DE60129920T2

DE60129920T2 - Interferenzmikroskop und Verfahren zum Bedienen eines Interferenzmikroskops

Info

Publication number: DE60129920T2
Application number: DE60129920T
Authority: DE
Inventors: Jörg 69121 BEWERSDORF; Hilmar 69221 GUGEL
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2001-01-05
Filing date: 2001-12-11
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2021-12-12
Also published as: US7742226B2; JP2002221668A; EP1223451B1; US20020105722A1; US20060291043A1; EP1223451A2; DE10100247A1; DE60129920D1; EP1223451A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Interferenzmikroskop und ein Verfahren zum Bedienen eines Interferenzmikroskops. Als das Interferenzmikroskop wird insbesondere ein 4p-Mikroskop, ein Stehwellenfeldmikroskop oder ein I²M-, I³M- oder I⁵M-Mikroskop bereitgestellt. Dem Objekt ist mindestens ein Objektträger zugeordnet.
Interferenzmikroskope der Art kennt man aus dem Praxiseinsatz. EP 0 491 289 A1 zum Beispiel offenbart ein doppel-konfokales Elektronenrastermikroskop oder 4p-Mikroskop, bei dem ein Objekt punktförmig durch zwei Mikroskopobjektive, die einander gegenüberliegend angeordnet sind, beleuchtet wird. Dank dieser doppelseitigen Beleuchtung des Objekts und/oder der doppelseitigen Detektion des Lichts, das von dem Objekt kommt, wird ein Interferenzmuster erzeugt, mit dem eine Erhöhung der axialen Auflösung erreicht werden kann.
US-Patent Nr. 4,621,911 offenbart ein Stehwellenfeldmikroskop, bei dem ein Stehwellenfeld oder Interferenzmuster, das der Beleuchtung eines Objekts dient, durch die Überlagerung zweier Lichtstrahlen gebildet wird, die in kollimierter Form verlaufen. Dieses Stehwellenfeld hat Ebenen von gleicher Beleuchtungsintensität, die parallel zur Fokalebene der Mikroskopobjektive ausgerichtet sind, wobei die Beleuchtungsintensität von einem maximalen Beleuchtungsintensitätswert zu einem minimalen Beleuchtungsintensitätswert variiert und die wechselnde Beleuchtungsvariation periodisch entlang der optischen Achse der Mikroskopobjektive fortgesetzt wird. Mit diesem interferometrischen Beleuchtungsverfahren können fluoreszente Objekte angeregt werden, entsprechend dem Beleuchtungsmuster zu fluoreszieren, wodurch auch eine Verbesserung der axialen Auflösung ermöglicht wird.
US-Patent Nr. 5, 671, 085 offenbart einem I²M-, I³M- oder I⁵M-Mikroskop, bei dem ein Objekt auch angeregt wird, mit einer im Hellfeld auftreffenden Beleuchtung durch zwei Mikroskopobjektive, die einander gegenüberliegend angeordnet sind, zu fluoreszieren. Auch hier kann das Beleuchtungslicht und/oder detektierte Licht veranlasst werden zu interferieren, wodurch es auch wieder möglich wird, Verbesserungen der axialen Auflösung zu erreichen.
Ganz allgemein ausgedrückt, weisen Interferenzmikroskope einen Beleuchtungsstrahlweg von mindestens einer Lichtquelle sowie einen detektierten Strahlweg von mindestens einem Detektor auf. In den oben angesprochenen Interferenzmikroskopen sind zwei Objektive auf jeder Seite der Objektebene angeordnet, wobei die Objektive aufeinander gerichtet sind. Mindestens ein Strahlteiler zum Verteilen des Beleuchtungslichts zu den Objektiven und ein Strahlkombinierer zum Kombinieren des von den Objektiven kommenden Detektionslichts sind in dem Beleuchtungsstrahlweg und in dem detektierten Strahlweg angeordnet. Der Strahlteiler und der Strahlkombinierer können als ein und dieselbe Komponente konfiguriert werden. Objekte, die speziell mit Fluoreszenzmarkern gefärbt sind, insbesondere biologische Objekte, werden in der Regel mit den oben angesprochenen Interferenzmikroskopen untersucht. In diesem Kontext wird das Licht der Lichtquelle dafür verwendet, die Fluoreszenzmarker anzuregen, und nur dieses fluoreszente Licht wird durch den Detektor detektiert.
Aufgrund ihres interferometrischen Aufbaus und der geringen Abmessungen des Objektivfokus' sind Interferenzmikroskope dieser Art überaus anfällig für Stöße, Vibrationen und Wärmeausdehnung. Der Ausgleich von Differenzen der optischen Weglänge zwischen den Strahlwegsegmenten des Interferometers ist insbesondere eine kritische beeinflussende Variable für den erfolgreichen Betrieb eines Interferenzmikroskops. Die Differenzen der optischen Weglänge müssen so gering sein, dass einerseits das Beleuchtungslicht, das durch die zwei Strahlwegsegmente des Interferometers verläuft, interferieren können; d. h. die Differenz der optischen Weglänge zwischen den zwei Strahlwegsegmenten des Interferometers muss kleiner sein als die Kohärenzlänge des Beleuchtungslichts. Andererseits müssen die zwei Strahlwegsegmente des Interferometers im Hinblick auf die Differenz der optischen Weglänge so aneinander angeglichen werden, dass eine konstruktive Interferenz in der Objektregion des Interferenzmikroskops vorliegt.
Bei den bisher implementierten Interferenzmikroskopen erfolgt die Ausrichtung der Interferenzstrahlwegsegmente in der Praxis auf der Basis von Detektionen einzelner Objektregionen. Zum Beispiel wird ein axialer optischer Schnitt durch ein punktartiges oder lineares Objekt erfasst, und die Ausrichtung des Interferenzmikroskops erfolgt auf der Basis seines Intensitätssignalprofils. Anhand des axialen Intensitätssignalprofils können Rückschlüsse auf die Ist-Beleuchtungsbedingungen gezogen werden, die in der Objektregion vorliegen, d. h. ob eine konstruktive oder destruktive Interferenz vorliegt. Diese Ausrichtung ist komplex und muss durch den Bediener des Interferenzmikroskops individuell vorgenommen werden. Des Weiteren ist ein hohes Maß an Erfahrung seitens des Bedieners für eine erfolgreiche Ausrichtung unverzichtbar, so dass Interferenzmikroskope dieser Art schlussendlich nur von einer kleinen Gruppe von Bedienern benutzt werden können. Dieser Umstand hat bisher die weite Verbreitung der oben besprochenen Interferenzmikroskope behindert.
Es ist darum die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Interferenzmikroskop dieser Art und ein Verfahren zum Bedienen eines solchen Interferenzmikroskop zu beschreiben und weiterzuentwickeln, womit es möglich ist, die Phasenposition des interferierenden Lichts in der Objektregion zu bestimmen, um auf dieser Basis das Interferenzmikroskop auszurichten.
Das Interferenzmikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung erfüllt die oben angesprochene Aufgabe mit Hilfe der Merkmale von Anspruch 1.
Was gemäß der vorliegenden Erfindung erkannt wurde, ist erstens, dass es möglich ist, auf die Detektion einzelner Objektregionen zum Bestimmen der Phasenposition zu verzichten, wenn mindestens ein in geeigneter Weise konfigurierter planarer Bereich des Objektträgers als ein Referenzobjekt verwendet wird. Speziell bei der Detektion von fluoreszenten Objekten verringert dies die Belastung des zu detektierenden fluoreszenten Objekts, da die erforderlichen Messungen zum Detektieren der Phasenposition des interferierenden Lichts an dem planaren Bereich des Objektträgers vorgenommen werden können. Ein Bleichen des fluoreszenten Objekts lediglich zum Zweck der Phasenbestimmung kann somit vermieden werden, da die Messung zum Bestimmen der Phasenposition des interferierenden Lichts in einer Region des planaren Bereichs des Objektträgers erfolgen kann, die hinreichend weit von dem Objekt entfernt ist, damit das Objekt allenfalls geringfügig zum Fluoreszieren angeregt wird. Eine Referenzmessung in einem planaren Bereich des Objektträgers unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge, die nicht geeignet ist, die Fluoreszenzmarker anzuregen, wäre auch denkbar, aber auch sie würde kein kontrastreicheres Messsignal des Objekts erbringen, da das Objekt allgemein nur schwach absorbiert.
Darum ist gemäß der vorliegenden Erfindung der planare Bereich des Objektträgers so konfiguriert, dass er durch Lichtmikroskopie detektiert werden kann. Für diesen Zweck wird insbesondere ein planarer Bereich des Objektträgers so konfiguriert oder präpariert, dass Licht an dem planaren Bereich reflektiert oder indu ziert werden kann.
Ein planarer Bereich des Objektträgers, der so konfiguriert ist, dass er durch Lichtmikroskopie detektiert werden kann, könnte mittels einer mindestens teilweise reflektierenden Beschichtung einer Oberfläche des Objektträgers, zum Beispiel in Form eines einseitig beschichteten Deckglases, implementiert werden. Als eine Alternative dazu könnte der Objektträger eine reflektierende oder lumineszente Schicht zwischen zwei Glasplatten aufweisen, so dass ein planarer Bereich, der so konfiguriert ist, dass er durch Lichtmikroskopie detektiert werden kann, durch die Schicht gebildet wird. Zwei Glasplatten mit unterschiedlichen Materialeigenschaften in direktem Kontakt miteinander könnten auch einen planaren Bereich bilden, der so konfiguriert ist, dass er durch Lichtmikroskopie detektiert werden kann. Wenn zum Beispiel die Brechungsindizes der zwei Glasplatten sich voneinander unterscheiden, so ist der planare Bereich durch Lichtmikroskopie mittels Brechungsindexübergangs detektierbar. Des Weiteren kann die Verwendung von Kristall- oder Glasplatten mit holografischen Beschichtungen oder Konfigurationen zu einem planaren Bereich führen, der so konfiguriert ist, dass er durch Lichtmikroskopie detektiert werden kann. Als eine Alternative dazu kann eine Oberfläche des Objektträgers mit einer fluoreszenten Schicht überzogen sein, so dass fluoreszentes Licht an der Oberfläche induziert werden kann. Obgleich ein planarer Bereich gewöhnlich eine zweidimensionale Ausdehnung hat, ist in diesem Kontext ein "planarer Bereich" gewiss auch als eine Schicht oder ein Gegenstand mit einer dreidimensionalen Ausdehnung zu verstehen, auch wenn er nur eine geringe physische Ausdehnung in einer Dimension aufweist.
Eine Kombination dieser Möglichkeiten kommt auch in Betracht. In diesem Fall werden sowohl eine reflektierende als auch eine fluoreszente Schicht angeordnet, so dass die fluoreszente Schicht durch das Beleuchtungslicht zum Fluoreszieren angeregt wird (d. h. fluoreszentes Licht wird induziert) und das Beleuchtungslicht von der reflektierenden Schicht reflektiert wird.
Dieses induzierte und/oder reflektierte Licht wird durch einen Detektor detektiert. Auf der Basis der detektierten Signale lassen sich Rückschlüsse auf die Phasenposition direkt in der Objektregion des Interferenzmikroskops ziehen, infolge dessen das Interferenzmikroskop entsprechend ausgerichtet werden kann. In besonders vorteilhafter Weise macht diese Verfahrensweise zum Bestimmen des Beleuchtungszustands in der Objektregion des Interferenzmikroskops eine reproduzierbare und gleichzeitig objektive Messung möglich, da das Ergebnis dieser Messung nur von der Oberfläche, die in einer festgelegten Weise präpariert wurde, oder von den festgelegten Eigenschaften des planaren Bereichs abhängt und die Messung nicht an dem gemessenen Objekt ausgeführt zu werden braucht. Diese Verfahrensweise führt des Weiteren zwangsläufig zu einem reproduzierbaren Ergebnis, was mit der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrensweise nicht immer möglich ist (wo der Beleuchtungszustand in der Objektregion am Objekt selbst detektiert wird), da zum Beispiel das Objekt möglicherweise keine geeigneten Strukturen aufweist, auf deren Basis Rückschlüsse auf die tatsächlich vorhandene Phasenposition des Beleuchtungslichts gezogen werden können.
Mindestens ein planarer Bereich des Objektträgers könnte von teilweise reflektierender Konfiguration sein. Zu diesem Zweck könnte die Oberfläche beschichtet sein. Insbesondere könnte die Oberfläche in einer solchen Weise beschichtet sein, dass sie einen bestimmten Grad an Reflexionsvermögen aufweist, der vorzugsweise über die gesamte Oberfläche hinweg konstant ist. Die Beschichtung der Oberfläche könnte wellenlängenabhängig sein, so dass zum Beispiel nur Licht einer bestimmten Wellenlänge an der Beschichtung der Oberfläche reflektiert wird. Als die Oberflächenbeschichtung wird eine metallische oder dielektrische Beschichtung verwendet. Eine dielektrische oder metallische/dielektrische Hybridbeschichtung wäre ebenfalls vorstellbar.
In einer weiteren vorteilhaften Weise weist mindestens eine Oberfläche des Objektträgers mindestens eine Schicht auf, die zum Lumineszieren, insbesondere zum Fluoreszieren, angeregt werden kann. Diese lumineszente Schicht könnte eine Monoschicht sein. Monoschichten besitzen eine bestimmte Dicke, die durch die Abmessung der verwendeten lumineszenten Moleküle und durch ihre Anordnung auf der Oberfläche bestimmt wird. Eine Monoschicht stellt somit eine ideale planare Struktur dar, die für Lumineszenz geeignet ist.
In besonders vorteilhafter Weise ist die Oberfläche des Objektträgers mit mehreren lumineszenten Schichten versehen, von denen jede andere lumineszente Eigenschaften aufweist. Diese lumineszenten Schichten können selektiv durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zum Lumineszieren angeregt werden, und das lumineszente Licht, das durch die lumineszenten Schichten abgestrahlt wird (das ebenfalls in der Wellenlänge differiert), kann selektiv detektiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mehrere Monoschichten mit unterschiedlichen lumineszenten Eigenschaften, die zum Lumineszieren angeregt werden können, als die Oberflächenbeschichtung aufgebracht. Die eine oder die mehreren lumineszenten Schichten können mit Licht einer Lichtquelle zum Lumineszieren angeregt werden. Dies könnte die Lichtquelle des Interferenzmikroskops sein. Die Verwendung einer zusätzlichen Lichtquelle, die nur die Lumineszenz der lumineszenten Schicht anregt, ist ebenfalls denkbar. Idealerweise sendet die Lichtquelle Licht unterschiedlicher Wellenlängen aus, so dass eine Oberfläche, die mit mehreren unterschiedlichen lumines zenten Schichten beschichtet ist, zum Lumineszieren mit Licht von dieser einen Lichtquelle angeregt werden kann. Konkret ausgedrückt, könnte das ein Argon-Krypton-Laser sein, der gleichzeitig Licht der Wellenlängen 488 nm, 568 nm und 647 nm aussendet. Die Verwendung einer HBO-Lampe ist auch möglich. Mit diesem Licht unterschiedlicher Wellenlängen ist es auch möglich, unterschiedliche lumineszente Wellenlängen zum Lumineszieren anzuregen.
In einer alternativen Ausführungsform sind Mittel vorhanden, um Licht mittels nicht-linearer Prozesse in einem planaren Bereich des Objektträgers zu induzieren. Insbesondere wird kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (KARS) als der nicht-lineare Prozess verwendet. KARS ist ein Vierwellen-Mischprozess, der sich proportional zum Quadrat der Intensität des verwendeten Lichts verhält. KARS tritt nur an Stellen auf, an denen es eine optische Asymmetrie gibt, zum Beispiel eine Diskontinuität des Brechungsindexes, die auf der Oberfläche des Objektträgers vorliegt, weil es dort einen Brechungsindexübergang von Glas zu dem Immersionsmedium gibt, welches das Objekt umgibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Licht, das in dem planaren Bereich reflektiert und/oder induziert wird, mit Hilfe des Detektors des Interferenzmikroskops detektiert. Das ist insbesondere vorteilhaft, wenn das Licht, das in dem planaren Bereich reflektiert/induziert wird, ungefähr im gleichen Leistungsbereich und Wellenlängenbereich liegt wie das Licht des zu detektierenden Objekts und an den Detektionsbereich des Detektors des Interferenzmikroskops angepasst ist. Es ist aber auch vorstellbar, dass das Licht, das in dem planaren Bereich reflektiert/induziert wird, mit einem zusätzlichen Detektor detektiert werden kann. Zu diesem Zweck wird das reflektierte/induzierte Licht mittels mindestens einer optischen Komponente aus dem detektierten oder Beleuchtungsstrahlweg des Interfe renzmikroskops ausgekoppelt und in den zusätzlichen Detektor geleitet. Zu diesem Zweck könnte eine herkömmliche Glasplatte mit einem bestimmten Reflexions- oder Durchlässigkeitsgrad als die optische Komponente verwendet werden. Ein dichroitischer Strahlteiler, ein Filter, ein Prisma, ein Gatter und/oder eine spektral empfindliche Anordnung wären ebenfalls als die optische Komponente zum Auskoppeln des reflektierten/induzierten Lichts denkbar. Insbesondere, wenn das Licht, das in dem planaren Bereich des Objektträgers induziert wird, fluoreszentes Licht einer fluoreszenten Schicht ist, kann das fluoreszente Licht in spektral selektiver Weise unter Verwendung einer spektral empfindlichen Anordnung zu dem Detektor geleitet werden. Die spektral empfindliche Anordnung könnte zum Beispiel Linsen, Blenden und ein Prisma oder ein Gitter aufweisen.
Die Detektion des Lichts, das in dem planaren Bereich des Objektträgers reflektiert und/oder induziert wird, könnte im Weitfeldmodus bewerkstelligt werden. Der Weitfeldmodus beinhaltet eine planare Beleuchtung und/oder Detektion, wie man sie zum Beispiel in einem Stehwellenfeldmikroskop oder einem I⁵M-Mikroskop findet. Der Detektor, der das Licht detektiert, das in dem planaren Bereich reflektiert/induziert wird, könnte entsprechend als ein planarer Detektor, zum Beispiel in Form eines CCD-Chips, verkörpert sein.
Das Licht, das in dem planaren Bereich des Objektträgers reflektiert und/oder induziert wird, könnte konfokal detektiert werden. In diesem Fall erfolgt eine konfokale Beleuchtung; d. h. das Licht, das zur Beleuchtung dient, wird auf einen Punkt der Fokalebene des Mikroskopobjektivs fokussiert. Für eine konfokale Detektion wird vor dem Detektor eine Lochblende angeordnet, die vorzugsweise in einer Ebene angeordnet ist, die der Objektebene des Objektivs entspricht. Die Beleuchtungs- oder Detektionslochblende des Interferenzmikroskops könnte als die Lochblende verwendet werden. Wenn die Detektion des Lichts, das in dem planaren Bereich des Objektträgers reflektiert/induziert wird, unter Verwendung des konfokalen Detektors des Interferenzmikroskops bewerkstelligt wird, so ist die Lochblende, die vor dem Detektor angeordnet ist, die Detektionslochblende des Interferenzmikroskops. Wenn die Beleuchtungslochblende als die Lochblende dient, so könnte eine optische Komponente, die zwischen der Lichtquelle und der Beleuchtungslochblende angeordnet ist, das Licht, das in dem planaren Bereich des Objektträgers reflektiert/induziert wird, aus dem Beleuchtungsstrahlweg auskoppeln und es einem entsprechend angeordneten Detektor zuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dafür gesorgt, dass die Bestimmung des Beleuchtungszustands in der Objektregion des Interferenzmikroskops unter Verwendung von Licht von mindestens einer zusätzlichen Lichtquelle ausgeführt wird. Wie bereits angesprochen, kann dies ein Lasersystem, ein Laser oder eine HBO-Lampe sein.
In einer konkreten Ausführungsform besteht der Objektträger aus Glas. Die Oberflächen des Objektträgers weisen idealerweise einen hohen Grad an Oberflächenplanarität auf, den auch die Beschichtung oder die fluoreszente Schicht aufweist, die auf eine Oberfläche aufgetragen werden kann. Konkret ausgedrückt, könnte der Objektträger als ein Deckglas konfiguriert sein. Diese könnten handelsübliche Deckgläser sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Objekt zwischen zwei Objektträgern angeordnet, vorzugsweise zwischen zwei Objektträgern, die als Deckgläser konfiguriert sind. Vorzugsweise ist der planare Bereich des Objektträgers, der dem Objekt zugewandt ist, in reflektierbarer oder induzierbarer Weise konfiguriert.
Hinsichtlich des Verfahrens wird die eingangs genannte Aufgabe mittels der Merkmale von Anspruch 11 erreicht.
Insbesondere wird das Licht detektiert, das in dem planaren Bereich reflektiert und/oder induziert wird. Zu diesem Zweck wird ein Intensitätssignalprofil als eine Funktion der axialen Position des planaren Bereichs detektiert. Zur Detektion des axialen Intensitätssignalprofils wird das Objekt zusammen mit dem Objektträger entlang der optischen Achse des einen oder der mehreren Objektive bewegt, und das Licht, das durch den planaren Bereich reflektiert und/oder induziert wird, wird in diesem Kontext unter Verwendung eines Detektors detektiert. Die axiale Positionierung des Objekts zusammen mit dem Objektträger könnte kontinuierlich oder schrittweise bewerkstelligt werden. Für ein präzises Bewerkstelligen der Signaldetektion wird zunächst das Objekt zusammen mit dem Objektträger in einer solchen Weise positioniert, dass der planare Bereich des Objektträgers in der Fokusregion des Objektivs des Interferenzmikroskops angeordnet ist. Infolge dessen ist es allgemein möglich, ein Signal des Lichts, das in dem planaren Bereich reflektiert und/oder induziert wird, zu detektieren.
Insbesondere wird das Detektieren mehrerer axialer Intensitätsprofile, insbesondere an einem und/oder mehreren Punkten der Fokalebene, veranlasst. In einem doppel-konfokalen Elektronenrastermikroskop oder 4p-Mikroskop findet man die verschiedenen Punkte, an denen ein oder mehrere Intensitätssignalprofile jeweils zu detektieren sind, mittels einer Strahlabtastung. Infolge dessen würde es vorteilhafterweise auch möglich sein zu gewährleisten, dass eine bestimmte Phasenbeziehung für mehrere Punkte der Fokalebene existiert, so dass das Objekt mit dem Strahlabtastverfahren beleuchtet und detektiert werden kann, wobei die gleiche bestimmte Phasenbeziehung für unterschiedliche Strahlablenkwinkel und -abtastwinkel existiert. Der wesentliche Vorteil des Strahlabtastverfahrens liegt in der schnellen Objektdetektion. Eine Alternative zu dem Strahlabtastverfahren wäre ein Objektabtastverfahren, bei dem das Objekt zum Beispiel mäanderförmig durch den Fokus des stationären Beleuchtungsstrahls bewegt wird.
Speziell im Hinblick auf eine Änderung des Zustands des Interferenzmikroskops wird dafür gesorgt, dass mehrere Detektionen axialer Intensitätssignalprofile ausgeführt werden, zum Beispiel um den Beleuchtungszustand in der Objektregion des Interferenzmikroskops zu unterschiedlichen Zeiten zu bestimmen. Vorzugsweise wird dafür gesorgt, dass Detektionen des Intensitätssignalprofils auch während einer Objektdetektion stattfinden. Wenn Licht unterschiedlicher Wellenlängen zum Bestimmen des Beleuchtungszustands in der Objektregion des Interferenzmikroskops verwendet wird, so wird dafür gesorgt, dass eine Detektion eines axialen Intensitätssignalprofils in jedem Fall für das Licht jeder Wellenlänge ausgeführt wird. Jedes Licht einer unterschiedlichen Wellenlänge, das in dem planaren Bereich reflektiert/induziert wird, würde entsprechend einem Detektor zugeordnet und durch diesen detektiert werden. In diesem Fall wäre eine gleichzeitige Detektion des Lichts der unterschiedlichen Wellenlängen möglich. Es wäre ebenso denkbar, das Licht unterschiedlicher Wellenlängen jedes Mal ein und demselben Detektor zuzuführen. In diesem Fall ist nur eine sequenzielle Detektion des Lichts der einzelnen Wellenlängen möglich.
In einem weiteren Verfahrensschritt wird dafür gesorgt, dass das detektierte axiale Intensitätssignalprofil mit Hilfe eines Algorithmus ausgewertet wird. Dieser Algorithmus dient grundsätzlich dem Bestimmen der Phasenbeziehung des Beleuchtungs- oder detektierten Lichts, das in der Objektregion des Interferenzmikroskops vorhanden ist.
Konkret ausgedrückt, wird dafür gesorgt, dass der Algorithmus zuerst den Mittelpunkt des axialen Intensitätssignalprofils bestimmt. Außerdem wird die Höhe des Signals am Mittelpunkt des Intensitätssignalprofils bestimmt.
Zusätzlich oder alternativ könnte der Algorithmus auch die Signalpunkte von zwei Punkten vergleichen, die im gleichen Abstand vom Mittelpunkt des Intensitätssignalprofils entfernt liegen. Die Punkte, die im gleichen Abstand vom Mittelpunkt entfernt liegen, könnten zum Beispiel an der Stelle realisiert werden, an der sich in der 4p-Mikroskopie in der Regel die sekundären Maxima oder die zwei ersten Minima befinden. Es könnte des Weiteren dafür gesorgt werden, dass der Algorithmus die Symmetrie des Intensitätssignalprofils relativ zu seinem Mittelpunkt auswertet.
Schließlich wird dafür gesorgt, dass das Interferenzmikroskop als eine Funktion des Beleuchtungszustands in der Objektregion ausgerichtet wird. Die Ausrichtung des Interferenzmikroskops erfolgt mit dem Ziel der Implementierung einer konstruktiven Interferenz im Beleuchtungsfokus. Für diesen Zweck könnte ein. entsprechendes Steuerungssystem vorgesehen werden. Konkret ausgedrückt, könnte die Ausrichtung eine Änderung der optischen Weglänge eines Strahlwegsegments des Interferometers umfassen. Dies könnte zum Beispiel durch Parallelverschiebung eines entsprechenden Spiegels implementiert werden.
Die oben beschriebenen Detektions- und Ausrichtungsoperationen werden wiederholt und werden mit dem Driftverhalten des Interferenzmikroskops koordiniert. Wenn zum Beispiel auf das Interferenzmikroskop relativ starke Temperaturschwankungen einwirken, so ist eine häufige Wiederholung der Detektions- und Ausrichtungsoperationen erforderlich, um den Beleuchtungszustand im Beleuchtungsfokus in einer solchen Weise zu steuern, dass nahezu ausschließlich eine konstruktive Interferenz vorliegt.
Es gibt verschiedene Wege zur vorteilhaften Verkörperung und Entwicklung der Lehre der vorliegenden Erfindung. Der Leser wird auf die Ansprüche und die Spezifikation weiter unten verwiesen. In den Zeichnungen ist Folgendes dargestellt:
1 zeigt schematisch ein 4p-Mikroskop.
2 zeigt schematisch einem Abschnitt des optischen Strahlweges des 4p-Mikroskops von 1.
3a zeigt ein Diagramm eines axialen Intensitätssignalprofils in einem herkömmlichen konfokalen Elektronenrastermikroskop.
3b zeigt ein Diagramm eines axialen Intensitätssignalprofils eines 4p-Mikroskops im Fall einer konstruktiven Interferenz.
3c zeigt ein Diagramm eines axialen Intensitätssignalprofils eines 4p-Mikroskops im Fall einer destruktiven Interferenz.
4 zeigt schematisch die Region zwischen den zwei Objektiven von 2.
5 zeigt ein Diagramm, bei dem das gemessene axiale Intensitätssignalprofil als eine Funktion der Position einer beschichteten Oberfläche entlang der optischen Achse aufgetragen ist, wobei in diesem Fall konstruktive Interferenz vorliegt.
6 zeigt ein Diagramm, bei dem das gemessene axiale Intensitätssignalprofil als eine Funktion der Position der beschichteten Oberfläche entlang der optischen Achse aufgetragen ist, wobei in diesem Fall destruktive Interferenz vorliegt.
1 zeigt ein Interferenzmikroskop, das als ein 4p- Mikroskop konfiguriert ist. Das Licht von der Lichtquelle 10 verläuft durch die Erregungslochblende 11 und wird durch den dichroitischen Strahlteiler 12 in Richtung der Strahlablenkvorrichtung 13 abgelenkt. Die Strahlablenkvorrichtung 13 tastet den Lichtstrahl in zwei Richtungen ab bzw. steuert den Lichtstrahl in zwei Richtungen, die im Wesentlichen senkrecht zueinander liegen, so dass schlussendlich als ein Ergebnis der Abtastbewegung der Strahlablenkvorrichtung 13 der Beleuchtungsfokus in der Objektregion eine zweidimensionale Region der Fokalebene abtastet, zum Beispiel in mäanderförmiger Weise. Das Interferenzmodul 14, das in 1 nur schematisch gezeigt ist, ist in 2 gezeigt. Hier bezeichnet 8 die Schnittstelle zum Mikroskop, was gleichzeitig eine Ebene darstellt, die der Eintrittspupillenebene des Objektivs des Interferenzmoduls 14 entspricht. Durchgezogene Linien 1 zeigen einen nicht-abgelenkten oder nicht-abgetasteten ausgebreiteten Lichtstrahl an. Der Lichtstrahl 2, der mit durchbrochenen Linien gezeichnet ist, zeigt ein abgelenktes Strahlprofil, das durch die Strahlablenkvorrichtung 13 hervorgebracht wurde. Die Lichtstrahlen 1 und 2 werden durch den Spiegel 3 in Richtung des Strahlteilerwürfels 5 reflektiert. Der Strahlteilerwürfel 5 teilt das Beleuchtungslicht in zwei Teilstrahlen, die jeweils durch den Spiegel 3 in Richtung des Objektivs 6 reflektiert werden. Die zwei Objektive 6 sind auf jeder Seite der Objektebene 26 angeordnet und aufeinander gerichtet. Die Eintrittspupillen 7 der Objektive 6 sind nur schematisch eingezeichnet. Aus der schematisch gezeigten Fokusregion in der Objektebene 26 ist zu erkennen, dass als ein Ergebnis der Strahlablenkung der Lichtstrahl 1, der mit durchgezogenen Linien gezeichnet ist, eine andere seitliche Position der Objektebene 26 beleuchtet als der Lichtstrahl 2, der mit durchbrochenen Linien gezeichnet ist. Linsen 4 dienen dem Verschieben der Eintrittspupillen 7 der Objektive 6, die in dem Interferenzmodul 14 weiter von der Ebene, die der Eintrittspupillenebene des Objektivs 8 entspricht, entfernt liegen, als es bei einem herkömmlichen Mikroskop der Fall wäre. Die Pupillenverschiebung in 2 wird mit Hilfe eines realen Zwischenbildes hervorgerufen. Der Strahlweg, der die in 2 gezeigten optischen Komponenten enthält, ist in einem Modul angeordnet, das an ein herkömmliches Mikroskop angepasst werden kann.
Das fluoreszente Licht, das von dem Objekt reflektiert oder ausgesendet wird und das durch die Objektive gesammelt wird, verläuft entlang des Beleuchtungsstrahlweges in der entgegengesetzten Richtung. Das Licht, das entlang der zwei Strahlwegsegmente 27, 28 des Interferometers verläuft, wird somit am Strahlteiler 5 kombiniert und nach der Reflexion am Spiegel 3 in Richtung der Schnittstelle 8 zum Mikroskop reflektiert. In dem hier vorliegenden konkreten Fall verläuft das fluoreszente Licht, das von dem Objekt ausgesendet wird, ebenfalls durch die Strahlablenkvorrichtung 13 in der entgegengesetzten Richtung und verläuft aufgrund seiner Wellenlängeneigenschaften durch den dichroitischen Strahlteiler 12. Aufgrund der konfokalen Anordnung kann nur fluoreszentes Licht von der Fokusregion der zwei Objektive 6 die Detektionslochblende 15 passieren. Dichroitische Strahlteiler 17, die hinter der Detektionslochblende 15 angeordnet sind, führen das fluoreszente Licht der verschiedenen Fluorochrome, mit denen das Objekt markiert ist, zu den drei Detektoren 16, die jeweils fluoreszentes Licht einer bestimmten Emissionswellenlängenregion detektieren.
3a zeigt ein Intensitätssignalprofil eines herkömmlichen konfokalen Elektronenrastermikroskops als eine Funktion der Z-Koordinate oder der axialen Richtung entlang der optischen Achse. Ein Intensitätssignalprofil dieser Art kann zum Beispiel unter Verwendung einer fluoreszenten Schicht detektiert werden, die in der Objektebene 26 angeordnet ist, wenn nur das Strahl-Wegsegment 28 des Interferometers für die Beleuchtung und für die Detektion verwendet wird. 3b zeigt ein axiales Intensitätssignalprofil als eine Funktion der Z-Koordinate oder der axialen Richtung eines doppelkonfokalen Elektronenrastermikroskops oder eines 4p-Mikroskops. An der Fokusposition (die mit einer Punkt-Strich-Linie dargestellt ist) der zwei Objektive 6 hat das axiale Intensitätsprofil von 3b ein Hauptmaximum. Aufgrund der Entstehung eines Beleuchtungsinterferenzmusters des Interferenzmoduls 14 entstehen zusätzlich zum Hauptmaximum zwei sekundäre Maxima von geringerer Intensität, die jeweils ungefähr λ/2 axial in jeder Richtung versetzt sind. Das in 3b gezeigte axiale Intensitätssignalprofil ist ein Signalprofil, das sich aus dem Vorhandensein konstruktiver Interferenz ergibt. In diesem Fall ist die Phasenbeziehung des Beleuchtungslichts, das entlang der zwei Interferenzstrahlwegsegmente 27, 28 verläuft, annähernd so konfiguriert, dass sich die zwei fokussierten Teilstrahlen einander exakt in der Objektebene 26 verstärken.
3c zeigt ebenfalls ein axiales Intensitätssignalprofil als eine Funktion der Z-Koordinate oder der axialen Richtung, bei dem destruktive Interferenz vorliegt. Die Phasenbeziehung des Beleuchtungslichts, das entlang der zwei Strahlwegsegmente 27, 28 des Interferometers verläuft, ist daher so konfiguriert, dass ihre Amplituden einander in der Objektebene exakt auslöschen, so dass ein Minimum an der Z-Position vorhanden ist, das mit einer Punkt-Strich-Linie markiert ist.
4 zeigt die Region zwischen den zwei Objektiven 6 in Vergrößerung. Aus 4 ist zu erkennen, dass das zu untersuchende Objekt in einer Region zwischen zwei Objektträgern 22, die als Deckgläser konfiguriert sind, angeordnet ist, welche die Objektregion 23 begrenzen. In jedem Fall ist ein Immersionsmedium 24 zwischen den Deckgläsern 22 und dem Objektiv 6 vorhanden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist zum Bestimmen des Beleuchtungszustands in der Objektregion 23 des Interferenzmikroskops mindestens eine Oberfläche 29 eines Deckglases 22 so konfiguriert, dass sie durch Lichtmikroskopie detektiert werden kann. In diesem Kontext wird das Licht, das an der Oberfläche 29 reflektiert/induziert wird, durch den Detektor 16 detektiert.
Die Oberfläche 29 ist von teilweise reflektierender Konfiguration. Zu diesem Zweck ist die Oberfläche mit einer metallischen Beschichtung 25 versehen und hat einen konstanten Remissionsgrad. Zwei Schichten, die zum Fluoreszieren angeregt werden können (nicht gezeigt) und die jeweils in Form einer Monoschicht konfiguriert sind, sind auf die metallische Beschichtung 25 aufgebracht. Die zwei fluoreszenten Monoschichten haben unterschiedliche fluoreszente Eigenschaften. Die zwei fluoreszenten Schichten werden jeweils mit Licht von einer Lichtquelle 10 zum Fluoreszieren angeregt. Das an der Oberfläche reflektierte und induzierte Licht wird mit Detektoren 16 des Interferenzmikroskops detektiert. Diese Detektion ist eine konfokale Detektion, wobei die Detektionslochblende 15 vor den Detektoren 16 angeordnet ist. Die Detektionslochblende 15 ist in einer Ebene angeordnet, die der Objektebene 26 der Objektive 6 entspricht. Die zwei Objektträger 22 sind Deckgläser, von denen nur eines eine Beschichtung 25 aufweist. Diese Beschichtung wird auf die Oberfläche des Deckglases aufgebracht, die dem Objekt zugewandt ist.
Im Hinblick auf das Verfahren erfolgt die Bestimmung des Beleuchtungszustands in der Objektregion 23 des Interferenzmikroskops auf der Basis des Lichts, das an der Oberfläche 29 reflektiert und induziert wird, durch Messung eines Intensitätssignalprofils als eine Funktion der axialen Position der Oberfläche 29. Zu diesem Zweck wird das Objekt zusammen mit Deckgläsern 22 entlang der optischen Achse der Objektive 6 bewegt, und das an der Oberfläche 29 reflektierte und induzierte Licht wird durch die Detektoren 16 detektiert.
Das axiale Intensitätssignalprofil wird in einer solchen Weise detektiert, dass zuerst das Objekt zusammen mit den Deckgläsern 22 so positioniert wird, dass die Oberfläche 29 des einen Deckglases 22 in der Fokusregion der Objektive 6 angeordnet ist. Es wird veranlasst, dass mehrere axiale Intensitätssignalprofile an mehreren Punkten in der Fokalebene oder Objektebene 26 detektiert werden. Die verschiedenen Punkte in der Fokalebene erhält man mittels einer Strahlabtastung, die durch die Strahlablenkvorrichtung 13 erzeugt wird.
Da die Oberfläche 29 des Deckglases 22 mit einer einzelnen teilweise reflektierenden Schicht und zwei unterschiedlichen fluoreszenten Schichten beschichtet ist, erfolgt eine Detektion eines axialen Intensitätssignalprofils mit jedem der Detektoren 16 gleichzeitig. Zum Beispiel wird das Beleuchtungslicht, das an der teilweise reflektierenden Beschichtung 25 reflektiert wird, zum ersten Detektor 16 geleitet; das fluoreszente Licht der einen fluoreszenten Schicht wird zum zweiten Detektor 16 geleitet; und das fluoreszente Licht der zweiten fluoreszenten Schicht wird an den dritten Detektor 16 geleitet. Das Licht von der Lichtquelle 10, das dazu dient, die fluoreszenten Schichten zu beleuchten und anzuregen, enthält Licht der Wellenlängen 488 nm und 647 nm. Der erste Detektor 16 detektiert entsprechend das Licht mit der Wellenlänge 488 nm, das an der reflektierenden Beschichtung 25 reflektiert wird. Das Beleuchtungslicht mit der Wellenlänge 488 nm regt die erste fluoreszente Schicht zum Fluoreszieren an; und das Beleuchtungslicht mit der Wellenlänge 647 nm regt die zweite fluoreszente Schicht zum Fluoreszieren an.
5 zeigt in einem Diagramm ein gemessenes axiales Intensitätssignalprofil des ersten Detektors 16, der das Licht mit der Wellenlänge 488 nm detektiert, das an der reflektierenden Beschichtung 25 reflektiert wird. Das axiale Intensitätssignalprofil ist als eine Funktion der Z-Koordinate oder der optischen Achse dargestellt und ist in Einheiten der verwendeten Wellenlänge aufgetragen. Die Z-Koordinate 0 entspricht der Objektebene 26. Das in 5 gezeigte gemessene Intensitätssignalprofil entspricht konstruktiver Interferenz; d. h. in der Objektebene 26 addieren sich die Amplituden des Beleuchtungslichts, das entlang den Strahlwegsegmenten 27, 28 des Interferometers verläuft, konstruktiv zu einem Maximum. Das könnte genau der Fall sein, wenn die optischen Weglängen der Strahlwegsegmente 27, 28 des Interferometers von exakt gleicher Länge sind. Das könnte ebenfalls der Fall sein, wenn sich die Differenzen der optischen Weglänge zwischen den zwei Strahlwegsegmenten 27, 28 des Interferometers um ein Mehrfaches von λ/2 unterscheiden. Das in 5 gezeigte gemessene axiale Intensitätssignalprofil stellt das Licht dar, das von der Beschichtung 25 reflektiert und durch den Detektor 16 detektiert wird und das aus einer reflektierten und einer durchgelassenen Komponente besteht, die im Moment der Detektion addiert werden. Der Remissionsgrad der Beschichtung 25 beträgt hier 0,05. Da das in 5 gezeigte axiale Intensitätssignalprofil reflektiertes Licht betrifft, erfährt dieses Licht eine doppelte Weglängendifferenz, da das Licht aufgrund der Reflexion die doppelte Distanz zurücklegt. Wenn die geometrische Weglängendifferenz zwischen einem Strahlwegsegment des Interferometers und dem anderen λ/2 beträgt, kommt es darum zu konstruktiver Interferenz, wie in 5 gezeigt. Wenn die geometrische Weglängendifferenz zwischen den Strahlwegsegmenten 27, 28 des Interferometers nur λ/4 beträgt, so kommt es am Detektor zu destruktiver Interferenz, wie in 6 gezeigt. Im Fall einer fluoreszenten Anregung einer fluoreszenten Schicht wird jedoch eine destruktive Interferenz erhalten, wenn die Differenz der optischen Weglänge zwischen den zwei Strahlwegsegmenten 27, 28 des Interferometers λ/2 beträgt.
In besonders vorteilhafter Weise werden die gemessenen axialen Intensitätssignalprofile des reflektierten Lichts und der zwei unterschiedlichen fluoreszenten Schichten gleichzeitig gemessen und gemeinsam der Analyse zugeführt. Da die gemessenen Signale von Licht unterschiedlicher Wellenlängen abgeleitet werden, ist es dadurch praktisch möglich, in besonders vorteilhafter Weise einen absoluten Abgleich der optischen Weglängen der zwei Strahlwegsegmente 27, 28 des Interferometers vorzunehmen, weil es nur mit einer absoluten Weglängendifferenz von 0 geschehen kann, dass das Licht der unterschiedlichen Wellenlängen in gleichmäßig konstruktiver Weise interferiert, sofern die Wellenlängen keine rationalzahligen Mehrfachen voneinander sind. In diesem Fall würde ein 4p-Mikroskop vom Typ C implementiert werden, und zwar eines, bei dem konstruktive Interferenz des Beleuchtungslichts und konstruktive Interferenz des detektierten Lichts vorliegt, wodurch die axiale Auflösung optimiert wird.
Die axialen Intensitätssignalprofile werden unter Verwendung eines Algorithmus' ausgewertet. Dieser Algorithmus bestimmt einerseits die Höhe des Signals am Mittelpunkt des Intensitätssignalprofils, der sich im Fall der gemessenen Intensitätssignalprofile der 5 und 6 an der axialen Position 0 befindet. Der Algorithmus vergleicht des Weiteren die Signalhöhen von zwei Punkten im gleichen Abstand vom Mittelpunkt des Intensitätssignalprofils. Die Punkte im gleichen Abstand vom Mittelpunkt an der Z-Koordinate 0 befinden sich an den Z-Koordinaten λ/2, –λ/2, d. h. genau dort, wo die ersten sekundären Maxima der konstruktiven Interferenzphänomene, die in 3b gezeigt sind, eintreten sollten.
Das Interferenzmikroskop wird als eine Funktion des Beleuchtungszustands in der Objektregion ausgerichtet. Zu diesem Zweck ist ein Steuerungssystem vorhanden, das während des Vorgangs des Messens der axialen Intensitätssignalprofile die optischen Weglängen der Strahlwegsegmente 27 des Interferometers in einer solchen Weise modifiziert, dass die gemessenen axialen Intensitätssignalprofile ein Signalprofil aufweisen, das für konstruktive Interferenz typisch ist, zum Beispiel wie in 5 gezeigt. Diese Detektions- und Ausrichtungsabläufe werden wiederholt ausgeführt und werden mit dem Driftverhalten des Interferenzmikroskops und insbesondere mit dem Driftverhalten des Interferenzmoduls 14 koordiniert.

Claims

Interferenzmikroskop, das Folgendes aufweist: – eine Lichtquelle (10), die Beleuchtungslicht aussendet; – zwei Objektive (6), die auf jeder Seite eines Objekts (23) entlang einer optischen Achse angeordnet sind; – einen Strahlteilerwürfel (5), der das Beleuchtungslicht in zwei Teilstrahlen teilt, von denen jeder auf jedes Objektiv (6) gerichtet ist; – einen Objektträger, wobei der Objektträger durch zwei Deckgläser (22) definiert wird, zwischen denen das Objekt gehalten wird, dadurch gekennzeichnet, dass: – mindestens eine planare Oberfläche eines Deckglases (22), die dem Objekt zugewandt ist, mit mindestens einer reflektierenden oder lumineszenten Beschichtung (25, 29) versehen ist; und – mindestens einen Detektor (16), der dafür geeignet ist, ein Lichtintensitätssignalprofil als eine Funktion der Z-Koordinate der Beschichtung (25, 29) in der Richtung der optischen Achse zu messen, wobei das Licht, das an der Beschichtung (25, 29) reflektiert und/oder ausgesandt wird, detektiert wird; und – wobei das Mikroskop dafür konfiguriert ist, anhand eines Intensitätssignalprofils als eine Funktion der Z-Koordinate entlang der optischen Achse eine Fokusposition der zwei Objektive (6) zu bestimmen.
Interferenzmikroskop nach Anspruch 1, wobei das Mikroskop aus einem 4π-Mikroskop, einem Stehwellenfeldmikroskop, einem I²M-, I³M- oder I⁵M-Mikroskop besteht.
Interferenzmikroskop nach Anspruch 1, wobei die Beschichtung (25, 29) einen bestimmten Remissionsgrad aufweist, der vorzugsweise konstant ist, und die Beschichtung (25, 29) in einer wellenlängenabhängigen Weise so konfiguriert ist, dass Licht mindestens einer Wellenlänge reflektiert wird.
Interferenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens eine Beschichtung (25, 29) auf der Oberfläche eines Deckglases (22) mindestens eine Schicht ist, die zum Lumineszieren, insbesondere zum Fluoreszieren, angeregt werden kann.
Interferenzmikroskop nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei an der mindestens einen planaren Beschichtung (25, 29) auf der Oberfläche eines Deckglases (22) mittels nicht-linearer Prozesse Licht induziert werden kann.
Interferenzmikroskop nach Anspruch 1, wobei eine Lochblende (15) vor dem Detektor (16) angeordnet ist.
Interferenzmikroskop nach Anspruch 6, wobei die Lochblende (15) in einer Ebene angeordnet ist, die der Objektebene (26) eines Objektivs (6) entspricht.
Verfahren zum Bedienen eines Interferenzmikroskops mit zwei Objektiven (6), das folgende Schritte aufweist: – Erzeugen von Beleuchtungslicht mit einer Lichtquelle (10); – Anordnen des Objekts (23) zwischen den zwei Objektiven (6), wobei die Objektive entlang einer optischen Achse angeordnet sind; – Bereitstellen eines Objektträgers, wobei der Objektträger durch zwei Deckgläser (22) definiert wird, zwischen denen das Objekt gehalten wird, – Positionieren des Objekts zusammen mit den zwei Deckgläsern (22) in einer solchen Weise, dass mindestens eine reflektierende oder lumineszente Beschichtung (25, 29) auf mindestens einer planaren Oberfläche eines Deckglases (22) in der Fokusregion eines Objektivs des Interferenzmikroskops angeordnet ist, und – Messen eines Intensitätssignalprofils als eine Funktion der Z-Koordinate der Beschichtung (25, 29) entlang der optischen Achse, wobei das Licht, das an der Beschichtung (25, 29) reflektiert und induziert wird, detektiert wird; und – Bestimmen einer Fokusposition der zwei Objektive (6) anhand eines Intensitätssignalprofils als eine Funktion der Z-Koordinate entlang der optischen Achse.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Interferenzmikroskop ein 4π-Mikroskop, ein Stehwellenfeldmikroskop oder ein I²M-, I³M- oder I⁵M-Mikroskop ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei zum Detektieren des axialen Intensitätssignalprofils das Objekt zusammen mit den Deckgläsern (22) entlang der optischen Achse der Objektive (6) bewegt wird und das Licht, das durch die mindestens eine Beschichtung (25, 29) reflektiert und/oder ausgesendet wird, in diesem Kontext detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei am Beginn der Detektion des Intensitätssignalprofils das Objekt zusammen mit den Deckgläsern (22) in einer solchen Weise positioniert wird, dass die mindestens eine Beschichtung (25, 29) des Deckglases (22) in der Fokusregion des Objektivs (6) des Interferenzmikroskops angeordnet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Interferenzmikroskop als eine Funktion des Beleuchtungszustands des Objekts ausgerichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Ausrichtung des Interferenzmikroskops in einer solchen Weise erfolgt, dass konstruktive Interferenz im Beleuchtungsfokus vorliegt, vorzugsweise unter Verwendung eines entsprechenden Steuerungssystems.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Detektions- und Ausrichtungsvorgänge wiederholt werden und mit dem Driftverhalten des Interferenzmikroskops koordiniert werden.