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DE602005004026T2 - Einen transkriptionsfaktor kodierendes humanes prädispositionsgen für autismus sowie dessen verwendungen - Google Patents

Einen transkriptionsfaktor kodierendes humanes prädispositionsgen für autismus sowie dessen verwendungen Download PDF

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DE602005004026T2
DE602005004026T2 DE602005004026T DE602005004026T DE602005004026T2 DE 602005004026 T2 DE602005004026 T2 DE 602005004026T2 DE 602005004026 T DE602005004026 T DE 602005004026T DE 602005004026 T DE602005004026 T DE 602005004026T DE 602005004026 T2 DE602005004026 T2 DE 602005004026T2
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autism
pitx1
gene
disorder
polypeptide
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Anne Philippi
Francis Rousseau
Peter Brooks
Jörg Hager
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IntegraGen SA
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Description

  • FACHGEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Fachgebiete Genetik und Medizin.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Autismus ist eine neuropsychiatrische Entwicklungsstörung, die durch Beeinträchtigungen bei der wechselseitigen sozialen Interaktion und verbalen und nonverbalen Kommunikation, begrenzte und stereotype Interessen- und Aktivitätsmuster und das Vorliegen von Abnormitäten in der Entwicklung im Alter bis zu 3 Jahren gekennzeichnet ist (Bailey et al., 1996). In seiner bahnbrechenden Beschreibung des kindlichen Autismus bezog Kanner (1943) die folgenden Symptome ein: Sprachstörungen, mangelnder Blickkontakt, mangelnde soziale Interaktion, repetitives Verhalten und starres Festhalten an Ritualen. Er stellte fest, dass in den meisten Fällen das kindliche Verhalten von frühester Kindheit an abnormal war. Aufgrund dessen vermutete er das Vorliegen eines angeborenen, vermutlich genetischen Defekts. Ein Jahr später beschrieb Hans Asperger in Deutschland ähnliche Patienten und nannte den Zustand „autistische Psychopathie".
  • Autismus wird mit Hilfe von Verhaltenskriterien definiert, weil bis heute keine spezifischen biologischen Marker für eine Diagnose der Krankheit bekannt sind. Das klinische Bild von Autismus variiert hinsichtlich der Schwere und wird von vielen Faktoren, einschließlich Erziehung, Fähigkeiten und Temperament, modifiziert. Außerdem ändert sich das klinische Bild im Verlauf der Entwicklung im Individuum. Zusätzlich ist Autismus häufig mit weiteren Störungen wie Aufmerksamkeitsdefizitstörug, Koordinationsmotorikstörungen und psychiatrischen Symptomen wie Angst und Depression assoziiert. Es gibt einige Anzeichen, dass Autismus ebenfalls epileptische, metabolische und immunologische Störungen umfassen kann. Im Einklang mit der klinischen Anerkennung der Variabilität besteht nun eine allgemeine Übereinkunft, dass es ein Spektrum autistischer Störungen gibt, das Individuen aller Intelligenzniveaus und Sprachfähigkeitsstufen umfasst und alle Intensitätsgrade abdeckt.
  • Ein Element des autistischen Spektrums, das aber als eine spezielle Untergruppe betrachtet wird, ist das Asperger Syndrom (AS). Das AS unterscheidet sich von der autistischen Störung durch Ein Element des autistischen Spektrums, das aber als eine spezielle Untergruppe betrachtet wird, ist das Asperger Syndrom (AS). Das AS unterscheidet sich von der autistischen Störung durch die fehlende klinisch signifikante Verzögerung der Sprachentwicklung bei Vorhandensein der beeinträchtigten sozialen Interaktion und der beschränkten repetitiven Verhaltens-, Interessen- und Aktivitätsmuster, die das Spektrum autistischer Störungen (ASDs) kennzeichnen.
  • ASDs sind Formen von tiefgreifenden Entwicklungsstörungen (PPD). PPD, „nicht anders bezeichnet" (PPD-NOS) wird zur Kategorisierung von Kindern verwendet, welche die strengen Kriterien für Autismus nicht erfüllen, aber ihnen nahe kommen, entweder weil sie einen atypischen Autismus zeigen oder weil sie die diagnostischen Kriterien in zwei oder drei Schlüsselbereichen nahezu erfüllen.
  • Um die Diagnose von Autismus zu standardisieren, sind von der Weltgesundheitsorganisation (International Classification of Diseases, 10th Revision (ICD-10), 1992) und der American Psychiatric Association (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition (DSM-IV), 1994) Diagnosekriterien definiert worden. Ein Autismus-Diagnose-Interview (ADI) ist entwickelt worden (Le Couteur et al., 1989; Lord et al., 1994). Das ADI ist das einzige Diagnosewerkzeug, das für eine Diagnose von ASD zur Verfügung steht und welches standardisiert und streng getestet worden ist und weltweit anerkannt ist. Das ADI ist ein bewertetes, halb-strukturiertes Interview der Eltern, das auf ICD-10 und DSM-IV Kriterien für die Diagnose von Autismus beruht. Es konzentriert sich auf das Verhalten in den drei Hauptbereichen: Qualitäten der wechselseitigen sozialen Interaktion; Kommunikation und Sprache; und beschränkte und repetitive, stereotype Interessen- und Verhaltensmuster. Unter Verwendung dieser Kriterien wird Autismus nicht länger als eine seltene Störung betrachtet. Es sind höhere Raten von 10–12 Fällen pro 10.000 Individuen in jüngeren Studien (Gillberg und Wing, 1999) genannt worden verglichen mit der früher berichteten Prävalenzrate von 4–5 Patienten pro 10.000 Individuen basierend auf den Kriterien von Kanner (Folstein und Rosen-Sheidly, 2001). Schätzungen für die Prävalenzrate des gesamten Spektrums autistischer Störungen liegen um des 1,5 bis 2,5-fache höher. Es gibt übereinstimmende Berichte eines vierfach höheren Vorkommens in männlichen verglichen mit weiblichen Individuen. Eine geistige Zurückgebliebenheit liegt in zwischen 25% und 40% der Fälle mit ASD vor (Baird et al., 2000; Chakrabarti und Fombonne, 2001). Zusätzliche medizinische Zustände unter Einbeziehung des Gehirns werden bei etwa 10% der Bevölkerung beobachtet (Gillberg und Coleman, 2000).
  • Die Mechanismen, die der Zunahme der berichteten Autismusfälle zugrunde liegen, sind nicht bekannt. Es wird sehr diskutiert, ob dieser Unterschied eine Zunahme der Prävalenz von Autismus, eine graduelle Änderung bei den Diagnosekriterien, eine Anerkennung einer größeren Variabilität der Krankheitsausprägung oder eine erhöhte Aufmerksamkeit für die Störung widerspiegelt. Zusätzlich besteht eine weitverbreitete öffentliche Auffassung, dass die offensichtliche Zunahme primär auf Umweltfaktoren zurückzuführen sei (Nelson, 1991; Rodier und Hyman, 1998). Allerdings erscheint es wahrscheinlich, dass der größte Teil der erhöhten Prävalenz mit der Erweiterung der Diagnosekriterien zusammen mit einer breiteren Anwendung dieser Kriterien erklärt werden kann.
  • Obwohl es wirksame Behandlungen für eine Besserung der Krankheit gibt, gibt es keine Heilung und der Nutzen der Behandlung bleibt bescheiden. Vielversprechende Ergebnisse sind für mehrere Behandlungspläne erhalten worden, die verschiedene Verhaltens- und Entwicklungsstrategien nutzen. Unter den vielversprechendsten Behandlungen sind solche, die auf der Applied Behavior Analysis (ABA) basieren. Mehrere Medikationen schienen verschiedene mit Autismus assoziierte Symptome zu verbessern, wobei dadurch die Fähigkeit des Individuums erhöht wurde, von Erziehungs- und Verhaltensinterventionen zu profitieren. Die am intensivsten untersuchten Agenzien sind die Dopamin-Antagonisten. Mehrere Studien lassen einen Nutzen verschiedener selektiver Serotonin-Wiederaufnahmehemmer vermuten.
  • Es sind drei Zwillingsstudien durchgeführt worden, um die Erblichkeit von Autismus zu beurteilen (Folstein und Rutter, 1977; Bailey et al., 1995; Steffenburg et al., 1989). Es wurden alle Zwillinge, die in einer geographisch definierten Population lebten, ausfindig gemacht. In den kombinierten Daten wurden 36 monozygotische (MZ) und 30 dizygotische (DZ) Zwillinge untersucht. Die durchschnittlich MZ-Konkordanzrate liegt bei 70% im Vergleich mit einer DZ-Rate von 0%. Eine Erblichkeit von mehr als 90% wurde aus dem MZ zu DZ-Konkordanz-Verhältnis berechnet und das Wiederauftretungsrisiko bei den Nachkommen wurde auf etwa 2%–4% geschätzt (Jorde et al., 1991; Szatmari et al., 1998). Untersuchungen bei nichtautistischen Verwandten haben eindeutig gezeigt, dass mehrere Kennzeichen der ASDs häufiger bei den Eltern autistischer Kinder als bei Eltern von Kontrollen, einschließlich sozialer Zurückhaltung, Kommunikationsschwierigkeiten, Präferenz des Gewohnten und Schwierigkeiten mit Veränderungen, festgestellt werden (Folstein und Rutter, 1977). Eine verzögerte Sprachentwicklung und Leseschwierigkeiten sind bei Familienmitglieder von Individuen mit Autismus ebenfalls verbreiteter wie auch wiederkehrende Depression, Angstzustände, erhöhtes Thrombocyten-Serotonin und vergrößerter Kopfumfang (Folstein und Rosen-Sheidley, 2001).
  • Die Autismus-Inzidenz fällt signifikant mit abnehmendem Verwandtschaftsgrad mit einem affiziertem Individuum, was darauf hinweist, dass ein Einzelgen-Modell für die meisten Fälle von Autismus nur unwahrscheinlich in Betracht kommt (Jorde et al., 1990). Eine angeführte Segregationsanalyse stimmte am weitesten mit einem polygenen Vererbungsmodus überein (Jorde et al., 1991). Das einfachste genetische Modell ist ein Modell, in dem mehrere Gene miteinander interagieren, um den Autismusphänotyp zu bilden (Folstein und Rosen-Sheidley, 2001).
  • Ein wichtiger indirekter Anhaltspunkt weist auf eine mögliche Rolle der Autoimmunität bei Autismus. In einer Studie wurden mehr Familienmitglieder mit Autoimmunkrankheiten in Familien mit einem autistischen Probanden verglichen mit Kontrollprobanden festgestellt (Comi et al., 1999). Einige Studien berichteten, dass Haplotypen am Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Locus, die bei manchen Kindern mit Autismus oder deren Müttern vorhanden sind, ihre autistischen Kinder für eine Autoimmunität prädisponieren könnten (Burger und Warren, 1998). In zwei Studien wurden Autoantikörper gegen bestimmte Gehirngewebe und Proteine, einschließlich Myelin-basisches Protein, Neurofilamentproteine und Gefäßepithel, häufiger in autistischen Kindern verglichen mit Kontrollen gefunden (Singh et al., 1993; Conolly et al., 1999; Weizman et al., 1982).
  • Obwohl die meisten Autismusfälle mit den vorgeschlagenen Oligogen- und Epistasie-Mechanismen übereinstimmen, sind eine Minderheit in Verbindung mit chromosomalen Abnormitäten und mit Störungen beobachtet worden, die spezifische Ätiologien aufweisen. Smalley (1997) erklärte, dass ungefähr 15 bis 37% der Autismusfälle einen komorbiden medizinischen Zustand aufweisen, einschließlich 5 bis 14% mit einer bekannten genetischen Störung oder Chromosomen-Anomalie. Chromosomalen-Anomalien sind von fast allen humanen Chromosomen berichtet worden. Diese umfassen autosomale Aneuploidien, Geschlechtschromosom-Anomalien, Deletionen, Duplikationen, Translokationen, Ringchromosomen, Inversionen und Marker-Chromosomen (Gillberg, 1998). Am häufigsten sind Abnormitäten der Prader Willi/Angelman Syndrom Region auf Chromosom 15. Eine Verknüpfung von Autismus und einem Mendelschen Zustand oder genetischem Syndrom umfasste unbehandelte Phenylketonurie, fragiles X-Syndrom, tuberöse Sklerose und Neurofibromatose. Kürzlich identifizierten Carney et al. (2003) Mutationen in dem MECP2 (Methyl-CpG-Bindeprotein 2) Gen in zwei weiblichen Individuen mit Autismus, die keine Manifestationen des Rett-Syndroms zeigten, das in 80% der Fälle durch Mutationen in dem MECP2-Gen verursacht ist.
  • Verschiedene Gruppen machen auf Autismus oder umfassendere Phänotypen von ASDs bezogene Genom-Scans. Dieser Ansatz scheint sehr vielversprechend zu sein, weil er sowohl systematisch als auch modellunabhängig ist. Zusätzlich hat er sich als erfolgreich erwiesen. Folglich sind positive Kopplungsresultate selbst mit der Analyse vergleichsweise kleiner Studiengruppen erhalten worden. Und noch wichtiger, einige Erkenntnisse sind bereits repliziert worden. Das am besten übereinstimmende Resultat wurde für Chromosom 7q erhalten, aber es liegt ebenfalls eine beträchtliche Überschneidung auf Chromosom 2q und 16p vor (Folstein und Rosen-Sheidley, 2001). Beträchtliche Fortschritte bei der Identifizierung chromosomaler Regionen sind ebenfalls auf Chromosom 15 und dem X-Chromosom gemacht worden. Mutationen in zwei X-Chromosom-gekoppelten Genen, die die Neuroligine NLGN3 und NLGN4 codieren, sind in Geschwistern mit Störungen des autistischen Spektrums identifiziert worden (Jamain et al., 2003). Mehrere Beweislinien stützen die Tatsache, dass Mutationen in Neuroliginen an einer autistischen Störung involviert sind. Erstens verursachen die genannten Mutationen starke Veränderungen der vorhergesagten Proteinstruktur. Zweitens ist von Deletionen am Xp22.3, die NLGN4 umfassen, in mehreren autistischen Kindern berichtet worden. Drittens erschien eine Mutation in NLGN4 de novo bei einer Mutter eines affizierten Individuums.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung legt nun die Identifizierung eines humanen Autismus-Anfälligkeitsgens offen, das für die Diagnose, Prävention und Behandlung von Autismus, Störungen des autistischen Spektrums und mit Autismus assoziierten Störungen wie auch für die Durchmusterung therapeutisch aktiver Arzneimittel verwendet werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung legt insbesondere die Identifizierung eines humanen Autismus-Anfälligkeitsgens offen, das für die Diagnose, Prävention und Behandlung von Autismus und verwandten Störungen ebenso wie für die Durchmusterung therapeutisch aktiver Arzneimittel verwendet werden kann. Spezifischer legt die Erfindung bestimmte Allele des Hypophysen-Homöobox-Transkriptionsfaktor 1-(PITX1)-Gens offen, das mit einer Anfälligkeit für Autismus verbunden ist und neuartige Ziele für eine therapeutische Intervention darstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft spezielle Mutationen in dem PITX1-Gen und -Expressionsprodukten wie auch diagnostische Werkzeuge und Kits, die auf diesen Mutationen basieren. Die Erfindung kann bei der Diagnose einer Veranlagung zu, Nachweis, Prävention und/oder Behandlung des Asperger Syndroms, der tiefgreifenden Entwicklungsstörung, disintegrativen Störung im Kindesalter, geistigen Zurückgebliebenheit, von Angst, Depression, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörungen, Sprachentwicklungsverzögerung oder vor Sprachstörungen, Epilepsie, Stoffwechselstörung, Immunstörung, bipolaren Erkrankung und von weiteren psychiatrischen und neurologischen Erkrankungen einschließlich Schizophrenie genutzt werden.
  • Die Erfindung kann bei der Diagnose einer Veranlagung zu oder eines Schutzes vor, Nachweis, Prävention und/oder Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung genutzt werden, wobei das Verfahren den Nachweis in einer Probe von dem Patienten des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Gen oder -Polypeptid umfasst, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf das Vorliegen von oder auf die Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist. Das Vorhandensein besagter Veränderung kann ebenfalls auf einen Schutz vor Autismus hinweisen.
  • Ein spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegen von oder der Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten umfasst, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf das Vorliegen von oder auf die Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist. Eine Veränderung, die auf das Vorliegen von oder auf die Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist, ist eine Veränderung mit einer bevorzugten Übertragung auf Autisten. Alternativ ist eine Veränderung, die auf das Vorliegen von oder auf die Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist, eine Veränderung mit einer höheren Häufigkeit bei Autisten verglichen mit nicht affizierten Individuen.
  • Ein zusätzlicher spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zum Nachweis des Schutzes vor Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten umfasst, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf den Schutz vor Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist. Eine Veränderung, die auf den Schutz vor Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist, ist eine Veränderung mit einer bevorzugten Nichtübertragung auf Autisten. Alternativ ist eine Veränderung, die auf den Schutz vor Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist, eine Veränderung mit einer geringeren Häufigkeit bei Autisten verglichen mit nicht affizierten Individuen.
  • Ein anderer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Bewertung des Ansprechen eines Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandensein einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten umfasst, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf ein bestimmtes Ansprechen auf besagte Behandlung hinweist.
  • Ein weiterer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Bewertung der Nebenwirkung in einem Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten umfasst, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf eine Nebenwirkung für besagte Behandlung hinweist.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Prävention von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, umfassend den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf eine Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist; und Verabreichen einer prophylaktischen Behandlung gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung.
  • In einer bevorzugten Anwendungsform ist besagte Veränderung ein oder mehrere SNP(s) oder ein Haplotyp von SNP(s), die mit Autismus assoziiert sind. Bevorzugt sind besagte SNP(s) aus solchen ausgewählt, die in Tabellen 1a und 1b aufgelistet sind, im Speziellen solche, die in Tabellen 3 bis 8 aufgelistet sind. Im Speziellen kann der mit Autismus assoziierte SNP aus der aus SNP6 und SNP33 bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Im Speziellen umfasst besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp mehrere SNPs, die aus den in Tabelle 1a und 1b aufgelisteten SNPs ausgewählt sind, oder besteht aus diesen. Bevorzugt sind besagte SNPs aus der Gruppe ausgewählt, die aus den in Tabellen 3 bis 8 aufgelisteten bestehen. In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP6, SNP33, SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33. In einer speziellen Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21 und SNP22. Noch spezieller ist besagter Haplotyp aus den Haplotypen ausgewählt, die in den Tabellen 4, 6, 7 und 8 aufgelistet sind. Gegebenenfalls können die in der vorliegenden Erfindung aufgelisteten Haplotypen einen oder mehrere zusätzliche SNPs umfassen. Bevorzugter kann besagter mit Autismus assoziierter SNP SNP6 oder SNP33 sein. In einer am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP24, SNP25 beziehungsweise SNP40, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer anderen am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP23, SNP25 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer weiteren am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP25, SNP27, SPN29, SPN31 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 2-1-1-1-1.
  • Vorzugsweise wird die Veränderung in dem PIXT1-Genlocus mittels Durchführen eines Hybridisierungsassays, eines Sequenzierungsassays, eines Mikrosequenzierungsassays, eines Oligonuldeotid-Ligationsassays, eines Konfirmation-basierten Assays, einer Schmelzkurvenanalyse, eines denaturierenden Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(DHPLC)-Assays oder eines Allel-spezifischen Amplifikationsassays bestimmt.
  • Ein spezieller Aspekt dieser Erfindung beruht in Zusammensetzungen, umfassend Primer, Sonden und/oder Oligonuldeotide, die für einen spezifischen Nachweis wenigstens eines SNP oder Haplotyps, der mit Autismus assoziiert ist, in der genomischen Region, einschließlich des PITX1-Gens, entwickelt sind, oder eine Kombination davon. Bevorzugt sind besagte SNP(s) aus solchen ausgewählt, die in Tabellen 1a und 1b aufgelistet sind, im Speziellen solche, die in Tabellen 3 bis 8 aufgelistet sind. Im Speziellen kann besagter mit Autismus assoziierter SNP aus der aus SNP6 und SNP33 bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Im Speziellen umfasst besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp mehrere SNPs, die aus den in Tabelle 1a und 1b aufgelisteten SNPs ausgewählt sind, oder besteht aus diesen. Bevorzugt sind besagte SNPs aus der Gruppe ausgewählt, die aus den in Tabellen 3 bis 8 aufgelisteten bestehen. In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP6, SNP33, SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33. In einer speziellen Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21 und SNP22. Noch spezieller ist besagter Haplotyp aus den Haplotypen ausgewählt, die in den Tabellen 4, 6, 7 und 8 aufgelistet sind. Gegebenenfalls können die in der vorliegenden Erfindung aufgelisteten Haplotypen einen oder mehrere zusätzliche SNPs umfassen. Bevorzugter kann besagter mit Autismus assoziierter SNP SNP6 oder SNP33 sein. In einer am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP24, SNP25 beziehungsweise SNP40, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer anderen am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP23, SNP25 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer weiteren am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP25, SNP27, SPN29, SPN31 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 2-1-1-1-1.
  • Die Erfindung beruht ebenfalls in Verfahren zur Behandlung von Autismus und/oder assoziierten Störungen in einem Patienten durch eine Modulation der PITX1-Expression oder Aktivität. Derartige Behandlungen nutzen zum Beispiel PITX1-Polypeptide, PITX1-DNA-Sequenzen (einschließlich Antisense-Sequenzen und an den PITX1-Genlocus gerichtete RNAi), anti-PITX1-Antikörper oder Arzneimittel, die die PITX1-Expression oder -Aktivität modulieren.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Behandlung von Individuen, die schädliche Allele des PITX1-Gens tragen, einschließlich einer präsymptomatischen Behandlung oder kombinierten Therapie, wie mit Hilfe einer Gentherapie, Proteinsubstitutionstherapie oder mit Hilfe der Verabreichung von PITX1-Protein-Mimetika und oder -Inhibitoren.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung beruht in der Durchmusterung von Arzneimitteln für eine Therapie von Autismus oder einer assoziierten Störung, basierend auf der Modulation eines Allels des PITX1-Gens oder dem Binden an ein Allel des PITX1-Gens oder ein Genprodukt davon, das mit Autismus oder einer assoziierten Störung assoziiert ist.
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfasst Antikörper, die für PITX1-Polypeptidfragmente spezifisch sind, und Derivate derartiger Antikörper, derartige Antikörper sezernierende Hybridome und diese Antikörper umfassende Diagnose-Kits. Bevorzugter sind besagte Antikörper für ein PITX1-Polypeptid oder Fragment davon spezifisch, das eine Veränderung umfasst, wobei besagte Veränderung die Aktivität von PITX1 modifiziert.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein PITX1-Gen oder ein Fragment davon, das eine Veränderung umfasst. Außerdem betrifft die Erfindung ein PITX1-Polypeptid oder ein Fragment davon, das eine Veränderung umfasst. Bevorzugt modifiziert besagte Veränderung die Aktivität von PITX1. In einer speziellen Anwendungsform ist besagte Veränderung aus der in Tabelle 11 aufgelisteten Mutation ausgewählt.
  • LEGENDE DER FIGUREN
  • 1: Hochdichtekartierung unter Anwendung von Genomic Hybrid Identity Profiling (GenomeHIP)
  • Insgesamt 2263 BAC-Klone mit einem durchschnittlichen Intervall von 1,2 Mega-Basenpaaren zwischen Klonen, die das gesamte Humangenom repräsentieren, wurden auf eine Kopplung unter Verwendung von GenomeHIP getestet. Jeder Punkt entspricht einem Klon. Ein signifikantes Anzeichen für eine Kopplung wurde für Klon BACA4ZA08 (p-Wert 6,4 × 10–7) rechnerisch ermittelt. Die gesamte Kopplungsregion umfasste eine Region von Basenpaar 134 095 595 bis Basenpaar 135 593 528 auf dem humanen Chromosom 5. Der p-Wert von 2 × 10–5, der dem Signifikanzlevel für eine signifikante Kopplung entsprach, wurde als ein Signifikanzlevel für die gesamten Genome-Screens verwendet, wie von Lander und Kruglyak (1995) vorgeschlagen.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung legt die Identifikation von PITX1 als einem humanen Autismus-Anfälligkeitsgen offen. Verschiedene Nukleinsäure-Proben von 114 Familien mit Autismus wurden einem speziellen GenomeHIP-Verfahren unterzogen. Dieses Verfahren führte zur Identifikation von bestimmten identical-by-descent Fragmenten in besagten Populationen, die in autistischen Patienten verändert sind. Durch die Durchmusterung der IBD-Fragmente identifizierten wir das Hypophysen-Homöobox-Transkriptionsfaktor 1-Gen auf Chromosom 5q31.1 (PITX1) als einen Kandidaten für Autismus und verwandte Phänotypen. Dieses Gen ist tatsächlich im kritischen Intervall vorhanden und exprimiert einen funktionellen Phänotyp, der mit einer genetischen Regulation von Autismus in Einklang steht. SNPs des PITX1-Gens wurden ebenfalls identifiziert und eine Korrelation mit Autismus in Humanpatienten festgestellt. Es wurde festgestellt, dass SNP6 und SNP33, die im PITX1-Genlocus lokalisiert sind, mit Autismus assoziiert sind. In Tabellen 4 und 6 bis 8 aufgelistete Haplotypen, umfassend mehrere SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21, SNP22, SNP23, SNP24, SNP25, SNP27, SNP29, SNP31, SNP33, SNP36, SNP39 und SNP40, sind ebenfalls als mit Autismus assoziiert identifiziert worden.
  • Die vorliegende Erfindung schlägt folglich vor, das PITX1-Gen und die entsprechenden Expressionsprodukte für die Diagnose, Prävention und Behandlung von Autismus, Störungen des autistischen Spektrums und mit Autismus assoziierten Störungen wie auch für die Durchmusterung therapeutisch aktiver Arzneimittel zu verwenden.
  • DEFINITIONEN
  • Autismus und Störungen des autistischen Spektrums (ASDs); Autismus ist üblicherweise als Teil eines Spektrums von Störungen (ASDs) charakterisiert, einschließlich Asperger Syndrom (AS) und anderer tiefgreifender Entwicklungsstörungen (PPD). Autismus soll als ein beliebiger Zustand einer beeinträchtigten sozialen Interaktion und Kommunikationen aufgefasst werden, der mit beschränkten repetitiven, stereotypen Verhaltens-, Interessen- und Aktivitätsmustern vor Erreichen des dritten Lebensjahrs in einem Ausmaß vorliegt, so dass die Gesundheit beeinträchtigt sein kann. AS unterscheidet sich von der autistischen Störung durch das Ausbleiben einer klinisch signifikanten Verzögerung der Sprachentwicklung bei Vorliegen der beeinträchtigen sozialen Interaktion und beschränkten repetitiven Verhaltens-, Interessen- und Aktivitätsmuster, die Störungen des autistischen Spektrums (ASDs) kennzeichnen. PPD-NOS (PPD, nicht anders bezeichnet) wird für die Kategorisierung von Kindern genutzt, die nicht die strengen Kriterien für Autismus erfüllen, aber ihnen nahe kommen, entweder weil sie einen atypischen Autismus zeigen oder weil sie die Diagnosekriterien in zwei oder drei Schlüsselbereichen nahezu erfüllen.
  • Mit Autismus assoziierte Störungen, Erkrankungen oder Pathologien schließen spezifischer beliebige Stoffwechsel- oder Immunstörungen, Epilepsie, Angst, Depression, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom, verzögerte Sprachentwicklung oder Sprachstörungen, motorische Inkoordination, geistige Zurückgebliebenheit, Schizophrenie und bipolare Störung ein.
  • Die Erfindung kann in verschiedenen Patienten, insbesondere Menschen, einschließlich Erwachsener, Kinder, und im pränatalen Stadium angewandt werden.
  • Im Kontext dieser Erfindung bezeichnet PITX1-Genlocus alle PITX1-Sequenzen oder Produkte in einer Zelle oder einem Organismus, einschließlich PITX1 codierender Sequenzen, PITX1 nicht-codierender Sequenzen (z. B. Introns), PITX1 regulatorischer Sequenzen, die die Transkription, Translation und/oder Stabilität kontrollieren (z. B. Promotor, Enhancer, Terminator, etc.), wie auch alle entsprechenden Expressionsprodukte, wie PITX1 RNAs (z. B. mRNAs) und PITX1-Polypeptide (z. B. ein Prä-Protein und ein reifes Protein). Der PITX1-Genlocus umfasst ebenfalls das PITX1-Gen umgebende Sequenzen, die SNPs umfassen, die sich in einem Kopplungsungleichgewicht mit SNPs befinden, die im PITX1-Gen lokalisiert sind. Zum Beispiel umfasst der PITX1-Locus umgebende Sequenzen, die in Tabelle 1a und/oder 1b aufgelistete SNPs umfassen.
  • Wie hier in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezeichnet der Ausdruck „PITX1-Gen" das Hypophysen-Homöobox-Transkriptionsfaktor 1-Gen auf dem humanen Chromosom 5q31.1 wie auch Varianten, Analoga und Fragmente davon, einschließlich Allele davon (z. B. Keimbahnmutationen), die mit einer Anfälligkeit für Autismus und Autismus assoziierten Störungen verbunden sind. Das PITX1-Gen kann ebenfalls als paired-like Homöodomäne-Transkriptionsfaktor-Hypophysen-Homöobox 1, PTX1, Backfoot, Maus Homolog von BFT, Hypophysen-OTX-verwandter Faktor, POTX, bezeichnet werden.
  • Der Ausdruck „Gen" soll bedeuten, dass jede Art codierender Nukleinsäure, einschließlich genomischer DNA (gDNA), komplementärer DNA (cDNA), synthetischer oder halbsynthetischer DNA, wie auch jede Form korrespondierender RNA umfasst ist. Der Ausdruck Gen umfasst insbesondere PITX1 codierende rekombinante Nukleinsäuren, d. h. jedes beliebige nicht natürlich vorkommende Nukleinsäure-Molekül, das künstlich hergestellt ist, z. B. durch Zusammensetzen, Schneiden, Ligieren oder Amplifizieren von Sequenzen. Ein PITX1-Gen ist typischerweise doppelsträngig, obwohl auch andere Formen, wie ein Einzelstrang, in Betracht kommen können. PITX1-Gene können von verschiedenen Quellen und gemäß verschiedenen, in der Technik bekannten Methoden, wie beispielsweise mittels Durchmusterung von DNA-Bibliotheken, oder mittels Amplifikation von verschiedenen natürlichen Quellen, erhalten werden. Rekombinante Nukleinsäuren können mit Hilfe herkömmlicher Techniken, einschließlich chemischer Synthese, gentechnischer Methoden, enzymatischer Methoden oder einer Kombination davon, hergestellt werden. Geeignete PITX1-Gensequenzen können in Genbanken, wie beispielsweise Unigene Cluster für PITX1 (Hs.84136) und Unigene Representative Sequence NM_002653 gefunden werden. Ein besonderes Beispiel eines PITX1-Gens umfasst SEQ ID NR. 1 oder 37.
  • Der Ausdruck „PITX1-Gen" umfasst jede beliebige Variante, jedes beliebige Fragment oder Analogon von SEQ ID NR. 1 oder 37 oder jede beliebige wie oben definierte codierende Sequenz. Derartige Varianten umfassen zum Beispiel natürlich vorkommende Varianten aufgrund von Allel-Variationen unter den Individuen (z. B. Polymorphismen), mutierte Allele, die mit Autismus in Verbindung stehen, alternative Spleißformen, etc. Der Ausdruck Variante umfasst ebenfalls PITX1-Gensequenzen von anderen Quellen oder Organismen. Varianten sind vorzugsweise zu SEQ ID NR. 1 oder 37 homolog, d. h. sie zeigen eine Nukleotidsequenzidentität von wenigstens etwa 65%, typischerweise wenigstens etwa 75%, bevorzugt wenigstens etwa 85%, bevorzugter wenigstens etwa 95% mit SEQ ID NR. 1 oder 37. Varianten oder Analoga eines PITX1-Gens umfassen ebenfalls Nukleinsäure-Sequenzen, die an eine wie oben definierte Sequenz (oder an einen komplementären Strang davon) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren.
  • Typische stringente Hybridisierungsbedingungen umfassen Temperaturen über 30°C, bevorzugt über 35°C, bevorzugter über 42°C und/oder einen Salzgehalt von weniger als etwa 500 mM, bevorzugt weniger als 200 mM. Hybridisierungsbedingungen können vom Fachmann durch Verändern von Temperatur, Salzgehalt und/oder der Konzentration anderer Reagenzien wie SDS, SSC, etc. reguliert werden.
  • Ein Fragment eines PITX1-Gens bezeichnet jeden beliebigen Teil von wenigstens etwa 8 aufeinanderfolgenden Nukleotiden einer wie oben offen gelegten Sequenz, bevorzugt wenigstens etwa 15, bevorzugter wenigstens etwa 20 Nukleotiden, noch bevorzugter wenigstens etwa 30 Nukleotiden. Fragmente umfassen alle möglichen Nukleotidlängen zwischen 8 und 100 Nukleotiden, bevorzugt zwischen 15 und 100, bevorzugter zwischen 20 und 100.
  • Ein PITX1-Polypeptid bezeichnet jedes beliebige Protein oder Polypeptid, das von einem wie oben offen gelegten PITX1-Gen codiert wird. Der Ausdruck „Polypeptid" bezieht sich auf jedes Molekül, das eine Folge von Aminosäuren umfasst. Dieser Ausdruck umfasst Moleküle verschiedener Längen, wie Peptide und Proteine. Das Polypeptid kann modifiziert sein, wie mittels Glycosylierungen und/oder Acetylierungen und/oder chemischer Reaktion oder Kopplung, und kann eine oder mehrere nicht-natürliche oder synthetische Aminosäuren enthalten. Ein spezifisches Beispiel eines PITX1-Polypeptids umfasst die vollständige oder einen Teil der SEQ ID NR. 2 (NP_002644).
  • Der Ausdruck „Ansprechen auf eine Behandlung" bezieht sich auf die Behandlungswirkung, einschließlich, aber hierauf nicht beschränkt, auf die Fähigkeit zur Metabolisierung einer therapeutischen Verbindung, auf die Fähigkeit zur Umwandlung einer Prodrug in ein aktives Arzneimittel und auf die pharmakokinetischen Eigenschaften (Absorption, Verteilung, Elimination) und pharmakodynamischen Eigenschaften (auf Rezeptoren bezogen) eines Arzneimittels in einem Individuum.
  • Der Ausdruck „Nebenwirkungen einer Behandlung" bezieht sich auf Nebenwirkungen einer Therapie, die aus weiter reichenden Wirkungen neben der pharmakologischen Hauptwirkung des Arzneimittels resultieren, oder auf idiosynkratische nachteilige Reaktionen, die aus einer Wechselwirkung des Arzneimittels mit einzigartigen Wirtsfaktoren resultieren. „Nebenwirkungen auf eine Behandlung" umfassen, sind aber hierauf nicht beschränkt, nachteilige Reaktionen, wie dermatologische, hämatologische oder hepatologische Toxizitäten, und umfasst außerdem gastritische und intestinale Ulzeration, Störung der Thrombocytenfunktion, Nierenschädigungen, allgemeine Urticaria, Bronchokonstriktion, Hypotension und Schock.
  • DIAGNOSE
  • Die Erfindung stellt nun Diagnoseverfahren basierend auf das Monitoring des PITX1-Genlocus in einem Patienten bereit. Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck „Diagnose" den Nachweis, das Monitoring, die Bestimmung, den Vergleich, etc. zu verschiedenen Stadien, einschließlich früher, präsymptomatischer Stadien, und später Stadien, in Erwachsenen, Kinder und vor der Geburt. Die Diagnose umfasst üblicherweise die Prognose, die Bewertung einer Veranlagung oder eines Risikos der Entwicklung, die Charakterisierung eines Patienten, um die geeigneteste Behandlung zu definieren (Pharmakogenetik), etc.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Diagnoseverfahren bereit, um zu untersuchen, ob ein Individuum ein Risiko einer Entwicklung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung trägt oder an Autismus, an einer Störung des autistischen Spektrums oder an einer mit Autismus assoziierten Störung leidet, die aus einer Mutation oder einem Polymorphismus in dem PITX1-Genlocus resultiert. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren bereit, um zu untersuchen, ob ein Individuum wahrscheinlich auf ein therapeutisches Agens positiv anspricht, oder ob ein Individuum ein Risiko einer Entwicklung einer nachteiligen Nebenwirkung auf ein therapeutisches Agens aufweist.
  • Ein besonderer Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von oder der Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, wobei das Verfahren den Nachweis in einer Probe von dem Patienten des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe umfasst. Das Vorhandensein besagter Veränderung weist auf das Vorhandensein oder die Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hin. Gegebenenfalls umfasst besagtes Verfahren einen vorherigen Schritt der Bereitstellung einer Probe von einem Patienten. Vorzugsweise wird das Vorhandensein einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe mit Hilfe der Genotypisierung einer Probe nachgewiesen.
  • Ein anderer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zum Nachweis des Schutzes vor Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten umfasst, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung ein Hinweis auf den Schutz vor Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung darstellt.
  • In einer bevorzugten Anwendungsform ist besagte Veränderung ein oder mehrere SNP(s) oder ein Haplotyp von SNP(s), die mit Autismus assoziiert sind. Bevorzugt sind besagte SNP(s) aus solchen ausgewählt, die in Tabellen 1a und 1b aufgelistet sind, im Speziellen solche, die in Tabellen 3 bis 8 aufgelistet sind. Im Speziellen kann der mit Autismus assoziierte SNP aus der aus SNP6 und SNP33 bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Im Speziellen umfasst besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp mehrere SNPs, die aus den in Tabelle 1a und 1b aufgelisteten SNPs ausgewählt sind, oder besteht aus diesen. Bevorzugt sind besagte SNPs aus der Gruppe ausgewählt, die aus den in Tabellen 3 bis 8 aufgelisteten bestehen. In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP6, SNP33, SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33. In einer speziellen Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21 und SNP22. Noch spezieller ist besagter Haplotyp aus den Haplotypen ausgewählt, die in den Tabellen 4, 6, 7 und 8 aufgelistet sind. Gegebenenfalls können die in der vorliegenden Erfindung aufgelisteten Haplotypen einen oder mehrere zusätzliche SNPs umfassen. Bevorzugter kann besagter mit Autismus assoziierter SNP SNP6 oder SNP33 sein. In einer am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP24, SNP25 beziehungsweise SNP40, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer anderen am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP23, SNP25 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer weiteren am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP25, SNP27, SPN29, SPN31 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 2-1-1-1-1.
  • Ein anderer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Bewertung des Ansprechen eines Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung, wobei das Verfahren (i) das Bereitstellen einer Probe von dem Patienten und (ii) das Nachweisen des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe umfasst.
  • Ein anderer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Bewertung des Ansprechen eines Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung, wobei das Verfahren das Nachweisen in einer Probe des Patienten des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe umfasst. Das Vorhandensein besagter Veränderung ist ein Hinweis auf ein spezielles Ansprechen auf besagte Behandlung. Bevorzugt wird das Vorhandensein einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe mit Hilfe der Gentypisierung einer Probe nachgewiesen.
  • Ein weiterer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Bewertung der Nebenwirkungen für einen Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung, wobei das Verfahren das Nachweisen in einer Probe von dem Patienten des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe umfasst. Das Vorhandensein besagter Veränderung ist ein Hinweis auf Nebenwirkungen auf besagte Behandlung. Bevorzugt wird das Vorhandensein einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in besagter Probe mit Hilfe der Gentypisierung einer Probe nachgewiesen.
  • In einer bevorzugten Anwendungsform ist besagte Veränderung ein oder mehrere SNP(s) oder ein Haplotyp von SNP(s), die mit Autismus assoziiert sind. Bevorzugt sind besagte SNP(s) aus solchen ausgewählt, die in Tabellen 1a und 1b aufgelistet sind, im Speziellen solche, die in Tabellen 3 bis 8 aufgelistet sind. Im Speziellen kann der mit Autismus assoziierte SNP aus der aus SNP6 und SNP33 bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Im Speziellen umfasst besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp mehrere SNPs, die aus den in Tabelle 1a und 1b aufgelisteten SNPs ausgewählt sind, oder besteht aus diesen. Bevorzugt sind besagte SNPs aus der Gruppe ausgewählt, die aus den in Tabellen 3 bis 8 aufgelisteten bestehen. In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP6, SNP33, SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33. In einer speziellen Anwendungsform umfasst oder besteht besagter mit Autismus assoziierter Haplotyp aus mehreren SNPs, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21 und SNP22. Noch spezieller ist besagter Haplotyp aus den Haplotypen ausgewählt, die in den Tabellen 4, 6, 7 und 8 aufgelistet sind. Gegebenenfalls können die in der vorliegenden Erfindung aufgelisteten Haplotypen einen oder mehrere zusätzliche SNPs umfassen. Bevorzugter kann besagter mit Autismus assoziierter SNP SNP6 oder SNP33 sein. In einer am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP24, SNP25 beziehungsweise SNP40, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer anderen am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP23, SNP25 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 1-2-1. In einer weiteren am meisten bevorzugten Anwendungsform umfasst oder besteht besagter Haplotyp aus SNP25, SNP27, SPN29, SPN31 beziehungsweise SNP33, bevorzugt mit den Allelen 2-1-1-1-1.
  • In einer weiteren Anwendungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Prävention von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, umfassend das Nachweisen des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus in einer Probe von dem Patienten, wobei das Vorhandensein besagter Veränderung auf die Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung hinweist; und Verabreichen einer prophylaktischen Behandlung gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung. Besagte prophylaktische Behandlung kann eine Verabreichung eines Arzneimittels sein. Besagte prophylaktische Behandlung kann ebenfalls eine Verhaltenstherapie sein.
  • Diagnostika, die das Ansprechen auf eine Behandlung oder Arzneimittel, oder Nebenwirkungen von einer Behandlung oder einem Arzneimittel analysieren und vorhersagen, können verwendet werden, um zu untersuchen, ob ein Individuum mit einem bestimmten Arzneimittel behandelt werden soll. Falls zum Beispiel das Diagnostikum anzeigt, dass ein Individuum auf eine Behandlung mit einem bestimmten Arzneimittel oder auf eine bestimmte Verhaltenstherapie wahrscheinlich positiv anspricht, kann das Arzneimittel dem Individuum verabreicht werden. Falls dagegen das Diagnostikum anzeigt, dass ein Individuum wahrscheinlich negativ auf eine Behandlung mit einem bestimmten Arzneimittel anspricht, kann ein alternatives Therapieverfahren verordnet werden. Ein negatives Ansprechen kann entweder als das Ausbleiben einer wirksamen Reaktion oder als das Auftreten von toxischen Nebenwirkungen definiert werden.
  • Klinische Arzneimittelversuche stellen eine weitere Anwendung für die PITX1 SNPs dar. Ein oder mehrere PITX1 SNPs, die eine Reaktion auf ein Arzneimittel oder auf Nebenwirkungen eines Arzneimittels anzeigen, können mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren identifiziert werden. Demgemäß können mögliche Teilnehmer von klinischen Versuchen mit einem derartigen Agens durchmustert werden, um diejenigen Individuen zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten positiv auf das Arzneimittel ansprechen, und um diejenigen auszuschließen, die wahrscheinlich Nebenwirkungen erfahren. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit eines Arzneimittels in Individuen bestimmt werden, die auf das Arzneimittel positiv ansprechen, ohne die Messung als Folge der Einbeziehung von Individuen zu verschlechtern, die wahrscheinlich nicht positiv in der Studie reagieren, und ohne unerwünschte Sicherheitsrisiken einzugehen.
  • Klinische Versuche für die Bewertung des Nutzens einer Verhaltenstherapie sind ebenfalls eine Verwendung für PITX1 SNPs. Ein oder mehrere PITX1 SNPs, die eine Reaktion auf eine Verhaltenstherapie oder auf Nebenwirkungen einer Verhaltenstherapie anzeigen, können mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren identifiziert werden. Demgemäß können mögliche Teilnehmer von klinischen Versuchen mit einer derartigen Therapie durchmustert werden, um diejenigen Individuen zu identifizieren, die am wahrscheinlichsten positiv auf die Therapie ansprechen, und um diejenigen auszuschließen, die wahrscheinlich Nebenwirkungen erfahren. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit einer Verhaltenstherapie bei Individuen bestimmt werden, die auf die Therapie positiv ansprechen, ohne die Messung als Folge der Einbeziehung von Individuen zu verschlechtern, die wahrscheinlich nicht positiv in der Studie reagieren, und ohne unerwünschte Sicherheitsrisiken einzugehen.
  • Die Veränderung kann auf Ebene der PITX1 gDNA, der RNA oder des Polypeptids bestimmt werden. Gegebenenfalls wird der Nachweis mittels Durchführen eines Hybridisierungsassays, eines Sequenzierungsassays, eines Mikrosequenzierungsassays, eines Oligonukleotid-Ligationsassays, eines Konfirmation-basierten Assays, einer Schmelzkurvenanalyse, eines denaturierenden Hochleistungsflüssigchromatographie-(DHPLC)-Assays (Jones et al., 2000) oder eines Allel-spezifischen Amplifikationsassays erbracht. In einer speziellen Anwendungsform wird der Nachweis durch Sequenzierung des gesamten oder eines Teils des PITX1-Gens oder durch eine selektive Hybridisierung oder Amplifikation des gesamten oder eines Teils des PITX1-Gens durchgeführt. Bevorzugter wird eine für das PITX1-Gen spezifische Amplifikation vor dem Identifizierungsschritt der Veränderung durchgeführt.
  • Eine Veränderung in dem PITX1-Genlocus kann eine beliebige Form von Mutation(en), Deletion(en), Rearrangement(s) und/oder Insertion(en) in der codierenden und/oder nicht-codierenden Region des Locus, allein oder in verschiedenen Kombinationen, sein. Mutationen umfassen spezieller Punktmutationen. Deletionen können eine beliebige Region aus einem, zwei oder mehreren Resten in einem codierenden oder nicht-codierenden Abschnitt des Genlocus umfassen, wie von zwei Resten bis zum gesamten Gen oder Locus. Typische Deletionen betreffen kleinere Regionen, wie Domänen (Introns) oder Wiederholungssequenzen oder Fragmente von weniger als etwa 50 aufeinanderfolgenden Basenpaaren, obwohl größere Deletionen ebenso vorkommen können. Insertionen können das Hinzufügen eines oder mehrerer Reste in einem codierenden oder nicht-codierenden Abschnitt des Genlocus umfassen.
  • Insertionen können typischerweise ein Hinzufügen zwischen 1 und 50 Basenpaaren in dem Genlocus umfassen. Ein Rearrangement beinhaltet eine Inversion von Sequenzen. Die Veränderung des PITX1-Genlocus kann zur Bildung neuer Stop-Codons, Leserahmenverschiebungen, Aminosäure-Substitutionen, insbesondere RNA-Spleißung oder -Prozessierung, Produktinstabilität, zur Produktion verkürzter Polypeptide, etc, führen. Die Veränderung kann zur Produktion eines PITX1-Polypeptids mit einer veränderten Funktion, Stabilität, Ausrichtung oder Struktur führen. Die Veränderung kann ebenfalls eine Verringerung der Proteinexpression oder alternativ eine Steigerung besagter Produktion hervorrufen.
  • In einer speziellen Anwendungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Veränderung in dem PITX1-Genlocus aus einer Punktmutation, einer Deletion und einer Insertion in dem PITX1-Gen oder dem entsprechenden Expressionsprodukt, bevorzugter einer Punktmutation und einer Deletion, ausgewählt. Die Veränderung kann auf Ebene der PITX1 gDNA, RNA oder des Polypeptids bestimmt werden.
  • In dieser Hinsicht legt die vorliegende Erfindung nun einen SNP in dem PITX1-Gen und bestimmte Haplotypen offen, die SNPs umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21 und SNP22, die mit Autismus assoziiert sind. Die SNPs sind in der folgenden Tabelle 1a aufgeführt. Tabelle 1a
    Nukleotidposition in der genomischen Sequenz von Chromosom 5 (Build34) SNP-Identität dbSNP-Referenz Polymorphismus Position im Locus und Art der Aminosäure-Änderung Sequenz Referenz
    134298380 SNP1 rs319589 A/G 3' vom PITX1-Locus 3
    134331549 SNP3 rs737587 C/T 3' vom PITX1-Locus 4
    134344806 SNP4 rs737587 C/T 3' vom PITX1-Locus 5
    134448086 SNP6 rs39882 G/T nahe der PITX1-Promotorregion 6
    134530030 SNP7 rs745558 A/G 5' vom PITX1-Locus 7
    135347578 SNP21 rs28792 A/G 5' vom PITX1-Locus 8
    135368924 SNP22 rs248166 A/G 5' vom PITX1-Locus 9
    Tabelle 1b
    Nukleotidposition in der genomischen Sequenz von Chromosom 5 (Build34) SNP-Identität dbSNP-Referenz Polymorphismus Position im Locus und Art der Aminosäure-Änderung Sequenz Referenz
    134331549 SNP23 C_644488_10/rs319589 A = 1/G = 2 5' vom PITX1-Locus 10
    134344806 SNP24 C_644467_10/rs737587 C = 1/T = 2 5' vom PITX1-Locus 11
    134424172 SNP25 C_15800861_10/rs2249596 C = 1/T = 2 5' vom PITX1-Locus 12
    134428749 SNP26 C_1012452_10/rs28330 C = 1/T = 2 5' vom PITX1-Locus 13
    134432016 SNP27 C_3199522_10/rs657223 A = 1/T = 2 5' vom PITX1-Locus 14
    134437236 SNP28 rs31210 A = 1/G = 2 5' vom PITX1-Locus 15
    134440733 SNP29 C_1012466_10/rs479632 C = 1/G = 2 Missense Mutation 16
    134441306 SNP30 C_1012468_20/rs474853 C = 1/T = 2 Intron 17
    134442415 SNP31 C_27486310_10/rs3805663 A = 1/G = 2 Intron 18
    134444616 SNP32 C_2036559_10/rs7700313 C = 1/T = 2 Intron 19
    134448086 SNP33 C_11256661_10/rs39882 G = 1/T = 2 3' vom PITX1-Locus 20
    134451092 SNP35 C_8883433_10/rs1700488 A = 1/G = 2 3' vom PITX1-Locus 21
    134455172 SNP36 C_1012473_10/rs254550 C = 1/G = 2 3' vom PITX1-Locus 22
    134455527 SNP37 rs39881 G = 1/T = 2 3' vom PITX1-Locus 23
    134456746 SNP38 C_3199528_10/rs254551 A = 1/G = 2 3' vom PITX1-Locus 24
    134471341 SNP39 rs1875957 A = 1/G = 2 3' vom PITX1-Locus 25
    134498420 SNP40 rs254577 A = 1/G = 2 3' vom PITX1-Locus 26
  • In einem beliebigen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere SNP in dem PITX1-Gen und bestimmte Haplotypen, die SNP in dem PITX1-Gen und umgebenden Regionen umfassen, spezieller solche, die in der vorliegenden Erfindung offen gelegt sind, in Kombination mit einem anderen SNP oder Haplotyp, der mit Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung assoziiert ist und in einem anderen Gen oder Genen lokalisiert ist, verwendet werden.
  • In einer anderen Variante umfasst das Verfahren den Nachweis einer veränderten Expression der PITX1-RNA. Eine veränderte RNA-Expression umfasst das Vorliegen einer veränderten RNA-Sequenz, das Vorliegen einer veränderten RNA-Spleißung oder -Prozessierung, das Vorliegen einer veränderten RNA-Menge, etc. Diese können mit verschiedenen, in der Technik bekannten Methoden nachgewiesen werden, einschließlich zum Beispiel mittels Sequenzierung der gesamten oder eines Teils der PITX1-RNA oder mittels selektiver Hybridisierung oder selektiver Amplifikation der gesamten oder eines Teils besagter RNA.
  • In einer weiteren Variante umfasst das Verfahren den Nachweis des Vorliegen einer veränderten Expression des PITX1-Polypeptids. Eine veränderte Expression des PITX1-Polypeptids umfasst das Vorhandensein einer veränderten Polypeptid-Sequenz, das Vorhandensein einer veränderten Menge an PITX1-Polypeptid, das Vorhandensein einer veränderten Gewebeverteilung, etc. Diese können mit verschiedenen, in der Technik bekannten Methoden, einschließlich zum Beispiel mittels Sequenzierung und/oder Binden an spezifische Liganden (wie Antikörper), nachgewiesen werden.
  • Wie oben gezeigt, können verschiedene, in der Technik bekannte Methoden angewandt werden, um ein verändertes PITX1-Gen oder veränderte RNA-Expression oder -Sequenz nachzuweisen oder zu quantifizieren, einschließlich Sequenzierung, Hybridisierung, Amplifikation und/oder Binden an spezifsche Liganden (wie Antikörper). Andere geeignete Verfahren umfassen Allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Oligonukleotid-Ligation, Allel-spezifische Amplifikation, Southern-Blot (für DNAs), Northern-Blot (für RNAs), Einzelstrang-Konformationsanalyse (SSCA), PFGE, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Gelmigration, „clamped" denaturierende Gelelektrophorese, denaturierende HPLC, Schmelzkurvenanalyse, Heteroduplexanalyse, RNase-Schutz, chemische oder enzymatische Fehlpaarungs-Spaltung, ELISA, Radioimmunoassays (RIA) und Immunoenzymassays (IEMA).
  • Einige dieser Ansätze (z. B. SSCA und CGGE) basieren auf einer Änderung der elektrophoretischen Mobilität der Nukleinsäuren als Folge des Vorliegen einer veränderten Sequenz. Gemäß dieser Methoden wird die veränderte Sequenz durch eine Änderung der Mobilität auf Gelen sichtbar gemacht. Die Fragmente können dann sequenziert werden, um die Veränderung zu bestätigen.
  • Einige andere Ansätze basieren auf einer spezifischen Hybridisierung zwischen Nukleinsäuren von dem Patienten und einer Sonde, die für das Wildtyp-Gen oder ein verändertes PITX1-Gen oder veränderte RNA spezifisch ist. Die Sonde kann in Suspension oder auf einem Substrat immobilisiert vorliegen. Die Sonde ist üblicherweise markiert, um den Nachweis der Hybride zu erleichtern.
  • Einige dieser Ansätze sind besonders für eine Bewertung einer Polypeptid-Sequenz oder eines Expressionslevels geeignet, wie Northern-Blot, ELISA und RIA. Diese letzteren erfordern die Verwendung eines für das Polypeptid spezifischen Liganden, bevorzugter eines spezifischen Antikörpers.
  • In einer speziellen, bevorzugten Anwendungsform umfasst das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins eines veränderten PITX1-Genexpressionsprofils in einer Probe von dem Patienten. Wie oben angegeben, kann dies bevorzugter mittels Sequenzierung, selektiver Hybridisierung und/oder selektiver Amplifikation von in besagter Probe vorhandener Nukleinsäuren erreicht werden.
  • Sequenzierung
  • Die Sequenzierung kann unter Anwendung von in der Technik bekannten Methoden unter Verwendung eines automatischen Sequenzierers durchgeführt werden. Das Sequenzierung kann mit dem vollständigen PITX1-Gen oder bevorzugter mit spezifischen Domänen davon durchgeführt werden, üblicherweise mit solchen, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie schädliche Mutationen oder andere Veränderungen tragen.
  • Amplifikation
  • Die Amplifikation basiert auf der Bildung spezifischer Hybride zwischen komplementären Nukleinsäure-Sequenzen, die zur Initiierung der Nukleinsäure-Reproduktion dienen.
  • Eine Amplifikation kann gemäß verschiedenen Methoden, die in der Technik bekannt sind, durchgeführt werden, wie mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strangverdrängungsamplifikation (SDA) und Nukleinsäure basierter Amplifikation (NASBA). Diese Methoden können unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien und Protokolle durchgeführt werden. Bevorzugte Methoden nutzen Allel-spezifische PCR oder PCR-SSCP. Die Amplifikation erfordert normalerweise die Verwendung von Nukleinsäure-Primern, um die Reaktion zu starten.
  • Nukleinsäure-Primer, die für ein Amplifizieren des PITX1-Gens oder -Locus zweckdienlich sind, sind in der Lage, mit einem Abschnitt des PITX1-Genlocus, der eine Zielregion auf besagtem Locus flankiert, spezifisch zu hybridisieren, wobei besagte Zielregion in bestimmten Patienten mit Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung verändert ist. Beispiele derartiger Zielregionen sind in Tabellen 1a und 1b angegeben.
  • Primer, die für eine Amplifizierung der PITX1-Zielregion, umfassend wie in Tabelle 1 identifizierte SNPs, verwendet werden können, können basierend auf der Seq Id Nr. 1 oder basierend auf der genomischen Sequenz von PITX1 konstruiert werden. In einer speziellen Anwendungsform können Primer basierend auf SEQ ID NR. 3–26 konstruiert werden.
  • Ein anderer spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Nukleinsäure-Primer, der für eine Amplifizierung von Sequenzen von dem PITX1-Gen oder -Locus, einschließlich umgebender Regionen, zweckdienlich ist. Derartige Primer sind bevorzugt komplementär zu und hybridisieren spezifisch an Nukleinsäure-Sequenzen in dem PITX1-Genlocus. Spezielle Primer sind in der Lage, mit einem Abschnitt des PITX1-Genlocus, der eine Zielregion von besagtem Locus flankiert, spezifisch zu hybridisieren, wobei besagte Zielregion in bestimmten Patienten mit Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung verändert ist.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Nukleinsäure-Primer, wobei besagter Primer zu einem Abschnitt einer PITX1 codierenden Sequenz (z. B. Gen oder RNA) komplementär ist und an diesen Abschnitt spezifisch hybridisiert, der in bestimmten Patienten mit Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung verändert ist. In dieser Hinsicht sind spezielle Primer dieser Erfindung für veränderte Sequenzen in einem PITX1-Gen oder -RNA spezifisch. Bei Verwendung derartiger Primer zeigt der Nachweis eines Amplifikationsprodukts das Vorliegen einer Veränderung in dem PITX1-Genlocus an. Im Gegensatz hierzu zeigt das Fehlen eines Amplifikationsprodukts an, dass die spezifische Veränderung in der Probe nicht vorliegt.
  • Typische Primer dieser Erfindung sind einzelsträngige Nukleinsäure-Moleküle mit einer Länge von etwa 5 bis 60 Nukleotiden, bevorzugter mit einer Länge von etwa 8 bis etwa 25 Nukleotiden. Die Sequenz kann direkt von der Sequenz des PITX1-Genlocus abgeleitet sein. Eine vollkommene Komplementarität wird bevorzugt, um eine hohe Spezifität sicherzustellen Allerdings kann eine gewisse Fehlpaarung toleriert werden.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Nukleinsäure-Primers oder eines Nukleinsäure-Primerpaars, wie oben beschrieben, in einem Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von oder der Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten oder in einem Verfahren zur Bewertung der Ansprechbarkeit eines Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung.
  • Selektive Hybridisierung
  • Nachweisverfahren mittels Hybridisierung basieren auf der Bildung eines spezifischen Hybrids zwischen komplementären Nukleinsäure-Sequenzen, die zum Nachweisen der Nukleinsäure-Sequenzveränderung(en) dienen.
  • Eine spezielle Nachweismethode umfasst die Verwendung einer Nukleinsäure-Sonde, die für das Wildtyp-Gen oder ein verändertes PITX1-Gen oder -RNA spezifisch ist, und den nachfolgenden Nachweis des Vorhandenseins eines Hybrids. Die Sonde kann in Suspension oder immobilisiert an einem Substrat oder Träger (wie in Nukleinsäure-Array- oder Chip-Techniken) vorliegen. Die Sonde ist üblicherweise markiert, um den Nachweis der Hybride zu erleichtern.
  • In dieser Hinsicht umfasst eine spezielle Anwendungsform dieser Erfindung das Inkontaktbringen der Probe von dem Patienten mit einer Nukleinsäure-Sonde, die für einen veränderten PITX1-Genlocus spezifisch ist, und eine Bewertung der Bildung eines Hybrids. In einer speziellen bevorzugten Anwendungsform umfasst das Verfahren das gleichzeitige Inkontaktbringen der Probe mit einem Satz von Sonden, die jeweils für den Wildtyp PITX1-Genlocus und für verschiedene veränderte Formen davon spezifisch sind. In dieser Anwendungsform ist es möglich, das Vorhandensein verschiedener Formen von Veränderungen in dem PITX1-Genlocus in der Probe direkt nachzuweisen. Ebenfalls können verschiedene Proben von verschiedenen Patienten parallel behandelt werden.
  • Im Kontext dieser Erfindung bezeichnet eine Sonde eine Polynukleotid-Sequenz, die zu einem (Zielabschnitt von einem) PITX1-Gen oder -RNA komplementär ist oder zu einem spezifischen Hybridisieren in der Lage ist, und welche für einen Nachweis von mit PITX1-Allelen assoziierten Polynukleotid-Polymorphismen geeignet ist, die zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung prädisponieren oder damit assoziiert sind. Sonden sind vorzugsweise vollkommen komplementär zu dem PITX1-Gen, -RNA oder Zielabschnitt davon. Sonden umfassen typischerweise einzelsträngige Nukleinsäuren mit einer Länge zwischen 8 bis 1000 Nukleotiden, zum Beispiel zwischen 10 und 800, bevorzugter zwischen 15 und 700, typischerweise zwischen 20 und 500. Es sollte einzusehen sein, dass längere Sonden genauso verwendet werden können. Eine bevorzugte Sonde dieser Erfindung ist ein einzelsträngiges Nukleinsäure-Molekül mit einer Länge zwischen 8 bis 500 Nukleotiden, das an eine Region eines PITX1-Gens oder RNA, die eine Veränderung trägt, spezifisch hybridisieren kann,.
  • Eine spezifische Anwendungsform dieser Erfindung ist eine Nukleinsäure-Sonde, die für ein verändertes (z. B. ein mutiertes) PITX1-Gen oder -RNA spezifisch ist, d. h. eine Nukleinsäure-Sonde, die an besagtes verändertes PITX1-Gen oder -RNA spezifisch hybridisiert und im Wesentlichen nicht an ein PITX1-Gen oder -RNA hybridisiert, dem/der diese Veränderung fehlt. Die Spezifität wird dadurch angezeigt, dass eine Hybridisierung an die Zielsequenz ein spezifisches Signal generiert, das von dem Signal unterschieden werden kann, welches durch eine unspezifische Hybridisierung generiert wird. Vollkommen komplementäre Sequenzen werden für die Konstruktion von Sonden gemäß dieser Erfindung bevorzugt. Es sollte allerdings einzusehen sein, dass ein gewisses Ausmaß an Fehlpaarung toleriert werden kann, solange das spezifische Signal von der unspezifischen Hybridisierung unterschieden werden kann.
  • Spezielle Beispiele für derartige Sonden sind Nukleinsäure-Sequenzen, die zu einem Zielabschnitt der genomischen Region, einschließlich des eine Punktmutation tragenden PITX1-Gens oder -RNA, wie in Tabelle 1 oben aufgelistet, komplementär sind. Insbesondere können die Sonden eine Sequenz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR. 3–26 oder einem Fragment davon, das den SNP umfasst, oder eine komplementäre Sequenz davon.
  • Die Sequenz der Sonden können von Sequenzen des PITX1-Gens und -RNA abgeleitet sein, wie sie in der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt werden. Nukleotid-Substitutionen wie auch chemische Modifizierungen der Sonde können gemacht werden. Derartige chemische Modifizierungen können gemacht werden, um die Stabilität der Hybride zu erhöhen (z. B. interkalierende Gruppen) oder die Sonde zu markieren. Typische Beispiele für Markierungen umfassen, ohne Beschränkung, Radioaktivität, Fluoreszenz, Lumineszenz, Markieren mit Enzymen, etc.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung einer wie oben beschriebenen Nukleinsäure-Sonde in einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegen von oder der Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten oder in einem Verfahren zur Bewertung des Ansprechen eines Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung.
  • Oligonukleotid-Ligation
  • Der Oligonukleotid-Ligationsassay ist ein Verfahren, das aus der Konstruktion von 3 spezifischen Primer pro SNP besteht, wobei zwei Primer das SNP basenspezifische 3'-Ende tragen, und ein gewöhnlicher Primer 5' mit der nächsten Base in der Zielsequenz startet. Die beiden Allel-spezifischen Primer tragen ein Tag mit einer einzigartigen Sequenzen, die jedes Allel kennzeichnet. Primer werden an die Zielsequenz angelagert und eine Ligationsreaktion wird die Allel-spezifischen Primer mit dem gewöhnlichen Primer verknüpfen, falls die Allelspezifische 3'-Base vorhanden ist. Eine kurze, mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonde, die zum Tag der einzigartigen Sequenz homolog ist, wird dann an das immobilisierte Produkt hybridisiert, was den Nachweis des entsprechenden Allels ermöglicht. Bin Oligo-Ligationskit ist im Handel erhältlich (SNPlex, Applied Biosystems, Forster City).
  • Spezifische Ligandbindung
  • Wie oben angegeben, kann eine Veränderung in dem PITX1-Genlocus ebenfalls mittels Durchmusterung auf Veränderungen) in der PITX1-Polypeptid-Sequenz oder in den PITX1-Experessionslevels nachgewiesen werden. In dieser Hinsicht umfasst eine spezifische Anwendungsform dieser Erfindung das Inkontaktbringen der Probe mit einem für ein PITX1-Polypeptid spezifischen Liganden und Bestimmung der Komplexbildung.
  • Unterschiedliche Ligandtypen, wie spezifische Antikörper, können verwendet werden. In einer spezifischen Anwendungsform wird die Probe mit einem für ein PITX1-Polypeptid spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht und die Bildung eines Immunkomplexes wird bestimmt. Verschiedene Verfahren zum Nachweis eines Immunkomplexes können angewandt werden, wie beispielsweise ELISA, Radioimmunoassays (RIA) und Immunoenzymassays (IEMA).
  • Im Kontext dieser Erfindung steht Antikörper für einen polyklonalen Antikörper, einen monoklonalen Antikörper wie auch für Fragmente oder Derivate davon mit der im Wesentlichen gleichen Antigenspezifität. Fragmente umfassen Fab, Fab'2, CDR-Regionen, etc. Derivate umfassen einzelkettige Antikörper, humanisierte Antikörper, polyfunktionelle Antikörper, etc.
  • Ein für ein PITX1-Polypeptid spezifischer Antikörper bezeichnet einen Antikörper, der ein PITX1-Polypeptid selektiv bindet, nämlich einen Antikörper, der gegen ein PITX1-Polypeptid oder ein Epitop enthaltendes Fragment davon gezüchtet ist. Obwohl ein unspezifisches Binden an anderen Antigenen vorkommen kann, erfolgt ein Binden an das PITX1-Zielpolypeptid mit einer höheren Affinität und kann von einem unspezifischen Binden zuverlässig unterschieden werden.
  • In einer spezifischen Anwendungsform umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen einer Probe von dem Patienten mit (einem Träger beschichtet mit) einem Antikörper, der für eine veränderte Form eines PITX1-Polypeptids spezifisch ist, und Bestimmen des Vorhandenseins eines Immunkomplexes. In einer speziellen Anwendungsform kann die Probe gleichzeitig oder parallel oder nacheinander mit verschiedenen (beschichteten Trägern mit) Antikörpern in Kontakt gebracht werden, die für verschiedene Formen eines PITX1-Polypeptids spezifisch sind, wie ein Wildtyp und verschiedene veränderte Formen davon.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Liganden, bevorzugt eines Antikörpers, eines Fragments oder eines Derivates davon, wie sie oben beschrieben sind, in einem Verfahren zum Nachweis des Vorliegens von oder der Veranlagung zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten oder in einem Verfahren zur Bewertung des Ansprechen eines Patienten auf eine Behandlung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Diagnose-Kit, umfassend Produkte und Reagenzien für den Nachweis in einer Probe von einem Patienten des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1-Gen oder -Polypeptid, in der Expression des PITX1-Gen oder -Polypeptids und/oder PITX1-Aktivität. Besagtes Diagnose-Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst einen Primer, ein Primerpaar, eine Nukleinsäure-Sonde und/oder einen Liganden, bevorzugt Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind. Besagtes Diagnose-Kit gemäß der vorliegenden Erfindung kann außerdem Reagenzien und/oder Protokolle zur Durchführung einer Hybridisierung, Amplifikation oder Antigen-Antikörper-Immunreaktion umfassen.
  • Die Diagnoseverfahren können in vitro, ex vitro oder in vivo, bevorzugt in vitro oder ex vivo, durchgeführt werden. Sie verwenden eine Probe von dem Patienten, um den Status des PITX1-Genlocus zu bewerten. Die Probe kann eine beliebige, von dem Patienten stammende Probe sein, die Nukleinsäuren oder Polypeptide enthält. Beispiele für derartige Proben umfassen Flüssigkeiten, Gewebe, Zellproben, Organe, Biopsien, etc. Die bevorzugtesten Proben sind Blut, Plasma, Speichel, Urin, Samenflüssigkeit, etc. Eine pränatale Diagnose kann ebenfalls durch Testen von zum Beispiel Fötus- oder Plazentazellen durchgeführt werden. Die Probe kann mit herkömmlichen Techniken gewonnen und für eine Diagnose unmittelbar verwendet werden oder aufbewahrt werden. Die Probe kann vor Durchführung des Verfahrens behandelt werden, um Nukleinsäuren oder Polypeptide zum Testen verfügbar zu machen oder um deren Verfügbarkeit zu verbessern. Behandlungen umfassen zum Beispiel Lyse (z. B. mechanisch, physikalisch, chemisch, etc.), Zentrifugation, etc. Ebenfalls können die Nukleinsäuren und/oder Polypeptide mit herkömmlichen Techniken vorgereinigt oder angereichert und/oder in ihrer Komplexität verringert werden. Nukleinsäuren und Polypeptide können ebenfalls mit Enzymen behandelt oder anderen chemischen oder physikalischen Behandlungen unterzogen werden, um Fragmente davon herzustellen. Angesichts der hohen Empfindlichkeit der beanspruchten Verfahren sind sehr geringe Probenmengen zur Durchführung des Assays hinreichend.
  • Wie angegeben, wird die Probe bevorzugt mit Reagenzien, wie Sonden, Primer oder Liganden, in Kontakt gebracht, um das Vorhandensein eines veränderten PITX1-Genlocus zu bewerten. Das Inkontaktbringen kann in jeder geeigneten Vorrichtung, wie Platte, Röhrchen, Vertiefung, Glas, etc., durchgeführt werden. In spezifischen Anwendungsformen erfolgt das Inkontaktbringen auf einem Substrat, das mit dem Reagenz, wie einem Nukleinsäure-Array oder einem spezifischen Liganden-Array, beschichtet ist. Das Substrat kann ein festes oder halbfestes Substrat sein, wie ein beliebiger Träger, der Glas, Kunststoff, Nylon, Papier, Metall, Polymere und dergleichen umfasst. Das Substrat kann verschiedene Formen und Formate einnehmen, wie ein Objektträger, eine Membran, ein Kügelchen, eine Säule, etc. Das Inkontaktbringen kann unter beliebigen Bedingungen erfolgen, die zur Bildung eines Komplexes zwischen Reagenz und Nukleinsäuren oder Polypeptiden der Probe geeignet sind.
  • Die Feststellung eines veränderten PITX1-Polypeptids, -RNA oder -DNA in der Probe zeigt das Vorhandensein eines veränderten PITX1-Genlocus in dem Patienten an, was mit dem Vorliegen von, der Veranlagung zu oder einem Entwicklungsstadium von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung korreliert werden kann. Zum Beispiel besitzt ein Individuum mit einer PITX1-Mutation in der Keimbahn ein erhöhtes Risiko für eine Entwicklung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung. Die Bestimmung des Vorhandenseins eines veränderten PITX1-Genlocus in einem Patienten erlaubt ebenfalls die Entwicklung einer geeigneten therapeutischen Intervention, die wirksamer und individueller ist. Ebenfalls erlaubt diese Bestimmung auf präsymptomatischer Ebene eine anzuwendende Präventionstherapie.
  • Kopplungsungleichgewicht
  • Sobald ein erster SNP in einer genomischen Region von Interesse, spezieller im PITX1-Genlocus, identifiziert worden ist, kann der Fachmann weitere SNPs, die sich im Kopplungsungleichgewicht mit diesem ersten SNP befinden, leicht identifizieren. Tatsächlich wird jeder SNP in einem Kopplungsungleichgewicht mit dem ersten SNP, der mit Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung assoziiert ist, mit diesem Merkmal verknüpft sein. Sobald diese Verknüpfung zwischen einem gegebenen SNP und Autismus oder einer assoziierten Störung gezeigt worden ist, kann deshalb die Entdeckung weiterer, mit diesem Merkmal assoziierter SNPs von großem Interesse sein, um die Dichte von SNPs in dieser speziellen Region zu erhöhen.
  • Die Identifikation weiterer SNPs im Kopplungsungleichgewicht mit einem gegebenen SNP umfasst: (a) Amplifizieren eines Fragments von der genomischen Region, die einen ersten SNP umfasst oder umgibt, von einer Vielzahl an Individuen; (b) Identifizieren zweiter SNPs in der genomischen Region, die besagten ersten SNP umgibt oder beherbergt; (c) Durchführung einer Kopplungsungleichgewichtsanalyse zwischen besagtem ersten SNP und zweiten SNPs; und (d) Auswahl besagter zweiter SNPs, wenn sie im Kopplungsungleichgewicht mit besagtem ersten Marker sind. Unterkombinationen, die Schritte (b) und (c) umfassen, kommen ebenfalls in Betracht.
  • Verfahren zur Identifizierung von SNPs und zur Durchführung einer Analyse des Kopplungsungleichgewichts können vom Fachmann ohne weiteres unter Anwendung weit bekannter Verfahren durchgeführt werden.
  • Diese SNPs im Kopplungsungleichgewicht können ebenfalls in Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und spezieller in Diagnoseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Zum Beispiel ist ein Kopplungslocus von Morbus Crohn in einer großen Region, die sich 18 cM auf Chromosom 5q31 erstreckt, kartiert worden (Rioux et al., 2000 und 2001). Unter Verwendung dichter Karten von Mikrosatelliten-Markern und SNPs über die gesamte Region wurde ein starker Hinweis auf ein Kopplungsungleichgewicht (LD) gefunden. Nachdem ein Hinweis auf ein LD gefunden wurde, entwickelten die Autoren eine ultra-hochdichte SNP-Karte und untersuchten eine dichtere Kollektion von Markern, die aus dieser Karte ausgewählt wurden. Multilocus-Analysen definierten einen einzigen allgemeinen Risiko-Haplotyp, der durch mehrfache SNPs gekennzeichnet war, die jeweils unabhängig voneinander unter Verwendung von TDT assoziiert waren. Diese SNPs waren für den Risiko-Haplotyp einzigartig und in ihrem Informationsgehalt aufgrund ihres fast vollständigen LD miteinander im Wesentlichen identisch. Die äquivalenten Eigenschaften dieser SNPs machen die Identifizierung der kausalen Mutation innerhalb dieser Region basierend auf ausschließlich eines genetischen Anzeichens unmöglich.
  • Kausale Mutation
  • Mutationen in dem PITX1-Gen, die für Autismus oder eine assoziierte Störung verantwortlich sind, können durch Vergleich der Sequenzen des PITX1-Gens von Patienten, die Autismus oder eine assoziierte Störung aufweisen, mit den entsprechenden Sequenzen von Kontrollpersonen identifiziert werden. Basierend auf dem identifizierten Zusammenhang zwischen SNPs von PITX1 und Autismus oder einer assoziierten Störung, kann der Locus auf Mutationen abgesucht werden. In einer bevorzugten Anwendungsform werden funktionelle Regionen, wie Exons, Spleißstellen, Promotoren und andere regulatorische Regionen des PITX1-Gens auf Mutationen abgesucht. Vorzugsweise Patienten, die Autismus oder eine assoziierte Störung aufweisen, tragen die Mutation, von der eine Verknüpfung mit Autismus oder einer assoziierten Störung gezeigt worden ist, und Kontrollpersonen tragen keine mit Autismus oder einer assoziierten Störung in Verbindung stehende Mutation oder Allel. Es könnte ebenfalls möglich sein, dass Patienten, die Autismus oder eine assoziierte Störung aufweisen, die Mutation, von der eine Verknüpfung mit Autismus oder einer assoziierten Störung gezeigt worden ist, mit einer höheren Häufigkeit als Kontrollpersonen tragen.
  • Das für den Nachweis derartiger Mutationen angewandte Verfahren umfasst im Allgemeinen die folgenden Schritte: Amplifikation einer Region des PITX1-Gens, umfassend einen SNP oder eine Gruppe von SNPs, die mit Autismus oder einer assoziierten Störung verknüpft sind, von DNA-Proben des PITX1-Gens von Patienten, die Autismus oder eine assoziierte Störung aufweisen, und Kontrollpersonen; Sequenzierung der amplifizierten Region; Vergleich von DNA-Sequenzen des PITX1-Gens von Patienten, die Autismus oder eine assoziierte Störung aufweisen, und Kontrollpersonen; Bestimmung von Mutationen, die für Patienten mit Autismus oder einer assoziierten Störung spezifisch sind.
  • Deshalb kann die Identifizierung einer kausalen Mutation in dem PITX1-Gen von einem Fachmann ohne weiteres mit Hilfe weit bekannter Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel sind in den folgenden Beispielen die kausale Mutationen mit Hilfe von Routineverfahren identifiziert worden.
  • Hugot et al. (2001) wandte eine Positionsklonierungsstrategie an, um Genvarianten mit einer Anfälligkeit für Morbus Crohn in einer Region von Chromosom 16 zu identifizieren, von der bereits festgestellt worden ist, dass sie mit einer Anfälligkeit für Morbus Crohn in Verbindung steht. Um die Position des potentiellen Anfälligkeitslocus genauer zu bestimmen, wurden 26 Mikrosatellitenmarker gentypisiert und auf eine Assoziation mit Morbus Crohn mit Hilfe des Transmission-Disequilibrium-Test getestet. Eine grenzsignifikante Assoziation wurde zwischen einem Allel des Mikrosatellitenmarkers D16S136 festgestellt. Elf weitere SNPs wurden von den umgebenden Regionen ausgewählt und mehrere SNPs zeigten eine signifikante Assoziation. Es wurde festgestellt, dass SNP5-8 von dieser Region in einem einzigen Exon des NOD2/CARD15-Gens vorhanden waren und von denen gezeigt wurde, dass sie nicht-synonyme Varianten waren. Dies veranlasste die Autoren, die vollständige codierende Sequenz dieses Gens in 50 MC-Patienten zu sequenzieren. Es wurden zwei weitere nicht-synonyme Mutationen (SNP12 und SNP13) gefunden. SNP13 war der am signifikanteste assoziierte SNP (p = 6 × 10–6) bei Anwendung des Pedigree-Transmission-Disequilibrium-Tests. In einer anderen unabhängigen Studie wurde die gleiche Variante durch Sequenzieren der codierenden Region dieses Gens von 12 affizierten Individuen bei einem Vergleich mit 4 Kontrollen ebenfalls gefunden (Ogura et al., 2001). Das seltene Allel von SNP 13 entsprach einer 1-bp Insertion, von der vorhergesagt wurde, dass sie das NOD2/CARD15-Protein verkürzt. Dieses Allel war ebenfalls in normalen gesunden Individuen vorhanden, wenn auch mit einer signifikant geringeren Häufigkeit verglichen mit den Kontrollen.
  • Ähnlicherweise führten Lesage et al. (2002) eine Mutationsanalyse von CARD15 mit 453 Patienten mit MC, die 166 sporadische und 287 familiäre Fälle umfassten, mit 159 Patienten mit ulzerativer Colitis (UC) und 103 gesunden Kontrollpersonen mittels einer systematischen Sequenzierung der codierenden Region durch. Von 67 identifizierten Sequenzvariationen besaßen 9 eine Allelhäufigkeit > 5% in Patienten mit MC. Sechs von diesen wurden als Polymorphismen erachtet und bei dreien (SNP12-R702W, SNP8-G908R und SNP13-1007fs) wurde bestätigt, dass sie mit einer Anfälligkeit für MC unabhängig voneinander assoziiert waren. Ebenfalls als potentiell krankheitsauslösende Mutationen (DCMs) wurden weitere 27 seltene Mutationen erachtet. Die drei Hauptvarianten (R702W, G908R und 1007fs) repräsentierten 32%, 18% beziehungsweise 31% der gesamten MC-Mutationen, wohingegen die gesamten 27 seltenen Mutationen 19% der DCMs repräsentierten. Insgesamt waren 93% der Mutationen in dem distalen Drittel des Gens lokalisiert. Es wurde keine Mutation festgestellt, die mit UC assoziiert war. Im Gegenteil 50% der Patienten mit MC trugen wenigstens eine DCM, einschließlich 17%, die eine doppelte Mutation besaßen.
  • Arzneimittel-Durchmusterung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls neuartige Ziele und Verfahren für die Durchmusterung von Arzneimittel- oder Wirkstoffkandidaten bereit. Die Verfahren umfassen Bindungsassays und/oder funktionelle Assays und können in vitro, in Zellsystemen, in Tieren, etc. durchgeführt werden.
  • Ein spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Auswahl von Verbindungen, die gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung aktiv sind, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen in vitro einer Testverbindung mit einem PITX1-Gen oder Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung und die Untersuchung des Vermögens besagter Testverbindung, besagtes PITX1-Gen oder -Polypeptid zu binden, umfasst. Das Binden an besagtes Gen oder Polypeptid liefert einen Hinweis auf das Vermögen der Verbindung, die Aktivität besagten Ziels zu modulieren, und folglich einen Stoffwechselweg zu beeinflussen, der zu Autismus, zu einer Störung des autistischen Spektrums oder zu einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten führt. In einer bevorzugten Anwendungsform umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen in vitro einer Testverbindung mit einem PITX1-Polypeptid oder Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung und die Untersuchung des Vermögens besagter Testverbindung, besagtes PITX1-Polypeptid oder Fragment zu binden. Das Fragment umfasst bevorzugt eine Bindungsstelle des PITX1-Polypeptids. Bevorzugt ist besagtes PITX1-Gen oder -Polypeptid oder Fragment davon ein verändertes oder mutiertes PITX1-Gen oder -Polypeptid oder Fragment davon, das die Veränderung oder Mutation umfasst.
  • Ein spezieller Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Auswahl von Verbindungen, die gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung aktiv sind, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen in vitro einer Testverbindung mit einem PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung oder einem die Bindungsstelle enthaltenden Fragment davon und die Untersuchung des Vermögens besagter Testverbindung, besagtes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon zu binden, umfasst. Bevorzugt ist besagtes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon ein verändertes oder mutiertes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon, das die Veränderung oder Mutation umfasst.
  • In einer weiteren speziellen Anwendungsform umfasst das Verfahren das Inkontaktbringen einer rekombinanten Wirtszelle, die ein PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, mit einer Testverbindung und die Untersuchung des Vermögens besagter Testverbindung, besagtes PITX1 zu binden und die Aktivität des PITX1-Polypeptids zu modulieren. Bevorzugt ist besagtes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon ein verändertes oder mutiertes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon, das die Veränderung oder Mutation umfasst.
  • Die Untersuchung der Bindung kann mit verschiedenen Methoden, wie durch Markieren der Testverbindung, durch Konkurrenz mit einem markierten Referenzliganden, etc. durchgeführt werden.
  • Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Auswahl von Verbindungen, die gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung aktiv sind, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen in vitro einer Testverbindung mit einem PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung und die Untersuchung des Vermögens besagter Testverbindung, die Aktivität besagten PITX1-Polypeptids zu modulieren, umfasst. Bevorzugt ist besagtes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon ein verändertes oder mutiertes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon, das die Veränderung oder Mutation umfasst.
  • Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Auswahl von Verbindungen, die gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung aktiv sind, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen in vitro einer Testverbindung mit einem PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung und die Untersuchung des Vermögens besagter Testverbindung, die Expression besagten PITX1-Gens zu modulieren, umfasst. Bevorzugt ist besagtes PITX1-Gen oder Fragment davon ein verändertes oder mutiertes PITX1-Gen oder Fragment davon, das die Veränderung oder Mutation umfasst.
  • In einer anderen Anwendungsform betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Durchmusterung, Auswahl oder Identifizierung von aktiven Verbindungen, speziell von Verbindungen, die gegen Autismus, eine Störung des autistischen Spektrums oder eine mit Autismus assoziierte Störung aktiv sind, wobei besagtes Verfahren das Inkontaktbringen einer Testverbindung mit einer ein Reporterkonstrukt umfassenden rekombinanten Wirtszelle, wobei besagtes Reporterkonstrukt ein Reportergen unter der Kontrolle von einem PITX1-Genpromotor umfasst, und Auswahl der Testverbindungen, die die Expression des Reportergens modulieren (z. B. stimulieren oder reduzieren), umfasst. Bevorzugt ist besagter PITX1-Genpromotor oder Fragment davon ein veränderter oder mutierter PITX1-Genpromotor oder Fragment davon, der/das die Veränderung oder Mutation umfasst.
  • In einer speziellen Anwendungsform der Durchmusterungsverfahren ist die Modulation eine Inhibierung. In einer anderen speziellen Anwendungsform der Durchmusterungsverfahren ist die Modulation eine Aktivierung.
  • Die obigen Durchmusterungsassays können in jeder beliebigen geeigneten Vorrichtung, wie Platten, Röhrchen, Schalen, Kolben, etc. ausgeführt werden. Üblicherweise wird der Assay in Platten mit mehreren Vertiefungen durchgeführt. Mehrere Testverbindungen können parallel getestet werden. Außerdem kann die Testverbindung unterschiedlichen Ursprungs, unterschiedlicher Natur und Zusammensetzung sein. Sie kann jede beliebige organische oder anorganische Substanz, wie ein Lipid, Peptid, Polypeptid, Nukleinsäure, kleines Molekül, etc., in isolierter Form oder als Gemisch mit anderen Substanzen, sein. Die Verbindungen können zum Beispiel die gesamte oder Teil einer kombinatorischen Bibliothek von Produkten sein.
  • PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG, THERAPIE
  • Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend (i) ein PITX1-Polypeptid oder ein Fragment davon, eine Nukleinsäure, die ein PITX1-Polypeptid codiert, oder ein Fragment davon, einen Vektor oder eine rekombinante Wirtszelle, wie sie oben beschrieben sind, und (ii) einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikulum.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, wobei das Verfahren das Verabreichen eines funktionsfähigen (z. B. Wildtyp) PITX1-Polypeptids oder einer dasselbe codierenden Nukleinsäure an besagten Patienten umfasst.
  • Eine andere Anwendungsform dieser Erfindung beruht in einem Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten, wobei das Verfahren das Verabreichen an besagten Patienten einer Verbindung umfasst, die die Expression oder Aktivität eines PITX1-Gens oder -Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung moduliert, vorzugsweise aktiviert oder imitiert. Besagte Verbindung kann ein Agonist oder Antagonist von PITX1, eine Antisense-RNAi von PITX1, ein Antikörper oder ein Fragment oder ein Derivat davon sein, der/das für ein PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung spezifisch ist. In einer speziellen Anwendungsform des Verfahrens ist die Modulation eine Inhibition. In einer anderen speziellen Anwendungsform des Verfahrens ist die Modulation eine Aktivierung.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls allgemein die Verwendung eines funktionsfähigen PITX1-Polypeptids, einer dasselbe codierenden Nukleinsäure oder einer Verbindung, welche(s) die Expression oder Aktivität eines PITX1-Gens oder -Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung moduliert, in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung in einem Patienten. Besagte Verbindung kann ein Agonist oder Antagonist von PITX1, eine Antisense-RNAi von PITX1, ein Antikörper oder ein Fragment oder ein Derivat davon sein, der/das für ein PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung spezifisch ist. In einer speziellen Anwendungsform des Verfahrens ist die Modulation eine Inhibition. In einer anderen speziellen Anwendungsform des Verfahrens ist die Modulation eine Aktivierung.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt die Korrelation zwischen Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung und dem PITX1-Genlocus. Die Erfindung stellt folglich ein neuartiges Ziel für eine therapeutische Intervention bereit. Verschiedene Versuchsansätze können in Erwägung gezogen werden, um die PITX1-Aktivität oder -Funktion in einem Patienten wiederherzustellen oder zu modulieren, insbesondere in denjenigen, die einen veränderten PITX1-Genlocus tragen. Es wird vermutet, dass eine Übertragung der Wildtyp-Funktion auf derartige Patienten, eine Phänotypexpression von Autismus, Störungen des autistischen Spektrums oder mit Autismus assoziierten Störungen in einer kranken Zelle oder einem kranken Organismus supprimiert. Die Übertragung einer derartigen Funktion kann durch eine Gen- oder Proteintherapie oder durch Verabreichen von Verbindungen erfolgen, die die PITX1-Polypeptidaktivität modulieren oder imitieren (z. B. wie in den obigen Durchmusterungsassys identifizierte Agonisten).
  • Das Wildtyp PITX1-Gen oder ein funktionsfähiger Teil davon kann in die Zellen des Patienten, der dieses benötigt, unter Verwendung eines wie oben beschriebenen Vektors eingeführt werden. Der Vektor kann ein viraler Vektor oder ein Plasmid sein. Das Gen kann ebenfalls als nackte DNA eingeführt werden. Das Gen kann so bereitgestellt werden, dass es sich in das Genom der Empfängerwirtszellen integriert oder dass es extrachromosomal bleibt. Eine Integration kann zufällig oder an genau definierten Stellen, wie durch eine homologe Rekombination, erfolgen. Insbesondere kann eine funktionstfähige Kopie des PITX1-Gens als Ersatz für eine veränderte Version in einer Zelle mittels homologer Rekombination inseriert werden. Weitere Methoden umfassen die Gen-Kanone, Liposomen-vermittelte Transfektion, kationisches Lipid-vermittelte Transfektion, etc. Eine Gentherapie kann mittels direkter Gen-Injektion oder mittels Verabreichen ex vivo präparierter und gentechnisch veränderter Zellen, die ein funktionsfähiges PITX1-Polypeptid exprimieren, durchgeführt werden.
  • Andere Moleküle mit einer PITX1-Aktivität (z. B. Peptide, Arzneimittel, PTX1-Agonisten oder organische Verbindungen) können ebenfalls für eine Wiederherstellung einer funktionellen PITX1-Aktivität in einem Patienten oder für eine Suppression des schädlichen Phänotyps in einer Zelle verwendet werden.
  • Eine Wiederherstellung einer funktionellen PITX1-Genfunktion in einer Zelle kann genutzt werden, um die Entwicklung von Autismus, einer Störung des autistischen Spektrums oder einer mit Autismus assoziierten Störung zu verhindern oder die Progression von besagter Krankheit zu verringern. Eine derartige Behandlung kann den Autismus assoziierten Phänotyp einer Zelle, insbesondere derjenigen Zellen, die ein schädliches Allel tragen, supprimieren.
  • Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden im nachfolgenden Beispielteil offen gelegt, der als eine Veranschaulichung und nicht als Beschränkung des Rahmens der vorliegenden Anmeldung betrachtet werden soll.
  • GEN, VEKTOREN, REKOMBINANTE ZELLEN UND POLYPEPTIDE
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung beruht in neuartigen Produkten für eine Verwendung in Diagnose, Therapie oder Durchmusterung. Diese Produkte umfassen Nukleinsäure-Moleküle, die ein PITX1-Polypeptid oder ein Fragment davon codieren, Vektoren, die dieselben umfassen, rekombinante Wirtszellen und exprimierte Polypeptide.
  • Spezieller betrifft die Erfindung ein verändertes oder mutiertes PITX1-Gen oder Fragment davon, das besagte Veränderung oder Mutation umfasst. Die Erfindung betrifft ebenfalls Nukleinsäure-Moleküle, die ein verändertes oder mutiertes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon codieren, das besagte Veränderung oder Mutation umfasst. Besagte Veränderung oder Mutation modifiziert die PITX1-Aktivität. Die modifizierte Aktivität kann erhöht oder vermindert sein. Die Erfindung betrifft außerdem einen Vektor, der ein verändertes oder mutiertes PITX1-Gen oder Fragment davon umfasst, das besagte Veränderung oder Mutation umfasst, oder ein Nukleinsäure-Molekül, das ein verändertes oder mutiertes PITX1-Polypeptid oder Fragment davon codiert, das besagte Veränderung oder Mutation umfasst, rekombinante Wirtszellen und exprimierte Polypeptide.
  • Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Vektor, umfassend eine Nukleinsäure, die ein PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung codiert. Der Vektor kann ein Klonierungsvektor oder bevorzugter ein Expressionsvektor sein, d. h. ein Vektor, umfassend regulatorische Sequenzen, die die Expression eines PITX1-Polypeptids von besagtem Vektor in einer kompetenten Wirtszelle bewirken.
  • Diese Vektoren können verwendet werden, um ein PITX1-Polypeptid in vitro, ex vivo oder in vivo zu exprimieren, um transgene oder „Knock Out" nicht-humane Tiere zu erzeugen, um die Nukleinsäuren zu amplifizieren, um Antisense-RNAs zu exprimieren, etc.
  • Die Vektoren dieser Erfindung umfassen typischerweise eine PITX1 codierende Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit regulatorischen Sequenzen, z. B. einem Promotor, einem polyA, etc, operabel verknüpft ist. Der Ausdruck „operabel verknüpft" gibt an, dass die codierenden und regulatorische Sequenzen funktionsfähig assoziiert sind, so dass die regulatorischen Sequenzen die Expression (z. B. Transkription) der codierenden Sequenzen bewirken. Die Vektoren können außerdem einen oder mehrere Replikationsursprünge und/oder selektierbare Marker umfassen. Die Promotorregion kann bezüglich der codierenden Sequenz homolog oder heterolog sein und kann für eine ubiquitäre, konstitutive, regulierte und/oder Gewebe-spezifische Expression in einer beliebigen Wirtszelle, einschließlich der in vivo Verwendung, sorgen. Beispiele für Promotoren umfassen bakterielle Promotoren (T7, pTAC, Trp-Promotor, etc.), virale Promotoren (LTR, TK, CMV-IE, etc.), Promotoren für Säugergene (Albumin, PGK, etc.) und dergleichen.
  • Der Vektor kann ein Plasmid, ein Virus, ein Cosmid, ein Phage, ein BAC, ein YAC, etc. sein. Plasmidvektoren können aus im Handel erhältlichen Vektoren, wie pBluescript, pUC, pBR, etc., präpariert werden. Virale Vektoren können aus Baculoviren, Retroviren, Adenoviren, AAVs, etc. gemäß in der Technik bekannten rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden.
  • In dieser Hinsicht beruht ein spezieller Gegenstand dieser Erfindung in einem rekombinanten Virus, der ein wie oben definiertes PITX1-Polypeptid codiert. Das rekombinante Virus ist bevorzugt replikationsdefekt, noch bevorzugter aus E1- und/oder E4-defekten Adenviren, gag-, pol- und/oder env-defekten Retroviren und Rep- und/oder Cap-defekten AAVs, ausgewählt. Derartige rekombinante Retroviren können mit in der Technik bekannten Methoden hergestellt werden, wie beispielsweise mittels Transfizieren von Verpackungszellen oder mittels transienter Transfektion mit Helferplasmiden oder -viren. Typische Beispiele für Virus-Verpackungszellen umfassen PA317-Zellen, PsiCRIP-Zellen, GPenv+-Zellen, 293-Zellen, etc. Detaillierte Protokolle zur Herstellung derartiger replikationsdefekter rekombinanter Viren können zum Beispiel in WO95/14785 , WO96/22378 , US5.882.877 , US6.013.516 , US4.861.719 , US5.278.056 und WO94/19478 gefunden werden.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung beruht in einer rekombinanten Wirtszelle, die ein rekombinantes PITX1-Gen oder einen Vektor umfasst, wie sie oben beschrieben sind. Geeignete Wirtszellen umfassen, ohne Beschränkung, prokaryotische Zellen (wie Bakterien) und eukaryotische Zellen (wie Hefezellen, Säugerzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, etc.). Spezifische Beispiele umfassen E. coli, Kluyveromyces- oder Saccheromyces-Hefen, Säugerzelllinien (z. B. Varo-Zellen, CHO-Zellen, 3T3-Zellen, COS-Zellen, etc.) wie auch primäre oder etablierte Säugerzellkulturen (z. B. aus Fibroblasten, Embryozellen, Epithelzellen, Nervenzellen, Adipocyten, etc. hergestellt).
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle, die ein PITX1-Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, wobei besagtes Verfahren umfasst (i) Einführen in vitro oder ex vivo einer wie oben beschriebenen rekombinanten Nukleinsäure oder eines Vektors in eine kompetente Wirtszelle, (ii) Kultivieren in vitro oder ex vivo der erhaltenen rekombinanten Wirtszellen und (iii) gegebenenfalls Selektieren der Zellen, die das PITX1-Polypeptid exprimieren.
  • Derartige rekombinante Wirtszellen können für die Produktion von PITX1-Polypeptiden wie auch für die Durchmusterung aktiver Moleküle verwendet werden, wie es oben beschrieben ist. Derartige Zellen können ebenfalls als ein Modellsystem zur Untersuchung von Autismus verwendet werden. Diese Zellen können in geeigneten Kulturmedien, wie DMEM, RPMI, HAM, etc., in jeder geeigneten Kulturvorrichtung (Platte, Kolben, Schale, Röhrchen, Beutel, etc.) gehalten werden.
  • BEISPIELE
  • 1. GenomeHIP-Plattform für die Identifizierung des Anfälligkeitsgens auf Chromosom 5
  • Die GenomeHIP-Plattform wurde angewandt, um eine schnelle Identifizierung eines Autismus-Anfälligkeitsgen zu ermöglichen.
  • Kurz gefasst: die Technologie besteht in der Bildung von Paaren aus der DNA verwandter Individuen. Jede DNA wird mit einer spezifischen Markierung markiert, die ihre Identifizierung erlaubt. Hybride werden dann zwischen zwei DNAs gebildet. Ein spezielles Verfahren ( WO00/53802 ) wird dann angewandt, das sämtliche Fragmente identical-by-descent (IBD) von zwei DNAs in einem mehrstufigen Verfahren selektiert. Die verbleibende IBD angereicherte DNA wird dann gegen einen BAC-Klon abgeleiteten DNA-Mikroarray bewertet, was die Positionsbestimmung der IBD-Fraktion auf einem Chromosom erlaubt.
  • Die Anwendung dieses Verfahrens bei vielen verschiedenen Familien führt zu einer Matrix von IBD-Fraktionen für jedes Paar von jeder Familie. Mit statistische Analysen werden dann die minimalen IBD-Regionen berechnet, die allen getesteten Familien gemeinsam sind. Signifikante Ergebnisse (p-Werte) sind ein Hinweis für eine Kopplung der positiven Region mit dem Merkmal von Interesse (hier Autismus). Das gekoppelte Intervall kann dann von den beiden am weitesten auseinanderliegenden Klonen, die signifikante p-Werte zeigen, abgegrenzt werden.
  • In der vorliegenden Studie wurden 114 Familien aus den Vereinigten Staaten (114 unabhängige Geschwisterpaare), die bezüglich eines strengen Autismus (wie mit ADI-R definiert) konkordant waren, dem GenomeHIP-Verfahren unterzogen. Die resultierenden IBD angereicherten DNA-Fraktionen wurden dann mit Cy5-Fluoreszenzfarbstoffen markiert und gegen ein DNA-Array hybridisiert, das aus 2263 BAC-Klonen bestand, die das gesamte menschliche Genom mit einem mittleren Intervall von 1,2 Megabasenpaaren abdeckten. Nicht-selektierte, mit Cy3 markierte DNA wurde für eine Normalisierung der Signalwerte und der Berechnung der Verhältnisse für jeden Klon eingesetzt. Eine Cluster-Bildung der Verhältnisergebnisse wurde dann durchgeführt, um den IBD-Status für jeden Klon und jedes Paar zu bestimmen.
  • Mit Hilfe der Anwendung dieses Verfahrens wurden mehrere BAC-Klone identifiziert (BACA19ZB03, BACA16ZG06, BACA4ZA08 und BACA11ZF12), die sich ungefähr 1,5 Megabasen in der Region auf Chromosom 5 erstreckten (Basen 134 095 595 bis 135 593 528), die einen signifikanten Hinweis auf eine Kopplung mit Autismus zeigten (p < 6,40E-07).
  • Tabelle 2: Kopplungsergebnisse für Chromosom 5 in dem PITX1-Locus: Es ist die Region angegeben, die mit 4 BAC-Klonen mit einem Hinweis auf eine Kopplung übereinstimmt. Die Anfangs- und Endpositionen der Klone stimmen mit ihren Genompositionen basierend auf NCBI Build34 bezüglich des Anfangs des Chromosoms (p-ter) überein. Tabelle 2
    Humanes Chromosom Klone Anfang Ende Verhältnis der informativen Paare p-Wert
    5 BACA19ZB03 134 095 595 134 095 947 0,9 0,00078
    5 BACA16ZG06 134 467 773 134 639 876 0,91 1,60E-05
    5 BACA4ZA08 134 467 793 134 639 841 0,93 6,40E-07
    5 BACA11ZF12 135 422 346 135 593 528 0,9 0,00011
  • 2. Identifizierung eines Autismus-Anfälligkeitsgens auf Chromosom 5
  • Mittels Durchmusterung der zuvor erwähnten 1,5 Megabasen in der gekoppelten Chromosomenregion identifizierten wir das Hypophysen-Hombobox-Transkriptionsfaktor 1-(PITX1)-Gen als einen Kandidaten für Autismus und verwandte Phänotypen. Dieses Gen ist in der Tat in dem kritischen Intervall mit einem Hinweis auf eine Kopplung vorhanden und von den oben grob dargestellten Klone abgegrenzt.
  • Das PITX1-Gen codiert ein Mitglied der RIEG/PITX-Homöobox-Familie, eine expandierende Familie von Bicoid-verwandten Homöobox-Genen von Vertebraten. Mitglieder dieser Familie sind an der Organentwicklung, insbesondere Gehirn und Facies sowie links-rechts-Asymmetrie, beteiligt. Lamonerie et al. (1996) klonierten und charakterisierten ein Transkriptionsfaktor-Gen der Maus (von ihnen als Ptx1 bezeichnet) basierend auf dessen Fähigkeit, die Transkription des Proopiomelanocortin-Gens (POMC) in der Hypophyse zu aktivieren. Sechs Hormone sind von dem POMC-Gen abgeleitet: ACTH, Lipotropin, alpha-MSH, beta-MSH, Endorphin und ein weiteres. ACTH und beta-Lipotropin (beta-LPH) stammen von einem größeren Vorläufer-Peptid ab. Von jedem dieser Hormone ist bekannt, dass es kleinere Peptide mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten umfasst: alpha-Melanotropin (alpha-MSH) und Corticotropin-like intermediate Lobe Peptid (CLIP) werden aus ACTH gebildet; gamma-LPH und beta-Endorphin sind Peptidkomponenten von beta-LPH. Beta-MSH ist in gamma-LPH enthalten.
  • Die PTX1, PTX2 und PTX3-Gene definieren eine neue Familie von Transkriptionsfaktoren, die PTX-Unterfamilie, innerhalb der paired-like Klasse von Homöodomänenfaktoren. In Mäusen ist die Ptx1 und Ptx2-Genexpression im Areal der primordialen Hypophyse detektiert worden und wird über die Entwicklung in der Rathke Tasche und adulten Hypophyse aufrechterhalten. Pellegrini-Bouiller et al. (1999) zeigten die Expression der PTX1, PTX2 und PTX3-Gene in der normalen humanen Hypophyse und in verschiedenen humanen Hypophysen-Adenoma.
  • Tremblay et al. (1998) berichteten, dass die meisten Hypophysenhormon-codierenden Genpromotoren durch Ptx1 aktiviert werden und deshalb scheint Ptx1 ein allgemeiner Regulator der Hypophysen-spezifischen Transkription zu sein. Zusätzlich wird die Ptx1-Wirkung durch Zell-beschränkte Transkriptionsfaktoren synergistisch verstärkt und verleiht eine Promotorspezifische Expression. Experimente mit Antisense-RNA, durchgeführt in alphaT3-1-Zellen, die das alphaGSU-Gen exprimieren, zeigten, dass die Expression von endogenem alphaGSU stark abhängig von Ptx1 ist, wohingegen viele andere Gene nicht beeinflusst werden. Das einzige andere Gen, von dem festgestellt wurde, dass von Ptx1 für eine Expression stark abhängig ist, war das Gen für den Lim3/Lhx3-Transkriptionsfaktor. Folglich liegt Ptx1 stromaufwärts von Lim3/Lhx3 in einer Kaskade von Regulatoren, die in einem kombinatorischen Code zu arbeiten scheinen, um die Hypophysen-, Lineage- und Promotor-spezifische Transkription zu steuern.
  • Shapiro et al. (2004) beschrieben natürlich vorkommende Varianten in regulatorischen Regionen von PITX1 im Stichling, die zu verschiedenen PITX1-Genexpressionsmustern und funktionellen Unterschieden in Beckenanatomie führen. Sie betonen, dass regulatorische Regionen von Homöobox-Genen wie PITX1 in zahlreichen weit auseinanderliegenden Stellen und bis zu mehreren 100 Kilobasen von dem Gen entfernt gefunden werden können.
  • Szeto et al. (1999) stellten fest, dass Pitx1-deletierte Mäuse auffallende Anomalien bei Morphogenese und Wachstum der Hinterläufe zeigten. Mäuse, die für die Pitx1-gerichtete Mutation homozygot sind, sterben unmittelbar oder kurz nach der Geburt. Eine kleine Anzahl an Pitx1-null Mäuse zeigen eine embryonale Letalität nach E11.5. Der Hinterlauf von Pitx1 -null Mäusen ist signifikant kürzer. Die Größe des Beckens ist ebenfalls deutlich verringert. Eine Untersuchung der Expression von Thyroid-stimulierendem Hormonβ, luteinisierendem Hormonβ und der gewöhnlichen Glycoprotein alpha-Untereinheit lässt vermuten, dass sowohl die Anzahl an gonadotropen als auch thyreotropen Hormonen wie auch der Level an luteinisierendem Hormonβ und Thyroid-stimulierendem Hormonβ-Transkripten und Protein in den einzelnen Zellen vermindert sind. Interessanterweise ist der Level an TSHβ-Transkripten am stärksten in der thyreotropen Population der rostralen Spitze verringert, die kein Pit-1 für eine TSHβ-Genaktivierung benötigt. Die Expression von Wachstumshormon erscheint unverändert, wohingegen die Anzahl und Expressionslevels des POMC-Gens bei den Hypophysenzwischenlappen melanotropen Hormonen zwischen E15,5 und P0 normal zu sein scheint. Es besteht eine übereinstimmende Zunahme bei den Levels sowohl der Anzahl an ACTH-Iranskripten als auch der ACTH-Peptidlevels der corticotropen Hormone in dem vorderen Hypophysenlappen.
  • Chamberlain und Herman (1990) schlugen ein neuartiges biochemisches Modell vor, in dem eine Untergruppe autistischer Individuen eine Hypersekretion von pinealem Melatonin aufweisen können, was eine Kaskade biochemischer Effekte auslöst, einschließlich einer entsprechenden Hyposekretion von Hypophysen-Proopiomelanocortin-(POMC)-Peptiden und einer Hypersekretion von Hypothalamus-Opioidpeptiden und Serotonin (5-HT). Autismus kann eine Dysfunktion in der Pinea-Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinde-Achse widerspiegeln, die die POMC- und 5-HT-Systeme des Gehirns moduliert. Dieses Modell stimmt mit zahlreichen klinischen Forschungen überein, die eine Hypersekretion von 5-HT- und Opioidpeptiden im Gehirn bei Autismus in einen Zusammenhang bringen.
  • Curin et al. (2003) stellten fest, dass Individuen mit Autismus signifikant geringere Serumkonzentrationen von Cortisol (p < 10–6) und signifikant höhere ACTH-Konzentrationen (p = 0,002) aufweisen als Kontrollpersonen gleichen Alters und gleichen Geschlechts. Ebenfalls waren die Prolactin-Konzentrationen in autistischen Patienten mit Epilepsie signifikant höher, wenn sie mit normalen Patienten verglichen wurden. Die beobachteten Hormonveränderungen stimmen mit einer Dysfunktion der Hypothalamus-Hypophysen-Nebermierenrinde-Achse in Individuen mit Autismus überein.
  • 3. Assoziationsstudie
  • Die gleichen Familien, die für die Kopplungsstudie verwendet worden sind, wurden ebenfalls für einen Test auf eine Assoziation zwischen einem in Frage kommenden spezifischen Phänotyp (hier Autismus) und dem genetischen Marker-Allel oder der Haplotypen, die ein spezifisches Marker-Allel enthalten, mit dem Transmission-Disequilibrium-Test (TDT) verwendet. Der TDT ist ein aussagekräftiger Assoziationstest, da er für Populationsstratifaktionsprobleme in der getesteten Probe nicht empfindlich ist. Zusammengefasst, es wird die Segregation von Allelen von heterozygoten Eltern bei ihren affizierten Nachkommen getestet. Der Anteil von Allelen, die auf die affizierten Nachkommen verglichen mit den nichtübertragenen Allelen übertragen wird, wird mit dem Verhältnis verglichen, das bei einer Zufallsverteilung erwartet wird. Eine signifikant höhere Allelübertragung über dem erwarteten Wert ist ein Anzeichen für eine Assoziation des jeweiligen Allels oder Haplotyps mit dem untersuchten Autismusphänotyp.
  • Ein alternativer Test ist der Pedigree-Disequilibrium-Test (PDT), der aussagekräftig bleibt, selbst wenn es eine Fehlklassifizierung von nicht affizierten Individuen kommt (Martin et al. 2000). Simulationen lassen vermuten, dass eine Anwendung des PDT von Vorteil sein kann, selbst wenn die Daten aus unabhängigen Familien ohne umfassende familiäre Informationen stammen.
  • Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass bestimmte Allele des PITX1-Gens positiv mit Autismus assoziiert sind und deshalb die Anfälligkeit für diese Krankheit erhöhen. In der getesteten Population ist das Allel G von SNP6 mit Autismus korreliert, wie es mittels TDT (p-Wert = 0,028) und PDT (p-Wert = 0,0044) bestimmt wurde. Im Gegensatz hierzu wird das Allel T von SNP6 signifikant weniger auf autistische Individuen übertragen, was zeigt, dass dieses Allel vor der Krankheit schützen hilft.
  • Beispiele für die Übertragung der Allele auf Autisten sind in Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3
    Art des Tests SNP Allel Häufigkeit, mit der das Allel auf Autisten übertragen wird Häufigkeit, mit der das Allel auf Autisten nicht übertragen wird (Anmerkung 1) p-Wert
    TDT SNP6 G 0,75 0,63 0,028
    TDT SNP6 T 0,25 0,37 0,028
    PDT SNP6 G 0,71 0,0044
    PDT SNP6 T 0,29 0,0044
    • Tabelle 3, Anmerkung 1: Die Häufigkeit in dieser Spalte für den PDT-Test ist die Populationshäufigkeit
  • Zusätzlich wurden für SNP1, SNP3, SNP4, SNP6, SNP7, SNP21 und SNP22 Haplotypen konstruiert, um die Phase für alle SNPs zu identifizieren.
  • Die Ergebnisse dieser Analyse in der getesteten Population zeigte, dass bestimmte Haplotypen, die alle durch das Vorhandensein von Allel G bei SNP6 gekennzeichnet waren, stark mit Autismus assoziiert sind, während bestimmte Haplotypen ohne Allel G vorzugsweise nicht auf Autisten übertragen werden. Ein Beispiel ist der Haplotyp A-G-A für SNP3-SNP6-SNP22, p = 3,68 × 10–5. Haplotypen, die Allel T anstatt Allel G bei SPN6 tragen, zeigen eine signifikante Unterrepräsentanz in autistischen Patienten. Ein Beispiel ist der Haplotyp A-T-A für SNP3-SNP6-SNP22, p = 0,000218.
  • Eine bevorzugte Übertragung bestimmter Haplotypen wurde ebenfalls durch die Berechnung des Chancenverhältnisses gezeigt. Ein Chancenverhältnis von größer als 1 bedeutet, dass das getestete Gen-Allel mit der Krankheit assoziiert ist und deshalb das Allel die Anfälligkeit für die Krankheit erhöht. Es liegt eine negative Assoziation vor, wenn das Chancenverhältnis kleiner als 1 ist, was zeigt, dass das getestete Gen-Allel vor der Krankheit zu schützen hilft. Zum Beispiel ist für die Übertragung des Haplotyps A-G-G für SNP3-SNP6-SNP22 4,32, mit p = 3,62 × 10–5.
  • Beispiele für Haplotypen mit einer bevorzugten Übertragung und Nichtübertragung von SPN6 auf Autisten sind in Tabelle 4 angeführt. Tabelle 4
    Für die Konstruktion des Haplotyps verwendeten SNPs Haplotyp Häufigkeit, mit der der Haplotyp auf Autisten übertragen wird Häufigkeit, mit der der Haplotyp auf Autisten nicht übertragen wird p-Wert
    SNP3-SNP6 A-G 0,509 0,347 0,008032
    SNP3-SNP6 A-T 0,074 0,209 0,001418
    SNP4-SNP6-SNP7 C-G-G 0,339 0,1491 0,000739
    SNP4-SNP6-SNP7 C-T-A 0 0,0590 0,001157
    SNP3-SNP6-SNP22 A-G-A 0,433 0,1824 3,68E-05
    SNP3-SNP6-SNP22 A-T-A 0,050 0,2098 0,000218
    SNP3-SNP6-SNP21 A-G-G 0,418 0,1793 3,62E-05
    SNP3-SNP6-SNP21 A-T-G 0,068 0,1825 0,005894
    SNP 1-SNP6-SNP22 C-G-A 0,410 0,1998 0,000619
    SNP1-SNP6-SNP22 C-T-A 0,058 0,2095 0,000548
  • Um den Informationsgehalt zu erhöhen und das Assoziationsintervall einzuschränken, wurde die SNP-Dichte in dem PITX1-Gen auf ungefähr ein SNP je 2,5 kb erhöht. Mehrere zusätzliche Marker zeigten positive Einzelpunktergebnisse in dem PITX1-Gen. Die stärkste Assoziation wurde für Marker SNP33 beobachtet, wobei Allel 1 häufiger auf Autisten übertragen wurde als durch Zufall erwartet wurde, während Allel 2 bevorzugt nicht auf Autisten übertragen wurde (p = 0,001674). Interessanterweise ist dieser Marker mit SNP6 identisch, welcher bereits in der vorherigen Analyse als assoziiert erkannt wurde. Beispiele für auf Autisten übertragene und nichtübertragene Allele sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
    Marker Allel N übertragen N nicht übertragen p-Wert
    SNP25 1 55 84 0,013903
    SNP25 2 84 55 0,013903
    SNP26 1 100 71 0,026576
    SNP26 2 71 100 0,026576
    SNP27 1 98 70 0,030754
    SNP27 2 70 98 0,030754
    SNP31 1 100 62 0,002831
    SNP31 2 62 100 0,002831
    SNP32 1 19 40 0,006258
    SNP32 2 40 19 0,006258
    SNP33 1 101 61 0,001674
    SNP33 2 61 101 0,001674
    SNP35 1 15 31 0,018321
    SNP35 2 31 15 0,018321
  • Haplotypen wurden ebenfalls konstruiert, um die Phase zu bestimmen, und auf eine Assoziation in dem vollständigen Probensatz untersucht, der für eine wie oben beschriebene Kopplungsanalyse eingesetzt wurde. Die Ergebnisse dieser Analyse in der getesteten Population zeigten, dass bestimmte Haplotypen fest mit Autismus assoziiert sind, die alle durch das Vorhandensein von Allel 2 bei Marker SNP25, Allel 1 bei Marker SNP27, Allel 1 bei Marker SNP29, Allel 1 bei Marker SNP31 oder beziehungsweise Allel 1 bei Marker SNP33 gekennzeichnet sind. Das signifikanteste Ergebnis wurde für Haplotyp 1-2-1 für die Marker SNP24, SNP25 und SNP40 mit einem p-Wert von 2,24 x 10403 erhalten. Während bestimmte Haplotypen, die durch Allel 1 bei Marker SNP25, Allel 2 bei Marker SNP27 oder beziehungsweise Allel 2 bei Marker SNP40 gekennzeichnet sind, vorzugsweise nicht auf Autisten übertragen werden.
  • Beispiele für Haplotypen mit einer bevorzugten Übertragung und Nichtübertragung auf Autisten von dem vollständigen Datensatz sind in Tabelle 6 gegeben.
    Figure 00480001
    Figure 00490001
    N: Anzahl, T: übertragene Haplotypen, NT: nichtübertragene Haplotypen
  • Dieser Familiensatz umfasst Proben von verschiedenen ethnischen Gruppen, die in der Bevölkerung der USA vertreten sind. Um jegliche Populationsstratifikationseffekte auszugleichen, wurde die Haplotyp-Analyse für jede ethnische Gruppe wiederholt. Eine signifikante Assoziation wurde für mehrere Haplotypen in der kaukasischen Population festgestellt. Ein Beispiel für einen Haplotyp, der häufiger auf Autisten übertragen wird, ist Haplotyp 1-2-1 für Marker SNP23, SNP25 und SNP33 (p = 4,44 × 10–3), während Haplotyp 1-2-2 für Marker SNP25, SNP29 und SNP31 bevorzugt auf Autisten nicht übertragen wurde (p = 0,006).
  • Beispiele für Haplotypen mit einer bevorzugten Übertragung und Nichtübertragung auf Autisten des Kaukasier-Datensatzes sind in Tabelle 7 gegeben. Tabelle 7
    Figure 00500001
    Figure 00510001
    N: Anzahl, T: auf Autisten übertragene Haplotypen; NT: auf Autisten nichtübertragene Haplotypen
  • Ein zweiter unabhängiger Satz von 167 Trio-Familien (Satz 2) wurde für die Replikation der Assoziation untersucht, die in den Familien beobachtet wurde, die einen Anhaltspunkt für eine Kopplung (Satz 1), wie oben beschrieben, liefern.
  • Da dieser zweiter Familiensatz (Satz 2) ebenfalls Proben von verschiedenen ethnischen Gruppen, die in der Bevölkerung der USA vertreten sind, wie Satz 1 umfasst, wurde die Haplotyp-Analyse für jede ethnische Gruppe getrennt durchgeführt, um mögliche Populationsstratifikationseffekte auszugleichen. Eine signifikante Assoziation wurde bei einigen Haplotypen in der kaukasischen Population festgestellt, die durch das Vorhandensein der Allele 2, 1, 1, 1 oder 1 für die Marker SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33 gekennzeichnet waren. Ein Beispiel für einen Haplotyp, der häufiger auf Autisten übertragen wird, ist der Haplotyp 2-1-2 für die Marker SNP25, SNP27 und SNP32 (p = 5,93 × 10–3), während der Haplotyp 2-1-2 für die Marker SNP25, SNP26 und SNP27 häufiger auf Autisten nicht übertragen wurde (p = 0,04).
  • Beispiele für Haplotypen mit einer bevorzugten Übertragung und Nichtübertragung auf Autisten von dem Kaukasier-Datensatz im Familiensatz 2 sind in Tabelle 8 gegeben.
    Figure 00520001
    Figure 00530001
    Figure 00540001
    N: Anzahl, T: übertragene Haplotypen, NT: nichtübertragene Haplotypen
  • Zusammengefasst: eine Haplotyp-Analyse bei Kaukasiern zeigte eine positive Replikation von Haplotyp 2-1-1-1-1 für die Marker SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33 in Satz 2 (p = 3,2 × 10–3 in Satz 1 und p = 6,85 × 10–3 in Satz 2), wie es in Tabelle 9 unten gezeigt ist. Tabelle 9: Haplotyp-Analyse in Kaukasiern in Familien aus Satz 1 und Satz 2.
    Marker SATZ 1 SATZ 2
    SNP25 SNP27 SNP29 SNP31 SNP33 p-Wert T NT p-Wert T NT
    2 1 1 1 1 0,003213 69 50 0,006854 113 89
  • 4. Identifizierung der Nukleotid-Austäusche
  • Bei 96 nichtverwandten affizierten Individuen wurde ein Mutation-Screen durchgeführt. Primer wurden konstruiert, um die codierende Region des PITX1-Gens zu amplifizieren. Die Sequenzen der Primer sind der Tabelle 10 unten zu entnehmen: Tabelle 10
    Vorwärts-Primer Rückwärts-Primer
    Exon 1 SEQ ID NR. 27 SEQ ID NR. 28
    Exon 2 SEQ ID NR. 29 SEQ ID NR. 30
    Exon 3 SEQ ID NR. 31 SEQ ID NR. 32
    Exon 4a SEQ ID NR. 33 SEQ ID NR. 34
    Exon 4b SEQ ID NR. 35 SEQ ID NR. 36
  • Die resultierenden Amplifikationprodukte wurden direkt in einer Richtung mittels Dye-Terminator Sequencing Chemistry sequenziert, um seltene Nukleotid-Austäusche (Mutationen) und Polymorphismen (Allel-Frequenz > 1%) im Gen zu identifizieren.
  • Insgesamt wurden 10 Nukleotid-Austäusche in der codierenden Region des Gens, einschließlich der flankierenden Intron-Regionen in großer Nähe der Spleißstellen nachgewiesen (die Positionen siehe Tabelle 11). Zwei davon führten zu Veränderungen der Aminosäuren in den jeweiligen Codons, wie es in Tabelle 11 erläutert ist.
  • Zwei Deletionen, MUT1 und MUT9, wurden in der untranslatierten Region identifiziert. MUT1 wurde in der 5'-UTR nachgewiesen. Zwei Punktmutationen, MUT2 und MUT3, wurden ebenfalls in der 5'-UTR nachgewiesen. Diese Mutationen könnten einen Effekt auf die Transkriptionsebene der PITX1-RNA besitzen. MUT9 wurde in der 3'-UTR entdeckt und könnte die Stabilität der RNA beeinflussen.
  • Zwei nicht-synonyme Mutationen, MUT6 und MUT7, wurden ebenfalls gefunden, die einen Effekt auf die Funktion des Proteins besitzen könnten Tabelle 11
    ID Nuldeotidposition in SEQ ID NR. 37 Allele Art der Veränderung Variation und Position in SEQ ID NR. 2 Minor-Allel-Frequenz
    MUT1 632–637 632_637del CCGGAG 5'-UTR 25%
    MUT2 696 G/T 5'-UTR 15%
    MUT3 823 A/T 5'-UTR 2%
    MUT4 5397 A/G intronisch 31%
    MUT5 5492 CIA codierend R140R 2%
    MUT6 5970 G/C codierend G299A 33%
    MUT7 5973 T/C codierend L300P 2%
    MUT8 6073 C/T 3'-UTR 9%
    MUT9 6076 6076_6081del GCGCGG 3'-UTR 30%
    MUT10 6100 C/T 3'-UTR 3%
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Claims (20)

  1. Ein in vitro Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Veranlagung zu Autismus oder zu einer Störung des autistischen Spektrums bei einem Patienten, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1 Genlocus in dieser Probe von dem Patienten umfasst.
  2. Ein in vitro Verfahren zum Nachweis des Schutzes vor Autismus oder vor einer Störung des autistischen Spektrums, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1 Genlocus in dieser Probe von dem Patienten umfasst.
  3. Ein in vitro Verfahren zur Bewertung des Ansprechens von einem Patienten auf eine Behandlung von Autismus oder einer Störung des autistischen Spektrums, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1 Genlocus in dieser Probe von dem Patienten umfasst.
  4. Ein in vitro Verfahren zur Bewertung der Nebenwirkung bei einem Patienten auf die Behandlung von Autismus oder einer Störung des autistischen Spektrums, wobei das Verfahren den Nachweis des Vorhandenseins einer Veränderung in dem PITX1 Genlocus in dieser Probe von dem Patienten umfasst.
  5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Vorhandensein von einer Veränderung in dem PITX1 Genlocus durch Sequenzierung, selektive Hybridisierung und/oder selektive Amplifikation nachgewiesen wird.
  6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Veränderung ein oder mehrere SNP(s) oder ein mit Autismus assozierter Haplotyp von SNPs ist.
  7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei diese SNPs ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus solchen, die in Tabellen 1a und 1b aufgelistet sind, im Speziellen solche, die in den Tabellen 3 bis 8 aufgelistet sind.
  8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei diese mit Autismus assoziierten SNP(s) ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SNP6 und SNP33.
  9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei dieser mit Autsimus assoziierte Haplotyp mehrere SNPs, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SNP6, SNP33, SNP25, SNP27, SNP29, SNP31 und SNP33, umfasst oder aus diesen besteht.
  10. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei dieser Haplotyp SNP24, SNP25 und SNP40, vorzugsweise mit den Allelen C-T-A, umfasst oder aus diesen besteht.
  11. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Haplotyp SNP23, SNP25 und SNP33, vorzugsweise mit den Allelen A-T-G, umfasst oder aus diesen besteht.
  12. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Haplotyp SNP25, SNP27, SNP29 und SNP31, vorzugsweise mit den Allelen T-A-C-A, umfasst oder aus diesen besteht.
  13. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der mit Autismus assozierte Haplotyp ausgewählt ist von den Haplotypen, die in Tabellen 4, 6, 7 und/oder 8 aufgelistet sind.
  14. Ein in vitro Verfahren zur Auswahl bzgl. Autismus oder Störungen des autistischen Spektrums biologisch aktiver Verbindungen, wobei dieses Verfahren das in Kontakt bringen einer Testverbindung mit einem PITX1-Polypetid oder -Gen oder ein Fragment davon und die Untersuchung des Vermögens dieser Testverbindung das PITX1-Polypeptid oder -Gen oder ein Fragment davon zu binden umfasst.
  15. Ein in vitro Verfahren zur Auswahl bzgl. Autismus oder Störungen des autistischen Spektrums biologisch aktiver Verbindungen, wobei dieses Verfahren das in Kontakt bringen einer rekombinanten Wirtszelle, die ein PITX1-Polypeptid exprimiert, mit einer Testverbindung und die Untersuchung des Vermögens dieser Testverbindung das PITX1-Polypeptid zu binden und die Aktivität des PITX1-Polypeptids zu modulieren umfasst.
  16. Ein in vitro Verfahren zur Auswahl bzgl. Autismus oder Störungen des autistischen Spektrums biologisch aktiver Verbindungen, wobei diese Methode das in Kontakt bringen einer Testverbindung mit einem PITX1-Gen und die Untersuchung des Vermögens der Testverbindung die Expression des PITX1-Gens zu modulieren umfasst.
  17. Ein in vitro Verfahren zur Auswahl bzgl. Autismus oder Störungen des autistischen Spektrums biologisch aktiver Verbindungen, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen einer Testverbindung mit einer ein Reporterkonstrukt umfassende rekombinanten Wirtszelle, wobei dieses Reporterkonstrukt ein Reportergen unter der Kontrolle von einem PITX1-Genpromotor umfasst, und Auswahl der Testverbindungen, die die Expression des Reportergens modulieren (zum Beispiel stimulieren oder reduzieren) umfasst.
  18. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das PITX1-Gen oder -Polypeptid oder Fragment davon ein geändertes oder mutiertes PITX1-Gen oder -Polypeptid oder Fragment davon ist, das eine Änderung oder Mutation umfasst.
  19. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Modulation eine Aktivierung ist.
  20. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Modulation eine Inhibierung ist.
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