DE602005002496T2

DE602005002496T2 - Identifizierung des Gens und der Mutation für die fortschreitende Degenerierung der Sinneszellen (Stäbchen und Zapfen) in der Netzhaut von Hunden und Testmethoden

Info

Publication number: DE602005002496T2
Application number: DE602005002496T
Authority: DE
Inventors: Gustavo Philadelphia Aguirre; Gregory M. Unionville Acland; Barbara Philadelphia Zangerl; Orly Ithaca Goldstein; Susan Berkshire Pearce-Kelling; Jeanette S. Horseheads Felix; Duska J. Brookfield Sidjanin
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2025-06-22
Also published as: DK1609876T3; DE602005002496D1; EP1609876A1; US20090111976A1; AU2005202704A1; PL1609876T3; CA2507927C; AU2005202704B2; US20050282212A1; US20100323349A1; US7312037B2; EP1609876B1; US8206911B2; ATE373728T1; US7671187B2; PT1609876E; CA2507927A1; ES2293494T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein eine bei Hunden beobachtete Klasse genetisch bedingter Krankheiten, die als progressive Stäbchen-Zapfen-Degeneration ("prcd") bezeichnet wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Gen und eine Mutation eines einzelnen Nukleotids in dem Gen, das mit progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration bei Hunden assoziiert ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Progressive Retina-Atrophie (PRA) ist eine heterogene Klasse von Retinaerkrankungen, denen ein im Großen und Ganzen ähnlicher klinischer Phänotyp der Erkrankung gemein ist und von denen der Hund (Canis familiaris) betroffen ist (Aguirre, 1976). Die klinischen Merkmale beinhalten: anfänglich Nachtblindheit; gefolgt von einer Abnahme des Zapfensehens, die zu vollständiger Erblindung führt; Abnahme der Retinagefäße und Verdünnung der Retina; Anomalitäten in einem Elektroretinogramm ("ERG"); und Entwicklung von Katarakten. Krankheiten dieser Gruppe werden üblicherweise über einen autosomal rezessiven Gendefekt vererbt, wenngleich auch dominante und X-chromosomale Formen von PRA bekannt sind (Kijas et al., 2002; Zhang et al., 2002). PRA lässt sich in Entwicklungskrankheit und degenerative Krankheit einteilen. Die Entwicklungsklasse umfasst mehrere genetisch verschiedene Krankheiten, die sich zytologisch in der unmittelbaren postnatalen Periode ausdrücken, wenn Sehzellen in der caninen Retina zu differenzieren beginnen (Acland et al., 1989). Im Gegensatz dazu zeigt die degenerative Klasse Defekte, bei denen Fotorezeptorzellen nach normaler Differenzierung degenerieren – diese Klasse beinhaltet die spezifische Krankheit, die als progressive Stäbchen-Zapfen-Degeneration (prcd) bezeichnet wird. Diese spezifische Form von PRA ist eine autosomal rezessiv vererbte, spät ausbrechende Retinadegeneration, von der zahlreiche verschiedene Hunderassen betroffen sind (Aguirre und Acland, 1988).
Für alle bislang bekannten autosomal rezessiven, spät ausbrechenden erblichen Retinadegenerationen bei Hunden sind Mutationen am prcd-Genort verantwortlich. Durch Kreuzungsversuche wurde festgestellt, dass der prcd-Genort für progressive Retina-Atrophie bei Pudeln (Toy- und Zwergpudel), Cockerspaniels (Amerikanisch und Englisch), Labrador-Retrievern und Portugiesischen Wasserhunden (siehe z. B. Aguirre und Acland, 1988, Aguirre und Acland, 1991; Pearce-Kelling et al., 2002) verantwortlich ist. Kreuzungsexperimente lassen vermuten, dass die gleiche Mutation im F04-Gen (das Gen, das für prcd verantwortlich ist) auch bei mehreren anderen Rassen vorhanden ist, sowohl bei Hunden, die an prcd leiden, oder die Träger der Krankheit sind. Basierend auf klinischen und genetischen Parametern, die mit einer Erkrankung als Folge von Mutationen am prcd-Genort konsistent sind, beinhalten andere Hunderassen, von denen man annimmt, dass sie prcd als die Form beobachteter progressiver Retina-Atrophie haben, Akita, Basenji, Border-Collie, Englischer Mastiff, English Springer Spaniel, Havanese, Lowchen, Samoyed, Standard-Drahthaardackel, Tibet-Terrier, Berner Sennenhund und Zwergschnauzer. Abhängig von der Rasse des Hundes können verschiedene Mutationen, die für Allelvarianten des prcd-Genorts verantwortlich sind, die Progressionsrate, aber nicht den Phänotyp der Fotorezeptordegeneration steuern.
Die klinische Diagnose der prcd-Erkrankung wird durch die Notwendigkeit hochentwickelter Testverfahren wie ERG und den späten Ausbruch der Krankheit noch komplizierter. Das Alter, in dem die Krankheit mit den zur Zeit verfügbaren Verfahren diagostiziert werden kann, kann nach dem reproduktiven Leben des Hundes liegen. Beim Englischen Cockerspaniel kann progressive Retina-Atrophie beispielsweise durch ERG im Alter von drei Jahren und durch Ophthalmoskopie im Alter von 5-8 Jahren diagnostiziert werden. Diagnose in diesem späten Alter führt zur Ausbreitung des unerwünschten genetischen Merkmals in der Population und zu einer Häufigkeitszunahme der Krankheit.
Die geschätzte Prävalenz progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration unterscheidet sich bei den betroffenen Rassen. Man nimmt an, dass etwa 2 % Labrador-Retriever im Alter von mehr als 2-3 Jahren an progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration leiden; in diesem Fall könnte der Anteil von Labrador-Retrievern, von denen zu erwarten ist, dass sie am prcd-Ort heterozygot sind, bis zu 24 % betragen. Bei Pudeln und Cockerspaniels ist die Krankheitsrate höher als die, die man bei Labrador-Retrievern beobachtet, und folglich sollte man erwarten, dass die Trägerrate höher liegt. Nach Ergebnissen einer Untersuchung Portugiesischer Wasserhunde beträgt die berechnete Trägerhäufigkeit etwa 40 %.
Übliche Maßnahmen zur Kontrolle von Erbkrankheiten in einer Population beinhalteten "Testpaarungen" zur Identifizierung von Trägerhunden und zur Eliminierung der identifizierten Träger aus Zuchtprogrammen, wodurch die Häufigkeit einer genetisch bedingter Krankheiten in einer Zucht verringert wird. Bei einer Testpaarung wird der als potenzieller Träger der genetischen Krankheit zu beurteilende Hund mit einem Hund gepaart, von dem bekannt ist, dass er an der Krankheit leidet. Bei der Nachkommenschaft wird dann verfolgt, ob die Krankheit auftritt oder nicht, und ein Wurf von gleich oder größer sechs, bei dem kein Nachkomme krank ist, schließt den Hund üblicherweise als Träger aus. Testpaarungen wurden zwar effektiv für Rassen mit größeren Würfen und für Krankheiten mit frühem Einsetzen eingesetzt, ein solches Verfahren ist jedoch nicht geeignet, um die Häufigkeit von prcd zu verringern. Neben den Nachteilen von Testpaarungen, wie großem Zeitaufwand und Mühen, um einen Hund auszuschließen, und dass kranke Hunde geboren werden können, wenn sich der Hund als Träger herausstellt, sind Testpaarungen zum Auffinden von Trägern von prcd wegen des späten Ausbruchs von mit der Krankheit verbundenen klinischen Symptomen und weil einige der betroffenen Rassen kleine Würfe haben (zu klein, um eine statistische Wahrscheinlichkeit zu beweisen), nicht besonders geeignet.
Obwohl das Gen, das die Mutation oder die Mutationen trägt, die zu prcd führen, bislang nicht bekannt war, zeigten genetische Kopplungsstudien bei prcd-Familien, dass das Gen, das bei Hunden die Ursache der Erkrankung ist, am zentromeren Ende des caninen Chromosoms 9 liegt, einem Bereich, der homolog zum telomeren Ende des langen Arms von humanem Chromosom 17 ist (Acland et al., 1999; Sidjanin et al., 2003).
Trotz umfangreicher Bemühungen in der Technik, das für prcd verantwortliche Gen zu finden, blieb das Gen bislang nicht fassbar. Identifizierung, Isolierung, Klonierung und Sequenzierung des prcd-Gens sollte die Entwicklung und Herstellung von Produkten ermöglichen, die sich zur Diagnose und zum Screening von prcd eignen. Daher bestand in der Hundezuchtbranche ein nachhaltiger Bedarf an einem genetischen Test, der eine direkte Identifizierung von Hunden erlaubt, die die prcd-Form von progressiver Retina-Atrophie haben (d. h. vor dem feststellbaren Einsetzen klinischer Symptome), und auch die Genotypisierung von Hunden erlaubt, bei denen ein Risiko für prcd besteht, um festzustellen, ob sie krank, Träger oder genetisch normal sind.
Casse, C. et al., ARVO Annual Meeting Abstract Search and Program planner, Bd. 2003, 2003, Abstract Nr. 2318, XP002342659, beschreibt ein Gen, das möglicherweise an progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration (PRCD) beteiligt ist.
WO 99/02731 beschreibt Chromosom 9 und genetische Marker und Assays für progressive Stäbchen-Zapfen-Degeneration.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um festzustellen, ob ein Hund ein Träger progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration ist oder dafür prädisponiert ist, welches umfasst: Testen einer biologischen Probe, die von dem Hund erhaltene Nukleinsäuren umfasst, auf eine Transversion von G zu A im F04-Gen an einer Position, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht, wobei die Transversion von G zu A in einem Allel einen Träger von progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration anzeigt, die Transversion von G zu A in beiden Allelen einen Hund anzeigt, der an progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration leidet oder dafür prädisponiert ist, und das Fehlen der Transversion von G zu A einen Hund anzeigt, der weder Träger progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration ist noch dafür prädisponiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein neues, mit der Krankheit assoziiertes canines Gen codiert, das hier als das F04-Gen bezeichnet wird. Die Erfindung stellt ferner das F04-Gen mit einer Mutation von G zu A an Position 1298 von SEQ ID NO:1 bereit. Diese Transversion ist mit prcd assoziiert und zeigt diese an.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Hunden, die genetisch normal sind, Träger der prcd-Krankheit sind oder an dieser erkrankt sind. Genetisch normale Hunde sind solche, bei denen beide Allele des F04-Gens G als das Nukleotid an einer Position haben, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht. Kranke Hunde oder prädisponierte Hunde sind solche, bei denen beide Allele des F04-Gens A als das Nukleotid an einer Position haben, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht. Trägerhunde sind solche, bei denen ein Allel des F04-Gens G und das andere Allel A als das Nukleotid an einer Position hat, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht. Eine Änderung von G zu A im F04-Gen an einer Position, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht, wird hier als die "prcd-Mutation" bezeichnet. Die Nukleotidposition 1298 in SEQ ID NO:1 entspricht auch Nukleotidposition 115 in der in SEQ ID NO:3 gezeigten cDNA-Sequenz.
Das Verfahren umfasst die Schritte des Erhaltens einer biologischen Probe von einem Hund und des Testens der biologischen Probe, um festzustellen, ob G an einer Position vorliegt, die Nukleotidposition 1298 des F04-Gens entspricht, oder nicht. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren den Nachweis einer Mutation von G zu A an einer Position, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht, in einem oder beiden Allelen, was einen Hund anzeigt, der ein Träger von prcd ist, bzw. einen Hund, der an prcd leidet (oder dafür prädisponiert ist).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, um Hunde für eine Zucht auszuwählen. Dieses Verfahren umfasst den Erhalt einer biologischen Probe von einem Hund, Testen der biologischen Probe auf ein F04-Gen mit einer prcd-Mutation in einem oder beiden Allelen, und Eliminieren von Hunden mit der prcd-Mutation aus einem Zuchtbestand, oder Kreuzen der Hunde mit der prcd-Mutation mit genetisch normalen Hunden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die genomische Sequenz des caninen F04-Gens.
2 zeigt die Sequenz der cDNA des caninen F04-Gens.
3 ist eine Darstellung des Restriktionsendonukleaseverdaus amplifizierter Produkte von genetisch normalen Hunden, Trägerhunden oder Hunden, die an prcd leiden. 3A zeigt Verdau mit der Restriktionsendonuklease RsaI, und 3B zeigt Verdau mit Restriktionsendonuklease ApaLI.
4 ist eine Abbildung des experimentellen Aufbaus, der verwendet wurde, um mittels Pyrosequencing^TM festzustellen, ob ein Hund ein Träger der prcd-Mutation ist, von dieser betroffen ist oder diesbezüglich normal ist.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Nukleinsäuremolekül bereit, das für ein neues F04-Gen codiert, das bei Hunden auf Chromosom 9 lokalisiert ist. Die Sequenz des Wildtyp-F04-Gens ist in 1 dargestellt, und Einzelheiten betreffend die Sequenz sind wie folgt.
Erklärung der genomischen Sequenz
Die genomische Sequenz des F04-Gens ist 18592 bp lang. Die in SEQ ID NO:1 angegebene Sequenz beinhaltet alle bislang identifizierten Polymorphismen.
Nukleotidaustausche sind wie folgt in Kursivbuchstaben gezeigt: W = A/T; M = A/C; R = A/G; Y = C/T; S = C/G; K = G/T. Insertionen/Deletionen sind in Kursivbuchstaben gezeigt und unterstrichen. Die Sequenz des betroffenen und des anderen Allels für alle in der Sequenz gezeigten Polymorphismen sind in einer separaten Polymorphismentabelle dargestellt (Beispiel 2). Ein Mikrosatellit an Position 13.146-13.278 bp ist ebenfalls in Kursivschrift gezeigt und eingerahmt.
In der öffentlich zugänglichen Sammlung für canine Genomsequenzen (canFam1) vom Juli 2004 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks?org=Dog&db=canFaml&hgsid=42443361) wird die genomische F04-Sequenz (SEQ ID NO:1) fälschlicherweise auf chr18:26,568,308-26,586,788 lokalisiert. Wir glauben, dass dies nicht richtig ist, da wir durch unser BAC-Contig und durch FISH und meiotische Kopplungskartierung, wie durch Vergleich mit den homologen Regionen des menschlichen Genoms und des Mäusegenoms vorhergesagt, festgestellt haben, dass diese canine genomische Region richtigerweise auf CFA9 lokalisiert ist. Diese Diskrepanz beeinträchtigt die Genauigkeit oder die Anwendungsmöglichkeit der hier beschriebenen Tests nicht.
In der gesamten Sequenz sind die vorgeschlagenen Exons und UTR-Regionen in Großbuchstaben gezeigt, und definierte Exons sind in Fettdruck. Intronregionen sind in Kleinbuchstaben angegeben.

Exon 1: bp 1-1367 Beinhaltet eine TATA-Box an Position 727-731, drei CRX-Bindungsstellen an den Positionen 1122-1128; 1159-1165; 1177-1183, und das ATG-Signal, das den Start des ORF anzeigt, an Position 1294-1296, die alle unterstrichen und eingerahmt sind. Die prcd-Mutation an Position 1298 ist in Kursivschrift, fett und eingerahmt. Die Mutation ist eine Änderung von G zu A und ist als "R" angegeben.
Exon 2: bp 1650-1718
Exon 3: bp 3746-3826 Beinhaltet das Stoppcodon an Position 3765-3767, das unterstrichen und eingerahmt ist.
Exon 4: bp 4161-4256
3'UTR: bp 4257-18.592 In dieser Region gibt es mehrere potenzielle Adenylierungssignale, die durch Unterstreichen und Einrahmen hervorgehoben sind. Von der als 3'UTR bezeichneten Region wurde auch gezeigt, dass sie Regionen für alternatives Splicing enthält (durch Fettdruck angezeigt), was in dieser Region ferner definiert:
Exon 5a: bp 4806-5399
Exon 5b: bp 4839-5399
Exon 5c: bp 5093-5399
Exon 6: bp 6558-6665
Exon 7: bp 6927-7164
Exon 8: bp 7547-7720
Exon 9: bp 12275-18592

Die auf Basis der Sequenz von SEQ ID NO:1 unter Annahme einer Startstelle an Position 1294 abgeleitete Aminosäuresequenz eines putativen, vom F04-Gen codierten Proteins ist weiter unten als SEQ ID NO:2 gezeigt.
Met Cys Thr Thr Leu Phe Leu Leu Ser Thr Leu Ala Met Leu Trp Arg Arg Arg Phe Ala Asn Arg Val Gln Pro Glu Pro Ser Gly Ala Asp Gly Ala Val Val Gly Ser Arg Ser Glu Arg Asp Leu Gln Ser Ser Gly Arg Lys Glu Glu Pro Leu Lys – (SEQ ID NO:2)
In diesem Fall würde die prcd-Mutation zu einem Austausch von Cystein (der zweiten Aminosäure) durch Tyrosin führen.
Die F04-cDNA-Sequenz (siehe SEQ ID NO:3)
Es wurden mehrere Spleißvarianten des F04-Gens identifiziert, die alle denselben ORF beinhalten. Die kürzeste vollständige Spleißvariante ist 695 bp lang; die cDNA (SEQ ID NO:3) für diese Variante des F04-Gens ist in 2 gezeigt. Der Fachmann erkennt, dass eine mögliche zukünftige Identifizierung weiterer Exons, die den hier beschriebenen F04-ORF nicht verändern (wie ein nicht codierendes Exon 5' zu Exon 1 oder 3' zu Exon 3), die gezeigte Assoziation der prcd-Mutation mit PRA oder den hier beschriebenen Nachweis der prcd-Mutation nicht beeinträchtigt.
Erklärung der cDNA-Sequenz:
Die cDNA-Sequenz umfasst den ORF mit 165 bp, der sich an Position 111-275 befindet (sowohl Start- als auch Stoppcodon sind durch Fettdruck hervorgehoben). Die Mutation befindet sich innerhalb des ORF an Position 115 uns ist kursiv und fett gedruckt und eingerahmt (normales Allel = G; mutiertes Allel = A). Andere Polymorphismen (beispielsweise: Y = C/T, Nt 312 SEQ ID NO:3, Polymorphismus #55, Tabelle 1; und R = G/A, Nt 633 SEQ ID NO:3, Polymorphismus #57, Tabelle 1) in der 3'UTR sind nicht mit der Krankheit assoziiert, weil beide Allele auf normalen Chromosomen identifiziert wurden. Alle cDNAs, die den F04-ORF beinhalten, beinhalten Exon 1 (bp 1-184), Exon 2 (bp 185-253), Exon 3 (bp 254-334) und Exon 4 (bp 335-695), partielle cDNAs, die mit verschiedenen Primersets erhalten wurden, beweisen jedoch, dass verschiedene Spleißvarianten in der 3'UTR zumindest Exons 5 und 8, wie sie in der genomischen Sequenz definiert sind, beinhalten können. Andere Merkmale sind die gleichen wie in der genomischen DNA.
Der Nachweis der prcd-Mutation im F04-Gen kann mit jeder geeigneten, von einem Hund erhaltenen biologischen Probe erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe irgendein Gewebe, das genomische DNA enthält. Geeignete Quellen für eine biologische Probe beinhalten Blut, Haar, Schleimhautabstriche, Samenflüssigkeit, Gewebebiopsie oder Speichel. Bei einer Ausführungsform ist die biologische Probe Blut.
Hunde, die die prcd-Mutation im F04-Gen tragen, können gefunden werden, indem man entweder die DNA oder die RNA testet, wobei eine Vielzahl allgemein bekannter Methoden verwendet werden kann. Die genomische DNA, die für die Diagnose verwendet wird, kann aus einer biologischen Probe, wie sie oben beschrieben ist, erhalten werden. Die DNA kann direkt verwendet werden, oder sie kann vor der Mutationsanalyse enzymatisch in vitro mittels PCR (Saiki et al., Science, 239:487-491 (1988)) oder anderer in vitro-Amplifikationsverfahren, wie Ligasekettenreaktion (LCR) (Wu und Wallace, Genomics, 4:560-569 (1989)), Strand-Displacement-Amplifikation (SDA) (Walker et al., PNAS USA, 89:392-396 (1992)), Self-Sustained Sequence Replication (3SR) (Fahy et al., PCR Methods Appl., 1:25-53 (1992)), amplifiziert werden. Die Methodik zur Präparation von Nukleinsäuren in einer zum Mutationsnachweis geeigneten Form ist dem Fachmann allgemein bekannt.
Der Nachweis von DNA-Sequenzmutationen, wie der prcd-Mutation im F04-Gen, kann mit einer Vielzahl von Methoden erfolgen, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Nachweis durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus auf Basis allelspezifischer Spaltung mit Restriktionsendonukleasen (Kan und Dozy, Lancet, 2(8096:910-912 (1978)), Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonukleotidsonden (Wallace et al., Nucl. Acids Res., 6:3543-3557 (1978)) einschließlich immobilisierter Oligonukleotide (Saiki et al., PNAS USA, 86:6230-6234 (1989)) oder Oligonukleotidarrays (Maskos und Southern, Nucl. Acids Res., 21:2269-2270 (1993)), allelspezifischer PCR (Newton et al., Nucl. Acids Res., 17:2503-2516 (1989)), Mismatch-Repair-Detektion (MRD) (Faham und Cox, Genome Res., 5:474-482 (1995)), denaturierender Gradientengelelektrophorese (DGGE) (Fisher und Lerman et al., PNAS USA, 80:1579-1583 (1983)), Detektion mittels Einzelstrangkonformationspolymorphismus (Orita et al., Genomics, 5:874-879 (1983)), RNAase-Spaltung an fehlgepaarten Basenpaaren (Myers et al., Science, 230:1242 (1985)), chemischer (Cotton et al., PNAS USA, 85:4397-4401 (1988)) oder enzymatischer (Youil et al., PNAS USA, 92:87-91 (1995)) Spaltung von Heteroduplex-DNA, Verfahren auf Basis allelspezifischer Primerverlängerung (Syvanen et al., Genomics 8:684-692 (1990)), Genetic Bit Analysis (GBA) (Nikiforov et al., Nucl. Acids Res., 22:4167-4175 (1994)), Oligonucleotide-Ligation-Assay (OLA) (Landegren et al., Science, 241:1077 (1988)), allelspezifischer Ligasekettenreaktion (LCR) (Barrany, PNAS USA, 88:189-193 (1991)), gap-LCR (Abravaya et al., Nucl. Acids Res., 23:675-682 (1995)) und radioaktiver DNA-Sequenzierung und/oder DNA-Fluoreszenzsequenzierung nach allgemein bekannten Verfahren.
Außerdem wurden mehrere neue Methoden beschrieben, die dynamische allelspezifische Hybridisierung (DASH), Microplate Array Diagonal Gel Electrophoresis (MADGE), Pyrosequenzierung, das TaqMan-System sowie verschiedene DNA-"Chip"-Methoden wie die Polymorphismuschips von Affymetrix beinhalten. Diese Verfahren erfordern eine Amplifizierung der genetischen Zielregion, üblicherweise mittels PCR. Andere neu entwickelte Verfahren, die nicht unbedingt PCR benötigen, basieren auf der Bildung kleiner Signalmoleküle durch invasive Spaltung gefolgt von Massenspektrometrie, oder auf immobilisierten Padlock-Sonden und Rolling-Circle-Amplifikation. Einige der auf diesem Gebiet bekannten Verfahren zum Nachweis spezifischer Einzelnukleotidpolymorphismen sind in US-Patent 6,720,141 beschrieben, und die Beschreibung dieser Verfahren bildet hier Bestandteil der vorliegenden Offenbarung.
Wie der Fachmann erkennt, kann die Mutationsanalyse auch an RNA-Proben über reverse Transkription zu cDNA erfolgen.
Erfindungsgemäß kann jede dieser Methoden oder eine Kombination davon zum Aufbau einer diagnostischen Vorrichtung und eines Verfahrens zum Screening von DNA- oder RNA-Proben auf die prcd-Genmutation von G zu A an einer Position entsprechend Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 des F04-Gens verwendet werden. Erfindungsgemäß wird daher ein nukleinsäurebasierter Test auf die prcd-Genmutation bereitgestellt, der das Bereitstellen einer Probe einer Hunde-DNA oder -RNA und das Überprüfen der DNA oder RNA auf das Vorliegen der prcd-Mutation umfasst. Proben von Hunde-DNA oder -RNA (oder genomische, transkribierte, revers transkribierte und/oder komplementäre Sequenzen des prcd-Gens) lassen sich ohne Weiteres erhalten. Durch die Identifizierung und Charakterisierung des F04-Gens, wie sie in der vorliegenden Erfindung gelehrt und offenbart wird, kann ein Durchschnittsfachmann die genomischen, transkribierten, revers transkribierten und/oder komplementären Sequenzen der prcd-Gensequenz in einer Probe leicht identifizieren und Unterschiede in ihnen leicht auffinden.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform Nukleinsäurefragmente zum Nachweis von Nukleinsäuren bereit, in denen die Mutation vorliegt. Im Allgemeinen basieren die Nachweisverfahren auf DNA-Hybridisierungsmethoden, wobei die Hybridisierung an DNA-Sequenzen unter solch stringenten Bedingungen erfolgt, dass sich eine Änderung in einem Nukleotid nachweisen lässt. Optimale Stringenz wird üblicherweise erhalten, indem man die Reaktionstemperatur und/oder die Salzkonzentration so einstellt, dass die Sonde nur an ihr spezifisches Ziel hybridisiert; für den Fachmann ist es jedoch offensichtlich, dass auch andere Verfahren zur Optimierung targetspezifischer Hybridisierung ohne Weiteres zur Verfügung stehen.
Allelspezifische Sonden können somit unter Bedingungen hybridisiert werden, die so ausreichend stringent sind, dass es einen signifikanten Unterschied in der Intensität der beiden Allele gibt. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen so stringent, dass eine im Wesentlichen binäre Reaktion erfolgt (d. h. die Sonde hybridisiert an das eine, aber nicht an das andere Allel).
Außerdem lassen sich Primer konstruieren, die so an eine Zielsequenz hybridisieren, dass bei der Amplifikation Produkte gebildet werden, die die Stelle der prcd-Mutation enthalten. Die Primer sollten so lang sein, dass sie sich für Reaktionen wie Polymerasekettenreaktion (PCR) oder als Sonden bei einer Ligasekettenreaktion (LCR) eignen. Im Allgemeinen werden Fragmente, die wenigstens zwölf Basen lang sind, als für Amplifikationsreaktionen geeignet angesehen. Die Amplifikationsprodukte können mit Restriktionsendonukleasen behandelt und durch denaturierende Gradientengelelektrophorese identifiziert werden, um zwischen den Amplifikationsprodukten von den beiden Allelen zu unterscheiden.
Geeigriete Fragmente, die sich zur Hybridisierung eignen, lassen sich anhand der Sequenz des hier gezeigten F04-Gens identifizieren, oder sie können durch Hybridisierung an die Nukleinsäuresequenz des F04-Gens (SEQ ID NO:1) oder der cDNA (SEQ ID NO:3) unter stringenten Bedingungen wie oben beschrieben identifiziert werden.
Mit Hilfe der hier beschriebenen Mittel und Verfahren lassen sich Hunde identifizieren, die hinsichtlich der Krankheit genetisch normal sind (G in beiden Allelen), Träger der prcd-Erkrankung sind (Transversion von G zu A in einem Allel) und die an progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration leiden oder dafür prädisponiert sind (Transversion von G zu A in beiden Allelen). Nach Identifizierung können solche kranken (oder prädisponierten) Hunde oder Trägerhunde aus dem Zuchtbestand eliminiert werden. Alternativ können Hunde, die an prcd leiden (oder die prädisponiert sind), oder Träger der prcd-Erkrankung mit genetisch normalen Hunden (ohne die Transversion von G zu A) gepaart werden, um sicherzustellen, dass der Wurf keine Hunde enthält, die an prcd leiden.
Die Erfindung kann für jede Hunderasse verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Akita, Amerikanischer Cockerspaniel, American Eskimos, Australian Cattle Dog, Australian Stumpy Tailed Cattle Dog, Baseniji, Berner Sennenhund, Border-Collie, Chesapeake Bay Retriever, Chinesischer Schopfhund, Englischer Cockerspaniel, Englischer Mastiff, English Springer Spaniel, Entlebucher Sennenhund, Finnischer Lapphund, Deutsch-Kurzhaar, Riesenschnauzer, Havanese, Labrador-Retriever, Lowchen, Zwergpudel, Zwergschnauzer, Nova Scotia Duck Tolling Retriever, Portugiesischer Wasserhund, Samoyed, Silky Terrier, Spitz, Standardpudel, Standard-Drahthaardackel, Tibet-Terrier und Toy-Pudel. Da gezeigt wurde, dass die gleiche prcd-Mutation im F04-Gen in so vielen verschiedenen Rassen vorliegt und die Ursache von PRA ist, scheint es, dass diese Mutation lange vor Differenzierung der Hundepopulation zu diesen verschiedenen Rassen erfolgt ist. Es ist daher zu erwarten, dass sich herausstellen wird, dass die gleiche Mutation noch in weiteren Hunderassen vorkommt, bei denen ihr Auftreten bis jetzt noch nicht bekannt ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die beschriebenen Identifizierungsverfahren in vitro durchgeführt. Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die beschriebenen Verfahren also an isolierten Proben durchgeführt und erfolgen daher nicht (unmittelbar) am menschlichen Körper.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt der Test der biologischen Probe durch Pyrosequenzierung. Der Vorteil der Pyrosequenzierung besteht darin, dass sie die Sequenzinformation rasch, üblicherweise innerhalb von Minuten, liefert. Pyrosequenzieren kann, bei einer Ausführungsform, ein oder mehrere der folgenden Schritte umfassen: Inkubation von Nukleinsäuretemplat (vorzugsweise Einzelstrang-DNA, gegebenenfalls PCR-amplifiziert) mit Enzymen für die Pyrosequenzierung, wie DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase, und Substraten für die Pyrosequenzierung, wie Adenosin-5'-phosphosulfat (APS) und Luciferin; sequenzielle Zugabe und katalytischer Einbau von dNTPs in einen DNA-Strang durch komplementäre Basenpaarung unter Freisetzung von Pyrophosphat (PPi), vorzugsweise in einer Menge, die zu der Menge an eingebautem Nukleotid äquimolar ist; Erfassen der freigesetzten Menge an PPi. Erfassen von PPi kann, bei einer Ausführungsform, durch Überführen von PPi in ATP (beispielsweise durch ATP-Sulfurylase in Gegenwart von APS) und anschließendes Erfassen der gebildeten Menge ATP erfolgen. Der Schritt zur Erfassung kann lichtvermittelt sein. Bei einer Ausführungsform kann beispielsweise ATP die Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin treiben – wodurch sichtbares Licht in Mengen erzeugt wird, die proportional zur Menge von ATP sind. Das Licht lässt sich als ein Peak in einer Kurve erfassen und sehen, wobei die Höhe des Peaks proportional zur Anzahl eingebauter Nukleotide ist. Die Pyrosequenzierungsreaktion kann einen Regenerationsschritt beinhalten, bei dem die Reaktionslösung vor Zugabe des nächsten dNTP regeneriert wird. Beispielsweise kann dieser Schritt mit dem Enzym Apyrase durchgeführt wurden, das ATP und nicht eingebaute dNTPs abbaut. Da bei der Pyrosequenzierungsreaktion dNTPs zugegeben werden, wird der komplementäre DNA-Strang aufgebaut, und die Nukleotidsequenz kann beispielsweise anhand von Lichtsignalpeaks bestimmt werden. Bei einer Ausführungsform der Pyrosequenzierungsreaktion wird dATP durch dATPαS ersetzt, das von Luciferase nicht erkannt wird.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele besser verständlich, die lediglich der Erläuterung dienen und in keiner Weise einschränkend sein sollen.
BEISPIEL 1
Wir haben eine retinaspezifische canine EST-Genbank von 16 Wochen alten Beagles gemacht. Ein Satz von fünf einzelnen überlappenden EST-Klonen bildete ein Contig, das in der bereits früher spezifizierten CFA9-Region (Sidjanin et al., 2003) kartierte und daher weiter untersucht wurde. Diese Sequenz enthielt das später definierte F04-Exon 8 (siehe unten, EST-Klon-Contig, 1085 bp).
Anhand der Sequenzinformation des obigen EST-Contigs und hypothetischer humaner Gene, die in der entsprechenden Region der humanen Genomsequenz lokalisiert sind, wie sie bei GenBank hinterlegt ist, wurden zwei Primer zur RT-PCR konstruiert:
Vorwärts: 5'-caccttggccatgctctggc-3' (am Ende von Exon 1) – SEQ ID NO:4
Rückwärts: 5-aatgcatataaataaagcacttggc-3' (in Exon 8) – SEQ ID NO:5
RT-PCT erfolgte mit einem 3,3 Wochen alten normalen Hund, was zu einem 707 bp-Produkt führte (Klon 9), das das Ende von Exon 1, Exon 2, Exon 3, Exon 4 und Exon 8 umspannte.
Vergleichende in silico-Analyse der caninen genomischen Sequenz aus unserem BAC-Contigs (siehe Beispiel 2 unten) mit der öffentlich zugänglichen humanen genomischen Sequenz und der Mäusegenomsequenz identifizierte eine hochkonservierte Region angrenzend an das 51 Ende von Klon 9, die potenzielle CRX-Bindungsstellen gefolgt von einem ATG-Translationsinitiationscodon unmittelbar stromaufwärts der Sequenz von Klon 9 beinhaltete, und sagte einen ORF voraus, der mit diesem ATG beginnt und mit einem Stoppcodon in Exon 3 endet. Diese ORF-Sequenz entsprach keinem der bei Genbank bekannten Gene, und ihre putative Translation hatte auch keine erkennbaren Domänen oder Sequenzähnlichkeiten mit irgendeinem anderen bei Genbank bekannten Protein gemein.
Weil der F04-Klon anhand unserer retinaspezifischen Genbank identifiziert wurde, zeigten diese Daten in Kombination an, dass der F04 entsprechende ORF ein neues, bislang unbekanntes retinaexprimiertes Gen darstellt. Die Anwesenheit von Bindungsstellen für den fotorezeptorspezifischen CRX-Transkriptionsfaktor und die hochkonservierte Struktur der Region 5' zum identifizierten Startcodon identifizierte das putative Exon 1 als das erste codierende Exon eines retinaexprimierten Gens. Auf Basis dieser Information wurde ein neues Primerpaar derart konstruiert, dass das potenzielle Startcodon beinhaltet und Exons 1-4 umfasst sein sollten.
Vorwärts: 5'-ccagtggcagcaggaacc-3' (5' von Exon 1) – SEQ ID NO:6
Rückwärts: 5'-ccaagccagggcatgagc-3' (3' von Exon 4) – SEQ ID NO:7
RT-PCR erfolgte sowohl an einem 10,4 Wochen alten normalen Tier und an einem 8,5 Wochen alten, an prcd leidenden Individuum und führte bei beiden Tieren zu einem 562 bp-Produkt (siehe unten, RT-PCR-Exon 1-4). Der einzige beobachtete Unterschied war ein Austausch von G zu A, der bei dem kranken Individuum beobachtet wurde und folglich als die prcd-Mutation identifiziert wurde.
Um die 5'- und 3'-Enden dieses Gens zu identifizieren, stellten wir eine 5'-RACE-Retina-Genbank von einem 10 Wochen alten normalen Hund und einem 8 Wochen alten kranken Hund her. Amplifikation der 5'-Enden erfolgte mit unterschiedlichen spezifischen Primern, die in Exon 1 (CCAAGGTGCTGAGTAGGAAGAGGGTGGTG – SEQ ID NO:8) oder in Exon 3 (AGTCCCTGGGGCCGAGCTCCGCCTGAC – SEQ ID NO:9) lokalisiert waren. Amplifikation der 3'-Enden erfolgte mit einem spezifischen Primer, der auf Exon 1 lokalisiert war (CACCACCCTCTTCCTACTCAGCACCTTGG – SEQ ID NO:10), was die genaue komplementäre Sequenz des spezifischen Primers ist, der für die 5'-RACE verwendet wurde. Halb verschachtelte ("semi-nested") PCR erfolgte mit einem Primer, der auf Exon 3 lokalisiert war (AGGGACTGGGATCAGCTGGCAGAGGCAG – SEQ ID NO:11), um die Spezifität des Produkts zu verifizieren.
Die Konsensussequenz dieser Experimente ist der Klon, den wir als die cDNA des F04-Gens ansehen (siehe SEQ ID NO:3), die in 2 gezeigt ist. Einzelheiten der cDNA-Sequenz finden sich oben.
Zur Validierung der mit 5'- und 3'-RACE vorhergesagten Konsensussequenz wurden zwei Primer verwendet, um die Konsensussequenz von betroffener und nicht betroffener Retina-cDNA zu amplifizieren.
5'-AGTGGCAGCAGGAACCTCAGG-3' – SEQ ID NO: 29
5'-GGATTATATTAGGGATGAATGAGAAG-3' – SEQ ID NO: 30
Da die Ergebnisse einer 5'-RACE und einer 3'-RACE unabhängige Ergebnisse sind, ist dieser Schritt notwendig, um nachzuweisen, dass dieses Transkript in der betroffenen und in der nicht betroffenen Retina auftritt. Die RT-PCR bestätigte das Auftreten eines solchen Transkripts. Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden die folgenden Sequenzen erhalten.
EST-Klon-Contig:
Die ursprünglich in der EST-Genbank enthaltenen Klone lieferten die folgende Konsensussequenz aus 5 Klonen; 1085 bp:
Klon 9:
Gebildet durch RT-PCR mit Primern aus Exon 8 und dem Ende von Exon 1 (707 bp):
RT-PCR-Exons 1-4
Diese Sequenz wurde anhand der RT-PCR zum Vergleich des ORF von kranken und nicht kranken Tieren gebildet (562 bp):
Die F04-Mutation ist gedruckt und bei normalen Hunden als G und bei an prcd leidenden Hunden als A gezeigt.
Spleißvarianten
Neben alternativem Splicing, das während des gesamten Klonierungsprozesses für das F04-Gen bei einigen der erhaltenen Sequenzen beobachtet wurde (oben beschrieben), wurden durch RT-PCR mit Primern in den Exons 2 und 3 und mit Primern, die sich in stromabwärts vorhergesagten Exons befanden, verschiedene Spleißvarianten identifiziert (siehe unten).
Klon 1:
RT-PCR erfolgte mit einem Primer aus Exon 3 (CAGTCGTGGGCAGCAGGTCGG – SEQ ID NO:15) und einem aus Exon 8 (AATGCATATAAATAAAGCACTTGGC – SEQ ID NO:16), was ein 316 bp-Produkt lieferte:
Primer aus Exon 2 (GCAGCAGGTCGGAGAGAGAC – SEQ ID NO:18) und Exon 5 (CTTCCCTCAGATGTGGAGTCAG – SEQ ID NO:19) wurden verwendet, um cDNA zu amplifizieren, die aus normaler und betroffener Retina erhalten wurde. Es wurden die drei nachfolgend gezeigten unterschiedlichen Produkte erhalten. Produkt Nummer 1:
Produkt Nummer 2:
Produkt Nummer 3:
RT-PCR erfolgte an betroffener und nicht betroffener Retina mit den folgenden Primern:
5'-TTAATCAGTCTGCACAAGGTCG-3' – SEQ ID NO: 31
5'-GGGTCATTGCAAGGATTATATTAGG-3' – SEQ ID NO: 32
Es wurden zwei Spleißvarianten beobachtet: Produkt Nummer 1:

Produkt Nummer 2:
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass es mehrere retinale Spleißvarianten von F04 gibt. Auf Basis dieser Spleißvarianten und einer vergleichenden Genomanalyse wurde die Genomorganisation von F04 charakterisiert. Alle Spleißvarianten, die für prcd relevant sind, beinhalten jedoch Exons 1-4, und das kürzeste und am häufigsten exprimierte dieser krankheitsrelevanten Transkripte ist die als SEQ ID NO:3 identifizierte cDNA.
BEISPIEL 2
Seit der Kartierung des prcd-Orts auf dem caninen Chromosom 9 (CFA9) haben wir das Intervall der prcd-Erkrankung mit höherer Auflösung kartiert, die identifizierte canine Genomregion, in der das prcd-Gen lokalisiert ist, eingegrenzt und alle Kandidatengene innerhalb dieser Region getestet. Zu Beginn stellten wir mit caninen BACs (Sidjanin, 2003) eine physikalische Karte der Region auf und identifizierten mehrere polymorphe Marker innerhalb dieser und benachbart zu dieser Region. Prüfung der Genotypen von an prcd leidenden Hunden mehrerer Rassen auf diese polymorphen Marker bewies, dass sich der Haplotyp, der mit der prcd-Mutation kosegregierte, in den Rassen über eine breite Region erstreckte, einschließlich des physikalisch kartierten Intervalls (Sidjanin et al., 2003). Ein Vergleich dieser Genotypen ergab jedoch, dass die rassespezifischen Haplotypen unter den Rassen innerhalb des ursprünglich veröffentlichten Bereichs variierten (Sidjanin et al., 2003), aber für eine Gruppe von Markern, die physikalisch innerhalb eines einzigen BAC-Klons lokalisiert waren (BAC #10M13, Li et al., 1999), der benachbart zu dem ursprünglich veröffentlichten Bereich lokalisiert war, für alle Rassen konsistent waren. Dieser BAC-Klon enthielt mehrere Gene. Für jedes dieser Gene wurden Einzelnukleotidpolymorphismen identifiziert, und es wurde ein einziger Haplotyp konstruiert, der das prcd-übertragende CFA9 von dem aller normalen getesteten Hunde (Tabelle 1) in allen Rassen unterschied, von denen bekannt war, dass sie von prcd betroffen sind.
Tabelle 1

Region des Kopplungsungleichgewichts (LD), die das canine prcd/F04-Gen auf dem caninen Chromosom 9 (CFA9) flankiert. Alle Gene in dieser Region sind in dem caninen BAC #10M13 lokalisiert. Das "betroffene Allel" für jeden Polymorphismus ist das, das man auf allen untersuchten, prcd-übertragenen Chromosomen von Hunden verschiedener Rassen findet; das "andere Allel" ist das, das beispieisweise in BAC #10M13 vorliegt. Wo die Information über den Polymorphismus fett gedruckt ist, gibt der Polymorphismusname die Position (Basennummer) in der genomischen F04-Sequenz (d. h. SEQ ID NO:1) an. Lokalisation des Polymorphismus gibt das Gen in der Genomsequenz an, in dem der Polymorphismus lokalisiert ist.

Polymorphismus Nr.	Polymorphismusname	Betroffenes Allel	Anderes Allel	Lokalisation des Polymorphismus
1		A	G	FLJ22341
2	p43	G	T	FLJ22341
3		C	T	FLJ22341
4		C	T	FLJ22341
5	b712	A	C	FLJ22341
6	b817	Deletion	CTG	FLJ22341
7	b1149	T	C	FLJ22341
8	p49	C	T	FLJ22341
9		T	G	FLJ22341
10	SINE	kein SINE	SINE	FLJ22341
11	p48	G	A	FLJ22341
12		A	G	FLJ22341
13		A	G	FLJ22341
14		T	C	FLJ22341
15		C	T	FLJ22341
16	p45	T	C	FLJ22341
17	p41	C	T	FLJ22341
18		C	T	FLJ22341
19	b682	C	G	FLJ22341
20	b937	A	G	FLJ22341
21	b1130	A	G	FLJ22341
22	b1275	G	Deletion	FLJ22341
23	b1351	G	A	FLJ22341
24	p38	T	C	CYGB
25		G	A	CYGB
26		A	G	CYGB
27	CYGB	T	C	CYGB
28	b3128	T	C	CYGB
29	b3133	T	C	CYGB
30	b3605	C	G	CYGB
31	b3769	C	G	CYGB
32	3820-23	Deletion	TGCC	CYGB
33	p40	A	G	CYGB
34		G	A	CYGB
35		A	G	CYGB
36	31F5	A	C	CYGB
37	31F4	A	G	CYGB
38		A	G
39	285	C	T	F04
40	851	C	G	F04
41	999	C	T	F04
42	1298	A	G	F04
43	1633-1635	CTT	Deletion	F04
44	1854	Deletion	C	F04
45	1912	C	G	F04
46	2413	A	G	F04
47	2590	T	C	F04
48	2601-2603	Deletion	TCC	F04
49	2607	A	G	F04
50	2660-2666	ATGAGAA	Deletion	F04
51	2710	C	T	F04
52	2741	G	A	F04
53	2769	C	T	F04
54	3119	G	A	F04
55	3804	C	T	F04
56	3971	G	C	F04
57	4459	G	A	F04
58	5244	G	A	F04
59	5698	G	T	F04
60	6254	A	C	F04
61	6318	Deletion	G	F04
62	6953	T	C	F04
63	7030	T	A	F04
64	7183	A	C	F04
65	7239	G	A	F04
66	7855	A	G	F04
67	8230	C	T	F04
68	8843	G	Deletion	F04
69	8977	G	A	F04
70	10230	A	G	F04
71	10268	A	C	F04
72	10855	A	T	F04
73	12175	A	G	F04
74	12613	A	G	F04
75	15033	C	T	F04
76	15347	G	A	F04
77	15359	A	T	F04
78	15445	T	C	F04
79	17200	T	C	F04
80	17407	Deletion	C	F04
81	17435-17437	GGG	Deletion	F04
82	17672	T	Deletion	F04
83	17892	A	G	F04
84	b1409	C	T	STHM
85	p2	A	C	STHM
86	STHM-Nael	A	G	STHM
87	STHM-Aval	C	T	STHM
88	Base 3526	C	T	STHM
89	Base 3655	G	A	STHM
90	10-299	G	A	STHM
91	10-597	G	G	STHM
92	b2263	Deletion	T	STHM
93	b2411	T	C	STHM
94	b2425	Deletion	C	STHM
95	b2748	G	Deletion	STHM
96	aus RT-PCR	A	G	STHM

Von jedem dieser Gene wurden die Exons sequenziert und untersucht, und nur in einem einzigen Gen wurde eine mit der Krankheit assoziierte Sequenzänderung (d. h. eine Mutation) gefunden. Dieses Gen, das hier als F04 bezeichnet wird, ist in dem in US-Patent 5,804,388 beschriebenen Intervall lokalisiert. Einzelheiten der caninen cDNA-Sequenz und der genomischen DNA-Sequenz für F04 finden sich oben. Die Mutation bei Nukleotid 1298 von SEQ ID NO:1 stellt einen Übergang von G nach A von der normalen zur betroffenen Sequenz dar. Diese Sequenzänderung wird hier als die "prcd-Mutation" im F04-Gen bezeichnet und ist in der obigen Tabelle als Polymorphismus Nr. 42 gezeigt.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt einen PCR-basierten Test mittels Restriktionsverdau, der entwickelt wurde, um die Sequenzänderung im F04-Gen zu identifizieren. Es wurden die folgenden Primer verwendet:
Primer 1: ccagtggcagcaggaacc – SEQ ID NO:27
Primer 2: ccgacctgctgcccacgactg – SEQ ID NO:28
PCR erfolgt unter Standardbedingungen (Annealingtemperatur 58 °C, 1,5 MgCl₂) in 25 μl, 35 Zyklen. Das Amplifikationsprodukt hat eine Größe von 512 bp (entsprechend bp 1182 bis 1693 in SEQ ID NO:1. Das Restriktionsenzym RsaI verdaut das Amplifikationsprodukt mit dem A- Allel, aber nicht dem G-Allel. Umgekehrt verdaut ApaLI das G-Allel, aber nicht das A-Allel. Beide Verdaus erfolgten zwei Stunden lang bei 37 °C.
Der Restriktionsverdau liefert dementsprechend die in Tabelle 2 gezeigten Diagnoseergebnisse: Tabelle 2

ENZYM (Restriktionsstelle) ALLEL FRAGMENTGRÖSSE(N) (bp)

RsaI (GT|AC) G 512

A 116; 396

ApaLI (G|TGCAC) G 115; 397

A 512
Es wurde eine große Population von Hunden untersucht, die an prcd litten. Wir haben mehr als 100 kranke Tiere aus 13 verschiedenen Rassen oder Rassearten untersucht. Diese beinhalten: 36 Australien Cattle Dogs, 2 Chinesische Schopfhunde, 5 Englische Cockerspaniels, 5 Finnische Lapphunde, 48 Labrador-Retriever, 45 Zwerg- oder Toy-Pudel, 1 Nova Scotia Duck Tolling Retriever, 3 Portugiesische Wasserhunde, 1 Silky Terrier, 25 American Eskimos und 14 Entlebucher Sennenhunde.
Ein Beispiel für die Identifizierung des G-Allels (normal) und des A-Allels (betroffenes Allel) nach RsaI-Verdau ist in 3A und nach Verdau mit ApaLI in 3B gezeigt. Beim RsaI-Verdau (3A) zeigt ein normaler Hund (GG) ein Produkt mit 512 bp, ein kranker Hund (AA) zeigt Produkte mit 396 bp und 116 bp, und ein Trägerhund (AG) zeigt Produkte mit 512 bp, 396 bp und 116 bp. Beim ApaLI-Verdau (3B) zeigt ein normaler Hund (GG) Produkte mit 397 bp und 115 bp, ein kranker Hund (AA) zeigt ein Produkt mit 512 bp, und ein Trägerhund (AG) zeigt Produkte mit 512 bp, 397 bp und 115 bp. Dieses Verfahren kann daher verwendet werden, um normale Hunde (d. h. Hunde, bei denen beide Allele des F04-Gens G als das Nukleotid in einer Position haben, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht), Trägerhunde (d. h. Hunde, bei denen ein Allel G und das andere Allel A als das Nukleotid in einer Position hat, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht) und kranke oder prädisponierte Hunde (d. h. Hunde, bei denen beide Allele des F04-Gens A als das Nukleotid in einer Position haben, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht) zu identifizieren.
BEISPIEL 4
Um den Ausschluss des betroffenen Allels von der allgemeinen Hundepopulation zu bestätigen, testeten wir 1000 Tiere aus 67 Rassen, von denen nicht bekannt war, dass sie die prcd-Form von PRA haben, um die Abwesenheit des "A"-Allels nachzuweisen. Diese Hunde wurden mittels Pyrosequencing^TM (Biotage, Charlottesville, VA; <http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx>) wie folgt getestet. Die Methode basiert auf der Amplifikation der Zielsequenz mit einem unmarkierten Vorwärtsprimer und einem biotinmarkierten (5'-Bio)-Rückwärtsprimer, die verwendet werden, um ein einzelsträngiges DNA-Produkt zu isolieren. Ein Sequenzierprimer wird verwendet, um eine anschließende nukleotidspezifische Primerverlängerung zu starten, und die An- oder Abwesenheit eines Nukleotids wird in einer von der Allelfrequenz abhängigen Weise auf Basis einer Luciferasereaktion aufgezeichnet.
Vorwärtsprimer: 5'TTGTGAGAGCCGGCAGG3' – SEQ ID NO:23
Rückwärtsprimer: 5'-Bio/ATGGCCAAGGTGCTGAGTAG3' – SEQ ID NO:24
Sequenzierprimer: 5'GGGGCAGCTGAGCCA3' – SEQ ID NO:25
Produkt: 113 bp (Primersequenz ist in Großbuchstaben gezeigt, der G/A-Polymorphismus ist fett gedruckt, und Bio gibt den Biotinmarker an):
TTGTGAGAGCCGGCAGGggccattttggcctttctcctgcagactctgtccgggaggggatGGGGCAGCTGAGCC Atgtg/acaccaccctcttcCTACTCAGCACCTTGGCCAT – Bio – SEQ ID NO:26
4 stellt den Testaufbau für die Verfahren dieses Beispiels dar. Auf Basis der Testsequenz wird während der Primerverlängerung eine Reihe von Nukleotiden jeweils eins nach dem anderen injiziert (die Sequenz ist unter jeder Tafel gezeigt), und die resultierende Lichtreaktion wird registriert (für jedes Nukleotid angezeigt durch den Balken, direkt proportional zur Menge vorhandener Allele). Nukleotide 1 (C) und 7 (G) der Sequenz sind negative Kontrollen und sollten überhaupt keine Lichtreaktion liefern. Positionen 2, 3, 4, 8 und 9 sind positive Kontrollen und reagieren in allen Proben basierend auf der getesteten Sequenz gleich. Die fragliche Mutation entspricht den Nukleotiden 5 und 6. Bei normalen Tieren liegt nur das G-Allel vor und führt zu einer Reaktion der gleichen Stärke wie die positiven Kontrollen. Bei kranken Individuen gilt das Gleiche für das A-Allel, während Träger beide Allele in einem Verhältnis von 50/50 haben und daher bei jeder Position die halbe Intensität liefern. In allen Fällen waren die durch Pyrosequencing^TM getesteten Tiere "GG", d. h. sie hatten in beiden Allelen des F04-Gens G an einer Position, die Position 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht.
Der Fachmann erkennt, dass sich an den verschiedenen oben beschriebenen Ausführungsformen übliche Modifikationen vornehmen lassen. Solche Modifikationen sollen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung liegen.
Literaturstellen

1. Aguirre, G. D.: Inherited Retinal Degenerations in the Dog Trans. Amer. Acad. Ophth. and Otol. 81:667, 1976.
2. Aguirre, G. D, Acland, G. M. Variation in Retinal Degeneration Phenotype Inherited at the prcd Locus. Exp. Eye Res. 46:663, 1988.
3. Acland, G., Fletcher, R. T., Gentleman, S., Chader, G. und Aguirre, G: Non-allelism of Three Genes (rcd1, rcd2 and erd) for Early-Onset Hereditary Retinal Degeneration. Exp. Eye Res. 49:983, 1989.
4. Aguirre, G. und Acland, G.: Inherited Retinal Degeneration in the Labrador Retriever Dog. A New Animal Model of RP? Invest. Ophthalmol. Vis Sci. (Supp). 32(4), 1991.
5. Acland, G., Ray, K., Mellersh, C., Gu, W., Langston, A., Rine, J., Ostrander, E., und Aguirre, G. Linkage analysis and comparative mapping of canine progressive rod-cone degeneration (prcd) establishes potential locus homology with retinitis pigmentosa (RP17) in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:3048-3053, 1998.
6. Kijas, J. W., Cideciyan, A. V., Aleman, T. S., Pianta, M. J., Pearce-Kelling, S. E., Miller, B.
J., Jacobson, S. G., Aguirre, G. D. und Acland, G. M. Naturally-occurring rhodopsin mutation in the dog causes retinal dysfunction and degeneration mimicking human dominant retinitis pigmentosa. Proc. Natl. Acad. Sciences USA 99:6328-6333, 2002.
7. Li, R., Mignot, E., Faraco, J., Kadotani, H., Cantanese, J., Zhao, B., Lin, X., Hinton, L., Ostrander, E. A., Patterson, D. F., et al. 1999. Construction and characterization of an eightfold redundant dog genomic bacterial artificial chromosome library. Genomics 58:9-17.
8. Pearce-Kelling, S. E., Nickle, A., Kijas, J. W., Sidjanin, D. J., Miller, B. J., Aguirre, G. D. und Acland, G. M., 2002.
9. Sidjanin, D. J., Miller, B., Kijas, J. K., McElwee, J., Pillardy, J., Malek, J., Pai, G., Feldblyum, T., Fraser, C., Acland, G. und Aguirre, G. Radiation Hybrid Map, Physical Map and Low-Pass Genomic Sequence of the Canine prcd Region on CFA9, and Comparative Mapping with the Syntenic Region on Human Chromosome 17. Genomics 81:138-148, 2003.
10. Zhang, Q., Acland, G. M., Wu, W. X., Johnson, J. L. Pearce-Kelling, S., Tulloch, B., Vervoort, R., Wright, A. F., Aguirre, G. D. Different RPGR exon ORF15 Mutations in Canids Provide Insights into Photoreceptor Cell Degeneration. Hum. Molec. Genet. 11:993-1003, 2002.
11. Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: An accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Human Mutation, 2002; 19(5).
12. Ronagi, M., Elahi, E. Discovery of Single Nucleotide Polymorphisms and mutations by Pyrosequencing. Corp Funct Gemon. 2002; 3:51-56.
13. Shendure, J., Mitra, R. D., Varma, C., Church, G. M. Advanced sequencing technologies: methods and goals. Nature Reviews Genetics. May 2004; 5(5), 335-344.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Bestimmen, ob ein Hund Träger progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration ist oder dafür prädisponiert ist, umfassend: Testen einer biologischen Probe, die von dem Hund erhaltene Nukleinsäuren umfasst, auf eine Transversion von G zu A im F04-Gen an einer Position, die Nukleotidposition 1298 von SEQ ID NO:1 entspricht, wobei die Transversion von G zu A in einem Allel einen Träger progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration anzeigt, die Transversion von G zu A in beiden Allelen einen Hund anzeigt, der an progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration leidet oder dafür prädisponiert ist, und das Fehlen der Transversion von G zu A einen Hund anzeigt, der weder Träger progressiver Stäbchen-Zapfen-Degeneration ist noch dafür prädisponiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Test durchgeführt wird, indem man die Nukleinsäuren der biologischen Probe amplifiziert, die amplifizierten Nukleinsäuren mit ein oder mehr Restriktionsendonukleasen verdaut, und die Transversion von G zu A in den amplifizierten und verdauten Nukleinsäuren identifiziert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Restriktionsendonuklease RsaI ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Restriktionsendonuklease ApaLI ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Amplifikation mit den Primern von SEQ ID NO:24 und SEQ ID NO:25 durchgeführt wird.
Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei der Test mittels Pyrosequenzierung durchgeführt wurde.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Pyrosequenzierung mit den Primern von SEQ ID NO:20, 21 und 22 durchgeführt wurde.
Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die Nukleinsäure DNA ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1-8, wobei die Nukleinsäure mRNA ist.
Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei die biologische Probe ein Gewebe ist, das genomische DNA oder mRNA enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut, Haar, Schleimhautabstrich, Samenflüssigkeit, Gewebebiopsie und Speichel.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die biologische Probe Blut ist.
Verfahren nach irgendeinem vorhergehenden Anspruch, wobei der Hund ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Akita, Amerikanischer Cocker Spaniel, American Eskimo, Australian Cattle Dog, Australian Stumpy Tail Cattle Dog, Basenji, Berner Sennenhund, Border-Collie, Chesapeake Bay Retriever, Chinesischer Schopfhund, Englischer Cocker Spaniel, Englischer Mastiff, English Springer Spaniel, Entlebucher Sennenhund, Finnischer Lapphund, Deutsch-Kurzhaar, Riesenschnauzer, Havanese, Labrador-Retriever, Lowchen, Zwergpudel, Zwergschnauzer, Nova Scotia Duck Tolling Retriever, Portugiesischer Wasserhund, Samoyede, Silky Terrier, Spitz, Standardpudel, Standard-Drahthaardackel, Tibet-Terrier und Toy-Pudel.
Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine DNA-Sequenz von SEQ ID NO:1, eine SEQ ID NO:1 entsprechende RNA-Sequenz, eine zu SEQ ID NO:1 komplementäre DNA-Sequenz oder eine zu SEQ ID NO:1 komplementäre RNA-Sequenz.
Isoliertes Polynukleotid, umfassend eine DNA-Sequenz von SEQ ID NO:3, eine SEQ ID NO:3 entsprechende RNA-Sequenz, eine zu SEQ ID NO:3 komplementäre DNA-Sequenz oder eine zu SEQ ID NO:3 komplementäre RNA-Sequenz.