichtet und unter Verwenden eines Feldemissions-Rasterelektronen-Mikroskops untersucht (JSM-6300F, Jeol Ltd., Tokyo, Japan).
  • Beispiel 10: Abschätzen von Fc-GPVI-nt-Binden an immobilisiertes Kollagen.
  • Das Binden von Fc-GPVI-nt an immobilisiertes Kollagen wurde bestimmt. ELISA-Platten (Immulon2 HB, Dynx Technologies, Chantilly, VA) wurden über Nacht bei 4 °C mit 1 μg Kollagen (Typ I Rind, BD Bioscience, Bedford, MA) in 100 μl Beschichtungspuffer (1,59 g/l Na2CO3, 2,93 g/l NaHCO3, 0,2 g/l NaN3, pH 9,6) überschichtet. Die Platten wurden mit 250 μl/Vertiefung PBS/0,05 % Tween 20 (PBST) zwei Mal gewaschen und mit 250 μl/Vertiefung Roti-Block (Roth, Karlsruhe, Deutschland) über Nacht geblockt. Die Platten wurden mit 250 μl/Vertiefung PBST zweifach gewaschen, dann wurde 3,0; 6,0; 12,5; 25,0; 50,0 oder 100 μg/ml Fc-GPVI-nt in PBST hinzugefügt und die Platte wurde für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Soweit angegeben wurde Fc-GPVI-nt (20 μg/ml) für 10 min mit löslichem Kollagen präinkubiert. Nach Inkubation wurden die Platten 5 Mal mit 250 μl PBST gewaschen und Peroxidase-konjugierter Ziegen-anti-Menschen-IgG-Antikörper Fcγ-Fragment-spezifisch (109-035-098; Dianova, Hamburg, Deutschland) wurde in einer Verdünnung von 1:10.000 hinzugefügt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 5-fachem Waschen mit 250 μl PBST wurde 100 μl Detektionsreagenz (BM Blue POD Substrat; Roche, Mannheim, Deutschland) hinzugefügt und bis zu 10 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von 100 μl 1 M H2SO4 gestoppt und die Platte wurde bei 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 690 nm gemessen.
  • Fc-GPVI-nt zeigte ein dosisabhängiges und gesättigtes Binden an immobilisiertes Kollagen (9b). Halbmaximales Kollagenbinden wurde bei einer Endkonzentration an Fc-GPVI-nt von 6,0 μg/ml beobachtet. Das Binden von GPVI-Fc trat nicht auf an BSA, vWF (9c, linkes Bild) oder Poly-L-Lysin (nicht gezeigt), was die Spezifität des Fc-GPVI-nt-Bindens unterstützt. Ferner detektierten wir kein signifikantes Binden des Kontroll-Fc-Proteins, welchem die externe GPVI-Domäne fehlte, unter identischen Bedingungen (9c, rechtes Bild).
  • Um die Spezifität des GPVI-Bindens weiter anzugehen, wurde die Fähigkeit von solubilisiertem, fibrillärem Kollagen getestet mit immobilisiertem Kollagen um die Assoziation mit Fc-GPVI-nt zu konkurrieren. Lösliches Kollagen inhibierte das Fc-GPVI-nt-Binden an inmmobilisiertes Kollagen in einer dosisabhängigen Weise (9d). Eine Konzentration von 100 μg/ml löslichem Kollagen wurde benötigt, um Fc-GPVI-nt-Binden um mehr als 50 % zu reduzieren. Zusammen deuten diese Daten an, dass Fc-GPVI-nt-Binden an Kollagen spezifisch ist und charakterisiert ist durch eine hohe Affinität.
  • Beispiel 11: Generierung von monoklonalem Antikörper gegen menschliches GPVI.
  • Monoklonale Antikörper wurden im Wesentlichen wie beschrieben generiert (17). Lou/C-Ratten wurden mit dem adenoviral-exprimierten menschlichen FC-GPVI-nt-Fusionsprotein immunisiert. Das Screening von Hybridoma-Überständen wurde in einem Fest-Phasen-Immunoassay durchgeführt indem Fc-GPVI-nt oder Fc verwendet wurde, dem die GPVI-Domäne fehlte. Das Screening identifizierte den Überstand von Hybridom SC4, welcher spezifisch an Fc-GPVI-nt band, aber nicht an Fc, welchem die externe GPVI-Domäne fehlte. Der Immunglobulintyp wurde bestimmt mit Ratten-IgG-Klassen (anti-IgM) und IgG Subklassen-spezifischen Maus-mAbs. Die monoklonalen Antikörper wurden unter Verwenden von Protein G-Sepharose-Säulen gereinigt. Die Antikörperspezifität von SC4 wurde verifiziert durch Immunoblotten gegen Fc-GPVI-nt und Kontroll-Fc. Der monoklonale SC4 Antikörper detektierte adenoviralexprimiertes Fc-GPVI-nt, aber nicht Kontroll-Fc. Ferner wurde menschliches GPVI in Lysaten wieder gefunden welche aus menschlichen Blutplättchen gewonnen worden waren. Weiterhin bindet SC4 spezifisch an die Oberfläche von Blutplättchen, nicht aber von Leukozyten oder roten Blutzellen, wie nachgewiesen, indem Durchflusszytometrie verwendet wurde (nicht gezeigt).
  • Beispiel 12: FACS-Messung der CD62 P-Externalisierung.
  • Menschliches Citratblut wurde von Freiwilligen gesammelt, Blutplättchen-reiches Plasma (PRP) wurde nach Zentrifugation und Wascharbeitsverfahren (PBS 1 ×; pH 7,2) mit 2.000 rpm bei 4 °C und Resuspendierung generiert. PRP gelöst in Färbepuffer (1 × PBS (ohne Ca2+ und Mg+) mit 0,5 % Natriumazid und 2 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM CaCl2) wurde mit Pferdekollagen Typ 1 (0; 2; 5 und 10 μg/ml; Nobis) in der Anwesenheit von Fc-GPVI-nt (100 μg/ml) oder equimolaren Konzentrationen an Kontroll-Fc inkubiert. Anti-CD 62P Antikörper, welche mit der Fluorophor-Peroxidase (Immunotech) markiert worden waren, wurden hinzugefügt. FACS-Messungen wurden an einem Becton Dickenson FACScalibur-Gerät durchgeführt.
  • Ansteigende Konzentrationen von Kollagen führten zur Blutplättchen-Absonderung aus alpha-Granula, angedeutet durch die CD 62P Externalisierung .Ko-Inkubation von Kollagen mit Fc-GPVI-nt bluntete die CD62P Externalisierung bestimmt durch FACS (10).
  • Beispiel 13: Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung.
  • PRP wurde generiert wie oben beschrieben. Die Aggregation wurde bestimmt in einem Gesamtblut-Aggregometer 500VS (Chrono-Log-Corporation). Die Blutplättchen-Anzahl aus PRP wurde mit Thyrodes-HEPES-Puffer (2,5 mmol/l HEPES, 150 mmol/l NaCl, 12 mmol/l NaHCO3, 2,5 mmol/l KCl, 1 mmol/l MgCl2, 2 mmol/l CaCl2, 5,5 mmol D-Glucose, 1 mg/ml BSA, pH 7,4) auf 1,0 × 108 Zellen/ml eingestellt. Chrono-Lume #395 (Chrono-Log Corporation) wurde für die ATP-Messung hinzugefügt. Agonisten wurden zu den Blutplättchen hinzugefügt, in das Aggregometer pipetiert, und die Aggregation wurde unter definierten Rührbedingungen gestartet. Die Aggregation wurde bestimmt durch eine Veränderung der Lichttransmission auf Grund der Koagulierung von Blutplättchen und an einen internen Standard normalisiert. Die ATP-Freisetzung wird bestimmt bei der charakteristischen Wellenlänge des Chrono-Lume für ATP und an einem internen Standard nach den Anweisungen des Herstellers normalisiert.
  • Die Blutplättchen-Aggregation und die ATP-Freisetzung wurden spezifisch inhibiert durch Fc-GPVI-nt für eine Kollagen-vermittelte Agonistenstimulation (11a & b). ADP- und Thrombin-vermittelte (TRAP 10 μM) Blutplättchen-Aggregation und ATP-Freisetzung waren durch Fc-GPVI-nt unbeeinflusst.
  • Beispiel 14: PDGF-Freisetzung aus menschlichen Blutplättchen.
  • PRP von menschlichen Freiwilligen wurde wie oben beschrieben hergestellt. PDGF-Freisetzung aus menschlichen Blutplättchen wurde mit einem Kit-System (R & D Systems # DHD00B) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die PDGF-Freisetzung wurde mit Kollagen Typ 1 (20 μg/ml; Nobis) unter Kontrollbedingungen und in der Anwesenheit von Fc-GPVI-nt (100 μg/ml) oder equimolaren Konzentrationen von Kontroll-Fc stimuliert. PDGF-Freisetzung ist normalisiert an die Standardprobe des Herstellers.
  • Die PDGF-Freisetzung als ein Indikator für die Freisetzung von endogenen Transmittern aus alpha-Granula von Blutplättchen wurde zudem nach Kollagen-Stimulierung gebluntet. (11c)
  • Beispiel 15: Effekt von Fc-GPVI-nt auf die Blutungszeit von menschlichem Gesamtblut in vitro.
  • Die in vitro-Blutungszeit wurde bestimmt mit einem PFA-100-Gerät (Dade-Behring). 800 μl menschliches Gesamtblut wurde in das PFA-100-Gerät injiziert. Die Blutungszeit wurde mit ADP/Kollagen- und Epinephrin/Kollagen-beschichteten Messzellen nach den Anweisungen des Herstellers gemessen.
  • Es gab keine signifikante Verlängerung der Blutungszeit in vitro (PFA-100-Gerät) bei ansteigenden Konzentrationen von Fc-GPVI-nt nach Stimulierungen mit unterschiedlichen Agonisten. Im Gegensatz dazu verlängerten die therapeutisch relevanten Konzentrationen von ReoPro die Blutungszeit in dem PFA-100-Gerät maximal (12)
  • Beispiel 16: Effekt von löslichem GPVI auf die Blutplättchen-Adhäsion an immobilisiertes Kollagen unter Fluss.
  • Menschliche Blutplättchen wurden aus ADC-antikoaguliertem Gesamtblut wie beschrieben isoliert (18). Gewaschene Blutplättchen wurden in Tyrodes-HEPES-Puffer resuspendiert (2,5 mmol/l HEPES, 150 mmol/l NaCl, 12 mmol/l NaHCO3, 2,5 mmol/l KCl, 1 mmol/l MgCl2, 2 mmol/l CaCl2, 5,5 mmol D-Glucose, 1 mg/ml BSA, pH 7,4) um eine Blutplättchen-Anzahl von 2 × 108 Zellen/ml zu erhalten. Die Adhäsion von Blutplättchen an Platten, welche mit immobilisiertem Kollagen überschichtet worden waren, wurde in einer Parallelplatten-Durchflusskammer in der Anwesenheit von 200 μg/ml Fc-GPVI-nt oder Kontroll-Fc bestimmt.
  • GPVI spielt eine äußerst wichtige Rolle in dem Prozess der Blutplättchen-Rekrutierung an immobilisiertes Kollagen in vitro (22). Wir bestimmten den Effekt von Fc-GPVI-nt auf die Adhäsion von menschlichen Blutplättchen an immobilisiertes Kollagen unter Scherbedingungen in vitro. Wie von anderen früher berichtet (23) adherierten Blutplättchen fest an immobilisiertes Kollagen bei beiden, geringen (500 sec–1) und hohen (1.000 sec–1) Scherraten und bildeten Thromben (13). Lösliches Fc-GPVI-nt, aber nicht Kontroll-Fc, dem die externe GPVI-Domäne fehlte, schwächte die Blutplättchen-Adhäsion an immobilisiertes Kollagen um 37 und 44 % signifikant ab bei Scherraten von 500 sec–1 bzw. 1.000 sec–1 (13). Die Inhibition war spezifisch, da Fc-GPVI-nt die Blutplättchen-Adhäsion an immobilisierten vWF nicht beeinflusste.
  • Beispiel 17. Bestimmung von Fc-GPVI-nt Plasmakonzentrationen
  • Wurde durchgeführt mit einem IMMUNO-TEK ELISA-System für die quantitative Bestimmung von menschlichem IgG (ZeptoMetrix Corporation; Cat #0801182). Spezifische Peroxidase-konjugierte Ziegen-anti-menschlichem IgG-Antikörper gegen den Fc-Teil des Fc-GPVI-nt werden verwendet (Dianova). Nach mehreren Waschschritten mit PBS-T nach den Angaben des Herstellers wird Peroxidasesubstrat (BM Blue POD, Roche) hinzugefügt und bei der charakteristischen 450 nm Wellenlänge in einem ELISA-Assay-Reader (Tecan Sunrise) gemessen. Die Fc-GPVI-nt-Konzentration wird durch Vergleich mit einem internen menschlichen IgG-Standard quantifiziert. Fc-GPVI-nt zeigte günstige in vivo-Pharmakokinetiken. Nach einzelner intraperitonealer Injektion in Mäusen waren nach 24 Stunden hohe Plasmalevel messbar und die Halbwertszeit des Fusionsproteins überschritt 96 Stunden (14a). Wiederholte intraperitoneale Injektion führte zur Blutakkumulation des Fusionsproteins (14b), was auf günstige Kinetiken für eine Langzeitanwendung bei der Behandlung von chronischen Krankheiten hinweist. Nach einer einzelnen intravenösen Injektion von Fc-GPVI-nt mit ansteigenden Dosen waren dosisabhängige Plasmakonzentrationen von Fc-GPVI-nt über 5 bis 60 Minuten bis zu 14 Stunden detektierbar (14c).
  • Beispiel 18: Herstellung von Mäuse-Blutplättchen für die intravitale Fluoreszenzmikroskopie.
  • Mäuse-Blutplättchen wurden aus Gesamtblut isoliert und mit 5-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester (DCF), wie früher beschrieben, markiert (19). Die DCF-markierte Blutplättchen-Suspension wurde auf eine Endkonzentration von 200 × 106 Blutplättchen/250 μl eingestellt. Die Adhäsion von Mäuse-Blutplättchen wurde vor und nach Karotidverletzung durch in vivo Videomikroskopie, wie unten beschrieben, beurteilt.
  • Beispiel 19: Karotidabbinden und Beurteilung der Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation durch intravitale Mikroskopie.
  • Die Blutplättchen-Rekrutierung nach endothelialer Denudation wurde, wie früher beschrieben durchgeführt (3). In Kürze, Wildtyp C57BL6/J-Mäuse wurden anästhesiert durch intraperitoneale Injektion einer Lösung von Midazolam (5 mg/kg Körpergewicht, Ratiopharm, Ulm, Deutschland), Medetomidin (0,5 mg/kg Körpergewicht, Pfizer, Karlsruhe, Deutschland) und Fentanyl (0,05 mg/kg Körpergewicht, CuraMed Pharma GmbH, München, Deutschland). Wo angegeben, wurde Fc-GPVI-nt (1 oder 2 mg/kg Körpergewicht) oder Kontroll-Fc in einer Menge equimolar zu 2 mg/kg Fc-GPVI-nt intravenös verabreicht. Danach wurde die endotheliale Denudation durch heftiges Abbinden nahe der Karotisgabel für 5 min induziert. Nach der Induktion der vaskulären Verletzung wurden fluoreszente Blutplättchen (200 × 106/250 μl) intravenös durch Polyethylen-Katheter (Portex, Hythe, England), welche in die rechte Jugularvene implantiert worden waren, eingeflößt. Die fluoreszenten Blutplättchen wurden in situ sichtbar gemacht durch in vivo Videomikroskopie der rechten Arteria carotis communis, indem ein Zeiss Axiotech Mikroskop (20 × Wasserimmersionsobjektiv, W 20 ×/0,5; Zeiss) mit einer 100 W HBO Quecksilberlampe zur Epi-Illumination verwendet wurde. Alle aufgezeichneten Bilder wurden ausgewertet unter Verwenden eines Computer-gestützten Bildanalyseprogramms (Cap Image 7.4, Dr. Zeintl, Heidelberg, Deutschland (19; 20)). Getetherte Blutplättchen wurden definiert als alle Zellen, die einen initialen Kontakt mit der Gefäßwand aufbauten, gefolgt durch langsame Oberflächen-Translokation (mit einer Geschwindigkeit signifikant geringer als die Mittelachsengeschwindigkeit) oder durch stabile Adhäsion; ihre Anzahlen sind als Zellen per mm2 endotheliale Oberfläche angegeben. Die Anzahl von adherierten Blutplättchen wurde abgeschätzt durch Zählen der Zellen, welche sich nicht bewegten oder sich innerhalb von 10 Sekunden von der endothelialen Oberfläche lösten. Die Anzahl von Blutplättchenaggregaten an der Stelle der vaskulären Verletzung wurde ebenso quantifiziert und ist in mm2 dargestellt. Ferner wurde der gesamte Thrombusbereich unter Verwenden von Cap Image 7.4 bestimmt.
  • Beispiel 20: Rasterelektronenmikroskopie.
  • Nach intravitaler Videofluoreszenzmikroskopie wurde die Karotidarterie mit PBS (37 °C) für 1 min in drei Tieren pro Gruppe durchschwemmt, gefolgt durch eine Perfusionsfixierung mit Phosphat-gepuffertem Glutaraldehyd (1 % Vol/Vol). Die Karotidarterie wurde ausgeschnitten, longitudinal geöffnet und weiter durch Immersion in 1 % PBS-gepuffertes Glutaraldehyd für 12 Stunden fixiert, in Ethanol entwässert und aufgearbeitet durch kritisches Punkttrocknen mit CO2. Anschließend wurden die Karotidarterienproben mit dem Lumen exponiert orientiert mit Karbonfarbe überschichtet und spritzbeschichtet mit Platin und begutachtet unter Verwendung eines Feldemissionsrasterelektronenmikroskops (JSM-6300F, Jeol Ltd., Tokyo, Japan).
  • Beispiel 21: Abschätzen des in vivo Fc-GPVI-nt-Bindens durch Immunohistochemie.
  • Karotidarterien, erhalten aus Mäusen, welche mit Fc-GPVI-nt behandelt worden waren, wurden schockgefroren und in Cryoblöcke (medite, Medizintechnik GmbH, Burgdorf, Deuschland) eingebettet. Das Binden von Fc-GPVI-nt an das Endothel und Subendothel wurde bestimmt auf 5 μm Cryostatschnitten, gefärbt mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-menschlichem IgG-Antikörper Fcγ-Fragment-spezifisch (109-035-098; Dianova, Hamburg, Deutschland). Karotidarterien, erhalten aus Fc-behandelten Mäusen, dienten als Kontrollen.
  • Beispiel 22: Effekt von löslichem GPVI auf Blutplättchen-Zahlen, Blutungszeit und Blutplättchen-Adhäsion in vivo.
  • Tiere wurden behandelt mit 2 mg/kg oder 4 mg/kg Fc-GPVI-nt oder equimolaren Dosen von Kontroll-Fc, dem die externe GPVI-Domäne fehlte. Infusion von Fc-GPVI-nt oder Kontroll-Fc, sogar bei den höchsten Dosen von 4 mg/kg hatte keine signifikanten Effekte auf die Zahlen der peripheralen Blutplättchen. Ferner induzierte das Fc-GPVI-nt-Fusionsprotein keine signifikante Verlängerung der Schwanzblutungszeiten, verglichen mit Kontrolltieren (15a). Die absoluten Blutungszeiten waren 1,9 ± 0,9 in PBS-behandelten Mäusen und 2,9 ± 1,9 min und 4,6 ± 0,6 min in Mäusen behandelt mit 2 mg/kg oder 4 mg/kg Fc-GPVI-nt. Im Gegensatz dazu waren die Blutungszeiten beträchtlich verlängert (42,6 ± 21,6) in Intregrilin-behandelten Tieren (0,2 mg pro kg IV).
  • Die Effekte von Fc-GPVI-nt auf die Blutplättchen-Rekrutierung in einem Mausmodell der Karotidverletzung kann studiert werden unter Verwenden der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie. Die Tiere wurden behandelt mit 1 mg/kg oder 2 mg/kg Fc-GPVI-nt oder einer equimolaren Menge an Kontroll-Fc, dem die externe GPVI-Domäne wie oben beschrieben fehlte. Nach Infusion von Fc-GPVI-nt oder Kontroll-Fc wurde die endotheliale Denudation der Maus Karotidarterie durch heftiges Abbinden induziert, wie vorher berichtet (3). Das Abbinden der Karotidarterie verursachte durchweg einen vollständigen Verlust der endothelialen Zellschicht. Die Blutplättchen-Adhäsion wurde direkt sichtbar gemacht und quantifiziert unter Verwenden von in vivo Fluoreszenzmikroskopie (19; 20) (15d). In Kontroll-(Fc-behandelten)-Mäusen waren zahllose Blutplättchen an die Gefäßwand innerhalb der ersten Minuten nach der endothelialen Denudation getethert (12,026 ± 1,115 getetherte Blutplättchen/mm2). Blutplättchen, die einen Kontakt mit dem Subendothel aufbauten, zeigten zunächst eine langsame Oberflächen-Translokation, welche häufig gefolgt ist durch anschließende stabile Blutplättchen-Adhäsion und Blutplättchen-Aggregation (5494 ± 874 adherierte Blutplättchen/mm2 und 114 ± 17 Blutplättchen-Thromben/mm2). Im Gegensatz dazu war in Gegenwart des Fc-GPVI-nt die Blutplättchen-Rekrutierung an der Stelle der vaskulären Verletzung dramatisch abgeschwächt. Das Blutplättchen-Tethering war um 65 und 71 % reduziert, verglichen mit Fc-behandelten Tieren, nach der Vorbehandlung mit 1 mg/kg oder 2 mg/kg Fc-GPVI-nt (P < 0,05 gegen Kontrolle). Gleichzeitig war die stabile Blutplättchen-Adhäsion in einer dosisabhängigen Weise reduziert (um 49 und 65 anschließend an das Verabreichen von 1 mg/kg bzw. 2 mg/kg Fc-GPVI-nt, P < 0,05 vs. Kontrolle). Ebenso war die Aggregation von adherierten Blutplättchen nahezu fehlend in Tieren, welche mit 2 mg/kg Fc-GPVI-nt-Fusionsprotein behandelt worden waren (P < 0,05 gegen Kontroll-Fc, 15b-d). Rasterelektronenmikroskopie zeigte auch deutlich, dass die Blutplättchen-Adhäsion und -Aggregation anschließend an endotheliale Denudation der Arteria carotis communis nahezu fehlend in Fc-GPVI-nt-behandelten, aber nicht in FC-vorbehandelten Mäusen war (15e). Um die Anwesenheit von Fc-GPVI-nt an den Stellen der Verletzung zu bestätigen, wurden die Karotidarterien ausgeschnitten im Anschluss an in vivo Mikroskopie und weiter für die Immunhistochemie aufgearbeitet unter Verwenden von Peroxidase-konjugierten Ziegen-anti-menschlichen IgG-Antikörpern. In Fc-GPVI-nt-behandelten Mäusen wurde Fc-GPVI-nt detektiert durch den luminalen Aspekt an der Stelle des vaskulären Schadens (15f). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass Fc-GPVI-nt spezifisch an Stellen vaskulärer Verletzung in vivo bindet und anschließende Blutplättchen-Rekrutierung verhindert.
  • Effekt von löslichem GPVI auf Atherosklerose.
  • 4 Wochen alte apoE-/-Mäuse (The Jackson Laboratory) verzehrten eine 0,25 % Cholesterol-Diät (Harlan Research diets) für 6 Wochen. Nach 2 Wochen wurden 4 apoE-/-Mäuse mit Fc-GPVI-nt 200 μg pro Maus zwei Mal wöchentlich injiziert bei andauernder Cholesterol-Diät. 4 apoE-/-Mäuse mit dem gleichen Protokoll wurden mit dem Kontroll-Fc-Protein (200 μg) zwei Mal wöchentlich gespritzt und dienten als Kontrollmäuse. Für die Beurteilung der Plaquebildung wurden die Tiere getötet und der vaskuläre Baum (vascular tree) wurde sorgfältig aus den Tieren entfernt. Die gesamten Präparate der Aorten und Karotiden wurden mit 0,9 % Natriumchlorid gespült und fixiert. Die gesamte vaskuläre Präparation wurde mit SUDAN III Rot gefärbt, um die Plaquebildung zu beurteilen und unter einem Mikroskop angesehen. Die Behandlung von zu Atherosklerose neigenden apoE-/-knockout-Mäusen mit Fc-GPVI-nt über 4 Wochen schwächte signifikant die Atheroprogression ab. (16).
  • Beispiel 23: FACS-Messung von CD61- und CD32-Oberflächenexpression auf Blutplättchen aus diabetischen Patienten.
  • Menschliches Citratblut wurde von 111 Patienten gesammelt, die an Diabetes litten, und von 363 nicht-diabetischen Patienten. Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde generiert nach Zentrifugation und Wascharbeitsverfahren (PBS 1 ×, pH 7,2) mit 2.000 rpm bei 4 °C und Resuspendierung. Anti-CD61- und anti-CD32-Antikörper, markiert mit dem Fluorophor Peroxidase (Immunotech) wurden hinzugefügt oder der monoklonale anti-GPVI-Antikörper 4C9 markiert mit FITC. FACS-Messung wurde durchgeführt an einem Becton Dickenson FACScalibur-Gerät. Die Oberflächenexpression wurde durch Fluoreszenz quantifiziert. Die Korrelation von CD32-Fluoreszenz und 4C9-Fluoreszenz wurde mit dem Korrelationskoeffizienten r = 0,516 kalkuliert.
  • Statistische Analyse.
  • Vergleiche zwischen Gruppenmittelwerten wurden durchgeführt unter Verwenden des Mann-Whitney Rank Sum Test. Die Daten bedeuten Mittelwert ± s.e.m.. Ein Wert von P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (35)

  1. Fusionsprotein, umfassend: (a) einen GPVI-Anteil ausgewählt aus einer extrazellulären Domäne von GPVI und einer Variante davon, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden; und (b) einen Fc-Anteil ausgewählt aus einer Fc-Domäne eines Immunglobulins und einer funktionsfähigen konservativen Variante davon, wobei der GBVI-Anteil und der Fc-Anteil durch einen Linker fusioniert sind, welcher durch die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg charakterisiert ist.
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Fc-Domäne davon eine IgG Fc-Domäne ist.
  3. Fusionsprotein nach Anspruch 1, welches charakterisiert ist durch die Aminosäuresequenz von 7.
  4. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die extrazelluläre Domäne von GPVI menschlich ist.
  5. Fusionsprotein nach einem beliebigen vorherigen Anspruch, wobei die Fc-Domäne menschlich ist.
  6. Fusionsprotein nach einem beliebigen vorherigen Anspruch, wobei der funktionsfähige konservative Bestandteil der Fc-Domäne funktionsfähig ist, dem Fusionsprotein zu ermöglichen, von einer Zelle sekretiert zu werden in einer Form, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden.
  7. Fusionsprotein nach einem beliebigen vorherigen Anspruch, welches an einer oder mehreren Aminosäuren glycosyliert ist.
  8. Fusionsprotein nach einem beliebigen vorherigen Anspruch, welches ein homodimeres Fusionsprotein ist.
  9. Fusionsprotein nach Anspruch 8, wobei die zwei Monomere kovalent verbunden sind.
  10. Fusionsprotein nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, welches fluoreszenzmarkiert ist.
  11. Nukleinsäuresequenz umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (a) die Nukleinsäure von 8 oder eine Variante davon, welche für das gleiche Polypeptid gemäß der Degeneration des genetischen Codes kodiert; (b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid, welches mindestens 70 % Sequenzhomologie zu dem Polypeptid kodiert durch 8 aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, umfassend von seinem N-Terminus zu seinem C-Terminus eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder eine Variante davon, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden, einen Linker mit der Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg und eine Fc-Domäne oder eine funktionsfähige konservative Variante davon, welche funktionsfähig ist, einem Protein, kodiert durch die Nukleinsäure, zu ermöglichen, von einer Zelle sekretiert zu werden in einer Form, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden; und (c) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid von mindestens 300 Aminosäuren und aufweisend, in der 5'- zu 3'-Richtung, ein erstes Segment kodierend für mindestens 100 Aminosäuren, umfassend eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder eine Variante davon, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden, ein zweites Segment, welches für die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg kodiert und ein drittes Segment, welches für mindestens 200 Aminosäuren kodiert, welches funktionsfähig ist, als eine Fc-Domäne welche einem Protein, kodiert durch die Nukleinsäure, ermöglicht, von einer Zelle sekretiert zu werden, in einer Form, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden.
  12. Nukleinsäure nach Anspruch 11, welche durch die Sequenz von 8 charakterisiert ist.
  13. Nukleinsäure nach Anspruch 11 b oder Anspruch 11 c, wobei Basen an den Positionen entsprechend den Basen 1 bis 807 von 8 für die extrazelluläre Domäne von GPVI kodieren.
  14. Nukleinsäure nach Anspruch 11 b oder Anspruch 11 c, wobei Basen an den Positionen entsprechend den Basen 817 bis 1515 von 8 für die Fc-Domäne eines IgG-Immunglobulins kodieren.
  15. Protein kodiert durch die Nukleinsäure nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14.
  16. Anti-atherosklerotisches Mittel für die Behandlung oder Prävention von Atherosklerose enthaltend zwei Polypeptidketten kodiert durch die Nukleinsäure eines beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, wobei jede eine Scharnierregion verbunden mit der Scharnierregion der anderen durch Interketten-Disulfidbrücken aufweist.
  17. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14.
  18. Zelle, exprimierend ein Fusionsprotein nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7 oder ein homodimeres Fusionsprotein nach Anspruch 8 oder Anspruch 9.
  19. Homodimere Fusionsprotein nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 zur Verwendung als ein Arzneimittel.
  20. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Immunoadhesin, welches ein homodimeres Fusionsprotein ist, umfassend eine extrazelluläre Domäne von GPVI oder eine Variante davon, welche funktionsfähig ist, an Kollagen zu binden, wobei die extrazelluläre Domäne oder Variante davon und die Fc-Domäne oder funktionsfähige konservative Bestandteil davon durch einen Linker fusioniert sind, wobei dieser Linker charakterisiert ist durch die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Arg.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Immunoadhäsin ein Homodimer des Polypeptids von 7 ist.
  22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, welche eine intravenöse Zubereitung ist.
  23. Verwendung eines homodimeren Fusionsproteins nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder eines Proteins nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Atherosklerose in einem Patienten.
  24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei das Medikament für die Prävention von Atheroprogression ist.
  25. Verwendung eines homodimeren Fusionsproteins nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder eines Proteins nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, für die Herstellung eines Medikaments für die Prävention von intraarterieller Thrombose in einem Patienten.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei der Patient an akutem Coronar- oder Carotidsyndrom leidet und aktive intraarterielle Läsionen aufweist.
  27. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 23 bis 26, wobei das Medikament für die Behandlung von atherosklerotischen Komplikationen von Diabetes ist.
  28. Verwendung eines homodimeren Fusionsproteins nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, oder eines Proteins nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention von myocardialem Infarkt und/oder cerebralem Schlaganfall.
  29. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 23 bis 28, wobei das Medikament für die orale, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Verabreichung ist.
  30. Verwendung nach einem beliebigen der Ansprüche 23 bis 29, wobei das Medikament in einer Dosierungsform zum Liefern von 0,5 bis 6,0 mg/kg des Fusionsproteins ist.
  31. Verwendung eines homodimeren Fusionsproteins nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder eines Proteins nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, für das Screening nach Inhibitoren von GPVI-Bindung an Kollagen in vitro.
  32. Verwendung nach Anspruch 31, wobei das homodimere Fusionsprotein fluoreszenzmarkiert ist.
  33. Verfahren eines in vitro-Screenings nach Inhibitoren der Bindung von Glycoprotein VI an Kollagen, umfassend: (i) Bereitstellen einer Oberfläche, welche Kollagen exponiert; (ii) Kontaktieren eines Anteils der Oberfläche mit dem Fusionsprotein von Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder einem Protein nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, unter vorherbestimmten Bedingungen, welche die Bindung des Fusionsproteins an die Oberfläche erlauben; (iii) in Kontakt bringen eines anderen Anteils der Oberfläche mit diesem Fusionsprotein in Anwesenheit einer Testverbindung unter Bedingungen wie in Schritt (ii); (iv) Bestimmen der Menge des Fusionsproteins, welches an die Oberfläche in der Abwesenheit und in der Anwesenheit der Testverbindung gebunden ist; (v) Identifizieren einer Testverbindung als Inhibitor, falls das Binden des Fusionsproteins an die Oberfläche vermindert ist in der Anwesenheit der Testverbindung verglichen mit der Abwesenheit der Testverbindung; und (vi) gegebenenfalls Bestimmen des funktionalen Effekts des Inhibitors auf Blutplättchen-Aggregation und/oder Blutplättchen-Aktivierung.
  34. Verwendung eines homodimeren Fusionsproteins nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder eines Proteins nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, für ein in vitro-Screening für Inhibitoren von GPVI-vermittelter Adhäsion von Blutplättchen an aktive intravaskuläre Läsionen.
  35. Verfahren zum Erzeugen eines monoklonalen Antikörpers von einem nicht-menschlichen Säuger, umfassend Verwenden eines homodimeren Fusionsproteins nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder eines Proteins nach Anspruch 15, wenn in homodimerer Form, als ein Immunogen.
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