DE60126337T2

DE60126337T2 - Verfahren zum screenen für gpr40-liganden

Info

Publication number: DE60126337T2
Application number: DE60126337T
Authority: DE
Inventors: Leon John Reseach Triangle Park ANDREWS; Patricia Celia Research Triangle Park BRISCOE; Michelle Diane Research Triangle Park IGNAR; Isobel Alison Brentford MUIR; Ray Jr. Howard Research Triangle Park SAULS; Mohammad Brentford TADAYYON
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd; Glaxo Group Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; Glaxo Group Ltd
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2021-12-19
Also published as: EP1354200B1; AU2002246702A1; DE60126337D1; WO2002057783A2; ATE352784T1; EP1354200A2; WO2002057783A3; ES2280427T3; GB0031527D0

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft die Identifizierung eines Liganden für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) und seine Verwendung in Durchmusterungsverfahren und in der rationellen Wirkstoffentwicklung zur Identifizierung von Antagonisten und Agonisten des Rezeptors.
Hintergrund
Die Membranproteingen-Superfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) wird dadurch gekennzeichnet, dass sie 7 mutmaßliche Transmembrandomänen besitzt. Es wird angenommen, dass die Domänen Transmembran-α-Helices darstellen, die durch extrazelluläre und cytoplasmatische Schleifen verbunden sind. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren schließen einen weiten Bereich von biologisch aktiven Rezeptoren ein, wie z.B. Hormon-, virale, Wachstumsfaktor- und Neurorezeptoren.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden dadurch gekennzeichnet, dass sie diese 7 konservierten hydrophoben Abschnitte mit ca. 20 bis 30 Aminosäuren einschließen, wobei wenigstens 8 divergente hydrophile Schleifen verbunden werden. Die G-Proteinfamilie von gekoppelten Rezeptoren schließt Dopaminrezeptoren ein, die an neuroleptische Wirkstoffe binden, die zur Behandlung von psychotischen und neurologischen Störungen verwendet werden. Andere Beispiele für Mitglieder dieser Familie schließen ohne Beschränkung Calcitonin-, adrenerge, Endothelin-, cAMP-, Adenosin-, Muscarin-, Acetylcholin-, Serotonin-, Histamin-, Thrombin-, Kinin-, follikelstimulierende Hormon-, Opsin-, endotheliale Differenzierungsgen-1-, Rhodopsin-, Duft- und Cytomegalovirus-Rezeptoren ein.
Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren haben einzelne konservierte Cysteinreste in jeder der ersten zwei extrazellulären Schleifen, die Disulfidbindungen bilden, von denen angenommen wird, dass sie die funktionelle Proteinstruktur stabilisieren. Die 7 Transmembranregionen werden als TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 und TM7 bezeichnet. TM3 wurde mit der Signaltransduktion in Verbindung gebracht.
Die Phosphorylierung und Lipidierung (Palmitylierung oder Farnesylierung) von Cysteinresten kann die Signaltransduktion einiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren beeinflussen. Die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren enthalten potentielle Phosphorylierungsstellen innerhalb der dritten cytoplasmatischen Schleife und/oder innerhalb des Carboxy-Terminus. Für mehrere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren wie den B-Adrenorezeptor vermittelt die Phosphorylierung durch Proteinkinase A und/oder spezifische Rezeptorkinasen eine Rezeptordesensibilisierung.
Für einige Rezeptoren wird angenommen, dass die Ligandenbindungsorte der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren einen hydrophilene Anschluss umfassen, der durch mehrere G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Transmembrandomänen gebildet wird, wobei der Anschluss von hydrophoben Resten der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren umgeben ist. Es wird postuliert, dass die hydrophile Seite jeder G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Transmembranhelix nach innen zeigt und einen polaren Ligandenbindungsort bildet. TM3 wurde mit mehreren G-Protein-gekoppelten Rezeptoren als einen Ligandenbindungsort, wie z.B. der TM3-Aspartatrest, aufweisend in Verbindung gebracht. TM5-Serine, ein TM6-Asparagin und TM6- oder TM7-Phenylalanine oder -Tyrosine werden ebenfalls mit der Ligandenbindung in Verbindung gebracht.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren können intrazellulär durch heterotrimere G-Proteine an verschiedene intrazelluläre Enzyme, Ionenkanäle und Transporter gekoppelt werden (s. Johnson et al., Endoc. Rev., (1989) 10: 317-331). Unterschiedliche G-Protein-A-Untereinheiten stimulieren vorzugsweise besondere Effektoren zur Modulierung verschiedener biologischer Funktionen in einer Zelle. Die Phosphorylierung von cytoplasmatischen Resten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wurde als ein wichtiger Mechanismus für die Regulierung der G-Protein-Kopplung einiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren identifiziert. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren werden an zahlreichen Orten innerhalb eines Säugetierwirtes gefunden.
In den vergangenen 15 Jahren wurden beinahe 150 therapeutische Mittel, die auf 7-Transmembran-(7-TM)-Rezeptoren abzielen, erfolgreich im Markt eingeführt, wodurch ihr Wert als therapeutische Ziele etabliert wurde.
Zusammenfassung
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern einer Testverbindung zur Bestimmung, ob die Verbindung ein GPR40-Rezeptorligand ist. Das Verfahren umfasst das Detektieren, ob die Testverbindung kompetitiv die Bindung eines Fettsäure-GPR40-Liganden an einen GPR40-Rezeptor inhibiert, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand eine gesättigte oder ungesättigte C₆-C₂₃-Fettsäure ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Testzelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reporterkonstrukt enthält, das ein Gq-reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Die Testzelloberfläche wird einem GPR40-Fettsäureagonisten unter Bedingungen ausgesetzt, die die Bindung eines GPR40-Fettsäureagonisten erlauben, und dann einer Testverbindung ausgesetzt. Jedes durch das Reportergen erzeugte detektierbare Signal wird gemessen und mit dem detektierbaren Signal verglichen, dessen Erzeugung erwartet wird, falls die Zelle nur dem GPR40-Agonisten ausgesetzt würde. Eine Abnahme des detektierbaren Signals zeigt an, dass die Testverbindung ein GPR40-Antagonist ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reportkonstrukt enthält, das ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Das reagierende Transkriptionselement kann ein Gi-reagierendes Transkriptionselement, ein Gq-reagierendes Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement sein. Die Testverbindung wird mit der Zelloberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bindung eines GPR40-Liganden an den GPR40-Rezeptor erlauben, und die Reportgenexpression wird detektiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reporterkonstrukt enthält, das ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Das reagierende Transkriptionselement kann ein Gi-reagierendes Transkriptionselement, ein Gq-reagierendes Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement sein. Die Zelloberfläche wird mit einer Testverbindung und einem GPR40-Agonisten unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bindung eines GPR40-Liganden an den GPR40-Rezeptor erlauben, und die Reportergenexpression wird detektiert. Eine verringerte Reportergenexpression in Gegenwart von sowohl Testverbindung als auch Agonist im Vergleich mit der Reportergenexpression in Gegenwart nur des GPR40-Agonisten zeigt an, dass die Testverbindung ein GPR40-Antagonist ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität, worin das Verfahren das Detektieren umfasst, ob eine Testverbindung die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung aus oder Produktion durch Säugetier-Pankreas-β-Zellen in Gegenwart eines GPR40-Agonisten verringert, verglichen mit der Glucose-stimulierten Insulinfreisetzung, die aufgrund der Gegenwart des GPR40-Agonisten auftreten würde.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität, das das Detektieren umfasst, ob die Verbindung an GPR40 bindet und die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung aus oder Produktion durch Säugetier-Pankreas-β-Zellen erhöht.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Calciumreaktion (gemessen durch Fluoreszenzveränderung) von GPR40 auf die Fettsäure Elaidinsäure in HEK-293-Zellen, die transient entweder GPR40, den 7TM-Rezeptor GPRW oder den 7TM-Rezeptor HLTEX11 exprimieren.
2 zeigt die Ergebnisse von Tests unter Verwendung von transient transfizierten Melanophoren zur Bestimmung der G-Protein-Kopplung von GPR40. Zunehmende Mengen von transfizierter GPR40-DNA erzeugten eine Zunahme der Gα_i/Gα_o-Aktivität, was anzeigt, dass eine konstitutive Aktivität von GPR40 durch Gα_i erfolgt.
3a zeichnet die x-fache Reaktion von CHO-Zellen auf, die CRE-Luciferase humanes GPR40 exprimieren; es gab keine Zunahme der im CRE-System detektierten Reporteraktivität bei jeglicher Dosis von GPR40-Expressionsvektor.
3b zeichnet die x-fache Reaktion von CHO-Zellen auf, die CRE-Luciferase humaner GS-gekoppelter Rezeptor exprimieren; es gab eine signifikante Zunahme der mit zunehmenden Dosen von Expressionsvektor detektierten Luciferaseaktivität.
3c zeichnet die Wirkung von Calcitonin und Eicosatriinsäure auf die Luciferaseaktivität von CHO-Zellen auf, die CRE-Luciferase humanes GPR40 exprimieren, oder von CHO-Zellen, die CRE-Luciferase ohne Rezeptor exprimieren. Die Luciferaseproduktion nahm durch Calcitonin sowohl in den Zellen, die nur Reporter enthielten, als auch in den Zellen, die GPR40 enthielten, zu, wohingegen kein signifikanter Effekt von 5,8,11-Eicosatriinsäure bei jeglicher getesteter Konzentration detektiert wurde.
4A zeigt Veränderungen der L-alpha-Lysophosphatidsäure-(LPA)-stimulierten Reporteraktivität mit und ohne Pertussistoxin-(PTX)-Behandlung. Wirtszellen bestanden aus CHO-Zellen, die GAL4/Elk-1-Luciferase-Reporterkonstrukte enthielten. 3G8 und 5F6 sind klonale CHO-Zelllinien, die mit humanem GPR40 transfiziert sind und GAL4/Elk-1-Luciferase-Reportkonstrukt enthalten. Die Luciferaseproduktion in Wirtszellen aufgrund von LPA-Stimulation wurde durch Pertussistoxin-Behandlung aufgehoben.
4B zeigt Veränderungen der 5,8,11-Eicosatriinsäure-stimulierten Reporteraktivität mit und ohne Pertussistoxin-(PTX)-Behandlung. Die Zellen sind wie für 4A beschrieben. Die Luciferaseproduktion aufgrund von 5,8,11-Eicosatriinsäure-Stimulation war in Zellen erhöht, die GPR40 transfiziert waren, und wurde nicht durch Pertussistoxin-Behandlung gehemmt.
4C zeigt Veränderungen der Thrombin-stimulierten Reporteraktivität mit und ohne Pertussistoxin-(PTX)-Behandlung. Die Zellen sind wie für 4A beschrieben. Die Luciferaseproduktion aufgrund von Thrombin-Stimulation war nur teilweise abgeschwächt nach Pertussistoxin-Behandlung.
4D zeigt die prozentuale Inhibierung der Luciferase-Aktivität nach Pertussistoxin-Behandlung in CHO-Zellen, die nur GAL4/ELK-1-Luciferase exprimieren (Wirtszelle), und in 5 unterschiedlichen CHO-Zellklonen, die GAL4/ELK1-Luciferase und humanes GPR40 exprimieren.
4E zeigt Basis-Luciferasezahlen aus CHO-Zellen, die nur GAL4/ELK1-Luciferase exprimieren (Wirtszelle), und aus unterschiedlichen CHO-Zellklonen, die GAL4/ELK1-Luciferase und humanes GPR40 exprimieren, entweder mit oder ohne Pertussistoxin-Behandlung. Mit GPR40-Expressionskonstrukt und ELK-Gal4-Reporter transfizierte Klone wiesen eine erhöhte Basis-Reporteraktivität verglichen mit derjenigen der Wirtszelllinie auf, aber diese war um bis zu 70% nach Pertussistoxin-Behandlung verringert.
Ausführliche Beschreibung
GPR40 ist ein vor kurzem beschriebener seltener G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der während einer Suche nach neuen Rezeptoren isoliert wurde (Sawzdargo, M. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 239 (2), 543-547). Die Polynukleotidsequenz von humanem GPR40 (GenBank-Eingansnummer NM_005303) ist hier in SEQ ID NO: 1 angegeben, und die Aminosäuresequenz des dadurch kodierten Polypeptids ist hier in SEQ ID NO: 2 angegeben.
Vor noch neuerer Zeit wurde ein Mäuse-GPR40-Ortholog kloniert und sequenziert (US-Patentanmeldung Nr. 60/234,253, SmithKline Beecham). Die Polynukleotidsequenz von Mäuse-GPR40 wird hier in SEQ ID NO: 3 angegeben, und das dadurch kodierte Polypeptid hat die vorliegende Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem ungewöhnlichen und unerwarteten Befund, dass der humane GPR40-Rezeptor spezifisch durch sowohl gesättigte als auch ungesättigte Fettsäure aktiviert wird. Ferner wurde gezeigt, dass GPR40 in der menschlichen Bauchspeicheldrüse exprimiert wird, spezifisch in den β-Zellen der Langerhansschen Inseln.
Die vorliegenden Erfinder stellten fest, dass der GPR40-Rezeptor konstitutiv durch ein Pertussistoxin-empfindliches G-Protein wirken kann. Sowohl Gi- als auch Go-Proteine (und Subtypen davon) sind als Pertussistoxin-empfindlich bekannt. Jedoch führten die vorliegenden Erfinder weitere Untersuchungen zur Feststellung durch, dass Fettsäuren GPR40-Liganden sind, die über Gq-Protein (Pertussistoxin-unempfindliches G-Protein) wirken.
Viele Studien haben gezeigt, dass die akute Behandlung von Langerhansschen Inseln mit Fettsäuren (1-3 Stunden) die Glucose-stimulierte Insulinsekretion stimuliert, wohingegen längere Behandlungszeiträume (6-24 Stunden) inhibitorisch für die Glucose-stimulierte Insulinsekretion sind (Warnotte C. et al. (1994), Diabetes 43(5): 703-7111; Zhou YP. et al. (1996), Metabolism: Clinical & Experimental, 45(8): 981-986). Es gibt zunehmende Beweise, die zeigen, dass eine Zunahme der Plasma-Fettsäurespiegel nachteilig für die β-Zellfunktion sein kann (Lipotoxizität). Studien in den ZDF-Ratten, die häufig als Modell für Diabetes verwendet werden, haben gezeigt, dass erhöhte Spiegel von Fettsäuren im Kreislauf zur Produktion von Ceramid, Aktivierung von Stickoxidsynthase und Apoptose von β-Zellen führen (Shimabukuro M. et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2498-2502). Wir haben festgestellt, dass die Expression von GPR40 in humanen Langerhansschen Inseln um das 2- bis 100-fache (4 individuelle Proben analysiert) für einen äquivalenten RNA-Eingang im Vergleich mit humaner vollständiger Bauchspeicheldrüsen-RNA angereichert ist. Diese Gewebelokalisierung legt nahe, dass der Rezeptor eine Rolle in der β-Zellfunktion haben kann. Der Befund, dass Fettsäuren Liganden für GPR40 sind, kann in der Aufklärung der GPR40-Funktion in den β-Zellen helfen. Eine Konsequenz der akuten Rezeptoraktivierung kann deshalb die Steigerung der Glucose-stimulierten Insulinsekretion sein, wohingegen man erwarten kann, dass längere Zeiträume zu Abnahmen der Glucose-stimulierten Insulinsekretion und von Genen führen, die mit Glucoseempfindlichkeit von β-Zellen verbunden sind, z.B. Glucokinase. Auf dieser Basis ist es möglich, dass entweder Agonisten oder Antagonisten für GPR40 von therapeutischem Wert für Diabetes und insbesondere für Typ II-Diabetes sein können. Man kann deshalb erwarten, dass die Behandlung mit einem GPR40-Agonisten die Glucose-stimulierte Insulinsekretion auf β-Zellen kurzfristig erhöht. GPR40-Antagonisten können von therapeutischem Wert in Bezug auf mögliche Reduktionen der Lipotoxizität sein und somit zur Verbesserung der β-Zellfunktion wirken.
Diese Identifizierung von Fettsäuren als Liganden für GPR40 erleichtert deshalb die Entwicklung von Durchmusterungsverfahren zum Identifizieren von Agonisten und Antagonisten des Rezeptors.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereit, die an den GPR40-Rezeptor binden und ihn aktivieren (Agonist) oder seine Aktivierung inhibieren (Antagonist), wobei das Verfahren die Verwendung von GPR40 in Kombination mit Fettsäure-GPR40-Liganden von gesättigten oder ungesättigten C₆-C₂₃-Fettsäure, die ggf. bis zu 6 Alken- oder 3 Acetylenbindungen, ggf. cyclisch oder verzweigt, und ggf. substituiert mit 1 bis 3 Hydroxygruppen, umfasst.
Wie hier verwendet, bezeichnet „GPR40" ein Rezeptorpolypeptid mit wenigstens 95% Identität mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptidsequenz und mit GPR40-Funktion; GPR40-Rezeptorpolypeptide, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, stammen bevorzugt aus Säugern und sind besonders bevorzugt human. GPR40 bezeichnet auch Derivate des Rezeptors, die in den hier offenbarten Durchmusterungs- und rationalen wirkstoffentwicklungsverfahren nützlich sind. Solche Derivate schließen Teile des Polypeptids auf SEQ ID NO: 2 ein, die Ligandenbindungsfunktion bewahren.
Bevorzugt ist der Fettsäureligand aus der Gruppe ausgewählt, die aus folgenden Mitgliedern besteht:

1) trans-Retinolsäure (Vitamin A-Säure; Tretinoin) C₂₀H₂₈O₂ (unges.)
2) cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure C₂₂H₃₂O₂ (unges.)
3) Palmitinsäure C₁₆H₃₂O₂ (ges.)
4) Pentadecansäure C₁₅H₃₀O₂ (ges.)
5) Elaidinsäure C₁₈H₃₄O₂ (unges.)
6) Petroselinsäure C₁₈H₃₄O₂ (unges.)
7) Heptadecansäure C₁₇H₃₄O₂ (ges.)
8) Tridecansäure C₁₃H₂₆O₂ (ges.)
9) Laurinsäure (Dodecansäure) C₁₂H₂₄O₂ (ges.)
10) Arachidonsäure C₂₀H₃₂O₂ (unges.)
11) Linolensäure C₁₈H₃₀O₂ (unges.)
12) Palmitoleinsäure C₁₆H₃₀O₂ (unges.)
13) Caprinsäure C₁₀H₂₀O₂ (ges.)
14) Myristinsäure C₁₄H₂₈O₂ (ges.)
15) Stearinsäure C₁₈H₃₆O₂ (ges.)
16) Undecansäure C₁₁H₂₂O₂ (ges.)
17) Eicosatriinsäure

In dieser Liste bezeichnet „ges." eine gesättigte und „unges." eine ungesättigte Fettsäure.
Wie hier nachfolgend verwendet, wird der Begriff „Fettsäureligand" als ein Fettsäureligand der Erfindung definiert, wobei der Ligand eine gesättigte oder ungesättigte C₆-C₂₃-Fettsäure ist, die ggf. bis zu 6 Alken- oder 3 Acetylenbindungen enthält, ggf. cyclisch oder verzweigt und ggf. mit 1 bis 3 Hydroxygruppen substituiert.
Unter Verwendung der Verfahren der Erfindung identifizierte Verbindungen können nützlich in der Behandlung von Typ II-Diabetes (nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus, NIDDM) und Fettsucht, Glucoseintoleranz, Insulinresistenz, neurodegenerativer Krankheit (z.B. Alzheimer-Krankheit) und anderen Indikationen wie Schlaganfall sein.
In einer ersten Ausführungsform kann ein Agonist oder Antagonist von GPR40 durch In-Kontakt-Bringen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche den Rezeptor GPR40 exprimiert, wobei der Rezeptor mit einer zweiten Komponente assoziiert ist, die ein detektierbares Signal als Reaktion auf die Bindung einer Verbindung an den Rezeptor liefern kann, mit einer zu durchmusternden Verbindung unter Bedingungen, die die Bindung an den Rezeptor erlauben; und durch Bestimmung, ob die Verbindung an den Rezeptor bindet und ihn aktiviert oder inhibiert, durch Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines Signals identifiziert werden, das aus der Wechselwirkung der Verbindung mit dem Rezeptor erzeugt wird, ggf. in Gegenwart von markiertem oder unmarkiertem Ligand, z.B. einem Fettsäureligand.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein Agonist oder Antagonist von GPR40 durch Bestimmen der Inhibierung der Bindung eines Liganden (z.B. eines Fettsäureliganden) an Zellen, die den GPR40-Rezeptor auf ihrer Oberfläche aufweisen, oder mit Zellmembranen, die den Rezeptor enthalten, in Gegenwart einer Kandidatenverbindung und unter Bedingungen identifiziert werden, die die Bindung an den Rezeptor erlauben. Durch Bestimmung der an den Rezeptor gebundenen Ligandenmenge wird eine Verbindung, die eine Reduzierung der Bindung eines Liganden verursachen kann, als Agonist oder Antagonist von GPR40 identifiziert.
Allgemein beinhalten solche Durchmusterungsverfahren das Bereitstellen geeigneter Zellen, die GPR40 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Solche Zellen schließen Zellen aus Säugetieren (z.B. Eierstock des Chinesischen Hamsters (CHO), HEK (humane embryonale Niere), Beta-Zellen aus Langerhansschen Inseln), Melanophorzellen und Zellen aus Drosophila oder E. coli ein. Insbesondere wird ein Polynukleotid, das GPR40 kodiert, zur Transfektion von Zellen eingesetzt, um dadurch den Rezeptor zu exprimieren. Die Konstruktion von Expressionsvektoren, die ein GPR40-kodierendes Polynukleotid umfassen, und die Transfektion von Zellen mit den GPR40-Expressionsvektoren kann unter Verwendung von Standardverfahren erreicht werden, wie sie z.B. beschrieben werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Die Rezeptorexpression kann transient oder stabil sein. Bevorzugt ist die Expression stabil. Besonders bevorzugt wird eine Säuger-Zelllinie mit einem Expressionsvektor transfiziert, der eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die den GPR40-Rezeptor kodiert, z.B. das Polynukleotid von SEQ ID NO: 1, oder die kodierende Region davon, und die Zelllinie wird dann in einem Kulturmedium kultiviert, so dass der Rezeptor stabil auf der Oberfläche der Zelle exprimiert wird. Der exprimierte Rezeptor wird dann mit einer Testverbindung zur Beobachtung von Bindung, Stimulation oder Inhibierung einer funktionellen Reaktion in Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden (wie eines Fettsäureliganden wie hier oben beschrieben) in Kontakt gebracht.
Tests wie hier beschrieben können intakte Zellen verwenden, die funktionelles GPR40 exprimieren, oder Zellmembranen, die den Rezeptor enthalten, wie es fachbekannt ist.
Alternativ kann ein löslicher Teil des GPR40-Rezeptors (d.h. nicht membrangebunden), der die Ligandenbindungsdomäne umfasst, in der löslichen Fraktion exprimiert werden, entweder im intrazellulären Kompartiment oder sezerniert aus der Zelle in das Medium. Techniken zur Isolierung und Reinigung von exprimierten löslichen Rezeptoren sind allgemein fachbekannt.
Ein Beispiel für ein Durchmusterungsverfahren schließt das Exprimieren von GPR40 ein, in dem der Rezeptor an Phospholipase C oder D gebunden ist. Repräsentative Beispiele für solche Zellen schließen ohne Beschränkung Endothelzellen, glatte Muskelzellen und embryonale Nierenzellen ein. Die Durchmusterung kann wie hier oben beschrieben durch Detektieren der Aktivierung des Rezeptors oder der Inhibierung der Aktivierung des Rezeptors aus dem Phospholipase-Sekundärsignal erreicht werden.
Ein anderes Verfahren beinhaltet das Durchmustern auf Verbindungen, die Liganden für GPR40 sind, durch Bestimmung der Inhibierung der Bindung eines markierten Liganden (wie eines Fettsäureliganden) an Zellen, die den Rezeptor auf ihrer Oberfläche aufweisen, oder an Zellmembranen, die den Rezeptor enthalten. Ein solches Verfahren beinhaltet das Transfizieren einer eukaryotischen Zelle mit DNA, die GPR40 kodiert, so dass die Zelle den Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimiert. Die Zelle wird dann mit einer Testverbindung in Gegenwart einer markierten Form eines Liganden, wie z.B. mit einem markierten Fettsäureliganden, in Kontakt gebracht. Der Ligand kann unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens markiert werden, wie es fachbekannt ist, einschließlich Radioaktivität (z.B. mit ¹²⁵Iod), fluoreszente Verbindungen, β-Glucuronidase, Luciferase etc. Die an die Rezeptoren gebundene Menge von markiertem Ligand wird z.B. durch Messung der Radioaktivität gemessen, die mit transfizierten Zellen oder Membranen aus diesen Zellen assoziiert ist. Falls die Testverbindung an den Rezeptor bindet, wird die Bindung von markiertem Ligand an den Rezeptor inhibiert, wie es durch eine Reduzierung des markierten Liganden bestimmt wird, der an die Rezeptoren bindet. Dieses Verfahren wird allgemein als Bindungstest („Bindungsassay") bezeichnet.
Ein weiteres Durchmusterungsverfahren beinhaltet die Verwendung von Säugerzellen, die zur Expression von funktionellem GPR40 transfiziert sind. Die Zellen werden mit einem Indikatorfarbstoff beladen, der ein Fluoreszenzsignal bei Bindung an Calcium erzeugt, und die Zellen werden mit einer Testsubstanz und/oder einem Rezeptoragonisten wie einem Fettsäureliganden in Kontakt gebracht. Jede Veränderung des Fluoreszenzsignals wird über einen definierten Zeitraum unter Verwendung z.B. eines Fluoreszenzspektrophotometers oder Fluoreszenz-Bildplattenlesegerät („Fluorescence Imaging Plate Reader") gemessen. Eine Veränderung des durch den Liganden erzeugten Fluoreszenzsignalmusters zeigt an, dass eine Verbindung ein potentieller Agonist für den Rezeptor ist. Eine Abnahme des durch den Agonisten in Gegenwart der Testverbindung erzeugten Fluoreszenzsignalmusters zeigt an, dass eine Verbindung ein potentieller Antagonist für den Rezeptor ist.
Ein anderes Verfahren beinhaltet das Durchmustern auf GPR40-Liganden durch Bestimmung der Wirkungen auf die Rezeptor-vermittelte cAMP- und/oder Adenylylcyclase-Anreicherung. Ein solches Verfahren beinhaltet das transiente oder stabile Transfizieren einer eukaryotischen Zelle mit GPR40 zur Expression des Rezeptors auf der Zelloberfläche. Die Zelle wird dann mit Testverbindungen in Gegenwart oder Abwesenheit eines GPR40-Agonisten wie einer Fettsäure in Kontakt gebracht. Die Veränderung des cAMP-Spiegels wird dann über einen definierten Zeitraum gemessen, z.B. durch Radioimmun- oder Proteinbindungstests (z.B. unter Verwendung von F1ashPlates (PerkinElmer Life Sciences) oder eines Scintillationsproximitätstests). Veränderungen der cAMP-Spiegel können auch durch direktes Messen der Aktivität des Enzyms, Adenylatcyclase, in aufgebrochenen Zellzubereitungen bestimmt werden. Falls die Testverbindung den Rezeptor bindet und die GPR40-Aktivierung beeinflusst, werden die Spiegel von GPR40-vermitteltem cAMP oder die Adenylatcyclase-Aktivität reduziert oder erhöht sein.
Verschiedene Verfahren sind zur Detektion von GPCR-Aktivierung fachbekannt, abhängig zum Teil vom G-Protein, an das der Rezeptor gekoppelt ist. Z.B. verringert die Aktivierung des Gi-Reaktionsweges die Adenylylcyclase-Aktivität, und ein Gi-Signal kann durch Messung der Inhibierung der Forskolin-stimulierten cAMP-Anreicherung detektiert werden (Wong et al., Methods Enzymology, 238:81 (1994)).
Die Verwendung von Reporter-basierten Tests ist fachbekannt zur Identifizierung von GPCR-Liganden. Allgemein verwenden solche Tests rekombinante Zellen, die ein funktionelles Zielrezeptorprotein exprimieren, dessen Signaltransduktionsaktivität durch Wechselwirkung mit einem extrazellulären Liganden moduliert wird, wobei die Transduktionsaktivität ein detektierbares Signal erzeugen kann. Siehe z.B. Chen et al., J. Pharmacol. Toxicol. 42:199 (1999); Stables et al., J. Recept. Signal Transduct. Res. 19:395 (1999).
Zur Veranschaulichung wird das transduzierte intrazelluläre Signal durch die spezifische Wechselwirkung eines extrazellulären Liganden mit dem Rezeptor auf der Zelloberfläche eingeleitet. Diese Wechselwirkung leitet eine Reihe von intrazellulären Ereignissen ein, die zu einer schnellen und detektierbaren Veränderung der Transkription oder Translation eines Gens führen. Durch Selektieren regulatorischer Transkriptionssequenzen, die auf die transduzierten intrazellulären Signale ansprechen, und funktionsfähiges Verbinden der ausgewählten Promotoren mit Reportergenen, deren Transkription, Translation oder letztliche Aktivität leicht detektierbar und messbar ist, zeigt der Transkriptions-basierte Test an, ob ein spezifischer Rezeptor mit einer Testverbindung zur Beeinflussung der intrazellulären Transduktion wechselwirkt. Siehe z.B. Himmler et al., J. Receptor Res. 13:79 (1993); Weyer et al., Receptors and Channels 1:193 (1993); Bevan et al., Neuroreport 9:2703 (1998).
Unter Verwendung solcher Tests können Testverbindungen, die die Rezeptorsignalisierung induzieren, identifiziert werden (Agonisten). Alternativ kann der Test Testverbindungen auf die Fähigkeit zur Potenzierung der Induktionsreaktion untersuchen, die durch Behandlung der Zelle mit einem bekannten Agonisten erzeugt wird. Falls die Testverbindung die Aktivität des Rezeptorproteins nicht direkt zu induzieren scheint, kann der Test mit der rekombinanten Zelle wiederholt werden, die zuerst mit einem bekannten Aktivator des Zielrezeptors in Kontakt gebracht wurde, um den Signaltransduktionsweg zu induzieren (und das detektierbare Signal zu erzeugen). Testverbindungen können dann auf die Fähigkeit untersucht werden, der Aktivierung des Rezeptors durch einen bekannten Agonistaktivator entgegenzuwirken (zu inhibieren oder zu blockieren).
Wie hier verwendet, bezeichnet ein „Agonist" Mittel, die die Aktivierung von Rezeptorsignalisierungswegen induzieren, z.B. durch Nachahmung eines Liganden für den Rezeptor, sowie Mittel, die die Empfindlichkeit des Rezeptors für einen Liganden potenzieren, z.B. die Konzentrationen an Ligand verringern, die zur Induzierung einer besonderen Höhe der Rezeptor-abhängigen Signalisierung erforderlich sind.
In solchen Tests verwendete Zellen können den Rezeptor von Interesse endogen exprimieren oder können manipuliert werden, um ein heterologes Zielrezeptorprotein zu exprimieren. Verfahren zur Einführung heterologer DNA in eukaryotische Zellen sind fachbekannt, und jedes geeignete Verfahren kann verwendet werden. Wie es fachbekannt ist, kann es wünschenswert sein, ein oder mehrere endogene Gene der Wirtszellen zu inaktivieren (z.B. das Gen für den homologen Rezeptor). Zusätzlich können andere Proteine, die an der Signaltransduktion aus dem Zielrezeptor beteiligt sind, inaktiviert oder mit einem Ortholog oder Paralog aus einem anderen Organismus ergänzt werden, z.B. können G-Proteinuntereinheiten aus Hefe durch G-Proteinunterheiten aus Säugetieren in Hefezellen ergänzt werden, die auch zur Expression eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors aus Säugetier manipuliert sind.
Die Wirtszelle kann ein Reporterkonstrukt enthalten, das ein Reportergen in funktionsfähiger Verbindung mit einem oder mehreren regulatorischen Transkriptionselementen umfasst, die auf die Signaltransduktionsaktivität des Rezeptorproteins reagieren. Exemplarische Reportergene schließen Enzyme (z.B. Luciferase, Phosphatase, sezernierte alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, grün fluoreszierendes Protein, Beta-Lactamase, Chloramphenicolacetyltransferase), die ein spektrometrisch aktives Signal erzeugen können (z.B. Veränderungen von Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz), oder ein Genprodukt ein, das einen zellulären Phänotyp verändert (z.B. Zellwachstum, Wirkstoffresistenz oder Auxotrophie).
Wie hier verwendet, ist ein „Reportergenkonstrukt" ein Nukleinsäuremolekül, das ein Reportergen einschließt, das funktionsfähig mit einer regulatorischen Transkriptionssequenz (Sequenzen) oder einem Element (Elementen) verbunden ist, die die Transkription des Reportergens kontrollieren. Die Aktivität wenigstens einer oder mehrerer dieser Kontrollsequenzen wird direkt oder indirekt durch das Zielrezeptorprotein reguliert. Die regulatorischen Transkriptionssequenzen schließen die Promotor- und anderen regulatorischen Regionen ein, wie z.B. Verstärkersequenzen, die die Aktivität des Promotors modulieren, oder regulatorische Sequenzen, die die Aktivität oder Effizienz der RNA-Polymerase modulieren, die den Promotor erkennt, oder regulatorische Sequenzen, die durch Effektormoleküle erkannt werden, einschließlich derjenigen, die spezifisch durch Wechselwirkung eines extrazellulären Signals mit dem Zielrezeptor induziert werden. Z.B. kann die Modulierung der Aktivität des Promotors durch Veränderung der RNA-Polymerasebindung an die Promotorregion bewirkt werden, oder alternativ durch Wechselwirken mit der Einleitung der Transkription oder Verlängerung der mRNA. Solche Sequenzen werden hier kollektiv als regulatorische Transkriptionselemente oder -sequenzen bezeichnet. Zusätzlich kann das Konstrukt Sequenzen von Nukleotiden einschließen, die die Translation der resultierenden mRNA verändern, wodurch die Menge des Reportgenprodukts verändert wird.
Der Grad der Expression des Reportergens liefert das Rezeptor-abhängige Detektionssignal. Die Höhe der Transkription aus dem Reportergen kann unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens gemessen werden, das den Fachleuten bekannt ist. Z.B. kann die spezifische mRNA-Expression unter Verwendung von Northern Blots oder quantitativer Echtzeit- Polymerasekettenreaktion (PTR), wie z.B. als TAQMAN erhältlich, detektiert werden; oder spezifisches Proteinprodukt kann durch eine charakteristische Färbung oder eine intrinsische Aktivität identifiziert werden. Das Reportergen kann ein Genprodukt kodieren, das durch enzymatische Aktivität zu einem Detektionssignal auf Basis von Farbe, Fluoreszenz oder Lumineszenz führt. Die Reaktion des Reportergens wird dann mit der Reaktion in entweder der gleichen Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen, oder sie kann mit der Reaktion in einer im wesentlichen identischen Zelle verglichen werden, der die spezifischen Rezeptoren fehlen. Jeder statistisch oder in anderer Weise signifikante Unterschied der Reaktion zeigt an, dass die Testverbindung die Aktivität des spezifischen Rezeptors verändert hat.
Agonisten und Antagonisten sind „Rezeptoreffektor"-Moleküle, die die Signaltransduktion über den Rezeptor modulieren. Die Rezeptoreffektor-Moleküle können an den Rezeptor binden, obwohl nicht notwendigerweise am Bindungsort des natürlichen Liganden. Rezeptoreffektoren können die Signaltransduktion modulieren, wenn sie allein verwendet werden (Ersatzliganden), oder können die Signaltransduktion in Gegenwart des natürlichen Liganden verändern, entweder zur Steigerung oder Inhibierung der Signalisierung durch den natürlichen Liganden. Z.B. sind „Antagonisten" Moleküle, die die Signaltransduktionsaktivität des Rezeptors blockieren oder verringern, z.B. können sie kompetitiv oder nicht-kompetitiv und/oder allosterisch die Signaltransduktion aus dem Rezeptor inhibieren, wohingegen „Agonisten" die Signaltransduktionsaktivität eines Rezeptors potenzieren, induzieren oder in anderer Weise steigern. Die Begriffe „Rezeptoraktivator" und „Ersatzligand" bezeichnen einen Agonisten, der die Signaltransduktion aus einem Rezeptor induziert.
„Signaltransduktion" ist die Verarbeitung von chemischen Signalen aus der zellulären Umgebung durch die Zellmembran und kann durch einen oder mehrere verschiedene Mechanismen wie Phosphorylierung, Aktivierung von Ionenkanälen, Effektorenzymaktivierung über Guaninnukleotid-bindende Proteinzwischenstufen, Bildung von Inositphosphat, Aktivierung von Adenylylcylase und/oder direkte Aktivierung (oder Inhibierung) eines Transkriptionsfaktors erfolgen. Der Begriff „Modulation einer Signaltransduktionsaktivität eines Rezeptorproteins" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, wie hier verwendet, bezeichnet die Induktion und/oder Potenzierung sowie die Inhibierung eines oder mehrerer Signaltransduktionswege stromabwärts eines Rezeptors.
Verfahren, die Pigmentzellen zum Identifizieren von GPCR-Liganden verwendet, sind fachbekannt. Allgemein verwendet das Verfahren Pigmentzellen, die Pigment als Reaktion auf einen Rezeptor-vermittelten Reiz dispergieren oder aggregieren können und einen endogenen G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimieren. Der Zustand des Pigments (Aggregation oder Dispersion) als Reaktion auf eine Testverbindung zeigt an, ob die Testverbindung mit dem exprimierten GPCR wechselwirkt. Siehe z.B. US-PS 5,462,856; US-PS 6,051,386.
Xenopus laevis-Melanophoren können funktionell rekombinante Rezeptoren exprimieren, die G-Protein unter Adenylierung von Cyclase oder Phospholipase C (PLC) koppeln. Die Rezeptor-vermittelte Stimulation eines dieser Enzyme verursacht die Dispersion von Melanosomen, während die Rezeptorstimulation, die die Adenylatcyclase inhibiert, die Melanosomaggregation induziert. Verschiedene Tests wurden entwickelt, die Xenopus-Melanophoren verwenden, die mit einem GPCR von Interesse transfiziert sind, um die agonistischen (oder antagonistischen) Wirkungen von Testverbindungen auf die Rezeptoren zu detektieren. Siehe z.B. Chen et al., J. Pharmacol. Toxicol. 42:199 (1999); McClintock et al., Anal. Biochem. 209:298 (1993); Potenza et al., Anal. Biochem. 206:315 (1992); Potenza et al., Pigment Cell Res. 5:372 (1992).
Der Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR^TM, Molecular Devices, UK) misst die intrazelluläre Fluoreszenz in Mulivertiefungsmikroplatten. Wenn ein GPCR an einen Calciumsignalisierungsweg koppelt, kann das FLIPR-System mit Zellen verwendet werden, die den G-Protein-gekoppelten Rezeptor exprimieren und calciumempfindliche fluoreszierende Farbstoffe enthalten, um den intrazellulären Calciumstrom zu überwachen, der nach Aktivierung des G-gekoppelten Rezeptors auftritt. Siehe z.B. Kirk et al., J. Biomolecular Screening, 1:75 (1996).
Bestimmte GPCRs koppeln nicht mit Calciumsignalisierungswegen, während andere nicht durch Calciumwege signalisieren mögen, abhängig vom Zelltyp, in dem der Rezeptor exprimiert wird. In solchen Situationen wurden chimäre G-Proteine verwendet, um den Rezeptor an die Calciumsignalisierung in transfizierten Zellen zu binden, um dadurch die Verwendung von Hochdurchsatz-FLIPR-Tests zu erlauben (Wada et al., Developing a High Troughput Functional Screening Assay for Gi/o-coupled Cloned Receptors using the FLIPR^TM System, veröffentlicht von Molecular Devices, 2001; Coward et al., Chimeric G-proteins allow a high-throughput signaling assay of Gi-coupled receptors, Analytical Biochemistry 270:242 (1999)). Coward et al. berichten über die Verwendung von chimären G-Proteinen, die die Signalisierung von Gi-gekoppelten Rezeptoren durch Gq erlauben und eine detektierbare Calciumreaktion in CHO-Zellen erzeugen, gemessen unter Verwendung der FLIPR^TM-Technology.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Durchmustern von Testverbindungen zur Bestimmung bereit, ob die Verbindung ein GPR40-Rezeptorligand ist, in dem bestimmt wird, ob die Testverbindung kompetitiv die Bindung eines Fettsäure-GPR40-Liganden an einen GPR40-Rezeptor inhibiert. Der Fettsäureligand kann mit einem detektierbaren Marker markiert werden, wie es allgemein fachbekannt ist. Wie hier verwendet, schließen detektierbare Marker Einheiten ein, die durch visuelle Beobachtung detektiert werden können (z.B. solche, die gefärbte Elemente einschließen oder erzeugen), oder die mit Hilfe künstlicher Detektionssysteme detektiert werden, die z.B. optische Systeme, spektroskopische Systeme, radiographische Systeme und dergleichen einschließen. Der detektierbare Marker kann aus Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen und Enzymen ausgewählt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Durchmustern von Testverbindungen auf GPR40-antagonistische Aktivität bereit. Ein solches Verfahren verwendet eine Testzelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reporterkonstrukt enthält, das ein Gq-reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Die Testzelloberfläche wird einem GPR40-Fettsäureagonisten unter Bedingungen ausgesetzt, die die Bindung des GPR40-Fettsäureagonisten an den GPR40-Rezeptor erlauben, und dann wird die Zelloberfläche der Testverbindung unter ähnlichen Bedingungen ausgesetzt. Das durch das Reportergen erzeugte detektierbare Signal wird dann gemessen und mit dem detektierbaren Signal verglichen, von dem man erwartet würde, das es in Gegenwart allein des GPR40-Fettsäureagonisten auftreten würde (d.h. in Abwesenheit der Testverbindung). Dieser Vergleich kann ein Nebeneinandervergleich des detektierbaren Signals in einer Kontrollzelle sein (d.h. in einer der Testzelle in allen Weisen ähnlichen Zelle, die aber dem GPR40-Fettsäureagonisten in Abwesenheit von Testverbindung ausgesetzt wird). Alternativ kann der Vergleich mit einem Standard sein, der bestimmt wird, bevor oder nachdem die Zelle verarbeitet wird, d.h. ein Kontrollexperiment, das vor oder nach dem detektierbaren Signal durchgeführt wurde, um einen quantitativen oder qualitativen Standard zu ermitteln, der im Vergleich verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität bereit. Ein solches Verfahren verwendet eine Zelle, die GPR40-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimiert und ein Reportkonstrukt enthält, das ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Das Transkriptionselement kann ein Gi-reagierendes Transkriptionselement, ein Gq-reagierendes Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement sein. Die Zelloberfläche wird mit einer Testverbindung unter Bedingungen in Kontakt gebracht (d.h. ihr ausgesetzt), die die Bindung eines GPR40-Liganden an den GPR40-Rezeptor erlauben, und eine etwaige Reportergenexpression wird detektiert (was anzeigt, dass die Testverbindung GPR40-agonistische Aktivität besitzt).
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität bereit. Ein solches Verfahren verwendet eine Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reportkonstrukt enthält, das ein reagierendes Transkriptionselement und ein Reportergen umfasst, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt. Das reagierende Transkriptionselement kann ein Gq-reagierendes Transkriptionselement oder ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement sein. Die Zelloberfläche wird einer Testverbindung und einem GPR40-Agonisten unter Bedingungen ausgesetzt (d.h. damit in Kontakt gebracht), die die Bindung des GPR40-Agonisten an den GPR40-Rezeptor erlauben. Die nachfolgende Reportergenexpression wird detektiert, und eine verringerte Reportergenexpression in Gegenwart von sowohl Testverbindung als auch Agonist (verglichen mit der in Gegenwart allein des GPR40-Agonisten erwarteten Reportergenexpression) zeigt an, dass die Testverbindung ein GPR40-Antagonist ist. Wie hier zuvor beschrieben wurde, kann ein Vergleich der Reportergenexpression in der Testzelle mit einer Kontrollzelle oder mit einem bekannten Standard einer quantitativen oder qualitativen Reaktion durchgeführt werden.
Wie hier verwendet, ist ein Gq-reagierendes Transkriptionselement eines, das bei Aktivierung eines Gαq- (oder Gαq-Subtyp-)-gebundenen Rezeptors anspricht (aktiviert wird). Wie fachbekannt ist, sind Gq-Proteine Pertussistoxin-unempfindliche G-Proteine. Wie hier verwendet, ist ein Gi-reagierendes Transkriptionselement eines, das bei Aktivierung eines Gαi- (oder Gαi-Subtyp-)-gebundenen Rezeptors anspricht (aktiviert wird). Wie fachbekannt ist, sind Gi-Proteine Pertussistoxin-empfindliche G-Proteine (ebenso wie Go). Wie hier verwendet, ist ein Gq/Gi-reagierendes Transkriptionselement eines, das bei Aktivierung eines Gαq-gebundenen Rezeptors (oder von Gαq-Subtypen) oder eines GαI-gebundenen Rezeptors (oder von GαI-Subtypen) anspricht (aktiviert wird). Ein solches Gq/Gi-reagierendes Transkriptionselement ist GAL4/Elk-1 (siehe z.B. Bevan et al., Neuroreport 9:2703 (1998)).
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-antagonistische Aktivität durch Detektieren bereit, ob die Verbindung die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung aus Pankreas-Beta-Zellen aus Säugetier (oder die Insulinproduktion innerhalb von Pankreas-Beta-Zellen aus Säugetier) in Gegenwart eines GPR40-Agonisten verringert, verglichen mit der Glucose-stimulierten Insulinfreisetzung, die aufgrund der Gegenwart des GPR40-Agonisten erfolgen würde. Die „erwartete" Insulinfreisetzung aufgrund der Gegenwart des GPR40-Agonisten kann durch Durchführen eines gleichzeitigen oder nachfolgenden Kontrollexperiments ermittelt werden oder kann ein zuvor bestimmter Standard sein. Verschiedene Verfahren sind fachbekannt zur Messung der Insulinfreisetzung aus oder -produktion innerhalb von Zellen. Jedes geeignete Verfahren kann in den vorliegenden Verfahren verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Durchmustern einer Verbindung auf GPR40-agonistische Aktivität durch Detektieren bereit, ob die Verbindung an GPR40 bindet und die Glucose-stimulierte Insulinfreisetzung aus (oder Insulinproduktion innerhalb von) Pankreas-Beta-Zellen aus Säugetier erhöht.
Umgekehrt können weitere Rezeptoren, für die die Fettsäureliganden der Erfindung als Liganden wirken, durch Durchmustern potenzieller Kandidaten gegen einen Fettsäureliganden in einem geeigneten Test identifiziert werden, z.B. durch Bestimmung der potentiellen Inhibierung von Forskolinerhöhten cAMP-Spiegeln.
Kits, die zur Durchführung der vorliegenden Verfahren geeignet sind, können folgendes enthalten:

(a) GPR40 und ein oder mehrere markierte oder unmarkierte Fettsäureliganden;
(b) eine rekombinante Zelle, die GPR40 exprimiert, und ein oder mehrere markierte oder unmarkierte Fettsäureliganden; oder
(c) eine Zellmembran, die GPR40 exprimiert, und ein oder mehrere markierte oder unmarkierte Fettsäureliganden.

Man wird einsehen, dass in jedem solchen Kit (a), (b) oder (c) eine substantielle Komponente umfassen kann.
Agonisten und/oder Antagonisten können aus einer Vielzahl von Quellen identifiziert werden, z.B. aus Zellen, zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktmischungen. Solche Agonisten und/oder Antagonisten können natürliche oder modifizierte Substrate, Liganden, Rezeptoren, Enzyme etc., je nach Fall, eines beliebigen Fettsäureliganden der Erfindung sein; oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sein (siehe Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991)).
Beispiele für potenzielle Antagonisten schließen ein:

(a) Antikörper oder, in manchen Fälle, Oligonukleotide, die an den Rezeptor binden, aber keine zweite Botenreaktion auslösen, so dass die Aktivität des Rezeptors verhindert wird;
(b) Fettsäuren, die eng mit einem Liganden von GPR40 verwandt sind, die aber keine Reaktion aus dem GPR40-Rezeptor auslösen;
(c) kleine Moleküle, die an GPR40 binden, was es unzugänglich für Liganden macht, so dass die normale biologische Aktivität verhindert wird, z.B. kleine Peptide oder peptidartige Moleküle;
(d) lösliche Formen von GPR40, z.B. Fragmente des Rezeptors, die an den Liganden binden und die Wechselwirkung des Liganden mit membrangebundenem GPR40 verhindern.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können nützlich in einem Verfahren zur rationellen Wirkstoffentwicklung sein, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Sondieren der Struktur eines Fettsäureliganden-Bindungsorts auf dem GPR40-Rezeptor mit dem Fettsäureliganden oder einem Derivat davon;
b) Identifizieren von Kontaktatomen im Bindungsort des GPR40-Rezeptors, die mit einem Fettsäureliganden während der Bindung wechselwirken; und
c) Entwickeln von agonistischen oder antagonistischen Verbindungen, die mit den in (b) identifizierten Atomen im Bindungsort wechselwirken, um den Rezeptor zu aktivieren (Agonist) oder dessen Aktivierung zu inhibieren (Antagonist).

Umgekehrt kann auch die Struktur beliebiger Fettsäureliganden bei Bindung an den Ligandenbindungsort auf dem GPR40-Rezeptor bestimmt werden, was die Entwicklung von weiteren antagonistischen Verbindungen ermöglicht.
Solche Antagonisten binden an den Fettsäureliganden, wodurch die Bindung des Fettsäureliganden an den Rezeptor verhindert wird. Verfahren der Verwendung von Liganden oder ihren Derivaten zum Sondieren der Struktur der Ligandenbindungsorte in Rezeptoren und die rationelle Wirkstoffentwicklung auf Basis dieser Strukturinformation sind allgemein fachbekannt (siehe z.B. S. Boyle et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 1994, 2, 101-113; A.G. Beck-Sickinger et al., European Journal of Biochemistry 1994, 225, 947-958; C.A. McWerther et al., J. Biol.Chem. 1997, 272, 11874-11880; D.C. Horwell et al., International Journal of Peptide & Protein Research 1996, 48, 522-531; M.A. Bednarek et al., Peptides 1999, 20, 401-409).
Unter Verwendung der obigen Durchmusterungs- oder rationellen Entwicklungsverfahren identifizierte Verbindungen werden von Nutzen in der Therapie sein. Z.B. kann eine als Agonist oder Antagonist von GPR40 identifizierte Verbindung nützlich in der Therapie sein, insbesondere zur Behandlung von Typ II-Diabetes (nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus, NIDDM) und Fettsucht, Glucoseintoleranz, Insulinresistenz, neurodegenerative Krankheit (z.B. Alzheimer-Krankheit) und von anderen Indikationen wie u.a. Schlaganfall.
Z. B. ein Verfahren zur Behandlung eines abnormalen Zustands, der mit einem Übermaß an GPR40-Aktivität und/oder einem Übermaß eines GPR40-Liganden (z.B. eines Fettsäureliganden) verbunden ist. Das Verfahren umfasst das Verabreichen eines GPR40-Antagonisten, wie hier zuvor beschrieben, in einer zur Blockierung oder Verringerung der Bindung von Liganden an den Rezeptor oder zur Inhibierung oder Verringerung eines zweiten Signals wirksamen Menge an einen bedürftigen Patienten, um dadurch den abnormalen Zustand zu lindern.
In noch einem anderen Ansatz kann die Expression des Gens, das endogenes GPR40-Polypeptid kodiert, unter Verwendung von Expressionsblockierungstechniken inhibiert werden. Solche bekannten Techniken beinhalten die Verwendung von antisense-Sequenzen, entweder intern erzeugt oder extern verabreicht (siehe z.B. O'Connor, J. Neurochem. (1991) 56:560 in „Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Alternativ können Oligonukleotide, die Tripelhelices („Triplexe") mit dem Gen bilden, zugeführt werden (siehe z.B. Lee et al., Nucleic Acids Res. (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360). Diese Oligomere können als solche verabreicht werden, oder die relevanten Oligomere können in vivo exprimiert werden. Synthetische antisense- oder Triplex-Oligonukleotide können modifizierte Basen oder modifizierte Gerüste umfassen. Beispiele für letztere schließen Methylphosphonat-, Thiophosphat- oder Peptidnukleinsäure-Gerüste ein. Solche Gerüste werden in das antisense- oder Triplex-Oligonukleotid aufgenommen, um Schutz vor Abbau durch Nukleasen bereitzustellen, und sind allgemein fachbekannt. Antisense- und Triplex-Moleküle, die mit diesen oder anderen modifizierten Gerüsten synthetisiert werden, bilden ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Zusätzlich kann die Expression des humanen GPR40-Polypeptids durch Verwendung von Ribozymen verhindert werden, die spezifisch für die humane GPR40-mRNA-Sequenz sind. Ribozyme sind katalytisch aktive RNAs, die natürlich oder synthetisch sein können (siehe z.B. N. Usman et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (1996) 6(4), 527-33). Synthetische Ribozyme können entwickelt werden, um GPR40-mRNAs an ausgewählten Positionen spezifisch zu spalten, um dadurch die Translation der humanen GPR40-mRNAs zu funktionellem Polypeptid zu verhindern. Ribozyme können mit einem natürlichen Ribosephosphat-Gerüst und natürlichen Basen, wie sie normalerweise in RNA-Molekülen gefunden werden, synthetisiert werden. Alternativ können die Ribozyme mit nicht-natürlichen Gerüsten synthetisiert werden, um Schutz vor Ribonukleaseabbau bereitzustellen, z.B. 2'-O-Methyl-RNA, und können modifizierte Basen enthalten.
Die Identifizierung eines Liganden für GPR40, wie z.B. eines Fettsäureliganden der Erfindung, erlaubt die wirksame Identifizierung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, die gegen GPR40 erzeugt werden und neutralisierende Antikörper sind. Solche neutralisierenden Antikörper sind von Nutzen in der Therapie im Vergleich mit nicht-neutralisierenden Antikörpern, die ineffektiv sind. Entsprechend sieht die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung von neutralisierenden Antikörpern, die gegen GPR40 erzeugt wurden, in der Therapie vor.
Verbindungen, die aktiv sind, wenn sie oral verabreicht werden, können als Flüssigkeiten, z.B. Sirupe, Suspensionen oder Emulsionen, Tabletten, Kapseln und Lutschtabletten formuliert werden. Eine flüssige Formulierung wird allgemein aus einer Suspension oder Lösung der Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes in (einem) geeigneten flüssigen Träger(n), z.B. Ethanol, Glycerin, nicht-wässrigem Lösungsmittel (z.B. Polyethylenglycol), Ölen oder Wasser mit einem Suspendiermittel, Konservierungsmittel, Aroma oder Färbemittel bestehen. Eine Zusammensetzung in Form einer Tablette kann unter Verwendung beliebiger geeigneter pharmazeutischer Träger hergestellt werden, die routinemäßig zur Herstellung fester Formulierungen verwendet werden. Beispiele für solche Träger schließen Magnesiumstearat, Stärke, Lactose, Saccharose und Cellulose ein. Eine Zusammensetzung in Form einer Kapsel kann unter Verwendung von routinemäßigen Verkapselungsverfahren hergestellt werden. Z.B. können Pellets, die den aktiven Bestandteil enthalten, unter Verwendung von Standardträgern hergestellt und dann in eine Hartgelatinekapsel gefüllt werden; alternativ kann eine Dispersion oder Suspension unter Verwendung beliebiger geeigneter pharmazeutischer Träger (z.B. mit wässrigen Gummen, Cellulosen, Silicaten oder Ölen) hergestellt und die Dispersion oder Suspension dann in eine Weichgelatinekapsel gefüllt werden. Typische parenterale Zusammensetzungen bestehen aus einer Lösung oder Suspension der Verbindung oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes in einem sterilen wässrigen Träger oder einem parenteral akzeptablen Öl, z.B. Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Lecithin, Erdnussöl oder Sesamöl. Alternativ kann die Lösung lyophilisiert und dann mit einem geeigneten Lösungsmittel gerade vor der Verabreichung rekonstituiert werden. Eine typische Suppositorienformulierung umfasst eine aktive Verbindung oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, das bei Verabreichung auf diese Weise aktiv ist, mit einem Binde- und/oder Schmiermittel wie polymeren Glycolen, Gelatinen oder Kakaobutter oder anderen niedrig schmelzenden pflanzlichen oder synthetischen Wachsen oder Fetten. Die Erfindung wird ferner in den folgenden Beispielen beschrieben, die zur Veranschaulichung der Erfindung ohne Beschränkung ihres Umfangs gedacht sind. Zur Erleichterung des Verständnisses der folgenden Beispiele werden bestimmte Verfahren und/oder Begriffe beschrieben werden.
Beispiele
Beispiel 1
TAQMAN^®-Analyse der GPR40-Expression in humanen Geweben
Erzeugung von Proben zur TAQMAN^®-mRNA-Analyse:
TAQMAN^®-PCR wurde unter Befolgen des von H. M. Sarau et al. veröffentlichten Verfahrens durchgeführt („Identification, Molecular Cloning, Expression and Characterisation of a Cysteinyl Leukotriene Receptor", Molecular Pharmacology, 1999, 56, 657-663). Quantitative TAQMAN^®-PCR wurde zur Messung von GPR40-mNRA unter Verwendung von mehrfachen Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Ein 20 μl-Volumen einer PCR-Mastermischung (enthaltend 2,5 μl TAQMAN^®-Puffer, 6 μl 25 mM MgCl₂, 0,5 μl 10 mM dATP, 0,5 μl 20 mM dUTP, 0,5 μl 10 mM dCTP, 0,5 μl 10 mM dGTP, 0,25 μl Uracil-N-glycosylase, 1 μl 10 μM Vorwärtsprimer, 1 μl 10 μM Umkehrprimer, 0,5 μl 5 μM TAQMAN^®-Sonde, 0,125 μl TaqGold [PE Biosystems], 6,625 μl Wasser) wurde zu jeder Vertiefung unter Verwendung von Biomek-Robotern (Beckman Coulter, High Wycombe, UK) hinzugegeben und die Platte unter Verwendung von optischen Deckeln (PE Biosystems) verschlossen. Die PCR-Reaktion wurde an einem ABI7700 Sequence Detector (PE Biosystems) unter Verwendung der folgenden PCR-Parameter durchgeführt: 50°C für 2 Minuten, 95° für 10 Minuten und 45 Zyklen mit 94°C für 15 Sekunden, 60°C für 1 Minute, und die Menge von aus mNRA stammender cDNA in jeder Probe wurde aus dem TAQMAN^®-Signal unter Verwendung von Plasmid/genomischen DNA-Kalibrierungsstandards, die in jedem Durchlauf eingeschlossen wurden, berechnet. Die Menge an genomischer DNA, die die ursprünglichen RNA-Proben verunreinigte, wurde als vernachlässigbar (< 10 Kopien genomische DNA/ng RNA) durch TAQMAN^®-Messung der genomischen Sequenz für 10 Gene in wiederholten Proben nachgewiesen, die durch das beschriebene Umkehrtranskriptionsverfahren unter Auslassung der Umkehrtranskriptase geführt wurden. Genspezifische Reagentien für GPR40:
Vorwärtsprimer: 5'GTGGTGCTTAATCCGCTGGT (SEQ ID NO: 5)
Umkehrprimer: 5'TGGCGTTACTTCTGGGACTTG (SEQ ID NO: 6)
Sonde: 5'CTTGCGTTCTTGCCGCACACACTGT (SEQ ID NO: 7)
Die Ergebnisse zeigen, dass die höchsten Mengen von GPR40 in der Bauchspeicheldrüse exprimiert werden; die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 GPR40-Körpergewebe-mRNA-Spiegel Einheiten: Kopien von detektierter GPR40-mRNA/ng mRNA-Ansammlung
Beispiel 2
Expression von GPR40 in humanen Langerhansschen Inseln
TAQMAN^®-Analyse von RNA aus humanen Langerhansschen Inseln gegenüber Gesamt-Pankreas-RNA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Für eine äquivalente RNA-Probe aus Inselzellen und Gesamtpankreas gab es in 3 unabhängigen Inselproben eine 2- bis 100-fach höhere Expression von GPR40 als im Gesamtpankreas (Ergebnisse nicht gezeigt).
Beispiel 3
Expression von GPR40 in MIN6- und BRIN-Insulinomzellen
TAQMAN^®-Bedingungen für GPR40-Expression in Maus und Ratte:
TAQMAN^® wurde unter Verwendung von 50 ng cDNA pro Reaktion mit 0,3 μM Vorwärtsprimer, 0,3 μM Umkehrprimer, 0,1 μM Sonde und 1x TAQMAN^® Master Mix (PE Applied Biosystems, UK) durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 50°C für 2 Min., 95°C für 10 Min., gefolgt von 40 Zyklen mit 95°C für 15 s, 60°C für 1 Min.
Primer/Sondensätze für GPR40 aus Maus/Ratte

Vorwärtsprimer: 5'AGTTCCCTGGGCATCAACATA3' (SEQ ID NO: 8)
Umkehrprimer: 5'CAAGGGCAGAAAGAAGAGCAGA3' (SEQ ID NO: 9)
Sonde: 5'AATGGCTCCCCGGTCTGCCTGG3' (SEQ ID NO: 10)

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass GPR40 in beiden Insulinomzelllinien exprimiert wurde, was die β-Zelllokalisierung bestätigte. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass die Expression von GPR40 in MIN6-Zellen viel größer als in BRIN-Zellen ist.
Tabelle 2

1) Der Ct-Wert bezeichnet die Zyklusanzahl von TAQMAN^®, die zur Detektion der Genexpression für das Transkript notwendig ist.
2) HPRT = Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase

Beispiel 4
GPR40-Expression ist in ob/ob-Mäuse-Pankreas erhöht
Die TAQMAN^®-Analyse wurde zur Bestimmung von GPR40-Spiegeln in mageren C57B1/6-Mäusen im Vergleich mit homozygoten C57B1/6 ob/ob-Knock-out-Mäusen durchgeführt. Diese Spiegel wurden ferner mit Spiegeln von Insulin-mRNA verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3

1) Relative Messung aus einer Standardkurve, die unter Verwendung bekannter Mengen von cDNA erzeugt wurde, hergestellt aus Gesamt-RNA mit zufälligen Primern.

Beispiel 5
GPR40 und Fettsäuren – Rezeptor-Liganden-Paarung
Zellen, die den GPR40-Rezeptor exprimieren, weisen eine dosisbezogene Zunahme der intrazellulären Calciumspiegel als Reaktion auf Fettsäureliganden gemäß Messung durch die FLIPR-Technologie auf. 1 zeigt die nach Zugabe von Elaidinsäure (trans-Oleinsäure, 9-Octadecansäure) zu HEK-293-Zellen, die transient den GPR40-Rezeptor exprimieren, detektierte FLIPR-Reaktion. Keine Reaktion wurde in Zellen detektiert, die transient zwei andere 7TM-Rezeptoren (PGRW und HLTEX11) exprimieren. Die Tests verwendeten einen G-Protein-Cocktail (+GPC), der chimäre und promiske G-Proteine enthielt, wie es auf dem Gebiet der Durchmusterung von seltenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bekannt ist.
Die GPR40-Stimulation durch andere Fettsäureliganden unter Verwendung der FLIPR-Technologie, wie hier beschrieben, wird nachfolgend in Tabelle 4 gezeigt (pEC50 = –log EC50, worin EC50 die „effektive Konzentration" ist; EC50 ist die Hälfte der Konzentration an Verbindung, die für eine maximale Reaktion notwendig ist).
Tabelle 4
Beispiel 5A
Funktionelle Tests
G-Protein-Kopplung
Die meisten GPCRs zeigen konstitutive Aktivität, wenn die Expression des GPCR zunimmt. Experimente wurden zur Bestimmung, ob GPR40 durch Gα_s, Gα_q oder Gα_i koppelt, unter Verwendung konstitutiv aktiver Reporter und nach Agonistaktivierung durchgeführt.
Konstitutive-GPR40-Aktivität wurde in Melanophoren untersucht. Die Melanophoren wurden transient mit 10, 20, 40 und 80 μg GPR40/pJG3.6-Plasmid-DNA durch Elektroporation transfiziert und in Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert. 48 Stunden nach der Elektroporation wurden die Medien abgesaugt und durch L-15-Testpuffer, Testpuffer + 25 nM Melatonin oder Testpuffer + 100 nM alpha-MSH ersetzt. Diese Reagenzien ließ man für 2 Stunden inkubieren, und die Transmittanz (T) wurde ausgelesen.
Prozentuale konstitutive Aktivität wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: (T(L15) – T(MSH))·100 / (T(Melatonin) – T(MSH))
Die Ergebnisse zeigen, dass zunehmende Mengen an transfizierter GPR40-DNA eine Zunahme der Gα_q/Gα_o-Aktivität erzeugten, was anzeigt, dass die konstitutive Aktivität von GPR40 durch beide aus der Gα_q/Gα_o-Familie von G-Proteinen erfolgt (2).
Die spezifische Kopplung wurde in Säugerzellen unter Verwendung der transienten Expression eines CRE-Luciferase-Reporters für Gα_s und in stabilen Zelllinien, die Gal4/ELK-1-Luciferase-Reporter enthielten, für Gα_q/Gα_o bestimmt. CHO-Zellen vom Wildtyp wurden mit 3X-CRE-Luciferase-Reportervektor und verschiedenen Mengen eines Expressionsvektors für GPR40 kotransfiziert. Die Kontrollzellen wurden nur mit Reportervektor transfiziert. Die Reportergenplasmide wurden inhäusig erzeugt, aber ähnliche Vektoren können von Stratagene erworben werden (PATHDETECT^®). Zellen wurden in eine Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen mit 1 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in DMEM/F12, ergänzt mit 5% FBS, ausplattiert. Nach 72 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ wurden die Zellen unter Verwendung des liposomalen Tranfektionsreagens, das unter der Marke LIPOFECTAMINE^® verkauft wird, und mit den folgenden Kombinationen von Plasmiden transfiziert:

A – 3x-CRE-Luc
B – 3x-CRE-Luc + CMV-GPR40
C – 3x-CRE-Luc + CMV-Gs-gekoppelter Rezeptor

Die Konzentration an Reporterplasmid für alle Vertiefungen betrug 0,15 μg/Vertiefung. Die Konzentrationen der Reporterplasmide betrugen 0,5, 1,0, 5,0, 10,0 ng/Vertiefung. Nach 24 h wurden Zellen, die 1 ng/Vertiefung an Reporterplasmid oder keine DNA-Kontrolle und CRE-Luc-Reporter enthielten, mit Fettsäure oder Calcitonin, das dafür bekannt ist, durch einen Gs-gekoppelten Rezeptor zu wirken (Chakraborty, Science 251:1078 (1991)), mit den angegebenen Konzentrationen behandelt. Die Luciferase-Produktion wurde nach 4 Stunden Behandlung unter Verwendung eines Luciferase-Reportergen-Testkits getestet, das unter der Marke LUCLITE^® erhältlich, verwendet gemäß Herstelleranweisungen (Packard Bioscience).
Wie in 3a gezeigt wird, gab es keine Zunahme an Reporteraktivität im CRE-System bei jeder Dosis von GPR40-Expressionsvektor. Im Gegensatz, wie in 3b gezeigt wird, löste die Expression eines Gs-gekoppelten Rezeptors eine signifikante Zunahme an Luciferaseaktivität aus.
Wie in 3c gezeigt wird, obwohl Calcitonin eine Zunahme der Luciferaseproduktion sowohl in den Zellen auslöste, die nur Reporter enthielten, als auch in denjenigen, die GPR40 enthielten, gab es keine Wirkung von 5,8,11-Eicosatriinsäure bei jeder untersuchten Konzentration, was anzeigt, dass weder GPR40-konstitutive noch Agonist-aktivierte Aktivität über Gαs gekoppelt ist.
Zur weiteren Untersuchung der Kopplung von GPR40 an Gα_q/Gα_o wurde ein GAL4-Elk-1-Reporter verwendet. Eine stabile klonale Reporterlinie wurde durch Transfizieren von CHO-Zellen mit einem Plasmid geschaffen, das ein Expressionskonstrukt für GAL4/Elk-1- und ein GAL4-Luciferase-Reporterkonstrukt enthält. Ein ähnliches Reportersystem kann jetzt von Stratagene erworben werden (unter der Marke PATHDETECT^®). Ein Expressionskonstrukt für humanes GPR40, das ein G418-Resistenzkonstrukt enthält, wurde in die CHO-GAL4/Elk-1-Reporterzelllinie als Wirt (10 μg Plasmid-DNA pCR3-GPR40) über Elektroporation transfiziert. Die Zelllinien wurden mit 500 μg/ml G418 selektiert, bis alle Zellen in der Kontrolle tot waren, und Klone wurden dann gepickt. Der GAL4/Elk-1-Reporter kann durch Gq oder Gi aktiviert werden. Zur Bestätigung der Kopplung über Gi wurden Zellen mit Pertussistoxin-Behandlung behandelt, was Gαi ADP-ribosyliert, was seine Wechselwirkung mit Rezeptoren verhindert (Bokoch et al., J. Biol. Chem. 258:2072 (1983)). Pertussistoxin hat keine bekannte Wirkung auf Gαq.
Wirtszellen und diejenigen, die mit dem GPR40-Konstrukt transfiziert wurden, wurden in eine Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen mit 2000 Zellen/Vertiefung in DMEM/F12, ergänzt mit 5% FBS, ausplattiert. Nach 48 Stunden bei 37°C mit 5% CO₂ wurden die Zellen in serumfreies DMEM/F12 in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μg/ml Pertussistoxin plattiert. Nach 16 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ wurden die Wirtszellen behandelt mit: Lysophosphatidsäure (Oleoyl) (LPA), die durch Gαi zur Aktivierung von MAP-Kinase koppelt (Hordijk et al., J. Biol. Chem. 269:645 (1994)); Thrombin, das durch Gαi und Gαq koppelt (Hung et al., J. Biol. Chem. 267:20831 (1992)); oder 5,8,11-Eicosatriinsäure (ein GPR40-Ligand), mit den angegebenen Konzentrationen. Die Wirtszellen, die das GPR40-Konstrukt enthalten, wurden mit 5,8,11-Eicosatriinsäure in den angegebenen Konzentrationen stimuliert. Kontrollen für Lysophosphatidsäure enthielten 0,5% DDMSO; Kontrollen für 5,8,11-Eicosatriinsäure enthielten 0,5% Ethanol. Luciferaseaktivität wurde 4 Stunden nach der Behandlung unter Verwendung eines Luciferase-Reportergen-Testkits getestet, das unter der Marke LUCLITE^® erhältlich ist, gemäß Herstelleranweisung (Packard Bioscience).
Wie in 4A gezeigt wird, wurde die LPA-stimulierte Reporteraktivität in den Wirtszellen vollständig durch die Pertussistoxin-Behandlung aufgehoben, was eine Kopplung durch Gαi bestätigt.
Wie in 4C gezeigt wird, war die Luciferaseproduktion aufgrund von Thrombinstimulation nur teilweise nach Toxinbehandlung abgeschwächt, was eine Gαi/Gαq-Kopplung bestätigt.
Wie in 4D und 4E gezeigt wird, wiesen Klone, die mit dem GPR40-Expressionskonstrukt und einem Elk-/GAL4-Reporter transfiziert waren, eine Zunahme der Basis-Reportaktivität gegenüber der Wirtszelllinie auf, die nur Reporter allein enthielt, die um bis zu 70% nach Pertussistoxin-Behandlung verringert war, was eine konstitutive Gαi-gekoppelte Rezeptoraktivität nahelegt.
Wie in 4B gezeigt wird, hatte 5,8,11-Eicosatriinsäure keine Wirkung auf die Luciferaseproduktion in den Wirtszellen, aber eine erhöhte Luciferaseaktivität im Vergleich mit der Basis in Zellen, die GPR40 in einer Weise enthielten, die nicht durch Pertussistoxin-Behandlung inhibiert wurde.
Diese Tests zeigen, dass konstitutive GPR40-Rezeptoraktivität an die Gαi- oder Gαo- (und verwandte Familienmitglieder) -Pertussistoxin-empfindliche G-Proteine gekoppelt ist. Außerdem ist die Fettsäureagonist-stimulierte GPR40-Rezeptoraktivierung durch ein Pertussistoxin-unempfindliches G-Protein gekoppelt, was nahelegt, dass die Agonist-stimulierte GPR40-Rezeptoraktivierung durch Gαq gekoppelt ist.
Beispiel 6
Funktionale Tests
Calciumtest
Rezeptoren, die stabil in HEK 293-Zellen exprimiert werden, können eine robuste Calciumreaktion auf Agonisten mit der geeigneten Rangreihenfolge und Wirksamkeit zeigen. Basiscalciumspiegel in den HEK 293-Zellen in GPR40-transfizierten Zellen oder Vektorkontrollzellen sind im normalen Bereich von 100 bis 200 nM. HEK 293-Zellen, die rekombinante GPR40-Rezeptoren exprimieren, werden mit dem fluoreszierenden Indikator FLUO-4 beladen, und an einem einzigen Tag werden mehr als 150 selektierte Liganden auf Agonist-induzierte Calciummobilisierung ausgewertet. Agonisten, die eine transiente Calciummobilisierung darstellen, werden in Vektorkontrollzellen zur Bestimmung getestet, ob die Calciumreaktion einzigartig für die transfizierten Rezeptorzellen ist. Wenn eine einzigartige Agonist-induzierte Reaktion identifiziert wird, wird die Reaktion in einer separaten Gruppe von Zellen reproduziert und dann pharmakologisch mit Konzentrations-Reaktions-Kurven für die wirksamen und verwandten Liganden charakterisiert.
Beispiel 7
Membranpräparation und Durchmusterung auf GPR40
Kompetitive Fettsäureligandenbindungstests sind nützlich zum Auffinden von Antagonisten und Agonisten des GPR40-Rezeptors. Als Quelle des GPR40-Rezeptors sind CHO- oder HEK-293-Zellen, die mit dem GPR40-Rezeptor stabil transfiziert sind, nützlich; andere Zellen, die mit dem GPR40-Rezeptor transfiziert sind, oder Zellen, die natürlicherweise eine hochgradige Expression des GPR40-Rezeptors zeigen, können auch eingesetzt werden. Typischerweise wird die Kultur von Zellen, die den GPR40-Rezeptor exprimieren, auf 30L maßstabsvergrößert, und Zellen werden durch Zentrifugieren mit 600 x g für 10 Min. gewonnen. Das Zellpellet wird dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Pellets enthalten gewöhnlich ca. 10⁹ Zellen. Zur Membranisolierung werden Pellets dreimal eingefroren/aufgetaut. Sie werden dann in eiskaltem 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM DTA (Natriumsalz) (40 ml/10⁸ Zellen) resuspendiert und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators (Glas/Glas) (20-25 Schläge), gefolgt von einer Polytron-Suspension mit 3-10 s-Pulsen bei der Einstellung 3/4 (Brinkman-Gewebehomogenisator) homogenisiert. Diese Suspension wird mit 300 x g für 10 min. zentrifugiert. Das Pellet wird verworfen, und die überstehende Fraktion wird mit 40.000 x g für 30 Min. bei 4°C zentrifugiert (Sorvall SS-34: 18.000 U/Min.), in Homogenisierungspuffer unter Verwendung des Polytron resuspendiert und einmal gewaschen. Das Pellet wird in Testpuffer (50 mM Tris pH 7,5) mit einer Konzentration von 1-4 mg Protein/ml resuspendiert.
Auf diese Weise erhaltene Membranen sind für das Ansetzen eines kompetitiven Hochdurchsatz-Fettsäureliganden-Bindungstests geeignet, um nach Verbindungen zu suchen, die in die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung eingreifen. Die Gesamtbindung einer markierten Fettsäure an diese Membranen wird zuerst getestet, damit sie linear zur verwendeten Menge an Membranen ist. Der Zeitraum, um die Gleichgewichtsbindung bei einer geeigneten Temperatur zu erreichen, wird ebenfalls ermittelt und beträgt nach unserer Erfahrung ca. 1 h bei einer Temperatur von 20°C. Bedingungen für einen solchen Durchmusterungstest werden exemplarisch durch diejenigen angegeben, die in der MCH-Rezeptorbindung verwendet werden. Typischerweise werden 25 μg Membranprotein pro Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 100 μl Puffer verwendet, der 50 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ und 0,5% Rinderserumalbumin (Western-Blot-Qualität) enthält, pH 7,4. Die Konzentration an ¹²⁵I-mMCH beträgt typischerweise 1-2 nM und 75.000 Impulse pro Min./Vertiefung. Die spezifische Bindung von ¹²⁵I-mMCH sollte vollständig durch unmarkiertes MCH bei Konzentrationen von 100 nM oder mehr verdrängt werden.
Die zu untersuchenden Verbindungen werden typischerweise gelöst und hinzugegeben in DMSO, und Endkonzentrationen von DMSO im Test sind 1% oder weniger. Nach Inkubation werden die Inhalte der Vertiefungen auf einem Polyethylenimin-behandelten GF/C-Filter unter Verwendung eines Zellernters für eine Platte mit 96 Vertiefungen geerntet, und die Filter werden viermal mit typischerweise 1 ml eiskaltem Waschpuffer gewaschen, der 20 mM HEPES, 0,5 M NaCl pH 7,4 enthält. Die Filter werden gezählt, um Antagonisten der markierten Fettsäureligandenbindung zu identifizieren.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Durchmustern einer Testverbindung zur Bestimmung, ob die Verbindung ein GPR40-Rezeptorligand ist, umfassend das Detektieren, ob die Testverbindung kompetitiv die Bindung eines Fettsäure-GPR40-Liganden an einen GPR40-Rezeptor inhibiert, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand eine gesättigte oder ungesättigte C₆-C₂₃-Fettsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand bis zu 6 Alkylen- oder 3 Acetylenbindungen enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand cyclisch oder verzweigt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand mit 1 bis 3 Hydroxygruppen substituiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand mit einem detektierbaren Marker markiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der GPR40-Rezeptor durch Zellmembranen bereitgestellt wird, die funktionelle GPR40-Rezeptoren enthalten.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand aus den folgenden GPR40-Fettsäureagonisten ausgewählt ist: Palmitoleinsäure C₁₆H₃₀O₂ (9Z); Linolensäure C₁₈H₃₀O₂ (9Z, 12Z, 15Z); Linolsäure C₁₈H₃₂O₂ (9Z, 12Z); Elaidinsäure C₁₈H₃₄O₂ (9E); Oleinsäure C₁₈H₃₄O₂ (9Z); Petroselinsäure C₁₈H₃₄O₂ (6Z); all-trans-Retinal (Vitamin A; Aldehyd) C₂₀H₂₈O; all-trans-Retinolsäure (Vitamin A-Säure; Tretinoin) C₂₀H₂₈O₂; 9-cis-Retinolsäure (9-cis-Tretinoin) C₂₀H₂₈O₂; all-trans-Retinol (Vitamin A) C₂₀H₃₀O; Arachidonsäure C₂₀H₃₂O₂ (5Z, 8Z, 11Z, 14Z); cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure C₂₂H₃₂O₂; Erucasäure C₂₂H₄₂O₂ (13Z); Nervonsäure C₂₄H₄₆O₂ (15Z); n-Capronsäure C₆H₁₂O₂; Heptansäure C₇H₁₄O₂; Caprylsäure C₈H₁₆O₂; Nonansäure C₉H₁₈O₂; Caprinsäure C₁₀H₂₀O₂; Undecansäure C₁₁H₂₂O₂; Laurinsäure (Dodecansäure) C₁₂H₂₄O₂; Tridecansäure C₁₃H₂₆O₂; Myristinsäure C₁₄H₂₈O₂; Pentadecansäure C₁₅H₃₀O₂; Palmitinsäure C₁₆H₃₂O₂; Heptadecansäure C₁₇H₃₄O₂; Stearinsäure C₁₈H₃₆O₂; Nonadecansäure C₁₉H₃₈O₂; Arachinsäure C₂₀H₄₀O₂; Heneicosansäure C₂₁H₄₂O₂; Behensäure (Docosansäure) C₂₂H₄₄O₂; Tricosansäure C₂₃H₄₆O₂; Lignocerinsäure C₂₄H₄₈O₂; Meansäure (10:3,n-9); Linolsäure (18:2,n-6); Linolensäure (18:3,n-3); gamma-Linolensäure (18:3,n-6); Elaidinsäure (18:1,n-9,E); 17-Octadecinsäure (17-ODYA) (18:1 x terminale Acetylengruppe); Eicosa-11Z,14Z-diensäure (20:2,n-6); Eicosa-5Z,8Z-diensäure (20:2,n-12); Eicosa-11Z,14Z,17Z-triensäure (20:3,n-3); Dihomo-gamma-linolensäure (20:3,n-6); 5,8,11-Eicosatriinsäure (20:3 x Acetylengruppen); Eicosa-5Z,8Z,11Z,14Z,17Z-pentaensäure (20:5,n-3); Arachidonsäure (20:4,n-6); 14(R),15(S)-DiHETE (20:4 + 2 Hydroxylgruppen); Docosa-13Z,16Z,19Z-triensäure (22:3,n-3); Adrensäure (22:4,n-6); Docosa-7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-pentaensäure (22:5,n-3); Docosa-4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z-hexaensäure (22:6,n-3).
Verfahren gemäß Anspruch 7, worin der Fettsäure-GPR40-Ligand ausgewählt ist aus trans-Retinolsäure; cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure; Palmitinsäure; Pentadecansäure; Elaidinsäure; Petroselinsäure; Heptadecansäure; Tridecansäure; Laurinsäure; Arachidonsäure; Linolensäure; Palmitoleinsäure; Caprinsäure; Myristinsäure; Stearinsäure; Undecansäure; und Eicosatriinsäure.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, umfassend: (a) Bereitstellen einer Zelle, die auf ihrer Oberfläche einen GPR40-Rezeptor exprimiert und ein Reporterkonstrukt enthält, das folgendes umfaßt: (i) ein reagierendes Transkriptionselement, das aus einem Gi-reagierenden Transkriptionselement, einem Gq-reagierenden Transkriptionselement und einem Gi/Gq-reagierenden Transkriptionselement ausgewählt ist; und (ii) ein Reportergen, worin die Expression des Reportergens ein detektierbares Signal erzeugt; (b) Inkontaktbringen der Zelloberfläche mit einer Testverbindung und einem GPR40-Agonisten unter Bedingungen, die die Bindung eines GPR40-Liganden an den GPR40-Rezeptor erlauben; und (c) Detektieren von Reportergenexpression; worin eine verringerte Reportergenexpression in Gegenwart von sowohl Testverbindung als auch Agonist, verglichen mit der Reportergenexpression in Gegenwart nur des GPR40-Agonisten, anzeigt, daß die Testverbindung ein GPR40-Antagonist ist.
Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Vergleichsschritt das Vergleichen des gemessenen detektierbaren Signals mit einem vorgegebenen Standard umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Vergleichsschritt das Bereitstellen einer Kontrollzelle, das Inkontaktbringen der Kontrollzelle mit dem GPR40-Fettsäureagonisten, das Messen des durch das Reportergen erzeugten detektierbaren Signals und das Vergleichen der Kontrollzellmessungen mit den Testzellmessungen umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das Reportergen ein Enzym codiert, das aus Luciferase, Phosphatase, sezernierter alkalischer Phosphatase, R-Galactosidase, grün fluoreszierendem Protein, beta-Lactamase und Chloramphenicolacetyltransferase ausgewählt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, worin die Zelle eine Säugerzelle ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, worin das reagierende Transkriptionselement ein Gi-reagierendes Transkriptionselement ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, worin das reagierende Transkriptionselement ein Gq-reagierendes Transkriptionselement ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, worin das reagierende Transkriptionselement ein Gi/Gq-reagierendes Transkriptionselement ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, worin das Gi/Gq-reagierende Transkriptionselement Gal4/ELK-1 ist.