DE60212861T2

DE60212861T2 - Verfahren zur Diagnose von Fettsucht

Info

Publication number: DE60212861T2
Application number: DE60212861T
Authority: DE
Inventors: Philippe Boutin; Severine Dubois; Christian Dina; Philippe Froguel
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2002-12-13
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2022-12-14
Also published as: EP1572999A1; EP1428875A1; WO2004055180A1; US20060269919A1; JP2006509519A; AU2003276616A1; DE60212861D1; ATE331784T1; CA2509831A1; ES2266432T3; EP1428875B1

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Humangenetik und betrifft neue Verfahren zur Diagnose und Therapie von Fettleibigkeit, insbesondere krankhafter Fettleibigkeit, basierend auf der Identifizierung von Polymorphismen in der 5'-Region des gad2-Gens.
Krankhafte Fettleibigkeit ist ein ernster Krankheitsprozess, bei welchem die Anhäufung von Fettgewebe am Körper übermäßig hoch wird, mit den anderen Körperorganen interferiert oder diese schädigt und ernste und lebensbedrohende Gesundheitsprobleme, die als Comorbiditäten bezeichnet werden, erzeugt (oder vorhersagbar erzeugen wird).
Man sagt, dass Menschen krankhaft fettleibig sind, wenn ihr Körpermasseindex (BMI = Höhe (cm)/(Masse (kg))²) gleich oder über 40 ist.
Zahlreiche wissenschaftliche Untersuchungen haben ermittelt, dass es eine genetische Prädisposition für krankhafte Fettleibigkeit gibt.
Eine Region des Chromosoms 10 ist mit Fettleibigkeit in Verbindung gebracht worden (Hager et al., Nature Genetics 1998; 20:304-38), was unlängst in einer Kohorte von jungen deutschen fettleibigen Subjekten (Hinney et al., 2000, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2000; 85(8):2962-5) wie auch bei weißen Kaukasiern und bei Afro-Amerikanern (Price et al. 2001, Diabetologia 1999, 42:555-9) und bei den „Old Order Amish" (Hsueh et al. 2001, The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2001; 86(3):1199-1205) bestätigt worden ist.
Im Rahmen der Erfindung sind drei neue Einzelnucleotidpolymorphismen (SNPs), die in dieser Region und spezieller in der 5'-Region des gad2-Gens lokalisiert sind, identifiziert worden. Diese SNPs zeigen eine positive Assoziation mit Fettleibigkeit bei krankhaft fettleibigen Subjekten, während andere SNPs in dieser Region diese Assoziation nicht zeigen.
Im Rahmen der Erfindung soll mit gad2-Gen ein Gen bezeichnet werden, dessen codierende Sequenz durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird.
Die 5'-flankierende Region des gad2-Gens soll die Region, welche die Nucleotide 1-2379 von SEQ ID Nr. 2 umfasst, und speziell die Region, welche aus den Nucleotiden 1-2379 von SEQ ID Nr. 2 besteht, bezeichnen. Die Nucleotide 2380-2382 von SEQ ID Nr. 2 repräsentieren das Startcodon des gad2-Gens (ATG).
Dementsprechend betrifft in einer ersten Ausführungsform die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Prädisposition für Fettleibigkeit und insbesondere krankhafte Fettleibigkeit bei einem menschlichen Subjekt, welches das Bestimmen umfasst, ob eine Keimbahnänderung in der Sequenz der 5'-flankierenden Region des gad2-Gens vorliegt, wobei die Änderung die Anwesenheit mindestens einer der folgenden Mutationen ist: -243 A>G am Nucleotid 2137 von SEQ ID Nr. 2, -1,6kb G>A am Nucleotid 780 von SEQ ID Nr. 2, -2004 A>T am Nucleotid 376 von SEQ ID Nr. 2, wobei die Änderung eine Prädisposition für Fettleibigkeit anzeigt.
Die 5'-flankierende Region des gad2-Gens wird durch die Nucleotide 1-2379 von SEQ ID Nr. 2 dargestellt und die erfindungsgemäßen SNPs befinden sich bei Nucleotid 376 (Anwesenheit eines T bei Patienten mit Prädisposition und eines A bei Patienten ohne Prädisposition), 780 (Anwesenheit eines A bei Patienten mit Prädisposition und eines G bei Patienten ohne Prädisposition) und 2137 (Anwesenheit eines G bei Patienten mit Prädisposition und eines A bei Patienten ohne Prädisposition) von SEQ ID Nr. 2.
Die Erfindung betrifft allgemeiner die Untersuchung der 5'-Promotorregion des gad2-Gens. Tatsächlich haben die Erfinder gezeigt, dass die Anwesenheit der speziellen SNPs, die in der vorliegenden Anmeldung angegeben werden, zu einer erhöhten Bindung von Kernfaktoren an die 5'-Region des gad2-Gens führt, was zu einer Zunahme der Transkription führt.
Es ist dementsprechend denkbar, zu spekulieren, dass andere Modifikationen in der Promotorregion des gad2-Gens, welche zu einer höheren Expression des GAD2-Proteins führen, ebenfalls zu einer Prädisposition für Fettleibigkeit führen werden aufgrund einer Zunahme bei dem GABA-Pool. Aufgrund der appetitanregenden Wirkung von GABA könnte dies das Verhalten bei der Nahrungsaufnahme verändern.
Dementsprechend betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Prädisposition für Fettleibigkeit bei einem menschlichen Subjekt, in dem die Konzentration eines Expressionsprodukts des gad2-Gens in der Probe untersucht wird.
Die Expressionsprodukte sollen gemäß der Erfindung RNA oder Protein oder das, was als „sekundäres" Expressionsprodukt bezeichnet werden könnte, wie GABA, umfassen. Die Letztgenannte ist tatsächlich nicht wirklich ein Expressionsprodukt des gad2-Gens, aber eine Zunahme der Produktion von GAD2-Protein führt zu einer Zunahme der GABA-Konzentration.
Eine Veränderung der mRNA-Expression kann durch jegliche Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, detektiert werden. Diese umfassen eine Northern-Blot-Analyse, PCR-Amplifizierung und RNase-Schutz.
In einer Ausführungsform wird mRNA der Probe mit einer gad2-Gen-Sonde in Kontakt gebracht unter Bedingungen, welche für eine Hybridisierung der Sonde mit einer RNA, welche dem gad2-Gen entspricht, geeignet sind, und die Hybridisierung der Sonde wird bestimmt und das Niveau des Signals nach der Hybridisierung wird mit einem Standard- (Referenz-) -signal (welches entweder von einem nicht-fettleibigen Patienten oder einem fettleibigen Patienten erhalten wird) verglichen.
Der Hybridisierungskomplex sendet ein Signal aus, welches auf die Markierung der Sonde oder der mRNA zurückzuführen sein kann. Die unterschiedlichen Markierungen, die verwendet werden können, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt, und man kann ³²P, ³³P, ³⁵S, ³H oder ¹²⁵I aufführen. Nicht-radioaktive Markierungen können ausgewählt werden aus Liganden, wie Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxigenin, Haptenen, Farbstoffen, lumineszierenden Mitteln, wie radiolumineszierenden, chemolumineszierenden, biolumineszierenden, fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Mitteln.
Um die in der Anmeldung erwähnten SNPs zu identifizieren, ist es möglich, eine Sonde für die 5'-Region des gad2-Gens mit genomischer DNA, welche aus der Probe isoliert worden ist, unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung der Sonde mit dem Gen geeignet sind, in Kontakt zu bringen, und die Hybridisierung der Sonde wird bestimmt.
Die Sonde für die 5'-Region des gad2-Gens ist entweder eine „Wildtyp"-DNA (d.h. der gesuchte SNP ist auf der Sonde nicht vorhanden und eine Hybridisierung tritt auf, wenn kein SNP gemäß der Erfindung auf der DNA in der Probe vorhanden ist) oder eine „mutierte" (d.h. welche den gesuchten SNP trägt, und eine Hybridisierung tritt nur auf, wenn der SNP auf der DNA in der Probe vorhanden ist).
Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die Techniken, um die allelspezifischen Sonden für eine Verwendung in dieser Ausführungsform, deren Längen oder die Hybridisierungsbedingungen zu bestimmen. Bedingungen hoher Stringenz sind zu bevorzugen, um falsche positive Ergebnisse zu verhindern, beispielsweise unter hochstringenten Bedingungen von 0,2 ×SSC und 0,1% SDS bei 55-65°C oder unter Bedingungen, wie sie nachfolgend beschrieben werden.
Die stringenten Hybridisierungsbedingungen können definiert werden, wie in Sambrook et al. ((1989) Molecular cloning : a laboratory manual; 2. Aufl., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York) beschrieben, mit den folgenden Bedingungen: 5 × oder 6 × SSC, 50-65°C. Hochstringente Bedingungen, die ebenfalls für eine Hybridisierung verwendet werden können, werden mit den folgenden Bedingungen definiert: 6 × SSC, 60-65°C.
Die DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung kann in zwei Schritten ausgeführt werden: (1) Vorhybridisierung bei 42°C während 3 h in Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,5), enthaltend 5 oder 6 × SSC (wobei 1 × SSC einer Lösung von 0,15 M NaCl + 0,015 M Natriumcitrat entspricht), 50% Formamid, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 × Denhardt's, 5% Dextransulfat und 1% Lachssperma-DNA; (2) Hybridisierung während bis zu 20 bei einer Temperatur von 50-65°C, mehr bevorzugt 60-65°C, gefolgt von verschiedenen Wäschen (ungefähr 20 min bei in 2 × SSC + 2% SDS, dann 0,1 × SSC + 0,1% SDS). Die letzte Wäsche wird in 0,2 × SSC + 0,1% SDS für ungefähr 30 min bei ungefähr 50-65°C und/oder in 0,1 × SSC + 0,1% SDS bei der gleichen Temperatur ausgeführt. Diese hochstringenten Hybridisierungsbedingungen können durch einen Fachmann auf dem Gebiet angepasst werden. Tatsächlich ist der Fachmann auf diesem Gebiet in der Lage, die besten Stringenzbedingungen zu bestimmen, indem die SSC- und SDS-Konzentrationen und die Temperatur der Hybridisierung und der Waschschritte variiert werden.
In einer anderen Ausführungsform ist das Expressionsprodukt das Polypeptid, das durch das gad2-Gen in der Probe codiert wird. Das Polypeptid kann insbesondere durch Immunblotting oder Immunzytochemie detektiert werden.
Es können für GAD2 spezifische Antikörper verwendet werden, um eine erhöhte GAD2-Expression zu detektieren. Immunologische Assays können in jeglichen geeigneten Formaten, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgeführt werden. Diese umfassen Western-Blots, immunhistochemische Assays und ELISA-Assays.
Dementsprechend sind Antikörper, die mit dem GAD2-Polypeptid reagieren, wie auch reaktive Fragmente von solchen Antikörpern, ebenfalls im Umfang der Erfindung mit enthalten. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimär, einzelkettig und/oder bispezifisch sein. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Antikörper oder das Fragment davon entweder von humanem Ursprung sein oder wird „humanisiert" sein, d.h. so hergestellt worden sein, dass eine Immunreaktion gegen den Antikörper, wenn er einem Patienten verabreicht wird, verhindert oder minimiert wird.
Das Antikörperfragment kann ein jegliches Fragment sein, das mit den Polypeptiden der Erfindung reagiert. Die Erfindung umfasst auch die Hybridome, die erzeugt werden, indem das erfindungsgemäße Polypeptid oder ein Fragment davon als Antigen einem ausgewählten Säugetier präsentiert wird, gefolgt von einem Fusionieren von Zellen (z.B. Milzzellen) des Säugetiers mit bestimmten Krebszellen, um immortalisierte Zelllinien durch bekannte Techniken, wie die Technik von Köhler und Milstein (1975 Nature 256, 495), zu erzeugen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind beispielsweise chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, Fab- oder F(ab')₂-Fragmente. Sie können für Detektionszwecke Immunkonjugate oder markierte Antikörper sein.
In einer anderen Ausführungsform wird die Erfindung ausgeführt, indem bestimmt wird, ob es eine Änderung in der Keimbahnsequenz der 5'-Region des gad2-Gens in der Probe gibt, indem Verschiebungen bei der elektrophoretischen Mobilität von einzelsträngiger DNA aus der Probe auf denaturierenden oder nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen beobachtet werden. Die einzelsträngigen Nucleinsäuren können nach einer Amplifizierung der genomischen DNA unter Verwendung von geeigneten Primern und Denaturierung erhalten werden (das Gel und die Elektrophoresebedingungen sind für einen solchen Zweck üblicherweise denaturierend).
In einer anderen Ausführungsform wird die Erfindung ausgeführt durch Amplifizierung der Gesamtheit oder eines Teils des 5'-Region des gad2-Gens aus der Probe und Bestimmung der Sequenz der amplifizierten DNA, beispielsweise durch die Sanger-Sequenzierungstechnik.
In einer anderen Ausführungsform werden allelspezifische Oligonucleotid-Primer eingesetzt, um zu bestimmen, ob ein spezielles mutiertes gad2-Allel in der Probe vorhanden ist, wobei die Amplifizierung nur in diesem Falle stattfindet. Diese Methode ist in diesem Fachgebiet wohlbekannt.
In einer anderen Ausführungsform wird die Gesamtheit oder ein Teil der 5'-Region des gad2-Gens aus der Probe kloniert, um eine klonierte Sequenz herzustellen, und die Sequenz der klonierten Sequenz wird bestimmt. Die Klonierung wird in Vektoren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, wie pUC- oder pBR-Vektoren, ausgeführt.
Allgemein betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Prädisposition für Fettleibigkeit, insbesondere krankhafte Fettleibigkeit, in einem Subjekt aus einer Probe des Subjekts, welches umfasst, zu bestimmen, ob es eine Fehlpaarung zwischen (1) der 5'-Region der genomischen DNA des gad2-Gens, welche aus der Probe isoliert wird, und (2) einer Nucleinsäuresonde, welche zu der humanen Wildtyp-5'-Region der gad2-Gen-DNA, wie durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt, komplementär ist, gibt, wenn die Moleküle (1) und (2) unter Bildung eines Doppelstrangs miteinander hybridisiert werden, und wobei die Fehlpaarung auf die Anwesenheit von mindestens einem der 3 identifizierten SNPs, welche bei den Nucleotiden 376, 780 oder 2137 von SEQ ID Nr. 2 vorhanden sind, zurückzuführen ist.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, in welchem eine Amplifizierung der Sequenzen der 5'-flankierenden Region des gad2-Gens in der Probe ausgeführt und eine Hybridisierung der amplifizierten Sequenzen mit einer oder mehreren Nucleinsäuresonden, welche aus der Sequenz der 5'-flankierenden Region des Wildtyp-gad2-Gens (wie in SEQ ID Nr. 2 dargestellt) oder einer mutierten Sequenz der 5'-flankierenden Region des gad2- Gens (in welcher mindestens einer der drei bei den Nucleotiden 376, 780 oder 2137 von SEQ ID Nr. 2 lokalisierten SNPs vorhanden ist) stammen, bestimmt wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, welches umfasst, die Hybridisierung der 5'-flankierenden Region des gad2-Gens in der Probe in situ zu bestimmen mit einer oder mehreren Nucleinsäuresonden, die aus einer Wildtyp- oder einer mutierten Sequenz der 5'-flankierenden Region des gad2-Gens stammen.
Die Erfindung eröffnet ein neues Feld bei der Behandlung und/oder Verhütung von Fettleibigkeit, insbesondere krankhafter Fettleibigkeit, speziell für Patienten in Familien, wo eine genetisch-bedingte Anfälligkeit vermutet wird.
Tatsächlich machen die Anwesenheit der SNPs in der 5'-Region des gad2-Gens und die Daten, welche eine erhöhte Bindung von Kernfaktoren an diese Region, wenn die im Rahmen der Erfindung identifizierten Polymorphismen vorhanden sind, zeigen, es wahrscheinlich und glaubhaft, dass die Anwesenheit dieser Polymorphismen die Expression von gad2 erhöht, wahrscheinlich durch verstärkte Transkription. Darüber hinaus führt eine erhöhte Aktivität des gad2-Gens zu einer Zunahme des GABA-Pools, der appetitanregenden Wirkung von GABA, welche das Verhalten bei der Nahrungsaufnahme verändern und zu der Entwicklung von krankhafter Fettleibigkeit für die Träger der identifizierten Mutationen beitragen können.
Dementsprechend betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Durchmusterung potentieller Fettleibigkeitsarzneistoffe, welches umfasst: Vereinigen (i) einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Fettleibigkeitsarzneistoff ist, (ii) eines GAD2-Polypeptids und Bestimmen der Menge der Bindung des GAD2-Polypeptids an die Verbindung. Tatsächlich werden Inhibitoren des GAD2-Enzyms mit der Bildung von GABA interferieren und können als nützliche Arzneimittel für die Behandlung von Fettleibigkeit, allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen, angesehen werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Durchmusterung potentieller Fettleibigkeitstherapeutika, welches umfasst: Vereinigen (i) eines GAD2-Bindungspartners, (ii) eines GAD2-Polypeptids und (iii) einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Fettleibigkeitstherapeutikum ist, und Bestimmen der Menge an Bindung des GAD2-Polypeptids an seinen Bindungspartner.
In einer besonderen Ausführungsform ist der Bindungspartner L-Glutaminsäure.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Durchmustern von potentiellen Fettleibigkeitstherapeutika, welches umfasst: Vereinigen (i) eines gad2-Gen-Bindungspartners, (ii) eines gad2-Gens und (iii) einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Fettleibigkeitstherapeutikum ist, und Bestimmen der Menge an Bindung des gad2-Gens an seinen Bindungspartner. In dieser Ausführungsform muss der Begriff „gad2-Gen" so verstanden werden, dass er die 5'-flankierende Region in dem gad2-Genort, welche die Polymorphismen der Erfindung, insbesondere -243 A>G, umfasst, mit umfasst.
Insbesondere ist der gad2-Gen-Bindungspartner IK2 (Ikaros 2), dessen Aminosäuresequenz durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt wird.
Die Verfahren zur Ermittlung der Bindung einer Verbindung an eine Nucleinsäure oder ein Protein sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt und werden vorzugsweise in vitro ausgeführt. Ein Verfahren, um ein solches Ziel zu erreichen, kann darin bestehen, die Nucleinsäure oder das Protein an einen festen Träger zu binden, auf welchem man die zu testende Verbindung fließen lässt, und die Rückgewinnung der Verbindung nach der Passage auf dem Träger zu überprüfen. Indem Parameter angepasst werden, ist es auch möglich, die Bindungsaffinität zu bestimmen. Die Verbindungen können auch durch andere Methoden, einschließlich FRET, SPA..., gefunden werden, wenn die Verbindungen und die Nucleinsäure oder das Protein markiert werden. Der Assay kann auch an Zellen, die die Nucleinsäure der Erfindung, beispielsweise auf einem Vektor gemäß der Erfindung, enthalten und/oder das erfindungsgemäße Protein exprimieren, ausgeführt werden. Dies liefert auch Informationen über die Fähigkeit der Verbindung, durch die Membran hindurchzutreten und in Zellen einzudringen. Diese Zellen können Bakterienzellen oder Säugetierzellen sein.
Das Verfahren der Erfindung erlaubt auch das Durchmustern, die Detektion und/oder die Identifizierung von Verbindungen, welche in der Lage sind, die biologische Aktivität des GAD2-Proteins und insbesondere die Zunahme der Menge von produziertem GABA zu hemmen.
Die Erfindung erlaubt dementsprechend die Detektion, Identifizierung und/oder das Durchmustern von Verbindungen, die für die Behandlung von Krankheiten, an welchen eine V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist, nützlich sein können. Nichtsdestotrotz müssen die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierten Verbindungen, um im Rahmen einer therapeutischen Behandlung verwendet werden zu können, möglicherweise optimiert werden, um eine höhere Aktivität und/oder eine geringere Toxizität aufzuweisen.
Tatsächlich wird die Entwicklung von neuen Arzneimitteln oftmals auf der folgenden Grundlage ausgeführt:

– Durchmustern von Verbindungen mit der gesuchten Aktivität mittels eines relevanten Modells durch ein geeignetes Verfahren,
– Selektion der Verbindungen, die die benötigten Eigenschaften haben, aus dem ersten Durchmusterungstest (hier Modulation der GAD2- oder GABA-Produktion),
– Bestimmung der Struktur (insbesondere der Sequenz (wenn möglich der Tertiärstruktur), wenn sie Peptide, Proteine oder Nucleinsäuren sind, der Formel und des Grundgerüsts, wenn sie chemische Verbindungen sind) der selektierten Verbindungen,
– Optimierung der selektierten Verbindungen durch Modifikation der Struktur (beispielsweise durch Änderung der stereochemischen Konformation (beispielsweise Übergehen der Aminosäuren in einem Peptid von L zu D), Hinzufügen von Substituenten an dem Peptid- oder chemischen Gerüst, insbesondere durch Aufpfropfen von Gruppen oder Resten auf das Gerüst, Modifikation der Peptide (siehe insbesondere Gante „Peptidomimetics", in Angewandte Chemie-International Edition Engl. 1994, 33, 1699-1720),
– Testen und Durchmustern der „optimierten" Verbindungen mittels geeigneter Modelle, die oftmals Modelle sind, die der untersuchten Pathologie näher kommen. In diesem Stadium würde man oftmals Tiermodelle, insbesondere Nagetiere (Ratten oder Mäuse) oder Hunde oder nicht-humane Primaten, die gute Modelle für Fettleibigkeit sind, verwenden und nach den phänotypischen Veränderungen in den Modellen nach Verabreichung der Verbindung suchen.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und eine Verbindung, wie in Anspruch 10 definiert, und die Verwendung einer durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifizierten Verbindung, wie in den Ansprüchen 11 oder 12 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels, welches dazu bestimmt ist, Fettleibigkeit, insbesondere krankhafte Fettleibigkeit zu behandeln und/oder zu verhüten.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Fettleibigkeit, insbesondere krankhafter Fettleibigkeit, welches die Verabreichung einer Verbindung oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung umfasst.
Um die Aktivität des gad2-Gens und -Proteins zu verringern, ist es möglich, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von Fettleibigkeit Antisense-Moleküle zu verwenden, welche insbesondere zu der mRNA von gad2 komplementär sind. Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Fettleibigkeit, welches eine Verabreichung eines anti-gad2-Antisense-Moleküls oder eines jeglichen Mittels, um die Menge von GAD2-Protein zu verringern, umfasst. Der Fachmann auf diesem Gebiet kennt die Mittel und Maßnahmen, um Antisense-Moleküle zu gestalten, und die Modifikationen, die an den Gerüsten der Moleküle vorgenommen werden können (Phosphorthioate, Methylphosphonate...).
Antisinn-Polynucleotidsequenzen sind nützlich, um die Expression des gad2-Gens zu verhindern oder zu verringern, wie sich für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht. Es können beispielsweise Polynucleotidvektoren, welche die Gesamtheit oder einen Teil des gad2-Gens (oder andere Sequenzen aus dem gad2-Genort, insbesondere der 5'-flankierenden Region) unter die Kontrolle eines Promotors in einer Antisense-Orientierung gestellt und in eine Zelle eingeführt werden. Die Expression eines solchen Antisense-Konstrukts innerhalb einer Zelle wird mit der gad2-Transkription und/oder -Translation interferieren.
Alternativ kann eine „Sense"-Strategie vorgesehen werden, wo ein Nucleinsäure-Oligonucleotid oder eine Nucleinsäure-Sonde, welche(s) einen Teil der 5'-Region des gad2-Gens (welcher insbesondere die -243 A>G-Variante bei Nukleotid 2137 von SEQ ID Nr. 2 umfasst) umfasst, in die Zellen eingeführt wird, um einen Kompetitor hinsichtlich der Bindung der Kernfaktoren, welche die Transkription aktivieren, darzustellen. Die Größe des Fragments der 5'- flankierenden Region des gad2-Gens, das im Rahmen der Sense-Strategie verwendet werden kann, beträgt vorzugsweise ungefähr 50-150 Basen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Tiermodellen zum Untersuchen von Fettleibigkeit, wo die Expression des gad2-Gens erhöht ist. Die Expression dieses Gens kann insbesondere nur konditional erhöht werden, indem Promotoren, die entweder orts- oder zeitspezifisch sind, oder induzierbare Promotoren verwendet werden. Es ist dementsprechend möglich, die gad2-Expression nur im Pankreas der Tiere gemäß der Erfindung oder im Gehirn zu erhöhen. Die Verfahren, um Tiere gemäß der Erfindung zu erhalten, sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und sind insbesondere nützlich zum Testen von einigen Arzneimitteln, die gemäß den Verfahren der Erfindung identifiziert werden können.
Die Insertion eines Konstrukts in das Genom eines Tiers, um ein transgenes Tier zu erhalten, kann durch Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, ausgeführt werden und kann entweder zufallsgesteuert oder zielgerichtet erfolgen. In wenigen Worten wird der Fachmann einen Vektor konstruieren, welcher die in das Genom zu inserierende Sequenz mit einem geeigneten Promotor und einem Selektionsmarker (beispielsweise das das Protein, welches Resistenz gegen Neomycin verleiht, kodierende Gen) enthält, und diesen in die embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) eines Tiers eindringen lassen. Die Zellen werden dann mittels des Selektionsmarkers selektiert und in einem Embryo eingebracht, beispielsweise durch Mikroinjektion in eine Blastozyste, die geerntet werden kann, indem der Uterus von schwangeren Weibchen perfundiert wird. Eine Reimplantation des Embryos und eine Selektion der transformierten Tiere, gefolgt von einer potentiellen Rückkreuzung, ermöglicht es, ein solches transgenes Tier zu erhalten. Um ein „saubereres" Tier zu erhalten, kann das Selektionsmarkergen durch die Verwendung einer ortsspezifischen Rekombinase herausgeschnitten werden, wenn dieses durch die korrekten Sequenzen flankiert wird.
Gemäß einer Ausführungsform weist das transgene nicht-humane Säugetier in sein Genom integriert die Nucleinsäuresequenz des gad2-Gens oder die kodierende Sequenz davon auf, operativ verknüpft mit regulatorischen Elemente, wobei die Expression der kodierenden Sequenz die Konzentration des GAD2-Proteins und/oder den GABA-Pool in dem Säugetier bezogen auf ein nicht-transgenes Säugetier derselben Art erhöht. Transgene Mäuse, welche eine erhöhte Expression von gad2 aufweisen, werden in WO-A-98/37224 oder Geng et al., PNAS, Band 95, 1995, S. 10055-10060, beschrieben.
Die gad2-Sequenz, die für die vorangegangene Ausführungsform vorgesehen wird, kann eine humane gad2-Gensequenz, die in das Genom des Tiers der Erfindung eingeführt wird, oder die endogene gad2-Gensequenz, deren Promotor modifiziert worden ist, um eine Überexpression zu induzieren, sein. Beispielsweise ist die gad2 kodierende Sequenz für die Maus bekannt und kann in GenBank unter der Nummer NM_008078 gefunden werden. Andere endogene gad2-Gene in anderen Tieren können unter Ausnutzung der Homologien zwischen Sequenzen identifiziert werden.
Alternativ wird ein transgenes nicht-humanes Säugetier, dessen Genom eine Zerstörung des endogenen gad2-Gens umfasst, als ein Tiermodell zum Testen von Verknüpfungen zwischen GAD2 und Fettleibigkeit verwendet. Diese Zerstörung umfasst insbesondere die Insertion einer selektierbaren Markersequenz, und die Zerstörung führt dazu, dass das nicht-humane Säugetier einen Defekt in der GABA-Konzentration verglichen mit einem nicht-humanen Wildtyp-Säugetier aufweist.
Insbesondere ist die Zerstörung eine homozygote Zerstörung und die homozygote Zerstörung führt zu einer Nullmutation des endogenen Gens, welches GAD2 kodiert.
US 6,087,555 beschreibt eine Weise, um eine Knock-out-Maus zu erhalten, und die allgemeine Lehre dieses Patents wird in diese Unterlagen durch Bezugnahme aufgenommen (Spalte 5, Zeile 54, bis Spalte 10, Zeile 13). In diesem Patent wird eine OPG-Knock-out-Maus beschrieben, aber die gleiche Methode ist für eine GAD2-Knock-out-Maus anwendbar. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird auch in Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1986) Informationen finden.
Das Säugetier der Erfindung ist vorzugsweise ein Nagetier, insbesondere eine Ratte oder eine Maus. GAD65 (gad2)-Knock-out-Mäuse werden in Fagiolini und Hensch, Nature, Band 404, 2000, S. 183-186, beschrieben.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: schematische Darstellung des gad2-Gens und der Häufigkeit der SNPs, die im Rahmen der Erfindung identifiziert worden sind.
2: Gel-Shift-Assay (Gel-Verschiebungs-Assay), welcher die Bindung von Kernprotein in der 5'-Region des gad2-Gens abhängig von der Natur des Nucleotids an Position -243 testet. mt = mutiert (G); wt = Wildtyp (A).
3: Wirkung der -243A>G-gad2-Variante auf die Transkriptionsaktivität in βTC3-Zellen. Relative Luciferase-Einheiten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung ausgedrückt.
BEISPIELE
Beispiel 1: Assoziation zwischen Fettleibigkeit und SNPs
Das Gad2-Gen kodiert eine Isoform der Glutaminsäuredecarboxylase (GAD65), welche die Bildung von gamma-Aminobuttersäure (GABA) aus L-Glutaminsäure katalysiert, und wird sowohl im Gehirn als auch in den Langerhans'-Inselzellen des Pankreas exprimiert. GABA ist einer der stärksten inhibitorischen Neurotransmitter des Zentralnervensystems (ZNS). GABA moduliert die Sekretion von Gastrin und Somatostatin und stimuliert möglicherweise die Glucoseaufnahme in mehreren Geweben (Erdo und Wolff, 1990, J. Neurochem.; 54(2):363-72).
Drei SNPs (-243 A>G-Variante (5'UTRI); -1,6kb G>A (SNP 668); -2004 A>T SNP669)), die in der 5'-flankierenden Region des gad2-Gens lokalisiert sind, enthüllten eine positive Assoziation mit Fettleibigkeit bei krankhaft fettleibigen Subjekten.
Die DNA-Fragmente, die diese Polymorphismen tragen, können mit den folgenden Primersätzen amplifiziert werden.
Polymorphismen des gad2-Gens wurden durch direkte Sequenzierung oder durch die LightCycler^TM-Technologie (Roche, Mannheim, Deutschland) genotypisiert. Der LightCycler-Assay basiert auf Hybridisierungssonden, die mit fluoreszierenden Farbstoffen, die einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer erlauben, markiert sind (Blomeke et al., 1999, Anal. Biochem., 275, 93-7). Die SNP-Genotypisierung wurde unter Verwendung einer Schmelzkurvenanalyse ausgeführt. PCR werden in einem 9700-Gerät (Applied Biosystems, Foster City, USA) vor der LightCycler-Analyse ausgeführt. Sequenzen von für die PCR und für die LightCycler-Assays verwendeten Primern sind in der folgenden Tabelle beschrieben.

(F steht für die Fluorescein-Markierung).

PCR-Amplifizierungen wurden in einem Reaktionsendvolumen von 20 μl PCR-Puffer, welcher 50 ng humane genomische DNA, 10 pmol von jedem Primer, 2,5 mmol/l MgCl2, 2,5 mmol/l dMTP und 0,2 E Taq Gold-Polymerase enthält, ausgeführt. Die Thermozyklus-Bedingungen für das PCR-Produkt waren: 1 Zyklus 95°C 12 min; 35 Zyklen, 95°C 15 s, 55°C 15 s, 72°C 30 s; 1 Zyklus 72°C 10 min; 1 Zyklus 15°C 15 min.
Zusätzlich wurden, um das eingeschränkte Essen und die „latente Fettleibigkeit" zu untersuchen, die kognitive Einschränkung des Essens, die Disinhibition und der Hunger gemäß dem „Three factor eating questionnaire or TFEQ„ (Stunkard, AJ, und Messick, S., 1985, J. Psychosom Res.; 29(1):72-83) analysiert.
Assoziationsuntersuchungen wurden bei 369 nicht-verwandten krankhaft fettleibigen Patienten ausgeführt (mittlerer BMI: 47,3 ± 7,4 kg/m²; mittleres Alter: 46 ± 12 Jahre; Frauen/Männer, 294/75).
Eine Gruppe von 381 nicht-verwandten nicht-fettleibigen, nicht-diabetischen Subjekten (mittlerer BMI: 22,8 ± 2,44 kg/m²; mittleres Alter: 58,3 ± 14,1 Jahre; Frauen/Männer, 228/152) wurde als Kontrollgruppe verwendet. Tabelle 1 zeigt die Genotypverteilung und Allelhäufigkeiten der 3 SMPs (-243 A>G-Variante (5'UTRI); -1,6kb G>A (SMP 668); -2004 A>T (SNP669)).
Tabelle 1. Genotypverteilung und Allelhäufigkeiten von 242 A>G-, 1,6kb G>A- und 1,7kb A>T-SNPs
Im Rahmen des codominanten und des dominanten Modells wurden der -243 A>G- und der -1,6kb G>A-SNP mit krankhafter Fettleibigkeit assoziiert (jeweilige p-Werte von 0,004 und 0,02 im Rahmen eines dominanten Modells). Ein Trend in Richtung einer Assoziation wurde für die -2004 A>T-Variante beobachtet.
Das relative Risiko von diesen 3 SNPs wurde abgeschätzt: O.R = 1,55 (95% Cl[1,14 2,12])(UTR5I; -243); O.R = 1,45 (95% Cl[1,06 2])(SNP668; -1,6kb]; O.R = 1,34 (95% Cl[0,97 1,84])(SNP669; -2004).
Um diese Ergebnisse zu replizieren, wurden die 3 SNPs in einer anderen Gruppe von 316 nicht-verwandten krankhaft fettleibigen Subjekten genotypisiert. Für den -243 A>G-SNP wurde ein ähnliches Ergebnis erhalten (im Rahmen des dominanten Modells, p = 0,009) und für den -1.6kb G>A-SNP wurde ein Trend in diese Richtung erhalten (im Rahmen des dominanten Modells, p = 0,06).
Es wurde eine Varianzanalyse für mit Fettleibigkeit in Verbindung stehende Phänotypen ausgeführt (BMI, Leptin, Prozent Fettmasse, Insulinämie...) und es wurde eine signifikante Assoziation zwischen den 3 SNPs und den drei Faktoren des Essverhaltens gefunden.
Um das menschliche Essverhalten zu testen, füllten die Subjekte den TFEQ (Three Factor Eating Questionnaire)-Fragebogen, der von Stunkard et al. (a.a.O.) erstellt worden ist, aus. In Tabelle 2 ist die Varianzanalyse für drei stabile Faktoren, die durch den TFEQ gemessen werden: kognitive Einschränkung des Essens (Qres), Disinhibition (Qdis) und Hunger (Qhun,) gezeigt. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen den 3 SNPs war signifikant (χ² = 174, p < 10^–10).
Das Kopplungsungleichgewicht zwischen jedem SNP wurde durch die Estimation Haplotype (EH)-Software abgeschätzt. D' = 0,84 (SNPs -243 A>G und -1,6kb G>T), D' = 0,84 (SNPs -243 A>G und -2004kb G>A), d' = 0,87 (SNPs -1,6kb G>T und -2004kb G>A).
Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse, die für die -243 A>G (5'UTR)-Variante erhalten wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden für die -1,6kb G>A (SNP 668)- und die -2004 A>T (SNP 669)-Variante erhalten.
Tabelle 2: Varianzanalysen mit gefundenen Aufnahmeverhaltensparametern
Unter Verwendung eines codominanten Modells wurde festgestellt, dass die GG-Träger einen niedrigeren Restriktions-Score als heterozygote und Wildtyp-Subjekte aufwiesen (p-Wert = 0,06). Sie zeigten auch einen höheren Disinhibitions- (p-Wert = 0,03) und einen höheren Hunger-Score (p-Wert = 0,001) als heterozygote und Wildtyp-Subjekte. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass GG-Träger jünger sind (p-Wert = 0,04) und ein Maximalgewicht in frühen Jahren zu erreichen scheinen als AG- und AA-Träger (p-Wert = 0,03). Diese Daten legen nahe, dass Änderungen des Nahrungsaufnahmeverhaltens durch gad2-Varianten zu der Entwicklung eines Ausbruchs von krankhafter Fettleibigkeit in jüngeren Jahren beitragen können.
Haplotyp-Untersuchungen wurden mit der -243 A>G-, -1,6kb G>A- und der -2004 A>T-Variante ausgeführt (EHplus-Software). Es wurde ein signifikanter Haplotyphäufigkeitsunterschied zwischen fettleibigen und nicht-fettleibigen Subjekten beobachtet (p < 10^–10). Es wurde gezeigt, dass der ATG-Haplotyp verglichen mit Kontrollen (8%) bei fettleibigen Subjekten häufiger war (16,9%) (1).
Beispiel 2: Funktionale Untersuchung einer Promotorvariante des gad2-Gens
Um nach potentiellen Bindungsstellen zu suchen, wurde die Sequenz der 5'-flankierenden Region des gad2-Gens bei dem transfac server: http://transfac.gbf.de/cgi-bin/mat, eingereicht.
In silico-Analysen zeigten, dass -243 A>G (lokalisiert bei Nucleotid 2137 von SEQ ID Nr. 2) und -1,6kb G>A (lokalisiert bei Nucleotid 780 von SEQ ID Nr. 2) nahe der vorhergesagten Ikaros 2 (IK2)-Response-Element-Stelle lokalisiert waren. IK2 ist ein Transkriptionsfaktor, der in humanen Lymphozyten stark exprimiert wird, und seine Aminosäuresequenz wird durch SEQ ID Nr. 3 dargestellt.
Um zu testen, ob die -243 A>G-Variante die Bindung von Kernproteinen an die DNA verändert, wurde ein Gel-Shift-Assay ausgeführt unter Verwendung von Primern mit Sequenzen der Wildtyp- und der mutierten Stelle und eines Zellkernextrakts aus MIN6-Zellen (2).
Die Ergebnisse des Gel-Shift-Assays zeigten, dass es eine in vitro-Bindung von Kernproteinen an die IK2-Response-Element-Stelle gibt. Offensichtlich haben die Kernproteine eine höhere Affinität gegenüber der Response-Element-G-Variante (vgl. 6 gegenüber 1). Ein ähnliches Ergebnis wurde mit einer Kompetition des A- und G-Allels erhalten (vgl. 2 gegenüber 3; 6 gegenüber 8, 7 gegenüber 9).
Um zu untersuchen, ob die Allelvariante an Position -243 das GAD2-Transkriptionsniveau beeinflusst, wurden vorübergehende Cotransfektionen unter Verwendung des Leuchtkäfer-Luciferase-Reporter-Konstrukts ausgeführt, um die proximale Promotoraktivität von Wildtyp-Promotoren und Promotorvarianten in βTC3-Zellen (Maus-Insulinom-Zelllinie) zu messen. Es wurde der Renilla-Vektor verwendet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren. Die Transkriptionsaktivität des mutierten -243A>G-Konstrukts war verglichen mit dem Wildtyp-Konstrukt 8,61-mal höher (n = 8, p < 0,0001) (3).
Die beobachtete erhöhte Transkriptionsaktivität, die durch das G-Allel von -243 A>G induziert wird, steht in Übereinstimmung mit den genetischen Ergebnissen

– die Assoziation der -243 A>G-Variante mit Fettleibigkeit (p = 0,004, O.R = 1,55 (95% Cl[1,14-2,12])
– die GG-Träger haben einen niedrigeren Nahrungsrestriktions- bzw. Nahrungseinschränkungs-Score (p = 0,06), einen höheren Disinhibitions-Score (p = 0,03) und einen höheren Hunger-Score-Parameter (p = 0,001).

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Bindung von Kernproteinen (potentiell des IK2-Transkriptionsfaktors) in Gegenwart der Allelvariante erhöht wurde und möglicherweise das Gad2-Gen transaktiviert und dementsprechend den GABA-Pool. Dementsprechend könnte die appetitanregende Wirkung von GABA erhöht werden und könnte das Nahrungsaufnahmeverhalten verändern und zu der Entwicklung von krankhafter Fettleibigkeit für G-Träger der -243 A>G-Variante beitragen.
Das Ergebnis könnte auf die anderen SNPs, die ebenfalls nahe bei dem IK2-Response-Element liegen, generalisiert werden.
Die in dieser Anmeldung präsentierten Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des GABA-Wegs an Fettleibigkeit beim Menschen an. Dies ist ein wichtiger Schritt in Richtung eines besseren Verständnisses der molekularen Mechanismen, die zu üblichen Formen von Fettleibigkeit führen. Es scheint klar, dass die GABAergen Neuronen an der Integration von Signalen, welche die Nahrungsaufnahme modulieren, beteiligt sind. Die Identifizierung von SNPs in der 5'-Region des gad2-Gens und der Nachweis, dass deren Anwesenheit die Expression eines Schlüsselenzyms (GAD2) moduliert, was wiederum den GABA-Pool modulieren wird, eröffnet eine neue Perspektive für Arzneimittel gegen Fettleibigkeit.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Diagnostizieren einer Prädisposition für Fettleibigkeit und insbesondere krankhafte Fettleibigkeit bei einem menschlichen Subjekt, welches das Bestimmen umfasst, ob eine Keimbahnänderung in der Sequenz der 5' flankierenden Region des gad2-Gens vorliegt, dessen codierende Sequenz durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, wobei die Änderung die Anwesenheit mindestens einer der folgenden Mutationen ist: -243 A>G am Nucleotid 2137 von SEQ ID Nr. 2, -1,6 kb G>A am Nucleotid 780 von SEQ ID Nr. 2, -2004 A>T am Nucleotid 376 von SEQ ID Nr. 2, wobei die Änderung eine Prädisposition für Fettleibigkeit anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Fettleibigkeit krankhafte Fettleibigkeit ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Prädisposition für Fettleibigkeit bei einem menschlichen Subjekt aus einer Probe des Subjekts, in dem die Konzentration eines Expressionsprodukts des gad2-Gens in der Probe untersucht wird.
Verfahren nach Anspruch 3, in dem das Expressionsprodukt RNA oder Protein oder GABA ist.
Verfahren zur Durchmusterung potentieller Fettleibigkeitsarzneistoffe, welches umfasst: Vereinigen (i) einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Fettleibigkeitsarzneistoff ist, (ii) eines GAD2-Polypeptids und Bestimmen der Menge der Bindung des GAD2-Polypeptids an die Verbindung.
Verfahren zur Durchmusterung potentieller Fettleibigkeitstherapeutika, welches umfasst: Vereinigen (i) eines GAD2-Bindungspartners, (ii) eines GAD2-Polypeptids und (iii) einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Fettleibigkeitstherapeutikum ist, und Bestimmen der Menge an Bindung des GAD2-Polypeptids an seinen Bindungspartner.
Verfahren nach Anspruch 6, in dem der GAD2-Bindungspartner L-Glutaminsäure ist.
Verfahren zum Durchmustern von potentiellen Fettleibigkeitstherapeutika, welches umfasst: Vereinigen (i) eines gad2-Bindungspartners, (ii) eines gad2-Gens und (iii) einer Verbindung, von der vermutet wird, dass sie ein Fettleibigkeitstherapeutikum ist, und Bestimmen der Menge an Bindung des gad2-Gens an seinen Bindungspartner.
Verfahren nach Anspruch 8, in dem der gad2-Gen-Bindungspartner IK2 (Ikaros 2) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Sense-Molekül, das ein Fragment der 5' flankierenden Region des gad2-Gens umfasst, die insbesondere die -243 A>G Variante (am Nucleotid 2137 der SEQ ID Nr. 2) innerhalb dieser Region umfasst, und eine pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung eines Antisense-Moleküls, das komplementär zu der gad2-mRNA ist, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit, insbesondere krankhafter Fettleibigkeit.
Verwendung eines Sense-Moleküls, das ein Fragment der 5' flankierenden Region des gad2-Gens umfasst, die insbesondere die -243 A>G Variante (am Nucleotid 2137 der SEQ ID Nr. 2) innerhalb der Region umfasst, für die Herstellung eines Arzneimittels, das zur Behandlung von Fettleibigkeit bestimmt ist.
Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, das in seinem Genom integriert die Nucleinsäuresequenz von gad2 oder die codierende Sequenz davon operativ mit Regulationselementen verknüpft aufweist, wobei die Expression der Sequenz die Konzentration des GAD2-Proteins und/oder den GABA-Pool in dem Säugetier relativ zu einem nicht-transgenen Tier derselben Art erhöht, als Modell zur Untersuchung von Fettleibigkeit oder zum Testen von potentiellen Antifettleibigkeitsarzneistoffen.
Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Säugetiers, dessen Genom eine Zerstörung des endogenen gad2-Gens umfasst, wobei die Zerstörung die Insertion einer selektierbaren Markersequenz umfasst und wobei die Zerstörung zur Folge hat, dass das nicht-menschliche Säugetier einen Mangel der GABA-Konzentration im Vergleich zu eine nicht-menschlichen Wildtyp-Säugetier zeigt, als Modell zur Untersuchung von Fettleibigkeit und zum Testen von potentiellen Antifettleibigkeitsarzneistoffen.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Säugetier eine Maus ist.