DE202017007130U1

DE202017007130U1 - Lysereagenz für Blutzellen

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Publication number: DE202017007130U1
Application number: DE202017007130.4U
Authority: DE
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2019-08-29
Anticipated expiration: 2027-04-27
Also published as: JP2019515277A; AU2023201805B2; US20190136225A1; EP3736332A1; EP3736332B1; DE202017007129U1; EP3448998B1; US20220002707A1; JP2023002621A; US20210139886A1; CA3021914C; JP2026009106A; AU2023201805A1; AU2017257978A1; JP7134869B2; WO2017189746A1; US20240360435A1; JP7331038B2; JP2021121809A; EP3736332C0

Abstract

Lysereagenz für Blutzellen, das Folgendes umfasst: (i) einen Puffer, (ii) Lithiumlaurylsulfat (LLS), und (iii) eines oder beides von einem Chlorid-haltigen Salz und einem Gerinnungshemmer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EDTA-Na, EGTA, und Kombinationen davon, wobei das Reagenz einen pH aufweist, der größer als 5,5 ist.

Description

QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
Die vorliegende Anmeldung beansprucht den Vorteil unter 35 U.S.C. § 119(e) der provisorischen US-Patentanmeldung Nr. 62/328,358 , eingereicht am 27. April 2016, deren gesamter Inhalt hierdurch unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
HINTERGRUND
Obwohl es kommerzielle Assays für den Nachweis von RNA in Blut gibt, liegt die RNA, die in derartigen Assays nachgewiesen wird, gewöhnlich in extrazellulären Formen vor, wie zum Beispiel HIV- oder HCV-Partikeln im Blut. Der Nachweis von RNA oder anderen Zielmolekülen aus dem Inneren von Blutzellen und insbesondere aus dem Inneren von roten Blutzellen ist eine größere Herausforderung. Reagenzien, die in der Lyse verwendet werden, können die nachfolgende Verarbeitung beeinträchtigen, da viele Nicht-Zielmoleküle, die durch die Lyse freigesetzt werden, insbesondere Nukleasen oder Proteasen, Zielmoleküle abbauen können.
Die intrinsische Instabilität von RNA und die Gegenwart von RNAsen im Vollblut erschwert die Aufgabe der Isolierung von RNA. Die Verwendung von hochreiner, intakter RNA ermöglicht empfindliche klinische diagnostische Assays. Bestehende Ansätze beinhalten normalerweise mehrere aufeinanderfolgende Schritte: einen Schritt des Aufschließens der Zellen, einen Schritt der Denaturierung der Proteine, einen weiteren Schritt für die Stabilisierung und den Schutz von RNA vor RNAsen und dann einen Schritt für die Isolierung der RNA.
Tetradecyltrimethylammoniumoxalat (TDTMAO) wird häufig für den Transport, die Lagerung und Verarbeitung von Blut verwendet ( US-Pat. Nr. 6,602,718 und 6,617,170 ). Dieses quartäre Amin ist beispielsweise in dem PAXgene™ Blood RNA System (BD Biosciences) enthalten und funktioniert durch Penetrierung der Zelle und Stabilisierung von intrazellulärer Ziel-RNA. Die RNA kann dann später von den Komponenten von Vollblut unter Verwendung von Standardtechniken aufgereinigt und analysiert werden. Verfahren für die Lyse von Zellen und Inhibierung von RNAsen unter Verwendung von Guanidiniumsalzen sind auch bekannt (Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159).
ZUSAMMENFASSUNG
Hierin wird ein Lysereagenz für Blutzellen bereitgestellt, das Folgendes umfasst: (i) einen Puffer, (ii) Lithiumlaurylsulfat (LLS), und (iii) eines oder beides von einem Chlorid-haltigen Salz und einem Gerinnungshemmer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EDTA-Na₂, EGTA, und Kombinationen davon, wobei das Reagenz einen pH aufweist, der größer als 5,5 ist.
In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein Natriumbicarbonat-Puffer. In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein TRIS (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol)-Puffer. In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein Natriumbicarbonat-Puffer. In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein Natriumphosphat-Puffer. In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein Natriumbicarbonat-Puffer in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM, von etwa 10 mM bis etwa 20 mM, etwa 10 mM bis etwa 15 mM oder von etwa 15 mM bis etwa 20 mM. In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein TRIS-Puffer in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 75 mM bis etwa 150 mM, von etwa 75 mM bis etwa 125 mM, von etwa 100 mM bis etwa 125 mM oder von etwa 90 mM bis etwa 110 mM. In einigen Ausführungsformen ist der Puffer ein Natriumphosphat (Na₃PO₄)-Puffer in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM, von etwa 10 mM bis etwa 20 mM, etwa 10 mM bis etwa 15 mM oder von etwa 15 mM bis etwa 20 mM. In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration von Natriumphosphat in dem Reagenz von etwa 8 mM bis etwa 40 mM, von etwa 10 mM bis etwa 33 mM, von etwa 15 mM bis etwa 30 mM, etwa 30 mM oder etwa 15 mM. In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration von monobasischem Natriumphosphat in dem Reagenz von etwa 8 mM bis etwa 40 mM, von etwa 10 mM bis etwa 33 mM, von etwa 15 mM bis etwa 30 mM, etwa 30 mM oder etwa 15 mM. In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration von dibasischem Natriumphosphat in dem Reagenz von etwa 8 mM bis etwa 40 mM, von etwa 10 mM bis etwa 33 mM, von etwa 15 mM bis etwa 30 mM, etwa 30 mM oder etwa 15 mM. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
In einigen Ausführungsformen ist der Gerinnungshemmer eines oder mehrere von EDTA ((Ethylendinitrilo)tetraessigsäure), EDTA-Na₂ (Dinatriumethylendiamintetraacetat-Dihydrat), EGTA (Ethylenbis(oxyethylennitrilo)tetraessigsäure), Heparin oder Citrat. In einigen Ausführungsformen umfasst der Gerinnungshemmer eine EDTA in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM oder von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM. In einigen Ausführungsformen ist der Gerinnungshemmer EDTA in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM oder von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM. In einigen Ausführungsformen ist der Gerinnungshemmer EDTA-Na₂ in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM oder von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM. In einigen Ausführungsformen ist der Gerinnungshemmer EGTA in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM oder von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
In einigen Ausführungsformen umfasst das Salz eines oder mehrere der folgenden Ionen: ein Natriumion, ein Kaliumion, ein Ammoniumion, ein Magnesiumion, ein Lithiumion und ein Chloridion. In einigen Ausführungsformen ist das Salz Magnesiumchlorid, Ammoniumchlorid, Kaliumchlorid oder Natriumchlorid. In einigen Ausführungsformen umfasst das Salz ein Chloridion und eines von einem Magnesiumion, Natriumion oder Kaliumion und beträgt die Konzentration des Salzes in dem Reagenz von etwa 10 mM bis etwa 50 mM, von etwa 15 mM bis etwa 40 mM oder von etwa 20 mM bis etwa 35 mM. In einigen Ausführungsformen ist das Salz Ammoniumchlorid in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 100 mM bis etwa 500 mM, von etwa 200 mM bis etwa 350 mM oder von etwa 250 mM bis etwa 300 mM. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
In einigen Ausführungsformen ist das Detergens Lithiumlaurylsulfat (LLS). In einigen Ausführungsformen liegt das Detergens in dem Reagenz in einer Konzentration vor, die größer ist als etwa 1,5 % (V/V oder m/V). In einigen Ausführungsformen liegt das Detergens in dem Reagenz in einer Konzentration vor, die kleiner ist als etwa 15,5 % (V/V oder m/V). In einigen Ausführungsformen liegt das Detergens in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 2 % bis etwa 15 % (V/V oder m/V) vor. In einigen Ausführungsformen liegt das Detergens in dem Reagenz in einer Konzentration von etwa 2 % bis etwa 15 % (V/V oder m/V) vor. In einigen Ausführungsformen ist das Detergens LLS und beträgt die Konzentration von LLS in dem Reagenz von etwa 2 % bis etwa 15 % (m/V), von etwa 4 % bis etwa 10 % (m/V) oder von etwa 5 % bis etwa 8 % (m/V). In einigen Ausführungsformen ist das Detergens LLS und liegt in dem Reagenz in etwa 14 mM bis etwa 50 mM vor. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
In einigen Ausführungsformen ist der pH des Reagenzes größer als ein pH von 5,5. In einigen Ausführungsformen ist der pH des Reagenzes kleiner als ein pH von 10,5. In einigen Ausführungsformen beträgt der pH des Reagenzes von etwa 6,0 bis etwa 10,0. In einigen Ausführungsformen beträgt der pH des Reagenzes von etwa 6,5 bis etwa 8,0 oder von etwa 7,0 bis etwa 8,0 oder von etwa 7,2 bis etwa 7,6 oder von etwa 6,7 bis etwa 7,5 oder etwa 6,7 oder etwa 7,3 oder etwa 7,5. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
In einigen Ausführungsformen des Reagenzes beträgt die Konzentration von Natriumbicarbonat 14 mM, beträgt die Konzentration von Ammoniumchlorid 250 mM, beträgt die Konzentration von LLS 8 % (m/V), beträgt die Konzentration von EDTA von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM und beträgt der pH 7,2-7,6. In einigen Ausführungsformen des Reagenzes ist der Puffer aus der Gruppe ausgewählt, die aus Natriumbicarbonat, Natriumphosphat und TRIS besteht, beträgt das Detergens von etwa 5 % bis etwa 10 % (V/V oder m/V), beträgt der pH von etwa 6,5 bis etwa 8,0 und ist das Salz aus der Gruppe ausgewählt, die aus Magnesiumchlorid, Ammoniumchlorid und Kaliumchlorid besteht. In einigen Ausführungsformen des Reagenzes ist der Puffer aus der Gruppe ausgewählt, die aus Natriumphosphat und TRIS besteht, und ist das Salz aus der Gruppe ausgewählt, die aus Magnesiumchlorid und Ammoniumchlorid besteht. In einigen Aspekten dieser Ausführungsform beträgt die Konzentration an Gerinnungshemmer etwa 0 mM bis etwa 1 mM. In einigen weiteren Aspekten dieser Ausführungsform ist das Detergens LLS in einer Konzentration von etwa 6 % bis etwa 10 % (m/V). In einigen weiteren Aspekten dieser Ausführungsform ist der Puffer TRIS in einer Konzentration von etwa 90 mM bis etwa 110 mM und beträgt der pH des Reagenzes von etwa 7,2 bis etwa 7,5. In einigen weiteren Aspekten dieser Ausführungsform liegt der Gerinnungshemmer in einer Konzentration von etwa 0,1 mM bis etwa 5 mM vor und ist EGTA, EDTA, EDTA-Na₂ oder eine Kombination davon.
In einigen Ausführungsformen wird das Reagenz Blutzellen, roten Blutzellen oder Produkten, die von roten Blutzellen stammen, beigemischt. In bestimmten Ausführungsformen wird das Reagenz Vollblut beigemischt. In einigen Ausführungsformen wird das Reagenz Vollblut in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 (V/V) bis etwa 4 : 1 (V/V), einschließlich aller ganzzahliger Verhältnisse und Teilmengen dazwischen, beigemischt. In einigen Ausführungsformen wird das Reagenz Vollblut in einem Verhältnis von 3 : 1 (V/V) beigemischt. In einigen Ausführungsformen ist das Vollblut menschliches Vollblut, nichtmenschliches Vollblut oder eine Mischung davon.
Weiter wird hierin ein Verfahren zur Analyse eines Analyten aus Blutzellen bereitgestellt, das Folgendes umfasst: (a) Inkontaktbringen von Blutzellen mit einem Reagenz, das einen Puffer, ein Salz und ein Detergens umfasst, wobei das Reagenz zur Lyse der Blutzellen und Inhibierung des Abbaus des Analyten, der aus den Blutzellen freigesetzt wurde, wirksam ist; und (b) Analysieren des Analyten, der aus den Blutzellen freigesetzt wurde.
In einigen Verfahren ist das Ziel ein Pathogen-abstammendes Ziel. In einigen Verfahren ist das Ziel RNA.
In einigen Verfahren umfasst das Analysieren des Ziels einen Nukleinsäure-Assay. In einigen Verfahren umfasst das Analysieren des Ziels das Inkontaktbringen des freigesetzten Ziels mit einer Einfangsonde und einer immobilisierten Sonde, wobei die Einfangsonde Folgendes aufweist: ein erstes Segment, das zu dem Ziel komplementär ist, und ein zweites Segment, das zu der immobilisierten Sonde komplementär ist, wobei das Ziel zu der Einfangsonde bindet und wobei die gebundene Einfangsonde zu der immobilisierten Sonde bindet. Einige Verfahren umfassen weiter die Durchführung einer transkriptionsvermittelten Amplifikation des Ziels und den Nachweis des entstehenden Amplifikationsproduktes mit einer Nachweissonde.
Einige Verfahren werden ohne einen Zentrifugationsschritt durchgeführt, um das Reagenz von dem Ziel, das aus den Blutzellen freigesetzt wurde, abzutrennen.
Figurenliste

SEQ.-ID Nr. 1 legt die Nukleinsäuresequenz eines Nicht-T7-Primers dar.
SEQ.-ID Nr. 2 legt die Nukleinsäuresequenz eines T7-Primers dar.
SEQ.-ID Nr. 3 legt die Nukleinsäuresequenz einer Acridiniumester (AE)-Sonde dar.
SEQ.-ID Nr. 4 legt die Nukleinsäuresequenz einer Zieleinfangoligonukleotid (TCO)-Sonde dar.

DEFINITIONEN
Pathogene schließen Viren, Bakterien, Protozoen, Pilze und andere Mikroorganismen ein, die für Erkrankungen beim Menschen und anderen Tieren verantwortlich sind.
Ein Analyt (manchmal hierin als ein Ziel bezeichnet) kann eine einzige Molekülart, wie zum Beispiel ein Protein oder eine Nukleinsäure, oder eine Molekülklasse, wie zum Beispiel jedwedes Protein oder jedwede RNA aus einem Parasiten oder jedwedes Protein oder jedwede RNA aus Blutzellen, sein. Es können auch mehrere verschiedene Analyten, wie zum Beispiel ein RNA-Analyt und ein Protein-Analyt, oder zwei verschiedene RNA-Analyten, wie zum Beispiel zwei unterschiedliche mRNA-Analyten oder ein mRNA-Analyt und ein rRNA-Analyt, analysiert werden. Analyten schließen endogene Komponenten von Blutzellen und Komponenten, die infolge von Infektion mit Pathogen auftreten, von infizierten Blutzellen ein und werden normalerweise durch das infizierende Pathogen (d. h. „pathogene“ oder „Pathogen-abstammende“ Analyten) kodiert.
Ein Lysereagenz ist ein Reagenz, das häufig in Form einer Lösung bereitgestellt wird, das für die Auslösung der Lyse von Blutzellen in Vollblut wirksam ist, die die Lyse von roten Blutzellen oder Produkten von roten Blutzellen, wie zum Beispiel pelletierten roten Blutzellen, einschließt.
Detergenzien sind oberflächenaktive Stoffe, die die Solubilisierung von hydrophoben Molekülen bewirken. Diese sind im Allgemeinen wasserlösliche oberflächenaktive Stoffe, die aus einem hydrophoben Teil bestehen, gewöhnlich einer langen Alkylkette, der an hydrophile oder die Wasserlöslichkeit verbessernde funktionelle Gruppen gebunden ist. Detergenzien schließen anionische Detergenzien, kationische Detergenzien, zwitterionische Detergenzien, nichtionische Detergenzien und Antischaummittel ein.
Gerinnungshemmer inhibieren die Gerinnung von Vollblut. Gerinnungshemmer schließen Heparine und Calcium-Komplexbildner ein. Heparine aktivieren Antithrombin III, das die Aktivität von Thrombin und anderen Proteasen, die an der Blutgerinnung beteiligt sind, inhibiert. Calcium-Komplexbildner, wie zum Beispiel die EDTAs, die EGTAs und Citrate, binden Calciumionen, die für die Blutgerinnung notwendig sind.
Ein Puffer bezieht sich auf eine schwache Säure oder schwache Base, die zur Aufrechterhaltung des pH einer Lösung verwendet wird.
Eine Nukleinsäure bezieht sich auf eine multimere Verbindung, die Nukleotide oder Analoga umfasst, die stickstoffhaltige heterocyclische Basen oder Basenanaloga aufweisen, die zur Bildung eines Polymers, einschließlich konventioneller RNA, DNA, gemischter RNA-DNA und Analoga davon, miteinander verknüpft sind.
Die stickstoffhaltigen heterocyclischen Basen können als Nukleinbasen bezeichnet werden. Nukleinbasen können Folgendes sein: konventionelle DNA- oder RNA-Basen (A, G, C, T, U), Basenanaloga, (The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., Hrsg., 11. Aufl., 1992; van Aerschott et al., 1995, Nucl. Acids Res. 23(21): 4363-70), Pyrimidin- oder Purinderivate, (Hill et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(8):4258-63, Lin und Brown, 1992, Nucl. Acids Res. 20(19):5149-52), Pyren-funktionalisierte LNA-Nukleosidanaloga (Babu & Wengel, 2001, Chem. Commun. (Camb.) 20: 2114-5; Hrdlicka et al., 2005, J. Am. Chem. Soc. 127(38): 13293-9) und hydrophobe Nukleinbasen, die doppelsträngige DNA ohne Wasserstoffbrückenbindung bilden (Berger et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28(15): 2911-4). Viele derivatisierte und modifizierte Nukleinbasen oder Analoga sind kommerziell erhältlich (z. B. Glen Research, Sterling, Va.).
Eine Nukleinbaseeinheit, die an einen Zucker gebunden ist, kann als Nukleinbaseeinheit oder Monomer bezeichnet werden. Zuckereinheiten einer Nukleinsäure können Ribose, Desoxyribose oder ähnliche Verbindungen, z. B. mit 2'-Methoxy- oder 2'-Halogenidsubstitutionen, sein. Nukleotide und Nukleoside sind Beispiele für Nukleinbaseeinheiten.
Die Nukleinbaseeinheiten können mit einer Vielfalt von Verknüpfungen oder Konformationen verbunden sein, einschließlich Phosphodiester-, Phosphorothioat- oder Methylphosphonat-Verknüpfungen, Peptid-Nukleinsäure-Verknüpfungen (PNA; Nielsen et al., 1994, Bioconj. Chem. 5(1): 3-7; PCT Nr. WO 95/32305 ) und einer verbrückten Nukleinsäure (LNA = locked nucleic acid)-Konformation, in der Nukleotidmonomere mit einer bicyclischen Furanoseeinheit in einer RNA-nachahmenden Zuckerkonformation verbrückt sind (Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42): 13233-41; Hakansson & Wengel, 2001, Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 (7):935-8), oder Kombinationen von derartigen Verknüpfungen in einem Nukleinsäurestrang. Nukleinsäuren können einen oder mehrere „abasische“ Reste einschließen, d. h. die Hauptkette schließt keine stickstoffhaltige Base für eine oder mehrere Positionen ein ( US-Pat. Nr. 5,585,481 ).
Eine Nukleinsäure kann nur konventionelle RNA- oder DNA-Zucker, -Basen und -Verknüpfungen einschließen oder kann sowohl konventionelle Komponenten als auch Substitutionen einschließen (z. B. konventionelle RNA-Basen mit 2'-0-Methyl-Verknüpfungen oder eine Mischung aus konventionellen Basen und Analoga). Der Einschluss von PNA, 2'-Methoxy- oder 2'-Fluor-substituierter RNA oder Strukturen, die die Gesamtladung, Ladungsdichte oder sterischen Organisationen eines Hybridisierungskomplexes beeinflussen, einschließlich Oligomeren, die geladene Verknüpfungen (z. B. Phosphorothioate) oder neutrale Gruppen (z. B. Methylphosphonate) enthalten, kann die Stabilität von Doppelsträngen, die durch Nukleinsäuren gebildet werden, beeinflussen.
Ein Oligomer kann eine „statistische („zufällige“) Polymer-“Sequenz enthalten, die sich auf eine Grundgesamtheit von Oligomeren bezieht, die im Wesentlichen in der gesamten Länge und anderen Eigenschaften gleich sind, doch in der zumindest ein Teil des Oligomers durch zufälligen Einbau von unterschiedlichen Basen für eine spezifische Länge, z. B. eine zufällige Auswahl aller vier Standardbasen (A, T, G und C) in einem DNA-Oligomer oder eine zufällige Auswahl weniger Basen (U oder T und G) in einem definierten Teil eines größeren Oligomers, synthetisiert ist. Das entstehende Oligomer ist tatsächlich eine Grundgesamtheit von Oligomeren, deren endliche Anzahl an Gliedern durch die Länge und Anzahl von Basen bestimmt wird, die den zufälligen Teil ausmachen (z. B. 2⁶ Oligomere in einer Grundgesamtheit von Oligomeren, die eine 6-nt-Zufallssequenz enthält, die durch Verwendung von 2 verschiedenen Basen synthetisiert wird).
Komplementarität von Nukleinsäuren bedeutet, dass eine Nukleotidsequenz in einem Strang der Nukleinsäure aufgrund der Orientierung ihrer Nukleinbasengruppen Wasserstoffbrückenbindungen zu einer anderen Sequenz an einem entgegengesetzten Nukleinsäurestrang bildet. Die komplementären Basen sind normalerweise in DNA A mit T und C mit G und in RNA C mit G und U mit A. Komplementarität kann perfekt (d. h. exakt) oder wesentlich/ausreichend sein. Perfekte Komplementarität zwischen zwei Nukleinsäuren bedeutet, dass die zwei Nukleinsäuren einen Doppelstrang bilden können, in dem jede Base in dem Doppelstrang zu einer komplementären Base durch Watson-Crick-Paarung gebunden ist. „Wesentliche“ oder „ausreichende“ Komplementarität bedeutet, dass eine Sequenz in einem Strang nicht vollständig und/oder perfekt komplementär zu einer Sequenz in einem entgegengesetzten Strang ist, doch dass ausreichende Bindung zwischen Basen an den zwei Strängen besteht, um einen stabilen Hybridekomplex unter einer Reihe von Hybridisierungsbedingungen (z. B. Salzkonzentration und Temperatur) zu bilden. Derartige Bedingungen können durch Verwendung der Sequenzen und mathematischen Standardberechnungen vorhergesagt werden, um die Tm von hybridisierten Strängen vorherzusagen, oder durch empirische Bestimmung der Tm durch Verwendung von Routineverfahren vorhergesagt werden. Tm bezieht sich auf die Temperatur, bei der eine Grundgesamtheit von Hybridisierungskomplexen, die zwischen zwei Nukleinsäuresträngen ausgebildet wurden, 50 % denaturiert ist. Bei einer Temperatur unterhalb der Tm wird die Bildung eines Hybridisierungskomplexes begünstigt, während bei einer Temperatur oberhalb der Tm das Schmelzen oder die Trennung der Stränge in dem Hybridisierungskomplex begünstigt wird. Die Tm kann für eine Nukleinsäure, die einen bekannten G+C-Gehalt aufweist, in einer wässrigen 1 M NaCl-Lösung durch Verwendung von z. B. Tm = 81,5 + 0,41 (% G+C) abgeschätzt werden, obwohl andere bekannte Tm-Rechnungen Struktureigenschaften von Nukleinsäuren berücksichtigen.
„Abtrennen“ oder „Isolieren“ oder „Aufreinigen“ beziehen sich auf die Entfernung von einer oder mehreren Komponenten aus einer komplexen Mischung, wie zum Beispiel einer Probe. Bevorzugt entfernt ein Abtrennungs-, Isolierungs- oder Aufreinigungsschritt mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 90 % und bevorzugter mindestens 95 % (m/m) der Nukleinsäureanalyten aus anderen Probenkomponenten. Ein Abtrennungs-, Isolierungs- oder Aufreinigungsschritt kann optional zusätzliche Waschschritte einschließen, um Nicht-Analytenprobenkomponenten zu entfernen.
„Freisetzung“ eines Einfanghybrids bezieht sich auf die Abtrennung von einer oder mehreren Komponenten eines Einfanghybrids voneinander, wie zum Beispiel Abtrennung eines Nukleinsäureanalyten von einer Einfangsonde und/oder einer Einfangsonde von einer immobilisierten Sonde. Die Freisetzung des Nukleinsäurestrangs trennt den Analyten von anderen Komponenten eines Einfanghybrids und macht den Analyten für die Bindung an eine Nachweissonde verfügbar. Andere Komponenten des Einfanghybrids können gebunden bleiben, z. B. der Einfangsondenstrang zu der immobilisierten Sonde an einem Einfangträger, ohne den Nachweis des Analyten zu beeinflussen.
Eine „Markierung“ bezieht sich auf eine molekulare Einheit, die nachweisbar ist oder eine nachweisbare Reaktion oder ein nachweisbares Signal direkt oder indirekt erzeugt, z. B. durch Katalyse einer Reaktion, die ein nachweisbares Signal erzeugt. Markierungen schließen Folgende ein: lumineszierende Einheiten (wie zum Beispiel fluoreszierende, biolumineszierende oder chemilumineszierende Verbindungen), Radioisotope, Elemente von spezifischen Bindungspaaren (z. B. Biotin und Avidin), Enzym oder Enzymsubstrat, reaktive Gruppen oder Chromophore, wie zum Beispiel einen Farbstoff oder ein Partikel, der/das zu einer nachweisbaren Farbe führt.
Eine Einfangsonde schließt Folgendes ein: ein erstes Segment, das einen Ziel-komplementären Bereich der Sequenz einschließt, und ein zweites Segment für die Anbringung der Einfangsonde oder eines Hybridisierungskomplexes, der die Einfangsonde einschließt, an eine immobilisierte Sonde. Das erste Segment kann konfiguriert sein, um im Wesentlichen komplementär zu einer spezifischen Nukleinsäureanalytensequenz (oder Zielsequenz) zu sein, sodass ein erstes Segment und eine Zielnukleinsäure hybridisieren können, um einen stabilen Doppelstrang (d. h. der einen nachweisbaren Schmelzpunkt aufweist) unter Hybridisierungsbedingungen zu bilden, wie in den Beispielen beschrieben. Alternativ kann das erste Segment konfiguriert sein, um nichtspezifisch zu Nukleinsäuresequenzen in einer Probe unter Hybridisierungsbedingungen zu binden (siehe WO 2008/016988 ). Das zweite Segment schließt einen Bereich der Sequenz ein, der zu einer Sequenz einer immobilisierten Sonde komplementär ist. Bevorzugt schließt eine chimäre Einfangsonde ein Nukleinsäure-Homopolymer (z. B poly-A oder poly-T) ein, das kovalent zu einem Ziel-komplementären Bereich der Einfangsonde gebunden ist und das unter geeigneten Bedingungen zu einem komplementären Homopolymer der immobilisierten Sonde (z. B. poly-T bzw. poly-A) hybridisiert, wie zuvor beschrieben ( US-Pat. Nr. 6,110,678 an Weisburg et al.). Einfangsonden können weiter ein drittes Segment umfassen, das als eine Schlusssequenz agiert, um ungebundene Ziel-Einfangsonden in einer Einfangreaktion zu inaktivieren. Dieses dritte Segment kann das erste Segment gegenüber dem zweiten Segment flankieren (z. B. Einfangsequenz : Zielhybridisierungssequenz : Schlusssequenz) oder es kann das zweite Segment gegenüber dem ersten Segment flankieren (z. B. Schlusssequenz : Einfangsequenz : Zielhybridisierungssequenz). Siehe WO 2006/007567 und US 2009-0286249 .
Eine immobilisierte Sonde schließt eine Nukleinsäure ein, die direkt oder indirekt mit einem Träger verbunden ist. Die Nukleinsäure ist zu einer Nukleinsäure in der Einfangsonde komplementär, obgleich sie die gleiche Länge (Anzahl der Nukleinbaseeinheiten) wie die in der Einfangsonde aufweisen kann oder nicht. Die Nukleinsäure in der immobilisierten Sonde enthält bevorzugt mindestens sechs fortlaufende Nukleinbaseeeinheiten und kann beispielsweise 10-45 oder 10-40 oder 10-30 oder 10-25 oder 15-25 einschließlich L-Nukleinbaseeinheiten enthalten. Die Nukleinsäure ist bevorzugt ein Homopolymer und bevorzugter ein Homopolymer aus Adenin oder Thymin. Eine bevorzugte Form einer immobilisierten Sonde ist ein Homopolymer aus 14 Thyminresten für die Verwendung in Verbindung mit einer Einfangsonde, die ein zweites Segment mit einem Homopolymer aus Adeninresten einschließt, oder schließt ein solches ein. Die Nukleinsäureeinheit einer immobilisierten Sonde wird normalerweise in einsträngiger Form bereitgestellt oder, falls nicht, wird vor oder während der Verwendung zur einsträngigen Form denaturiert.
Jedwedes einer Vielfalt von Materialien kann als Träger für die immobilisierten Sonden verwendet werden, z. B. Matrizen oder Partikel, die aus Nitrocellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, gemischten Polymeren, Polystyrol, Silanpolypropylen und magnetisch anziehbaren Materialien hergestellt sind. Monodisperse magnetische Kügelchen sind ein bevorzugter Träger, da sie größenmäßig relativ gleichmäßig sind und durch Anlegen einer magnetischen Kraft an den Reaktionsbehälter, bevorzugt in einem automatisierten System, leicht aus der Lösung zurückgewonnen werden. Eine immobilisierte Sonde kann direkt mit dem Einfangträger verknüpft sein, z. B. durch Verwendung von jedweder von einer Vielfalt von kovalenten Verknüpfungen, Komplexierung oder ionischer Wechselwirkung, oder kann indirekt über einen oder mehrere Linker, die mit dem Träger verbunden sind, verknüpft sein. Der Linker kann ein oder mehrere Nukleotide einschließen, die nicht zur Hybridisierung mit der Einfangsonde vorgesehen sind, doch als Spacer zwischen der Nukleinsäure der immobilisierten Sonde und ihrem Träger agieren sollen.
Eine „Nachweissonde“ ist eine Nukleinsäure oder ein anderes Molekül, die/das spezifisch zu einer Zielsequenz bindet und deren/dessen Bindung direkt oder indirekt zu einem nachweisbaren Signal führt, um die Gegenwart der Zielsequenz anzuzeigen. Eine Nachweissonde muss nicht markiert sein, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen, z. B. kann ein elektrischer Impuls, der aus der Bindung der Sonde zu ihrer Zielsequenz resultiert, das nachweisbare Signal sein. Eine „markierte Sonde“ ist eine Sonde, die eine Markierung enthält oder direkt oder indirekt mit einer Markierung verknüpft ist (z. B., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Kap. 10; US-Pat. Nr. 6,361,945 , Becker et al.; US-Pat. Nr. 5,658,737 , Nelson et al.; US-Pat. Nr. 5,656,207 , Woodhead et al.; US-Pat. Nr. 5,547,842 , Hogan et al.; US-Pat. Nr. 5,283,174 , Arnold et al.; US-Pat. Nr. 4,581,333 , Kourilsky et al.; US-Pat. Nr. 5,731,148 , Becker et al.). Beispielsweise können Nachweissonden einen Nicht-Nukleotid-Linker und eine chemilumineszierende Markierung, die an dem Linker angebracht ist, einschließen ( US-Pat. Nr. 5,185,439, 5,585,481 und 5,639,604 , Arnold et al.). Beispiele für Nachweissonden schließen Oligonukleotide von etwa 5 bis 50 Nukleotiden in der Länge ein, die eine angebrachte Markierung aufweisen, die in einer homogenen Reaktion nachgewiesen wird, z. B. einer, die differentielle Hydrolyse einer Markierung an einer gebundenen oder ungebundenen Sonde nutzt.
Nachweissonden können eine Nukleotidsequenz aufweisen, die die gleiche oder entgegengesetzte Richtung wie eine Zielsequenz aufweisen, abhängig vom Format des Assays. Nachweissonden können mit dem gleichen oder verschiedenen Segment einer Zielsequenz als Einfangsonde hybridisieren. Einige Nachweissonden weisen einen angebrachten chemilumineszierenden Marker auf, z. B. eine Acridiniumester (AE)-Verbindung ( US-Pat. Nr. 5,185,439, 5,639,604, 5,585,481 und 5,656,744 ). In einigen Nachweissonden ist eine Acridiniumester-Markierung an einem mittleren Bereich der Sonde in der Nähe eines Bereiches von A- und T-Basenpaaren unter Verwendung eines Nicht-Nukleotid-Linkers angebracht ( US-Pat. Nr. 5,585,481 und 5,656,744 , Arnold et al.), was die Amine der Nukleotidbasen an beiden Seiten des AE einschränkt und eine Stelle für die Einlagerung bereitstellt. Alternativ kann eine AE-Markierung an dem 3'- oder 5'-Terminus der Nachweissonde angebracht sein, die in Verbindung mit einem zweiten Oligomer verwendet wird, das benachbart zu der Nachweissonde an der Zielnukleinsäure hybridisiert, um die Wirkungen von nahegelegenem Amin, das von der Zielnukleinsäure beigesteuert wird, einzuschränken. In einigen Nachweissonden liegt eine AE-Markierung an oder nahe der Stelle einer Fehlpaarung mit einer zugehörigen Nicht-Zielpolynukleotidsequenz vor, um eine Unterscheidung zwischen der zugehörigen Sequenz und der Zielsequenz zu ermöglichen, die sich durch lediglich ein Nukleotid unterscheiden könnten, da der Bereich des Doppelstrangs um die Fehlpaarungsstelle ausreichend destabilisiert ist, um den AE an der Sonde, die mit der zugehörigen Nicht-Zielsequenz hybridisiert ist, für einen Hydrolyseabbau anfällig zu machen. HIV-1 und HCV können unter Verwendung einer modifizierten Form des kommerziellen Assays PROCLEIX^® ULTRIO HIV-1/HCV/HBV von Gen-Probe nachgewiesen werden. Die Modifizierung beinhaltet den Ersatz der D-poly-A- und D-poly-T-Sequenzen in Einfang- und immobilisierten Sonden gegen L-poly-A- bzw. L-poly-T-.
„Hybridisierungsbedingung“ bezieht sich auf die gesamte Umgebung, in der ein Nukleinsäurestrang zu einem zweiten Nukleinsäurestrang durch komplementäre Strangwechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindung bindet, um einen Hybridisierungskomplex zu erzeugen. Derartige Bedingungen schließen die chemischen Komponenten und ihre Konzentrationen (z. B. Salze, Komplexbildner, Formamid) einer wässrigen oder organischen Lösung, die die Nukleinsäuren enthält, und die Temperatur der Mischung ein. Andere Faktoren, wie zum Beispiel die Länge der Inkubationszeit oder Abmessungen der Reaktionskammer, können zu der Umgebung beitragen (z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., S. 1.90- 1.91, 9.47-9.51, 11.47-11.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)).
Spezifische Bindung eines Zieleinfangoligomers zu einer Zielnukleinsäure oder Zielnukleinsäuren bedeutet die Bindung zwischen einer einzelnen definierten Sequenz in dem ersten Segment eines Zieleinfangoligomers und einem exakt oder im Wesentlichen komplementären Segment an der/den Zielnukleinsäure(n), um einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Eine derartige Bindung ist nachweisbar stärker (höheres Signal oder Schmelztemperatur) als die Bindung zu anderen Nukleinsäuren in der Probe, denen ein Segment fehlt, das exakt oder im Wesentlichen komplementär zu der einzelnen definierten Zieleinfangoligomersequenz ist. Nichtspezifische Bindung eines Zieleinfangoligomers zu Zielnukleinsäuren bedeutet, dass das Zieleinfangoligomer zu einer Grundgesamtheit von Zielsequenzen binden kann, die kein Segment teilen, das eine exakte oder wesentliche Komplementarität zu einer einzelnen definierten Zieleinfangoligomersequenz aufweist. Dies kann beispielsweise durch die Verwendung einer zufälligen Sequenz in dem ersten Segment der Einfangsonde erreicht werden.
Fehlende Bindung zwischen Nukleinsäuren kann sich durch Bindung äußern, die von nichtspezifischer Bindung ununterscheidbar ist, die zwischen einem zufällig ausgewählten Paar von Nukleinsäuren auftritt, denen wesentliche Komplementarität fehlt, doch die die gleiche Länge wie die betreffenden Nukleinsäuren aufweisen.
„Freisetzung“ eines Einfanghybrids bezieht sich auf die Abtrennung von einer oder mehreren Komponenten eines Einfanghybrids voneinander, wie zum Beispiel die Abtrennung einer Zielnukleinsäure von einer Einfangsonde und/oder eines Zieleinfangoligomers von einer immobilisierten Sonde. Die Freisetzung des Zielnukleinsäurestrangs trennt den Analyten von anderen Komponenten eines Einfanghybrids ab und macht den Analyten für die Bindung an eine Nachweissonde verfügbar. Andere Komponenten des Einfanghybrids können gebunden bleiben, z. B. der Zieleinfangoligomerstrang zu der immobilisierten Sonde an einem Einfangträger, ohne den Nachweis des Analyten zu beeinflussen.
„Sensitivität“ ist der Anteil an richtig positiven Ergebnissen, die korrekt als solche identifiziert wurden (z. B. der Prozentsatz von infizierten Patienten, die korrekt identifiziert wurden, dass sie die Infektion aufweisen). Spezifität misst den Anteil von richtig negativen Ergebnissen, die korrekt identifiziert wurden (z. B. den Prozentsatz von nicht infizierten Patienten, die korrekt identifiziert werden, dass sie die Infektion nicht aufweisen).
Der Bezug auf einen Wertebereich schließt auch ganze Zahlen innerhalb des Bereiches und Unterbereiche, die durch ganze Zahlen in dem Bereich definiert sind, ein. Der Bezug auf jedweden numerischen Wert oder Bereich von numerischen Werten sollte verstanden werden, dass er jedwede derartige Variation beinhaltet, wie es beim Messen inhärent ist, die andere typische Anwendungsbedingungen bewertet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Allgemeines
Bereitgestellt hierin ist ein Lysereagenz für die Lyse von Blutzellen, wodurch RNA oder ein anderer Analyt in einer Form freigesetzt wird, die für die Analyse geeignet ist. Bevorzugt lysiert das Lysereagenz Blutzellen, einschließlich roter Blutzellen, wodurch RNA oder ein anderer Analyt in einer Form freigesetzt wird, die für die Analyse geeignet ist. In einem Aspekt lysiert das Lysereagenz eine Probe, die Blutzellen umfasst, daraus besteht oder im Wesentlichen daraus besteht, wodurch RNA oder ein anderer Analyt in einer Form freigesetzt wird, die für die Analyse geeignet ist. Das Lysereagenz umfasst: (i) einen Puffer, (ii) Lithiumlaurylsulfat (LLS), und (iii) eines oder beides von einem Chlorid-haltigen Salz und einem Gerinnungshemmer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EDTA-Na₂, EGTA, und Kombinationen davon, wobei das Reagenz einen pH aufweist, der größer als 5,5 ist. Das Reagenz dient zur Lyse von Blutzellen, schützt einen freigesetzten Analyten vor Abbau in dem Lysat und ist mit nachfolgenden Schritten für die Analyse des Analyten kompatibel, wie zum Beispiel Zieleinfang, Amplifikation, Nachweis und/oder Sequenzierung. Das Lysereagenz ist für die Analyse eines Analyten von einem Pathogen oder einem Wirt zugänglich. Analyten sind bevorzugt Nukleinsäureanalyten von einem Pathogen oder von einem Wirt. Bevorzugter sind Analyten RNA-Analyten von einem Pathogen oder von einem Wirt. Das Lysereagenz ist insbesondere für die Analyse von Nukleinsäuren von Pathogenen, die Blutzellen infizieren, zugänglich, einschließlich, doch nicht beschränkt auf: Hepatitis-Viren, menschliche Immunschwächeviren, Dengue-Viren, West-Nile-Viren, Flaviviren, wie zum Beispiel Zika-Virus, und parasitische Organismen, wie zum Beispiel Babesia- und Plasmodium-Spezies.
Das offenbarte Lysereagenz resultiert teilweise aus der Identifizierung von Unzulänglichkeiten mit verschiedenen bekannten Lysereagenzien für die Herstellung und Analyse von Pathogen-abstammender RNA aus roten Blutzellen; jedoch kann das Lysereagenz für die Herstellung etlicher Komponenten aus Blutzellen verwendet werden. Es wurde herausgefunden, dass bekannte Lysereagenzien mit Reagenzien und Verfahren für die Analyse von Pathogen-abstammender RNA inkompatibel sind, Zellverklumpung, das Auftreten von Niederschlag und den Verlust von magnetischen Kügelchen verursachen, wenn lysierte Proben zu Einfangreagenzien zugegeben wurden. Im Gegensatz dazu war das vorliegende Lysereagenz mit diesen Verfahren kompatibel, ermöglicht die Lyse von Blutzellen in Vollblutproben und den empfindlichen Nachweis der freigesetzten Pathogen-abstammenden RNA nach Zieleinfang und transkriptionsvermittelter Amplifikation. Das vorliegende Lysereagenz inhibiert auch den Abbau der Pathogen-abstammenden RNA durch Nukleasen und Proteasen nach Lyse und zeigte Reproduzierbarkeit zwischen den Proben.
II. Lysereagenzien
Das vorliegende Lysereagenz umfasstumfasst: (i) einen Puffer, (ii) Lithiumlaurylsulfat (LLS), und (iii) eines oder beides von einem Chlorid-haltigen Salz und einem Gerinnungshemmer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EDTA-Na₂, EGTA, und Kombinationen davon, wobei das Reagenz einen pH aufweist, der größer als 5,5 ist. Puffer liegen in dem Lysereagenz in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 150 mM vor. Natriumbicarbonat ist ein Beispiel für einen geeigneten Puffer (NaHCO₃). Natriumbicarbonat-Puffer kann in dem Reagenz in einer Konzentration beispielsweise von etwa 5 mM bis etwa 30 mM, von etwa 10 mM bis etwa 20 mM, von etwa 10 mM bis etwa 15 mM, von etwa 15 mM bis etwa 20 mM, von etwa 12 mM bis etwa 16 mM oder bei etwa 14 mM vorliegen. TRIS-Puffer kann in dem Reagenz in einer Konzentration beispielsweise von etwa 75 mM bis etwa 150 mM, von etwa 75 mM bis etwa 125 mM, von etwa 100 mM bis etwa 125 mM, von etwa 90 mM bis etwa 110 mM oder bei etwa 100 mM vorliegen. Natriumphosphat-Puffer kann in dem Reagenz in einer Konzentration beispielsweise von etwa 5 mM bis etwa 40 mM, von etwa 10 mM bis etwa 33 mM, von etwa 15 mM bis etwa 30 mM, etwa 30 mM oder etwa 15 mM vorliegen. Monobasischer Natriumphosphat-Puffer kann in dem Reagenz in einer Konzentration beispielsweise von etwa 8 mM bis etwa 40 mM, von etwa 10 mM bis etwa 33 mM, von etwa 15 mM bis etwa 30 mM, etwa 30 mM oder etwa 15 mM vorliegen. Dibasischer Natriumphosphat-Puffer kann in dem Reagenz in einer Konzentration beispielsweise von etwa 8 mM bis etwa 40 mM, von etwa 10 mM bis etwa 33 mM, von etwa 15 mM bis etwa 30 mM, etwa 30 mM oder etwa 15 mM vorliegen.
Der pH des Reagenzes kann beispielsweise von etwa 6,0 bis etwa 10,0, von etwa 6,5 bis etwa 9,0, von etwa 7,0 bis etwa 8,0, von etwa 7,2 bis etwa 7,6, etwa 7,5, etwa 7,3 oder etwa 6,7 betragen. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
Detergenzien können sowohl als Lysereagenz als auch als Inhibitor des Abbaus des Analyten nach der Lyse von Blutzellen agieren. Detergenzien sind insbesondere für die Inhibierung des Abbaus von Nukleinsäuren verwendbar. LLS ist bevorzugt. Beispielshalber schließt ein Konzentrationsbereich von Detergens in dem Lysereagenz Folgende ein: von etwa 2 % bis etwa 15 % (V/V oder m/V), von etwa 4 % bis etwa 10 % (V/V oder m/V), von etwa 5 % bis etwa 8 % (V/V oder m/V), etwa 6 % (V/V oder m/V), etwa 8 % (V/V oder m/V) oder etwa 10 % (V/V oder m/V).
Salze, falls sie in dem Lysereagenz vorliegen, liegen in einer Konzentration von etwa 10 mM bis etwa 1 000 mM vor. Beispielhafte Konzentrationsbereiche für Ammoniumchlorid in dem Reagenz schließen Folgende ein: von etwa 100 mM bis etwa 1000 mM, von etwa 100 mM bis etwa 800 mM, von etwa 100 mM bis etwa 500 mM, von etwa 150 mM bis etwa 300 mM, von etwa 200 mM bis etwa 300 mM, von etwa 240 bis etwa 260 mM oder etwa 250 mM. Beispielhafte Konzentrationsbereiche für Magnesiumchlorid in dem Reagenz schließen Folgende ein: von etwa 10 mM bis etwa 300 mM, von etwa 15 mM bis etwa 200 mM, von etwa 20 mM bis etwa 100 mM, von etwa 25 mM bis etwa 50 mM, von etwa 28 mM bis etwa 40 mM, von etwa 30 mM bis etwa 35 mM, etwa 33 mM oder etwa 30 mM. Beispielhafte Konzentrationsbereiche für Kaliumchlorid in dem Reagenz schließen Folgende ein: von etwa 10 mM bis etwa 300 mM, von etwa 15 mM bis etwa 200 mM, von etwa 20 mM bis etwa 100 mM, von etwa 25 mM bis etwa 50 mM, von etwa 28 mM bis etwa 40 mM, von etwa 30 mM bis etwa 35 mM, etwa 33 mM oder etwa 30 mM.
Der Gerinnungshemmer, falls er in dem Lysereagenz vorliegt, liegt in einer Konzentration vor, die zur Inhibierung der Gerinnung der Probe (z. B. Vollblut oder rote Blutzellen) ausreicht. Durch Inhibierung der Gerinnung müssen die Proben während des Verfahrens zur Isolierung von roten Blutzellen durch den Gerinnungshemmer nicht zentrifugiert werden. Beispielhafte Gerinnungshemmer schließen EDTA, EDTA-Na₂, EGTA, Heparin oder Citrat ein. Beispielhafte Konzentrationen von EDTA in dem Lysereagenz schließen Folgende ein: von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM, von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM, etwa 10 mM, etwa 2,5 mM oder etwa 0,1 mM. Beispielhafte Konzentrationen von EDTA-Na₂ in dem Lysereagenz schließen Folgende ein: von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM, von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM, etwa 10 mM, etwa 2,5 mM oder etwa 0,1 mM. Beispielhafte Konzentrationen von EGTA in dem Lysereagenz schließen Folgende ein: von etwa 0,05 mM bis etwa 15 mM, von etwa 0,1 mM bis etwa 10 mM, von etwa 0,5 mM bis etwa 5 mM, etwa 7,5 mM, etwa 3 mM oder etwa 1 mM.
Ein bevorzugtes Lysereagenz schließt Natriumbicarbonat, Ammoniumchlorid, LLS und EDTA in einer Pulverform oder in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Wasser, in jedweder der vorstehend angegebenen Konzentrationen ein. Bevorzugt liegt Natriumbicarbonat in einer Konzentration von 12 mM bis 16 mM oder bevorzugter bei 14 mM vor, liegt Ammoniumchlorid in einer Konzentration von 100 mM bis 500 mM oder bevorzugter 250 mM vor, liegt LLS in einer Konzentration von 4 % bis 15 % oder bevorzugter 8 % (m/V) vor, liegt EDTA in einer Konzentration von 0,01 mM bis 10 mM oder bevorzugter 0,1 mM oder 10 mM vor und beträgt der pH des Reagenzes 7,2 bis 7,6 oder bevorzugter 7,3. Optional besteht das Lysereagenz im Wesentlichen aus Natriumbicarbonat, Ammoniumchlorid, LLS, EDTA und Wasser.
Ein bevorzugtes Lysereagenz schließt Natriumphosphat, LLS, EDTA-Na₂ und EGTA in einer Pulverform oder in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Wasser, in jedweder der vorstehend angegebenen Konzentrationen ein. Bevorzugt liegt der Natriumphosphat-Puffer in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM oder bevorzugter 30 mM oder 15 mM vor, liegt LLS in einer Konzentration von 4 % bis 15 % oder bevorzugter 10 % (m/V) vor, liegt EDTA-Na₂ in einer Konzentration von 0,5 mM bis 5 mM oder bevorzugter 1 mM vor und liegt EGTA in einer Konzentration von 0,5 mM bis 5 mM oder bevorzugter 1 mM vor und beträgt der pH des Reagenzes 6,0 bis 8,0 oder bevorzugter 6,7. Bevorzugt umfasst der Natriumphosphat-Puffer eines oder beide von monobasischem Natriumphosphat und dibasischem Natriumphosphat. Bevorzugt umfasst der Natriumphosphat-Puffer monobasisches Natriumphosphat in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM oder bevorzugter 30 mM oder 15 mM. Bevorzugt umfasst der Natriumphosphat-Puffer dibasisches Natriumphosphat in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM oder bevorzugter 30 mM oder 15 mM. Bevorzugt umfasst der Natriumphosphat-Puffer monobasisches Natriumphosphat in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM oder bevorzugter 30 mM oder 15 mM und umfasst dibasisches Natriumphosphat in einer Konzentration von etwa 5 mM bis etwa 30 mM oder bevorzugter 30 mM oder 15 mM. Optional besteht das Lysereagenz im Wesentlichen aus Natriumphosphat, Detergens, EDTA-Na₂, EGTA und Wasser.
Ein bevorzugtes Lysereagenz schließt TRIS, Magnesiumchlorid und LLS in einer Pulverform oder in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Wasser, in jedweder der vorstehend angegebenen Konzentrationen ein. Bevorzugt liegt TRIS in einer Konzentration von 75 mM bis 150 mM oder bevorzugter 100 mM vor, liegt Magnesiumchlorid in einer Konzentration von 10 mM bis 50 mM oder bevorzugter 30 mM vor, liegt LLS in einer Konzentration von 4 % bis 15 % oder bevorzugter 6 % (m/V) vor und beträgt der pH des Reagenzes 7,0 bis 8,0 oder bevorzugter 7,5. Optional besteht das Lysereagenz im Wesentlichen aus TRIS, Magnesiumchlorid und LLS und Wasser. Optional enthält das Lysereagenz ein Antischaummittel.
Das Lysereagenz kann als Kit bereitgestellt werden, der auch Einfangsonde, immobilisierte Sonde, festen Träger, Nachweissonde und oder Primer für die Durchführung eines Assays mit einem Analyten, der aus Blutzellen zu isolieren ist, einschließlich jedweden der vorstehend beschriebenen Analyten, einschließt. Ein derartiger Kit kann Anweisungen für die Verwendung des Lysereagenzes und/oder Durchführung eines Assays mit einem Analyten, der aus Blutzellen isoliert wird, einschließen. Reaktionsmischungen können aus den Kits hergestellt werden, einschließlich Blutzelllyse-Reaktionsmischungen, Zieleinfang-Reaktionsmischungen, Nukleinsäureamplifikations-Reaktionsmischungen, Nukleinsäurenachweis-Reaktionsmischungen und Kombinationen davon. Einige Reaktionsmischungen enthalten das hierin offenbarte Lysereagenz.
III. Verwendung von Lysereagenzien
Vollblut kann aus etlichen Quellen erhalten werden, einschließlich direkt von Vollblutspendern oder von Blutbankeinrichtungen. Rote Blutzellen können aus jedweder verfügbaren Quelle erhalten werden, wie zum Beispiel Vollblut oder jedweder Fraktion davon, die rote Blutzellen einschließt, wie zum Beispiel pelletierte rote Blutzellen. Vollblut kann menschliches Vollblut, nichtmenschliches Vollblut oder eine Kombination davon sein.
Das Lysereagenz kann den Blutzellen für eine ausreichende Zeit beigemischt werden, um die Zelllyse zu induzieren und die Freisetzung von Molekülen des/der gewünschten Analyten aus Zellen zu bewirken. Beispielhafte Zeiten für die Erhaltung von Blutzellen in Beimischung mit Lysereagenz schließen 1-30 Minuten, 2-15 Minuten, 3-10 Minuten, 4-6 Minuten oder 5 Minuten ein. Bevorzugt beträgt die Zeit nicht mehr als 30, 15, 10 oder 5 Minuten. Bevorzugt liegen in der Mischung nach der Lyse keine sichtbaren Partikel vor. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
Die Temperatur der Inkubation des Lysereagenzes mit Blutzellen kann variieren. Die Temperatur wird bevorzugt ausgewählt, um den Umfang und die Rate der Lyse zu maximieren und den Abbau von Analyt(en) zu minimieren oder die Inhibierung von nachfolgender Verarbeitung zu verhindern. Beispielhafte Temperaturbereiche schließen 0-50 °C, 5-45 °C, 10-40 °C, 15-37 °C, 20-30 °C, 22-27 °C oder 25 °C ein. Umgebungstemperatur ist geeignet. Die Lyse von Blutzellen sollte eine ausreichende Menge von Molekülen des Analyten freisetzen, die durch die hierin beschriebenen Verfahren nachweisbar sind. Bevorzugt führt die Lyse zu mindestens 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 100 % Lyse von Blutzellen in einer Probe, die lysiert wird. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
Das Verhältnis, in dem Vollblut mit Lysereagenz vereinigt wird, kann den Umfang und die Rate von Zelllyse und Schutz von Molekülen des Analyten vor Abbau nach Freisetzung aus lysierten Zellen beeinflussen. Beispielhafte Verhältnisse, in denen Vollblut mit dem Lysereagenz gemischt wird, schließen Verhältnisse von 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 10 oder einen Bereich von Verhältnissen zwischen 1 : 1 und 1 : 10 (V/V, Vollblut : Reagenz) ein. Ein bevorzugtes Verhältnis ist Vollblut, dem Lysereagenz in einem Verhältnis von etwa 1 : 2 bis etwa 1 : 4 oder 1 : 2 oder 1 : 3 oder 1 : 4 (V/V) beigemischt wird. Wenn die Probe rote Blutzellen umfasst, die aus Vollblut isoliert wurden, wie zum Beispiel pelletierte rote Blutzellen, können die roten Blutzellen mit dem Lysereagenz in beispielhaften Verhältnissen von 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 10 oder in einem Bereich von Verhältnissen zwischen 1 : 1 und 1 : 10 (V/V, rote Blutzellen : Reagenz) gemischt werden. Die Bereiche schließen alle ganzen Zahlen und Teilmengen darin ein.
IV. Analyten
Analyten, die aus Blutzellen, einschließlich aus roten Blutzellen, durch das vorliegende Reagenz freigesetzt werden, können Analyten aus einem Pathogen oder Analyten aus einem Wirt sein. Analyten, die aus Blutzellen, einschließlich aus roten Blutzellen, durch das vorliegende Reagenz freigesetzt werden, können Nukleinsäuren (z. B. DNA oder RNA), ganze Partikel, Proteine oder Antikörper einschließen. Analyten sind bevorzugt Nukleinsäureanalyten von einem Pathogen oder von einem Wirt. Bevorzugter sind Analyten RNA-Analyten von einem Pathogen oder von einem Wirt. Verschiedene Arten von RNA-Analyten können nachgewiesen werden. Die RNA-Analyten können ribosomale RNA (rRNA), Messenger-RNA (mRNA) oder heterogene nukleäre RNA (hnRNA) sein. Ein bevorzugter Analyt für Pathogen-abstammende Analyten ist ribosomale RNA, insbesondere 18S rRNA, 5S rRNA, 5.8S rRNA oder 28S rRNA.
Beispielhafte Pathogene schließen solche ein, die aus Blutzellen nachgewiesen werden können, einschließlich, doch nicht beschränkt auf: Hepatitis-Viren, menschliche Immunschwächeviren, Dengue-Viren, West-Nile-Viren, Flaviviren, wie zum Beispiel Zika-Virus, und parasitische Organismen. Beispielhafte parasitische Organismen schließen Parasiten aus der Gattung Babesia, Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Anaplasma oder Toxoplasma ein. Organismen der Gattung Babesia, die bei Menschen Krankheiten verursachen, können Babesia microti, Babesia divergens oder Babesia duncani sein. Organismen der Gattung Plasmodium können Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax oder Plasmodium knowlesi sein.
Assays
Moleküle des Analyten, die durch Lyse aus Blutzellen freigesetzt werden, werden der Analyse unterzogen.
Moleküle des Analyten können von dem Lysereagenz (durch Zentrifugation oder anderweitig) vor der Analyse abgetrennt werden oder nicht. Die Unterlassung eines Abtrennungsschritts kann den effizienten Arbeitsablauf bei der Durchführung des Assays erleichtern. Die Art des Assays hängt von dem Analyten ab.
Nukleinsäuren
Die Analyse von Nukleinsäureanalyten involviert häufig Schritte des Einfangens, der Amplifikation und des Nachweises. Alternativ können Amplifikations- und Nachweisverfahren ohne vorherigen Zieleinfang durchgeführt werden. Bevorzugt erfolgen Amplifikation und Nachweis und Zieleinfang (falls durchgeführt) ohne Abtrennung von Molekülen des Analyten von dem Lysereagenz. Somit kann der gesamte Prozess in einem einzigen Behälter durchgeführt werden.
Zieleinfang-Assay
Ein beispielhafter Zieleinfang-Assay kann wie folgt unter Verwendung von einer oder mehreren Einfangsonden, einer immobilisierten Sonde, einer Probe und einem geeigneten Medium durchgeführt werden, um die Hybridisierung des Zieleinfangoligomers mit der Zielnukleinsäure und des Zieleinfangoligomers mit der immobilisierten Sonde zu ermöglichen. Die Probe kann vor der Durchführung des Assays erhitzt werden (z. B. von 65 °C bis 95 °C), um jedwede Nukleinsäuren in doppelsträngiger Form zu denaturieren. Die Komponenten können in jedweder Reihenfolge gemischt werden. Beispielsweise kann das Zieleinfangoligomer zu der Probe gegeben und mit der Zielnukleinsäure in der Probe hybridisiert werden, bevor die immobilisierte Sonde zugegeben wird. Jedoch ist es für einen automatisierten Assay bevorzugt, die Anzahl von Zugabeschritten durch Bereitstellung des Zieleinfangoligomers und der immobilisierten Sonde zur gleichen oder im Wesentlichen gleichen Zeit zu minimieren. In diesem Fall kann die Reihenfolge von Hybridisierung durch Folgendes kontrolliert werden: Durchführen einer ersten Hybridisierung unter Bedingungen, unter denen ein Doppelstrang zwischen dem Zieleinfangoligomer und der Zielnukleinsäure gebildet werden kann, doch die die Schmelztemperatur des Doppelstrangs übersteigt, der zwischen ersten und zweiten Stammsegmenten der Einfangsonde und zwischen dem Zieleinfangoligomer und der immobilisierten Sonde gebildet werden würde, und dann Durchführen einer zweiten Hybridisierung unter Bedingungen von reduzierter Stringenz, bevorzugt unterhalb der Schmelztemperatur der Doppelstränge, die zwischen den ersten und zweiten Stammsegmenten und zwischen dem Zieleinfangoligomer und der immobilisierten Sonde gebildet werden. Die Stringenz kann durch Verringerung der Temperatur der Assay-Mischung reduziert werden. Bei der höheren Temperatur bildet die Zielbindungsstelle mit der Zielnukleinsäure einen Doppelstrang. Bei der niedrigeren Temperatur bilden die ersten und zweiten Stammsegmente von Einfangsonden, die nicht an Zielnukleinsäure gebunden sind, miteinander einen Doppelstang und bildet das erste Stammsegment von Einfangsonden, die an die Zielnukleinsäure gebunden sind, mit der immobilisierten Sonde einen Doppelstrang. Beispielsweise können die Hybridisierung bei höherer Stringenz bei oder um 60 °C und die Hybridisierung bei niedrigerer Stringenz durch Ermöglichen des Abkühlens auf Raumtemperatur oder 25 °C durchgeführt werden. Die Stringenz kann auch durch Reduzierung der Salzkonzentration oder Zugabe oder Erhöhung der Konzentration eines chaotropen Lösungsmittels reduziert werden. In einigen Verfahren können alle Schritte (mit der möglichen Ausnahme eines anfänglichen Denaturierungsschritts bei höherer Temperatur, um ein doppelsträngiges Ziel zu denaturieren) isotherm durchgeführt werden.
Nach der Bildung von Zielnukleinsäure : Einfangsonde wird das immobilisierte Sondenhybrid (der Einfanghybridkomplex) von anderen Probenkomponenten durch physikalische Abtrennung des Einfangträgers unter Verwendung von jedwedem einer Vielfalt von bekannten Verfahren, z. B. Zentrifugation, Filtration oder magnetische Anziehung eines magnetischen Einfangträgers, abgetrennt. Die Abtrennung wird bevorzugt bei einer Temperatur unterhalb der Schmelztemperatur von Stamm-Schleifen-Strukturen, die durch Zieleinfangoligomere gebildet werden, durchgeführt, sodass leere Zieleinfangoligomere nicht denaturieren können und somit zu der Einfangsonde binden. In einigen Verfahren wird die Abtrennung bei einer Temperatur von kleiner als, doch innerhalb von 10 °C der Schmelztemperatur der Stamm-Schleifen-Struktur (z. B. bei 60 °C) durchgeführt, um die Stringenz von Hybridisierungsbedingungen und die resultierende Fähigkeit zur Unterscheidung von gepaarten und ungepaarten Zielnukleinsäuren zu erhalten.
Um die Isolierung der Zielnukleinsäure von anderen Probenkomponenten, die nichtspezifisch an jedwedem Teil des Einfanghybrids haften, weiter zu erleichtern, kann das Einfanghybrid einmal oder mehrere Male gewaschen werden, um andere Probenkomponenten zu verdünnen und zu entfernen. Das Waschen kann durch Dissoziation des Einfanghybrids in seine einzelnen Komponenten in einer geeigneten wässrigen Lösung (z. B. einer Lösung, die Tris und EDTA enthält, siehe z. B. US 6,110,678 ) und unter geeigneten Bedingungen (z. B. Temperatur über der Tm der Komponenten) und dann durch die erneute Einstellung der Bedingungen, um die erneute Bildung des Einfanghybrids zu ermöglichen, erreicht werden. Jedoch wird zur Vereinfachung der Handhabung und Minimierung von Schritten beim Waschen bevorzugt das intakte Einfanghybrid, das an den Einfangträger gebunden ist, in einer Lösung unter Verwendung von Bedingungen, die das Einfanghybrid erhalten, gespült. Bevorzugt isoliert das Einfangen der Zielnukleinsäure durch Waschen, falls durchgeführt, mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 90 % und bevorzugter etwa 95 % der Zielnukleinsäuren von anderen Probenkomponenten. Isolierte Nukleinsäuren können für etliche nachgeschaltete Prozesse, wie zum Beispiel Nukleinsäureamplifikation, verwendet werden.
Ein Zieleinfang-Assay kann auch als Teil eines Echtzeit-, zweiphasigen, Zieleinfang- und Amplifikationsverfahrens durchgeführt werden. In einem derartigen Verfahren werden 500 µl Probe und 400 µl Zieleinfangreagenz (TCR) in Reaktionsgefäße gegeben. Das TCR enthält magnetische Partikel, Komponenten zur Lyse von Organismen, die in der Probe vorliegen, Einfangoligos, einen T7-Initiierungspromotor und einen internen Kalibrator. Die Flüssigkeit in den Reaktionsgefäßen wird für eine bestimmte Zeit und bei einer bestimmten Geschwindigkeit gemischt, um zu gewährleisten, dass die Mischung homogen ist. Die Reaktionsgefäße werden dann in einen Übergangsinkubator bei 43,7 °C überführt, um die Flüssigkeit in den Reaktionsgefäßen vorzuwärmen. Die Reaktionsgefäße werden dann in einen Annealing-Inkubator, der auf 64 °C eingestellt ist, überführt. Während der Inkubation bei 64 °C werden jedwede Organismen, die in der Probe vorliegen und zuvor durch das Lysereagenz nicht aufgespalten wurden, aufgespalten, was die Freisetzung des Analyten bewirkt. Die Reaktionsgefäße werden dann in einen Übergangsinkubator gestellt, um einen Abkühlprozess zu beginnen, und werden in einer Kühlvorrichtung (17 °C bis 19 °C) weiter gekühlt, was zur Bindung des T7-Initiierungspromotors und zum Einfangen von sowohl dem Analyten als auch dem internen Kalibrator an den magnetischen Partikeln über die Einfangoligos führt. Die Reaktionsgefäße werden zu einer magnetischen Abstellstation gebracht, wo sie Magneten ausgesetzt werden, die vor dem Eintritt in eine Waschstation die magnetischen Partikel zu den Seiten der Gefäße ziehen. In der Waschstation werden potentielle störende Substanzen aus der Reaktion durch Waschen der magnetischen Partikel entfernt.
Amplifikation
Ein Nukleinsäureanalyt kann unter Verwendung von Verfahren amplifiziert werden, wie zum Beispiel isothermen Amplifikationsreaktionen (z. B. transkriptionsvermittelter Amplifikation (TMA), Nukleinsäuresequenzen-basierter Amplifikation (nucleic acid sequence based amplification = NASBA), Schleifen-vermittelter isothermer Amplifikation, Polymerase Spiral Reaction (PSR) (Liu, W. et al. Polymerase Spiral Reaction (PSR): A novel isothermal nucleic acid amplification method. Sci. Rep. 5, 12723; (2015)), Ligasekettenreaktion und anderen isothermen Amplifikationsverfahren) oder Temperaturzyklen-Amplifikationsreaktionen (z. B. Polymerasekettenreaktion (PCR), quantitativer PCR (qPCT), Echtzeit-PCR (rt-PCT) oder anderen Temperaturzyklen-Amplifikationsverfahren) oder anderen Amplifikationsverfahren. Der Nachweis der amplifizierten RNA-Analytprodukte kann während der Amplifikation (Echtzeit-) oder nach der Amplifikation (Endpunkt-) durchgeführt werden.
Transkriptionsvermittelte Amplifikation
TMA wurde zuvor beschrieben (z. B. US-Pat. Nr. 5,399,491, 5,554,516, 5,824,518 und 7,833,716 ; und auch z. B. F. Gonzales und S. McDonough. Applications of Transcription-Mediated Amplification to Quantification of Gene Sequences. Gene Amplification. 1998, Hrsg. Francois Ferre, Birkhauser, Boston. S. 189-204). In TMA wird eine Zielnukleinsäure, die die zu amplifizierende Sequenz enthält, als einzelsträngige Nukleinsäure (z. B. ssRNA oder ssDNA) bereitgestellt. Für die Umwandlung einer doppelsträngigen Nukleinsäure (z. B. dsDNA) in eine einzelsträngige Nukleinsäure kann jedwedes konventionelle Verfahren verwendet werden. Ein Promotor-Primer bindet spezifisch zu der Analytnukleinsäure an seiner Zielsequenz und eine reverse Transkriptase (RT) verlängert das 3'-Ende des Promotor-Primers unter Verwendung des Zielstrangs als Template, um eine cDNA-Kopie zu erzeugen, was zu einem RNA:cDNA-Doppelstrang führt. Die RNase-Aktivität (z. B. RNase H von RT-Enzym) verdaut die RNA des RNA:cDNA-Doppelstrangs und ein zweiter Primer bindet spezifisch zu seiner Zielsequenz in der cDNA, nachgeschaltet von dem Promotor-Primer-Ende. Dann synthetisiert RT einen neuen DNA-Strang durch Verlängerung des 3'-Endes des zweiten Primers unter Verwendung der cDNA als Template, um eine dsDNA zu erzeugen, die eine funktionelle Promotorsequenz enthält. RNA-Polymerase, die für den funktionellen Promotor spezifisch ist, initiiert die Transkription, um etwa 100 bis 1000 RNA-Transkripte (amplifizierte Kopien oder Amplikons) zu erzeugen, die zu dem anfänglichen Zielstrang komplementär sind. Der zweite Primer bindet spezifisch zu seiner Zielsequenz in jedem Amplikon und die RT erzeugt eine cDNA aus dem Amplikon-RNA-Template, um einen RNA:cDNA-Doppelstrang zu erzeugen. Die RNase verdaut die Amplikon-RNA von dem RNA:cDNA-Doppelstrang und die zielspezifische Sequenz des Promotor-Primers bindet zu seiner komplementären Sequenz in der neu synthetisierten DNA und die RT verlängert das 3'-Ende des Promotor-Primers sowie das 3'-Ende der cDNA, um eine dsDNA zu erzeugen, die einen funktionellen Promotor enthält, zu dem die RNA-Polymerase bindet und zusätzliche Amplikons, die zu dem Zielstrang komplementär sind, transkribiert. Autokatalytische Zyklen, die diese Schritte wiederholt während der Reaktion verwenden, erzeugen etwa eine milliardenfache Amplifikation der anfänglichen Zielsequenz. Optional können Amplikons während der Amplifikation (Echtzeit-Nachweis) oder an einem Endpunkt der Reaktion (Endpunkt-Nachweis) unter Verwendung einer Sonde, die spezifisch zu einer Sequenz bindet, die in den Amplikons enthalten ist, nachgewiesen werden. Der Nachweis eines Signals, das aus den gebundenen Sonden resultiert, zeigt die Gegenwart der Zielnukleinsäure in der Probe an.
TMA kann auch als Teil eines Echtzeit-, zweiphasigen, Zieleinfang- und Amplifikationsverfahrens durchgeführt werden. In einem derartigen Verfahren kann TMA durch Zugabe von Amplifikationsreagenz (50 µl/Test) zu Reaktionsgefäßen, die eingefangene Moleküle des Analyten enthalten, und Mischen in einer Amplifikationsbeladungsstation durchgeführt werden. Das Amplifikationsreagenz enthält Oligos und Komponenten, die zum Aufbau von Nukleinsäuren notwendig sind. Die Reaktionsgefäße werden in einen Übergangsinkubator bei 43,7 °C gestellt, um die Temperatur der Flüssigkeit in den Reaktionsgefäßen zu erhöhen, die dann zurück in die Amplifikationsbeladungsstation gestellt werden, wo Enzym (25 µl/Test) zugegeben wird. Die Reaktionsgefäße werden in den Amplifikationsinkubator, der auf 42,7 °C eingestellt ist, gestellt und verbleiben in dem Inkubator für fünf Minuten, während dessen die ersten Runden der Amplifikation eingeleitet werden. Die Reaktionsgefäße werden zurück in die Amplifikationsbeladungsstation gestellt, wo Promotorreagenz (25 µl/Test) zugegeben wird. Die Reaktionsgefäße werden zurück in den Amplifikationsinkubator für weitere Runden der Analytenamplifikation gestellt. Das Promotorreagenz enthält Oligos und Fackeln. Die Fackeln sind komplementär zu dem Analyten oder internen Kalibrator und fluoreszieren bei Bindung, wodurch ein Signal in Echtzeit erzeugt wird. Die Signale für das Ziel und den internen Kalibrator weisen bevorzugt unterschiedliche Wellenlängen auf und können unterschieden werden.
ii. Polymerasekettenreaktion
Alternativ kann die PCR-Amplifikation (z. B. Reverse-Transkriptase- oder Echtzeit-PCR) zur Amplifikation verwendet werden. Die PCR kann mit oder ohne vorherige Freisetzung der Zielnukleinsäure aus dem Einfangkomplex durchgeführt werden. Die PCR-Reaktion kann im selben Behälter (z. B. einem Microfuge-Röhrchen) wie der Schritt des Einfangens durchgeführt werden. Die PCR-Reaktion involviert einen Temperaturwechsel zwischen einer hohen Temperatur von etwa 95 °C (z. B. 90-99 °C) zur Dissoziation und einer niedrigen Temperatur von etwa 60 °C (z. B. 40-75 oder 50-70 oder 55-64 °C) zum Annealing. Normalerweise beträgt die Anzahl der kompletten Thermozyklen mindestens 10, 20, 30 oder 40. Die PCR-Amplifikation wird unter Verwendung von einem oder mehreren Primer-Paaren durchgeführt. Ein Primer-Paar, das für die PCR-Amplifikation verwendet wird, schließt zwei Primer, komplementär zu entgegengesetzten Strängen einer Zielnukleinsäure, ein, die den Bereich, der zu sequenzieren ist, flankieren. Zur Sequenzierung des größten Teils eines viralen Genoms (z. B. mehr als 50, 75 oder 99 %) werden die Primer bevorzugt nahe an den Enden des viralen Genoms positioniert. Für die Amplifikation verwandter Moleküle (z. B. mutanter Formen des gleichen Virus, die in einer Patientenprobe vorliegen) sind die Primer bevorzugt komplementär zu konservierten Bereichen der Zielnukleinsäure, die wahrscheinlich in den meisten Mitgliedern der Grundgesamtheit vorhanden sind. Die PCR-Amplifikation wird in Folgenden beschrieben: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Hrsg. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Hrsg. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (Hrsg. McPherson et al., IRL Press, Oxford); und US-Patent 4,683,202 .
Nachweis
Der Nachweis eines Nukleinsäureanalyten kann nach dem Einfangen und entweder während (Echtzeit-) oder nach (Endpunkt-) Amplifikation durch Verwendung eines jedweden bekannten Verfahrens durchgeführt werden. Das Amplifikationsprodukt von RNA liegt häufig in Form von DNA infolge von RT-PCR oder RNA-Kopien infolge von TMA vor. Amplifizierte Nukleinsäuren können in der Lösungsphase oder durch Konzentrieren dieser in oder auf einer Matrix und Nachweisen von Markierungen, die mit diesen verbunden sind (z. B. ein interkalierendes Mittel, wie zum Beispiel Ethidiumbromid), nachgewiesen werden. Einige Nachweisverfahren verwenden Sonden, die zu einer Sequenz in dem amplifizierten Produkt komplementär sind, und weisen die Gegenwart des Sonde : Produkt-Komplexes nach oder verwenden einen Komplex von Sonden, um das von den amplifizierten Produkten nachgewiesene Signal zu verstärken (z. B. US-Pat. Nr. 5,424,413 , 5,451,503 und 5,849,481 ). Andere Nachweisverfahren verwenden eine Sonde, in der die Signalerzeugung mit der Gegenwart der Zielsequenz verbunden ist, da eine Änderung des Signals nur dann erfolgt, wenn die markierte Sonde zu einem amplifizierten Produkt bindet, wie zum Beispiel in einem sog. Molecular Beacon, einer molekularen Fackel oder einer Hybridisierungs-Schaltsonde (z. B. US-Pat. Nr. 5,118,801, 5,210,015, 5,312,728, 5,538,848, 5,541,308, 5,656,207, 5,658,737, 5,925,517, 6,150,097, 6,361,945, 6,534,274, 6,835,542 und 6,849,412 ; und US-Pub. Nr. 2006/0194240 A1 ). Diese Sonden verwenden normalerweise eine Markierung (z. B. Fluorophor), die an einem Ende der Sonde angebracht ist, und eine interagierende Verbindung (z. B. Löscher), die an einer anderen Stelle der Sonde angebracht ist, um die Signalerzeugung von der Markierung zu inhibieren, wenn die Sonde in einer Konformation („geschlossen“) vorliegt, die anzeigt, dass sie nicht mit amplifiziertem Produkt hybridisiert ist, doch ein nachweisbares Signal erzeugt wird, wenn die Sonde mit dem amplifizierten Produkt hybridisiert ist, das ihre Konformation (zu „offen“) verändert. Der Nachweis eines Signals von direkt oder indirekt markierten Sonden, die spezifisch mit dem amplifizierten Produkt verbunden sind, zeigt die Gegenwart der Zielnukleinsäure an, die amplifiziert wurde.
Sequenzierung
Nach Amplifikation kann ein Nukleinsäurenanalyt zusätzlich oder anstelle, dass er einem qualitativen oder quantitativen Nachweis unterzogen wird, sequenziert werden. Wenn gewünscht, kann eine Aufreinigung an einer Siliciumdioxidsäule (z. B. einer Qiagen-Schwerkraftflusssäule) durchgeführt werden. Die Zielnukleinsäure bindet an die Säule, wo sie gewaschen und dann eluiert werden kann. Alternativ kann die Aufreinigung unter Verwendung eines auf einer Nukleinsäuresonde basierenden Aufreinigungssystems durchgeführt werden (z. B. US-Pat. Nr. 6,110,678 oder 8,034,554 , US 2013/0209992 oder US 2009/0286249 oder WO 2012/037531 oder WO 2013/116774 ). Die amplifizierte Analyt-DNA kann auch durch Anbringen eines Adapters für einige Sequenzierungsformate angepasst werden. Die amplifizierte DNA kann durch Klenow-vermittelte Addition von Nukleotiden (gewöhnlich ein Homopolymer) verlängert werden, wonach Annealing an ein Oligonukleotid, das zur zugefügten Verlängerung komplementär ist, und Ligation folgen. In Abhängigkeit von der verwendeten Sequenzierungsplattform werden vor der Sequenzierung spezielle Adapter an das Template gebunden. Beispielsweise wird ein SMRT Bell Adapter an das Proben-Template für die Sequenzierung mit einem Pacific Biosciences' PacBio RS Sequencer gebunden (siehe z. B. Travers et al. Nucl. Acids Res. (2010) 38 (15): e159).
Die amplifizierte Zielnukleinsäure ist für die Sequenzanalyse durch eine Vielfalt von Techniken geeignet. Der Einfang von Zielnukleinsäure kann mit mehreren verschiedenen Formaten sogenannter Sequenzierungsverfahren der nächsten Generation und dritten Generation verbunden werden. Derartige Verfahren können Millionen von Ziel-Templaten parallel sequenzieren. Derartige Verfahren sind besonders nützlich, wenn die Zielnukleinsäure eine heterogene Mischung aus Varianten ist. Unter den vielen Vorteilen liefert das parallele Sequenzieren von Varianten ein Profil von medikamentenresistenten Mutationen in der Probe, selbst Medikamentenmutationen, die in relativ geringen Anteilen in der Probe vorliegen.
Einige Sequenzierungsverfahren der nächsten Generation amplifizieren durch Emulsions-PCR. Eine Zielnukleinsäure, die über ein Zieleinfangoligomer an Kügelchen immobilisiert ist, stellt ein geeignetes Ausgangsmaterial für Emulsions-PCR bereit. Die Kügelchen werden mit PCR-Reagenzien und Emulsionsöl gemischt, um einzelne Mikroreaktoren zu zeugen, die einzelne Kügelchen enthalten (Margulies et al., Nature 437, 376-80 (2005)). Die Emulsion wird dann aufgelöst, und die einzelnen Kügelchen mit amplifizierter DNA werden sequenziert. Die Sequenzierung kann Pyrosequenzierung sein, die beispielsweise unter Verwendung eines Roche 454 GS FLX Sequencers (454 Life Sciences, Branford, CT 06405) durchgeführt wird. Alternativ kann die Sequenzierung Ligation/Nachweis sein, die/der beispielsweise unter Verwendung eines ABI SOLiD Sequencing Systems (Life Technologies, Carlsbad, CA 92008) durchgeführt wird. In einer anderen Variation werden Analytnukleinsäuren von den Kügelchen, die Zieleinfangoligomere aufweisen, eluiert und werden an unterschiedlichen Stellen auf einem Array immobilisiert (z. B. dem HiScanSQ (Illumina, San Diego, CA 92121)). Die Zielnukleinsäuren werden durch Brückenamplifikation amplifiziert und durch Templategeleiteten Einbau von markierten Nukleotiden in einem Arrayformat sequenziert (Illumina). In einem anderen Ansatz werden Analytnukleinsäuren von dem Zieleinfangoligomer eluiert, und einzelne Moleküle werden durch Echtzeit-Nachweis der eingebauten Nukleotide durch eine Polymerase analysiert (Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung oder SMRT-Sequenzierung). Die Nukleotide können markierte Nukleotide sein, die ein Signal freisetzen, wenn sie eingebaut werden (z. B. Pacific Biosciences, Eid et al., Sciences 323 S. 133-138 (2009)), oder unmarkierte Nukleotide sein, wobei das System eine chemische Veränderung bei Einbau misst (z. B. Ion Torrent Personal Genome Machine (Life Technologies)).
Obwohl eingefangene Zielnukleinsäuren durch jedwede Technik sequenziert werden können, bieten Verfahren der dritten Generation, der nächsten Generation oder massiv parallele Verfahren erhebliche Vorteile gegenüber der Sanger-und-Maxam-Gilbert-Sequenzierung. Mehrere Gruppen haben ein DNA-Sequenzierungsverfahren mit einem ultrahohen Durchsatz beschrieben (siehe z. B. Cheeseman, US-Pat. Nr. 5,302,509 , Metzker et al., Nucleic Acids Res. 22: 4259 (1994)). Der Pyrosequenzierungsansatz, bei dem vier natürliche Nukleotide (die eine Base von Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) oder Thymin (T) umfassen) und mehrere andere Enzyme zur Sequenzierung von DNA durch Synthese eingesetzt werden, wird heute weitgehend zum Mutationsnachweis verwendet (Ronaghi, Science 281, 363 (1998); Binladin et al., PLoS ONE, Ausgabe 2, e197 (Februar 2007); Rehman et al., American Journal of Human Genetics, 86, 378 (März 2010); Lind et al., Next Generation Sequencing: The solution for high-resolution, unambiguous human leukocyte antigen typing, Hum. Immunol. (2010), doi 10.1016/jhumimm.2010.06.016 (im Druck); Shafer et al., J. Infect. Dis. 1; 199(5): 610 (2009)). In diesem Ansatz basiert der Nachweis auf dem Pyrophosphat (PPi), das während der DNA-Polymerase-Reaktion freigesetzt wird, der quantitativen Umwandlung von Pyrophosphat zu Adenosintriphosphat (ATP) durch Sulfurylase und der nachfolgenden Erzeugung von sichtbarem Licht durch Leuchtkäfer-Luziferase. Neuere Arbeiten führen DNA-Sequenzierung durch ein Syntheseverfahren durch, das sich größtenteils auf eine photospaltbare chemische Einheit konzentriert, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff zum Abschluss der 3'-OH-Gruppe von Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) verknüpft ist (Welch et al. Nucleosides and Nucleotides 18, 197 (1999) & European Journal, 5: 951-960 (1999); Xu et al., US-Pat. Nr. 7,777,013 ; Williams et al., US-Pat. Nr. 7,645,596 ; Kao et al., US-Pat. Nr. 6,399,335 ; Nelson et al., US-Pat. Nr. 7,052,839 & 7,033,762 ; Kumar et al., US-Pat. Nr. 7,041,812 ; Sood et al., US-Patentanmeldung Nr. 2004-0152119 ; Eid et al., Science 323, 133 (2009)). In der Methodik der Sequenzierung durch Synthese werden DNA-Sequenzen durch Messen von Pyrophosphatfreisetzung beim Testen von DNA-/Polymerase-Komplexen mit jedem Desoxyribonukleotidtriphosphat (dNTP) separat und nacheinander abgeleitet. Siehe Ronaghi et al., Science 281: 363 365 (1998); Hyman, Anal. Biochem. 174, 423 (1988); Harris, US-Pat. Nr. 7,767,400 .
Andere Analyten
Antikörper, Proteine, Partikel und andere Analyten können durch Formate, wie zum Beispiel Immunpräzipitation, Western Blotting, ELISA, Radioimmunassay, kompetitive und immunometrische Assays, nachgewiesen werden. Siehe Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988); US-Patent Nr. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,879,262; 4,034,074, 3,791,932; 3,817,837; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; und 4,098,876 . Sandwich-Assays sind ein bevorzugtes Format (siehe US 4,376,110, 4,486,530, 5,914,241 und 5,965,375 ).
Kompetitive Assays können auch verwendet werden. In einigen Verfahren konkurriert das Analytantigen in einer Probe mit exogen zugeführtem, markiertem Analytantigen um die Bindung an ein Antikörpernachweisreagenz. Die Menge des an den Antikörper gebundenen markierten Analytantigens ist umgekehrt proportional zu der Menge des Analytantigens in der Probe. Der Antikörper kann immobilisiert werden, um vor dem Nachweis die Abtrennung des gebundenen Komplexes von der Probe zu erleichtern.
Lateral-Flow-Vorrichtungen können auch für den Nachweis eines Analyten verwendet werden. Flüssigkeit wird auf einen Teststreifen aufgetragen, der mit einer Probe behandelt wurde, in der ein Analyt vorliegen kann. Markierte bindende Moleküle laufen durch den Streifen und können eingefangen werden, wenn sie in eine spezifische Zone gelangen, die die Probe mit dem Analyten enthält.
VI. Sensitivität
Die vorliegenden Verfahren können einen hochsensitiven Nachweis eines Analyten aus Blutzellen bereitstellen. Für Pathogen-abstammende RNA-Analyten kann die Sensitivität als eine minimale Zahl von pathogenen RNA-Kopien ausgedrückt werden, die in einem Volumen von Vollblut vorliegen. Das Volumen von Vollblut kann solches sein, das direkt mit Lysereagenz in Kontakt gebracht wird, oder kann solches sein, das zur Herstellung einer Blutfraktion, wie zum Beispiel pelletierten roten Zellen, verwendet wird, die wiederum mit dem Lysereagenz in Kontakt gebracht werden. Bevorzugt weisen die Verfahren die Gegenwart von pathogener RNA im Vollblut mit einer Sensitivität von etwa 2 × 10³ Kopien von ribosomaler RNA/ml (entsprechend einem Parasiten/1 ml) Vollblut oder besser, 2 × 10³ Kopien/5 ml Vollblut oder besser, 2 × 10³ Kopien/10 ml Vollblut oder besser, 2 × 10³ Kopien/50 ml Vollblut oder besser oder 2 × 10³ Kopien/100 ml Vollblut oder besser nach. Bevorzugt weisen die Verfahren die Gegenwart von pathogener RNA im Vollblut mit einer Sensitivität von etwa 8 × 10³ Kopien von ribosomaler RNA/ml (entsprechend vier Parasiten/1 ml) Vollblut oder besser, 8 × 10³ Kopien/5 ml Vollblut oder besser, 8 × 10³ Kopien/10 ml Vollblut oder besser, 8 × 10³ Kopien/50 ml Vollblut oder besser oder 8 × 10³ Kopien/100 ml Vollblut oder besser nach. Bevorzugt weisen die Verfahren die Gegenwart von pathogener RNA im Vollblut mit einer Sensitivität von etwa 24 × 10³ Kopien von ribosomaler RNA/ml (entsprechend 12 Parasiten/1 ml) Vollblut oder besser, 24 × 10³ Kopien/5 ml Vollblut oder besser, 24 × 10³ Kopien/10 ml Vollblut oder besser, 24 × 10³ Kopien/50 ml Vollblut oder besser oder 24 × 10³ Kopien/100 ml Vollblut oder besser nach.
BEISPIELE
Beispiel 1. Analyse von Reagenzien für die Zelllyse und Stabilisierung von Babesia-RNA
Der Zweck dieses Beispiels war die Identifizierung eines Lysereagenzes, das rote Blutzellen in menschlichem Vollblut effektiv und bevorzugt lysieren, Analyt(en) in der lysierten Probe stabilisieren und die Aktivität von RNAsen inhibieren kann. Die bevorzugte Lyse von roten Blutzellen gegenüber anderen zellulären Komponenten von Blut bedeutet, dass der Prozentanteil von lysierten roten Blutzellen höher ist als der von anderen zellulären Komponenten, die in der zu analysierenden Probe vorliegen, wobei die anderen Zellarten in dem Aggregat bewertet werden. In diesem Beispiel ist der Analyt ein Pathogen-abstammender RNA-Analyt, 18S ribosomale RNA von Babesia-Parasiten. Um mit Gen-Probe's Target Capture Technology (Zieleinfang-Technologie) unter Verwendung von magnetischen Kügelchen kompatibel zu sein, sollte das Lysereagenz bevorzugt zu einem homogenen Lysat für einen effizienten Zieleinfang führen.
In diesem ersten Beispiel wurden das PAXgene™ Blood RNA System (BD Biosciences), Lysereagenz A und Lysereagenz B für die Herstellung der Babesia-Probe bewertet. Das PAXgene-Reagenz, das in jedem Gefäß enthalten ist, umfasst die Wirkverbindung Tetradecyltrimethylammoniumoxalat (TDTMAO), ein quartäres Ammoniumsalz, von dem bekannt ist, dass es Zellmembranen lysiert und als Stabilisierungsreagenz agiert. Das Lysereagenz A war eine wässrige Lösung von 14 mM Natriumbicarbonat, 250 mM Ammoniumchlorid, 5 % (m/V) LLS und 0,1 mM EDTA bei einem pH von 7,4. Das Lysereagenz B war eine wässrige Lösung von 14 mM Natriumbicarbonat, 250 mM Ammoniumchlorid, 8 % (m/V) LLS und 0,1 mM EDTA bei einem pH von 7,3.
Die für die Herstellung verwendete Probe war menschliches Vollblut, das mit Babesia-infiziertem Hamsterblut versetzt war. Das infizierte Vollblut vom Hamster wurde durch Vereinigen von 10 ul infiziertem Hamsterblut mit 90 ul frischem menschlichem Spenderblut (nicht infiziert) seriell verdünnt. Jede dieser Serienverdünnungen wurde dann mit 900 ul frischem menschlichem Spenderblut vereinigt, um 1-ml-Proben bereitzustellen. Jede 1-ml-Probe wurde zuerst mit 3 ml Lysereagenz von einem PAXgene-Gefäß bei Raumtemperatur vereinigt und für 5 Minuten geschaukelt, um Zelllyse zu induzieren. 500 µl der lysierten Probe wurden dann zu 500 µl eines Target Capture Reagent (TCR) (Zieleinfangreagenz) gegeben. TCRs von Gen-Probe, Procleix und Aptima wurden bewertet. Nach der Zugabe der lysierten Probe zu dem TCR bildete sich ein weißer Niederschlag. Daher war das PAXgene System für die Lyse von Vollblut, den Einfang, die Amplifikation und den Nachweis von Babesia unter Verwendung der Zieleinfangs-, Amplifikations- und Nachweisreagenzien von Gen-Probe ungeeignet.

In einem nächsten Experiment wurde ein Lysereagenz von 250 mM Ammoniumchlorid (ACL), das mit 14 mM Natriumbicarbonat gepuffert war und LLS und EDTA enthielt, bewertet. Menschliches Vollblut wurde mit Babesia-infiziertem Hamsterblut in einer Verdünnung im Bereich von 1 × 10^-5 bis 1 × 10^-8 versetzt, wie allgemein vorstehend beschrieben. Ein ml von versetztem Vollblut wurde dann mit 3 ml Lysereagenz A für 5 Minuten bei 25 °C gemischt, um Lyse von roten Blutzellen zu induzieren. Nach der Zugabe von 500 µl der lysierten Probe zu 500 µl TCR wurde kein Niederschlag beobachtet. Der Zieleinfang wurde, wie allgemein im US-Pat. Nr. 6,110,678 beschrieben, durchgeführt. Babesia 18S rRNA wurde in jeder Probe durch transkriptionsvermittelte Amplifikation nachgewiesen ( US-Pat. Nr. 5,399,491, 5,554,516, 5,824,518 und 7,833,716 ). Es wurden sechs (6) Replikate von jeder Verdünnungsbedingung amplifiziert und nachgewiesen. Die Parasitenbelastung wurde basierend auf statistischer Identifizierung der Verdünnung, um etwa 1 Parasiten pro ml zu enthalten, bestimmt. Außerdem wurde eine Serienverdünnung einer IVT-Stammlösung mit einer bekannten Konzentration in separaten Wells der Reaktion amplifiziert und nachgewiesen, um eine Kurve für die Berechnung der Parasitenbelastung in jeder amplifizierten/nachgewiesenen Verdünnung des Hamsterbluts bereitzustellen. Zieleinfangoligomere, Primer und Sonden, die zum Einfang, zur Amplifikation und zum Nachweis von Babesia 18S rRNA in den Proben verwendet wurden, waren wie folgt: Tabelle 1.

FUNKTION	Sequenz (5'-3')
Nicht-T7-Primer	ACAGGGAGGTAGTGACAAG (SEQ.-ID Nr. 1)
T7 - Primer	AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACTGGAATTACCGCGGCTGCTGG (SEQ.-ID Nr. 2)
AE-Sonde	ACCCUUCC CA GAGUAUCAAU (SEQ.-ID Nr. 3)
TCO	GGAUUGGGUAAUUUGCGCGCCTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TCO	AAAAAAAA (SEQ.-ID Nr. 4)

Amplifikations- und Nachweisergebnisse von jeder der vorstehend erwähnten Bedingungen zeigen, dass Lysereagenz A rote Blutzellen effektiv lysierte, um Babesia 18S rRNA für die nachfolgende Analyse freizusetzen. Der Vergleich der Babesia-rRNA, die in jeder dieser Proben der Serienverdünnung nachgewiesen wurde, mit den Ergebnissen von der seriell verdünnten IVT zeigte eine Nachweisgrenze so niedrig wie 0,01 Parasiten pro ml.
Zusätzliche Lysereagenzien wurden auf ihre Lyse von Blutzellen und den Nachweis von Pathogen-abstammenden Analyten bewertet.
Beispiel 2. Bewertung von zusätzlichen Lysereagenzien für Blutzellen
Eine Studie von Lysereagenzien wurde zur Bewertung ihrer Fähigkeit zur effektiven Lyse von Blutzellen und Freisetzung von Analyten für die nachfolgende Bewertung durchgeführt. Nukleinsäureanalyten wurden in diesem Beispiel unter Verwendung einer TMA-Amplifikations- und Nachweisreaktion zur Identifizierung von 18S rRNA aus Babesia-Parasiten, wie hierin beschrieben, bewertet.
Die in diesem Beispiel verwendete Probe war Babesia-infiziertes menschliches Vollblut, das für Babesia durch PCR als positiv bestimmt wurde. Die Parasitämie wurde durch serielles Verdünnen des Babesia-infizierten Blutes in nichtinfiziertem Blut, dann Erhöhen des Volumens von jeder Verdünnung auf 1 ml unter Verwendung von nichtinfiziertem Blut, Mischen der 1-ml-Verdünnung mit 3 ml Lysereagenz A und dann Durchführen von Einfang-, Amplifikations- und Nachweisreaktionen, wie im Beispiel 1 vorstehend beschrieben, bestimmt. Die Parasitenbelastung in der mit Stammlösung infizierten menschlichen Blutprobe wurde basierend auf statistischer Identifizierung der Verdünnung, um etwa 1 Parasiten pro ml zu enthalten, und dann Zurückrechnen auf die mit Stammlösung infizierte Blutprobe bestimmt. Die infizierte Blutprobe wurde dann separat verdünnt, um 12-Parasiten/ml (12 P/ml)- und 4-Parasiten/ml (4 P/ml)-Verdünnungen in einem Gesamtvolumen von 1 ml bereitzustellen, wie allgemein beschrieben. Die 12 P/ml und die 4 P/ml wurden jeweils in den nachfolgenden Assays verwendet.

Das Lysereagenz C wurde ähnlich wie Lysereagenz B hergestellt, doch die Konzentration von EDTA wurde auf 10 mM erhöht. Das Lysereagenz D war eine wässrige Lösung von 15 mM monobasischem Natriumphosphat, 15 mM dibasischem Natriumphosphat, 10 % (m/V) LLS, 1 mM EGTA und 1 mM EDTA-Na²-Dihydrat mit einem pH von 6,7. Das Lysereagenz E war eine wässrige Lösung von 100 mM TRIS, 30 mM Magnesiumchlorid und 6 % (m/V) LLS mit pH 7,5. Separate versetzte Vollblutproben (vorstehend beschrieben) wurden jeweils mit einem der Lysereagenzien C-E in einem Verhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4 (Blutprobe : Lysereagenz) lysiert und bei 36 bis 72 Replikaten pro Bedingung getestet, wie in den Tabellen 2-4 ausgewiesen. Als reaktive Proben wurden solche mit einem RLU-Wert von größer als 100 000 RLU bestimmt. Babesia 18S rRNA wurde in jeder Probe unter Verwendung von Procleix TCR und Amplifikation durch TMA, wie vorstehend beschrieben, nachgewiesen. Die Bedingungen wurden auf Sensitivität, Stabilität und Robustheit bewertet. Die Ergebnisse für die Lysereagenzien C-E sind in Tabelle 2, Tabelle 3, Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 2. Sensitivität

Verhältnis	Konzentration	Lysereagenz	Anzahl von Reaktionen	Anzahl Reaktive	Prozent Reaktive
1 : 2	12 P/ml	C	71	70	98,5 %
		D	72	72	100,0 %
		E	72	72	100,0 %
	4 P/ml	C	72	50	69,4%
		D	72	66	91,7 %
		E	69	54	78,3 %
1 : 4	12 P/ml	C	72	72	100,0 %
		D	72	72	100,0 %
		E	72	72	100,0 %
	4 P/ml	C	72	66	91,7%
		D	72	63	87,5 %
		E	72	67	93,1 %

Tabelle 3. Stabilität: Ein Tag.

			Tag 0			Tag 1 (bei 4 °C gelagert)
Verhältnis	Konz.	Lysereagenz	Anzahl von Reaktionen	Anzahl Reaktive	Prozent Reaktive	Anzahl von Reaktionen	Anzahl Reaktive	Prozent Reaktive
1 : 2	12 P/ml	C	35	35	100,0 %	36	34	94,4%
		D	36	36	100,0 %	36	35	97,2 %
		E	36	36	100,0 %	36	36	100,0 %
	4 P/ml	C	36	28	77,8 %	36	20	55,6%
		D	36	31	86,1%	36	30	83,3 %
		E	36	27	75,0%	36	33	91,7 %
1 : 4	12 P/ml	C	36	36	100,0 %	36	36	100,0 %
		D	36	36	100,0 %	36	36	100,0 %
		E	36	36	100,0 %	36	36	100,0 %
	4 P/ml	C	36	32	88,9 %	36	35	97,2 %
		D	36	31	86,1 %	36	36	100,0 %
		E	36	33	91,7%	36	35	97,2 %

Tabelle 4. Stabilität: Drei Tage.

			Tag 0			Tag 3 (bei 4 °C gelagert)
Verhältnis	Konz.	Lysereagenz	Anzahl von Reaktionen	Anzahl Reaktive	Prozent Reaktive	Anzahl von Reaktionen	Anzahl Reaktive	Prozent Reaktive
1 : 2	12 P/ml	C	36	35	97,2 %	36	12	33,3 %
		D	36	36	100,0 %	36	36	100,0 %
		E	36	36	100,0 %	36	25	69,4 %
	4 P/ml	C	36	22	61,1%	36	9	25,0 %
		D	36	35	97,2%	36	27	75,0 %
		E	36	27	81,8 %	36	24	66,7 %
1 : 4	12 P/ml	C	36	36	100,0 %	18	18	100,0 %
		D	36	36	100,0 %	24	24	100,0 %
		E	36	36	100,0 %	24	24	100,0%
	4 P/ml	C	36	34	94,4 %	36	31	86,1 %
		D	36	32	88,9 %	36	29	80,6 %
		E	36	34	94,4%	36	32	88,9 %

Diese Daten zeigen, dass die Lysereagenzien C-E bei der Lyse von Vollblut und Freisetzung von Pathogen-abstammenden Analyten aus Blutzellen für die nachfolgende Analyse gut wirkten. Die analytische Sensitivität eines TMA-Assays für die Amplifikation und den Nachweis von Babesia 18S rRNA, die aus Blutzellen unter Verwendung der Lysereagenzien C-E erhalten wurde, war mindestens so niedrig wie 4 P/ml und bei einer Verdünnung von Lysepuffer zu Vollblut so niedrig wie 4 : 1. Es wurde ein Verlust an Sensitivität nach Lagerung bei 4 °C nach 3 Tagen beobachtet, wie durch die großen Schwankungen der Ergebnisse ersichtlich ist. Dieser Verlust an Sensitivität war leicht bei Proben mit einer 2 : 1-Verdünnung und 4 P/ml beobachtbar.
Obgleich die Erfindung zum Zwecke der Klarheit des Verständnisses ausführlich beschrieben wurde, könnten bestimmte Modifikationen innerhalb des Rahmens der angehängten Patentansprüche ausgeführt werden. Alle Veröffentlichungen, einschließlich Zugangsnummern, Webseiten und dergleichen, sowie Patentschriften, die in dieser Anmeldung angeführt wurden, werden hierdurch unter Bezugnahme in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke in gleichem Umfang eingeschlossen, als ob jede einzeln angegeben wäre. Insoweit, dass eine verschiedene Version einer Sequenz, Webseite oder anderen Quellenangabe zu verschiedenen Zeiten vorliegen kann, wird die Version, die zu der Quellenangabe an dem effektiven Einreichungsdatum gehört, verstanden. Das effektive Einreichungsdatum ist das früheste Prioritätsdatum, an dem die strittige Zugangsnummer offenbart wird. Sofern nicht anders aus dem Kontext offensichtlich, kann jedwedes/jedwede/jedweder Element, Ausführungsform, Schritt, Merkmal oder Aspekt der Erfindung zusammen mit jedwedem/jedweder anderen ausgeführt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Lysereagenz für Blutzellen, das Folgendes umfasst: (i) einen Puffer, (ii) Lithiumlaurylsulfat (LLS), und (iii) eines oder beides von einem Chlorid-haltigen Salz und einem Gerinnungshemmer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA, EDTA-Na₂, EGTA, und Kombinationen davon, wobei das Reagenz einen pH aufweist, der größer als 5,5 ist.
Das Reagenz nach Anspruch 1, wobei der Puffer Natriumbicarbonat ist, das in einer Konzentration von ungefähr 5 mM bis ungefähr 30 mM vorliegt.
Das Reagenz nach Anspruch 2, wobei das Natriumbicarbonat in einer Konzentration von ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM vorliegt.
Das Reagenz nach Anspruch 2, wobei das Natriumbicarbonat in einer Konzentration von ungefähr 14 mM vorliegt.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das LLS in einer Konzentration von ungefähr 2 % (V/V oder m/V) bis ungefähr 15 % (V/V oder m/V) vorliegt.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das LLS in einer Konzentration von ungefähr 4 % (V/V oder m/V)) bis ungefähr 10 % (V/V oder m/V) vorliegt.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das LLS in einer Konzentration von ungefähr 5 % (V/V oder m/V)) bis ungefähr 8 % (V/V oder m/V) vorliegt.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das LLS in einer Konzentration von ungefähr 8 % (V/V oder m/V)) bis ungefähr 10 % (V/V oder m/V) vorliegt.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 100 mM bis ungefähr 500 mM umfasst.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 150 mM bis ungefähr 300 mM umfasst.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 200 mM bis ungefähr 300 mM umfasst.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 240 mM bis ungefähr 260 mM umfasst.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 250 mM umfasst.
Das Reagenz nach Anspruch 1, wobei der Puffer Natriumbicarbonat ist, das in einer Konzentration von ungefähr 10 mM bis ungefähr 20 mM vorliegt, das LLS in einer Konzentration von ungefähr 5 % (V/V oder m/V) bis ungefähr 8 % (V/V oder m/V) vorliegt, und das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 240 mM bis ungefähr 260 mM umfasst.
Das Reagenz nach Anspruch 1, wobei der Puffer Natriumbicarbonat ist, das in einer Konzentration von ungefähr 14 mM vorliegt, das LLS in einer Konzentration von ungefähr 5 % (V/V oder m/V) bis ungefähr 8 % (V/V oder m/V) vorliegt, und das Reagenz Ammoniumchlorid in einer Konzentration von ungefähr 250 mM umfasst.
Das Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Reagenz EDTA umfasst und wobei das EDTA in einer Konzentration von ungefähr 0,1 mM bis ungefähr 10 mM vorliegt.
Das Reagenz nach Anspruch 1, wobei das Reagenz Natriumbicarbonat, Ammoniumchlorid, LLS und EDTA umfasst, wobei das Natriumbicarbonat in einer Konzentration von 12 mM bis 16 mM vorliegt, das Ammoniumchlorid in einer Konzentration von 100 mM bis 500 mM vorliegt, das LLS in einer Konzentration von 4 % bis 15 % (V/V oder m/V) vorliegt und das EDTA in einer Konzentration von 0,01 mM bis 10 mM vorliegt und der pH des Reagenzes 7,2 bis 7,6 ist.
Das Reagenz nach Anspruch 1, wobei das Reagenz Natriumbicarbonat, Ammoniumchlorid, LLS und EDTA umfasst, wobei das Natriumbicarbonat in einer Konzentration von 14 mM vorliegt, das Ammoniumchlorid in einer Konzentration von 250 mM vorliegt, das LLS in einer Konzentration von 8 % (V/V oder m/V) vorliegt und das EDTA in einer Konzentration von 0,01 mM bis 10 mM vorliegt und der pH des Reagenzes 7,3 ist.