CN107428818A - 隐藏多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本申请表征了(除其它方面之外)包括隐藏多肽、其功能性片段、或前述任一种的变体的多肽。本申请还表征了编码所述多肽的核酸、制备所述多肽的方法、以及使用所述多肽的各种诊断和治疗应用。例如所述多肽可以用于治疗患有骨流失相关症状的受试者。

Description

隐藏多肽及其用途

相关申请

本申请要求2015年1月29日提交的美国临时申请No.62/109,376的优先权，其通过引用整体并入本文。

背景介绍

骨流失是绝经后妇女最常被诊断出的严重临床问题，但可能发生在所有年龄的所有人群中(Marx(2004)Science 305:1420-1422和Lotinun等，(2012)Curr Mol Pharmacol5:195-204)。例如癌症、糖尿病、炎症性肠病以及炎性疾病等疾病需要类固醇治疗，这会抑制骨形成并导致骨折风险增加。骨流失相关的骨折是导致老年人住院、残疾和过早死亡的主要原因，影响了超过200万美国人，导致了每年50万人住院，以及每年18万人被安置在疗养院(Dempster(2011)Am J Manag Care 17(Suppl 6):S164-S169和Dawson-Hughes等，(2012)Osteoporos Int 23:811-820)。在2005年，美国与骨质疏松性骨折相关的医疗费用达近170亿美元，估计在20年内将累计超过474亿美元(Blume和Curtis(2011)OsteoporoInt 22:1835-1844)。除了增加骨折风险外，骨骼还具有广泛的生理功能，因此骨流失可能直接影响葡萄糖和胰岛素代谢、器官和血管修复以及免疫系统功能(Ferron等(2010)Cell142:296-308；Clemens和Karsenty，(2011)J Bone Miner Res 26:677-680；Cappariello等，(2014)Arch Biochem Biophys 558:70-78；以及Charles和Nakamura(2014)CurrOsteoporos Rep 12:1-8)。

由于问题的严重性，生物技术和制药公司已经在探索缓解、停止或逆转骨质流失的治疗方法。令人遗憾的是，只有一类已批准的药物可以恢复骨量，而且所有经批准的药物都有重大的局限性和副作用，影响其功效和长期施用。因此，仍然迫切需要具有良好耐受性和有效地刺激骨形成以恢复骨量的新型治疗剂。

发明概要

本申请至少部分地基于发现隐藏蛋白可以结合激活素A和激活素B，不仅可以抑制激活素A和B与其同源细胞受体结合的能力，而且通过这些受体抑制了信号传导。已经显示对激活素A的抑制可以促进体内的骨形成，因此，隐藏蛋白和包含隐藏蛋白(或其变体和功能片段)的多肽可用于增加骨形成、骨量、骨密度、骨强度等多种治疗应用。例如本文所述的多肽可用于治疗患有与骨流失相关的病症的受试者，例如骨质疏松症或佩吉特氏病。此外，发明人已经确定，当隐藏蛋白以高亲和力与激活素A结合时，隐藏蛋白以较低亲和力与转化生长因子β超家族蛋白GDF-11或肌生成抑制素(GDF-8)结合(表1)。已显示体内抑制肌生长抑制素信号会增加肌肉量，而抑制GDF-11会促进红细胞生成。因此，虽然本公开不受任何特定理论或作用机制的束缚，但是本文所述的隐藏多肽可用于治疗骨骼疾病，并且与其它激活素A抑制剂(例如，可溶性激活素RIIA和激活素RIIB分子)相比，其对肌肉生长和/或红细胞生成具有减少的继发效应(或无继发效应)。

因此，一方面，本发明表征了包含隐藏蛋白、其功能片段或其变体的多肽。在一些实施方案中，隐藏蛋白是哺乳动物蛋白(或衍生自哺乳动物隐藏蛋白的功能片段或变体)。在一些实施方案中，隐藏蛋白是人蛋白(或衍生自人隐藏蛋白的功能性片段或变体)。另一方面，本发明表征了一种多肽，其包含：(i)SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所示的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所述的氨基酸序列的变体，所述氨基酸序列具有不超过40个(例如，不超过39个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸的取代、缺失或插入，或任何前述的组合；或(iii)与SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所示氨基酸序列至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或99％)相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:7、8或9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:4-9中任一项所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或99％)相同。

在一些实施方案中，所述多肽与人激活素A结合的K_D低于1x 10^-9M、低于1x 10^-10M、低于1x 10^-11M、或低于1x 10^-12M。在一些实施方案中，所述多肽以约200皮摩尔至约1皮摩尔(例如，约200皮摩尔至约100皮摩尔，约100皮摩尔至约50皮摩尔之间，约50皮摩尔至约1皮摩尔之间，约150皮摩尔至约1皮摩尔之间)的K_D与人激活素A结合。在一些实施方案中，所述多肽以约500皮摩尔至约50皮摩尔的K_D与人激活素A结合。

在一些实施方案中，所述多肽在体外具有野生型人隐藏蛋白的至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％)的抑制人激活素A依赖性细胞信号传导的能力。在一些实施方案中，所述多肽与野生型人隐藏蛋白相比对人激活素A具有较高的亲和力，或者以更高程度抑制激活素A(例如，以作为与IgG1Fc的融合蛋白的一部分进行测定)。

在一些实施方案中，所述多肽以小于1×10^-9M或小于或等于5×10^-10M的K_D结合人激活素B。在一些实施方案中，所述多肽以约500皮摩尔至约1纳摩尔(例如，约300皮摩尔至约1纳摩尔，约200皮摩尔至约700皮摩尔，或约250皮摩尔至约800皮摩尔)的K_D结合人激活素B。

在一些实施方案中，所述多肽在体外具有野生型人隐藏蛋白的至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％)的抑制人激活素B依赖性细胞信号传导的能力。在一些实施方案中，所述多肽与野生型人隐藏蛋白相比对人激活素B具有较高的亲和力，或者以高程度抑制激活素B(例如，以作为与IgG1Fc的融合蛋白的一部分进行测定)。

在一些实施方案中，所述多肽包含增加受试者中多肽的血清半衰期的异源部分。在一些实施方案中，异源部分可以包含白蛋白的全部或部分。在一些实施方案中，异源部分包含免疫球蛋白Fc恒定区(例如，SEQ ID NO:17或21)。例如，在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1、2、19或20所示的氨基酸序列和Fc恒定区的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:17或21)。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:4至9中任一项所示的氨基酸序列和Fc恒定区的氨基酸序列。

在一些实施方案中，接头(例如，一个或多个氨基酸)可以将所述隐藏蛋白、其变体或功能片段与所述异源部分分隔。在一些实施方案中，所述接头可以具有SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，如下所述，所述接头可以含有蛋白酶切割位点(例如，TEV蛋白酶的切割位点)。

在一些实施方案中，所述多肽不包括接头序列。

在一些实施方案中，所述多肽是融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述异源部分包含聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，所述多肽包含将所述多肽靶向骨的异源部分。将多肽靶向骨的异源部分可以包括例如以下式：X_n，其中X是在生理pH下具有负电荷的标准或非标准氨基酸，且n为1至40的整数。X可以是，例如，天门冬氨酸或谷氨酸。n可以是1至30之间的整数，例如10至16、2至20、1至20、5至20、3至20、5至15、10至15、10至20、10至30、10至25或10至30之间的整数。在一些实施方案中，n为至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些实施方案中，n小于25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10。

在一些实施方案中，异源部分是可检测标记。

在一些实施方案中，所述多肽可以是单体。在一些实施方案中，当存在第二拷贝的所述多肽的情况下，所述多肽可以形成二聚体或多聚体。例如，在多肽是融合蛋白的实施方案中，所述融合蛋白包含与IgG Fc区融合的隐藏多肽的全部或部分，所述多肽可通过Fc区二聚化。在一些实施方案中，所述多肽包含二聚化或多聚化结构域，例如Fc区或任何其它能够二聚化的多肽(或其功能部分)。

在另一方面，本发明表征了包含本文所述的任何一种或多种多肽、药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物。

在另一方面，本发明表征了包含本文所述的一种或多种多肽的预填充注射器。

在另一方面，本发明表征了一种试剂盒，其包含本文所述的一种或多种多肽的药物单位剂型、用于向受试者施用所述一种或多种多肽的方式，以及任选的给药说明(例如，自我给药说明)。

在另一方面，本公开表征了包含编码本文所述的任一种多肽的核苷酸的核酸。本公开还表征了包含所述核酸的载体，例如表达载体。

在另一方面，本发明表征了包含载体或表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞(例如，酵母，昆虫，哺乳动物或植物)或原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是啮齿动物细胞(CHO细胞)或非人灵长类细胞(COS细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是NS0细胞。

在另一方面，本公开表征了一种用于产生多肽的方法。该方法包括在适于表达由核酸编码的多肽的条件下培养宿主细胞(上述)，从而制备多肽。该方法还可以包括从宿主细胞或培养宿主细胞的培养基中分离多肽。本文还表征了使用这种方法制备的多肽。

在另一方面，本公开表征了本文所述的任何一种多肽用于治疗与骨流失、缺乏适当的骨生长、缺乏骨密度、缺乏骨强度等相关的病症的用途。在一些实施方案中，多肽对肌肉生长和/或红细胞生成的继发作用降低或可忽略(例如，使用治疗水平的多肽治疗与骨流失相关的病症不明显增加肌肉量)。本公开还表征了本文所述的任何一种或多种多肽用于提高受试者(例如，人)中骨生长、骨强度或骨密度的用途。

在另一方面，本公开表征了用于提高受试者(例如，人)的骨生长、骨强度或骨密度的方法。该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的任何一种多肽，所述多肽的量足以提高受试者的骨生长、骨强度或骨密度。受试者可以具有与骨流失相关的病症，例如骨质疏松症、佩吉特氏病、类风湿性关节炎、牙周病(例如，牙龈炎或牙周炎)、骨折、骨缺损、转移性骨病、骨关节炎、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进或溶骨性骨病。该病症也可以是本文所述或本领域已知的那些中的任何一种。

在本文所述的任何方法或用途的一些实施方案中，在施用后，组合物改善骨参数，骨参数例如选自由以下组成的组：骨体积密度、总骨表面、骨表面密度、骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁间距和总体积。在一些实施方案中，本文所述的任何方法和用途可以进一步包括监测受试者在多个骨参数中任何一个的改善，例如：骨体积密度、总骨表面、骨表面密度、骨小梁数、骨小梁厚度、骨小梁间距或总体积。

在治疗骨疾病的一些实施方案中，将聚集于骨的多肽(例如，具有骨靶向部分)施用于受试者。

在一些实施方案中，将多肽静脉内施用于受试者。在一些实施方案中，将多肽皮下施用于受试者。

在本文所述的任何方法或用途的一些实施方案中，受试者是接受另一种针对与骨流失相关病症的治疗失败后的受试者。治疗可以是双膦酸盐或另一种激活素A抑制剂(例如，激活素RIIA-IgG Fc融合体或激活素RIIB-IgG Fc融合体)。

在一些实施方案中，本文所述的任何方法或用途还可包括向受试者施用至少一种另外的促进骨生长或抑制骨吸收的治疗剂。

在另一方面，本公开表征了一种用于增加有需要的受试者肌肉量或肌肉力量的方法，该方法包括给予受试者一种或多种本文所述的多肽，所述多肽的量足以在受试者中提高肌肉量或肌肉力量。在一些实施方案中，受试者患有肌肉紊乱症状(例如，肌肉消耗症)。

在另一方面，本公开表征了一种用于治疗患有肌肉消耗性疾病或肌肉萎缩症的受试者的方法。该方法包括以向受试者施用本文所述的任何一种或多种多肽，所述多肽的量足以治疗肌肉消耗性疾病或肌肉萎缩症。

在一些实施方案中，肌肉消耗性症状为杜氏肌营养不良症(DMD)、多种类型的肢带型肌营养不良(LGMD)、其它先天性肌营养不良(CMD)、肌肉减少症、癌症恶病质或糖尿病，或与上述相关。

在另一方面，本发明表征了一种用于治疗受试者的肌肉骨骼疾病的方法。该方法包括给予受试者任何一种或多种本文所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述肌肉骨骼疾病。在一些实施方案中，肌肉骨骼疾病是骨质疏松症、骨质减少症、肌肉减少症、关节炎、组织萎缩、牙周病、伤口愈合或由于例如恶性肿瘤、内分泌失调、关节炎、不动或废用导致的骨流失。

在另一方面，本公开表征了一种治疗代谢病症的方法，该方法包括给予受试者任何一种或多种本文所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述代谢性疾病。代谢疾病可以是例如2型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、高血糖症和肥胖症。

在另一方面，本发明表征了一种治疗患有免疫病症(例如，炎性疾病或自身免疫性疾病)的受试者的方法。该方法包括给予受试者任何一种或多种本文所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述免疫病症。在一些实施方案中，免疫疾病是与异常宿主防御反应相关的疾病。在一些实施方案中，免疫疾病可以是，例如：(a)由感染、有毒物质或创伤造成的组织急性损伤、手术后的伤口愈合、严重的烧伤或其它组织损伤、脑膜炎、阑尾炎、肾小管坏死、创伤性脑损伤和脓毒症；(b)自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病、血管炎、抗磷脂综合征、硬皮病、系统性红斑狼疮和骨关节炎；(c)呼吸系统疾病，包括但不限于肺炎、结节病、闭塞性细支气管炎、肺动脉高压、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、对感染性试剂(如，致病性病毒)的急性反应，所述感染性试剂包括但不限于甲型流感病毒H5N1和H1N1、冠状病毒SARS和人类鼻病毒C和D。

在另一方面，本公开表征了治疗患有癌症的受试者的方法。该方法包括给予受试者任何一种或多种本文所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述癌症。在一些实施方案中，癌症包括表达激活素A或激活素B的一种或多种受体的癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞的增殖和/或活力由激活素A或激活素B正向调节。在一些实施方案中，本文所述的方法可包括请求测试结果以确定癌症的癌细胞是否表达一种或多种受体或对激活素A或激活素B有应答。在一些实施方案中，所述方法可包括进行测试以确定癌症的癌细胞是否表达一种或多种受体或对激活素A或激活素B有应答。

在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神经组织癌、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。

在另一方面，本公开表征了本文所述的任何一种多肽用于治疗患有肌肉萎缩、肌肉消耗性疾病、代谢疾病(例如，本文所述的任何一种)、免疫疾病或肌肉骨骼疾病的受试者(例如，人)的用途。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且意指任何肽连接的氨基酸链，而无论长度或是否有翻译后修饰。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。优选的方法和材料如下所述，尽管与本文所述相似或相当的方法和材料也可用于本发明公开的方法和组合物的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。

本公开的其它特征和优点，例如用于治疗与骨流失相关的病症的方法将通过以下描述、实施例和权利要求清楚展现。

序列简要说明

SEQ ID NO:1描述了人隐藏蛋白的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:2描述了没有其信号肽序列的人隐藏蛋白的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:3描述了没有其信号肽的序列或C末端GPI锚定序列的人隐藏蛋白的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:4描述了人隐藏蛋白的低同源性结构域的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:5描述了人隐藏蛋白的表皮生长因子(EGF)结构域的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:6描述了人隐藏蛋白的Cripto-FRL-1-Cryptic(CFC)结构域的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:7描述了人隐藏蛋白多肽的片段的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:8描述了含有EGF和CFC结构域的人隐藏蛋白片段的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:9描述了人隐藏蛋白多肽的片段的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:10描述了本文所述的示例性融合多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11描述了在恒河猴中表达的隐藏蛋白多肽的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:12描述了在小鼠中表达的隐藏蛋白多肽的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:13描述了人抑制素β的A链的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:14描述了FLAG表位标签的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:15描述了多组氨酸表位标签的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:16描述了流感血凝素表位标签的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:17描述了人IgG Fc恒定区的示例性氨基酸序列。

SEQ ID NO:18描述了示例性连接肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19和20描述了人隐藏蛋白的示例性片段的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21描述了人IgG1Fc区的氨基酸序列。

SEQ ID NO:22描述了示例性隐藏蛋白-Fc融合蛋白的氨基酸序列。

附图说明

图1由三个图组成：(A)栏、(B)栏和(C)栏，其描绘构建体设计和融合蛋白纯化。在A栏中，显示了人和小鼠隐藏蛋白和Cripto-1的多重序列比对。两个分子都具有用于分泌的信号肽(未在比对中显示)、低同源性结构域(teal)、EGF样结构域(橙色)、CFC结构域(灰色)和GPI信号肽(由紫框表示)。Cripto-1GPI信号肽在Ser169(黄框中的残基)后被切除。灵长类动物起源的隐藏蛋白具有大的非规范GPI信号肽，其GPI修饰的氨基酸是未知的。对于表达构建体，将Cripto-1和隐藏蛋白在“FC-融合位点”(浅蓝色)处截短。B栏描绘了隐藏蛋白和Cripto-1构建体的结构域组成，其颜色如A中显示。两个分子在“FC-融合位点”通过22个氨基酸的接头与人Igg1-Fc融合。图1的C栏与CHO细胞中表达的隐藏蛋白-Fc和Cripto-1-Fc有关。两个分子在尺寸排阻色谱柱中作为单一的、明确的峰迁移。每种蛋白质的分子量对应于二聚体种类。非还原和还原SDS-PAGE凝胶分别显示二硫键连接的二聚体种类和还原的单体种类。通过Fc区中的半胱氨酸发生二聚化。

图2描述了配体结合实验的结果，图2由A栏至F栏组成：(A)激活素A与隐藏蛋白的结合；(B)激活素B与隐藏蛋白的结合；(C)GDF-8与隐藏蛋白的结合；和(D)GDF-11与隐藏蛋白的结合。(A-D)将隐藏蛋白-Fc固定在传感器芯片上，注入所示的各种浓度的配体。动力学分析的曲线拟合显示为橙色线。E栏描绘了配体与隐藏蛋白结合的叠加。F栏描绘了配体结合Cripto-1的叠加。(E-F)隐藏蛋白-Fc和Cripto-1-Fc被捕获在传感器芯片上，所示的所有配体以80nM的浓度注射。经测试的配体包括激活素A、激活素B、GDF-8、GDF-11、Nodal、BMP-9、BMP-2、BMP-4、TGFβ-1、GDF-1、GDF-3。商业购买的Nodal、GDF-11和GDF-3是通过从大肠杆菌重折叠而产生的，并且可能不能充分发挥作用。例如，Nodal显示了很大的批次差异。

图3描述了受体相互作用实验的结果，由A、B、C和D栏组成。A栏描绘了隐藏蛋白与TGF-β家族受体的结合。I型受体ALK4-Fc和ALK5-Fc以及II型受体ACTRIIA-Fc、ACTRIIB-Fc、BMPRII-Fc和TGF-βRII-Fc在传感器芯片上被捕获。以20μM的浓度注射不含Fc的隐藏蛋白。图B描绘了激活素A与ALK4的结合。在传感器芯片上捕获ALK4-Fc，注射所示的不同浓度的激活素A。动力学分析的曲线拟合显示为橙色线。C栏描绘了激活素A/隐藏蛋白复合物与ALK4的结合。将ALK4-Fc捕获在传感器芯片上，并注射10nM与不含Fc的隐藏蛋白(0-40nM)一起预孵育的激活素A。当结合隐藏蛋白时的反应单位的增加是由激活素A-隐藏蛋白复合物的较高分子量引起的。饱和度仅依赖于激活素A的浓度。D栏描绘了激活素A/隐藏蛋白复合物与ALK4的结合。将ALK4-Fc捕获在传感器芯片上，并注入所示的不同浓度的与恒定量的不含Fc的隐藏蛋白(400nM)一起预孵育的激活素A。

图4描述了竞争性抑制研究的结果，并由A栏至H栏组成。A栏描绘了隐藏蛋白对激活素A与ACTRIIA的结合的抑制。B栏描述了隐藏蛋白对激活素A与ACTRIIB的结合的抑制。(A-B)ACTRIIA-Fc或ACTRIIB-Fc被捕获在传感器芯片上，并且注入1nM的激活素A，其用0nM、0.5nM、5nM、10nM或40nM不含Fc的隐藏蛋白预孵育。C栏描绘了隐藏蛋白对激活素B与ACTRIIA的结合的抑制。D栏描绘了隐藏蛋白对激活素B与ACTRIIB的结合的抑制。E栏描绘了隐藏蛋白对GDF-8与ACTRIIA结合的抑制。F栏描绘了隐藏蛋白对GDF-8与ACTRIIB结合的抑制。(C-F)ACTRIIA-Fc或ACTRIIB-Fc被捕获在传感器芯片上，并注射10nM激活素B或GDF-8，其与0nM、5nM、50nM、100nM、400nM、800nM或1600nM不含Fc的隐藏蛋白预孵育。G栏描绘了隐藏蛋白对激活素B与BMPRII结合的抑制作用。BMPRII-Fc被捕获在传感器芯片上，并且注入了10nM激活素B，其用0nM、5nM、50nM、100nM或400nM不含Fc的隐藏蛋白预孵育。小插图显示了激活素B与BMPRII结合的叠加曲线拟合的感应图。H栏描绘了ACTRIIA对激活素A与隐藏蛋白结合的抑制。在传感器芯片上捕获隐藏蛋白-Fc，并注入10nM激活素A，其用0nM、5nM、50nM、100nM或400nM不含Fc的隐藏蛋白预孵育。

图5描述了与隐藏蛋白介导的激活素信号转导调节相关的体外研究的结果，并且由A栏至F栏组成。A栏描绘了隐藏蛋白-Fc对激活素A介导的基因表达的抑制。10ng/ml激活素A诱导表达Smad-2/3-响应报告物。ACTRIIA-Fc和隐藏蛋白-Fc以浓度依赖性方式等效地抑制激活素A依赖的荧光素酶信号(以ng/ml表示)。B栏是描述检测Smad2磷酸化的蛋白质印迹。激活素A(10ng/ml)诱导Smad2磷酸化。ACTRIIA-Fc和隐藏蛋白-Fc以浓度依赖性方式(1：10、2：500、3：10,000ng/ml)等效地阻止激活素A介导的Smad-2磷酸化。C栏描绘了隐藏蛋白-Fc抑制激活素B介导的基因表达。10ng/ml激活素A诱导表达Smad-2/3-响应报告物。ACTRIIA-Fc和隐藏蛋白-Fc以浓度依赖性方式等效地抑制激活素B依赖性萤光素酶信号(以ng/ml表示)。D栏是描述检测Smad2磷酸化的蛋白质印迹。激活素B(10ng/ml)诱导Smad2磷酸化。ACTRIIA-Fc和隐藏蛋白-Fc以浓度依赖性方式(1：10、2：500、3：10,000ng/ml)等效地阻止激活素B介导的Smad-2磷酸化。E栏描绘了隐藏蛋白对激活素A抑制成骨细胞矿化的作用。在含有和不含激活素A和隐藏蛋白-Fc的成骨培养基存在下培养HOS细胞。矿化通过茜素红S染色显现。F栏描绘了对矿化的定量。值表示为对照孔中矿化的百分比(％)。

图6描绘了A栏至D栏中的分子模型。A栏是基于BMP-9-ALK1-ACTRIIB结构的配体-受体相互作用模型。二硫键连接的同源二聚体配体(中心，橙色)结合I型激活素受体样激酶(浅蓝色)和II型激活素和BMP受体(深蓝色)的细胞外结构域。B栏是Cripto-1/隐藏蛋白配体相互作用的模型。Cripto-1和隐藏蛋白是II型激活素和BMP受体相互作用的竞争性抑制剂，表明Cripto-1和隐藏蛋白在配体上的结合位点与ACTRIIA、ACTRIIB和BMPRII的结合位点相同。C栏是TGF-β家族信号传导的表面模型。配体与I型和II型受体的同时结合引发磷酸化级联，其导致磷酸化的R-SMAD(浅绿色)转录因子转位到细胞核并表达靶基因。D栏是Cripto-1/隐藏蛋白功能的细胞表面模型。CRIPTO-1和隐藏蛋白阻止II型受体结合配体，阻断典型的TGF-β家族信号传导级联。

图7描绘了在骨重建中隐藏蛋白-Fc(与IgFc区融合的隐藏多肽)抑制激活素A的模型。激活素A通过结合II型激活素受体(ActRIIA和ActRIIB)传导信号。隐藏蛋白-Fc阻止激活素A结合II型激活素受体，并因此抑制激活素A信号传导，释放激活素A的骨抑制作用，并通过其它TGFβ家族信号传导分子进行骨诱导。

图8描绘了一系列融合蛋白构建体，每个包含全部或一部分隐藏蛋白，并高亮显示了隐藏蛋白的结构域组成。隐藏蛋白由用于分泌的信号肽(SP)、低同源性结构域(LH-D)、EGF结构域(EGF)、规范CFC结构域(CFC)和羧基末端GPI信号组成。对于隐藏蛋白-Fc，缺乏GPI信号肽的隐藏蛋白的细胞外结构域通过22个氨基酸的接头与来自人IgG1的Fc部分融合。

具体实施方式

本公开(除其它方面之外)涉及多肽、编码多肽的核酸、多肽的制备以及多肽在多种应用中的用途(例如，诊断和治疗方法)。例如，多肽可用于治疗具有与骨流失、癌症、代谢疾病(例如，与胰岛素生成不足相关的病症)、免疫疾病，肌肉消耗性疾病或肌肉骨骼疾病相关疾病的受试者。尽管不以任何方式为限制，但是在下文中详细阐述了示例性多肽、包含多肽的组合物(例如，药物组合物和制剂)以及制备和使用任何前述多肽和组合物的方法。

多肽

本文所述的多肽包括隐藏蛋白多肽(例如，脊椎动物隐藏蛋白多肽)、其功能片段或多肽或片段的变体。在一些实施方案中，本文所述的多肽包括全部或部分的人隐藏蛋白多肽，例如包含以下氨基酸序列的多肽：

MTWRHHVRLLFTVSLALQIINLGNSYQREKHNGGREEVTKVATQKHRQSPLNWTSSHFGEVTGSAEGWGPEEPLPYSRAFGEGASARPRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQRRSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHAHGPSAGGAPSLLLLLPCALLHRLLRPDAPAHPRSLVPSVLQRERRPCGRPGLGHRL(UniProt Id.No.P0CG37)(SEQ ID NO:1)。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包括来自任何脊椎动物，所述脊椎动物例如爬行动物、鸟或哺乳动物，哺乳动物例如非人类哺乳动物(例如，非人灵长类动物(例如，恒河猴或食蟹猴))。本领域技术人员将理解，这样的序列在本领域中是已知的或可以使用常规实验容易获得(参见，例如Sambrook等的文献(见下文))。在一些实施方案中，所述多肽包含所有或部分来自黑猩猩隐藏蛋白多肽，例如具有以下氨基酸序列的多肽：

MTWRHHVRLLFTVSLALQIINLGNSYQREKHNGGREEVIKVATQKHQQSPLNWTSSHFGEVTGSAEGWGPEEPLTYSWAFGEGASARPRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQRRSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHAHGPSAGGAPSLLLLLPCALLHRLLRPDAPAHPRSLVPSVLQRERRPCGRPGLGHRL(UniProtId.No.H2QIQ5)(SEQ ID NO:11)。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包括全部或部分啮齿动物隐藏蛋白多肽。例如，该多肽可以包括所有或部分的鼠隐藏蛋白多肽，例如具有下列氨基酸序列的多肽：MRANSPTQGISLKMHQARPLFLVTVALQLIGLGYSYQSEGDGAREVSNILSPVIPGTTLDRTLSNSSRKNDIPEGARLWDSLPDSSTLGESAVPVSRCCHNGGTCVLGSFCVCPAYFTGRYCEHDQRRRDCGALGHGAWTLHSCRLCRCIFSALYCLPHQTFSHCDLKSFLSSGARGSECSIPSLLLLVLCLLLQGVAGKG(UniProt Id.No.P97766)(SEQ IDNO:12)；

在一些实施方案中，本文所述多肽包含下述氨基酸序列：

YQREKHNGGREEVTKVATQKHRQSPLNWTSSHFGEVTGSAEGWGPEEPLPYSRAFGEGASARPRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQRRSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHAHGPSAGGAPSLLLLLPCALLHRLLRPDAPAHPRSLVPSVLQRERRPCGRPGLGHRL(SEQ ID NO:2)，其对应于缺少氨基末端前导序列的人隐藏蛋白多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的多肽包含以下氨基酸序列：

YQREKHNGGREEVTKVATQKHRQSPLNWTSSHFGEVTGSAEGWGPEEPLPYSRAFGEGASARPRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQRRSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRC(SEQ ID NO:3)，其对应于没有氨基末端前导序列或羧基末端前肽结构域的人隐藏蛋白多肽的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包含以下氨基酸序列：

YQREKHNGGREEVTKVATQKHRQSPLNWTSSHFGEVTGSAEGWGPEEPLPYSRAFGEGASAR(SEQ IDNO:4)，其对应于人隐藏蛋白多肽的低同源性结构域。在一些实施方案中，本文所述的多肽包含隐藏蛋白多肽的EGF结构域，例如人隐藏蛋白多肽的EGF结构域，例如包含以下氨基酸序列：

PRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQR(SEQ ID NO:5)，其对应于人隐藏蛋白多肽的EGF结构域。在一些实施方案中，本文所述的多肽包含隐藏蛋白多肽的Cripto-FRL-1-Cryptic(CFC)结构域，例如人隐藏蛋白多肽的CFC结构域，例如包含以下氨基酸序列：

RSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHA(SEQ ID NO:6)。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包含一个或多个以下氨基酸序列：

CCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQR(SEQ ID NO:7)，

PRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQRRSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHA(SEQ ID NO:8)或NGGTCVLGSFC(SEQ ID NO:9)。隐藏蛋白的示例性片段的图示于图8中。

在一些实施方案中，本文所述多肽包含下列序列中的一个或两个：

MTWRHHVRLL FTVSLALQII NLGNSYQREK HNGGREEVTK VATQKHRQSP LNWTSSHFGEVTGSAEGWGP EEPLPYSRAF GEGASARPRC CRNGGTCVLG SFCVCPAHFT GRYCEHDQRR SECGALEHGAWTLRACHLCR CIFGALHCLPLQTPDRCDPK(SEQ ID NO:19)或YQREK HNGGREEVTK VATQKHRQSPLNWTSSHFGE VTGSAEGWGP EEPLPYSRAF GEGASARPRC CRNGGTCVLG SFCVCPAHFT GRYCEHDQRRSECGALEHGA WTLRACHLCR CIFGALHCLP LQTPDRCDPK(SEQ ID NO:20)。

本文还表征了包含变体隐藏蛋白多肽或变体隐藏蛋白多肽的片段的多肽。相对于其来源的野生型隐藏蛋白多肽，这些变体包含一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，相对于其来源的野生型隐藏蛋白多肽(例如，包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列的野生型人隐藏蛋白多肽)，变体多肽包含至少两个(例如，至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或大于100个)氨基酸的取代、缺失或插入。在一些实施方案中，相对于其来源的野生型隐藏蛋白多肽(例如，包含SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列的野生型人隐藏蛋白多肽)，变体多肽包含不超过20个(例如，不超过19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个)氨基酸的取代，缺失或插入。取代可以是保守的、非保守的或两者的混合。

当用于本文时，术语“保守取代”是指用具有类似立体特性的天然或非天然存在的氨基酸替代给定多肽的天然序列中存在的氨基酸。当待替代的天然氨基酸的侧链是极性或疏水性时，保守取代应当是同为极性或疏水性的天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸，并且任选地与被取代的氨基酸的侧链具有相同或相似的空间特性。保守取代通常包括以下组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天门冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。一字母氨基酸缩写如下：丙氨酸(A)；精氨酸(R)；天冬酰胺(N)；天门冬氨酸(D)；半胱氨酸(C)；甘氨酸(G)；谷氨酰胺(Q)；谷氨酸(E)；组氨酸(H)；异亮氨酸(I)；亮氨酸(L)；赖氨酸(K)；甲硫氨酸(M)；苯丙氨酸(F)；脯氨酸(P)；丝氨酸(S)；苏氨酸(T)；色氨酸(W)，酪氨酸(Y)；和缬氨酸(V)。

本文所用的短语“非保守取代”是指通过具有不同电化学和/或空间特性的另一天然或非天然存在的氨基酸替代母体序列中存在的氨基酸。因此，取代氨基酸的侧链可以比被取代的天然氨基酸的侧链显著更大(或更小)和/或可以具有与被取代的氨基酸具有显著不同的电子性质的官能团。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包含具有与野生型隐藏蛋白多肽至少70％(例如，至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列的变体隐藏蛋白多肽。例如，在一些实施方案中，本文所述的变体多肽或其片段具有与SEQ ID NO:1至12中任一项所示的氨基酸序列至少80％(例如，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含以下氨基酸序列中的任何一个(或多个)：

YQREKHNGGREEVTKVATQKHRQSPLNWTSSHFGEVTGSAEGWGPEEPLPYSRAFGEGASAR(SEQ IDNO:4)，PRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQR(SEQ ID NO:5)，RSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHA(SEQ ID NO:6)，CCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQR(SEQ ID NO:7)，

PRCCRNGGTCVLGSFCVCPAHFTGRYCEHDQRRSECGALEHGAWTLRACHLCRCIFGALHCLPLQTPDRCDPKDFLASHA(SEQ ID NO:8)，或NGGTCVLGSFC(SEQ ID NO:9)，其中所述多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO:1或2所示的氨基酸序列至少70％(例如，至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)相同。

百分比(％)氨基酸序列同一性被定义为：在比对序列并引入间隙(如果需要的话)以达到最大百分比序列同一性之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。用于确定百分比序列同一性的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用诸如BLAST软件或ClustalW2之类的公开可用的计算机软件。用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法可以通过已知方法来确定。

在一些实施方案中，本文所述的多肽包括隐藏蛋白多肽的功能片段或变体隐藏蛋白多肽。这样的功能片段以及变体多肽保留所述变体或片段来源的相应成熟隐藏蛋白多肽活性的至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。例如，在一些实施方案中，本文所述的变体或功能片段保留至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)所述变体或功能片段来源的成熟野生型隐藏蛋白多肽的与激活素A和/或激活素B的亲和力。

本文所述的多肽可以特异性结合激活素A(例如，人激活素A)。本文使用的术语“特异性结合”、“特异结合”和类似语法术语是指两个分子在生理条件下形成相对稳定的复合物。通常，当结合常数(k_a)高于10⁶M^-1s^-1时，结合被认为是特异性的。因此，本文所述的多肽可以特异性结合活化素A，其结合常数为至少(或大于)10⁶M^-1s^-1(例如，至少或大于10⁷M^-1s^-1、10⁸M^-1s^-1、10⁹M^-1s^-1、10¹⁰M^-1s^-1、10¹¹M^-1s^-1、10¹²M^-1s^-1、10¹³M^-1s^-1、10¹⁴M^-1s^-1或10¹⁵M^-1s^-1或更高)。在一些实施方案中，本文描述的多肽的解离常数低于或等于10^-3s^-1(例如，8x10^-4s^-1、5x10^-4s^-1、2x10^-4s^-1、10^-4s^-1、或10^-5s^-1)。

在一些实施方案中，本文所述多肽结合激活素A(例如，人激活素A)的K_D低于10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12M或10^-13M。平衡常数K_D是动力学速率常数k_d/k_a的比值。在一些实施方案中，本文所述的多肽与激活素A结合的K_D小于1×10^-9M。在一些实施方案中，本文所述的多肽结合激活素A的K_D小于100皮摩尔、小于50皮摩尔，小于25皮摩尔、小于10皮摩尔或小于5皮摩尔。在一些实施方案中，多肽与激活素A结合，其K_D为约1皮摩尔至约100皮摩尔，例如约1至约5皮摩尔、约1至约10皮摩尔、约1至约20皮摩尔或约1至约50皮摩尔。

在一些实施方案中，本文所述的多肽结合激活素B(例如，人激活素B)的K_D小于10^-8、10^-9、或5x10^-10M。在一些实施方案中，本文所述的多肽与激活素B结合的K_D小于1×10^-9M。在一些实施方案中，本文所述多肽以小于500皮摩尔的K_D结合激活素B。

用于确定多肽是否结合靶抗原和/或多肽与目标抗原的亲和力的方法是本领域已知的。例如，可以使用多种技术来检测和/或定量一种多肽与靶多肽的结合，例如但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、等离子体表面共振法(例如，BIAcore系统；Pharmacia BiosensorAB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。用于评估试剂和激活素A的相互作用的示例性方法在例如如下的文献中描述：Li等，(2010)J Biol Chem 285 (47):36645-36655；Harrington等，(2006)EMBO J 25:1035-1045；以及Fischer等，(2003)JEndocrinol 176:61-68，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。

来自多个物种(包括人类)的成熟激活素A的氨基酸序列是本领域熟知的。例如，人激活素A是两个13kDa抑制素βA亚基的同源二聚体，其直到氨基末端前肽从每个亚基被切除才会活化。人抑制素β的A链的示例性氨基酸序列如下所示：

对应于信号肽的氨基酸是粗体，对应于前肽的氨基酸加了划线。

激活素A已经在本领域中描述，激活素A蛋白可以用于本文所述的任何方法，其可从许多来源商购获得，例如affymetrix eBioscience(SanDiego，California)和R&DSystems(Minneapolis，明尼苏达州)。

在一些实施方案中，本文所述的变体或功能片段保留所述变体或功能片段其来源的成熟野生型隐藏蛋白多肽至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的能力，以抑制激活素A与其同源细胞表面受体的结合和/或激活素A通过激活素A的至少一种同源细胞表面受体诱导细胞内信号传导。基于细胞的用于评估激活素A信号传导(或其抑制)的方法是本领域已知的，并且描述于例如Harrington等，同上，Schmierer等，(2003)J Biol Chem 278：21197-21203；Chantry等，(2010)J Bone Mineral Res 25(12)：2633-2646；和美国专利申请公开号20120141469。例如，培养的成骨细胞可以在存在或不存在隐藏蛋白多肽或其变体或功能片段的情况下与激活素A接触。可以测量成骨细胞矿化程度。此外，也可以测量激活素A的测试抑制剂(例如，本文所述的隐藏蛋白多肽的变体或功能片段)对破骨细胞数目或活性的影响，例如如Chantry等的文献所述(见上文)。

在一些实施方案中，本文所述的变体或功能片段保留所述变体或功能片段其来源的成熟野生型隐藏蛋白多肽至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的能力，以抑制激活素B与其同源细胞表面受体的结合和/或激活素B通过激活素B的至少一种同源细胞表面受体诱导细胞内信号传导。基于细胞的用于评估激活素B信号传导(或其抑制)的方法是本领域已知的，并且描述于例如Tsuchida等，(2004)Mol Cell Endocrinol 220(1-2)：59-65；Wacker等，(2014)PLoS One 9(10)：e111276；Frandsen等，(2007)Biochem Biophys ResCommun 362(3)：568-574；和美国专利号5,071,834。

当用于本文时，术语“抑制”和其语法等同术语是指特定活动、功能或相互作用的降低、限制和/或阻断。在一个实施方案中，该术语是指将给定输出或参数的水平降低至比相应的对照水平低至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更低。给定输出或参数的降低水平不需要(尽管有可能)意味着绝对不存在输出或参数。本发明不需要并且不限于完全消除输出或参数的方法。

在一些实施方案中，本文所述的变体或功能片段保留所述变体或功能片段其来源的成熟野生型隐藏多肽至少5％(例如，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的亲和力，以抑制激活素A和/或激活素B与其同源细胞受体之一(例如，ActRIIA或ActRIIB)的相互作用。

当用于本文时，当涉及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”是指分子彼此的物理接触(例如，结合)。通常，这种相互作用导致所述分子中的一种或两种的活性(其产生生物学效应)。抑制这种相互作用导致破坏了参与相互作用的一个或多个分子的活性。抑制可以(但不一定要)是完全的。

通过筛选重组产生的多肽可获得功能活性变体或片段(见下文)。此外，可以使用本领域熟知的技术化学合成片段，例如固相f-Moc或t-Boc化学。可以制备(重组或通过化学合成)片段并进行测试，以识别那些可用作激活素A蛋白或由激活素A介导的信号传导(和/或激活素B蛋白或由激活素B介导的信号传导)的拮抗剂(抑制剂)的那些肽基片段。多肽的功能活性变体也可以通过筛选由编码隐藏蛋白多肽的相应诱变的核酸重组产生的修饰的多肽的文库来获得。可以制备和测试变体以鉴定可用作激活素A蛋白(或激活素B)或由激活素A(或激活素B)介导的信号传导的拮抗剂(抑制剂)的变体。

可以通过编码多肽文库的基因的简并文库产生组合文库，其中每个文库都包含隐藏蛋白多肽序列的至少一部分。例如，可以将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得潜在的隐藏蛋白多肽核苷酸序列的简并集可表达为单个多肽，或者作为一组较大的融合蛋白(例如，用于噬菌体展示)。

有许多方式可以通过简并寡核苷酸序列产生潜在同系物的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后将合成的基因连接到合适的载体中进行表达。简并寡核苷酸的合成是本领域公知的(参见例如Narang，(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等，(1984)Annu Rev Biochem 53：323；Itakura等，(1984)Science 198：1056；和Ike等，(1983)Nucleic Acid Res 11：477)。这些技术已被用于其它蛋白质的定向进化(参见，例如Scotte等，(1990)Science 249：386-390；Roberts等，(1992)Proc Natl Acad SciUSA 89：2429-2433；Devlin等，(1990)Science 249：404-406；Cwirla等，(1990)Proc NatlAcad Sci USA 87：6378-6382；以及美国专利号5,223,409；5,198,346；和5,096,815)。

用于筛选通过点突变和截短产生的组合文库的基因产物的许多技术是已知的，并且由于此，用于筛选cDNA文库以获得具有某种性质的基因产物的许多技术也是已知的。这些技术一般将适于快速筛选通过隐藏蛋白多肽的组合诱变产生的基因文库。用于筛选大型基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得到的载体文库转化合适的细胞，并在特定条件下表达组合基因，在所述条件下检测所需活性促进了编码被检测产物的基因的载体被相对容易得分离。优选的测定法包括激活素结合测定和激活素介导的细胞信号传导测定。

在一些实施方案中，本文所述的多肽可以与异源部分缀合。所述异源部分可以是例如异源多肽、治疗剂(例如，毒素或药物)或可检测标记，例如但不限于放射性标记、酶标记、荧光标记、重金属标记、发光标记或亲和性标签(如，生物素或链霉亲和素蛋白)。合适的异源多肽包括例如用于纯化抗体或片段的抗原标签(例如，FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO:14))、多组氨酸(6-His；HHHHHH(SEQ ID NO:15)、血凝素(HA；YPYDVPDYA(SEQ ID NO:16))、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或麦芽糖结合蛋白(MBP))。异源多肽还包括可用作诊断或可检测标记物的多肽(例如，酶)，例如荧光素酶、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP))或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。合适的放射性标记物包括，例如³²P、³³P、¹⁴C、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S和³H。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、绿色荧光蛋白(GFP)、DyLight^TM488、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、PerCP、700、Cy5、别藻蓝蛋白和Cy7。发光标记包括例如各种发光镧系元素(例如，铕或铽)螯合物中的任何一种。例如，合适的铕螯合物包括二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)的铕螯合物。酶标记包括例如碱性磷酸酶、CAT、荧光素酶和辣根过氧化物酶。

两种蛋白质可以使用任一种已知的化学交联剂进行交联。这种交联剂的实例是那些通过包含“阻碍”二硫键的连接键连接两个氨基酸残基的交联剂。在这些连接键中，交联单元内的二硫键(通过二硫键两侧之一的阻碍基团)被保护从而不被例如还原型谷胱甘肽或二硫还原酶还原。一种合适的试剂，4-琥珀酰亚氨基氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)，利用其中一种蛋白质上的末端赖氨酸和另一种蛋白质上的末端半胱氨酸在两种蛋白质之间形成这种连接。也可以使用通过每种蛋白质上的不同偶联部分交联的异双功能试剂。其它可用的交联剂包括但不限于连接两个氨基的试剂(例如，N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亚胺)、连接两个巯基的试剂(例如，1,4-双马来酰亚胺丁烷)、连接氨基和巯基的试剂(例如，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、连接氨基和羧基的试剂(例如，4-[p-叠氮基水杨酰氨基]丁胺)以及连接氨基和存在于精氨酸侧链中的胍基的试剂(例如，对叠氮苯乙二醛一水合物)。

在一些实施方案中，放射性标记可以直接缀合到蛋白质试剂的氨基酸骨架。或者，可以将放射性标记作为更大分子的一部分(例如，在间-[¹²⁵I]碘苯基-N-羟基琥珀酰亚胺([¹²⁵I]mIPNHS)中的¹²⁵I)，其结合游离氨基以形成相关蛋白的间碘苯基(mIP)衍生物(参见，例如Rogers等，(1997)J Nucl Med 38：1221-1229)，或螯合(例如，与DOTA或DTPA)，其随后又结合到蛋白骨架。将放射性标记或含有放射性标记的较大分子或螯合物与本文所述的抗体或抗原结合片段缀合的方法是本领域已知的。这样的方法包括在促进放射性标记或螯合物与蛋白质结合的条件(例如，pH、盐浓度和/或温度)下将蛋白质与放射性标记物一起孵育(参见例如美国专利号6,001,329)。

将荧光标记(有时称为“荧光团”)与蛋白质(例如，抗体)缀合的方法在蛋白质化学领域中是已知的。例如，使用连接到荧光团上的琥珀酰亚胺基(NHS)酯或四氟苯基(TFP)酯部分，可将荧光团与游离氨基(例如，赖氨酸)或巯基(例如，半胱氨酸)缀合。在一些实施方案中，荧光团可以缀合至异双功能交联剂部分，例如磺基-SMCC。合适的缀合方法包括在促进荧光团与蛋白质的结合的条件下，将抗体蛋白质或其片段与荧光团一起孵育。参见例如Welch和Redvanly(2003)，“Handbook of Radiopharmaceuticals：Radiochemistry andApplications”，John Wiley and Sons(ISBN0471495603)。

在一些实施方案中，可以修饰试剂，例如用改善抗体在循环中(例如，在血液、血清或其它组织中)稳定和/或留存的部分(“moiety”)修饰试剂。例如，包含隐藏蛋白多肽或其变体或功能片段的试剂可以进行聚乙二醇化(见Lee等，(1999)Bioconjug Chem 10(6)：973-8；Kinstler等，(2002)Advanced Drug Deliveries Reviews 54：477-485；和Roberts等，(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54：459-476)或羟乙基淀粉化(HESylated，FreseniusKabi，Germany；参见，例如等，(2010)Int J Pharm 387(1-2)：110-119)。稳定化部分可以将多肽的稳定性或留存提高至少1.5倍(例如，至少2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍或50倍或更多)。

在一些实施方案中，本文所述的多肽可含有骨靶向剂。对骨具有亲和性或骨富集能力的药剂是本领域已知的。当用于本文时，“骨靶向剂”是指对羟基磷灰石(骨主要成分)中的钙离子具有高亲和力的化学结构或配体。在一个实施方案中，多肽可以靶向除骨之外的身体区域的钙沉积物，例如动脉、心脏、肾脏或胆囊中的钙沉积物。然而，骨靶向剂理想地选择性地结合骨组织。骨靶向剂被吸引到受试者的骨组织，优选以比非骨组织更高的亲和力结合骨，并且保持结合一定长度的时间，从而将组合物运输至骨环境。换句话说，骨靶向剂优选以比非骨组织高至少2倍的亲和力(例如，至少3倍、至少5倍、至少10倍或至少25倍的亲和力)结合骨组织。骨靶向剂优选可逆地结合骨组织，这意味着骨靶向剂最终从骨释放并从身体排出。

在一些实施方案中，骨靶向剂理想地选自磷酸盐、膦酸盐、双膦酸盐、羟基双膦酸盐、氨基亚甲基膦酸、酸性肽或其组合。骨靶向剂可以携带一个、两个、三个或更多个这些基团。例如，骨靶向剂可以是膦酸盐，这意味着骨靶向剂可以包含一个膦酸盐、两个膦酸盐或三个或更多个膦酸盐。可以用于本发明的一种合适的骨靶向剂是EDTMP(乙二胺-N,N,N',N'-四(亚甲基膦酸)，目前FDA批准(Quadramet^TM)作为放射性¹⁵³Sm复合物用于将选择性辐射量运输至骨转移瘤以疼痛缓解。EDTMP是含有四个膦酸基团的膦酸，因此是四膦酸盐。化合物，如¹⁵³Sm-EDTMP被选择性地定位在存在肿瘤的骨中，与正常骨相比比例大于10：1。

在一些实施方案中，骨靶向剂是多膦酸。已经证明多膦酸成功地将生物活性分子靶向骨组织。例如，通过多氨基膦酸(例如，ABDTMP)与生长因子(刺激骨形成)的缀合(通过异硫氰酸酯化学)成功地将生长因子靶向大鼠的骨骼(参见例如国际专利申请公开WO94/00145)。类似地，骨靶向剂已经与蛋白质偶联。例如，与人血清白蛋白缀合的双膦酸盐在体外(Biotechnol Prog 16：258(2000))和在体内(Biotechnol Prog 16：1116(2000))成功地将蛋白质运输到骨骼中。对骨靶向剂的应用扩展超越了将蛋白质递送至骨，且该应用包括例如，递送小的治疗分子。已经产生了包含靶向骨的二膦酸盐和烷基化剂的缀合物，例如BAD(参见例如Wingen等，(1986)J Cancer Res Clin Oncol 111：209)。

在一些实施方案中，骨靶向剂包含式X_n，其中X是在生理pH下具有负电荷标准或非标准氨基酸，且n为1至25的整数。在一些实施方案中，X是天门冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，n为5至15之间的整数。在一些实施方案中，n是10至16之间的整数。在一些实施方案中，n至少为4(例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。在一些实施方案中，n小于20(例如，小于19、18、17、16或15)。

在其它实施方案中，骨靶向剂是(天门冬氨酸)_n或(谷氨酸)_n。骨骼和牙本质中丰富的糖蛋白骨粘连蛋白的富酸肽序列对羟基磷灰石具有很强的亲和力(Fujisawa等，(1996)Biochimica et Biophysica Acta 53：1292)。因此，包含酸性氨基酸的肽配体是骨靶向剂的合适候选物。实际上，当(Glu)₁₀连接到生物素时，成功地将标记的链霉亲和素引导至羟基磷灰石(在国际专利申请公开号WO98/35703中进一步描述)。据信，(Asp)₆与骨的系链在破骨细胞介导的骨吸收过程中被代谢。因此，酸性肽配体不仅提供了将化合物靶向骨的方法，而且还提供了将化合物缓慢释放到骨细胞和周围组织的机制。

骨靶向剂的其它实例包括但不限于氨基-和羟基-烷基膦酸和二膦酸；羟基二膦酸，包括阿仑膦酸盐、帕米膦酸盐、4-氨基丁基膦酸、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸和氨基亚甲基双膦酸；磷酸盐如植酸；和氨基亚甲基膦酸，如N，N-双(甲基膦酰基)-4-氨基-苯甲酸和次氮基三(甲基膦酸)。

在一些实施方案中，例如其中骨靶向剂是蛋白质的实施方案，该试剂可以是本文所述的作为融合蛋白的那部分多肽(参见下文)。

融合蛋白

在一些实施方案中，多肽可以是具有至少一部分隐藏蛋白多肽(还有隐藏蛋白多肽的变体或功能片段)和一个或多个融合结构域的融合蛋白。这些融合结构域的众所周知的实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以选择融合结构域以赋予期望的性质。例如，一些融合结构域特别适用于通过亲和层析分离融合蛋白。为了亲和纯化，使用亲和层析的相关基质，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合树脂。作为另一个实例，可以选择融合结构域以便于多肽的检测。这些检测结构域的实例包括各种荧光蛋白(例如，GFP)以及能够产生针对其的特异性抗体并通常是短肽序列的“表位标签”。目前已经能够产生针对其的特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标签。在一些实施方案中，融合蛋白包含分离隐藏蛋白多肽(变体或功能片段)部分和异源部分(例如，Fc区或白蛋白分子)的一个或多个氨基酸的接头部分。在一些实施方案中，接头部分包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列(ENLYFQGGGSGGSGGDYKDDDD)。在一些实施方案中，接头结构域包含聚甘氨酸序列或聚(GS)序列。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如用于因子Xa、凝血酶或烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶，其允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白，从而从其释放重组蛋白质。然后可以通过随后的色谱分离从融合结构域分离释放的蛋白质。在一些实施方案中，隐藏蛋白多肽可以与在体内稳定隐藏蛋白多肽的结构域(“稳定剂”结构域)融合。“稳定”是指任何增加血清半衰期的物质，无论是由于破坏程度降低、肾脏清除率降低还是其它药代动力学作用。与免疫球蛋白的Fc部分的融合已知可以赋予许多蛋白质所需的药代动力学性质。同样地，与人血清白蛋白的融合可以赋予理想的性质。可以选择的其它类型的融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能结构域(根据需要赋予另外的生物功能，例如进一步刺激骨生长)。

在一些实施方案中，融合蛋白可以包含融合到Fc结构域的隐藏蛋白多肽(或其变体或功能片段)。在一些实施方案中，Fc结构域可包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:17)。

在一些实施方案中，Fc结构域可包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：

KSSDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK(SEQ ID NO:21)。

在一些实施方案中，融合蛋白包含以下氨基酸序列：

接头序列是粗体，而融合蛋白的Fc区加有下划线。剩余的序列对应于人隐藏蛋白的片段。

在一些实施方案中，融合蛋白包含以下氨基酸序列：

接头序列是粗体，而融合蛋白的Fc区加有下划线。剩下的序列是人隐藏蛋白的片段。

在某些情况下，例如通过基因工程或其它方法介导的突变、缺失或其它变化来修饰免疫球蛋白重链恒定区可能是有用的，使得某些活性(例如，补体固定或刺激抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))被减少或消除，同时优选地保持Fc区域结合Fc受体(例如，FcRn)的能力。

在一些实施方案中，Fc区(包括本文所述的抗体或抗原结合片段的那些)可以是相对于其相应的未改变的恒定区具有降低的(或没有)效应子功能的改变的Fc恒定区。涉及Fc恒定区的效应子功能可以通过改变恒定区或Fc区的性质来调节。改变的效应子功能包括例如一种或多种以下活性的调节：抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、凋亡、与一种或多种Fc受体的结合和促炎症反应。调节是指与恒定区的未改变形式的活性相比，包含改变的恒定区的受试抗体表现出的效应子功能活性的增加、减少或消除。在具体实施例中，调节包括消除活性或活性完全不存在的情况。例如，显示调节的ADCC和/或CDC活性的改变的Fc恒定区可以显示Fc恒定区未改变形式的ADCC和/或CDC活性的约0至50％(例如，小于50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2或1％)。本文所述的改变的Fc区可以表现出减少的或不可测量的ADCC和/或CDC活性。

在某些实施方案中，与天然序列恒定区或未改变的恒定区相比，改变的恒定区具有至少一个氨基酸取代、插入和/或缺失，例如在天然序列恒定区或母体多肽的恒定区中的约1至约100个氨基酸取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，本文中改变的恒定区域将与未改变的恒定区域具有至少约70％的同源性(相似性)或同一性，并且在一些情况下将具有至少约75％且在其它情况下具有至少约80％的同源性或同一性，并且在其它实施方案中与其具有至少约85％、90％或95％的同源性或同一性。改变的恒定区也可含有一个或多个氨基酸缺失或插入。另外，改变的恒定区可以包含导致改变的翻译后修饰的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入，包括例如改变的糖基化模式(例如，相对于未改变的恒定区的一种或多种糖组分的加入、一种或多种糖组分的缺失、或一种或多种糖组分的组成变化)。

改变的Fc恒定区可以通过工程化或产生具有变体恒定区，Fc区或重链区域的抗体来产生；重组DNA技术和/或细胞培养和表达的条件可以被用于产生具有改变的功能和/或活性的抗体。例如，可以使用重组DNA技术来工程化影响包括效应子功能在内的抗体功能的区域(例如，Fc区或恒定区)中的一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。或者，可以通过操纵产生抗体的细胞培养和表达条件来实现翻译后修饰的变化，例如糖基化模式。将一个或多个取代、添加或缺失引入抗体Fc区的合适方法是本领域熟知的，包括例如以下文献描述的标准DNA诱变技术：Sambrook等，(1989)，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；PCT公开WO06/53301；以及美国专利号7704497，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。

可以通过在抗体的某些区域的氨基酸序列中引入其它类型的变化来产生具有降低的效应子功能的改变的Fc恒定区。这样的氨基酸序列变化包括但不限于例如以下文献描述的Ala-Ala突变：PCT公开号WO94/28027和WO98/47531；和Xu等，(2000)Cell Immunol200：16-26。根据这些实施方案，Fc恒定区包含在234位的丙氨酸取代或在235位的丙氨酸突变。此外，改变的恒定区可能含有双突变：在234位的丙氨酸突变和235位的丙氨酸的第二突变。在一个实施方案中，Fc恒定区包含IgG4框架，其中Ala-Ala突变将描述234位的从苯丙氨酸到丙氨酸的突变和/或235位的从亮氨酸到丙氨酸的突变。在另一个实施方案中，Fc恒定区包含IgG1框架，其中Ala-Ala突变将描述在234位的从亮氨酸到丙氨酸突变和/或在235位从亮氨酸到丙氨酸的突变。Fc恒定区可以可选地或另外地携带其它突变，包括CH2结构域中的点突变K322A(Hezareh等，(2001)J Virol 75:12161-12168)。

当引入重链恒定区时导致效应子功能下降的其它取代见于例如Shields等，(2001)J Biol Chem 276(9):6591–6604。尤其参见Shields等的文献的表1(“人IgG1变体与人FcRn和FcγR的结合)，其中的公开内容通过引用整体并入本文。通过筛选抗IgE抗体的文库，该文库的每种抗体的差异在于用于结合Fc受体(包括FcRn、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIAFcRn)的重链恒定区的一个或多个取代，作者确定了很多调节特定的Fc-Fc受体相互作用的取代。例如，其中CH2结构域含有D265A取代(根据Kabat等，(同上)的重链氨基酸编号)的变体IgG2a重链恒定区导致变体恒定区与IgGFc受体FcγRIIB、FCγRIII、FCγRI和FcγRIV之间的相互作用的完全丧失。Shields等，(2001)，第6595页，表1。另见Baudino等，(2008)J Immunol 181：6664-6669(同上)。

铰链区域内的变化也会影响效应子的功能。例如，铰链区的缺失可能降低对Fc受体的亲和力，并可能减少补体活化(Klein等，Proc Natl Acad Sci USA 78:524–528)。因此，本公开内容也涉及具有铰链区域改变的抗体。

在一些实施方案中，改变的Fc恒定区(例如，改变的人Fc恒定区)可以以比衍生了所述改变的Fc恒定区或变体Fc恒定区的天然Fc恒定区的亲和力更高的亲和力结合新生儿Fc受体(FcRn)。例如，相对于衍生了所述变体人Fc恒定区的天然人Fc恒定区，所述Fc恒定区可以包含一个或多个(例如，二、三、四、五、六、七或八个或更多)氨基酸取代。取代可以增加含有变体Fc恒定区的IgG抗体在pH6.0下与FcRn的结合亲和力，同时保持相互作用的pH依赖性。参见，例如Hinton等，(2004)J Biol Chem 279：6213-6216和Datta-Mannan等，(2007)Drug Metab Dispos 35：1-9。用于测试抗体的Fc恒定区中的一个或多个取代是否增加了Fc恒定区对于pH6.0时的FcRn的亲和力(同时保持相互作用的pH依赖性)的方法是本领域已知的，并且在实施例中举例说明。参见，例如Datta-Mannan等，(2007)J Biol Chem 282(3)：1709-1717；国际公开号WO98/23289；国际公开号WO97/34631；和美国专利号6,277,375，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。

增强抗体Fc恒定区对FcRn的结合亲和力的取代是本领域已知的，其包括例如，(1)M252Y/S254T/TT256E三重取代，Dall'Acqua等，(2006)J Biol Chem 281：23514-23524；(2)M428L或T250Q/M428L取代，Hinton等，(2004)J Biol Chem279：6213-6216和Hinton等，(2006)J Immunol 176：346-356；和(3)N434A或T307/E380A/N434A取代，Petkova等，(2006)Int Immunol 18(12)：1759-69。另外的取代配对：P257I/Q311I、P257I/N434H和D376V/N434H描述于例如Datta-Mannan等，(2007)J Biol Chem 282(3)：1709-1717，其公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，变体恒定区在EU氨基酸残基255位具有对缬氨酸的取代。在一些实施方案中，变体恒定区在EU氨基酸残基309位具有对天冬酰胺的取代。在一些实施方案中，变体恒定区在EU氨基酸残基312位具有对异亮氨酸的取代。在一些实施方案中，变体恒定区在EU氨基酸残基386位具有取代。

在一些实施方案中个、相对于衍生了其的天然恒定区，变体Fc恒定区包含不超过30个(例如，不超过29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个)氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施方案中，变体Fc恒定区包含一个或多个选自以下氨基酸取代组成的组：M252Y、S254T、T256E、N434S、M428L、V259I、T250I和V308F。在一些实施方案中，变体人Fc恒定区包含位置428处的甲硫氨酸和位置434处的天冬酰胺，每个按EU编号。在一些实施方案中，变体Fc恒定区包含如例如美国专利号8,088,376中所述的428L/434S双取代。

在一些实施方案中，相对于天然人Fc恒定区，改变的或变体Fc恒定区包含在氨基酸位置237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434或436(EU编号)的取代。在一些实施方案中，所述取代选自以下组成的组：在237位用甲硫氨酸取代甘氨酸；在238位用丙氨酸取代脯氨酸；在239位用赖氨酸取代丝氨酸；在248位用异亮氨酸取代赖氨酸；在第250位用丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代苏氨酸；在252位用苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸取代甲硫氨酸；在254位用苏氨酸取代丝氨酸；在255位用谷氨酸取代精氨酸；在256位用天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺取代苏氨酸；在257位用丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代脯氨酸；在258位用组氨酸取代谷氨酸；在265位用丙氨酸取代天冬氨酸；在270位用苯丙氨酸取代天门冬氨酸；在286位用丙氨酸或谷氨酸取代天冬酰胺；在289位用组氨酸取代苏氨酸；在297位用丙氨酸取代天冬酰胺；在293位用甘氨酸取代丝氨酸；在303位用丙氨酸取代缬氨酸；在305位用丙氨酸取代缬氨酸；在307位用丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代苏氨酸；在308位用丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸取代缬氨酸；在309位用丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸或精氨酸取代亮氨酸或缬氨酸；在311位用丙氨酸、组氨酸或异亮氨酸取代谷氨酰胺；在312位用丙氨酸或组氨酸取代天门冬氨酸；在314位用赖氨酸或精氨酸取代亮氨酸；在315位用丙氨酸或组氨酸取代天门冬酰胺；在317位用取代丙氨酸赖氨酸；在325位用甘氨酸取代天门冬酰胺；在332位用缬氨酸取代异亮氨酸；在334位用亮氨酸取代赖氨酸；在360位用组氨酸取代赖氨酸；在376位用丙氨酸取代天门冬氨酸；在380位用丙氨酸取代谷氨酸；在382位用丙氨酸取代谷氨酸；在384位用丙氨酸取代天门冬酰胺或丝氨酸；在385位用天门冬氨酸或组氨酸取代甘氨酸；在386位用脯氨酸取代谷氨酰胺；在387位用谷氨酸取代脯氨酸；在389位用丙氨酸或丝氨酸取代天门冬酰胺；在424位用丙氨酸取代丝氨酸；在428位用丙氨酸、天门冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天门冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代甲硫氨酸；在433位用赖氨酸取代组氨酸；在434位用丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸取代天门冬酰胺；和在436位用组氨酸取代酪氨酸或苯丙氨酸，均为EU编号。

应当理解，融合蛋白的不同元件可以以与期望的功能一致的任何方式进行安排。例如，隐藏蛋白多肽可以被置于异源结构域的C-末端，或者，另选地，异源结构域可以被置于隐藏蛋白多肽的C-末端。隐藏蛋白多肽结构域和异源结构域不需要在融合蛋白中相邻，并且其它结构域或氨基酸序列可以包括在任一结构域的C-或N-末端或在结构域之间。

多肽表达

可以使用分子生物学和蛋白质化学领域已知的多种技术来产生重组多肽(例如，片段或融合蛋白)。例如，可以将编码融合蛋白的核酸插入含有转录和翻译调控序列的表达载体，所述表达载体包括例如启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、转录终止子信号、多聚腺苷酸化信号和增强子或激活子序列。调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。此外，表达载体可以包括多于一个复制系统，使得其可以维持在两种不同的生物体中(例如，在哺乳动物或昆虫细胞中)进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。

几种可能的载体系统可用于在哺乳动物细胞中从核酸表达重组多肽。一类载体依赖于将所需基因序列整合到宿主细胞基因组中。具有稳定整合DNA的细胞可以通过同时引入耐药基因进行选择，耐药基因例如大肠杆菌gpt(Mulligan和Berg，(1981)Proc NatlAcad Sci USA 78：2072)或Tn5neo(Southern和Berg，(1982)Mol Appl Genet 1：327)。可选择的标记基因可以与待表达的DNA基因序列连接，或通过共转染导入相同的细胞(Wigler等，(1979)Cell 16:77)。第二类载体使用赋予染色体外质粒自主复制能力的DNA元件。这些载体可以衍生自动物病毒，如牛乳头瘤病毒(Sarver等，(1982)Proc Natl Acad Sci USA，79：7147)、巨细胞病毒、多瘤病毒(Deans 等，(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：1292)或SV40病毒(Lusky和Botchan，(1981)Nature 293：79)。

可以以适于随后表达核酸的方式将表达载体导入细胞。如下所述，引入方法主要由靶细胞类型决定。示例性方法包括CaPO₄沉淀、脂质体融合、阳离子脂质体、电穿孔、病毒感染、葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、原生质体融合和直接显微注射。

用于表达重组蛋白的合适的宿主细胞包括酵母、细菌、昆虫、植物和哺乳动物细胞(例如，啮齿动物细胞系，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。特别令人感兴趣的是细菌如大肠杆菌，真菌如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichiapastoris)，昆虫细胞如SF9，哺乳动物细胞系(例如，人细胞系)以及原代细胞系。

在一些实施方案中，重组蛋白可以在转基因动物(例如，转基因哺乳动物)中表达并纯化。例如，重组蛋白可以在转基因非人哺乳动物(例如，啮齿动物)中产生并从奶中分离，如例如Houdebine，(2002)Curr Opin Biotechnol 13(6)：625-629；van Kuik-Romeijn等，(2000)Transgenic Res 9(2)：155-159；和Pollock等，(1999)J Immunol Methods 231 (1-2)：147-157。

可以在条件下，通过培养转化了表达载体(所述表达载体包含编码多肽的核酸)的宿主细胞生产多肽，并且培养时间足以允许蛋白质表达。蛋白质表达的这种条件将随着表达载体和宿主细胞的选择而变化，并且将由本领域技术人员通过常规实验容易地确定。例如，在大肠杆菌中表达的蛋白质可以从包涵体重折叠(参见例如Hou等，(1998)Cytokine10：319-30)。细菌表达系统及其使用方法在本领域中是公知的(参见Current Protocolsin Molecular Biology，Wiley&Sons，以及Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(2001))。密码子、合适的表达载体和合适的宿主细胞的选择将根据许多因素而变化，并且可以根据需要容易地优化。本文所述的融合蛋白可以在哺乳动物细胞或其它表达系统中表达，包括但不限于酵母、杆状病毒和体外表达系统(参见例如Kaszubska等，(2000)Protein Expression andPurification 18：213-220)。

表达后，可以分离重组蛋白。术语“纯化的”或“分离的”应用于本文所述的任何蛋白质，是指在表达所述蛋白质的原核或真核细胞中从天然伴随其的组分(例如，蛋白质或其它天然存在的生物或有机分子)中分离或纯化的多肽，天然伴随的组分例如其它蛋白质、脂质和核酸。典型地，当多肽占样品中总蛋白质的至少60(例如，至少65、70、75、80、85、90、92、95、97或99)重量％时，多肽是纯化的。

根据样品中存在的其它组分，可以以本领域技术人员已知的各种方式分离或纯化重组蛋白质。标准纯化方法包括电泳技术、分子技术、免疫学技术和色谱技术，色谱技术包括离子交换色谱、疏水性色谱、亲和色谱和反相HPLC色谱。例如，可以使用标准抗-抗体柱(例如，蛋白A或蛋白G柱)纯化抗体。超滤和渗滤技术结合蛋白质浓缩也是有用的。参见，例如Scopes，(1994)“Protein Purification，第三版”，Springer-Verlag，New York City，New York。所需的纯化程度将根据所需的用途而变化。在某些情况下，不需要纯化表达的蛋白质。

确定纯化蛋白质的产量或纯度的方法是本领域已知的，包括例如Bradford测定法、UV光谱法、Biuret蛋白测定法、Lowry蛋白测定法、酰胺黑蛋白测定法、高压液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和凝胶电泳方法(例如，使用蛋白质染色，如考马斯蓝或胶体银染色)。

在一些实施方案中，可以从蛋白质制剂中除去内毒素。从蛋白质样品中去除内毒素的方法是本领域已知的，并且在实施例中举例说明。例如，可以使用各种市售试剂从蛋白质样品中除去内毒素，包括但不限于ProteoSpin^TM内毒素去除试剂盒(Norgen BiotekCorporation)、Detoxi-Gel内毒素去除凝胶(Thermo Scientific；Pierce ProteinResearch Products)、内毒素去除试剂盒(Mirus)或Acrodisc^TM-E膜(Pall Corporation)。

用于检测和/或测量样品中的内毒素的量(纯化之前和之后)的方法是本领域已知的，并且商业试剂盒是可获得的。例如蛋白质样品中的内毒素浓度可以使用QCL-1000显色试剂盒(BioWhittaker)、基于鲎变形细胞裂解物(LAL)的试剂盒，例如 -T、Chromo-LAL和CSE试剂盒(可从Associates of Cape Cod Incorporated获得)确定。

药物组合物和制剂

本文所述的组合物可以配制成药物溶液，例如用于给予受试者增强对抗原的免疫应答。药物组合物通常包含药学上可接受的载体。当用于本文时，“药学上可接受的载体”是指并且包括在生理上相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。组合物可以包括药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见例如Berge等，(1997)J Pharm Sci 66；1-19)。

组合物可以根据标准方法配制。药物制剂是一种已知的技术，并且在例如以下的文献中进一步描述：Gennaro，(2000)“Remington：The Science and Practice ofPharmacy”，第20版，Lippincott，Williams&Wilkins(ISBN：0683306472)；Ansel等，(1999)“Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”，第7版，LippincottWilliams&Wilkins Publishers(ISBN：0683305727)；和Kibbe，(2000)“Handbook ofPharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association”，第3版(ISBN：091733096X)。在一些实施方案中，可以将组合物配制成例如适当浓度的缓冲溶液，并适于在2-8℃(例如，4℃)下储存。在一些实施方案中，组合物可以配制成在低于0℃(例如，-20℃或-80℃)的温度下储存。在一些实施方案中，组合物可以配制成在2-8℃(例如，4℃)下储存长达2年(例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月，六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、1年、1年半或2年)。因此，在一些实施方案中，本文所述的组合物在2-8℃(例如，4℃)下储存至少1年是稳定的。

药物组合物可以是各种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型、例如液体溶液(例如，可注射和不熔溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式部分地取决于预期的给药方式和治疗应用。例如，含有用于全身或局部递送的组合物可以是可注射或不熔溶液的形式。因此，可以将组合物配制成通过肠胃外模式(例如，静脉内、皮下、腹腔内或肌内注射)给药。本文所用的“肠胃外给药”和其它语法等同的术语是指除肠内和局部给药之外的给药方式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肺、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、肺内、腹腔内、经气管、皮下(subcutaneous)、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、脑内、颅内、颈内动脉和胸骨内注射和输注(见下文)。

组合物可以配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其它适合于以高浓度稳定储存的有序结构。无菌可注射溶液可以根据需要通过将组合物以所需量与上述所列成分的一种或其组合一起加入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将本文所述的组合物加入含有碱性分散介质的无菌载体和来自上述列举的所需的其它成分来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其产生本文所述组合物的粉末加上来自前面无菌过滤的溶液中的任何另外的所需成分(见下文)。可以维持溶液的适当的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散的情况下维持所需的粒度以及使用表面活性剂。可以通过在组合物中包含延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。

本文所述的组合物也可以配制在免疫脂质体组合物中。这样的制剂可以通过本领域已知的方法制备，例如以下文献描述的方法：Epstein等，(1985)Proc Natl Acad SciUSA 82：3688；Hwang等，(1980)Proc Natl Acad Sci USA 77：4030；和美国专利号4,485,045和4,544,545。具有增强的循环时间的脂质体在例如美国专利号5,013,556中公开。

在某些实施方案中，组合物可以与保护化合物免于快速释放的载体配制，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些制剂的许多方法是本领域已知的。参见，例如J.R.Robinson，(1978)“Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems”，Marcel Dekker，Inc.，NewYork。

在一些实施方案中，本文所述的组合物通过水溶液肠胃外注射施用。本公开表征了包含有效量的试剂(或多于一种试剂)的药物组合物，并且任选地包括药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这种组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度；和任选的添加剂如洗涤剂和增溶剂(例如，20、TWEEN80、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)和防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇)和膨胀物质(例如，乳糖、甘露糖醇)。制剂可以被灭菌，例如使用过滤、将灭菌剂加入组合物中、通过照射组合物、或通过加热组合物。

如上所述，可以制备相对高浓度的组合物。例如，组合物可以以约10mg/mL至100mg/mL(例如，约9mg/mL至90mg/mL之间；约9mg/mL至50mg/mL之间)的浓度配制；约10mg/mL至50mg/mL；约15mg/mL至50mg/mL；约15mg/mL至110mg/mL之间；约15mg/mL至100mg/mL之间；约20mg/mL至100mg/mL；约20mg/mL至80mg/mL；约25mg/mL至100mg/mL；约25mg/mL至85mg/mL；约20mg/mL和50mg/mL；约25mg/mL至50mg/mL；约30mg/mL至100mg/mL；约30mg/mL至50mg/mL；约40mg/mL和100mg/mL；约50mg/mL至100mg/mL；或约20mg/mL至50mg/mL之间)。在一些实施方案中，可以以大于5mg/mL且小于50mg/mL的浓度配制组合物。在水溶液中配制蛋白质的方法是本领域已知的，并且在例如如下的文献中描述：美国专利号7,390,786；McNally和Hastedt(2007)，“Protein Formulation and Delivery”，第二版，Drugs andthe Pharmaceutical Sciences，第175卷，CRCPress；和Banga(1995)，“Therapeuticpeptides and proteins：formulation，processing，and delivery systems”，CRCPress。在一些实施方案中，水溶液具有中性pH，例如6.5和8之间的pH(例如，在7和8之间，包括7和8)。在一些实施方案中，水溶液具有约6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的pH。在一些实施方案中，水溶液具有大于(或等于)6但小于pH 8的pH(例如，大于或等于6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8或7.9)。

当用于本文时，“约”和类似的语法术语是指基于测量的性质或精度可接受的数值测量误差的程度。示例性的误差范围包括高达20％(例如，不超过19％、18％、17％、16％、15％、14％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或小于1％)。在一些实施例中，例如在生物系统中，约包括在一个数量级内的值，例如在4倍、3倍或2倍内。在一些实施方案中，“约”是指不超过所述参考值的100％的值。

可以将编码治疗性多肽的核酸掺入基因构建体中，所述基因构建体用作基因治疗方案的一部分，以递送可用于在细胞内表达和产生试剂的核酸。这些组分的表达构建体可以在任何治疗有效的载体中施用，例如能够在体内有效地将组分基因递送到细胞的任何制剂或组合物。方法包括将受试者基因插入病毒载体，包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒-1(HSV-1)或重组细菌或真核质粒。病毒载体可直接转染细胞；也可以在体内借助于例如阳离子脂质体(lipofectin)或其衍生物、聚赖氨酸缀合物、短杆菌肽S、人造病毒包膜或其它这样的细胞内载体，以及直接注射基因构建体或CaPO₄沉淀，来递送质粒DNA(参见，例如WO04/060407)。合适的逆转录病毒的实例包括本领域技术人员已知的pLJ、pZIP、pWE和pEM(参见例如Eglitis等，(1985)Science 230：1395-1398；Danos和Mulligan，(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：6460-6464；Wilson等，(1988)Proc NatlAcad Sci USA 85：3014-3018；Armentano等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6141-6145；Huber等，(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88：8039-8043；Ferry等，(1991)ProcNatl Acad Sci USA 88：8377-8381；Chowdhury等，(1991)Science 254：1802-1805；vanBeusechem等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：7640-7644；Kay等，(1992)Human GeneTherapy 3：641-647；Dai等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：10892-10895；Hwu等，(1993)J Immunol 150：4104-4115；美国专利号4,868,116和4,980,286；PCT公开号WO89/07136、WO89/02468、WO89/05345和WO92/07573)。另一种病毒基因递送系统利用腺病毒衍生的载体(参见，例如Berkner等，(1988)BioTechniques 6：616；Rosenfeld等，(1991)Science252：431-434；和Rosenfeld等，(1992)Cell 68：143-155)。衍生自腺病毒Ad5型dl324或其它腺病毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员已知的。可用于递送受试者基因的另一种病毒载体系统是腺相关病毒(AAV)。参见，例如Flotte等，(1992)AmJ Respir Cell Mol Biol 7：349-356；Samulski等，(1989)J Virol 63：3822-3828；和McLaughlin等，(1989)J Virol 62：1963-1973。

在一些实施方案中，组合物可以与一种或多种另外的治疗剂一起配制，例如用于增加骨形成、骨密度或骨量的另外的试剂。

当组合物与第二种活性剂组合使用时，组合物可以与第二种试剂共同配制，或者该组合物可以与第二种制剂分开配制。例如，可以将各自的药物组合物混合(例如，在给药前)，并且一起给药或分开施用，例如在相同或不同的时间(见下文)。

试剂盒

本公开还涉及用于施用本文所述的任何一种或多种多肽的包装的药物组合物或试剂盒，例如用于治疗与骨流失相关的病症或本文所述的任何其它病症(例如，癌症、代谢紊乱、肌肉消耗性疾病、肌肉骨骼疾病或免疫疾病)。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种本文所述的多肽和用于施用用于治疗病症的多肽的说明书。说明书可以描述如何(例如，皮下或静脉内)，以及何时(例如，在第0周、第2周、第4周等)，将不同剂量的一种或多种多肽施用于受试者进行治疗。

本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含药物组合物(包含一种或多种本文所述的多肽和药学上可接受的载体)，以及一种或多种药物组合物(其各自包含可用于治疗与骨流失相关的病症的另外的治疗剂和药学上可接受的载体)。或者，试剂盒包含单一药物组合物，其包含一种或多种本文所述的多肽，一种或多种用于治疗有需要的受试者的药物(例如，具有与骨流失相关的病症的受试者)和药学上可接受的载体。所述说明书可以描述如何(例如，皮下)和何时(例如，在0周、2周、4周等)，将不同剂量的一种或多种多肽和/或另外的治疗剂施用于受试者以进行治疗。试剂盒可以包含用于治疗本文所述病症(例如，与骨流失相关的病症)的药物组合物的给药说明。

在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种试剂和/或说明书，用于测试骨生长、骨密度、骨强度、骨形成等的至少一个标志的改善。

治疗应用

本文所述的多肽可用于许多治疗应用。例如，多肽可以增加骨形成、骨量、骨密度、骨强度等。因此，多肽可用于各种治疗应用，例如用于治疗或预防与骨流失、骨不足或骨损伤相关的疾病或病症。例如，本文所述的隐藏蛋白多肽可用于治疗患有与骨流失相关的病症(例如，骨质疏松症或佩吉特氏病)的受试者。在一些实施方案中，本公开提供通过向个体施用治疗有效量的本文所述的多肽来治疗或预防有需要的个体的骨损伤的方法。在一些实施方案中，本公开提供通过向个体施用治疗有效量的本文所述的多肽来促进有需要的个体中的骨生长或矿化的方法。这些方法优选针对动物(更优选，人)的治疗和预防性治疗。在一些实施方案中，本公开提供了本文所述的多肽用于治疗与低骨密度或降低的骨强度相关的病症的用途。

本文所述的组合物可以使用部分依赖于给药途径的各种方法施用于受试者，例如人受试者。途径可以是例如静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)注射或肌内注射(IM)。

可以通过例如局部输注、注射或通过植入物实现给药。植入物可以是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，例如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。植入物可以被配置为持续或定期地将组合物释放至受试者。参见，例如美国专利申请公开号20080241223；美国专利号5,501,856；4,863,457；和3,710,795；EP488401；和EP430539，其各自的公开内容通过引用整体并入本文。可以通过基于例如扩散、侵蚀、或对流系统(例如，渗透泵、可生物降解植入物、电扩散系统、电渗系统、蒸气压泵、电解泵、泡腾泵、压电泵、基于腐蚀的系统或机电系统)的可植入装置将组合物递送到受试者。

当用于本文时，术语“有效量”或“治疗有效量”是指在体内条件下足以治疗、抑制或缓解所治疗病症的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理作用(例如，治疗与骨流失相关的病症)的剂量。精确的剂量将根据诸如受试者依赖变量(例如，年龄、免疫系统健康状况等)、疾病和所进行的治疗的各种因素而变化。本文公开的药物的治疗有效量治疗、改善一种或多种症状，或预防(例如，延迟发作或降低症状发作的严重性)本文所述的病症，例如与骨流失相关的病症。

本文所述的任何抗体或其片段的合适的人剂量可进一步在例如I期剂量递增研究中进行评估。参见例如van Gurp等，(2008)Am J Transplantation 8(8)：1711-1718；Hanouska等，(2007)Clin Cancer Res 13(2，第一部分)：523-531；和Hetherington等，(2006)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50(10)：3499-3500。

这些组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物(例如,骨疾病的动物模型)中的已知药学过程来确定。可以使用这些过程，例如确定LD50(使群体中的50％致死的剂量)和ED50(使群体中的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50的比值。优选表现出高治疗指数的药剂。尽管可以使用表现出毒副作用的组合物，但应注意设计将这些化合物靶向受影响组织部位的递送系统，并尽可能减少对正常细胞的潜在损伤，从而减少副作用。

从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人体的剂量范围。这样的抗体或其抗原结合片段的剂量通常在多肽的循环浓度的范围内，所述浓度的范围包括具有很少或没有毒性的ED50。剂量可以在该范围内变化，该范围取决于所用的剂型和使用的给药途径。最初可以通过细胞培养测定法估算治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现包含在细胞培养物中测定的IC₅₀的循环血浆浓度范围(即达到症状的半数最大抑制的抗体的浓度)。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。在一些实施方案中，例如当需要局部给药时，可以使用细胞培养或动物建模来确定在局部位点内实现治疗有效浓度所需的剂量。

在本文所述的任何方法的一些实施方案中，可以将一种试剂与一种或多种另外的治疗剂(例如，用于治疗骨疾病的治疗剂)联合施用于哺乳动物。

当用于本文时，受试者优选是人，但也可以是非人灵长类动物(例如，猴，狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，受试者是驯养动物或农场动物。在一些实施方案中，哺乳动物是婴儿(例如，人类婴儿)。

当用于本文时，“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指通过适当的医疗人员(例如，在人类的情况下是指医生、护士或是执业护士；在非人类哺乳动物的情况下是兽医)的判断，将从给定的治疗(例如，用本文所述的一种或多种多肽的治疗)中合理地获益的受试者。在一些实施方案中，该受试者是被诊断为具有本文所述的病症的受试者，例如与骨流失相关的病症。

术语“预防”在本领域中是认可的，并且当与病症相关地使用时，在本领域中是被充分理解的，并且包括相对于不施用组合物的受试者，施用了组合物的受试者的医学病症症状的频率降低或延迟发病。

本文还提供诱导骨和/或软骨形成、预防骨流失、增加骨矿化或防止骨的脱矿质的方法。例如，本文所述的多肽可用于治疗骨质疏松症并修复人类和其它动物中的骨折和软骨缺损。多肽可用于在已诊断为亚临床低骨密度的患者中作为抵抗骨质疏松症发展的保护措施。

在一些实施方案中，本文所述的一种或多种多肽可用于在人类和其它动物中治疗骨折和软骨缺损。在一些实施方案中，本文所述的多肽可用于减少闭合和开放性骨折以及改进人造关节固定。由成骨剂引起的新生骨形成有助于先天性、创伤诱导的或肿瘤切除引起的颅面缺损的修复，并且还可用于美容整形手术。在一些实施方案中，一种或多种多肽可用于治疗骨质疏松症。

与骨流失相关的病症包括但不限于骨质疏松症(包括继发性骨质疏松症)、甲状旁腺功能亢进、库兴氏病、佩吉特氏病、甲状腺毒症、慢性腹泻状态或吸收不良、肾小管性酸中毒或神经性厌食。骨质疏松症可能由各种因素引起，或与其相关。作为女性，特别是体重较轻的绝经后女性，并且导致久坐的生活方式都是骨质疏松症的风险因素(骨矿物质密度的丧失，导致骨折风险)。具有以下任何一个状况的人可以是使用本文所述的一种或多种多肽进行治疗的候选者：绝经后妇女，且不服用雌激素或其它激素替代疗法；本人或母系历史具有髋部骨折或吸烟史的人；绝经后的女性身高(超过5英尺7英寸)或瘦(小于125磅)；患有骨流失相关临床病症的人；使用已知会引起骨流失的药物的人，所述药物包括皮质类固醇如Prednisone^TM，各种抗癫痫药物如Dilantin^TM和某些巴比妥类药物或大剂量甲状腺替代药物；患有I型糖尿病，肝病、肾病或骨质疏松症家族史的人；具有高骨转换率的人(例如，尿样中的胶原蛋白过多)；患有甲状腺疾病患者，如甲状腺机能亢进；仅有轻度创伤后经历骨折的人；曾经有X射线证据显示椎体骨折或其它骨质疏松征象的人。

如上所述，骨质疏松症也可以是由另一种病症相关的状况或由于使用某些药物导致。由药物或其它医疗状况引起的骨质疏松症称为继发性骨质疏松症。在称为库兴氏病的情况下，由身体产生的过量的皮质醇导致骨质疏松和骨折。与继发性骨质疏松症相关的最常见的药物是皮质类固醇，其为一类像皮质醇一样起作用的药物，所述皮质醇是一种由肾上腺天然产生的激素。尽管骨骼的发育需要足够水平的甲状腺激素(由甲状腺产生)，但过量的甲状腺激素会随着时间的推移减少骨量。肾脏受损的人群，特别是透析患者，高剂量摄取含有铝的抗酸剂时可导致骨质流失。可引起继发性骨质疏松症的其它药物包括用于预防癫痫发作的苯妥英钠(Dilantin)和巴比妥类；甲氨蝶呤(Rheumatrex，Immunex，FolexPFS)，其是用于一些类型的关节炎、癌症和免疫疾病的药物；环孢菌素(Sandimmune，Neoral)，其是一种用于治疗某些自身免疫性疾病并抑制器官移植患者免疫系统的药物；促黄体激素释放激素激动剂(Lupron，Zoladex)，其用于治疗前列腺癌和子宫内膜异位症；肝素(Calciparine，Liquaemin)，一种抗凝药；和考来烯胺(Questran)和考来替泊(Colestid)，其用于治疗高胆固醇。癌症治疗引起的骨损失已被广泛认识，并将其称为癌症治疗引起的骨流失(CTIBL)。骨转移会在骨中产生腔，其可以用本文所述的一种或多种多肽进行治疗来矫正。因此，本文所述的多肽也可用于治疗与癌症相关的骨流失。

在一些实施方案中，多肽可用于增加有需要的受试者中的肌肉量或强度。例如，该多肽可用于治疗患有肌肉消耗性病症的受试者。在一些实施方案中，待治疗的受试者(例如，人)具有肌肉消耗性病症或患有肌肉萎缩。如本文所用的肌肉消耗性疾病包括肌肉消耗性是主要症状之一的疾病或病症，例如肌营养不良症、脊椎损伤、神经变性疾病、厌食症、肌肉减少症、恶病质(“Cachexia”)、由于固定引起的肌肉萎缩、长时间卧床休息或失重等，以及在疾病或疾病前状态(例如，II型糖尿病或X综合征)中涉及的异常高的脂肪与肌肉比例的疾病。

由于缺乏使用、衰老、饥饿以及多种疾病、病症和症状(诸如脓毒症、肌营养不良、艾滋病、衰老和癌症)的结果，骨骼肌的萎缩会在成年动物的肌肉中发生。一般而言，肌肉损失的特征在于蛋白质含量、力的产生、抗疲劳性和肌纤维直径的下降。这些下降可归因于蛋白质合成的减少和蛋白质降解的增加。本发明的组合物和方法所针对的肌肉消耗和相关症状包括任何在其中增强肌肉生长、或减少肌肉消耗会产生治疗结果或其它期望结果的症状。症状包括肌营养不良症、肌肉减少症、恶病质、糖尿病，并且肌肉量的改善是(例如，在食用动物中)合乎道德的和所期望的。

如上所述，一类肌肉消耗性病症是肌营养不良症。这些是神经肌肉疾病的异质组，其中包括最常见的类型，杜兴氏肌营养不良(DMD)、多种类型的肢带型肌营养不良(LGMD)和其它先天性肌营养不良(CMD)。进行性肌肉损伤和肌肉损失、组织炎症和用纤维性和脂肪组织替代健康肌肉导致肌肉营养不良中的肌肉消耗性。极度肌肉损失是该疾病最突出的症状之一，并导致并发症和症状，包括死亡。

肌肉减少症是与年龄相关的肌肉量、力量和功能损失。它开始于生命的第四个十年，并在大约75岁之后加速。许多因素，包括身体不活动、运动单位重塑、激素水平降低和蛋白质合成减少都可能导致肌肉减少。除了身体不活动之外，所有这些都可以进行遗传控制，其中基因调控可能是有用的。例如，肌肉蛋白质合成和蛋白质分解的速率影响肌肉减少症。蛋白质合成和分解的平衡决定了体内的蛋白质含量。研究一致性地报导老年人的肌肉蛋白质合成率比年轻成年人低。肌肉蛋白质分解代谢减少(例如，通过基因调控影响)可能减少或逆转肌肉量流失。

恶病质是与各种严重疾病有关的病症，包括癌症、艾滋病、败血症和充血性心力衰竭。其主要影响是脂肪组织和骨骼肌的大量流失，这不是由营养不良引起的。恶病质导致了所有癌症死亡的近三分之一。在尚不清楚的过程中，细胞因子和肿瘤因子通过抑制肌肉基因产物介导消耗。已经显示恶病质因子在靶向肌球蛋白重链中是有选择性的。恶病质病变涉及几个系统的复合破坏，这导致贫血、胰岛素抵抗、免疫抑制和急性期反应激活。由此产生的进行性虚弱会使患有癌症的患者更容易受到辐射和化疗的毒性作用的影响；许多这样的患者死于与恶病质相关的综合征，而不是因为其肿瘤。

如上所述，本文所述的多肽结合并抑制激活素A和激活素B的活性。激活素已被证明可以通过胰岛来调节胰岛素的产生。Tsuchida等，(2004)Mol Cell Endocrinol 220(1- 20)：59-65和Wu等，(2014)Diabetologia 57(1)：148-156。因此，虽然本公开不受任何特定理论或作用机理的约束，但是本文所述的多肽也可用于治疗代谢紊乱，例如与胰岛素产生不足相关的病症。代谢紊乱可以是例如2型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、高血糖症和肥胖症。

在另一方面，本发明表征了用于治疗患有免疫病症(例如，炎性疾病或自身免疫性疾病)的受试者的方法。该方法包括给予受试者足以治疗免疫病症的量的一种或多种任意的本文所述的多肽。在一些实施方案中，免疫疾病是与异常宿主防御反应相关的疾病。在一些实施方案中，免疫疾病可以是，例如：(a)由感染、有毒物质或创伤造成的组织的急性损伤、来自手术的伤口愈合、严重的烧伤或其它组织损伤、脑膜炎、阑尾炎、肾小管坏死、创伤性脑损伤和脓毒症；(b)自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病、血管炎、抗磷脂综合征、硬皮病、系统性红斑狼疮和骨关节炎；(c)呼吸系统疾病，包括但不限于肺炎、结节病、闭塞性细支气管炎、肺动脉高压、肺炎、急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病(COPD)、对感染性试剂(如，致病性病毒)的急性反应，包括但不限于甲型流感病毒H5N1和H1N1，冠状病毒SARS和人类鼻病毒C和D。参见例如欧洲专利申请公开号2594280。

多肽也可用于治疗患有增殖性疾病(如，癌症)的受试者。在一些实施方案中，哺乳动物是患有或被怀疑患有癌症或感染或有发展为癌症或感染的风险的哺乳动物。癌症是一类疾病或病症，其特征在于细胞的不受控制的分裂及其通过入侵直接生长到相邻组织中或通过转移植入远处的区域(其中癌细胞通过血液或淋巴系统运输)的扩散能力。癌症可以影响所有年龄段的人，但随着年龄增长，风险往往会增加。癌症的类型可以包括例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神经组织癌(例如，神经母细胞瘤)、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。血液肿瘤(液体肿瘤)包括例如白血病(例如，慢性淋巴细胞白血病例如B细胞或T细胞型慢性淋巴细胞白血病)和多发性骨髓瘤。骨癌包括但不限于骨肉瘤和骨癌。

在一些实施方案中，癌症包括表达激活素A和/或激活素B的一种或多种受体的癌细胞。在一些实施方案中，癌症包括增殖(例如，增殖的速率或幅度)和/或存活力受到激活素A或激活素B积极影响的癌细胞。参见，例如Togashi等，(2015)CancerLett356(2PtB)：819-827；Marino等，(2014)Mol Hum Reprod 20(12)：1223-1237；Kang等，(2009)J BoneMiner RES 24(7)：1180-1193；Hoda等，(2012)Br J Cancer 107：1978-1986；和Wildi等，(2001)Gut 49(3)：409-417。用于检测癌细胞的激活素受体的存在或表达水平的方法是本领域已知的，并且描述于例如Wildi等，同上。

基因表达可以以例如目标蛋白的蛋白质或mRNA表达的形式进行检测。也就是说，可以通过检测和/或测量mRNA或蛋白质表达的水平来确定蛋白质的存在或表达水平(量)。

可以使用多种合适的方法来检测和/或测量蛋白质的mRNA表达水平。例如，可以使用Northern印迹或斑点印迹分析、逆转录酶-PCR(RT-PCR，例如定量RT-PCR)、原位杂交(例如，定量原位杂交)或核酸阵列(例如，寡核苷酸阵列或基因芯片)分析确定mRNA表达。这些方法的细节在下文和例如如下文献中描述：Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，卷1、2和3，Cold Spring Harbor Laboratory Press：ColdSpring Harbor，NY，USA，1989年11月；Gibson等，(1999)Genome Res 6(10)：995-1001；和Zhang等，(2005)Environ Sci Technol 39(8)：2777-2785；美国专利号申请公开号2004086915；欧洲专利号0543942；和美国专利号7,101,663；其各自的公开内容通过引用整体并入本文。

在一个实例中，生物样品中一个或多个离散mRNA群体的存在或量可以通过分离来自生物样品的总mRNA来确定(参见，例如Sambrook等，(同上)和美国专利号6,812,341)，并将分离的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳以按大小分离mRNA。然后将按大小分离的mRNA转移(例如，通过扩散)到固体支持物，例如硝酸纤维素膜。然后可以使用与目标mRNA序列互补的一个或多个可检测标记的多核苷酸探针来确定生物样品中一个或多个mRNA群体的存在或量，所述多核苷酸探针结合相应的mRNA群体并因此使其可检测到其相应的mRNA群体。可检测的标记包括例如荧光素(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹酰氯、别藻蓝蛋白(APC)或藻红蛋白)、发光标记(例如，由Quantum Dot Corporation(PaloAlto，CA)提供的铕、铽、Qdot^TM纳米颗粒)，放射性标记(例如，125I、131I、35S、32P、33P或3H)和酶标记(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)。

在另一个实例中，可以使用核酸(或寡核苷酸)阵列确定生物样品中mRNA的离散群体的存在或数量。例如，可以使用具有随机六聚体或寡聚(dT)-引物介导的第一链合成的RT-PCR来扩增来自生物样品的分离的mRNA。RT-PCR步骤可用于可检测地标记扩增子，或者任选地，扩增子可以在RT-PCR步骤之后被可检测地标记。例如，可检测的标记物可使用各种合适技术中的任何一种通过酶促(例如，通过切口翻译或激酶例如T4多核苷酸激酶)或化学偶联于扩增子(参见，例如Sambrook等，同上)。然后将可检测标记的扩增子与多个多核苷酸探针组接触，每组多核苷酸探针组含有一种或多种对相应扩增子特异(并能够结合)的多核苷酸(例如，寡核苷酸)探针，其中许多含有很多探针组，其各自对应不同的扩增子。通常，探针组结合到固体支持物上，并且每个探针组的位置在固体支持物上是预设的。可检测标记的扩增子与探针组的相应探针的结合表明生物样品中靶mRNA的存在或量。使用核酸阵列检测mRNA表达的其它方法描述于例如美国专利号5,445,934；6,027,880；6,057,100；6,156,501；6,261,776；和6,576,424；其各自的公开内容通过引用整体并入本文。

检测和/或定量可检测标记的方法取决于标签的性质。由适当的酶催化的反应产物(其中可检测标记是酶；见上文)可以是但不限于荧光、发光或放射性，或者它们可以吸收可见光或紫外光。适用于检测这种可检测标记的检测器的实例包括但不限于X射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、发光计和密度计。

可以通过多种方法从组织样品中提取RNA，例如通过硫氰酸胍裂解，然后进行CsCl离心(Chirgwin等，1979，Biochemistry18:5294-5299)。来自单细胞的RNA可以从用于从单细胞制备cDNA文库的方法中获得，例如在Dulac，(1998)Curr Top Dev Biol 36：245和Jena等，(1996)J Immunol Methods 190：199中所描述的。必须注意避免RNA降解，例如通过包含RNA酶抑制剂。

然后可以将RNA样品以特定类别富集。在一个实施方案中，从RNA样品中分离出聚(A)⁺RNA。通常，这种纯化利用mRNA上的poly-A尾。特别地，如上所述，poly-T寡核苷酸可以固定在固体支持物上以用作mRNA的亲和配体。用于此目的的试剂盒可商购，例如MessageMaker试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)。

可用于本文所述方法的探针的类型包括cDNA、核糖探针、合成的寡核苷酸和基因组探针。所使用的探针的类型一般由特定情况决定，例如用于原位杂交的核糖核酸探针，以及用于Northern印迹的cDNA。在一个实施方案中，探针针对RNA独特的核苷酸区域。探针可以如差异识别标记mRNA转录物所需的那样短，并且可以短至例如15个碱基；然而，可以使用至少17、18、19或20个或更多个碱基的探针。在一个实施方案中，引物和探针在严格条件下特异性地与具有对应于标记物的核苷酸序列的DNA片段杂交。当用于本文时，术语“严格条件”是指杂交仅在核苷酸序列中具有至少95％同一性时才发生。在另一个实施方案中，当在序列之间存在至少97％的同一性时，发生“严格条件”下的杂交。

探针的标记形式可以是适当的任何形式，例如使用放射性同位素，例如³²P和³⁵S。通过使用适当标记的碱基可以实现放射性同位素的标记，无论探针是化学合成还是生物合成的。

在某些实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的多肽分子。或者，生物样品可以含有来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。

在其它实施方案中，所述方法还涉及从对照受试者获得对照生物样品，使对照样品与能够检测标记多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的化合物或试剂接触，检测标记多肽、mRNA、基因组DNA或其片段在生物样品中的存在，并将对照样品中标记多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在与测试样品中的标记多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在进行比较。

还可以通过检测和/或测量蛋白质(例如，融合蛋白)的表达来确定融合蛋白的表达。确定蛋白质表达的方法通常涉及使用对目标靶蛋白有特异性的抗体。例如，确定蛋白质表达的方法包括但不限于蛋白质印迹或斑点印迹分析、免疫组织化学(例如，定量免疫组织化学)、免疫细胞化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫吸附识别(ELISPOT；Coligan等编写，(1995)Current Protocols in Immunology，Wiley，NewYork)或抗体阵列分析(参见，例如美国专利号申请公开号20030013208和2004171068，其各自的公开内容通过引用整体并入本文)。上述许多方法的进一步描述和用于检测蛋白质表达的其它方法可以在例如Sambrook等，(同上)中找到。

在一个实例中，可以使用蛋白质印迹技术测定蛋白质表达的存在或量。例如，可以从生物样品制备裂解物，或者将生物样品本身与Laemmli缓冲液接触，并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。然后将经根据大小分离的SDS-PAGE解析的蛋白质转移到过滤膜(例如，硝化纤维素)上，并使用对目标蛋白质特异性的可检测标记的抗体进行免疫印迹技术。结合的可检测标记的抗体的存在或量表示生物样品中蛋白质的存在或量。

在另一个实例中，免疫测定可用于检测和/或测量蛋白质的蛋白质表达。如上所述，为了检测的目的，可以用携带检测部分的抗体(例如，荧光剂或酶)进行免疫测定。来自生物样品的蛋白质可以直接缀合到固相基质(例如，多孔测定板、硝化纤维素、琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)、编码的颗粒或磁珠)，或者它可以与特异性结合对(例如，生物素或链霉亲和素)的第一成员缀合，特定结合对的的第一成员通过与特异性结合对(例如，链霉抗亲和素或生物素)的第二成员结合连接到固相基质上。与固相基质的这种连接允许在与检测抗体接触之前将蛋白质从生物样品的其它干扰或不相关的组分中纯化出来，并且还允许随后洗脱未结合的抗体。如上所述，结合的可检测标记的抗体的存在或量表明生物样品中蛋白质的存在或量。

用于产生对蛋白质特异性的抗体或抗体片段的方法可以是通过免疫来产生，例如使用动物，或通过体外方法(如，噬菌体展示)产生。包括全部或部分靶蛋白的多肽可用于产生抗体或抗体片段。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体的制备物。

用于检测或测量基因表达的方法可以任选以允许快速制备、加工和分析多个样品的形式进行。这可以是例如在多孔测定板(例如，96孔或386孔)或阵列(例如，核酸芯片或蛋白质芯片)中。各种试剂的储备溶液可以手动或机器提供，随后的样品制备(例如，RT-PCR、标记或细胞固定)、移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育(例如，杂交)、样品读数、数据采集(光学数据)和/或分析(计算机辅助图像分析)可以使用商业上可获得的分析软件、机器人技术和能够检测从测定中产生的信号的检测仪器来机器进行。这种检测器的实例包括但不限于分光光度计、发光计、荧光计和测量放射性同位素衰变的装置。示例性的基于高通量的基于细胞的测定(例如，检测细胞中靶蛋白的存在或水平)可以使用ArrayVTI HCSReader或HCS Reader技术(Cellomics Inc.，Pittsburg，PA)。

当用于本文时，处于“发展成癌症的风险”的受试者是具有发展成癌症的一个或多个(例如，二、三、四、五、六、七、或八个或更多)风险因素的受试者。例如，具有发展成癌症风险的受试者可以具有发展成癌症的倾向(即，发展成癌症的遗传易感性，例如肿瘤抑制基因(例如，BRCA1、p53、RB或APC)中的突变)或已经暴露于可导致所述状况的条件下。因此，当受试者已经暴露于某些化合物的致突变或致癌水平(例如，香烟烟雾中的致癌化合物，例如丙烯醛、砷、苯、苯并[a]蒽，苯并[a]芘、钋-210(氡)，氨基甲酸酯或氯乙烯)时，可以是具有发展成癌症风险的受试者。此外，当受试者暴露于例如大剂量的紫外线或X射线照射或暴露(例如，感染)于引起肿瘤/肿瘤相关的病毒(例如，乳头瘤病毒、Epstein-Barr病毒、乙型肝炎病毒或人类T细胞白血病淋巴瘤病毒)时，该受试者可以是“处于发展成癌症的风险”。癌症是一类疾病或病症，其特征在于细胞的不受控制的分裂及其通过入侵直接生长到相邻组织中或通过转移植入远处的区域(其中癌细胞通过血流或淋巴系统运输)。癌症可以影响所有年龄段的人，但随着年龄增长，风险往往会增加。癌症的类型可以包括例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌，肝癌、骨癌、血液癌、神经组织癌(例如，成胶质细胞瘤如多形性成胶质细胞瘤)、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。

“疑似患有”癌症或感染的受试者是具有一种或多种癌症或感染症状的受试者。应当理解，处于发展成癌症或感染的风险中或怀疑患有癌症或感染的哺乳动物不覆盖目标物种内的所有哺乳动物。

在一些实施方案中，本文所述的多肽可以作为更广泛的治疗方案的一部分来进行施用，治疗方案包括用于目标综合征的一种或多种另外的疗法。也就是说，本文所述的多肽可以与其它药剂联合施用。联合施用可以通过施用单一共同制剂，通过同时施用或通过在不同时间施用来实现。

在一些实施方案中，如果与其它骨活性剂一起施用，则本文所述的多肽可能是特别有利的。患者可以从联合接受本文所述的一种或多种多肽并服用钙补充剂、维生素D、适当的运动和/或在某些情况下的其它药物而受益。其它药物的实例包括双膦酸盐(例如，阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐和利塞膦酸盐)、降钙素、雌激素、甲状旁腺激素和雷洛昔芬(见上文)。

在一些实施方案中，本文所述的多肽可以与一种或多种抗癌疗法一起施用。合适的抗癌疗法包括例如化学治疗剂、电离辐射、免疫治疗剂或热疗法。化疗剂包括但不限于：氨卡那普胺、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、bcg、比卡鲁胺、博来霉素、布舍瑞林、白消安、喜树碱、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸盐、秋水仙碱、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、双烯雌酚、己烯雌酚、多西他赛、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格拉司他、氟达拉滨、氟替卡松、氟尿嘧啶、氟西汀、氟他胺、吉西他滨、染料木素、戈舍瑞林、羟基脲、伊多比星、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素、伊立替康、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、左旋咪唑、洛莫司汀、美氯铵，甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌，尼鲁米特、诺考达唑、奥曲肽、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、卟菲尔钠、甲基苄肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链脲佐菌素、苏拉明、他莫昔芬、紫杉醇、替莫唑胺、替尼泊苷、睾酮、硫鸟嘌呤、噻替派、二氯二茂钛、托泊替康、曲妥珠单抗、维A酸、长春花碱、长春新碱、去乙酰长春新碱和长春瑞滨。

这些化学治疗性抗肿瘤化合物可以通过其作用机理分为几组，包括例如：抗代谢物/抗癌剂，例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物如长春花生物碱(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)，微管干扰剂例如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃坡霉素和诺维本、表鬼臼毒素(依托泊苷，替尼泊苷)，DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环霉素、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷氮介、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺奥沙利铂、异环磷酰胺、美法仑、氮芥、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、甲苄肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星，蒽环霉素，米托蒽醌，博来霉素，普卡霉素(丝霉素)和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶系统地代谢L-天冬酰胺，剥夺本身不具有合成天冬酰胺能力的细胞)；抗血小板药；抗增殖/抗有丝分裂的烷基化剂如氮芥(二氯甲基二乙胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)、trazenes-达卡巴嗪(DTIC)；抗增生/抗有丝分裂的抗代谢药如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配合物(顺铂、卡铂)、甲苄肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；荷尔蒙、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；免疫调节剂(沙利度胺及其类似物，如来那度列(Revlimid，CC-5013)和CC-4047(Actimid))、环磷酰胺)；抗血管生成化合物(TNP-470、染料木碱)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂))；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维A酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、恩因苷(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和胱天蛋白酶激活剂；和染色质干扰剂。

术语“免疫治疗剂”可以包括可以刺激宿主免疫系统以产生对受试者的肿瘤或癌症的免疫应答的任何分子、肽、抗体或其它试剂。用于组合物的各种免疫治疗剂是本领域已知的，并且包括例如PD-1和/或PD-1L抑制剂、CD200抑制剂、CTLA4抑制剂等。示例性PD-1/PD-L1抑制剂(例如，抗-PD-1和/或抗-PD-L1抗体)是本领域已知的并且在例如国际专利申请公开WO2010036959和WO2013/079174以及美国专利号8,552,154和7,521,051中描述，其各自的涉及抗体描述的公开内容通过引用整体并入本文。示例性的CD200抑制剂在本领域也是已知的，并且在例如国际专利申请公开号WO2007084321中描述。以下文献描述了合适的抗CTLA4拮抗剂：国际专利申请公开号WO2001/014424和WO2004/035607；美国专利号申请公开No.2005/0201994；和欧洲专利EP1212422。美国专利号5,811,097,5,855,887,6,051,227和6,984,720中描述了另外的CTLA-4抗体。

在另一个实施例中，使用放射治疗。用于放射治疗的辐射可以是电离辐射。放射治疗也可以是伽马射线、X射线或质子束。放射治疗的实例包括但不限于外束放射治疗、放射性同位素(I-125，钯，铱)的间质植入、诸如锶-89的放射性同位素、胸部放射治疗、腹腔内P-32放射治疗，和/或全部腹部和盆腔放射治疗。关于放射治疗的一般概述，参见Hellman，第16章：Principles of Cancer Management:Radiation Therapy，第6版，2001，DeVita等，编辑，J.B.Lippencott Company，Philadelphia。放射治疗可以作为外部束辐射或远程治疗来施用，其中辐射是从远程源引导的。放射治疗也可以作为内部治疗或近距离放射治疗来施用，其中放射源放置在身体内靠近癌细胞或肿瘤块。还包括使用光动力疗法，其包括施用光敏剂，例如血卟啉及其衍生物、维托芬(BPD-MA)、酞菁、光敏剂Pc4、脱甲氧基竹红菌素A；和2BA-2-DMHA。

在一些实施方案中，使用激素治疗。激素治疗可以包括例如激素激动剂，激素拮抗剂(例如，氟他胺、比卡鲁胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林醋酸酯(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)，激素生物合成和过程抑制剂和类固醇(例如，地塞米松、维甲酸，deltoids、倍他米松、皮质醇、可的松、泼尼松、脱氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕激素)，维生素A衍生物(例如，全反式视黄酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗前列腺素(例如，米非司酮、奥那司酮)或抗雄激素(例如，醋酸环丙孕酮)。

在一些实施方案中，使用热疗，其中身体组织暴露于高温(高达106°F)的过程，来治疗癌症或被选择作为对受试者的治疗。热可能有助于通过破坏细胞或剥夺他们生存需要的物质来收缩肿瘤。热疗可以是局部、区域和全身热疗，采用外部和内部加热装置。热疗几乎总是与其它形式的治疗(如，放射治疗、化疗和生物治疗)一起使用，以提高其疗效。局部热疗是指施加到非常小的区域(例如，肿瘤)的加热。该区域可以从身体外部的装置的高频波在外部朝向肿瘤加热。为了实现内部加热，可以使用几种类型的无菌探针之一，包括薄的加热线或填充有温水的中空管；植入微波天线；和射频电极。在区域性热疗中，器官或肢体被加热。产生高能量的磁体和设备放置在要加热的区域上。在另一种称为灌注方法中，一些患者的血液被去除，加热，然后泵入(灌注)到要在内部被加热的区域中。全身加热用于治疗遍及全身的转移性癌症。可以使用温水毯、热蜡、感应线圈(如，电热毯)、或热室(类似于大孵化器)来完成。热疗不会引起辐射副作用或并发症的明显增加。然而，直接施用于皮肤的热会在约半数治疗的患者中引起不适或甚至显著的局部疼痛。它也会引起通常快速愈合的水疱。

在一些实施方案中，光动力疗法(也称为PDT、光照射治疗、光疗法或光化学疗法)用于治疗某些类型的癌症。这是基于这样的发现：当生物暴露于特定类型的光时，称为光敏剂的某些化学物质可以杀死单细胞生物体。PDT通过使用固定频率激光与光敏剂组合来破坏癌细胞。在PDT中，将光敏剂注射到血液中并被全身的细胞吸收。该药物在癌细胞中比在正常细胞中停留更长的时间。当处理的癌细胞暴露于激光时，光敏剂吸收光并产生破坏经处理的癌细胞的活性形式的氧。必须仔细调整曝光时间点，以使其发生在大多数光敏剂已经离开了健康细胞但仍存在于癌细胞中。PDT中使用的激光可以通过光纤(非常薄的玻璃绞线)引导。将光纤放置在癌症附近以传递适量的光。光纤可以通过支气管镜进入肺部用于治疗肺癌或通过内窥镜进入食道以治疗食管癌。PDT的优点在于它对健康组织造成的伤害最小。然而，因为目前使用的激光不能通过超过约三厘米的组织(稍微超过一又八分之一英寸)，所以PDT主要用于治疗在皮肤上或稍稍在皮肤下或在内脏器官的内膜上的肿瘤。光动力治疗使皮肤和眼睛在治疗后6周或更长时间对光敏感。建议患者在至少6周内避免阳光直射和明亮的室内光线。如果患者必须走出户外，则需要戴防护服，包括太阳眼镜。PDT的其它暂时性副作用与特定区域的治疗有关，可能包括咳嗽、吞咽困难、腹痛、呼吸疼痛或呼吸急促。1995年12月，美国食品和药物管理局(FDA)批准了一种名为卟吩姆钠或的光敏剂，以缓解导致梗阻的食管癌症状或用于单独用激光治疗不能令人满意的食管癌。1998年1月，FDA批准了卟吩姆钠治疗早期非小细胞肺癌的患者，其不适合用常规治疗肺癌的疗法。国家癌症研究所和其它机构正在支持临床试验(研究)，以评估使用光动力疗法治疗几种类型的癌症，包括膀胱癌、脑癌、喉癌和口腔癌。

在一些实施例中，使用激光治疗来利用高强度光来破坏癌细胞。这种技术通常用于缓解癌症的症状，例如出血或梗阻，特别是当癌症不能通过其它疗法治愈时。它也可用于通过收缩或破坏肿瘤来治疗癌症。术语“激光”代表受激辐射的光放大。诸如来自灯泡的普通光具有许多波长并在各个方向上传播。另一方面，激光具有特定的波长并且聚焦在窄光束中。这种高强度光包含很多能量。激光非常强大，可用于切割钢材或使钻石成型。激光也可用于非常精确的外科手术，例如修复眼睛中损伤的视网膜或切开组织(代替手术刀)。虽然有几种不同种类的激光，但在医学上只有三种在医学上得到广泛的应用：二氧化碳(CO2)激光：这种激光可以从皮肤表面去除薄层，而不会穿透深层皮肤。这种技术特别适用于治疗尚未深入皮肤的肿瘤和某些癌前病症。作为传统手术刀手术的替代方案，CO2激光也能够切割皮肤。以这种方式使用激光去除皮肤癌。钕：钇-铝-石榴石(Nd：YAG)激光：来自该激光的光可以比来自其它类型激光的光穿透更深的组织，并且可以使血液迅速凝结。它可以通过光纤传递到身体较不易到达的部位。这种类型的激光有时用于治疗喉癌。氩激光：该激光只能穿过组织的表层，因此可用于皮肤科和眼科手术。它也与光敏染料一起使用，以一种称为光动力疗法(PDT)的方法治疗肿瘤。激光与标准外科手术工具相比具有以下优点，包括：激光比手术刀更精确。切口附近的组织被保护起来，因为与周围皮肤或其它组织几乎没有接触。激光产生的热消毒了手术部位，从而降低感染的风险。可能需要更少的手术时间，因为激光的精度允许较小的切口。加热时间往往缩短；由于激光加热密封了血管，因此出血少、肿胀少或疤痕少。激光手术可能不那么复杂。例如，通过使用光纤，激光可以被引导到身体的一部分而不需要大的切口。更多的程序可以在门诊的基础上进行。激光可以以两种方式用于治疗癌症：通过加热收缩或破坏肿瘤，或通过激活破坏癌细胞的化学物质(称为光敏剂)。在PDT中，光敏剂停留在癌细胞中，可以被光刺激引起杀死癌细胞的反应。CO2和Nd：YAG激光用于收缩或破坏肿瘤。它们可以与内窥镜一起使用，内窥镜为管状，其允许医生查看到身体的某些区域，例如膀胱。来自一些激光的光可以通过装配有光纤的柔性内窥镜传输。这允许医生查看并处理身体的一些部位，这些部位除了手术其他方法不能到达，因此允许激光束非常精确地瞄准。激光也可以与低功率显微镜一起使用，使医生清楚地看到被治疗的部位。激光系统与其它仪器一起使用时可以产生直径小至200微米的切割面积(小于非常细的线的宽度)。激光用于治疗许多类型的癌症。激光手术是声门(声带)癌、子宫颈癌、皮肤癌、肺癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌的某些阶段的标准疗法。除了用于摧毁癌症之外，激光手术还用于帮助缓解由癌症引起的症状(姑息治疗)。例如，激光可以用于收缩或破坏阻塞患者气管(trachea)(气管(windpipe))的肿瘤，使其更容易呼吸。有时它也用于缓解结肠直肠癌和肛门癌。激光诱导的间质热疗(LITT)是激光治疗最新发展之一。LITT使用与称为热疗的癌症治疗相同的想法；加热可能有助于通过破坏细胞或剥夺他们生存需要的物质来收缩肿瘤。在这种治疗中，激光被引导到体内的间质区域(器官之间的区域)。激光随后升高肿瘤的温度，损伤或破坏癌细胞。

以下示例旨在说明而不是限制本公开。

实施例

实施例1：材料与方法

TGF-β家族配体：重组激活素A、激活素B、Nodal(3218-ND-025/CF)、GDF-1(6937-GD-010/CF)、GDF-3(958-G3-010)、GDF-8、GDF-11(1958-GD-010/CF)、TGF-β-1、BMP-2(355-BM-010/CF)、BMP-4(314-BP-010/CF)和BMP-9(3209-BP-010/CF)购自R&D Biosystem。Nodal、GDF-3和GDF-11在大肠杆菌中产生，而所有其它配体均用哺乳动物细胞表达。(在某些情况下，在大肠杆菌中产生的不同批次的材料具有不同的活性。)

表达质粒：合成的人ACTRIIA-hIgG-Fc、ACTRIIB-hIgG-Fc、ALK4-hIgg-Fc和隐藏蛋白-hIgG-Fc基因获自Life Technologies融合构建体包括人ACTRIIA(氨基酸1-120)、ACTRIIB(氨基酸1-120)、ALK4(氨基酸1-110)和隐藏蛋白(氨基酸1-155)的细胞外结构域(ECD)。功能结构域与人IgG1Fc(SEQ ID NO:21)通过22个氨基酸长的接头(SEQ IDNO:18)连接，所述接头含有TEV切割位点、富含甘氨酸/丝氨酸的区域和FLAG标签。Cripto-1和BMPRII克隆自从ThermoScientific获得的cDNA。使用PCR将包含Cripto1(1-161)和BMPRII(1-120)的扩增子与hIgG1-Fc结构域融合。

蛋白质纯化：使用蛋白A捕获将ACTRIIA-Fc、ACTRIIB-Fc、ALK4-Fc、BMPRII-Fc、隐藏蛋白-Fc和Cripto-1-Fc以及激活素A、激活素B、GDF-8、TGF-β-1从条件培养基(CHO细胞培养)中纯化。用100mM甘氨酸(pH3.0)洗脱蛋白质，并立即用2M Tris(pH9.0)中和。使用固定金属亲和色谱法从条件培养基中捕获Nodal。通过尺寸排阻色谱进一步纯化或分析蛋白质以确定单分散性。将纯化的蛋白质透析至pH7.5的磷酸盐缓冲盐水中，并储存于-20℃或-80℃。在还原和非还原条件下，用SDS-PAGE或WesternBlot检测蛋白质的纯度。对于抑制测定，使用烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶除去Fc融合蛋白的Fc部分，然后进行蛋白A亲和色谱和尺寸排阻色谱。

细胞系：从ATCC获得A204细胞(HTB-82)和HOS细胞(CRL-1543)。根据ATCC(美国模式菌种收集中心)培养条件(补充有10％FBS、0.2单位/ml牛胰岛素(SigmaAldrich，11070-73-8)和1％青霉素/链霉素(P/S)混合物的RPMI培养基)培养细胞。对于成骨细胞研究，将HOS细胞维持在具有10％FBS和1％P/S的α-MEM中。细胞在37℃加湿、5％CO₂的条件下生长。在进行测定之前，将新鲜解冻的细胞传代至少三次。

免疫印迹：将2.0×10⁵个细胞铺板在24孔板中，并在完全培养基中生长至80％汇合，用1X PBS洗涤，饥饿过夜，并在含或不含有39nM激活素A或激活素B的无血清培养基中再生长24小时。用17.8或178nM隐藏蛋白(Cryptic)-1-Fc或ACTRIIA-Fc处理细胞。通过使用冰冷的RIPA裂解缓冲液(150mM NaCl，1％NP40，0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.5％脱氧胆酸钠，50mM Tris pH 8.0，1X‘RecomProteaseArrest'蛋白酶抑制剂混合物(G-Biosciences，786-436)和2X'PhosphataseArrest'磷酸酶抑制剂混合物(G-Biosciences，786-450))制备蛋白裂解物。将细胞裂解物储存在-80℃。使用Bradford测定裂解物的蛋白质浓度。对于Western印迹，在还原条件下，在“AnykD”SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，456-9035)上分离等量的蛋白质，并转移到Hybond-P膜(GE Healthcare，RPN2020F)中。用5％BSA封闭膜，并以1:1000稀释度与初级抗磷酸化Smad2(Cell Signaling，3108S)，抗Smad2(Cell Signaling，5339S)或抗肌动蛋白(Cell Signaling，3108S)抗体孵育，随后通过与1：2000稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。使用WesternBright ECL HRP底物进行检测(Advansta，K-12043-D20)。通过将凝胶暴露于放射自显影胶片(Denville，E3018)观察Western印迹。免疫印迹使用ImageJ软件定量。

表面等离子体共振：通过使用Biacore 2000的SPR测定受体-配体结合亲和力。使用胺偶联化学法将抗人IgG(Fc)抗体固定在CM5芯片的四个通道上。在实验流道上捕获纯化的Cripto-1-Fc、Cryptic-Fc、ACTRIIA-Fc、ACTRIIB-Fc、BMPRII-Fc或ALK4-Fc。监测对照通道以排除非特异性结合、漂移和体积偏移。对于配体结合的动力学分析，系列浓度的配体(Nodal、激活素A、激活素B、GDF-1、GDF-3、GDF-8、GDF-11、TGF-β-1、BMP-4、BMP-2和BMP-9)以50μl/min的流速注射到实验和对照流动通道上。为了分析Cripto-1或隐藏蛋白与受体的结合，以50μl/min的流速在实验和对照流动通道上注射浓度为5μM的不含Fc的Cripto-1或隐藏蛋白。对于在Cripto-1或隐藏蛋白存在下配体结合的动力学分析，将系列浓度的配体(Nodal，激活素A)与过量的Cripto-1或隐藏蛋白(200nM)组合，以50μl/min的流速在实验和对照流动通道上注射。对于抑制分析，将1nM Nodal，激活素A或激活素B与0nM、0.5、5、10、40、50、100或400nM无Fc的Cripto-1或隐藏蛋白组合。将预组装的配体-隐藏蛋白复合物以50μl/min的流速注入实验和对照流动通道。每个结合循环后，将抗体表面再生至基线。所有实验在25℃下进行。使用含有0.1％BSA的HBS-EPS缓冲液(0.01M HEPES，0.5M NaCl，3mMEDTA，0.005％(v/v)吐温20，pH7.4)作为缓冲液。含有大肠杆菌Nodal的样品在无BSA的情况下下进行保存，因为BSA的存在导致重组Nodal的快速失活。通过双参考分析传感图。为了获得动力学速率常数，将处理后的数据与使用Scrubber、Clamp或BiaEvaluation软件的质量传递限制的1：1Langmuir相互作用模型拟合。通过计算结合速率常数k_d/k_a的比例来确定平衡结合常数K_d。结果总结在表1(下文)中。

报告子测试：将完全培养基(补充有10％胎牛血清的McCoy's 5A培养基(Invitrogen))中的约50,000个A204细胞(ATCC)接种在96孔板的每个孔中并生长过夜。第二天，制备含有以下物质的溶液：200ng pNL[NlucP/SBE/Hygro]载体(实验荧光素酶报道质粒，萤火虫萤光素酶，Promega)、2ng pNL[NLucP/minP/Hygro]载体(对照荧光素酶报道质粒，海肾荧光素酶，Promega)、24μl的lipofectamine 2000(Life Technologies)和960μl的McCoy's 5A培养基(Life Technologies)，并在室温下孵育30分钟。孵育后，将3840μl的McCoy's 5A培养基加入到转染溶液中，用1×PBS洗涤细胞，向每个孔中加入50μl转染溶液。第二天除去含有转染试剂的培养基，用1×PBS洗涤细胞，用含有测试蛋白质的无血清McCoy's 5A培养基代替培养基。在37℃孵育16小时后，用Dual-Glo Luciferase AssaySystem(Promega)检测荧光素酶活性。使用Infinite M200酶标仪测量化学发光。通过将萤火虫荧光素酶单位(FLU)除以海肾荧光素酶单位(RLU)来计算相对荧光素酶单位。

成骨细胞矿化分析：将HOS细胞在12孔板中以每孔100,000个细胞铺板。达到汇合后，向培养基中加入2mM磷酸盐和25μg/ml抗坏血酸。用运载体、20μg/ml隐藏蛋白或50ng/ml激活素A单独或一起饲喂(每2-3天一次)处理细胞2周。用PBS冲洗细胞，并在室温下在10％福尔马林中固定30分钟。将细胞用新鲜制备的20mM茜素红染色溶液孵育1小时，冲洗并数字拍照。用10％氯化十六烷基吡啶除去染色，并在570nm波长处定量。

统计学：以四复孔的方式进行基于细胞的测定，并重复至少不同的两次。使用双尾T检验确定统计学显著性。P值<0.05被认为具有显著差异。

实施例2：隐藏蛋白和Cripto-1表达和纯化

隐藏蛋白和Cripto-1是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚附着于膜的分泌蛋白质(图1，A栏)。在用编码可溶性形式的核酸稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达人隐藏蛋白和Cripto-1的可溶形式。可溶性形式包括蛋白质的细胞外结构域和来自人IgG1的Fc部分，通过含有烟草蚀刻花叶病毒(Tobacco Etch Mosaic Virus，TEV)切割位点的22-氨基酸接头彼此连接(图1，B栏)。对于隐藏蛋白，建立了包含N末端信号肽并以丙氨酸167结束的构建体。对于Cripto-1，使用隐藏蛋白的信号肽，并在苏氨酸163(类似于隐藏蛋白残基丙氨酸167)处结束构建体(图1，A栏)。通过蛋白A亲和层析，然后通过尺寸排除色谱法，从条件培养基中纯化隐藏蛋白-Fc和Cripto-1-Fc蛋白。从培养的细胞获得大约每升100mg纯化的隐藏蛋白-Fc和30mg的纯化Cripto-1-Fc。制备尺寸排阻色谱(SEC)显示，隐藏蛋白可以以不含聚集体的形式获得(图1，C栏)。如期望的，纯化的蛋白质的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶显示出在还原条件下约50kDa的条带，在非还原条件下显示大约100kDa的条带(图1，C栏)。

实施例3：隐藏蛋白和Cripto-1结合不同配体

表面等离子体共振(SPR)用于表征人类隐藏蛋白和Cripto-1的配体结合特异性。将纯化的Fc融合蛋白捕获在与抗hFc抗体交联的CM5传感器芯片上，随后在捕获的隐藏蛋白和Cripto-1上注入不同浓度的不同的TGFβ家族配体，包括远远超过血清水平的浓度(45-47)(图2，表1)。显示了隐藏蛋白以非常高的亲和力结合激活素A和激活素B(分别为k_a＝3.1×10⁵(M^-1s^-1)，k_d＝4.6×10^-5(s^-1)，K_d＝0.15nM，和k_a＝3.1×10⁵(M^-1s^-1)，k_d＝4.6×10^-5(s^-1)，K_d＝0.15nM)(图2，A栏和B栏)。此外，隐藏蛋白还结合GDF-8和GDF-11，尽管与比激活素A和激活素B的亲和力低得多(图2，C栏和D栏)。尽管如此，隐藏蛋白和GDF-8或GDF-11之间的相互作用相对稳定，分别如较慢的解离速率所示：k_d＝4.6×10^-4和4.6×10^-4(s^-1)。隐藏蛋白也与Nodal结合；然而，隐藏蛋白-Nodal相互作用比Nodal-Cripto-1相互作用弱几个数量级(图2，E栏和F栏)。隐藏蛋白没有明显地与任何其它测试的TGF-β家族配体(如，TGF-β-1、GDF-1、GDF-3、BMP-2、BMP-4和BMP-9)结合(图2，E栏)。这些研究结果表明，激活素A和激活素B是人类隐藏蛋白调节的主要配体，隐藏蛋白也可以在调节GDF-8和GDF-11信号中发挥作用。

用人Cripto-1进行了类似的实验，表明其配体结合特异性与隐藏蛋白明显不同。在所有测试的配体中，只有Nodal与人Cripto-1的结合具有可观的亲和力(图2，F栏)。激活素B也结合Cripto-1，然而这种相互作用是不稳定的，其表现为较快的解离速率(k_d＝4.6×10^-5(s^-1))。未观察到Cripto-1与任何其它测试的TGF-β家族配体(包括激活素A)的结合。因此，这些发现表明，Cripto-1对于Nodal非常特异。

实施例4：隐藏蛋白不调节ALK4的配体结合

为了建立隐藏蛋白在配体-ALK4相互作用中的作用，将人类ALK4-Fc捕获在传感器芯片上。为了确定隐藏蛋白是否结合ALK4，以不同浓度注射不含Fc的隐藏蛋白。在没有配体和其它因子的情况下，即使在远远超过生理水平的浓度(例如，20μM)下也没有检测到隐藏蛋白与ALK4的结合(图3，A栏)。这些发现表明，在不含其它因子的情况下，隐藏蛋白不与ALK4相互作用。

为了确定隐藏蛋白是否增强或促进配体结合I型受体，研究了隐藏蛋白对激活素A和ALK4之间相互作用的影响(图3，B，C和D栏)。在隐藏蛋白过量存在(400nM)(图3，D栏)的情况下，人类ALK4-Fc被捕获在传感器芯片上，并与恒定量的用隐藏蛋白(0-40nM)滴定的激活素A(1nM)(图3，B栏)或滴定的激活素A(0-40nM)接触。人类隐藏蛋白没有改变激活素A和ALK4之间的相互作用。实际上，游离激活素A与ALK4结合的动力学模型与激活素A在存在过量人类隐藏蛋白时与ALK4结合的动力学模型几乎无法区分(k_a＝3.1×10⁵(M^-1s^-1)，k_d＝4.6×10^-5(s^-1)，K_d＝0.15nM)(表1)。总之，这些研究结果表明，隐藏蛋白在激活素A与ALK4的结合中不起作用。

表1：平衡结合和速率常数

*通过从大肠杆菌(RnD Systems)重折叠产生的GDF-11显示批次差异。

实施例5：隐藏蛋白抑制II型受体的配体结合

接下来，研究了隐藏蛋白对配体与II型受体结合的影响(图4)。选择配体激活素A、激活素B和GDF-8进行这些研究(图2)。为了确定隐藏蛋白是否与II型受体相互作用，将人ACTRIIA、ACTRIIB或BMPRII捕获在传感器芯片上，随后将隐藏蛋白通过捕获的受体。在不存在配体的情况下，隐藏蛋白不会结合远超过生理水平浓度(例如，20μM)的ACTRIIA、ACTRIIB或BMPRII(图3，A栏)。

为了确定隐藏蛋白是否对配体与ACTRIIA、ACTRIIB或BMPRII的结合有影响，将这些受体捕获在传感器芯片上，并将与浓度为0至1600nM的隐藏蛋白预孵育的激活素A(1nM)、激活素B(10nM)或GDF-8(40nM)通过传感器芯片。隐藏蛋白以浓度依赖性方式抑制配体与高亲和力受体的结合。在反向几何中观察到抑制，即，在存在不同量的ACTRIIA的情况下，将隐藏蛋白-Fc在传感器芯片上捕获，并将激活素A通过传感器芯片(图4，H栏)。进一步发现隐藏蛋白竞争性地抑制配体-II型受体相互作用。这些发现支持了如下结论：人类隐藏蛋白结合激活素A、激活素B和GDF-8的结合位点同这些配体结合II型受体ACTRIIA、ACTRIIB和BMPRII的位点相同。

实施例6：隐藏蛋白抑制激活素信号转导

如上所述，本文提供的数据表明，隐藏蛋白竞争性地抑制配体-II型受体相互作用。虽然本公开不受任何特定理论或作用机理的限制，但是隐藏蛋白也可能抑制配体介导的信号转导和基因表达。为了检查隐藏蛋白对配体依赖性基因表达的潜在作用，用pSBE4-luc(其为Smad-2/3响应报告基因)转染A-204横纹肌肉瘤细胞，并用pRL-CMV-luc作为对照(Zawal等，(1998)Mol Cell 1：611-617)。用10nM激活素A或激活素B和不同浓度的隐藏蛋白-Fc处理转染细胞(图5，A和C栏)。两种配体强烈地诱导荧光素酶报告基因活性(相对于对照约8倍)，并且隐藏蛋白-Fc以浓度依赖性方式抑制配体依赖性荧光素酶信号(图5，A和C栏)。实际上，隐藏蛋白-Fc和骨骼激活素抑制剂ACTRIIA-Fc都抑制激活素A和激活素B诱导的萤光素酶报告基因活性(图5，B和D栏)。对于信号转导，进行磷酸化Smad2蛋白质印迹(图5，B和D栏)。还用10nM配体和滴定的隐藏蛋白-Fc处理A-204细胞。激活素A和激活素B诱导但隐藏蛋白-Fc抑制Smad-2磷酸化。实际上，隐藏蛋白-Fc以与ACTRIIA-Fc类似的效力抑制Smad-2磷酸化(图5，B和D栏)。

鉴于激活素A抑制而激活素A抑制剂促进成骨细胞矿化(参见，例如Pear)，隐藏蛋白-Fc在激活素A存在下对成骨细胞矿化具有影响。在存在或不存在激活素A(50ng/ml)，有或没有隐藏蛋白的情况下，将人HOS细胞生长至汇合并诱导分化(通过加入磷酸盐和维生素C)。如预期的那样，激活素A的添加可防止成骨细胞矿化(图5，E和F栏)。引人注目的是，10μg/ml隐藏蛋白-Fc阻止了激活素A对矿化的抑制(图5，E和F栏)。总之，来自三个不同体外实验(与生理相关的结果，包括成骨细胞矿化的恢复(图5))的结果表明，隐藏蛋白-Fc有效抑制激活素A介导的信号传导。

虽然已经参考其具体实施例描述了本公开，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等同物。此外，可以进行许多修改以使特定情况、材料、物质的组成、过程、工艺步骤或步骤适应于本公开的目标、精神和范围。所有这些修改意在包括在本公开的范围内。

Claims (47)

1.一种多肽，所述多肽包含：(i)SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所示的氨基酸序列；(ii)SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所示的氨基酸序列的变体，所述变体中具有不超过10个氨基酸的取代、缺失或插入；或(iii)与SEQ ID NO:1至9、19或20中任一项所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:7至9、19或20中任一项所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:4至9中任一项所示的氨基酸序列，并且所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列至少80％相同。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽与人激活素A结合的K_D低于1x10^-9M。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽与人激活素A结合的K_D低于1x10^-10M。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽与人激活素A结合的K_D低于1x10^-11M。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有野生型人隐藏蛋白至少30％的体外抑制人激活素A依赖的细胞信号传导的能力。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽与人激活素B结合的K_D低于1x10^-9M。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽与人激活素B结合的K_D低于或等于5x 10^-10M。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的多肽，其中所述多肽具有野生型人隐藏蛋白至少30％的体外抑制人激活素B依赖的细胞信号传导的能力。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含异源部分，所述异源部分提高所述多肽在受试者中的血清半衰期。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述异源部分包含免疫球蛋白Fc恒定区。

13.根据权利要求11或12所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求11或12所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

15.根据权利要求11或12所述的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。

16.根据权利要求11所述的多肽，其中所述异源部分包含白蛋白的全部或部分。

17.根据权利要求11所述的多肽，其中所述异源部分包含聚乙二醇。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含使所述多肽靶向骨的异源部分。

19.根据权利要求18所述的多肽，其中使所述多肽靶向骨的异源部分包括式Xn，其中X是在生理pH值下具有负电荷的标准氨基酸或非标准氨基酸，且n为1至25之间的整数。

20.根据权利要求19所述的多肽，其中X是天门冬氨酸或谷氨酸。

21.根据权利要求19或20所述的多肽，其中n为5至15之间的整数。

22.根据权利要求19或20所述的多肽，其中n为10至16之间的整数。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含可检测的标记。

24.一种在有需要的受试者中提高骨生长、骨强度或骨密度的方法，所述方法包括给予受试者一种或多种根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，所述多肽的量足以在受试者中提高骨生长、骨强度或骨密度。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述受试者具有骨流失相关的症状。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述症状为骨质疏松。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述症状为佩吉特氏病或类风湿性关节炎。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述症状为牙周病、骨折、骨缺损、转移性骨病、骨关节炎、原发性或继发性甲状旁腺功能亢进或溶骨性骨病。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述牙周病是牙龈炎或牙周炎。

30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述组合物在给药后提高了选自如下组的骨参数：骨体积密度、总骨表面、骨表面密度、小梁数、小梁厚度、小梁间距和总体积。

31.根据权利要求24至30中任一项所述的方法，所述方法还包括监测受试者选自如下组的骨参数的提高：骨体积密度、总骨表面、骨表面密度、小梁数、小梁厚度、小梁间距和总体积。

32.根据权利要求24至31中任一项所述的方法，所述方法还包括给予受试者至少一种另外的促进骨生长或抑制骨吸收的治疗剂。

33.一种在有需要的受试者中提高肌肉量或肌肉强度的方法，所述方法包括给予受试者一种或多种根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，所述多肽的量足以在受试者中提高肌肉量或肌肉强度。

34.根据权利要求33的方法，其中所述受试者患有肌肉消耗性疾病。

35.一种治疗患有肌肉消耗性疾病或肌肉萎缩症的受试者的方法，所述方法包括给予所述受试者一种或多种根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述肌肉消耗性疾病或肌肉萎缩症。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中肌肉消耗性症状为杜氏肌营养不良症(DMD)、多种类型的肢带型肌营养不良(LGMD)、其它先天性肌营养不良(CMD)，肌肉减少症、癌症恶病质或糖尿病，或与之相关。

37.一种在受试者中治疗肌肉骨骼疾病的方法，所述方法包括给予受试者一种或多种据权利要求1至23中任一项所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述肌肉骨骼疾病。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述肌肉骨骼疾病为(i)骨质疏松症、(ii)骨质减少症、(iii)肌肉减少症、(iv)关节炎、(v)组织萎缩、(vi)牙周病、(vii)伤口愈合或(viii)恶性肿瘤、内分泌失调、关节炎、不动或废用导致的骨流失。

39.一种治疗患有代谢性疾病的受试者的方法，所述方法包括给予受试者一种或多种根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述代谢性疾病。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述代谢性疾病为II型糖尿病、非胰岛素依赖的糖尿病、高血糖症和肥胖。

41.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括给予受试者一种或多种根据权利要求1至23中任一项所述的多肽，所述多肽的量足以治疗所述癌症。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌症包括表达一种或多种激活素A或B受体的癌细胞。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述癌细胞的增殖和活力中的一种或两种由激活素A或B正向调节。

44.根据权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、胃癌、肝癌、骨癌、血液癌、神经组织癌、黑素瘤、甲状腺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、子宫颈癌、阴道癌或膀胱癌。

45.根据权利要求24至44中任一项所述的方法，其中所述多肽通过静脉给予受试者。

46.根据权利要求24至44中任一项所述的方法，其中所述多肽通过皮下给予受试者。

47.根据权利要求24至46中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。