DE602005002829T2

DE602005002829T2 - Verwendung eines serumfreien zellkulturmediums zur produktion von il-18bp in säugerzellen

Info

Publication number: DE602005002829T2
Application number: DE200560002829
Authority: DE
Inventors: Yehoshua Aloni; Orit Mazkeret Batya AHARONOVITZ; Thierry Ziegler
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2008-07-10
Anticipated expiration: 2025-03-01
Also published as: IL177493A; IL177493A0; EP1720979A1; DK1720979T3; US7553665B2; ME01218B; CA2554238C; AU2005217154A1; NO20064379L; EP1720979B1; PL1720979T3; NO335825B1; AU2005217154B2; RS50531B; WO2005083058A1; ATE375385T1; SI1720979T1; DE602005002829D1; CA2554238A1; US20070196895A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Feld der Kultivierung von Sängerzellen unter serumfreien Kulturbedingungen. Insbesondere betrifft sie das Wachstum von Säugerzellen, wie etwa Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO, „Chinese Hamster Ovary"). Die Zellen produzieren ein rekombinantes Protein, das Interleukin-18-Bindungsprotein (IL-18BP) genannt wird.
Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren unter Verwendung eines serumfreien Mediums für das Wachstum und die Erhaltung von Säugerzellen in Kultur.
Die Zellkultur wird heutzutage weithin verwendet für die Produktion von verschiedenen biologisch aktiven Produkten, wie etwa Virusvakzine, monoklonale Antikörper, Nichtantikörper-Immunregulatoren, Polypeptid-Wachstumsfaktoren, Hormone, Enzyme, tumorspezifische Antigene usw. Diese Produkte werden durch normale oder transformierte und genetisch veränderte Zellen produziert.
Für die Kultivierung von Zellen wurde in der Vergangenheit das Kulturmedium mit Serum ergänzt, das als ein universeller Nährstoff für das Wachstum und die Erhaltung von allen Säugerzelllinien dient, die biologisch aktive Produkte produzieren. Serum enthält Hormone, Wachstumsfaktoren, Trägerproteine, Anheftungs- und Diffusionsfaktoren, Nährstoffe, Spurenelemente usw. Kulturmedium enthielt normalerweise bis zu etwa 10% tierisches Serum, wie etwa fötales Rinderserum (FBS, „fetal bovine serum"), auch fötales Kälberserum (FCS, „fetal calf serum") genannt.
Obwohl es weithin verwendet wird, besitzt Serum viele Beschränkungen. Es enthält hohe Mengen an zahlreichen Proteinen, die mit den begrenzten Mengen des gewünschten Proteins von Interesse, das durch die Zellen produziert wird, wechselwirkt. Diese vom Serum stammenden Proteine müssen von dem Produkt während nachfolgender Prozesse abgetrennt werden, wie etwa der Reinigung des Proteins von Interesse, was das Verfahren verkompliziert und die Kosten ansteigen lässt.
Das Aufkommen von BSE (bovine spongiforme Enzephalopathie), einer übertragbaren neurodegenerativen Erkrankung von Kühen mit einer langen Latenz- oder Inkubationszeit, hat regulatorische Bedenken bezüglich der Verwendung von Serum von Tieren bei der Produktion von biologisch aktiven Produkten aufkommen lassen.
Deshalb besteht ein großer Bedarf an alternativen Medien, die frei von tierischen Quellen sind, die das Zellwachstum unterstützen und Zellen während der Produktion von biologisch aktiven Produkten erhalten.
Im Allgemeinen umfassen Zellkulturmedien viele Bestandteile unterschiedlicher Kategorien, wie etwa Aminosäuren, Vitamine, Salze, Fettsäuren und weitere Verbindungen:

– Aminosäuren: Beispielsweise offenbart US 6,048,728 (Inlow et al.), dass die folgenden Aminosäuren in einem Zellkulturmedium verwendet werden können: Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tryptophan, Tyrosin, Threonin und Valin.
– Vitamine: Beispielsweise beschreiben US 2003/0096414 (Ciccarone et
al.) oder US 5,811,299 (Renner et al.), dass die folgenden Vitamine in einem Zellkulturmedium verwendet werden können: Biotin, Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Myoisonitol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Vitamin B12, Thiamin, Putrescin.
– Salze: Beispielsweise offenbart US 6,399,381 (Blum et al.) ein Medium, das CaCl₂, KCl, MgCl₂, einwertiges Natriumphosphat, zweiwertiges Natriumphosphat, Natriumselenit, CuSO₄, ZnCl₂. Ein anderes Beispiel für ein Dokument, das anorganische Salze offenbart, die in einem Kulturmedium verwendet werden können, ist US 2003/0153042 (Arnold et al.), worin ein Medium beschrieben wird, das CaCl₂, KCl, MgCl₂, NaCl, ein wertiges Natriumphosphat, zweiwertiges Natriumphosphat, CuCl₂·2H₂O, ZnCl₂ umfasst.
– Fettsäuren: Fettsäuren, die bekanntermaßen in Medien verwendet werden, sind Arachidonsäure, Linolsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Myristinsäure ebenso wie Methyl-beta-Cyclodextrin, siehe beispielsweise US 5,045,468 (Darfler). Es sollte angemerkt werden, dass Cyclodextrin nicht per se ein Lipid ist, aber die Fähigkeit zur Bildung eines Komplexes mit Lipiden aufweist und somit verwendet wird, um Lipide in dem Zellkulturmedium zu solubilisieren.
– Weitere Bestandteile, die insbesondere im Rahmen eines serumfreien Zellkulturmediums verwendet werden, sind Verbindungen wie etwa Glucose, Glutamin, Natriumpyruvat, Insulin oder Ethanolamin (z. B. EP 274 445 ), oder ein Schutzmittel wie etwa Pluronic F68. Pluronic^® F68 (auch als Poloxamer 188 bekannt) ist ein Blockcopolymer von Ethylenoxid (EO) und Propylenoxid (PO).

Einem Fachmann sind auch Standard-"Basismedien" bekannt. Diese Medien enthalten bereits mehrere der oben erwähnten Mediumbestandteile. Beispiel für solche Medien, die weithin verwendet werden, sind Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), Roswell-Park-Memorial-Institute-Medium (RPMI) oder Ham's-Medium.
Für die Entwicklung und Bereitstellung von biologisch aktiven Produkten, wie etwa therapeutischen Proteinen oder Vakzinen, müssen große Mengen produziert werden. Es stellte sich heraus, dass geeignete Zellen, die weithin für die Produktion von Polypeptiden verwendet werden, Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO, „Chinese Hamster Ovary") sind.
CHO-Zellen wurden zuerst von Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) aus einer Biopsie von einer Ovarie eines weiblichen chinesischen Hamsters kultiviert. Aus diesen originalen Zellen wurden eine Anzahl von Unterlinien mit verschiedenen Charakteristika hergestellt. Eine dieser CHO-Zelllinien, CHO-K1, benötigt Prolin und ist bezüglich des Dihydrofulatreduktase (DHFR)-Gens diploid. Eine andere von dieser Zelllinie stammende Linie ist eine DHFR defiziente CHO-Zelllinie (CHO DUK B11) (PNAS 77, 1980, 4216–4220), die durch den Verlust der DHFR-Funktion als eine Konsequenz einer Mutation in einem DHFR-Gen und dem anschließenden Verlust des anderen Gens gekennzeichnet ist.
Weitere Zellen, die häufig für die Produktion von Proteinen verwendet werden, die für eine Verabreichung an Menschen vorgesehen sind, sind humane Zelllinien, wie etwa die humane Fibrosarkomzelllinie HT1080 oder die humane embryonale Nierenzelllinie 293.
Ein therapeutisches Protein von Interesse ist das Interleukin-18-Bindungsprotein (IL-18BP). IL-18BP ist ein lösliches Protein mit einer großen Affinität für IL-18. Es wurde zuerst aus humanem Urin isoliert, und die cDNAs des Menschen und der Maus ebenso wie das humane Gen wurden kloniert (Novick et al., 1999; WO 99/09063 ). Das Protein wird als IL-18-Bindungsprotein (IL-18BP) bezeichnet worden. Der international, nicht geschützte Name von IL-18BP ist Tadekinig-alpha.
IL-18BP ist nicht die extrazelluläre Domäne von einem der bekannten IL-18-Rezeptoren, sondern ein sekretiertes, natürlich zirkulierendes Protein. Es gehört zu einer neuen Familie von sekretierten Proteinen, die zudem mehrere Poxvirus-codierten Proteine umfasst (Novick et al., 1999). IL-18BP aus Harn ebenso wie rekombinantes IL-18BP bindet IL-18 spezifisch mit einer hohen Affinit und moduliert die biologische Affinität von IL-18.
Das IL-18BP-Gen wurde auf dem humanen Chromosom 11q13 lokalisiert, und in einer genomischen Sequenz mit 8,3 kb wurde kein Exon gefunden, das eine Transmembrandomäne codiert. Im Menschen sind bislang vier Splicevarianten oder Isoformen von IL-18BP gefunden worden, erzeugt durch alternatives mRNA-Splicing. Sie wurden IL-18BP a, b, c und d bezeichnet, alle teilen den gleichen N-Terminus unterscheiden sich im C-Terminus (Novick et al., 1999). Diese Isoformen variieren in ihrer Fähigkeit, IL-18 zu binden. Es ist bekannt, dass von den vieren die IL-18BP-Isoformen a und c eine neutralisierende Eigenschaft bezüglich IL-18 besitzen. Die humane IL-18BP-Isoform bindet an murines IL-18.
IL-18BP bei einer Anzahl von Erkrankungen und Störungen wurde als therapeutisches Protein vorgeschlagen worden, wie etwa bei Psoriasis, Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis, Arthritis psoriatica, Leberverletzung, Sepsis, Atherosklerose, ischämische Herzerkrankungen, Allergien usw., beispielsweise offenbart in WO 99/09063 , WO 01/07480 , WO 01/62285 , WO 01/85201 , WO 02/060479 , WO 02/096456 , WO 03/0080104 , WO 02/092008 , WO 02/101049 , WO 03/013577 .
Somit besteht ein Bedarf an einem effizientes Herstellungsverfahren für die Produktion von IL-18BP in Zellkultur, und bevorzugt an einem Verfahren, das unter serumfreien Bedingungen betrieben wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung eines Verfahrens für die Kultivierung von Zellen in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, und gleichzeitig für das Zellwachstum und die Erhaltung von Säugerzellkultur hocheffizient ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugen die Zellen IL-18BP oder sind so modifiziert worden, dass sie IL-18BP produzieren. Das Protein kann aus dem Zellkulturmedium (Überstand) isoliert und gereinigt werden und in eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, die für die Verabreichung an Menschen oder Tiere bestimmt ist.
Deshalb betrifft die Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren für die Kultivierung von IL-18BP-produzierenden Zellen, umfassend den Schritt Anziehen der Zellen in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, worin das Zellkulturmedium
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l umfasst.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von IL-18BP, umfassend den Schritt Kultivieren einer IL-18BP-exprimierenden Zelle in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, worin das Zellkulturmedium umfasst:
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l, Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mediums für die Herstellung eines Proteins von Interesse.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums für das Wachstum von Zellen in Kultur.
Ein fünfter Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mediums für die Erhaltung von Zellen in Kultur während einer Produktionsphase eines Polypeptids von Interesse.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: IL-18BP-exprimierende CHO-Zellen wurden in Suspension im erfindungsgemäßen serumfreien Medium mit wiederholten Verdünnungen mit frischem Medium für 60 Tage kultiviert (n = 10). 1 zeigt die Dichte lebensfähiger Zellen;
2 zeigt die kumulierten lebensfähigen Zellen;
3 zeigt die Verdopplungszeit; und
4 zeigt die Glucose- und Lactatkonzentration im Überstand.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entwicklung eines Verfahrens für das Wachstum und den Erhalt von IL-18BP-exprimierenden Zellen, und für die Produktion von IL-18BP in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von Serum stammen.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von IL-18BP, umfassend den Schritt Kultivieren einer IL-18BP-exprimierenden Zelle in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, worin das Zellkulturmedium umfasst:
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Kultivierung von IL-18BP-exprimierenden Zellen, umfassend den Schritt Anziehen der Zellen in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, worin das Zellkulturmedium umfasst:
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l.
Bevorzugt umfasst das Verfahren weiter den Schritt Sammeln des Mediums, das das Protein von Interesse umfasst.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter Isolieren des Proteins von Interesse.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiter Formulieren des isolierten Proteins mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu erhalten.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Zellkulturmediums, umfassend
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l
für die Herstellung eines Polypeptids von Interesse.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Zellkulturmediums, umfassend
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l
für das Anziehen von IL-18BP-exprimierenden Zellen in Kultur.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Zellkulturmediums, umfassend
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l
für die Erhaltung von IL-18BP-exprimierenden Zellen in Kultur, beispielsweise während der Produktionsphase eines Polypeptids von Interesse.
Gemäß den Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung umfasst das Zellkulturmedium:
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Asparagin in einer beliebigen Konzentration im Bereich von etwa 700 bis 1000 mg/l verwendet werden, z. B. 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 mg/l.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l verwendet werden, z. B. mit 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 mg/l.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l verwendet werden, z. B. 0,0035, 0,004, 0,0045, 0,005, 0,0055, 0,006, 0,0065, 0,007, 0,0075, 0,008, 0,0085, 0,009, 0,0095, 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02 mg/l.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Weizenhydrolysat mit einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l verwendet werden, z. B. 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 18000, 18500, 19000, 19500 mg/l.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l verwendet werden, z. B. 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 5, 4,25, 4,5 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75 mg/l.
Wie in den Beispielen unten gezeigt ist, unterstützt das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines Mediums, umfassend diese Bestandteile innerhalb der angegebenen Bereiche ein ausgezeichnetes Zellwachstum und Zellerhaltung über einen längeren Zeitraum.
Der Kultivierungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in einer beliebigen geeigneten Umgebung durchgeführt werden, wie etwa Petrischalen, T-Flaschen oder Rollerflaschen, aber bevorzugt in Gefäßen mit größeren Volumina, wie etwa beispielsweise einem Bioreaktor. T-Flaschen und Rollerflaschen sind für das Wachstum von Zellen besonders geeignet, und für die Proteinherstellung werden die Zellen bevorzugt in einem Bioreaktor gehalten.
Die im Rahmen der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Zellen sind bevorzugt Säugerzellen. Sie können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein. Beispiele für Säugerzellen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert werden können, umfassen beispielsweise 3T3-Zellen, COS-Zellen, humane Osteosarkomzellen, MRC-5-Zellen, BHK-Zellen, VERO-Zellen, CHO-Zellen, rCHO-tPA-Zellen, rCHO-Hep B-Oberflächenantigen-Zellen, HEK 293-Zellen, rHEK 293-Zellen, rC127-Hep B-Oberflächenantigen-Zellen, normale humane Fibroblastenzellen, Stromazellen, Hepatozytenzellen, PER.C6-Zellen und humane permanente Amniozytenzellen. Beispiele für Hybridomas, die im erfindungsgemäßen Verfahren kultiviert werden können, umfassen z. B. DA4.4-Zellen, 123A-Zellen, 127A-Zellen, GAMMA-Zellen und 67-9-B-Zellen.
Erfindungsgemäß ist es höchst bevorzugt, eine CHO (Chinese Hamster Ovary)-Zelle zu kultivieren.
Die erfindungsgemäß kultivierten Zellen können in Suspension wachsen, oder im Fall von Zellen, die von einer Befestigung abhängig sind, an einen festen Träger angeheftet wachsen. Für das Wachstum von Zellen, die auf eine Befestigung angewiesen sind, können in der Säugerzellkultur Mikroträger und Fibra-Cel^®-Platten verwendet werden, und dies ist unter den etablierten Technologieplatformen für die industrielle Produktion von Proteinen (siehe z. B. Bohak et al., 1987; Petti et al., 1994).
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen ist Asparagin bevorzugt als Asparagin. H₂O (TLC 99%, wobei TLC „Thin Layer Chromatography" ist) enthalten.
Selenit kann im Medium beispielsweise als Natriumselenit enthalten sein.
Weizenhydrolysat ist ein von einer Pflanze stammender Bestandteil, der ein Teil des erfindungsgemäßen Mediums ist, basierend auf der Tatsache, dass Zellen auch Aminosäuren verwenden können, welche in Peptidform vorliegen. Peptide können einen Größenbereich von 2 Aminosäuren bis zu vielen Aminosäuren aufweisen. Peptide, die von der Hydrolyse von Proteinen stammen, stellen eine ergänzende (nicht definierte) Aminosäurequelle in einer Form bereit, die ein vorzügliches Wachstum einer Vielzahl von Zelllinien/Typen unterstützt.
Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Mediums zu verwendende insulin kann von einer beliebigen Quelle und Spezies stammen, solange es das Wachstum und den Erhalt der bestimmten Zelllinie oder des bestimmten Zelltyps unterstützt, für die bzw. den das Medium verwendet wird. Bevorzugt kann das Insulin rekombinant sein. Es ist weiter bevorzugt, dass das Insulin von der Spezies stammt, welche der Spezies entspricht, von der die Zelllinie oder der Zelltyp stammt, oder dass es humanes Insulin ist.
Bevorzugte Konzentrationsbereiche der Bestandteile des Mediums, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, sind wie folgt:
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 810 bis etwa 850 mg/l, am meisten bevorzugt etwa 830.
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3400 bis etwa 3600 mg/l, am meisten bevorzugt etwa 3500 mg/l.
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 bis etwa 0,012 mg/l, am meisten bevorzugt etwa 0,0110 mg/l.
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 8000 bis etwa 12000 mg/l, am meisten bevorzugt etwa 10000 mg/l.
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 3 bis etwa 5 mg/l, am meisten bevorzugt etwa 4 mg/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medium weiter Glucose in einer Konzentration im Bereich von etwa 500 bis etwa 5500 mg/l, bevorzugt etwa 1000 mg/l oder etwa 4500 oder etwa 5000 mg/l.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medium eine oder mehrere Aminosäuren. Die Aminosäuren werden ausgewählt aus Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tryptophan, Thyrosin, Threonin und Valin, aber nicht Glutamin.
In einer alternativen Ausführungsform wird Glutamin zum Medium hinzugefügt. Glutamin kann bevorzugt während der Zellkultur (z. B. Wachstum, Erhalten, Produktionsmodus) zum Medium zugefügt werden.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Medium weiter Vitamine. Vitamine, die bevorzugt im erfindungsgemäßen Medium vorliegen, werden ausgewählt aus Biotin, Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Myoisonitol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Vitamin B12, Thiamin und Putrescin.
Das erfindungsgemäße Medium umfasst bevorzugt weiter anorganische Salze und Spurenelemente. Die Ionen sind bevorzugt Ca² ⁺, K⁺, Mg² ⁺, Na⁺, Cl^–, Phosphat, Cu²⁺, Zn² ⁺. Diese Salze und Spurenelemente werden bevorzugt ausgewählt aus CaCl₂ wasserfrei, KCl, MgCl₂ wasserfrei, NaCl, einwertigem Natriumphosphat, zweiwertigem Natriumphosphat, CuCl₂·2H₂O und ZnCl₂.
Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Medium weiter eine Puffersubstanz. Im Rahmen des erfindungsgemäßen Mediums können viele Puffersubstanzen verwendet werden, wie etwa Natriumbicarbonatpuffer, Tris, BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure), Glycinpuffer oder dergleichen. Ein Zwitterionenpuffer ist für das erfindungsgemäße Medium besonders zweckdienlich. Ein bevorzugter Zwitterionenpuffer, der verwendet werden kann, ist HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-2-ethansulfonsäure) in saurer Form.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Medium weiter Fettsäuren. Solche Fettsäuren werden bevorzugt ausgewählt aus Arachidonsäure, Linolsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Myristinsäure und Cyclodextrin, das per se kein Lipid ist, sondern vielmehr der Solubilisierung von Lipiden im Medium dient. Cyclodextrin ist bevorzugt Methyl-beta-cyclodextrin.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können weitere Hydrolysate verwendet werden, solange sie nicht von tierischen Quellen stammen. Bevorzugt kann das erfindungsgemäße Medium weiter ein Sojahydrolysat umfassen.
Es ist auch bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Medium weiterhin Steroide umfasst, wie etwa Cortison oder Hydrocortison und/oder weitere Energiequellen wie etwa beispielsweise Pyruvat, z. B. Natriumpyruvat und/oder ein Schutzmittel wie etwa Pluronic F68.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen kann jedes geeignete bekannte serumfreie Basismedium verwendet werden, solange die folgenden Bestandteile vorliegen:
Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 700 bis etwa 1000 mg/l, bevorzugt von etwa 800 bis etwa 900 mg/l,
Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 2000 bis etwa 5000 mg/l, bevorzugt von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l,
Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,003 bis etwa 0,02 mg/l, bevorzugt von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l,
Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 20000 mg/l, bevorzugt von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und
Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 1 bis etwa 8 mg/l, bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l.

Beispiele für bekannte serumfreie Basismedien sind unten aufgelistet:

Medium	Hersteller	Katalog-Nr.
EX-CELL 302	JRH	14312-1000M
EX-CELL 325	JRH	14335-1000M
CHO-CD3	Sigma	C-1490
CHO III PFM	Gibco	96-0334SA
CHO-S-SFM II	Gibco	12052-098
CHO-DHFR	Sigma	C-8862
ProCHO 5	Cambrex	BE12-766Q
SFM4CHO	HyClone	SH30549.01
Ultra CHO	Cambrex	12-724Q
HyQ PF CHO	HyClone	SH30220.01
HyQ SFX CHO	HyClone	SH30187.01
HyQ CDM4CHO	HyClone	SH30558.01
IS CHO-CD	Irvine Scientific	#91119
IS CHO-V	Irvine Scientific	#9197

Die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen dienen bevorzugt der Herstellung eines Polypeptids von Interesse.
Das Polypeptid von Interesse kann beispielsweise ein natürliches sekretiertes Protein, ein normales Zytoplasmaprotein, ein normales Transmembranprotein oder ein humaner oder ein humanisierter Antikörper. Wenn das Protein von Interesse ein normales Zytoplasmaprotein oder ein normales Transmembranprotein ist, ist das Protein bevorzugt verändert worden, damit es löslich wird.
Das Polypeptid von Interesse kann von beliebiger Herkunft sein.
Bevorzugte Polypeptide von Interesse sind humaner Herkunft, und mehr bevorzugt sind die Proteine von Interesse therapeutische Proteine.
Das Protein von Interesse kann ein Hormon, ein Cytokin-bindendes Protein, ein Interferon, ein löslicher Rezeptor oder ein Antikörper sein.
Therapeutische Proteine, die gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, umfassen z. B. Chorion-Gonadotropin, Follikel-stimulierendes Hormon, Lutropin-choriongonadotropes Hormon, Thyroid-stimulierendes Hormon, humanes Wachstumshormon, Interferone (z. B.
Interferon Beta-1a, Interferon Beta-1b), Interferonrezeptoren (z. B. Interferon-Gamma-Rezeptor), die TNF-Rezeptoren p55 und p75, TACI-Fc-Fusionsproteine, Interleukine (z. B. Interleukin-2, Interleukin-11), Interleukinbindungsproteine (z. B. Interleukin-18-Bindungsprotein), Anti-CD11a-Antikörper, Erythropoietin, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, die Hypophyse betreffende Peptidhormone, menopausales Gonadotropin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (z. B. Somatomedin-C), Keratinozyten-Wachstumfaktor, von einer Gliazelllinie stammendender neurotropher Faktor, Thrombomodulin, basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Insulin, Faktor VIII, Somatropin, knochenmorphogenetisches Protein-2, von Plättchen stammendender Wachstumfaktor, Hirudin, Epoietin, rekombinantes LFA-3/lgG1-Fusionsprotein, Glukozerebrosidase, und Muteine, Fragmente, lösliche Formen, funktionale Derivate, Fusionsproteine davon.
Das Polypeptid kann insbesondere ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Chorion-Gonadotropin (CG), Follikel-stimulierendem Hormon (FSH), Lutropin-choriongonadotropem Hormon (LH), Thyroid-stimulierendem Hormon (TSH), humanem Wachstumshormon (hGH), Interferonen (z. B. Interferon Beta-1a, Interferon Beta-1b), Interferonrezeptoren (z. B. Interferon-Gamma-Rezeptor), den TNF-Rezeptoren p55 und p75, Interleukinen (z. B. Interleukin-2, Interleukin-11), Interleukin-Bindungsproteinen (z. B. Interleukin-18-Bindungsprotein), Anti-CD11a-Antikörper, und Muteinen, Fragmenten, löslichen Formen, funktionalen Derivaten, Fusionsproteinen davon.
Weitere Polypeptide von Interesse umfassen beispielsweise Erythropoietin, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, die Hypophyse betreffende Peptidhormone, menopausales Gonadotropin, Insulin-ähnliche Wachstumfaktoren (z. B. Somatomedin C), Keratinozyten-Wachstumfaktor, von einer Gliazelllinie stammender neurotropher Faktor, Thrombomodulin, basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Insulin, Faktor VIII, Somatotropin, knochenmorphogenetisches Protein-2, von Plättchen stammender Wachstumfaktor, Hirudin, Epoietin, rekombinantes LFA-3/lgG1-Fusionsprotein, Gluko zerebrosidase, und Muteine, Fragmente, lösliche Formen, funktionelle Derivate, Fusionsproteine davon.
Sollte das Protein von Interesse mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel formuliert werden, ist das Ergebnis des Verfahrens eine pharmazeutische Zusammensetzung.
Die Definition von „pharmazeutisch verträglich" soll bedeuten, dass jedes beliebige Trägermittel umfasst ist, das nicht mit der Wirksamkeit und der biologischen Aktivität des Wirkstoffs wechselwirkt und das für den Wirt, an den es verabreicht wird, nicht toxisch ist. Für eine parenterale Verabreichung kann das oder können die aktiven Proteine beispielsweise in einer Einheitsdosierungsform für eine Injektion in Hilfsmitteln wie etwa Saline, Dextroselösung, Serumalbumin und Ringer-Lösung formuliert sein.
Die erfindungsgemäß formulierte pharmazeutische Zusammensetzung kann dann einem Individuum auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden. Die Verabreichungswege umfassen intradermal, transdermal (z. B. in Formulierungen mit langsamer Freisetzung), intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, oral, intrakranial, epidural, topisch, rektal und intranasale Wege. Es kann jede andere therapeutisch wirksame Verabreichungsart verwendet werden, z. B. die Absorption durch epitheliale oder endotheliale Gewebe oder durch Gentherapie, worin ein DNA-Molekül, codierend für das aktive Mittel, dem Patienten verabreicht wird (z. B. durch einen Vektor), was verursacht, dass das aktive Mittel exprimiert und in vivo sekretiert wird. Außerdem kann das oder die Proteine gemäß der Erfindung zusammen mit anderen Bestandteilen von biologisch aktiven Mitteln verabreicht werden, wie etwa pharmazeutisch verträglichen Detergenzien, Trägersubstanzen, Trägermittel, Verdünnungsmittel und Vehikel.
Für eine parenterale (z. B. intravenöse, subkutane, intramuskuläre) Verabreichung kann das oder die aktiven Proteine als eine Lösung, Suspension, Emulsion oder lyophilisiertes Pulver in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Trägermittel (z. B. Wasser, Saline, Dextroselösung) und Additiven formuliert sein, welche die Isotonie (z. B. Mannit) oder die chemische Stabilität (z. B. Konservierungsmittel und Puffer) aufrecht erhalten. Die Formulierung wird durch gewöhnlich verwendete Techniken sterilisiert.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen zielen auf die Herstellung des Interleukin-18-Bindungsproteins (IL-18BP).
IL-18BP kann nativ sein, d. h. natürlich vorkommendes IL-18BP. Bevorzugt ist das herzustellende IL-18BP humanen Ursprungs. Da IL-18BP ein lösliches sekretiertes Protein ist, wird es in den Zellkulturüberstand freigesetzt, entweder mittels seines natürlichen Signalpeptids oder mittels eines heterologen Signalpeptids, d. h. ein Signalpeptid, das von einem anderen sekretierten Protein stammt, das in dem bestimmten verwendeten Expressionssystem effizienter sein kann.
Der Begriff „IL-18-Bindungsprotein" wird hierin synonym mit „IL-18BP" verwendet. Dieser Begriff betrifft IL-18-Bindungsproteine wie etwa diejenigen, die in WO 99/09063 oder bei Novick et al., 1999 definiert werden. Der Begriff IL-18BP umfasst Splicevarianten und/oder Isoformen von IL-18-Bindeproteinen, wie diejenigen, die bei Kim et al., 2000, definiert werden, insbesondere die humanen Isoformen a und c von IL-18BP. Der Begriff „IL-18BP", wie hierin verwendet, umfasst weiter Muteine, funktionale Derivate, aktive Fraktionen, fusionierte Proteine, zirkulär permutierte Proteine und Teile bzw. „Slats" von IL-18BP, wie in WO 99/09063 definiert.
Das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Mediums hergestellte IL-18BP ist bevorzugt glykosyliert.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Muteine" auf Analoga von IL-18BP, oder Analoga eines viralen IL-18BPs, worin eine oder mehrere der Aminosäurereste eines natürlichen IL-18BP oder viralen IL-18BP durch andere Aminosäurereste ersetzt oder deletiert sind, oder ein oder mehrere Aminosäurereste zu der natürlichen Sequenz eines IL-18BP oder eines viralen IL-18BP hinzugefügt sind, ohne die Aktivität der resultierenden Produkte im Vergleich mit dem Wildtyp-IL-18BP oder viralen IL-18BP erheblich zu verändern. Diese Muteine werden durch bekannte Synthesetechniken und/oder durch ortsgerichtete Mutageneseverfahren, oder durch beliebige andere bekannte, dafür geeignete Verfahren hergestellt.
Muteine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, codiert durch eine Nukleinsäure wie etwa DNA oder RNA, die unter stringenten Bedingungen mit DNA oder RNA hybridisiert, die ein IL-18BP codiert oder ein virales IL-18BP codiert (WO 99/09063). Der Begriff „stringente Bedingungen" bezieht sich auf die Hybridisierung und nachfolgende Waschbedingungen, die Fachleute üblicherweise als „stringent" bezeichnen. Siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, siehe oben, Interscience, N. Y., §§6.3 und 6.4 (1987, 1992). Ohne Einschränkung umfassen Beispiele für stringente Bedingungen Waschbedingungen von 12–20°C unterhalb des berechneten Tm des untersuchten Hybrids, z. B. 2 × SSC und 0.5% SDS für 5 min, 2 × SSC und 0,1% SDS für 15 min, 0,1 × SSC und 0,5% SDS bei 37°C für 30–60 min und dann 0,1 × SSC und 0,5% SDS bei 68°C für 30–60 min. Fachleute verstehen, dass stringente Bedingungen auch von der Länge der DNA-Sequenzen, Oligonukleotidsonden (wie etwa 10–40 Basen) oder gemischten Oligonukleotidsonden abhängen. Wenn gemischte Sonden verwendet werden, ist es bevorzugt, anstelle von SSC Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zu verwenden. Siehe Ausubel, s. oben.
Die Identität spiegelt eine Beziehung zwischen zwei oder mehreren Polypeptidesequenzen oder zwei oder mehreren Polynukleotidsequenzen wider, bestimmt durch einen Vergleich der Sequenzen. Im Allgemeinen bezieht sich Identität auf eine exakte Übereinstimmung von Nukleotid mit Nukleotid oder Aminosäure mit Aminosäure der zwei Polynukleotide bzw. der zwei Polypeptidsequenzen über die Länge der Sequenzen, die verglichen werden.
Bei Sequenzen, bei denen keine exakte Übereinstimmung vorliegt, kann eine „%ige Identität" bestimmt werden. Im Allgemeinen werden die zwei zu vergleichenden Sequenzen so angeordnet, dass eine maximale Übereinstimmung zwischen den Sequenzen entsteht. Dies kann das Einfügen von „Lücken" entweder in einer oder beiden Sequenzen umfassen, um das Ausmaß der Anordnung zu verbessern. Eine %ige Identität kann über die gesamte Länge von jeder der verglichenen Sequenzen bestimmt werden (so genannte globale Anordnung), was besonders für Sequenzen der gleichen oder einer sehr ähnlichen Länge geeignet ist, oder über kürzere, definierte Längen (so genannte lokale Anordnung), was bei Sequenzen mit einer unterschiedlichen Länge besser geeignet ist.
Verfahren zum Vergleichen der Identität und Homologie von zwei oder mehr Sequenzen sind im Fachgebiet allgemein bekannt. So können beispielsweise Programme, die im Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 9.1 (Devereux J. Et al., 1984) erhältlich sind, beispielsweise die Programme BESTFIT und GAP, verwendet werden, um die %ige Identität zwischen zwei Polynukleotiden und die %ige Übereinstimmung und die %ige Homologie zwischen zwei Polypeptidsequenzen zu bestimmen. BESTFIT verwendet die Algorithmen der „lokalen Homologie" von Smith und Waterman (1981) und findet die beste Einzelregion einer Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen. Andere Programme zum Bestimmen der Übereinstimmung und/oder Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen sind im Fachgebiet auch bekannt, beispielsweise die BLAST-Familie von Programmen (Altschul S. F. et al., 1990, Altschul S. F. et al., 1997, zugänglich über die Homepage der NCBI unter www.ncbi.nlm.nih.gov) und FASTA (Pearson W. R., 1990).
Alle solche Muteine besitzen bevorzugt eine Aminosäuresequenz, die ausreichend duplikativ mit der eines IL-18BP oder ausreichend duplikativ mit einem viralen IL-18BP ist, so dass es eine ausreichend ähnliche Aktivität wie IL-18BP besitzt. Eine Aktivität von IL-18BP ist die Fähigkeit der Bindung von IL-18. Solange das Mutein eine wesentliche Bindungsaktivität gegenüber IL-18 besitzt, kann es so eingestuft werden, dass es eine wesentlich ähnliche Aktivität wie IL-18BP besitzt. Somit kann bestimmt werden, ob irgendein bestimmtes Mutein im Wesentlichen die gleiche Aktivität wie IL-18BP besitzt, mittels einer Routineuntesuchung, die Unterziehen eines solchen Muteins beispielsweise eines einfachen Sandwich-Competition-Assays umfasst, zur Bestimmung, ob es an ein in geeigneter Weise markiertes IL-18 bindet oder nicht, wie etwa in einem Radioimmunassay oder ELISA-Assay.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt ein beliebiges solches Mutein zumindest eine 40%-ige Identität oder Homologie entweder mit der Sequenz von IL-18BP oder einem viral codierten IL-18BP-Homologen, wie in WO 99/09063 definiert. Mehr bevorzugt, besitzt es mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder am meisten bevorzugt mindestens 90 oder 95% Übereinstimmung oder Homologie dazu.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sind bevorzugte Veränderungen bei Muteinen solche, die als „konservative" Substitutionen bekannt sind. Konservative Aminosäuresubstitutionen von IL-18BP-Polypeptiden oder Proteinen oder viralen IL-18BPs können synonyme Aminosäuren innerhalb einer Gruppe umfassen, die ausreichend ähnliche physiochemische Eigenschaften besitzen, sodass bei einer Substitution zwischen Mitgliedern der Gruppe die biologische Funktion des Moleküls aufrechterhalten wird (Grantham, 1974). Es ist klar, dass in den oben definierten Sequenzen auch Insertionen und Deletionen von Aminosäuren durchgeführt werden können, ohne deren Funktion zu verändern, insbesondere, wenn die Insertionen oder Deletionen nur wenige Aminosäuren betreffen, beispielsweise unter 30 und bevorzugt unter 10, und keine Aminosäuren entfernt oder ersetzt werden, die für eine funktionelle Konformation entscheidend sind, z. B. Cysteinreste. Durch solche Deletionen und/oder Insertionen erzeugte Proteine und Muteine liegen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Der Begriff „fusioniertes Protein" bezieht sich auf ein Polypeptid, umfassend ein IL-18BP oder ein virales IL-18BP, oder ein Mutein oder Fragment davon, das mit einem anderen Protein fusioniert ist, das beispielsweise eine verlängerte Verweildauer in Körperflüssigkeiten besitzt. Ein IL-18BP oder virales IL-18BP kann somit mit einem anderen Protein, Polypeptid oder dergleichen fusioniert sein, z. B. mit einem Immunglobulin oder einem Fragment davon.
Als „aktive Fraktionen" eines IL-18BP oder eines viralen IL-18BP, Muteins und fusionierten Proteins umfasst die vorliegende Erfindung ein beliebiges Fragment oder einen beliebigen Vorläufer der Polypeptidkette des Proteinmoleküls alleine oder zusammen mit verbundenen Molekülen oder daran gebundenen Resten, z. B. Zucker oder Phosphatreste, oder Aggregate des Proteinmoleküls oder der Zuckerreste untereinander, vorausgesetzt, dass die Fraktion eine im Wesentlichen ähnliche Aktivität wie IL-18BP besitzt.
Die Sequenzen von IL-18BP und den Splicevarianten/Isoformen davon können WO 99/09063 oder Novick et al., 1999 ebenso wie Kim et al., 2000, entnommen werden.
Sollte das IL-18BP der Erfindung als eine pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden, kann eine solche pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung und/oder Prophylaxe einer Anzahl von Erkrankungen und Störungen verwendet werden. Solche Erkrankungen und Störungen sind bevorzugt IL-18BP-vermittelte Erkrankungen. Insbesondere kann gereinigtes IL-18BP für die Behandlung und/oder Vorbeugung von Psoriasis, psoriatischer Arthritis, Morbus Crohn, rheumatoider Arthritis, einer Leberverletzung wie etwa einer alkoholischen Leberzirrhose, Sepsis, Atherosklerose, ischämischen Herzerkrankungen, Allergien, insbesondere eine T-Zell-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktion und einer geschlossenen Kopfverletzung verwendet werden, wie in WO 99/09063 , WO 01/07480 , WO 01/62285 , WO 01/85201 , WO 02/060479 , WO 02/096456 , WO 03/080104 , WO 02/092008 , WO 02/101049 , WO 03/013577 offenbart.
Nachdem nun diese Erfindung vollständig beschrieben ist, werden Fachleute erkennen, dass diese in einem breiten Bereich von äquivalenten Parametern, Konzentrationen und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne von der Idee und dem Umfang der Erfindung abzuweichen und ohne übermäßiges Experimentieren.
Obwohl diese Erfindung in Verbindung mit ihren spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es verständlich, dass weitere Modifikationen möglich sind. Diese Anmeldung soll alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung, im Allgemeinen die Prinzipien der Erfindung umfassen, und soll solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung umfassen, die in der bekannten oder gebräuchlichen Praxis in dem Fachgebiet vorkommen, zu dem die Erfindung gehört, und die auf die wesentlichen Merkmale hierin angewendet werden können, wie im Umfang der angehefteten Ansprüche im Folgenden angeführt ist.
Beispiel 1: Anziehen von IL-18BP-exprimierenden CHO-Zellen in serum freiem Medium
1.1 Herstellung eines serumfreien Mediums (SFM) mit der Bezeichnunq „SM-005"
Das Zellkulturmedium, das für die unter 1.2 beschriebenen Experimente verwendet wurde, war ein Medium, so angepasst, dass es die folgenden Bestandteile in den folgenden Konzentrationen enthält:

– Asparagin in einer Konzentration von 830 mg/l;
– Natriumchlorid in einer Konzentration von 3500 mg/l;
– Selenit in einer Konzentration von 0,0110 mg/l;
– Weizenhydrolysat in einer Konzentration von 10000 mg/l; und
– Insulin in einer Konzentration von 4 mg/l.

Das Medium enthielt auch 4,5 g/l Glucose. Wenn das Medium für den Produktionsmodus verwendet wird, kann die Glucosekonzentration auf 1 g/l verringert werden. Das Medium enthält weiter alle Aminosäuren außer Glutamin. Vitamine, Salze, Fettsäuren, HEPES als eine Puffersubstanz, Pluronic F68, Hydrocortison, Na-Pyruvat und Sojahydrolysat lagen in diesem Medium auch vor. Das Medium wird unten als SM-005 identifiziert.
1.2 Wachstum von Zellen in Suspension
T-Flaschen oder Rollerflaschen wurden mit Zellen von einem IL-18BP-exprimierenden und sekretierenden CHO-Klon angeimpft, der zuvor etabliert worden war. Diese Zellen wachsen in Suspension und wurden zuerst expandiert. Während des Zellexpansionsverfahrens wurden die Zellen in Suspension kultiviert und systematisch mit definierten Volumina von frischem SM-005-Medium an festgelegten Tagen verdünnt. Zu Kontrollzwecken wurden die Zelldichte, Glucose- und Lactatkonzentration bei jedem Verdünnungsschritt gemessen (siehe Figuren).
Am Tag 0 wurde ein Vial der zuvor etablierten Master-Zellbank aufgetaut. Die von diesem Vial stammenden Zellen wurden dann in eine Gewebekulturflasche mit 75 cm² (TCF 75 cm²) in einem Gesamtvolumen von 30 mg frischem SM-005-Medium angeimpft. Die resultierende Zellkonzentration in der TCF erreichte ungefähr 0,20 Millionen Zellen/ml. Schließlich wurde die TCF unter Bewegung bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.
Am Tag 4 wurde die Kultur in eine TCF175 cm² übertragen und durch Zugabe von frischem und vorgewärmtem SM-005-Medium auf 120 ml verdünnt.
An Tag 8 wurde die Kultur in eine RB850 cm² übertragen und durch Zugabe von frischem und vorgewärmtem SM-005-Medium auf 400 ml verdünnt.
Am Tag 12 wurde die Kultur durch Zugabe von frischem und vorgewärmtem SM-005-Medium auf 1200 ml verdünnt (Verdünnungsverhältnis von 1:3) und dann in drei Rollerflaschen RB850 cm² aufgeteilt, wobei jede 400 ml enthielt.
Am Tag 16 wurde die Kultur durch Zugabe von frischem und vorgewärmtem Medium auf 4800 ml verdünnt (Verdünnungsverhältnis von 1:4) und dann in 6 RB1750 cm² aufgeteilt, wobei jede 800 ml enthielt.
Vom Tag 20 an (Tag 20, Tag 23, Tag 26, ... bis zu Tag 62) wurde die RB1750 cm² alle drei Tage in einer wiederholten Art und Weise verdünnt, unter Berücksichtigung eines Verdünnungsverhältnisses von 1:4. An jedem Verdünnungstag wurde die erforderliche Zahl von RB1750 cm² erzeugt (zumindest 4 RB1750 cm²). Somit wurde jede RB1750 cm² durch Zugabe von frischem und vorgewärmtem Medium von 800 ml auf 3200 ml verdünnt, und dann in 4 RB1750 cm² aufgeteilt, wobei jede Flasche 800 ml enthielt.

Um Bioreaktoren zu beimpfen, wurde die erforderliche Zahl von Rollerflaschen an einem Verdünnungstag (zwischen Tag 20 und Tag 60) geerntet, in einer sterilen Glasflasche vereinigt und in Bioreaktoren übertragen. Tabelle 1: Schematische Beschreibung des Inokulum-Herstellungsverfahrens. Von Tag 20 an wurden die Zellen mit einem festen Verdünnungsverhältnis von 1:4 verdünnt.

Tag	Operation	Volumen
0	Auftauen MCB Vial → 75 cm² TCF	30 ml
4	Verdünnung mit frischem Medium 75cm² TCF → 150 cm² TCF	120 ml
8	Verdünnung mit frischem Medium 150 cm² TCF → 850 cm² RB	400 ml
12	Verdünnung mit frischem Medium 1 × 850 cm² RB → 3 × 850 cm² RB	1200 ml
16	Verdünnung mit frischem Medium 3 × 850 cm² RB → 46 × 1750 cm² RB	4800 ml
Von Tag 20 an, alle 3 Tage	Verdünnung mit frischem Medium Wiederholte Verdünnungen mit einem Teilungsverhältnis von 1:4 in RB1750 cm²	800 ml pro RB1750 cm cm²
Verdünnungstag Tag 20 ≤ Tag ≤ Tag 62	Ernten des Zellinokulums für eine Bioreaktorbeimpfung

Die 1 bis 4 zeigen die während des Inokulum-Herstellungsverfahrens gemessenen Daten (n = 10). 1 zeigt die Dichte lebensfähiger Zellen, 2 die kumulierten lebensfähigen Zellen, 3 die Verdopplungszeit, und 4 die Glucose- und Lactatkonzentration im Überstand.
Nach einer 20-tägigen Adaptationsphase ist das Wachstum der Zellen in dem serumfreien Medium sehr konsistent und reproduzierbar. Die stabilen Wachstumsbedingungen ermöglichen eine leichte Subkultur der Zellen durch eine wiederholte Verdünnung mit einem Verhältnis von 1:4 über verlängerte Zeiträume (untersucht bis zum Tag 62, wie in den 1, 2, 3, 4 gezeigt wird).
REFERENZEN

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2. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, s. oben, Interscience, N. Y., §§6.3 und 6.4 (1987, 1992).
3. Altschul, S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25: 389–3402, 1997.
4. Bohak et al. 1987 Bohak, Z., Kadouri, A. et al. (1987) „Novel anchorage matrices for suspension culture of mammalian cells" Biopolymers. 26 Suppl: S205–213.
5. Devereux, J. et al., Nucleic Acids Res., 12, 387–395, 1984.
6. Grantham et al., Science, Vol. 185, S. 862–864 (1974).
7. Kim, S. H., Eisenstein, M., Reznikov, L., Fantuzzi, G., Novick, D., Rubinstein, M., Dinarello, C. A. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: 1190–1195.
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9. Pearson, Methods Enzymol. 1990; 183:63–98.
10. Petti, S. A., Lages, A. C. et al. (1994) „Three-dimensional mammalian cell growth on nonwoven polyester fabric disks" Biotechnol. Prog. 10(5): 548–550.
11. Puck et al., J. Exp. Med. 108, 945, 1958.

Claims

Verfahren zur Kultivierung von IL-18BP-produzierenden Zellen, umfassend den Schritt Anziehen der Zellen in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, worin das Zellkulturmedium Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l, Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l, Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l umfasst.
Verfahren zur Herstellung von IL-18BP, umfassend den Schritt Kultivieren einer IL-18BP-exprimierenden Zelle in einem Zellkulturmedium, das frei ist von Bestandteilen, die von tierischem Serum stammen, worin das Zellkulturmedium Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l, Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l, Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiter umfassend den Schritt Sammeln des Mediums, das das interessierende Protein enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend Isolieren des interessierenden Proteins.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiter umfassend Formulieren des isolierten Proteins mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu erhalten.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Zellen Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO, „Chinese Hamster Ovary") sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Glukose in einer Konzentration im Bereich von etwa 500 bis etwa 5500 mg/l umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Aminosäuren umfasst, ausgewählt aus Alanin, Arginin, Asparaginsäure, Cystein, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Tryptophan, Tyrosin, Threonin und Valin, aber kein Glutamin.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Medium weiter Glutamin umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Vitamine umfasst, ausgewählt aus Biotin, Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Myoinositol, Niacinamid, Pyridoxin, Riboflavin, Vitamin B12, Thiamin und Putrescin.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Salze umfasst, ausgewählt aus CaCl₂, KCl, MgCl₂, Natriumphosphat, CuCl₂ und ZnCl₂.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter eine Puffersubstanz umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Fettsäuren umfasst, welche ausgewählt werden aus Arachidonsäure, Linolsäure, Ölsäure, Laurinsäure, Myristinsäure.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Cyclodextrin umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter ein Sojahydrolysat umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Hydrocortison umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter ein Schutzmittel, insbesondere Pluronic F68 umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medium weiter Pyruvat umfasst.
Verwendung eines Zellkulturmediums, umfassend Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l, Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l, Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l für das Anziehen von IL-18BP-exprimierenden Zellen in Kultur.
Verwendung eines Zellkulturmediums, umfassend Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l, Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l, Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l für die Herstellung von IL-18BP in IL-18BP-exprimierenden Zellen.
Verwendung eines Zellkulturmediums, umfassend Asparagin in einer Konzentration im Bereich von etwa 800 bis etwa 900 mg/l, Natriumchlorid in einer Konzentration im Bereich von etwa 3000 bis etwa 4500 mg/l, Selenit in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,005 bis etwa 0,015 mg/l Weizenhydrolysat in einer Konzentration im Bereich von etwa 5000 bis etwa 15000 mg/l und Insulin in einer Konzentration im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 6 mg/l für die Erhaltung von IL-18BP-exprimierenden Zellen in Kultur.