DE60132628T2

DE60132628T2 - Verfahren und vorrichtung zum sammeln und zum stabilisieren einer biologischen probe

Info

Publication number: DE60132628T2
Application number: DE60132628T
Authority: DE
Inventors: Frank Cedar Knolls AUGELLO; Helge Bastian; Uwe Oelmuller; Lynne Maplewood RAINEN; Matthew Madison WALENCIAK; Ralf Wyrich
Original assignee: Qiagen GmbH; Becton Dickinson and Co
Current assignee: Qiagen GmbH; Becton Dickinson and Co
Priority date: 2000-11-08
Filing date: 2001-11-07
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2021-11-08
Also published as: US6617170B2; US20020146677A1; JP2010217198A; US6602718B1; HK1063503A1; DE60132628D1; US20040115689A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sammeln, Aufbewahren, Transportieren und Stabilisieren einer biologischen Probe und insbesondere einer Vollblutprobe direkt von einem Patienten. Insbesondere betrifft die Erfindung evakuierte Flüssigkeitsprobenbehälter mit einem stabilisierenden Additiv, das darin enthalten ist, um Nucleinsäuren unmittelbar beim Isolieren einer biologischen Probe zu stabilisieren und eine ex-vivo-Geninduktion und einen Zerfall während der Aufbewahrung zu hemmen.
Hintergrund der Erfindung
Probensammelbehälter werden seit vielen Jahren zum Sammeln und Aufbewahren von Blut und anderen Körperflüssigkeiten oder Proben allgemein verwendet. Typischerweise sind die Sammelbehälter Glas- oder Kunststoffröhrchen mit einem nachgiebigen Stopfen. Diese Glas- oder Kunststoffröhrchen werden oft zum Sammeln von Blut verwendet.
Es sind Blutsammelröhrchen erhältlich, bei denen das Röhrchen evakuiert wird, um ein Blutvolumen in das Röhrchen zu ziehen. Die Röhrchen können verschiedene Additive wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) haben, die darin enthalten sind, um die Blutprobe für einen speziellen Test vorzubereiten. Ein übliches Additiv ist ein Antikoagulationsmittel. Typischerweise ist das gerinnungshemmende Additiv ein gepuffertes Citrat oder Heparin in einer wässrigen Lösung. Das wässrige Citrat wird mit der Blutprobe in einer spezifizierten Menge vereinigt, um die Menge eines gerinnungshemmenden Mittels zu bestimmen, die zur Durchführung bestimmter Tests erforderlich ist. Diese Vorrichtungen können nur zum serologischen Testen verwendet werden, weil die Additive die Nucleinsäuren in der Probe nicht stabilisieren. Während des Transports werden labile RNA-Moleküle enzymatisch zersetzt, so dass eine anschließende RNA-Trennung und -Analyse schwierig ist. Weiterhin bewirken eine mechanische Reizung oder Änderungen von physikalischen Bedingungen wie beispielsweise der Temperatur oder eine Zerstörung von Zellen während des Sammelns des Bluts und des Transports die Induktion einer Gentranskription mit einer gleichzeitigen Über- oder Unterproduktion bestimmter mRNA-Spezies.
Übliche Additive, die gerinnungshemmende Mittel zur Erhaltung eines ungerinnbaren Zustands der Blutprobe einschließen, werden zur Durchführung verschiedener Verarbeitungsschritte verwendet. Beispielsweise werden gerinnungshemmende Mittel typischerweise in Blutproben eingesetzt, bevor eine Zentrifugation zur Trennung des Bluts in Zellschichten erfolgt. Ein Beispiel für diesen Typ eines Probenröhrchens, das ein Antikoagulationsmittel enthält, ist im U.S.-Patent Nr. 5,667,963 , Smith et al., offenbart.
In den vergangenen Jahren besteht auf dem Gebiet der biologischen, medizinischen und pharmakologischen Wissenschaften ein zunehmendes Interesse an der Untersuchung von Genaktivitäten und Nucleinsäuren, die aus biologischen Proben erhalten werden. Insbesondere können Ribonucleinsäuren umfangreiche Informationen des genetischen Ursprungs und der funktionalen Aktivität der Zelle ergeben. Diese Informationen können in der klinischen Praxis zur Diagnostizierung von Infektionen, zum Nachweis des Vorhandenseins von Oncogenen exprimierenden Zellen, zum Nachweis von Erbkrankheiten, zur Überwachung des Zustands von Wirts-Abwehrmechanismen, zur Untersuchung und Diagnose von Stoffwechselkrankheiten, zur Untersuchung des Einflusses von Medikamenten auf die Genexpression in Patienten, zur Untersuchung von Neben- und toxischen Wirkungen von Medikamenten und zur Bestimmung des HLA-Typs oder eines anderen Identitätsmarkers verwendet werden.
Es existiert eine Anzahl von Verfahren zum Isolieren von RNA, welche eine Zerstörung der Zelle und die Freisetzung von RNA in Lösung einschließen. Andere Verfahren existieren zum Schutz der RNA vor einem enzymatischen Aufschluss durch endogene RNasen. Die RNA kann dann von der DNA und vom Protein abgetrennt werden, die zusammen mit der RNA löslich gemacht werden. Diese Verfahren werden üblicherweise schrittweise durchgeführt, statt gleichzeitig Zellen zu lysieren, RNA löslich zu machen und RNasen zu hemmen. Es sind einige Verfahren zum Lysieren von Zellen und zum Hemmen von RNasen bekannt, die chaotrope Salze von Guanidinium verwenden.
Ein üblicherweise eingesetztes Verfahren zur Isolierung von RNA umfasst ein Homogenisieren von Zellen in Guanidiniumisothiocyanat, gefolgt von der nacheinander erfolgenden Zugabe von Natriumacetaten und Phenol und Chloroform/Isoamylalkohol. Nach dem Zentrifugieren wird RNA durch die Zugabe von Alkohol aus der oberen Schicht ausgefällt. Andere Verfahren umfassen die Zugabe von heißem Phenol zu einer Zellsuspension, gefolgt von einer Ausfällung in Alkohol.
Zum Lysieren von Zellen und zur Freisetzung von zytoplasmischer RNA werden anionische und kationische Tenside verwendet. Ein Beispiel für ein Verfahren zum Lysieren von Zellen und zum gleichzeitigen Ausfällen von RNA und DNA aus der Lösung ist im U.S.-Patent Nr. 5,010,183 , Macfarlane, offenbart. Bei diesem Verfahren wird die RNA unlöslich gemacht. Eine 2%ige Lösung des Tensids Benzyldimethyl-n-hexadecylammoniumchlorid zusammen mit 40% Harnstoff und anderen Additiven wird zu einer Zellsuspension gegeben. Die Suspension wird dann zentrifugiert, um ein Pellet des unlöslichen Materials zu isolieren. Das Pellet wird in Ethanol resuspendiert, und die RNA und die DNA werden durch Zugabe eines Salzes ausgefällt.
Ein Verfahren zur Analyse von RNA, die aus Blut isoliert ist, nutzt Amplifizierungsverfahren einschließlich der Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis von RNA-Sequenzen in winzigen Mengen. Eine Schwierigkeit bei der Analyse von RNA besteht in der Trennung der RNA vom Protein und der DNA in der Zelle, bevor die RNA von Nucleasen abgebaut wird. RNase und andere Nucleasen sind im Blut in Mengen vorhanden, die ausreichend sind, um ungeschützte RNA zu zerstören. Daher ist es wünschenswert, ein Verfahren zur Isolierung von RNA aus Zellen auf eine Weise zu verwenden, die eine Hydrolyse von RNA durch Nuclease verhindert.
Mit den gegenwärtig üblicherweise eingesetzten Verfahren zum Sammeln von Blut ist es möglich, das Blut zu sammeln und für eine Analyse zu einem späteren Zeitpunkt zu halten. Die Sammelvorrichtung kann ein Antikoagulationsmittel einschließen, um eine Koagulation während der Aufbewahrung zu verhindern. Die im Blut vorhandenen Nucleasen hydrolysieren jedoch einige RNA-Spezies während der Lagerung und des Transports, während eine mechanische Reizung oder Änderungen der physikalischen Eigenschaften wie der Temperatur oder eine Zerstörung von Zellen während der Blutabnahme die Induktion einiger RNA-Spezies bewirkt. Diese präanalytischen Faktoren bei der Handhabung von Proben führen von einer Unter- oder Überrepräsentation von mRNA-Spezies und schließlich zu einem Abbau der gesamten RNA, der mittels molekularer Diagnosetestverfahren bestimmt wird. Darüber hinaus kann eine Geninduktion zu erhöhten RNA-Konzentrationen in der Probe führen, was falsche Ergebnisse verursachen kann. Demgemäß besteht in der Industrie ein andauernder Bedarf an einem verbesserten Verfahren und einer verbesserten Sammelvorrichtung für Blut und andere biologische Proben, die das in-vivo-Transkriptionsprofil für Tests auf der Grundlage von Nucleinsäuren erhält.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Sammeln einer biologischen Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, das einen Sammelbehälter enthält, und ein Verfahren zum Sammeln einer biologischen Probe und zum sofortigen In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem stabilisierenden Additiv, um eine ex-vivo-Geninduktion in der Probe zu blockieren, wodurch das in-vivo-Transkriptionsprofil beibehalten wird.
Demgemäß besteht ein primärer Aspekt der Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Sammeln einer biologischen Probe und insbesondere von Vollblut. Die biologische Probe wird unmittelbar nach der Isolierung mit einem Stabilisator in Kontakt gebracht, um die RNA zu stabilisieren und zu konservieren, indem eine Geninduktion in der Probe während der Lagerung gehemmt oder blockiert wird. Das stabilisierende Additiv ist in einer Menge vorhanden, die wirksam ist, um die Nucleinsäuren, insbesondere RNA, zu stabilisieren und eine Geninduktion zu hemmen oder zu blockieren.
Ein Aspekt der Erfindung besteht in der Herstellung einer biologischen Probe, die bei Raumtemperatur für längere Zeiträume stabil ist, wobei eine Geninduktion nur wenig oder überhaupt nicht erfolgt. Demgemäß wird ein Verfahren zur Erzeugung einer biologischen Probe verfügbar gemacht, die bei Raumtemperatur stabil ist, wobei während der Aufbewahrung nur ein geringes oder gar kein Auftreten einer Geninduktion erfolgt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zum Hemmen einer Geninduktion von Nucleinsäuren in einer biologischen Probe und in einem Lysieren von Zellen, Bakterien, Viren und Reticulozyten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Sammelbehälters zum Aufnehmen und Sammeln einer biologischen Probe, wobei der Behälter mit einer abgemessenen Menge eines die Geninduktion blockierenden Mittels vorgefüllt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung einer biologischen Probe und insbesondere von Vollblut durch ein In-Kontakt-Bringen der Probe unmittelbar nach dem Sammeln mit einem Stabilisator, um eine Geninduktion zu hemmen oder zu verhindern, wenn die Probe bei Raumtemperatur aufbewahrt wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung einer biologischen Probe und insbesondere von Vollblut durch ein In-Kontakt-Bringen der Probe unmittelbar nach dem Sammeln mit einem Stabilisator, um eine Geninduktion oder einen Abbau von Nucleinsäuren zu hemmen oder zu verhindern, wenn die stabilisierte Blutprobe bei Temperaturen unterhalb der Raumtemperatur, typischerweise bei 2°C bis 8°C, oder bei Temperaturen, die zum Archivieren der Proben geeignet sind, beispielsweise bei Temperaturen von –20°C bis –80°C, aufbewahrt wird. Zur Isolierung von Nucleinsäuren können gefrorene Proben bei Raumtemperatur aufgetaut werden.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Blockierung einer ex-vivo-Geninduktion in einer biologischen Probe unmittelbar nach dem Sammeln der biologischen Probe.
Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines evakuierten Behälters, der mit einer wirksamen Menge eines Mittels zur Blockierung einer Geninduktion vorgefüllt ist, wobei der Behälter einen Innendruck hat, der ausreichend niedrig ist, um eine vorbestimmte Menge einer biologischen Probe in den Behälter zu saugen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Blutsammelbehälters zum Sammeln einer Blutmenge und im Vermischen des Blutes mit einem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion zum Zeitpunkt des Sammelns, wodurch eine biologische Probe erzeugt wird, die bei Raumtemperatur stabil ist, indem eine Geninduktion so verhindert wird, dass eine Nucleinsäureanalyse der Probe zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt werden kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung von Blut durch das Sammeln der Blutprobe in einem Behälter mit einem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion und einem Puffer. Das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion kann ein Detergens, ein chaotropes Salz, RNase-Inhibitoren, Chelatisierungsmittel oder Mischungen davon sein. Der pH-Wert der resultierenden Mischung wird so eingestellt, dass ein Nucleinsäureabbau oder eine Geninduktion blockiert werden und eine effiziente Rückgewinnung des Analyten gefördert wird.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Stabilisierung einer Blutprobe in einer Sammelvorrichtung bei einem pH-Wert von 2 bis 5 in Gegenwart mindestens eines Mittels zur Blockierung einer Geninduktion.
Die Aspekte der Erfindung werden im Wesentlichen erreicht, indem eine Vorrichtung zum Sammeln einer biologischen Probe verfügbar gemacht wird. Die Vorrichtung schließt einen Behälter ein, der eine Seitenwandung, eine Bodenwandung und ein offenes Ende, die eine Innenkammer definieren, und einen Verschluss, der das offene Ende verschließt, umfasst. Der Behälter umfasst wenigstens ein Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer Menge, die wirksam ist, um die biologische Probe zu konservieren und eine ex-vivo-Geninduktion zu blockieren oder zu hemmen. Der Behälter kann mit dem Stabilisierungsmittel vorgefüllt sein.
Die Aspekte der Erfindung werden weiterhin erreicht, indem ein Verfahren zur Herstellung einer bei Raumtemperatur stabilen biologischen Probe verfügbar gemacht wird, umfassend die Schritte des: Bereitstellens eines Probensammelbehälters mit einer Seitenwandung und einem Boden, die eine Innenkammer definieren, wobei der Behälter wenigstens ein Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer Menge und Konzentration enthält, die ausreichend sind, um eine ex-vivo-Geninduktion zu blockieren und die biologische Probe zu konservieren. Eine biologische Probe wird erhalten und sofort in den Behälter eingeführt, und die biologische Probe wird mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion vermischt, wodurch eine stabilisierte biologische Probe gebildet wird.
Die Aspekte der Erfindung werden auch erreicht, indem ein Verfahren zum Sammeln und Stabilisieren einer Vollblut- oder einer anderen biologischen Probe verfügbar gemacht wird. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines Probensammelbehälters mit einer Seitenwandung, einer Bodenwandung und einem Verschlusselement, die eine Innenkammer bilden. Der Behälter ist mit einer wirksamen Menge einer wässrigen Lösung oder Dispersion eines Mittels zur Stabilisierung von Nucleinsäuren vorgefüllt, wodurch Nucleinsäuren und/oder das Transkriptionsprofil in einer Vollblutprobe stabilisiert und konserviert werden. Die Innenkammer hat einen Druck, der niedriger als der Luftdruck ist. Eine Vollblutprobe wird direkt vom Patienten im Sammelbehälter gesammelt, und die Blutprobe wird mit dem Stabilisierungsmittel vermischt, wodurch eine stabile Vollblutprobe gebildet wird.
Diese Aspekte, Vorteile und andere hervorragende Merkmale der Erfindung gehen aus der beigefügten Zeichnung und der folgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung hervor.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
Das Folgende ist eine kurze Beschreibung der Zeichnungen, worin:
1 eine Querschnitts-Seitenansicht des Behälters in einer Ausführungsform der Erfindung ist,
2 ein Diagramm ist, in dem die Änderungen des mRNA-Gehalts eines ersten Blutspenders veranschaulicht sind,
3 ein Diagramm ist, in dem die Änderungen des mRNA-Gehalts eines zweiten Blutspenders veranschaulicht sind,
4 ein Diagramm ist, in dem die Änderungen des mRNA-Gehalts eines dritten Blutspenders veranschaulicht sind,
5 ein Diagramm ist, in dem die Änderungen des mRNA-Gehalts eines vierten Blutspenders veranschaulicht sind,
6 ein Diagramm der Menge bestimmter Interleukin- und anderer mRNA-Spezies im Vollblut einer Blutprobe ohne ein stabilisierendes Reagens in einem fünftägigen Zeitraum ist,
7 ein Diagramm ist, in dem die Änderungen der Menge von IL-8- und IL-10-mRNA einer Blutprobe ohne ein stabilisierendes Reagens in einem fünftägigen Zeitraum veranschaulicht sind,
8 ein Diagramm ist, in dem die Mengen bestimmter mRNA-Spezies in Vollblut, die bei Raumtemperatur mit Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und Weinsäure aufbewahrt wurden, in einem fünftägigen Zeitraum veranschaulicht sind, und
9 ein Diagramm ist, in dem die Änderungen der Mengen an IL-8 und IL-10 in der Probe von 8 in einem fünftägigen Zeitraum aufgeführt sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Stabilisierung und Konservierung einer biologischen Probe, um eine Bestimmung von in-vivo-Gentranskriptzahlen mit einer höheren Genauigkeit zu ermöglichen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Hemmen oder Blockieren einer Geninduktion in einer biologischen Probe während des Sammelns, des Transports und der Aufbewahrung. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist die Vorrichtung ein vorgefüllter Behälter, der eine Menge eines Mittels zur Blockierung einer Geninduktion zum Vermischen mit einer biologischen Probe unmittelbar beim Sammeln der Probe enthält. Die Menge des Mittels zur Blockierung einer Geninduktion ist vorzugsweise in einer Menge eingeschlossen, die wirksam ist, um sich mit der biologischen Probe zu vermischen und diese zu stabilisieren. Die biologische Probe wird vorzugsweise direkt von einem Tier und insbesondere von einem menschlichen Patienten isoliert.
Die biologische Probe kann eine Körperflüssigkeit sein, die einem Tier und insbesondere einem menschlichen Patienten entnommen ist. In einer Ausführungsform ist die biologische Probe Vollblut. Beispiele für andere biologische Proben umfassen zellhaltige Zusammensetzungen wie Konzentrate von roten Blutkörperchen, Plättchenkonzentrate, Leukozytenkonzentrate, Tumorzellen, Knochenmark, Aspirate, Gewebe, feine Nadelaspirate und Zervixproben. In einer anderen Ausführungsform ist die biologische Probe eine Körperflüssigkeit wie Plasma, Serum, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit und Sputum. Bei der biologischen Probe kann es sich auch um Bakterien und eukaryontische Mikroorganismen handeln. In einer Ausführungsform ist die biologische Probe aus der aus Körperflüssigkeiten, Geweben, Körperabstrichen und Körperausstrichen bestehenden Gruppe ausgewählt. Das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion der Erfindung ist geeignetes Mittel, das dazu fähig ist, das Auftreten einer ex-vivo-Geninduktion während der Aufbewahrung einer biologischen Probe zu hemmen, zu verhindern oder zu vermindern. Das Mittel stabilisiert die biologische Probe wie eine Blutprobe, wodurch eine bei Raumtemperatur stabile Zusammensetzung erzeugt wird, die eine Transkription von in der biologischen Probe vorhandenen Nucleinsäuren hemmt oder verhindert.
In einer Ausführungsform ist die Vorrichtung 10 eine Vorrichtung zum Entnehmen einer Blutprobe direkt von einem Tier und insbesondere einem menschlichen Patienten zum Stabilisieren der Nucleinsäuren und zur Blockierung einer Gentranskription direkt zum Zeitpunkt des Sammelns. Unter Bezugnahme auf die Figuren umfasst die Vorrichtung 10 einen Behälter 12, der eine Kammer 14 definiert. In der veranschaulichten Ausführungsform ist der Behälter 12 ein Hohlrohr mit einer Seitenwandung 16, einem geschlosse nen unteren Ende 18 und einem offenen oberen Ende 20. Der Behälter 12 ist so dimensioniert, dass er ein geeignetes Volumen einer biologischen Probe aufnimmt. Ein nachgiebiger Verschluss 22 ist auf dem offenen Ende 20 angeordnet, um den Behälter 12 zu verschließen. Vorzugsweise bildet der Verschluss 22 eine Versiegelung, die dazu fähig ist, den Behälter 12 effektiv zu verschließen und eine biologische Probe in der Kammer 14 zu halten. Über dem Verschluss 22 befindet sich eine Schutzabdeckung 23.
Der Behälter 12 kann aus Glas, Kunststoff oder anderen geeigneten Materialien bestehen. Kunststoffmaterialien können sauerstoffundurchlässige Materialien sein oder eine sauerstoffundurchlässige Schicht enthalten. Alternativ kann der Behälter 12 aus einem wasser- und luftdurchlässigen Kunststoffmaterial bestehen. Vorzugsweise hält die Kammer 14 eine Druckdifferenz zum Luftdruck aufrecht und weist einen Druck auf, der niedriger als der Luftdruck ist. Der Druck in der Kammer 14 wird so ausgewählt, dass ein vorbestimmtes Volumen einer biologischen Probe in die Kammer 14 gesogen wird. Typischerweise wird eine biologische Probe in die Kammer 14 gesogen, indem der Verschluss 22 mit einer Nadel 24 oder einer Kanüle durchstochen wird, wie im Fachgebiet bekannt ist. Ein Beispiel für einen geeigneten Behälter 12 und einen Verschluss 22 ist im U.S.-Patent Nr. 5,860,937 offenbart.
Der Behälter 12 besteht vorzugsweise aus einem transparenten Material. Beispiele für geeignete transparente thermoplastische Materialien umfassen Polycarbonate, Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat. Der Behälter 12 hat ein zweckmäßiges Maß, das gemäß dem erforderlichen Volumen der gesammelten biologischen Probe ausgewählt ist. In einer Ausführungsform hat der Behälter 12 eine rohrförmige Form mit einer Axiallänge von etwa 100 mm und einem Durchmesser von etwa 13 mm bis 16 mm.
Der Verschluss 22 besteht aus einem nachgiebigen Material, das dazu fähig ist, eine Innendruckdifferenz beizubehalten, die niedriger als der Luftdruck ist, und das mit einer Nadel oder einer anderen Kanüle durchstochen werden kann, um eine biologische Probe in den Behälter 12 einzuführen. Geeignete Materialien für den Verschluss umfassen zum Beispiel Siliconkautschuk, natürlichen Kautschuk, Styrol-Butadien-Kautschuk, Ethylen-Propylen-Copolymere und Polychloropren.
Der Behälter 12 enthält auch ein Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion zum Stabilisieren der Blutprobe. Das Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion ist vorzugsweise eine Flüssigkeit, die ein Stabilisierungsmittel enthält und die in einer Menge eingeschlossen ist, die wirksam ist, um sich mit der biologischen Probe zu vermischen und die Nucleinsäuren zu stabilisieren und eine Geninduktion der darin enthaltenen Zellen oder Nucleinsäuren zu blockieren oder zu hemmen. In einer Ausführungsform werden der Innendruck des Behälters 12 und das Volumen des stabilisierenden Additivs 26 so ausgewählt, dass die erforderliche Konzentration des Stabilisierungsmittels für das Volumen der gesammelten biologischen Probe erhalten wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Innendruck des Behälters 12 so ausgewählt, dass ein vorbestimmtes Volumen von etwa 2,5 ml einer biologischen Probe in den Behälter 12 gesogen wird, der ein wirksames Volumen eines Mittels 26 zur Blockierung einer Geninduktion zur Stabilisierung des Volumens der biologischen Probe enthält. In alternativen Ausführungsformen kann der Behälter 12 einen Innendruck haben, der im Wesentlichen der Luftdruck ist. Vorzugsweise wird der Behälter 12 vom Hersteller mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion vorgefüllt und in einer gebrauchsfertigen Form verpackt. Typischerweise ist der verpackte Behälter steril und in sterilen Verpackungsmaterialien verpackt.
In einer Ausführungsform besteht der Behälter 12 aus einem Kunststoff, der wasser- und gasdurchlässig ist. Ein Wasserverlust durch Verdampfung des Stabilisierungsmittels durch die durchlässige Wandung des Behälters erhöht die Konzentration des Stabilisierungsmittels und vermindert den Druck innerhalb des Behälters. Die Diffusion von Sauerstoff durch die Wandung des Rohres hat die Auswirkung einer Verminderung des Unterdrucks im Behälter. Die Wasser- und Sauerstoffdurchlässigkeitseigenschaften des Behälters werden so ausgewählt, dass die gewünschte Druckdifferenz innerhalb des Behälters für die gewünschte Lagerzeit des Behälters beibehalten wird. Die Lagerdauer wird optimiert, indem die Sauerstoffdurchlässigkeit mit dem Wasserverlust ins Gleichgewicht gebracht wird. Der Behälter hat eine Lagerdauer von wenigstens etwa einem Jahr und vorzugsweise länger.
Das Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion ist ein Feststoff oder eine wässrige Lösung oder Suspension wenigstens eines aktiven Stabilisierungsmittels, das in den Behälter als vorgefüllter Behälter eingeschlossen ist. Das feste Mittel zur Blockierung einer Geninduktion kann ein trockenes Pulver oder teilchenförmiges Material wie ein sprühgetrocknetes oder lyophilisiertes Material sein. Das feste Mittel zur Blockierung einer Geninduktion kann ein loses teilchenförmiges Material sein, das im Behälter enthalten ist, oder eine trockene Beschichtung auf der Innenfläche des Behälters.
Das Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion enthält vorzugsweise wenigstens ein Stabilisierungsmittel in einer Konzentration, die dazu fähig ist, Nucleinsäuren in der biologischen Probe zu stabilisieren, und insbesondere eine Vollblutprobe. Typischerweise ist ein Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion eine wässrige Lösung eines Stabilisierungsmittels oder eine Mischung von Stabilisierungsmitteln. Die Stabilisierungsmittel sind vorzugsweise dazu fähig, DNA und RNA einschließlich mRNA, tRNA, snRNA, RNA mit einer niedrigen Molmasse (LMWRNA), rRNA und cRNA wirksam zu stabilisieren und eine ex-vivo-Geninduktion in einer biologischen Probe während der Aufbewahrung bei Raumtemperatur zu blockieren oder zu hemmen. Beispiele für geeignete Stabilisierungsmittel zur Stabilisierung und Konservierung von Nucleinsäuren und/oder zur Verhinderung einer Geninduktion umfassen kationische Verbindungen, Detergentien, chaotrope Salze, Ribonuclease-Inhibitoren, Chelatisierungsmittel, quaternäre Amine und Mischungen davon. Ein geeigneter Ribonuclease-Inhibitor ist das Plazenta-RNase-Inhibitorprotein. Beispiele für chaotrope Salze umfassen Harnstoffe, Formaldehyd, Guanidiniumisothiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Formamid, Dimethylsulfoxid, Ethylenglycol und Tetrafluoracetat. In anderen Ausführungsformen ist das Geninduktionsmittel ein organisches Lösungsmittel oder ein organisches Reduktionsmittel. Die Alkohole sind im Allgemeinen niedere Alkohole. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind aus der aus Phenol, Chloroform, Aceton und Alkoholen bestehenden Gruppe ausgewählt. Beispiele für organische Reduktionsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mercaptoalkoholen, Dithiothreitol (DTT) und Mischungen davon.
Das Stabilisierungsmittel kann auch eine andere Komponente zur Behandlung der biologischen Probe einschließen. Zum Beispiel können Chemikalien eingeschlossen sein, um Zellen in der biologischen Probe zu permeabilisieren oder zu lysieren. Vorzugsweise lysiert das Stabilisierungsmittel Reticulozyten, Bakterien, rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen. Andere Komponenten umfassen Proteinasen, Phenol, Phenol/Chloroform-Mischungen, Alkohole, Aldehyde, Ketone und organische Säuren.
Bei den Detergentien kann es sich um anionische Detergentien, kationische Detergentien oder nichtionische Detergentien handeln. Das anionische Detergens kann beispielsweise Natriumdodecylsulfat sein. Nichtionische Detergentien können beispielsweise Ethylenoxid-Kondensationsprodukte wie ethoxylierte Fettsäureester mehrwertiger Alkohole sein. Ein bevorzugtes nichtionisches Detergens ist ein Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, das unter der Handelsbezeichnung TWEEN 20 von der Sigma Chemical Co. verkauft wird. Ein weiteres geeignetes Detergens ist Natriumdodecylsulfat. Die Detergentien sind in einer Menge eingeschlossen, die wirksam ist, um die Zellen zu lysieren. Die Detergentien können auch Mizellen und andere Komplexe mit den Nucleinsäuren bilden und RNA und/oder DNA durch andere Mechanismen schützen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Stabilisierungsmittel eine kationische Verbindung mit der allgemeinen Formel YR₁R₂R₃R₄ X, wobei Y Stickstoff oder Phosphor ist, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig ein verzweigtes oder nichtverzweigtes Alkyl, ein C₆-C₂₀-Aryl oder ein C₆-C₂₆-Aralkyl sind und X ein organisches oder anorganisches Anion ist. In einer Ausführungsform sind R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig ein verzweigtes C₃-C₂₀-Alkyl oder ein nichtverzweigtes C₁-C₂₀-Alkyl.
Das Anion kann ein Anion einer anorganischen Säure wie HX sein, wobei X Fluor, Chlor, Brom oder Iod ist, wobei Chlor und Brom bevorzugt sind. Das Anion kann auch das Anion einer Mono-, Di- oder Tricarbonsäure sein. Typischerweise ist das Anion der kationischen Verbindung aus der aus Phosphat, Sulfat, Formiat, Acetat, Propionat, Oxalat, Malonat, Succinat, Citrat, Bromid und Chlorid bestehenden Gruppe ausgewählt.
Wenn R₁, R₂, R₃ und R₄ Arylgruppen sind, können die Arylgruppen unabhängig beispielsweise Phenyl, ein niederalkylsubstituiertes Benzyl und/oder ein halogeniertes Benzyl sein. In einer Ausführungsform ist R₁ ein C₁₂-, C₁₄- oder C₁₆-Alkyl, und R₁, R₂, R₃ und R4 sind Methylgruppen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Y Stickstoff, und das Stabilisierungsmittel ist ein quaternäres Amin. Geeignete quaternäre Amine umfassen Alkyltrimethylammonium, wobei die Alkylgruppe 12, 14 oder 16 Kohlenstoffe hat. Eine bevorzugte kationische Verbindung ist Tetradecyltrimethylammoniumoxalat. Andere geeignete quaternäre Amine umfassen Alkyltrimethylammonium, wobei die Alkylgruppe 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffe einschließt. Im Allgemeinen ist es wünschenswert, dass R₁, R₂, R₃ und R₄ 20 Kohlenstoffatome oder weniger aufweisen, weil Alkylgruppen mit 20 Kohlenstoffatomen schwierig löslich zu machen und in Lösung zu halten sind. Beispiele für geeignete quaternäre Amintenside sind im U.S.-Patent Nr. 5,728,822 offenbart.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Stabilisierungsmittel eine kationische Verbindung und umfasst einen Protonendonor in einer Menge, die wirksam ist, um Nucleinsäuren zu stabilisieren. Es ist gefunden worden, dass die Zugabe eines Protonendonors zu den kationischen Verbindungen die Fähigkeit der kationischen Verbindungen zur Stabilisierung der Nucleinsäuren in der biologischen Probe erhöht. Beispiele für geeignete Protonendonoren umfassen Monocarbonsäuren, Dicarbonsäuren, Tricarbonsäuren, aliphatische Ketodicarbonsäuren, Aminosäuren, Mineralsäuren und Mischungen davon. In einer Ausführungsform ist der Protonendonor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkenylcarbonsäuren, aliphatischen C₁-C₆-Monocarbonsäuren, aliphatischen C₂-C₆-Dicarbonsäuren, Tricarbonsäuren, Hydroxymonocarbonsäuren, Hydroxydicarbonsäuren, Hydroxytricarbonsäuren, aliphatischen Ketomonocarbonsäuren, aliphatischen Ketodicarbonsäuren, Aminosäuren und Mischungen davon. Beispiele für geeignete aliphatische Carbonsäuren umfassen C₁-C₆-Alkylcarbonsäuren wie Essigsäure, Propionsäure, n-Butansäure, n-Pentansäure, Isopentansäure, 2-Methylbutansäure, 2,2-Dimethylpropionsäure, n-Hexansäure, n-Octansäure, n-Decansäure und Dodecansäure. Beispiele für Alkenylcarbonsäuren umfassen Acrylsäure, Methacrylsäure, Butensäure, Isobutensäure und Mischungen davon.
Die Dicarbonsäuren des Protonendonors in einer Ausführungsform sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure und Mischungen davon. Beispiele für hydroxylhaltige Säuren umfassen Weinsäure und Apfelsäure. Geeignete Aminosäuren sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin und Mischungen davon. Die Tricarbonsäuren des Protonendonors können aus der aus Citronensäure und Isocitronensäure bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Die Menge des Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion im Behälter 12 ist durch das Innenvolumen des Behälters 12, den Innendruck und das Volumen der in den Behälter gesogenen biologischen Probe festgelegt. In der veranschaulichten Ausführungsform hat der Behälter 12 eine Axiallänge von etwa 100 mm und einen Durchmesser von etwa 16 mm und weist einen Innendruck auf, um eine biologische Probe von etwa 2,5 ml anzusaugen. Das stabilisierende Additiv 26 enthält typischerweise 50 mg bis 90 mg pro ml der Trägerflüssigkeit. Vorzugsweise ist das Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion ein wässriges Medium, das 60 mg/ml bis 80 mg/ml und am meisten bevorzugt 70 mg/ml enthält. Das Volumen des stabilisierenden Additivs 26 im Behälter 12 beträgt etwa 6 bis 8 ml und vorzugsweise 7 ml.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mittel 26 zur Blockierung einer Geninduktion etwa 70 mg/ml eines Nucleinsäure-Stabilisierungsmittels, das dazu fähig ist, eine ex-vivo-Geninduktion zu blockieren oder zu hemmen und das mit dem Vollblut vermischt wird, das einem Patienten direkt abgenommen wird. Das Blut wird mit der Flüssigkeit in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:3,5, vorzugsweise 1:2,5 bis 1:3,1 und am meisten bevorzugt 1:2,7 bis 1:2,8, bezogen auf das Volumen, vermischt.
Die Konzentration des Stabilisierungsmittels ist ausreichend, um die Nucleinsäuren zu stabilisieren und eine ex-vivo-Geninduktion zu blockieren oder zu hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die biologische Probe Vollblut. Die Konzentration des Stabilisierungsmittels nach dem Vermischen mit Blut beträgt 45 mg/ml bis 55 mg/ml der Mischung, vorzugsweise 50 mg/ml bis 53 mg/ml und am meisten bevorzugt 51 mg/ml bis 52 mg/ml.
Das Verfahren der Erfindung wird durchgeführt, indem eine biologische Probe unmittelbar bei der Sammlung in den Behälter eingeführt wird, der das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion enthält. In bevorzugten Ausführungsformen wird die biologische Probe hergestellt und unmittelbar direkt in den Sammelbehälter eingeführt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die biologische Probe ohne dazwischenliegende Verfahren oder Handhabungsschritte direkt vom Patienten in den Sammelbehälter überführt, um eine Zersetzung von Nucleinsäuren zu verhindern oder zu hemmen. Es ist gefunden worden, dass das Sammeln der biologischen Probe direkt vom Patienten wie beim Sammeln einer Vollblutprobe und eine Einführung der Probe direkt in den Behälter, der das Stabilisierungsmittel enthält, die Gentranskription und Zersetzung der Nucleinsäuren, die ansonsten erfolgt, wenn die Probe aufbewahrt wird, bevor sie mit dem Stabilisierungsmittel vereinigt wird, im Wesentlichen verhindert oder vermindert. Es ist gefunden worden, dass ein Vereinigen der biologischen Probe mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion unmittelbar nach dem Sammeln oder der Herstellung der biologischen Probe eine ex-vivo-Geninduktion während der Lagerung der biologischen Probe reduziert oder vermindert.
Die kationischen Verbindungen sind bevorzugte Stabilisierungsmittel. Die kationischen Verbindungen erzeugen eine stabilisierte Vollblutprobe, die bei Umgebungstemperatur oder unterhalb der Raumtemperatur zu einem Labor transportiert werden kann, wo die Nucleinsäuren aus der Probe isoliert werden können. Die stabilisierte Vollblutprobe kann auch bei einer Temperatur, die niedriger als die Raumtemperatur ist, zum Beispiel bei 2°C bis 8°C, aufbewahrt und transportiert werden. Die stabilisierte Vollblutprobe kann auch unter Bedingungen aufbewahrt werden, unter denen sie gefroren ist. Für ein längeres Aufbewahren und Archivieren können die Proben bei etwa –20°C aufbewahrt werden. Für eine spätere Isolation von Nucleinsäuren kann die Probe aufgetaut und weiterverarbeitet werden. Es ist gefunden worden, dass die Stabilisierungsmittel ein zuverlässiges Gefrieren von Blutproben für eine spätere RNA-Isolation ermöglichen. Biologische Proben und insbesondere Blutproben, die ohne die Stabilisierungsmittel gefroren werden, erfahren während des Auftauvorgangs einen Zerfall von Nucleinsäuren und insbesondere einen RNA-Abbau. In anderen Ausführungsformen können die biologischen Proben bei 0°C bis 80°C und vorzugsweise bei 0°C bis –70°C gelagert werden.
Es ist gefunden worden, dass die Sammlung und Stabilisierung von Nucleinsäuren in der biologischen Probe vom pH-Wert der biologischen Probe und des Stabilisierungsmittels abhängt. Der pH-Wert der resultierenden Mischung kann von einem pH-Wert von 2 bis zu einem pH-Wert von 12, vorzugsweise etwa einem pH-Wert von 2 bis zu einem pH-Wert von 10 und noch mehr bevorzugt von einem pH-Wert von 3 bis zu einem pH-Wert von 8 reichen. Die Lebensdauer der Nucleinsäuren in diesem Bereich variiert in Abhängigkeit von der biologischen Probe, dem Verhältnis der Menge der biologischen Probe zur Menge des Stabilisierungsmittels und dem verwendeten speziellen Stabilisie rungsmittel. Die Lagerdauer der stabilisierten Nucleinsäuren bei diesem pH-Wert kann von 24 h bis zu mehreren Tagen bei Raumtemperatur reichen. Die Lagerdauer der stabilisierten Nucleinsäuren im pH-Wert-Bereich kann in einem Kühlschrank bei 2°C bis 8°C bis zu mehreren Wochen reichen. Die stabilisierten Nucleinsäuren können bei –20°C oder bei tieferen Temperaturen, zum Beispiel –70°C bis –80°C, gefroren archiviert werden.
Der pH-Wert der resultierenden Mischung variiert in Abhängigkeit von der stabilisierten biologischen Probe. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die biologische Probe Vollblut, und die Mischung aus Vollblut und dem Stabilisierungsmittel wird auf einen pH-Wert von 2 bis zu einem pH-Wert von 5 eingestellt. Nucleinsäuren, die mit kationischen Verbindungen auf einen pH-Wert von 2 bis zu einem pH-Wert von 5 eingestellt sind, sind bei Raumtemperatur mehrere Tage lang oder bei 2°C bis 8°C mehrere Wochen lang stabil oder können archiviert werden, wenn sie bei Temperaturen von –20°C oder darunter gefroren sind. Es ist gefunden worden, dass eine optimale Langzeitstabilisierung von Nucleinsäuren in der Mischung aus Vollblut und dem Stabilisierungsmittel bei einem pH-Wert von 3,9 bis zu einem pH-Wert von 4,1 erhalten wird.
Die stabilisierende Lösung in der Sammelvorrichtung in einer bevorzugten Ausführungsform hat vor der Zugabe einer biologischen Probe einen optimalen pH-Wert von 3,6 bis 3,8. Nachdem eine Blutprobe zur Sammelvorrichtung gegeben wurde und mit der stabilisierenden Lösung vermischt wurde, hat die resultierende Mischung einen pH-Wert von 3,9 bis 4,1. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Sammelvorrichtung eine Menge eines Stabilisierungsmittels, so dass, wenn dieses in einem Verhältnis von Blut zum Stabilisierungsmittel von 1:2,5 bis 1:3,1, bezogen auf das Volumen, mit Vollblut vermischt wird, die resultierende Mischung einen pH-Wert von 3,9 bis 4,1 hat. In anderen biologischen Proben wird der pH-Wert zur Stabilisierung der Mischung zweckmäßig eingestellt. Beispielsweise ist gefunden worden, dass eukaryontische Zellkulturen bei einem pH-Wert von 4 bis zu einem pH- Wert von 8 und vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 bis zu einem pH-Wert von 8 stabilisiert werden.
Der pH-Wert der Mischung aus der biologischen Probe und dem Stabilisierungsmittel kann durch die Zugabe eines geeigneten Puffers eingestellt werden. Ein Beispiel für einen Puffer, von dem gefunden wurde, dass er bei der Einstellung des pH-Wertes der biologischen Probe wirksam ist, ist Weinsäure. Andere im Fachgebiet bekannte Puffer und Mittel zur Einstellung des pH-Wertes können auch verwendet werden. Der pH-Wert des Puffers kann durch die Zugabe von Natriumhydroxid auf den gewünschten Bereich eingestellt werden.
Die Nucleinsäuren, entweder DNA oder RNA, können von der stabilisierten biologischen Probe mittels verschiedener, im Fachgebiet bekannter Verfahren abgetrennt werden. Es ist gefunden worden, dass die Stabilisierungsmittel während des Reinigungsprotokolls, das im Labor durchgeführt wird, um die gereinigte Nucleinsäure zu erhalten, von den Nucleinsäuren abgetrennt werden können.
Kationische Verbindungen bewirken eine Lyse der Zellen und des Virus in der Probe und bewirken ein Ausfallen der Nucleinsäuren als Komplex mit der Verbindung. Die ausgefällten Nucleinsäuren können mittels einer Phenolextraktion oder mittels eines Formamid-Puffers aus dem Komplex extrahiert werden, wie im Fachgebiet bekannt ist. In einer weiteren Ausführungsform kann das Detergens löslich gemacht werden, um den Komplex zu dissoziieren und die unlöslichen Nucleinsäuren übrig zu lassen. Die Verbindung kann löslich gemacht werden, indem der Komplex mit einer konzentrierten Lösung von Lithiumchlorid oder anderen Lösungen mit einem hohen Salzgehalt wie beispielsweise Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorid behandelt wird. Andere Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren sind im U.S.-Patent Nr. 5,990,301 offenbart.
Beispiel 1 – Stabilisierung von RNA in humanem Blut
Dieses Beispiel demonstriert die Auswirkungen des Verhältnisses von Blut zum Stabilisierungsmittel und der Konzentration des Stabilisierungsmittels.
Für diesen Vergleich wurden 24 Proben hergestellt. Jede Probe wurde aus 2,5 ml Blut hergestellt, das mit einer Natriumcitrat enthaltenden Blutsammelvorrichtung abgenommen wurde, und mit 7,5 ml eines Stabilisierungspuffers vermischt, der 3% (w/v) Tetradecyltrimethylammoniumoxalat bzw. 125 mM und 200 mM Weinsäure in einem 12-ml-Polyethylenrohr enthielt. Der pH-Wert des Puffers wurde mit Natriumhydroxid auf 3,3, 3,5 bzw. 3,7 eingestellt. Proben wurden bei Raumtemperatur 25 h bzw. 72 h lang aufbewahrt. Um die zelluläre RNA zu isolieren, wurden die Rohre 10 min lang bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde einmal mit Wasser gewaschen. Nach einem zusätzlichen 10-minütigen Zentrifugieren bei 5000 × g wurde das Pellet in 300 μl eines Lysepuffers, d. h. des Puffers RLT (QIAGEN GmbH) aufgelöst, mit 360 μl Wasser verdünnt, und es wurden 40 μl Proteinase K zugegeben. Nach einem 10-minütigen Proteinaseaufschluss bei 55°C wurde die Probe 3 min lang bei 20 000 × g zentrifugiert, der Überstand wurde in ein neues Rohr überführt, und 350 μl 98%iges Ethanol wurden zugegeben. Die Probe wurde dann mittels einer 1-minütigen Zentrifugation bei 8000 × g auf eine Spin-Säule aufgetragen, die eine Siliciumdioxid-Membran enthielt. Die Spin-Säule wurde einmal mit einem GITC enthaltenden, waschpufferartigen Puffer RW1 (QIAGEN GmbH) und zweimal mit einer eine Ethanolwaschung enthaltenden, pufferartigen Puffer RPE (QIAGEN GmbH) gewaschen. Die RNA wurde dann mit 2 × 40 μl RNase-freiem Wasser von der Siliciumdioxid-Membran eluiert. Alle Proben wurden zweifach verarbeitet.

Die Ausbeute der isolierten RNA wurde bestimmt, indem die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm in einem Spektrophotometer gemessen und berechnet wurde, dass 1 OD260 einer Konzentration von 40 μg RNA/ml entsprach. Die Unversehrtheit der isolierten RNA wurde durch eine Elektrophore se von 30 μl des Eluats in einem denaturierenden Agarose/Formaldehyd-Gel, das mit Ethidiumbromid angefärbt war, bewiesen. Die RNA-Ausbeute ist in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 1 125 mM Weinsäure

Probe	pH-Wert	Aufbewahrungsdauer (h)	Ausbeute (μg)
1	3,3	24	8,4
2	3,3	24	7,6
3	3,5	24	9,5
4	3,5	24	9,8
5	3,7	24	13,3
6	3,7	24	17,2
7	3,3	72	7,2
8	3,3	72	6,8
9	3,5	72	10,3
10	3,5	72	10,9
11	3,7	72	14,8
12	3,7	72	16,1

Tabelle 2 200 mM Weinsäure

Probe	pH-Wert	Aufbewahrungsdauer (h)	Ausbeute (μg)
13	3,3	24	5,9
14	3,3	24	7,4
15	3,5	24	10,6
16	3,5	24	10,9
17	3,7	24	17,2
18	3,7	24	18,5
19	3,3	72	5,1
20	3,3	72	5,3
21	3,5	72	7,2
22	3,5	72	7,1
23	3,7	72	13,3
24	3,7	72	16,6

Die Ergebnisse zeigen, dass für das Blutvolumen von 2,5 ml, das mit 7,5 ml eines Stabilisierungspuffers vermischt ist, der 3% (w/v) Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und 125 mM bzw. 200 mM Weinsäuren enthält, der pH-Wert von 3,7 für die Ausbeute und die Unversehrtheit der Gesamt-RNA optimal ist. Bei allen pH-Werten war die Stabilisierung der RNA sehr gut, was anhand der Unversehrtheit der ribosomalen RNA beurteilt wird, wobei die Ausbeute der isolierten RNA mit den Puffern, die auf einen pH-Wert von 3,3 bzw. 3,5 eingestellt waren, jedoch niedriger als bei dem Puffer war, der auf einen pH-Wert von 3,7 eingestellt war. Sogar bei den niedrigeren Ausbeuten, die mit dem auf einen pH-Wert von 3,3 eingestellten Stabilsisierungspuffer erreicht wurden, wurden Ausbeuten erreicht, die mit denjenigen vergleichbar oder etwas besser als diejenigen waren, die mit einem Kontrollverfahren, der RNA-Isolation mit dem QIAamp^® RNA Blood Mini Kit (Qiagen Kat.-Nr. 52303), der eine mittlere Ausbeute von 6,8 μg RNA pro 2,5 ml Blut ergab.
Beispiel 2 – Northern-Blot-Analyse
Dieses Beispiel zeigt die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse, die mit Blutproben von drei verschiedenen Spendern durchgeführt wurde, wobei die Proben 1 h, 24 h, 48 h und 72 h lang bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden.
2,5-ml-Blutproben, die mit einer Natriumcitrat enthaltenden Blutsammelvorrichtung entnommen wurden, wurden mit 6,9 ml eines Stabilisierungspuffers vermischt, der 4% (w/v) Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und 200 mM Weinsäure in einem Polyethylenrohr von 16 × 100 mm enthielt. Proben wurden bei Raumtemperatur 1 h, 24 h, 48 h bzw. 72 h lang aufbewahrt. Zur Isolierung der zellulären RNA wurden die Rohre 10 min lang bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde einmal mit Wasser gewaschen. Nach einer zusätzlichen 10-minütigen Zentrifugation bei 5000 × g wurde das Pellet in 300 μl eines Lysepuffers, d. h. des Puffers RLT (QIAGEN GmbH) gelöst, mit 360 μl Wasser verdünnt, und 40 μl Proteinase K wurden zugegeben. Nach einem 10-minütigen Proteinaseaufschluss bei 55°C wurde die Probe 3 min lang bei 20 000 × g zentrifugiert, der Überstand wurde in ein neues Rohr übertragen, und 350 μl 98%iges Ethanol wurden zugegeben.
Die Probe wurde dann durch eine 1-minütige Zentrifugation bei 8000 × g auf eine Spinsäule aufgetragen, die eine Siliciumdioxid-Membran enthielt. Die Spinsäule wurde einmal mit einem GITC enthaltenden waschpufferartigen Puffer RW1 (QIAGEN GmbH) und zweimal mit einem eine Ethanol-Waschlösung enthaltenden, pufferartigen Puffer RPE (QIAGEN GmbH) gewaschen. Die RNA wurde dann mit 2 × 40 μl RNase-freiem Wasser aus der Siliciumdioxid-Membran eluiert. Für jede Variable wurde eine einzelne Probe hergestellt. Ein denaturierendes Agarose/Formaldehyd-Gel wurde mit 2,5 μg der isolierten RNA beladen, und nach der Elektrophorese wurde die RNA auf eine Nylonmembran übertragen. Anschließend wurde die Nylonmembran mit einer radioaktiv markierten RNA-Sonde, die die Sequenz eines IFN-γ- induzierbaren Gens (GeneBank Acc. No. L07633) enthielt, über Nacht bei 60°C hybridisiert, mehrmals bei 60°C mit Waschpuffern gewaschen, die 2 × SCC/0,1% SDS bis 0,5 × SSC/0,1% SDS enthielten. Anschließend wurde ein Röntgenfilm der Nylonmembran ausgesetzt. Als Kontrolle wurde RNA vom selben Spender isoliert, indem das Reagens TRIzoI^TM LS (Life Technologies) direkt nach der Blutabnahme verwendet wurde, und wie oben beschrieben analysiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Transkriptgrade des IFN-γ-induzierbaren Gens, das als Sonde zur Hybridisierung der isolierten RNA verwendet wurde, über den gesamten Zeitraum ohne sichtbare Änderung im Expressionsgrad konserviert wurden. Die Transkriptgrade waren gleich derjenigen der TRIzoI^TMLS-Kontrollen. Diese Kontrollen veranschaulichen die in-vivo-Bedingungen der Probe zum Zeitpunkt der Blutabnahme, weil das TRIzol-Reagens Phenol in Kombination mit Guanidinisothiocyanat enthält und als Reagens betrachtet wird, das Zellen sofort zerstört, Proteine denaturiert und dadurch jede biologische Aktivität vollständig hemmt. Der Vergleich der Signalintensitäten der aufbewahrten Proben mit denjenigen der TRIzol-Kontrollen bei der Northern-Blot-Analyse deutet darauf hin, dass die Transkriptgrade des mit IFN-γ-induzierbaren Gens unmittelbar nach der Zugabe des Stabilisierungspuffers zur Blutprobe "eingefroren" waren und sich während der Aufbewahrung nicht mehr änderten.
Beispiel 3 – Vergleich der Blutsammelvorrichtung mit einem herkömmlichen EDTA-Rohr
In diesem Beispiel wird die Stabilisierung von RNA mit der Sammelvorrichtung der vorliegenden Erfindung mit einem herkömmlichen EDTA enthaltenden Rohr verglichen.
2,5 ml Blut wurden von einem Spender mit einer Blutsammenvorrichtung abgenommen, die 6,9 ml eines Stabilisierungspuffers (4% (w/v) Tetradecyltrimethylammoniumoxalat, 200 mM Weinsäure, pH-Wert 3,7) in einem Polyethylenrohr von 16 × 100 mm enthielt, das mit einem HEMOGARD^TM-Verschluss (Becton Dickinson and Company) verschlossen und bis zu einem definierten Unterdruck evakuiert war, das 2,5 ml Blut ansaugt, wenn es an die Vene des Spenders angeschlossen wird. Proben wurden 1 h, 1 Tag, 3 Tage, 7 Tage bzw. 10 Tage lang bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Um die zelluläre RNA zu isolieren, wurden die Rohre 10 min lang bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde einmal mit Wasser gewaschen. Nach einer zusätzlichen 10-minütigen Zentrifugation bei 5000 × g wurde das Pellet in 360 μl eines Ammoniumacetat enthaltenden Resuspensionspuffers und dann in 300 μl eines Lysepuffers, d. h. des Puffers RLT (QIAGEN GmbH) gelöst, und 40 μl Proteinase K wurden zugegeben. Nach einem 10-minütigen Proteinaseaufschluss bei 55°C wurde die Probe 3 min lang bei 20 000 × g zentrifugiert, der Überstand wurde in ein neues Rohr übertragen, und 350 μl 98%iges Ethanol wurden zugegeben. Die Probe wurde dann durch ein 1-minütiges Zentrifugieren bei 8000 × g auf eine Spinsäule aufgetragen, die eine Siliciumdioxid-Membran enthielt. Die Spinsäule wurde einmal mit einem GITC-haltigen waschpufferartigen Puffer RW1 (QIAGEN GmbH) und zweimal mit einem ethanolhaltigen pufferartigen Puffer RPE (QIAGEN GmbH) gewaschen.
Ein Aufschluss der restlichen genomischen DNA, die in geringen Mengen zusammen mit der RNA gereinigt werden konnte, wurde gemäß der Anleitung im Handbuch zum RNase-Free DNase Set (QIAGEN GmbH Cat. No. 79254) an der Siliciumdioxid-Membran durchgeführt. Die RNA wurde mit 2 × 40 μl Elutionspuffer aus der Siliciumdioxid-Membran eluiert. Alle Proben wurden zweifach verarbeitet. Zur Analyse wurden die Eluate 1:125 verdünnt, und 1 μl des verdünnten Eluats wurden mittels Echtzeit-TagMan-RT-PCR analysiert. Die mRNA des GAPDH-Gens wurde mittels eines von Applied Biosystems entwickelten Assays (ABI) amplifiziert. Jede Probe wurde bei der TagMan-RT-PCR-Amplifizierung zweifach analysiert.
Als Kontrolle wurde Blut vom selben Spender mit einem Vacutrainer-EDTA-Rohr von Becton Dickinson abgenommen und in diesem Rohr für denselben Zeitraum aufbewahrt, der oben beschrieben ist. Die RNA aus 1 ml der aufbewahrten Blutprobe wurde zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung des TRIzol^TM-LS-Reagens (Life Technologies) isoliert. Die isolierte RNA wurde anschließend gemäß dem RNeasy^TM-Mini-Protokoll zur RNA-Reinigung (QIAGEN Cat. No. 74103) gereinigt. Die RNA wurde mit 2 × 40 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Das Eluat wurde um das 1:50-fache verdünnt, um das kleinere Probenvolumen, das mit dem TRIzol-Verfahren verarbeitet worden war, im Vergleich zu den 2,5 ml Blut in den Probenrohren auszugleichen. Die Proben wurden auch mit dem GAPDH TaqMan-RT-PCR-System von Applied Biosystems (ABI) analysiert.

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse zur Stabilisierung von zellulärer RNA in humanem Blut dargestellt. Die Echtzeit-RT-PCR-Ergebnisse zeigen, dass beim nicht konservierten EDTA-Blut der Transkriptgrad im Laufe der Zeit (was durch den steigenden ct-Wert bei der TagMan-Analyse veranschaulicht wird) bis zu einem Zerfallsgrad nach 7 bis 10 Tagen abnimmt, wobei die mRNA zu diesem Zeitpunkt nicht mehr nachweisbar ist. Andererseits zeigt die GAPDH-mRNA in den konservierten Proben keine Abnahme der Kopienzahl, wobei berücksichtigt ist, dass der Fehlerbereich des TagMan-Assays ± 1 ct-Wert beträgt. Innerhalb dieses Fehlerbereichs sind alle Änderungen des ct-Werts als normale Fluktuationen des Amplifizierungssystems aufzufassen, und kein Abbau ist sichtbar. Dieses Ergebnis unterstreicht klar den Vorteil der neu entwickelten Blutsammelvorrichtung gegenüber dem EDTA-Blutsammelrohr und verdeutlicht auch, dass die Stabilisierung der RNA eine Vorbedingung für die molekulare Analyse des Probenmaterials ist. Tabelle 3

Aufbewahrung bei Raumtemperatur	NA-Stabilisierungsvorrichtung/c_t-Wert	Mittelwert/c_t	EDTA-Rohr/c_t-Wert	Mittelwert/c_t
1 h	33,38		30,17
	31,42		29,63
		31,48		30,58
	31,06		32,29
	30,06		30,24
1 Tag	31,28		30,18
	28,62		29,35
		30,11		31,26
	30,34		33,2
	30,19		32,32
3 Tage	31,27		33,33
	31,92		32,37
		30,91		36,32
	30,15		40
	30,3		39,58
7 Tage	33,03		40
	31,16		39,01
		32,58		38,4
	34,21		37,67
	31,9		36,12
10 Tage	34,2		40
	32,47		40
		32,58		38,97
	32,36		38,38
	31,29		37,48

Beispiel 4 – Stabilisierung von genomischer DNA in Vollblut
Es war auch möglich, die genomische DNA aus der stabilisierten Blutprobe zu isolieren. 2,5 ml Blut, die mit einer Natriumcitrat enthaltenden Blutsammelvorrichtung abgenommen wurden, wurden mit 6,9 ml eines Stabilisierungspuffers vermischt, der 4% (w/v) Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und 200 mM Weinsäure in einem Polyethylenrohr von 16 × 100 mm enthielt. Proben wurden 24 h bzw. 72 h lang bei Raumtemperatur aufbewahrt. Zur Isolierung der genomischen DNA wurden die Rohre 10 min lang bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde einmal mit Wasser gewaschen. Nach einer zusätzlichen 10-minütigen Zentrifugation bei 5000 × g wurde das Pellet in 300 μl eines EDTA und Natriumchlorid enthaltenden Puffers gelöst, und 400 μl eines Lysepuffers, d. h. des Puffers AL (QIAGEN GmbH) und 20 μl Proteinase K wurden zugegeben. Nach einem 10-minütigen Proteinaseaufschluss bei 65°C wurden 420 μl 98%iges Ethanol zugegeben. Die Probe wurde dann auf durch eine 1-minütige Zentrifugation bei 8000 × g eine Spinsäule aufgetragen, die eine Siliciumdioxid-Membran enthielt. Die Spinsäule wurde einmal mit einem Guanidinhydrochlorid enthaltenden waschpufferartigen Puffer AW1 (QIAGEN GmbH) und einmal mit einem ethanolhaltigen pufferartigen Puffer AW2 (QIAGEN GmbH) gewaschen. Die DNA wurde dann mit 300 μl eines Tris-Puffers aus der Siliciumdioxid-Membran eluiert.
5 μl des Eluats wurden an einem 0,8%igen Agarose/TBE-Gel analysiert, das mit Ethidiumbromid angefärbt war. Die Ausbeute der isolierten DNA wurde bestimmt, indem die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm in einem Spektrophotometer gemessen und berechnet wurde, dass 1 OD260 einer Konzentration von 50 μg DNA/ml entspricht. Nach einer 24-stündigen und einer 72-stündigen Aufbewahrung bei Raumtemperatur wies die isolierte genomische DNA eine hohe Molmasse auf. Die Hauptbande wanderte bei einer Länge, die größer als 20 kb war. Die Ausbeute lag im Bereich zwischen 47 bis 80 μg pro 2,5 ml Blut, was innerhalb des erwarteten Ausbeutebereichs für diese Blutmenge liegt. Die DNA war auch auf enzymatische Reaktionen wie einen Aufschluss mit Restriktionsendonuclease und eine PCR-Amplifizierung anwendbar.
Die genomische DNA wurde auch auf enzymatische Reaktionen wie einen Aufschluss mit einem Restriktionsenzym und eine PCR-Amplifizierung angewandt. Zum Aufschluss mit einer Restriktionsendonuclease wurden 2 μg der DNA 3 h lang bei 37°C mit 6 U EcoRI (E) bzw. HindIII (H) aufgeschlossen und anschließend an einem 0,8%igen Agarose-TBE-Gel analysiert. Zur PCR-Amplifizierung wurden 150 und 300 ng der DNA zu einer PCR-Reaktionsmischung mit einem Gesamtvolumen von 50 μl gegeben, und ein Fragment von 1,1 kb des humanen Homologs des Giant-Larvae-Gens wurde amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden an einem 1,2%igen Agarose/TBE-Gel analysiert.
Beispiel 5
Dieses Beispiel demonstriert die Eigenstabilität und Transkription von RNA in einer biologischen Probe, wenn die Probe bei Raumtemperatur in Abwesenheit von Stabilisierungsmitteln aufbewahrt wird. Vollblutproben wurden von vier humanen Spendern genommen, die als die Spender 1, 2, 3 und 4 gekennzeichnet wurden. Bei jedem Spender wurde eine erste Gruppe von Proben in einem EDTA-Blutsammelrohr abgenommen und bei –70°C aufbewahrt. Eine zweite Gruppe von Proben wurde in einem identischen EDTA-Blutsammelrohr gesammelt und bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Die zweite Gruppe von Proben wurde unter identischen Bedingungen bei Raumtemperatur aufbewahrt und nach 1, 3, 5 und 7 Tagen mittels quantitativer TaqMan-RT-PCR auf die Gesamt-Interferon-γ-mRNA analysiert. Die erste Gruppe von Proben wurde unter identischen Bedingungen bei –70°C aufbewahrt und mittels quantitativer TaqMan-RT-PCR auf die Gesamt-Interferon-γ-mRNA analysiert. Der gemessene mRNA-Gehalt einer jeden Probe ist in den Diagrammen der 2–5 für die Spender 1–4 veranschaulicht. Wie in den Diagrammen veranschaulicht ist, weisen die bei –70°C gespeicherten Blutproben eine kleine Abnahme der Gesamtmenge an Interferon-γ-mRNA nach dem 1. Tag auf. Drei der –70-°C-Proben wiesen zwischen dem 1. Tag und dem 5. Tag eine kleine Erhöhung der mRNA auf, die als Schwankung im Fehlerbereich der Technik interpretiert werden kann.
Die Blutproben, die mit EDTA bei Raumtemperatur aufbewahrt wurden, wiesen nach drei Tagen eine signifikante Erhöhung der Gesamt-Interferon-γ-mRNA auf, was auf eine hohe Rate der Geninduktion hinweist. Nach dem 3. Tag wiesen die Proben eine Abnahme der Gesamt-Interferon-γ-mRNA auf, was auf eine signifikante Zersetzung hinweist. Die Daten dieses Beispiels veranschaulichen, dass Vollblut, das mit EDTA bei Raumtemperatur behandelt ist, nicht stabil ist und dass die Gesamt-mRNA in der Probe sich als Folge einer Geninduktion und Genzersetzung kontinuierlich ändert. Die ständigen Änderungen der Gesamt-mRNA in der Probe verhindern eine genaue Bestimmung und Analyse der ursprünglich in der Blutprobe vorhandenen mRNA.
Beispiel 6
In diesem Beispiel werden die Änderungen als Funktion der Zeit bestimmter Interleukin-mRNA-Spezies und anderer mRNA-Spezies in einer Vollblut-Kontrollprobe, die mit EDTA vereinigt und bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde, mit einer Vollblut-Testprobe verglichen, die mit einer Zusammensetzung aus Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und Weinsäure stabilisiert und bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde. Die Blutproben wurden direkt von denselben Probanden erhalten und sofort mit dem jeweiligen Stabilisierungsmittel vereinigt. Die resultierenden Proben wurden unter identischen Bedingungen bei Raumtemperatur aufbewahrt.
Bei der Sammelvorrichtung handelte es sich um ein Polyethylenrohr von 16 × 100 mm, das 6,9 ml eines Stabilisierungspuffers enthielt, der 4% (w/v) Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und 200 mM Weinsäure enthielt. Die Blutproben wurden direkt vom Spender in die Sammelvorrichtung gesogen, wo sie sofort mit dem Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und der Weinsäure vermischt wurden. Die Kontrollprobe wurde mit 2,5 ml frischem Blut hergestellt, das in ein Vacutainer-EDTA-Rohr von Becton Dickinson gesogen wurde. Zu ausgewählten Zeitpunkten wurden die Kontrollprobe und die Testprobe mittels quantitativer TaqMan-RT-PCR wie in den obigen Beispielen analysiert.
Die 6–9 sind Diagramme, in denen die Änderungen der Menge an spezifizierten Interleukin-mRNA-Spezies und anderen mRNA-Spezies in den Blutproben als Funktion der Zeit veranschaulicht sind. Die Proben wurden durch Standardverfahren zur Messung der Menge der mRNA-Spezies unmittelbar nach der Abnahme der Blutproben analysiert, um eine Basislinie zu bestimmen.
Die Proben wurden bei Raumtemperatur aufbewahrt und nach 4 h, 8 h, 24 h, 3 Tagen und 5 Tagen analysiert. 6 zeigt die Menge der mRNA-Spezies in der mit EDTA vermischten Blutprobe nach einer 5-tägigen Aufbewahrung, gemessen durch die Abweichung von der Basislinie. Die gemessenen speziellen mRNA-Spezies sind im unteren Teil des Diagramms entlang der horizontalen Achse aufgeführt. Die vertikale Achse veranschaulicht die Änderung der Menge der mRNA-Spezies, die als Änderung in Zehnerpotenzen gemessen wurde. Wie in 6 veranschaulicht ist, wiesen mehrere mRNA-Spezies nach 5 Tagen eine geringe oder keine Änderung auf, während bestimmte andere mRNA-Spezies signifikante Zu- oder Abnahmen aufwiesen. Die Zunahmen sind als Folge einer Geninduktion zu verstehen, während die Abnahmen die Folge eines Abbaus sind.
Das Diagramm von 7 zeigt die Änderungen der Menge an IL-8- und IL-10-Transkripten für die mit EDTA stabilisierte Blutprobe. Die Menge der Transkripte wurde nach 4 h, 8 h, 24 h, 3 Tagen und 5 Tagen gemessen, wie durch jeden Balken im Diagramm veranschaulicht ist. Wie dargestellt ist, nimmt die Menge der in der Probe vorhandenen IL-8-mRNA in den ersten drei Tagen als Folge einer Geninduktion stetig zu und beginnt dann als Folge eines Abbaus abzunehmen. Im Gegensatz dazu erfährt die IL-10-mRNA-Konzentration in den ersten drei Tagen eine Abnahme, gefolgt von einer kleinen Zunahme am 5. Tag im Vergleich zum 3. Tag. Die in 7 aufgeführten Daten belegen die Instabilität einer bei Raumtemperatur mit EDTA aufbewahrten Blutprobe.
Die Blut-Testprobe, die mit einer Zusammensetzung aus Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und Weinsäure stabilisiert war, wurde sofort nach der Sammlung analysiert, um die Menge der mRNA-Spezies zu messen und eine Basislinie zu bestimmen. Die Proben wurden nach drei Tagen nochmals analysiert, wobei die Proben bei Raumtemperatur (etwa 18–22°C) aufbewahrt wurden. Die Ergebnisse sind im Diagramm von 8 aufgeführt, in dem die Änderungen der mRNA-Spezies aufgeführt sind. Wie durch diese Daten belegt wird, wiesen die mRNA-Spezies in der Blutprobe im Vergleich zu der mit EDTA stabilisierten Blutprobe signifikant kleinere Änderungen auf.
9 ist ein Diagramm, in dem die Änderungen der Menge an IL-8-mRNA und IL-10-mRNA in 5 Tagen veranschaulicht sind, wobei nach 4 h, 8 h, 24 h, 3 Tagen und 5 Tagen gemessen wird. Die Daten zeigen im Vergleich zu den sehr signifikanten Änderungen in den in 7 beschriebenen EDTA-Vollblutproben nur sehr kleine Änderungen der IL-8-mRNA-Konzentration. Es ist dargestellt, dass die Menge an IL-10-mRNA nach 5 Tagen eine allmähliche Zunahme erfährt, während bei den EDTA-Vollblutproben (7) sehr signifikante Änderungen aufgetreten waren.

Claims

Vorrichtung zum Sammeln und Stabilisieren einer biologischen Probe, wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: einen Behälter, der eine Innenkammer definiert, die so dimensioniert ist, dass sie die biologische Probe aufnimmt, wobei der Behälter ein offenes Ende und einen Verschluss hat, der das offene Ende verschließt, und der einen Innendruck hat, der niedriger als der Atmosphärendruck ist, um ein vorbestimmtes Volumen der biologischen Probe in den Behälter zu saugen, und ein Mittel zur Blockierung einer Geninduktion, das in dem Behälter in einer Menge enthalten ist, die ausreichend ist, um eine ex-vivo-Geninduktion in der biologischen Probe zu blockieren und die biologische Probe gegen einen enzymatischen Abbau von Nucleinsäuren zu schützen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe Vollblut ist und der Behälter mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion vorgefüllt und dimensioniert ist, um eine Blutprobe zu enthalten.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus kationischen Verbindungen, Detergentien, chaotropen Salzen, Ribonuclease-Inhibitoren, Chelatbildnern und Mischungen davon.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ein wässriges Medium einschließt und einen pH-Wert von pH 2 bis pH 12 hat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mittel zur Blockierung einer Geninduktion feste Verbindungen in dem Behälter sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phenol, Chloroform, Aceton, Alkoholen und Mischungen davon.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mercaptoalkoholen, Dithiothreitol (DTT) und Mischungen davon.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ein organisches Lösungsmittel ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ein organisches Reduktionsmittel ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die wässrige Lösung einen pH-Wert von pH 2 bis pH 10 hat.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die wässrige Lösung einen pH-Wert von pH 3 bis pH 8 hat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ein Stabilisierungsmittel mit der Formel YR₁R₂R₃R₄ X umfasst, wobei Y Stickstoff oder Phosphor ist, R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig aus der aus einem verzweigten Alkyl, einem nichtverzweigten Alkyl, einem C₆-C₂₀-Aryl und einem C₆-C₂₆-Aralkyl bestehenden Gruppe ausgewählt sind und X ein Anion ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das verzweigte Alkyl ein C₃-C₂₀-Alkyl ist und das nichtverzweigte Alkyl ein C₁-C₂₀-Alkyl ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei X ein Anion ist, das aus der aus Phosphat, Sulfat, Formiat, Acetat, Propionat, Oxalat, Malonat, Succinat, Citrat, Bromid und Chlorid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei Y Stickstoff ist und das Stabilisierungsmittel ein quaternäres Amin ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei R₁ ein Alkyl mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen ist und R₂, R₃ und R₄ Methyl sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer solchen Menge eingeschlossen ist, dass Zellen in der biologischen Probe lysiert werden.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion Retikulozyten, Bakterien, rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen lysiert.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer solchen Menge eingeschlossen ist, dass Nucleinsäuren in der biologischen Probe konserviert und stabilisiert werden.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das chaotrope Salz aus der aus Guanidiniumisothiocyanat und Guanidiniumhydrochlorid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei das Detergens aus der aus Natriumdodecylsulfat und Polyoxyethylensorbitanmonolaurat bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Ribonuclease-Inhibitor ein placentales RNAse-Inhibitorprotein ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion weiterhin wenigstens einen Protonendonor in einer Menge umfasst, die wirksam ist, um Nucleinsäuren in der Probe zu stabilisieren.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei der Protonendonor aus der aus Carbonsäuren und Mineralsäure bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei der Protonendonor aus der aus Alkenylcarbonsäuren, aliphatischen Monocarbonsäuren, aliphatischen Dicarbonsäuren und aliphatischen Tricarbonsäuren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei der Protonendonor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkenylcarbonsäuren, aliphatischen C₁-C₆-Monocarbonsäuren, aliphatischen C₂-C₆-Dicarbonsäuren, Tricarbonsäuren, Hydroxymonocarbonsäuren, Hydroxydicarbonsäuren, Hydroxytricarbonsäuren, aliphatischen Ketomonocarbonsäuren, aliphatischen Ketodicarbonsäuren, Aminosäuren und Mischungen davon.
Verfahren zum Blockieren einer ex-vivo-Geninduktion in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte des: Bereitstellens eines Probensammelbehälters gemäß der Definition wie in Anspruch 1 oder 2 und Einführens einer biologischen Probe unmittelbar beim Sammeln in den Probensammelbehälter und unmittelbar das Vermischen der biologischen Probe mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion, um eine stabilisierte biologische Probe zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion wie in einem der Ansprüche 3 bis 26 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion aus der aus Feststoffen und wässrigen Lösungen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Verfahren das Ansaugen eines vorbestimmten Volumens der biologischen Probe mittels des Vakuums direkt in den Behälter und ihr Vermischen mit einer stabilisierenden Menge des Mittels zur Blockierung einer Geninduktion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die biologische Probe Vollblut ist und ein In-Kontakt-Bringen der Vollblutprobe mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion im Probensammelbehälter Zellen lysiert und Nucleinsäuren in der Vollblutprobe stabilisiert.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die biologische Probe aus der aus Konzentraten von roten Blutkörperchen, Plättchenkonzentraten, Leukozytenkonzentraten, Tumorzellen, Knochenmarkaspiraten, Gewebe, feinen Nadelaspiraten und Zervixproben bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die biologische Probe eine Körperflüssigkeit ist, die aus der aus Plasma, Serum, Urin und cerebrospinaler Flüssigkeit und Sputum bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die biologische Probe aus der aus Bakterien und eukaryotischen Mikroorganismen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei die biologische Probe aus der aus Körperflüssigkeiten, Geweben, Körperabstrichen und Körperausstrichen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen Ganzblutprobe, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Bereitstellung eines wie in Anspruch 1 oder 2 definierten Probensammelbehälters und Einführung einer Vollblutprobe unmittelbar bei der Entnahme in den Sammelbehälter und Vermischen der Blutprobe mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion, um eine bei Raumtemperatur stabile Vollblutprobe zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion wie in einem der Ansprüche 3 bis 26 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei der Verschluss ein Septum ist und das Verfahren das Durchstechen des Septums mit einer Kanüle und die Einführung der Vollblutprobe durch die Kanüle in den Sammelbehälter umfasst.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die wässrige Lösung oder Dispersion einen pH-Wert von pH 2 bis pH 5 hat.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei die wässrige Lösung oder Dispersion einen pH-Wert von pH 3,6 bis pH 3,8 vor dem Vermischen mit der Blutprobe hat.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer solchen Menge vorhanden ist, dass eine Mischung mit der Blutprobe mit einem pH-Wert von 39, bis 4,1 erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 36, umfassend das Vermischen der Blutprobe mit dem Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einem Verhältnis von Blut zum Blockierungsmittel von 1:2,5 bis 1:3,1, bezogen auf das Volumen.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Guanidiniumisothiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Natriumdodecylsulfat, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, placentalem RNAse-Inhibitorprotein und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion weiterhin einen Protonendonor umfasst, der aus der aus Carbonsäuren und Mineralsäuren bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion weiterhin einen Protonendonor einschließt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aliphatischen Monocarbonsäuren, aliphatischen Dicarbonsäuren, aliphatischen Tricarbonsäuren und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Carbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkenylcarbonsäuren, aliphatischen C₁-C₆-Monocarbonsäuren, aliphatischen C₂-C₆-Dicarbonsäuren, aliphatischen C₃-C₆-Tricarbonsäuren, aliphatischen Ketomonocarbonsäuren, aliphatischen Ketodicarbonsäuren, Hydroxymonocarbonsäuren, Hydroxydicarbonsäuren, Hydroxytricarbonsäuren, Aminosäuren und Mischungen davon.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer solchen Menge eingeschlossen ist, dass eine Mischung mit der Blutprobe gebildet wird, die bei Raumtemperatur stabil ist.
Verfahren nach Anspruch 36, wobei das Mittel zur Blockierung einer Geninduktion in einer solchen Menge eingeschlossen ist, dass eine Mischung mit der Blutprobe gebildet wird, die bei einer Temperatur von –20°C bis –80°C stabil ist, und wobei die Mischung im Wesentlichen ohne eine Zersetzung von Nucleinsäuren aufgetaut werden kann.