DE102005031910B4

DE102005031910B4 - Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE102005031910B4
Application number: DE102005031910A
Authority: DE
Inventors: Tung-Liang Huang; Shang-Chi Lin
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2025-07-08
Also published as: DE102005031910A1; FR2877343A1; FR2877343B1; GB2419594A; GB0512937D0; GB2419594B; GB2419594C

Abstract

Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren durch Bilden eines unlöslichen ionischen Komplexes zwischen Nukleinsäuren und einem oberflächenaktiven Mittel in einer biologischen Probe, umfassend einen Schritt des Inkontaktbringens der biologischen Probe mit einer Stabilisierungszusammensetzung, umfassend oberflächenaktive Aminverbindungen der Formel (I): R₁R₂R₃N(O)_x, (I)wobei R₁ und R₂ jeweils unabhängig H, eine C1-C6-Alkylgruppe, C6-C12-Arylgruppe oder C6-C12-Aralkylgruppe sind; R₃ eine C1-C20-Alkylgruppe, C6-C26-Arylgruppe oder C6-C26-Aralkylgruppe ist; und x eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist; und wobei der pH-Wert der Zusammensetzung im Bereich von 1 bis 5 liegt.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von Biomaterialien aus einer Probe und insbesondere ein Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe.
2. Beschreibung des Fachgebiets
Es ist bekannt, dass Nukleinsäuren die genetische Information eines Organismus tragen. Heutzutage spielen Nukleinsäuren auch eine wichtige Rolle in Forschungsgebieten der Molekularbiologie. Gemäß jüngsten Forschungsergebnissen ist es bekannt, dass genetische Defekte oder die Entwicklung von Erkrankungen eines Patienten durch klinische Praxis von der Abnormalität oder speziellen Sequenzen von Nukleinsäuren dieses Patienten hergeleitet werden kann. Folglich kann das Ziel zum Verhindern des Auftretens einer Erkrankung vor dem Ausbruch der Erkrankungen durch einen Nachweis der Abnormalität von Nukleinsäuren und Durchführen von notwendigen abhelfenden Schritten zur Behandlung erzielt werden. Zum Erzielen eines wirksamen Nachweises der Abnormalität oder speziellen Sequenzen der Nukleinsäuren handelt es sich bei der Isolierung von Nukleinsäuren aus einem Organismus sowie den Schritten des Intakthaltens der genetischen Information um Schlüsselaufgaben für betreffende Anwendungen.
Nukleinsäuren sind aktive Moleküle, insbesondere RNA. Herkömmliche Verfahren zum Isolieren von aktiven RNA-Molekülen werden im Allgemeinen mit Antigerinnungsmitteln, z. B. EDTA in das phlebotomisierte Vollblut angewandt, wonach die Probe bei 4°C aufbewahrt wird, bis die Isolierungsschritte durchgeführt werden können. Die RNA-Expressionsgrade würden durch die Zugabe von Antigerinnungsmitteln, Temperaturänderungen, die Lagerdauern und das Isolierungsverfahren für Leukozyten beeinflusst werden, wobei diese Faktoren die Schwierigkeiten der Vorhersage des Auftretens einer Erkrankung durch eine RNA-Expression erhöhen. Zum Erhalt von besseren Ergebnissen muss das Isolieren von RNA aus Vollblutproben innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden. Jedoch bedeutet diese zwingend erforderliche Verarbeitungszeit gewöhnlich, insbesondere, wenn große Probenmengen zum Bearbeiten eintreffen, eine unakzeptable Belastung für das medizinische Fachpersonal.
Zum Vermeiden einer Kontamination von Proteinen und anderen Organellen sind die Schritte des Isolierens von reinen Nukleinsäuren unter Beteiligung von der Anwendung von Phenol/Chloroform bei herkömmlichen Verfahren gängig. Jedoch erfordert die Anwendung von Phenol/Chloroform in den Schritten des Isolierens von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien eine sorgfältige Arbeitsweise und sorgfältiges Fachpersonal, um unerwünschte Organellen oder Materialien (z. B. Proteinen) von den Nukleinsäuren auszuschließen. Weiterhin sind Phenol und Chloroform für den Vorgang gefährlich und stark umweltverschmutzend. Zusätzlich können Phenol und Chloroform Nukleinsäuren nicht direkt kondensieren. Deshalb sind viele Chemikalien zum Unterstützen des Phenols oder Chloroforms beim Kondensieren von Nukleinsäuren nötig. Außerdem sind Phenole unbequem zu lagern und zu verwenden, da sie leicht oxidieren. Gemäß diesen vorstehend beschriebenen Nachteilen handelt es sich bei Phenol/Chloroform nicht um die beste Chemikalie zur Verwendung zum Isolieren von Nukleinsäuren, da es insbesondere für eine Isolierung mit hohem Durchsatz von Nukleinsäuren für klinische biomedizinische Anwendungen ungeeignet ist.
Einige Untersuchungen über die Isolierung von Nukleinsäuren ohne Phenol/Chloroform wurden erörtert. Qiagen Company offenbarte im PCT-Patent Nr. WO 03/084976 A1 zum Bewältigen der vorstehend veranschaulichten Nachteile ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren mit Ammoniak oder Ammonium. In diesem Verfahren wird eine feste Phase verwendet, die als Anlagerungssubstrat zum Binden von Nukleinsäuren wirkt. Zusätzlich liegt zu Beginn der Isolierungsstufe ein chaotropisches Mittel vor, um Doppelstrangoligonukleotide zu schmelzen. Außerdem wird in Gegenwart des Ammoniaks oder des primären Amins die Bindungseffizienz zwischen denaturierten Nukleinsäuren und der festen Phase verbessert. Demgemäß ist es bevorzugt, dass das Inkontaktbringen der Probe mit der Nukleinsäure-bindenden festen Phase in Gegenwart des Ammoniums oder Ammoniaks bei einem pH-Wertbereich von 8,5 bis 9,5 durchgeführt wird.
US 6,265,168 B1 an Gjerde et al. offenbart ein Verfahren zum Entfernen eines Ziel-DNA-Fragments mit einer vorherbestimmten Basenpaarlänge aus einem Gemisch aus DNA-Fragmenten. Das das Ziel-DNA-Fragment enthaltende Gemisch aus DNA-Fragmenten liegt in einem ersten Lösungsmittelgemisch mit einem Gegenion und einer DNA-Bindungskonzentration des Transportlösungsmittels vor und wird dann auf eine ein Medium mit einer nichtpolaren, nichtporösen Oberfläche enthaltende Trennsäule aufgebracht. Die Ziel-DNA-Fragmente werden durch Inkontaktbringen der Oberflächen mit einer zweiten Lösungsmittellösung von dem Medium abgetrennt. Bei denn hier verwendeten Gegenion handelt es sich um primäre Amine, sekundäre Amine, niedere tertiäre Amine und quartäre Alkylammoniumsalze. Bei den Schlüsselfaktoren des Verfahrens in US 6,265,168 B1 zum Reinigen eines Ziel-DNA-Fragments handelt es sich um die Säule mit nicht polarer und nicht poröser Oberfläche und die Gegenion-DNA-Komplexe, die leicht auf der Oberfläche absorbiert werden. Diese Offenbarung stellt ein Verfahren zum Isolieren von Ziel-DNA-Fragmenten aus einem gereinigten DNA-Pool bereit. Jedoch ist die Anwendung zum Reinigen von Nukleinsäuren direkt aus Blut auf dem Fachgebiet auf Grund der möglichen Säulenverstopfung noch nicht offenbart.
In WO 2004/013155 A1 offenbart Goldsborough et al. ein Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe. Bei den Hauptschritten zum Stabilisieren von Nukleinsäuren in diesem Verfahren handelt es sich um erstens das Modifizieren von 2'-, 3'-, und 5'-OH-Gruppen einer Nukleinsäure mit einer Schutzgruppe, was zum Verhindern des Nukleinsäureaufschlusses durch Nuklease dient, wonach die modifizierten Nukleinsäuren zum Entfernen der Schutzgruppe mit primären Aminen behandelt werden. Das hier verwendete primäre Amin dient eher nur der Abspaltung der Schutzgruppe als dem Bilden eines Komplexes mit Nukleinsäuren.
Auch offenbart US 2004/0048384 A1 an Augello, Frank A. et al. einen Sammelbehälter und ein Verfahren zum Sammeln eines vorbestimmten Volumens einer biologischen Probe, wobei die Vollblutprobe mindestens ein die Geninduktion blockierendes Mittel in einer zum Stabilisieren und Hemmen der Geninduktion wirksamen Menge einschließt. Das Stabilisierungsmittel des hier offenbarten die Geninduktion blockierenden Mittel ist ein quartäres Amin. Eine genauere Erörterung des betreffenden Verfahrens ist aus der Beschreibung von CA 2299119 A1 ersichtlich, wobei ein Verfahren zum Stabilisieren und/oder Isolieren von Nukleinsäuren offenbart ist. Das hierfür beschriebene Verfahren verwendet zum Ausfällen und Schützen von Nukleinsäuren mindestens zwei quartäre Amine oder kationische Polymere mit einer Phosphorgruppe.
Außerdem ist eine neue Zusammensetzung zum Isolieren und/oder Stabilisieren von Nukleinsäuren aus biologischen Materialien in US 2004/014703 A1 offenbart. Aufgabe des Verfahrens von US 2004/014703 A1 ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zum Stabilisieren von RNA in Gegenwart eines Gewebes, von Blut, Plasma oder Serum. Die Zusammensetzung umfasst zum Stabilisieren von Nukleinsäuren eine kationische Verbindung wie ein quartäres Amin.
Wenn auch die beiden Produkte „PAXgene Blood RNA Tube" und „PAXgene Blood RNA Isolation Kit" entwickelt und von Qiagen Company in den Handel gebracht wurden und die beiden Produkte zum Stabilisieren und Isolieren von Nukleinsäuren im Vollblut zusammenarbeiten. Jedoch sind die Kits nicht kosteneffizient, wodurch die Anwendungen des Kits Routineverwendungen erschweren.
WO 02/090539 A2 betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von oberflächenaktiven Aminverbindungen.
Es gibt keine Offenbarung über das Stabilisieren von Nukleinsäuren mit primärem Amin, sekundärem Amin und tertiärem Amin. Deshalb ist es erwünscht, ein verbessertes Verfahren zum Mindern und/oder Umgehen der vorstehend erwähnten Probleme bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß Patentanspruch 1 ein Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe mit oberflächenaktiven Aminverbindungen bereit. Die Mechanismen der Nukleinsäurestabilisierung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich von herkömmlichen Verfahren. Oberflächenaktive Mittel mit primären Aminen, sekundären Aminen und tertiären Aminen oder die Gemische mit verschiedenen Verhältnissen der oberflächenaktiven Mitteln werden in der vorliegenden Erfindung zum Stabilisieren von Nukleinsäuren durch Bilden von unlöslichen ionischen Komplexen zwischen Nukleinsäuren und einem oberflächenaktiven Mittel verwendet. Zum Beispiel schützen die Komplexe RNA innerhalb, um einen RNA-Abbau durch RNase sowie eine RNA-Transkription zu verhindern, womit die Nukleinsäuren in der biologischen Probe stabilisiert und geschützt werden und die RNA auch leicht mit den Komplexen zu isolieren ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann sogar automatisch durchgeführt werden, um den Durchsatz zu erhöhen und die Anwendung des molekularen diagnostischen Testens mit Nukleinsäure zu erweitern.
Zum Erzielen der Aufgabe umfasst das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Stabilisieren von Nukleinsäuren durch Bilden eines unlöslichen ionischen Komplexes zwischen Nukleinsäuren und einem oberflächenaktiven Mittel in einer Probe einen Schritt des Inkontaktbringens der biologischen Probe mit einem Stabilisierungsreagens, wobei das Stabilisierungsreagens aus oberflächenaktiven Aminverbindungen der Formel (I) besteht: R₁R₂R₃N(O)_x, (I)wobei R₁ und R₂ jeweils unabhängig H, eine C1-C6-Alkylgruppe, C6-C12-Arylgruppe oder C6-C12-Aralkylgruppe ist; R₃ eine C1-C20-Alkylgruppe, C6-C26-Arylgruppe oder C6-C26-Aralkylgruppe ist; und x eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist; und wobei der pH-Wert des Reagenzes im Bereich von 1 bis 5 liegt. Eine der besten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es, wenn in vorstehender Formel (I) R₁ und R₂ jeweils unabhängig H oder eine C1-C6-Alkylgruppe ist und R₃ eine C1-C20-Alkylgruppe ist, wenn x 0 ist.
Vorzugsweise ist die oberflächenaktive Aminverbindung der vorliegenden Erfindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dodecylamin, N-Methyldodecylamin, N,N-Dimethyldodecylamin, N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid und 4-Tetradecylanilin.
Das Stabilisierungsmittel kann in Lösung oder als Feststoff zugesetzt werden. Die Option der Zugabe als Feststoff beinhaltet die zusätzlichen Vorteile, dass Feststoffe größtenteils eine höhere chemische Stabilität aufweisen und ihre Zugabe zu der Probe häufig leichter durchgeführt werden kann. Folglich ist gemäß der vorliegenden Erfindung die Kontaktweise der biologischen Probe und des Stabilisierungsmittels nicht beschränkt, wobei es sich hierbei um eine flüssige Lösung oder einen Feststoff handeln kann. Jedoch handelt es sich bei dem Reagens gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Erhalt eines besseren Mischergebnisses der Probe und des Reagenzes um eine flüssige Lösung.
Wird das Reagens als Feststoff zugesetzt, ist der Gewichtsprozentanteil der oberflächenaktiven Aminverbindungen im Reagens nicht beschränkt und beträgt vorzugsweise weniger als 90% und liegt stärker bevorzugt im Bereich von 10 bis 90%. Wird das Reagens in Lösungsform zugesetzt, liegt die Konzentration der oberflächenaktiven Aminverbindungen in der Reagenslösung vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 20%.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ohne jegliche Gegenwart von nicht ionischen Detergenzien oder Säuren durchgeführt werden. Jedoch könnte die Verwendung von nicht ionischen Detergenzien, Säuren oder dem Gemisch davon unter Beteiligung der spezifischen oberflächenaktiven Aminverbindungen die Stabilisierungsergebnisse verbessern. Demzufolge kann das Stabilisierungsreagens mit oberflächenaktiven Aminverbindungen des Weiteren selektiv mindestens ein nicht ionisches Detergens umfassen. Das mindestens eine nicht ionische Detergens kann im Stabilisierungsreagens als flüssiges Detergens oder als festes Detergens vorliegen.
Die Konzentration des mindestens einen nicht ionischen Detergenzes liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 20%, wenn das Stabilisierungsreagens in flüssigem Zustand vorliegt; der Gewichtsprozentanteil des mindestens einen Detergenzes liegt im Bereich von 0,01 bis 40%, wenn das Reagens im festen Zustand vorliegt. Das mindestens eine nicht ionische Detergens der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges sein; vorzugsweise ist das mindestens eine nicht ionische Detergens Polyoxyethylensorbitmonolaurat. Stärker bevorzugt ist das nicht ionische Detergens Tween 20 oder Triton X-100.
Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Stabilisierungsreagens mit oberflächenaktiven Aminverbindungen kann des Weiteren selektiv mindestens eine Säure umfassen. Bei der mindestens einen Säure kann es sich um Säurepuffer oder Säuremittel in festem Zustand handeln. Die Konzentration des mindestens einen Säurepuffers beträgt weniger als 1 M. Vorzugsweise liegt die Konzentration des mindestens einen Säurepuffers im Bereich von 0,01 bis 0,5 M. Die mindestens eine Säure kann eine beliebige sein. Stärker bevorzugt ist die mindestens eine Säure ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Maleinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Carbonsäuren und Mineralsäuren. Der pH-Wert des gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Stabilisierungsmittels liegt im Bereich von 1 bis 5.
Bei der in der vorliegenden Erfindung verwendeten biologischen Probe mit Nukleinsäuren kann es sich um ein zellfreies Probenmaterial, Plasma, Körperflüssigkeit wie Blut, Serum, Zellen, Leukozytfraktionen, Sputum, Urin, Sperma, Fäkalien, Abstriche, Aspirate, Gewebeproben aller Arten wie Biopsien z. B. Teile von Geweben und Organen, Nahrungsmittelproben, die freie oder gebundene Nukleinsäuren enthalten, oder Zellen, die wie erfindungsgemäß vorgesehene Nukleinsäuren enthalten wie Organismen (ein- oder mehrzellige Organismen, Insekten usw.), Pflanzen oder Pflanzenteile, Bakterien, Viren, Hefen und andere Pilze, andere Eukaryoten und Prokaryoten usw. handeln.
Der Begriff „Nukleinsäuren" bezeichnet zum Zwecke der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren in breiterem Sinne und schließt folglich z. B. Ribonukleinsäuren (RNA) und auch Deoxyribonukleinsäuren (DNA) in allen Längen und Konfigurationen wie Doppelstrang, Einzelstrang, kreisförmig und linear, verzweigt usw. und alle möglichen Untereinheiten davon wie monomere Nukleotide, Oligomere, Plasmide, virale und bakterielle DNA und RNA sowie genomische und nicht genomische DNA und RNA von Tier- und Pflanzenzellen oder anderen Eukaryoten, mRNA in verarbeiteter und unverarbeiteter Form, tRNA, hn-RNA, rRNA, cDNA sowie andere vorstellbare Nukleinsäuren ein. Vorzugsweise sind die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung DNA oder RNA.
Andere Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung klarer, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Elektrophoreseergebnis von gereinigter RNA in den Beispielen 1–3 der vorliegenden Erfindung;
2 ist ein Elektrophoreseergebnis von gereinigter RNA in den Beispielen 4–6 der vorliegenden Erfindung;
3 ist ein quantitatives RT-PCR-Ergebnis von gereinigter RNA in den Beispielen 7–9 der vorliegenden Erfindung, das die relativen Genexpressionsgrade in verschiedenen Konservierungsdauern zeigt;
4 ist ein Elektrophoreseergebnis von gereinigten Nukleinsäuren mit Dodecylamin aus Vollblut;
5 ist ein Elektrophoreseergebnis von gereinigten Nukleinsäuren mit N,N-Dimethyldodecylamin aus Vollblut;
6 zeigt Elektrophoreseergebnisse von gereinigten Nukleinsäuren mit N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid aus Vollblut; und
7 zeigt ein Ergebnis der Elektrophorese, das aus gereinigten Nukleinsäuren mit 4-Tetradecylanilin isoliert wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgenden Beispiele und Figuren veranschaulicht. Erfindungsgemäße Ausführungsformen des Stabilisierens von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe des Stabilisierungsreagenzes sind in den folgenden Beispielen 1–11 und 1–3 beschrieben. In den Beispielen 12 bis 18 und 4–7 ist das nicht beanspruchte Isolieren von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe veranschaulicht.
Stabilisieren von Nukleinsäuren
Der RNA-Expressionsgrad wird durch die Menge und die Qualität der extrahierten RNA aus für eine Dauer von einigen Tagen durch drei verschiedene Konservierungsverfahren konservierten Vollblutproben zum Bewerten der Stabilisierungseffizienz von Nukleinsäuren bestimmt.
Beispiel 1
Ein Blutsammelröhrchen mit einem Volumen mit 10 ml des Typs Vacutainer (EDTA K3, Becton Dickinson) wird zum Sammeln der Vollblutproben verwendet. Die Probe im Vacutainer wird bei 4°C für eine Dauer von 0 bis 4 Tagen gelagert und die RNA dann nach der Lagerdauer isoliert.
Gemäß dem Handbuch des Lieferanten wird 1 ml Red Blood Cell Lysis Buffer (Roche Diagnostics GmbH) 500 μl Vollblut zur Reinigung von Leukozyten zugesetzt; dann werden 150 μl Puffer RLT (Qiagen GmbH) den Leukozyten zur Zelllyse zugesetzt; 90 μl Ethanol werden anschließend der Probe zugesetzt. Die Probe wird dann in ein Zentrifugenröhrchen (Qiagen GmbH) mit Silicamembran eingebracht, und ein Zentrifugationsschritt wird durchgeführt.
Die Silicamembran im Zentrifugenröhrchen wird mit 350 μl Puffer RW1 (Qiagen GmbH) gewaschen, und die DNA-Moleküle auf dem Filter werden mit RNase- free DNase Set (Qiagen GmbH) entfernt. Die Silicamembran wird dann erneut mit 350 μl Puffer RW1 und zweimal mit 500 μl Puffer RPE (Qiagen GmbH) gewaschen. Die RNA-Moleküle auf dem Silicafilter werden dann letztendlich zweimal mit 40 μl RNase-freiem Wasser eluiert.
Beispiel 2
Im vorliegenden Beispiel wird die Sammlung des Vollbluts und die RNA-Extraktion mit PAXgene Blood RNA Validation Kit (Qiagen GmbH) durchgeführt. Die Blutproben werden bei 4°C für eine Dauer von 1 bis 4 Tagen gekühlt und einige davon unmittelbar ohne Kühlen bearbeitet. Nach unterschiedlichen Lagerdauern wird RNA gemäß den im Handbuch wie vom Lieferanten empfohlen beschriebenen Verfahren direkt extrahiert.
Beispiel 3
Im vorliegenden Beispiel wird die Vollblutprobe zur RNA-Extraktion mit N-Methyldodecylamin zum Stabilisieren von RNA gelagert.
333 μl frisches Vollblut wird mit 1 ml einer Stabilisierungslösung, bestehend aus 3% (G/V) N-Methyldodecylamin, 5% (v/v) Triton X-100 und 100 mM Weinsäure gemischt und für eine Dauer von 0 bis 4 Tagen bei 4°C gekühlt. Zum Isolieren der RNA werden die Komplexe der oberflächenaktiven sekundären Aminverbindung und der RNA mit 5000 xg für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wird in 50 μl destilliertem Wasser gelöst. 100 μl Puffer RLT (QIAGEN GmbH) und 10 μl Proteinase K (QIAGEN GmbH) werden der Probe zugesetzt und bei 55°C für eine Dauer von 10 Minuten inkubiert. 200 μl 1-Brom-3-chlorpropan werden der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Die Probe wird dann für eine Dauer von 5 Minuten mit 10000 xg zentrifugiert.
Der Überstand wird dann in ein neues Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt. Die Probe wird mit 90 ml Ethanol gemischt und dann auf eine Spinsäule, enthaltend eine Silicamembran, aufgebracht. Das Probengemisch wird unter Zentrifugation durch die Membran geleitet. Die Silicamembran wird mit 350 μl Puffer RW1 (QIAGEN GmbH) gewaschen, und die DNA-Moleküle werden unter Verwendung des RNase-free DNase Set (QIAGEN GmbH) eliminiert. Die Silicamembran wird mit einem anderen Aliquot von 350 μl Puffer RW1 und zweimal mit 500 μl Puffer RPE (QIAGEN GmbH) gewaschen. Schließlich werden die RNA-Moleküle zweimal mit demselben Aliquot von 40 μl RNase-freiem Wasser eluiert.
Beispiel 4
Im vorliegenden Beispiel wird die Vollblutprobe zur RNA-Extraktion mit Dodecylamin zum Stabilisieren von RNA gelagert. Eine Stabilisierungslösung, bestehend aus 0,3% (G/V) Dodecylamin, 1% (v/v) Triton X-100 und 250 mM Weinsäure, wird hergestellt und der pH-Wert mit NaOH auf pH 3 eingestellt. 1 ml frisches Vollblut wird mit 3 ml der Stabilisierungslösung gemischt und die Probe dann für eine Dauer von 0 bis 4 Tagen bei 4°C gelagert.
Zum Isolieren der RNA werden die Komplexe der oberflächenaktiven Aminverbindung und der RNA durch Zentrifugation gesammelt. Das Pellet wird in 150 μl destillierten Wasser gelöst. 300 μl Puffer RLT (QIAGEN GmbH) und 30 μl Proteinase K (QIAGEN GmbH) werden der Probe zugesetzt und bei 55°C für eine Dauer von 10 Minuten inkubiert. 200 μ 1-Brom-3-chlorpropan werden der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Die Probe wird dann für eine Dauer von 5 Minuten mit 10000 xg zentrifugiert. Der Überstand wird dann in ein neues Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt. Die Probe wird mit 270 μl Ethanol gemischt und dann auf eine Spinsäule, enthaltend eine Silicamembran, aufgebracht.
Anschließend wird wie in Beispiel 3 verfahren.
Beispiel 5
Im vorliegenden Beispiel wird die Vollblutprobe zur RNA-Extraktion mit N,N-Dimethyldodecylamin zum Stabilisieren von RNA gelagert. Eine Stabilisierungslösung, bestehend aus 5% (G/V) N,N-Dimethyldodecylamin, 2% (V/V) Triton X-100 und 140 mM Weinsäure, wird hergestellt. 333 μl frisches Vollblut werden mit 1 ml Stabilisierungslösung gemischt, und das Gemisch wird für eine Dauer von 0 bis 14 Tagen bei –20°C eingefroren. Die Verfahren des RNA-Isolierens werden nach der Beschreibung in Beispiel 3 durchgeführt.
Beispiel 6
Im vorliegenden Beispiel wird die Vollblutprobe zur RNA-Extraktion mit einer Stabilisierungslösung, bestehend aus 3% (G/V) N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid, 1% (V/V) Triton X-100 und 125 mM Weinsäure, gelagert. Das Probengemisch wird für eine Dauer von 0 bis 14 Tagen bei –20°C gelagert. RNA in den Proben von verschiedenen Lagerdauern wird nach den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren isoliert.
Beispiel 7

Ein Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) wird zum Analysieren von 28S/18S-rRNA-Verhältnissen von in den Beispielen 1–3 isolierter RNA verwendet. Gemäß dem vom Fachmann empfohlenen Standardverhältnis weist das 28S/18S-rRNA-Verhältnis von höher als 1,5 darauf hin, dass die RNA-Moleküle intakt sind; weiterhin sind die isolierten RNA-Moleküle in gutem Zustand, wenn das 28S/18S-rRNA-Verhältnis um 2,0 liegt. Außerdem zeigt eine gute Qualität der RNA-Probe ein OD260/280-Verhältnis im Bereich von 1,9–2,1, das durch ein Spektrofotometer bestimmt wird. Die vorstehend beschriebenen Verfahren wer den zum Analysieren der Qualität und Menge von RNA-Proben verwendet, und die Ergebnisse sind in nachstehend dargestellter Tabelle 1 aufgezählt. Tabelle 1

Proben	RNA-Ausbeute (μg/ml)	RNA-Qualität (OD 260/280)	28S/18S-rRNA-Verhältnis
Beispiel 1	2,39 ± 0,69	2,00 ± 0,07	0,77 ± 0,08
Beispiel 2	4,68 ± 0,68	1,94 ± 0,03	1,57 ± 0,13
Beispiel 3	7,20 ± 0,48	1,98 ± 0,14	1,83 ± 0,17

Scheinbar zeigen die Ergebnisse von Beispiel 3 in Tabelle 1 eine höhere RNA-Ausbeute als Beispiel 1 oder Beispiel 2. Eine mittlere RNA-Ausbeute von 7,20 ± 0,48 μg kann mit der Stabilisierungslösung der vorliegenden Erfindung in Beispiel 3 isoliert werden. Auch beträgt ein Verhältnis von OD 260/280 1,98 ± 0,14 sowie das 28S/18S-rRNA-Verhältnis 1,83 ± 0,17, wobei beide dem höchsten Qualitätswert von 2,0 entgegengehen.
1 zeigt Elektrophoreseergebnisse von gereinigter RNA in den Beispielen 1–3, wobei (a) RNA ist, die aus Beispiel 1 erhalten wurde; (b) aus Beispiel 2 erhalten wurde und (c) aus Beispiel 3 erhalten wurde. Die über den Figuren dargestellten Zahlen 0–4 stellen die Lagerungstage dar. In den Elektrophoreseergebnissen stellt die erste Bande jeder Bahn 28S-rRNA und die zweite Bande 18S-rRNA dar. Offensichtlich weist die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Beispiel 3 isolierte RNA die beste Qualität und Menge gegenüber den anderen beiden Verfahren in Beispiel 1 oder 2 auf. Die Menge und die Qualität zeigen keine Unterschiede zwischen den RNA-Proben aus der 4-tägigen Lagerung und aus dem Frischblut (0-tägige Lagerung).

2 zeigt Elektrophoreseergebnisse von gereinigter RNA in den Beispielen 4–6, wobei (a) die RNA aus Beispiel 4 mit 0–2-tägiger Lagerung erhalten wurde; (b) aus Beispiel 5 mit 0–14-tägiger Lagerung erhalten wurde und (c) aus Beispiel 6 mit 0–14-tägiger Lagerung erhalten wurde. Die Daten des Agilent 2100 Bioanalyzers (Agilent Technologies) sind nachstehend in Tabelle 2 aufgezählt. Gemäß den Ergebnissen von Tabelle 2 und 2 zeigt aus Vollblut isolierte RNA sogar nach 14tägiger Lagerung einen akzeptablen Zustand.

Proben	Lagerungstage	28S/18S-rRNA-Verhältnis
Beispiel 4	0 Tage	1,60 ± 0,14
	1 Tag	1,60 ± 0,00
	2 Tage	1,50 ± 0,00
Beispiel 5	0 Tage	1,90 ± 0,26
	7 Tage	1,80 ± 0,35
	14 Tage	2,00 ± 0,36
Beispiel 6	0 Tage	1,70 ± 0,44
	7 Tage	1,53 ± 0,15
	14 Tage	2,10 ± 0,26

Beispiel 8
Alle Verfahren im Beispiel werden wie in der Beschreibung in Beispiel 1 durchgeführt, wobei das Vollblut für eine Dauer von 0–2 Tagen bei 4°C gelagert wird.
Beispiel 9
Alle Verfahren im Beispiel werden wie in der Beschreibung in Beispiel 2 durchgeführt, wobei das Vollblut für eine Dauer von 0–2 Tagen bei 4°C gelagert wird.
Beispiel 10
Im vorliegenden Beispiel wird 1 ml Vollblutprobe zur RNA-Extraktion mit 3 ml einer Stabilisierungslösung, bestehend aus 5% (G/V) N,N-Dimethyldodecylamin und 225 mM Weinsäure (der pH-Wert wird mit NaOH auf pH 3,0 eingestellt), gelagert. Das Probengemisch wird für eine Dauer von 0–2 Tagen bei 4°C gelagert. Die Verfahren des RNA-Isolierens werden nach verschiedenen Lagerungsdauern nach der Beschreibung in Beispiel 4 durchgeführt.
Beispiel 11
Einzelstrang-cDNA-Moleküle werden mit den aus Beispiel 8–10 isolierten RNA-Molekülen durch SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen) nach den im Handbuch wie von dem Lieferanten empfohlen beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die synthetisierten Einzelstrang-cDNA-Moleküle werden anschließend mit TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) und Assays-on-Demand-Gene Expression Products (Applied Biosystems) durchgeführt, wonach ein Echtzeit-PCR-Verfahren mit ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durchgeführt wird. Die Expressionsgrade der 4 Gene ADORA2A, CREB5, NFKB1 und IFNGR1 werden in verschiedenen Lagerungsdauern nach den vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt, und die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
In 3 stellen die relativen Expressionsfaltungswerte das Verhältnis der Genexpressionsgrade in RNA, die aus den bei 4°C über eine Dauer von 24 Stunden oder 48 Stunden gelagerten Proben isoliert wurde, im Vergleich mit keiner Lagerung dar. Zum Beispiel stellt der relative Expressionsfaltungswert von 1 dar, dass der Genexpressionsgrad der isolierten RNA-Moleküle nach einer bestimmten Zeitdauer der Lagerung der gleiche ist wie derjenige einer 0-stündigen Lagerung. A1–A4 in 3 sind die Ergebnisse von Beispiel 8, wobei A1 das Gen ADORA2A ist, A2 das Gen CREB5 ist, A3 das Gen IFNGR1 ist und A4 das Gen NFKB1 ist. B1–B4 in 3 sind die Ergebnisse von Beispiel 9, wobei B1 das Gen ADORA2A ist, B2 das Gen CREB5 ist, B3 das Gen IFNGR1 ist und B4 das Gen NFKB1 ist. C1–C4 in 3 sind die Ergebnisse von Beispiel 10, wobei C1 das Gen ADORA2A ist, C2 das Gen CREB5 ist, C3 das Gen IFNGR1 ist und C4 das Gen NFKB1 ist. Gemäß den Daten in 3 liegt der relative Expressionsfaltungswert in Beispiel 10 nahe an 1 und zeigen die Genexpressionsgrade der vier Gene leichte Variationen. Deshalb zeigt Beispiel 10 das beste Ergebnis des Konservierens von Nukleinsäuren in Vollblut unter diesen Beispielen.
Isolieren von Nukleinsäuren
In den folgenden Beispielen 12 bis 18 wird das nicht beanspruchte Isolieren von Nukleinsäuren in einer biologischen Probe beschrieben.
Beispiel 12
Reinigung von gesamter RNA aus Vollblut
Drei verschiedene Verfahren wurden zum Isolieren von gesamter RNA aus frischem Vollblut verwendet. Zuerst wurde RNA unter Verwendung von Red Blood Cell Lyse Buffer (Roche Diagnostics GmbH) mit einem phenolhaltigen Reagens (Trizol Reagent, Life Technologies) gemäß den im Handbuch wie durch den Lieferanten empfohlen beschriebenen Verfahren isoliert. Zweitens wurde der PAXgene Blood RNA Validation Kit (QIAGEN GmbH) gemäß dem Handbuch des Lieferanten verwendet. Schließlich wurde die Reinigung der gesamten RNA mit einer oberflächenaktiven primären Aminverbindung wie nachstehend beschrieben durchgeführt.
Zuerst wurde ein Lysepuffer, bestehend aus 1% (G/V) Dodecylamin, 50 mM Maleinsäure und 3% (V/V) Tween 20, hergestellt. Frisches menschliches Vollblut (333 μl) wurde mit 1 ml des hergestellten Lysepuffers gemischt und das Gemisch dann mit einer Geschwindigkeit von 11 UpM für eine Dauer von 20 Minuten zum Gewährleisten von Homogenität gedreht. Das Gemisch wurde mit 5000 xg für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand dann verworfen; das Pellet wurde mit 333 μl doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde die das Pellet enthaltende Lösung mit 5000 xg für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand vollständig verworfen.
147 μl Puffer RLT (QIAGEN GmbH) wurde zugesetzt und mit der Probe gründlich gemischt. Dann wurden 200 μl 1-Brom-3-chlorpropan zugesetzt und für eine Dauer von 10 Sekunden aufgewirbelt. Die Probe wurde mit 10000 xg für eine Dauer von 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand dann in ein neues Röhrchen überführt. 90 μl 100%iger Ethanol wurden zugesetzt und durch dreimaliges Pipettieren gemischt und die Lösung dann in eine RNeasy-Minisäule (QIAGEN GmbH) überführt.
Die Probe wurde mit 13000 UpM für eine Dauer von 30 Sekunden zentrifugiert, der Durchfluss dann verworfen; 350 μl Puffer RW1 wurden der Säule zugesetzt und das Gemisch wieder mit 13000 UpM für eine weitere Dauer von 30 Sekunden zentrifugiert. Der Durchfluss wurde dann verworfen. 10 μl DNase-I-Stammlösung (QIAGEN GmbH) wurde zu 70 μl Puffer RDD zugesetzt. Das DNase-I-Inkubationsgemisch wurde direkt der RNeasy-Minisäule zugesetzt und bei 20–30°C für eine Dauer von 15 Minuten inkubiert; 350 μl Puffer RW1 wurden der Säule zugesetzt, dann mit 13000 UpM für eine Dauer von 30 Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss verworfen.
500 μl Puffer RPE (QIAGEN GmbH) wurden der Säule zugesetzt, die Probe dann mit 13000 UpM für eine Dauer von 30 Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Weitere 500 μl Puffer RPE wurden der RNeasy-Säule zugesetzt. Die Säule wurde mit 13000 UpM für eine Dauer von 30 Sekunden zentrifugiert und der Durchfluss dann verworfen. Die leere Säule wurde mit 13000 UpM für eine Dauer von 1 Minute zentrifugiert und die Säule dann in ein sauberes Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt. 40 μl RNase-freies Wasser wurden der Säule zugesetzt und die Säule mit 13000 UpM für eine Dauer von 1 Minute zentrifugiert. Ein weiterer Aliquot von 40 μl RNase-freiem Wasser wurde zugesetzt und die Säule mit 13000 UpM für eine Dauer von 1 Minute zentrifugiert. 80 μl eluierte Lösung wurden in ein neues Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt.
Beispiel 13
Reinigung von genomischer DNA im Vollblut
Drei verschiedene Verfahren wurden zum Isolieren von genomischer DNA aus frischem Vollblut zum Vergleich verwendet. Im ersten Verfahren wurde DNA unter Verwendung des Red Blood Cell Lysis Buffer (Roche Diagnostics GmbH) und mit einem phenolhaltigen Reagens (Trizol Reagent, Life Technologies) nach den im Handbuch wie durch den Lieferanten empfohlen beschriebenen Verfahren isoliert. Das zweite Verfahren verwendete den QIAamp DNA Blood Kit (QIAGEN GmbH) nach dem Handbuch des Lieferanten. Schließlich erfolgt im dritten Verfahren die Reinigung der gesamten DNA unter Verwendung einer oberflächenaktiven primären Aminverbindung wie nachstehend beschrieben.
333 μl frisches Vollblut wurden mit 1 ml einer Lösung, bestehend aus 1% (G/V) Dodecylamin, 3% (V/V) Tween 20 und 50 mM Maleinsäure, gemischt. Zum Isolieren der DNA wurden die Komplexe aus der oberflächenaktiven primären Aminverbindung und der DNA mit 5000 xg für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in einem Gemisch aus 200 μl Puffer AL (QIAGEN GmbH) und 20 μl Proteinase K gelöst. Nach Inkubieren bei 55°C für eine Dauer von 10 Minuten wurde die Probe mit 200 μl Ethanol gemischt und dann auf eine eine Silicamembran enthaltende Spinsäule aufgebracht. Das Probengemisch wurde unter Zentrifugation durch die Membran geleitet. Die Silicamembran wurde zum Eluieren der DNA-Moleküle mit 500 μl Puffer AW1 (QIAGEN GmbH), dann mit 500 μl Puffer AW2 (QIAGEN GmbH) und schließlich mit 200 μl destilliertem Wasser gewaschen.
Beispiel 14
Qualität und Mengen von Nukleinsäuren
Zum Bewerten der Konzentrationen von isolierten Nukleinsäuren wurden Messungen mit einem Spektrophotometer in OD260/280 durchgeführt. In Bezug auf Tabelle 3 ist eine Vergleichstabelle der Qualität und Mengen mit drei verschiedenen Isolierungsverfahren dargestellt. Die drei Verfahren lauten: A. Isolierung mit einem primären Amin, B. im Handel erhältliche Kits von PAXgene Blood RNA Validation Kit oder QIAamp DNA Blood Kit und C. Isolierung mit herkömmlichen Verfahren unter Einsatz von RBC-Lyse- und Trizol-Reagens. Tabelle 3

Isolationsverfahren RNA-Menge (μg/ml Blut) RNA-Qualität (OD260/280) DNA-Menge (μg/ml Blut) DNA-Qualität (OD260/280)

A 9,60 2,01 7,80 1,75

B 4,56 1,74 37,00 1,66

C 3,76 2,06 27,52 2,00
Auf der Basis der Daten von Tabelle 3 zeigte die Isolierung von RNA mit einem primären Amin die höchste Menge unter diesen Verfahren, und die Qualität lag ebenso in einem idealen Messbereich von 1,9 bis 2,1. Die Daten zeigten, dass die oberflächenaktive primäre Aminverbindung auch bei der DNA-Isolierung nützlich war. Die erhaltenen Proben wurden des Weiteren unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese geprüft.
Wie in 4 dargestellt, stellte Bahn D1 das DNA-Isolierungsergebnis durch ein herkömmliches Verfahren des RBC-Lyse- und Trizol-Reagenzes dar; stellte Bahn D2 das DNA-Isolierungsergebnis durch QIAamp DNA Blood Kit dar; und stellte Bahn D3 das DNA-Isolierungsergebnis durch ein oberflächenaktives primäres Amin dar. Bahn R1 stellte das RNA-Isolierungsergebnis durch das herkömmliche Verfahren des RBC-Lyse- und Trizol-Reagenzes dar; Bahn R2 stellte das RNA-Isolierungsergebnis durch PAXgene RNA Blood Kit dar; und Bahn R3 stellte das RNA-Isolierungsergebnis durch die oberflächenaktive primäre Aminverbindung dar. Die Menge jeder Beladungsbahn betrug 100 ng DNA oder 200 ng RNA. Die Ergebnisse von Bahn D3 und Bahn R3 wiesen darauf hin, dass die Qualität der isolierten Nukleinsäuren durch die oberflächenaktive primäre Aminverbindung effizienter als in den anderen beiden herkömmlichen Verfahren war.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Verwendung einer oberflächenaktiven primären Aminverbindung DNA-Moleküle mit guter Qualität in einer guten Qualitätsweise isolieren kann. Die Menge der isolierten RNA in Bahn R3 war etwa dieselbe wie in den anderen beiden Bahnen. Es ist klar aus Bahn R3 dargestellt, dass mit dem Verfahren zum Isolieren von RNA mit einer oberflächenaktiven primären Aminverbindung reine RNA-Moleküle mit genomischen DNA-Kontaminanten erhalten werden können.
Beispiel 15
Reinigung von gesamter RNA mit einer oberflächenaktiven sekundären Aminverbindung.
18 Lösungen von 1%igem, 2%igem oder 3%igem oberflächenaktiven N-Methyldodecylamin und Weinsäure in verschiedenen Konzentrationen von 25, 50, 75, 100, 125 oder 150 mM wurden hergestellt. 1 ml jedes oberflächenaktiven Mittels wurde getrennten 333 μl frisches Blut zugesetzt, die Probengemische wurden mit einer Geschwindigkeit von 11 UpM für eine Dauer von 20 Minuten bei Raumtemperatur gedreht.
Die Lösung wurde für eine Dauer von 10 Minuten mit 5000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde dann durch Dekantieren oder Pipettieren entfernt. 666 μl doppelt destilliertes Wasser wurden dann dem Pellet zugesetzt und das Pellet erneut durch gründliches Aufwirbeln suspendiert. Die Probe wurde für eine Dauer von 10 Minuten mit 5000 xg zentrifugiert. Der gesamte Überstand wurde dann entfernt und verworfen.
Das Pellet wurde erneut gründlich mit 50 μl RNase-freiem Wasser durch Pipettieren, bis keine Teilchen mehr zu sehen waren, suspendiert. Dann wurden 100 μl Puffer RLT (Qiagen, RNeasy Minikit) und 40 μl Proteinase K zugesetzt und gleichmäßig durch Pipettieren gemischt. Die Lösung wurde für eine Dauer von 10 Minuten bei 55°C in einem Schüttelinkubator oder Wasserbad inkubiert. 200 μl 1-Brom-3-chlorpropan wurden der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Die Probe wurde dann für eine Dauer von 5 Minuten mit 10000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt.
90 μl 100%iger Ethanol wurden der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Das Gemisch wurde dann zum Entfernen von Tröpfchen im Röhrchendeckel mit niedriger Geschwindigkeit kurz zentrifugiert (weniger als 2 Sekunden).
Die Probenlösungen wurden auf eine RNeasy-Minisäule aufgebracht und für eine Dauer von 30 Sekunden mit 13000 UpM zentrifugiert. Dann wurden 350 μl Puffer RW1 der Säule zugesetzt und für eine Dauer von 1 Minute mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde verworfen.
10 μl DNase-I-Stammlösung wurden zugesetzt und mit 70 μl Puffer RDD gemischt. Die erhaltenen 80 μl DNase-I-Inkubationsgemisch wurden dann direkt in die Spinsäulenmembran überführt, und die Probe wurde für eine Dauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. 350 μl Puffer RW1 wurden auf die Säule aufgebracht, und die Spinsäule wurde für eine Dauer von 30 Sekunden mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde verworfen. 500 μl Puffer RPE wurden auf die Säule aufgebracht, und die Säule wurde für eine Dauer von 30 Sekunden mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde verworfen.
Weitere 500 μl Puffer RPE wurden in der Säule zugesetzt. Die Säule wurde dann für eine Dauer von 1 Minute mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde verworfen. Die Säule wurde erneut für eine Dauer von 2 Minuten mit 13000 UpM zentrifugiert.
Die Säule wurde in ein neues Elutionsröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt, wonach 40 μl RNase-freies Wasser direkt auf die Säulenmembran pipettiert wurden und das Probenröhrchen für eine Dauer von 1 Minute mit 13000 UpM zentrifugiert wurde. Weitere 40 ml RNase-freies Wasser wurden auf die Säule aufgebracht und erneut zentrifugiert, und man ließ das RNA-Produkt nach der Zentrifugation in ein Elutionsröhrchen fließen.
Die durch die vorstehend veranschaulichten Verfahren erzielte Pelletgröße (%) der isolierten RNA-Produkte ist in Tabelle 4A dargestellt. Tabelle 4A

Weinsäure (mM) 25 mM 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM

1% 9 21 18 15 18 30

2% 45 9 9 6 4,5 6

3% 60 30 7,5 6 4,5 3
Die Pelletgröße wurde als das Verhältnis des Pelletvolumens zum Blutvolumen bezeichnet. Der höhere Wert der Pelletgröße weist daraufhin, dass mehr im Pellet enthaltene Verunreinigungen oder Kontaminanten vorlagen.
Tabelle 4B zeigt die RNA-Ausbeute (μg/ml Blut) nach der RNA-Isolierung nach dem vorstehenden Verfahren. Tabelle 4B

Weinsäure (mM) 25 mM 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM

1% 1 4,26 3,82 2,74 2,86 1,25

2% N/A 3,61 3,42 2,24 2,57 2,25

3% N/A N/A 3,69 3,36 2,9 2,24
Auf der Basis der in den Tabellen 4A und 4B gezeigten Daten entfernte die Formulierung aus 2%igem oder 3%igem N-Methyldodecylamin mit 75 bis 150 mM Weinsäure die größte Menge an Verunreinigungen oder Kontaminanten im isolierten RNA-Produkt, und die Ausbeuten waren zufriedenstellend.
Beispiel 16
Reinigung von gesamter RNA mit oberflächenaktivem tertiärem Amin.
10 Lösungen von 1%igem oder 3%igem N,N-Dimethyldodecylamin mit Weinsäure in verschiedenen Konzentrationen von 50, 75, 100, 125 oder 150 mM wurden hergestellt. 333 μl frisches Blut wurden dann mit 1 ml jeder der hergestellten oberflächenaktiven Lösungen gemischt, und das erhaltene Probengemisch wurde bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 11 UpM für eine Dauer von 20 Minuten zum Gewährleisten von Homogenität gedreht. Die Lösung wurde dann für eine Dauer von 10 Minuten mit 5000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Dekantieren oder Pipettieren entfernt. Dann wurden 666 μl doppelt destilliertes Wasser dem Pellet zugesetzt, und das Pellet wurde erneut gründlich durch Auswirbeln suspendiert. Das Gemisch wurde für eine Dauer von 10 Minuten mit 5000 xg zentrifugiert. Der gesamte Überstand wurde dann entfernt und verworfen.
Das Pellet wurde gründlich mit 167 μl Puffer RLT (Qiagen, RNeasy Minikit), bis kein Teilchen mehr sichtbar war, erneut suspendiert. 200 μl 1-Brom-3-chlorpropan wurden der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Die Probe wurde dann für eine Dauer von 5 Minuten mit 10000 xg zentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt.
90 μl 100%iger Ethanol wurden der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Das Gemisch wurde dann zum Entfernen von Tröpfchen im Röhrchendeckel mit geringer Geschwindigkeit kurz zentrifugiert (weniger als 2 Sekunden).
Die Probenlösungen wurden auf eine RNeasy-Minisäule aufgebracht und für eine Dauer von 30 Sekunden mit 13000 UpM zentrifugiert. Dann wurden 350 μl Puffer RW1 der Säule zugesetzt und für eine Dauer von 1 Minute mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde verworfen.
10 μl DNase-I-Stammlösung wurden zu 70 μl Puffer RDD zugesetzt. Das DNase-I-Inkubationsgemisch (80 μl) wurde dann direkt in die Spinsäulenmembran überführt und die Probe bei Raumtemperatur für eine Dauer von 15 Minuten stehen gelassen. 350 μl Puffer RW1 wurden auf die Säule aufgebracht und für eine Dauer von 30 Sekunden mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde verworfen. 500 μl Puffer RPE wurden auf die Säule aufgebracht, und die Säule wurde für eine Dauer von 30 Sekunden mit 13000 UpM zentrifugiert. Das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen wurde dann verworfen.
Weitere 500 μl Puffer RPE wurden der Säule zugesetzt. Die Säule wurde dann für eine Dauer von 1 Minute mit 13000 UpM zentrifugiert und das alte den Durchfluss enthaltende Verarbeitungsröhrchen dann verworfen. Die Säule wurde wiederum für eine Dauer von 2 Minuten mit 13000 UpM zentrifugiert.
Die Säule wurde dann in ein neues Elutionsröhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt, wonach 40 μl RNase-freies Wasser direkt auf die Säulenmembran aufgebracht wurden und das Säulenröhrchen für eine Dauer von 1 Minute mit 13000 UpM zentrifugiert wurde. Weitere 40 μl RNase-freies Wasser wurden auf die Säule aufgebracht und wiederum zentrifugiert.
Die Pelletgröße (%) und die Ausbeuten der isolierten RNA-Produkte durch die vorstehend veranschaulichten Verfahren sind in Tabelle 5A bzw. 5B aufgezeigt. Tabelle 5A

Weinsäure (mM) 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM

1% 7,5 6 10,5 7,5 9

3% 2 1 1 1 1

Tabelle 5B

Weinsäure (mM) 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM

1% 5,16 5,07 3,07 2,5 1,94

3% 1,75 5,24 3,05 2,4 2,84
Auf der Basis der in den Tabellen 5A und 5B gezeigten Daten entfernte die Formulierung aus 3%igem N,N-Dimethyldodecylamin mit 75 mM Weinsäure effi zient die Verunreinigungen oder Kontaminanten in der isolierten RNA, was zu der höchsten Qualität der RNA-Produkte führte.
Die Isolierungseffizienz ist in den Elektrophoreseergebnissen in 5 ersichtlich, in welchen Bahn 1 bis Bahn 5 die Bahnen waren, in welchen 1%iges N,N-Dimethyldodecylamin verwendet wurde, und Bahn 6 bis Bahn 10 die Bahnen waren, in welchen 3%iges N,N-Dimethyldodecylamin verwendet wurde. Bahn 1 und 6, 2 und 7, 3 und 8, 4 und 9, 5 und 10 wurden mit 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM und 150 mM Weinsäure getrennt formuliert.
Beispiel 17
Reinigung von gesamter RNA mit oberflächenaktivem tertiärem Aminoxid.
16 Lösungen, in welchen jede 1%iges N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid mit verschiedenen Mengen an Maleinsäure, Zitronensäure, Weinsäure oder Oxalsäure enthielt, wurden in den Konzentrationen 25, 50, 75 oder 100 mM hergestellt. Dann wurde den vorstehend beschriebenen Schritten zum Isolieren von RNA aus einer Vollblutprobe in Beispiel 16 gefolgt.
Tabelle 6 zeigt die RNA-Ausbeuten (μg/ml Blut) nach der RNA-Isolierung durch Folgen der vorstehenden Verfahren. Tabelle 6

RNA-Ausbeute 25 mM 50 mM 75 mM 100 mM

Maleinsäure 4,32 3,12 3,84 2,40

Zitronensäure 3,84 3,12 4,56 3,36

Weinsäure 2,64 4,08 3,60 3,84

Oxalsäure 5,28 4,56 3,36 3,60
Die Isolierungseffizienz ist aus dem Elektrophoreseergebnis in 6 ersichtlich, wobei es sich bei Teil A um das mit Maleinsäure durchgeführte Ergebnis, bei Teil B um das Ergebnis mit Zitronensäure; bei Teil C um das Ergebnis mit Weinsäure und bei Teil D um das Ergebnis mit Oxalsäure handelte. Bahn 1 lag mit einer Konzentration von 25 mM, Bahn 2 mit 50 mM, Bahn 3 mit 75 mM und Bahn 4 mit 100 mM vor.
Gemäß den Daten in Tabelle 6 und dem Elektrophoreseergebnis in 6 zeigten alle mit 1% N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid und Zitronensäure, Weinsäure oder Oxalsäure isolierten RNA-Proben eine gute Qualität und akzeptable Mengen.
Beispiel 18
Reinigung von genomischer DNA in Vollblut mit 4-Tetradecylanilin.
3 Lösungen von 1%igem 4-Tetradecylanilin und Tween 20 in verschiedenen Konzentrationen von 3, 4 oder 5% wurden hergestellt. 333 μl frisches Vollblut wurden mit 1 ml jeder der hergestellten oberflächenaktiven Lösungen gemischt. Das Gemisch wurde dann mit 5000 xg für eine Dauer von 10 Minuten zentrifugiert, um die Komplexe der DNA-Moleküle und der oberflächenaktiven primären Amine auszufällen. Das Pellet wurde in 333 μl Puffer RLT (QIAGEN GmbH) gelöst. Dann wurden 200 μl 1-Brom-3-chlorpropan der Probe zugesetzt und durch Aufwirbeln gemischt. Die Probe wurde dann für eine Dauer von 5 Minuten mit 10000 xg zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen mit einem Volumen von 1,5 ml überführt, dann mit 160 μl Ethanol gemischt und auf eine eine Silicamembran enthaltende Spinsäule aufgebracht. Die Probe wurde unter Zentrifugation durch die Membran geleitet. Die Silicamembran wurde zum Eluieren der DNA-Moleküle einmal mit 700 μl Puffer RW1 (QIAGEN GmbH), dann zweimal mit 500 μl Puf fer RPE (QIAGEN GmbH) und schließlich mit 80 μl destilliertem Wasser gewaschen.
Die Isolierungseffizienz ist aus dem Elektrophoreseergebnis in 7 ersichtlich, wobei die drei Bahnen mit verschiedenen Konzentrationen an Tween 20 dargestellt sind. Bahn 1 lag mit einer Konzentration von 3%, Bahn 2 mit einer Konzentration von 4% und Bahn 3 mit einer Konzentration von 5% vor. Gemäß den Ergebnissen zeigten die mit 4-Tetradecylanilin isolierten DNA-Proben gute Qualität und zufriedenstellende Menge. Zudem kann eine intakte genomische DNA extrahiert werden.
Die Ausführungsformen zeigen, dass gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren in einer biologischen Probe mit verschiedenen Stabilisierungslösungen, enthaltend primäres Amin, sekundäres Amin oder tertiäres Amin effektiv stabilisiert werden können. Die vorliegende Erfindung verlängert die Stabilisierungs- oder Konservierungsdauern und verbessert auch die Menge der Isolierung mit einfachen Verfahren gemäß den Daten der vorstehend beschriebenen Beispiele. Das Verfahren kann automatisch durchgeführt werden, um den Durchsatz zu erhöhen und die Anwendung des molekulardiagnostischen Testens mit Nukleinsäuren zu erweitern.
Obwohl die vorliegende Erfindung in Bezug auf ihre bevorzugte Ausführungsform beschrieben wurde, ist es klar, dass viele andere mögliche Modifikationen und Variationen ohne Verlassen des wie nachstehend beanspruchten Geists und Umfangs der Erfindung durchgeführt werden können.

Claims

Verfahren zum Stabilisieren von Nukleinsäuren durch Bilden eines unlöslichen ionischen Komplexes zwischen Nukleinsäuren und einem oberflächenaktiven Mittel in einer biologischen Probe, umfassend einen Schritt des Inkontaktbringens der biologischen Probe mit einer Stabilisierungszusammensetzung, umfassend oberflächenaktive Aminverbindungen der Formel (I): R₁R₂R₃N(O)_x, (I)wobei R₁ und R₂ jeweils unabhängig H, eine C1-C6-Alkylgruppe, C6-C12-Arylgruppe oder C6-C12-Aralkylgruppe sind; R₃ eine C1-C20-Alkylgruppe, C6-C26-Arylgruppe oder C6-C26-Aralkylgruppe ist; und x eine ganze Zahl von 0 oder 1 ist; und wobei der pH-Wert der Zusammensetzung im Bereich von 1 bis 5 liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei x 1 ist, R₁ und R₂ jeweils unabhängig C1-C6-Alkyl sind und R₃ C1-C20-Alkyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei x 0 ist
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die oberflächenaktiven Aminverbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Dodecylamin, N-Methyldodecylamin, N,N-Dimethyldodecylamin, N,N-Dimethyldodecylamin-N-oxid und 4-Tetradecylanilin.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Konzentration der oberflächenaktiven Aminverbindungen in der Zusammensetzung im Bereich von 0,001 bis 20% liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung des Weiteren mindestens ein nicht ionisches Detergens, mindestens ein Säuresalz oder das Gemisch davon umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine nicht ionische Detergens Polyoxyethylensorbitmonolaurat ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine nicht ionische Detergens in der Zusammensetzung im Bereich von 0,01 bis 20% liegt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine nicht ionische Detergens Tween 20 oder Triton X-100 ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das mindestens eine Säuresalz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Maleinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Oxalsäure, Carbonsäuren und Mineralsäuren.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Gesamtkonzentration der Säuresalze in der Zusammensetzung im Bereich von 0,01 mol/l bis 1 mol/l liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Urin, Gewebe und Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuren DNA und RNA sind.