DE10123958A1 - Verfahren zur Identifizierung von Liganden für G protein coupled receptors - Google Patents

Abstract

Vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Liganden für orphan GPCRs.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Liganden für orphan GPCRs (G protein coupled receptors) mittels FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader).

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) spielen eine zentrale Rolle bei einer Vielzahl unterschiedlichster physiologischer Prozesse. Es wird angenpmmen, daß im menschlichen Genom etwa 1000 Gene für diese Rezeptorfamilie kodieren. Schätzungsweise 60% der gegenwärtig verfügbaren, verschreibungspflichtigen Arzneimittel wirken als Agonisten oder Antagonisten von GPCRs. Dies unterstreicht die bedeutende Rolle dieser Rezeptorklasse für die arzneimittelforschende Industrie. Aufgrund der Größe und Bedeutung der Proteinfamilie und angesichts Tatsache, daß für viele GPCRs noch kein physiologischer Ligand bekannt sind (orphan GPCRs), ist davon auszugehen, daß diese Rezeptorklasse in Zukunft eines der wichtigsten Reservois für geeignete Zielproteine bei der Suche nach neuen Arzneistoffen sein wird.

GPCRs sind eine Familie von integralen Membranproteinen, die auf der Zelloberfäche von Zellen lokalisiert sind. Sie empfangen Signale von extrazellulären Signalstoffen (z. B. Hormone, Neurotransmitter, Peptide, Lipide) und übertragen diese Signale über eine Familie von Guanin-Nucleotid-bindenden Proteinen, sogenannten G-Proteinen, ins Zellinnere. Dabei aktivieren sie in Abhängigkeit von der Spezifität des Rezeptors, des aktivierten G-Proteines und des Zelltyps verschiedene Signaltransduktionswege.

Die Polypeptidkette aller GPCRs falten sich zu sieben α-Helices, die die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran durchspannen. Aufgrund der sieben Membrandurchgänge ergeben sich extra-, und intrazelluläre Loops, die die extrazelluläre Ligandenbindung und die intrazelluläre Kopplung von G-Proteinen ermöglichen. Aus diesem Grund werden GPCRs auch als Sieben-transmembranäre Rezeptoren bezeichnet.

Alle G-Protein gekoppelten Rezeptoren funktionieren nach einem gemeinsamen Grundmuster: die Bindung eines extrazellulären Liganden führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptorproteins, so daß dieses Kontakt mit einem G- Protein aufnehmen kann. Über G-Protein-vermittelte Signaltransduktionskaskaden innerhalb der Zelle kommt es letztendlich zu einer biologischen Antwort der Zelle.

G-Proteine sind heterotrimere Proteine, die aus den Untereinheiten α, β und γ bestehen und aufgrund von Lipidankern auf der Innenseite der Zellmembran lokalisiert sind. Die Kopplung von aktivierten GPCRs an G-Proteine bewirkt einen GDP/GTP-Austausch der Gα-Untereinheit und die Dissoziation des Heterotrimers in eine α-, und eine βγ-Untereinheit. Sowohl die aktivierte α-Untereinheit als auch der βγ-Komplex können intrazelluläre Effektorproteine beeinflussen.

Die Aktivierung der membranständigen Adenylat-Cyclase (AC) durch G-Proteine vom Typ Gαs führt beispielsweise zum Anstieg des intrazellulären cAMP Spiegels bzw. zu dessen Abfall bei Aktivierung von G-Proteinen vom Typ Gαi. G-Proteine vom Typ Gq aktivieren die Phospholipase C (PLC), die die Bildung von Inositol- 1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) katalysiert. Diese Moleküle wiederum führen zur Freisetztung von Ca²⁺ aus intrazellulären Speichern, bzw. der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) mit weiteren Effekten in beiden Fällen. Neben den o. g. genannten G-Protein-Typen (Gαi/s, Gq) existieren noch zahlreiche weitere Typen, die als G16, G12/13 etc. bezeichnet werden. Die Vielfalt von G- Protein-Typen spiegelt die Vielzahl unterschiedlichster Funktionen von GPCRs wider.

Die meisten GPCRs binden nur an Gα-Untereinheiten eines Typs, d. h. sie besitzen Selektivität für einen bestimmten Signaltransduktionsweg. Für den Zweck ein Verfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe chemische Verbindungen identifiziert werden sollen, die GPCR-abhängige Signaltransduktionswege anschalten, ist diese enge Spezifität sehr hinderlich. Darüberhinaus sind für einen industriellen Assaytyp mit hohem Probendurchsatz (High Throughput Screening = HTS) beipielsweise nur solche Siganltransduktionswege geeignet, die schnelle und einfach auszuwertende read-outs liefern. Der Anstieg des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels durch Gq bzw. G16- Proteine erfüllt diese Vorraussetztung. Mit dem Ziel, möglichst alle GPCRs funktionell an den Ca²⁺-pathway zu koppeln und sie so einem HTS-Screening zugänglich zu machen, wurden in den letzten Jahren vermehrt sogenannte promiscuitive G-Proteine konstruiert. Promiscuität bezeichnet die Unselektivität des G-Proteins gegenüber einem GPCR. Mittels der Methoden der Molekularbiologie und Biochemie können promiscuitive G-Proteine aus Hybrid-G-Proteinen oder durch Mutagenese innerhalb der G16-Familie hergestellt werden. So kann z. B. durch die Fusion der Rezeptorerkennungsregion von Gαi mit der Effektor-Aktivierungsregion von Gαq ein Gαq/i-Hybrid hergestellt werden, das Signale von Gi-gekoppelten Rezeptoren empfängt aber den Gαq-PLCß-Signaltransduktionsweg anschaltet. Ein derartiges Hybrid, bei welchem die C-terminalen 5 Aminosäuren von Gαq durch die entsprechende Gαi-Sequenz ersetzt worden ist (Gαqi5) wurde von Conklin et al., Nature 363, 274-276 (1993) erstmalig beschrieben.

Diese "Umkopplung" von Rezeptoren hat den Vorteil, daß der Assayendpunkt (Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration im Vergleich zur Hemmung der Adenylatcyclase) einfacher durch meßtechnische Verfahren zugänglich ist und im High-Throughput-Screening verwendet werden kann. Ein Gerät, das im 96-well bzw. 384-well-Formal intrazelluläre Ca²⁺-Spiegel messen kann ist der FLIPR (Molecular Devices).

Für viele GPCRs sind noch keine natürlichen Liganden bekannt. Solche GPCRs werden orphan (orphan: engl.: Weisenkind) GPCRs genannt.

Beispiele für orphan GPCRs sind der GPR3, 6 oder 12 des Menschen. GPR steht für eine andere Bezeichnung von G-protein coupled-receptor. Die Zahlen beziehen sich auf den spezifischen Typ. Für alle drei Rezeptoren fand man ursprünglich eine starke Ausprägung im Zentralnervensystem. Mittlerweile konnte aber nachgewiesen werden, daß GPR3, 6 und 12 auch im periphären Gefäßsystem (Endothelzellen und glatte Muskelzellen) exprimiert werden. Es ist deshalb davon auszugehen, daß diese Rezeptoren eine essentielle Rolle spielen in der Physiologie/Pathophysiologie des Endothels und somit des gesamten Gefäßsystems des Menschen. Die Entstehung von Bluthochdruck, Atherosklerose oder anderen Herzkreislauferkrankungen könnte mit diesen Rezeptoren in Zusammenhang gebracht werden.

Anhand von Sequenzvergleichen wurde eine hohe Homologie zu GPCRs mit Lipidliganden festgestellt. Aufgrund der sequenziellen Ähnlichkeit ist es naheliegend, daß es sich bei GPR3, 6 und 12 ebenfalls um Lipidrezeptoren handeln könnte.

Die Sequenzinformationen für die Gene der drei Rezeptoren sind für die Öffentlichkeit zugänglich.

Die Zugangsnummer der Sequenzen sind für das humane Gen des GPR3 die Nummer "L 32831 ", für das humane Gen GPR 6 die Nummer "L 36150" und für das humane Gen des GPR 12 die Nummer "U 18548". Die Informationen sind erhältlich beispielsweise über www.ncbi.nlm.nih.gov.

Die Identifizierung von Liganden für GPCRs wird üblicherweise in Laborexperimenten durch Versuch und Irrtum festgestellt. Dieses Vorgehen hat den Nachteil, daß es häufig zeitraubend und vom Zufall gelenkt ist. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines schnellen und einfachen Verfahrens, mittels dessen ein oder mehrere Liganden für einen GPCR identifiziert werden können. Das Einfließen von Ergebnissen aus der Bioinformatik ist bierbei unverzichtbar für den Assayaufbau und die gezielte Suche nach physiologischen Liganden.

Bekannt war aus der Literatur, dass der humane GPR3 konstitutiv aktiv die G- Proteine des αs-Typs stimulieren kann (Eggerickx et al. 1995). Es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob es sich im Falle des GPR3 um einen wahrhaft permanent aktiven GPCR handelte, oder ob nicht vielmehr ein Faktor im Zellkulturmedium die konstitutive Aktivität auslöste.

Durch Sequenzvergleiche ist eine Verwandtschaft der Rezeptoren GPR3, 6, 12 mit Rezeptoren offenbar, die lipidartige Liganden binden. Lipide sind außerdem wesentliche Bestandteile des Zellkulturmediums. Aus diesem Grund lag die Spekulation nahe, dass im Medium vorhandene Lipide die Rezeptoraktivierung verursachen könnten.

Bereits maximal aktivierte Rezeptoren lassen sich nicht mehr zusätzlich stimulieren, so daß die Zellen für das Finden der potentiellen Stimulatoren einem Hungerzustand (Serum- und damit Lipidreduktion im Medium) ausgesetzt wurden. Hungernde Rezeptoren sollten sich durch exogene Zugabe des Aktivators anschalten lassen.

Versucht wurde in der vorliegenden Erfindung, die Rezeptoren nach der Stimulation mit potentiellen Lipid-Aktivatoren an den HTS-fähigen Ca²⁺-Weg zu schalten. Die funktionellen Versuche wurden in Gegenwart von 300 µM Suramin durchgeführt, um den durch endogene Lipidrezeptorexpression vorhandenen background zu reduzieren und die durch GPR3, 6, 12 vermittelten Signale zu potenzieren.

Ein physiologischer Ligand ist ebenfalls unbekannt für den GPR3 der Ratte. Für diesen Rezeptor liegt in öffentlich zugänglichen Datenbanken nur eine partielle Sequenz vor (Zugangsnummer: L 32829).

Damit entsteht der Nachteil beispielsweise für Selektivitätsuntersuchungen bezüglich Arzneimitteln, zu deren Profilierung auf diesen Rezeptor nicht zurückgreifen zu können. Als Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird deshalb auch die Bereitstellung eines vollständigen Gens des GPR3 der Ratte angesehen.

Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Identifizierung eines Liganden eines G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCRs) wobei

• a) eine Zelle zur Verfügung gestellt wird, deren endogene Siganaltransduktionskaskaden die Kopplung der orphan GPCRs GPR3, 6 und 12 als auch rGPR3 an den Ca²⁺-pathway erlauben. Essentiell ist hier die Kultivierung der Zellen (HEK293) in Medium mit 1% FCS und der Zugabe von 300 µM Suramin zur Reduktion des endogenen, lipid-induzierten Hintergrundsiganls.
• b) die Zelllinie aus a) mit einem rekombinaten Konstrukt eines GPCR so transfiziert wird, daß besagtes GPCR in dieser Zelllinie überexprimiert wird,
• c) mindestens eine chemische Verbindung zur Verfügung gestellt wird, die aufgrund von theoretischen Vorüberlegungen gestützt durch die Bioinformatik und Literaturrecherchen (Eggerickx et al. 1995) als möglicher Ligand in Betracht kommt.
• d) die chemische Verbindung aus c) mit der Zelllinie aus b) in Kontakt gebracht wird,
• e) eine Fluoreszenzmessung in einem FLIPR-Assay mittels eines calciumsensitiven Fluoreszensfarbstoff nach In-Kontakt-Bringen gemäß d) durchgeführt wird,
• f) eine Auswertung der Messergebnisse durch Vergleich der Ergebnisse der Fluoreszenzmessung aus e) mit den Ergebnissen einer Fluoreszenzmessung nach In-Kontakt-Bringen einer Zelle gemäß a) mit einer chemischen Verbindung gemäß c) vorgenommen wird.

Die GPCRs der vorliegenden Erfindung (GPR3, 6 und 12) wechselwirken insbesondere mit der Gαi-Klasse der G-Protein-α-Untereinheiten. Die Aktivierung von Gαi bewirkt die Inhibition der Adenylat Cyclase. Darüber hinaus kann der βγ- Komplex seinerseits eine intrazelluläre Freisetzung von Ca²⁺ aus Speicherorganellen bewirken. Im Hinblick auf einen FLIPR-Assay mit Gαi- oder αs­ koppelnden GPCRs werden G alpha Proteine verwendet, die GPCRs unterschiedlicher Ligandenspezifität an den Ca²⁺ Signalweg koppeln. Das Protein "Gα16" ist insbesondere geeignet zur Durchführung eines Verfahrens der vorstehend genannten Erfindung. Weitere Ga Proteine, die zur Durchführung der Verfahrensverwendet werden können, sind in der DE 100 33 353.2 offenbart.

Durch rekombinante Techniken können unterschiedliche GPCRs in Zelllinien zusammengeführt und getestet werden. Bevorzugt für die Durchführung des Verfahrens wird ein GPCR verwendet, für den noch kein physiologischer Ligand bekannt ist. Als physiologischer Ligand soll ein Molekül verstanden werden, welches von einem biologischen Organismus insbesondere einem Säugetier gebildet wird, an diesen GPCR bindet und dadurch eine Aktivierung eines nachgeschalteten G alpha Proteins bewirkt.

Weiterhin bevorzugt eignet sich zur Durchführung ein GPCR aus der Gruppe GPR3, 6 oder 12. Besonders bevorzugt eignet sich der vollständige Rezeptor des GPR3 aus Ratte.

Als Zellen eignen sich bevorzugt solche von Säugetieren. Diese Zellen können aus Primärzellen oder Zelllinien bestehen. Beispiele für solche Zellen sind Primärzellen aus Organen von Säugetieren (z. B. Gehirn, Muskel, Fettgewebe, Herz, Lunge, Leber, Niere, Blutgefäße, Hormondrüsen u. a.). Geeignete Zelllinien sind bevorzugt CHO-, HEK 293, COS-, Maus 3T3-, Hela- Zellen oder andere. Weiterhin bevorzugt können Hefezellen verwendet werden.

Die Bereitstellung einer Zelle umfaßt deren Herstellung, Anzucht und Weiterverarbeitung. Die Bereitstellung erfolgt beispielsweise durch Präparation geeigneten Zellmaterials aus Organen oder Geweben oder durch die Vermehrung von geeigneten Zelllinien oder Mikroorganismen. Für die Anzucht können verschiedene geeignete Nährmedien verwendet werden. Die Zellen werden bei der für den Organismus optimalen Temperatur gehalten. Gegebenenfalls werden dem jeweils verwendeten Wachstumsmedium Konservierungsmittel, Antibiotika, pH- Indikatoren, Blutserumbestandteile, Blutserum, Hilfsstoffe oder anderes zugegeben. Verfahren zur Herstellung, Anzucht und Weiterverarbeitung sind in Standartwerken beschrieben. (Beispiel: Basic Cell Culture; Ed. J. M. Davis; IRL Press; 1994).

Die Anwendung rekombinanter Technologien sieht voraus, daß ein in eine Zelle zu exprimierende Konstrukt in Form einer Polynuklestidsequenz vorliegt, das vom Fachmann routinemäßig unter Zuhilfenahme seines Fachwissens hergestellt werden kann. Das Fachwissen des biochemischen/molekularbiologischen Fachmanns hierfür findet dieser beispielsweise in "F. M. Ausubel et al.; Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley & Sons; New York". Zur Herstellung einer Vektorkonstruktion wird ein Polynukleotid, welches für die Aminosäuresequenz beispielsweise eines GPCRs codiert, in einen Expressionsvektor eingebaut. Als Expressionsvektor soll ein Vektor verstanden werden, in dem eine Polynukleotidsequenz in einer Wirtzelle transfiziert und exprimiert werden kann. Vektoren können abgeleitet sein von Plasmiden, Viren, oder Cosmiden. Vektoren müssen die Fähigkeit zur autonomen Replikation besitzen. Sie enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung, Schnittstellen für Restriktionsenzyme und Markergene wie beispielsweise Gene für Antibiotikaresistenzen. In einem Expressionsvektor steht die zu vermehrende fremde oder von außen eingefügte Polynukleotidsequenz unter funktioneller Kontrolle eines Promotors. Ein Promotor ist eine funktionelle Polynukleotidsequenz unterschiedlicher Länge mittels derer die Transkription d. h. die Synthese von mRNA einer unmittelbar in 3'-Richung hinter dem Promotor liegender Polynukleotidsequenz gesteuert wird. Es gibt Promotoren, die nur in Prokaroten aktiv sind, wie beispielsweise den lac-, tac- oder trc-Promotor sowie Promotoren, die nur in Eukaryoten aktiv sind, wie beispielsweise den CMV-, T-, oder ADH Promotor. Entsprechend unterscheidet man prokaryotische von eukaryotischen Expressionsvektoren.

Die rekombinante Vektorkonstruktion besteht in einer bevorzugten Ausführungsform aus einem in Eukaryoten und/ oder Prokaryoten verwendbaren Expressionsvektor. Ein Expressionsvektor enthält einen Promotor, der funktionell mit einer Polynukleotidsequenz verbunden werden kann, so daß ein von dieser Polynukleotidsequenz codiertes Protein in einem biologischen Organismus beispielsweise einem Bakterium, Pilz oder der Zeller einer eukaryotischen Zellinie synthetisiert wird. Der Promotor kann induzierbar sein beispielsweise mittels Tryptophan oder er kann konstitutiv aktiv sein. Beispiele für Expressionsvektoren sind pUC18, pUC19, pBluesccript, pcDNA3.1 oder andere.

Als Transfektion soll das Einschleusen von fremden Polynukleotidsequenzen mittels eines Vektors in eine Wirtzelle und die anschließende Vermehrung dieser Polynukleotidsequenz zu einer beliebigen Anzahl identischer Kopien verstanden werden.

Die transiente Transfektion einer Zellinie mit einem rekombinanten Konstrukt erfolgt mittels Routineverfahren die der Fachmann in vorstehend erwähnten "Current Protocols in Molecular Biology" veröffentlicht von John Wiley & Sons, New York oder in "Sambrook et al., A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-309-6" findet. Solche Routineverfahren sind beispielsweise die Elektroporation, die Ca²⁺-Phosphat-Copräzipation oder die Transfektion mit Hilfe von Liposomen. Die Expression transfizierter Gene in der Wirtszelle kann durch Western-Blotting von Zelllysaten transfizierter Zellen in Kombination mit einem immunologischen Nachweisverfahren erfolgen. Auch hierfür erhält der Fachmann in eben genannten Handbüchern die erforderlichen Laborprotokolle. Spezifische Antikörper zum immunologischen Nachweis von GPCR-Rezeptoren, die sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrens eignen (z. B. EDG 1-8) sind z. T. kommerziell erhältlich. Ein Anbieter unter mehreren ist die Firma Exalpha Biologicals (www.exalpha.com). Die Immunisierung von Kaninchen gegen GPR3, 6 und 12 wurde im Hinblick auf die Gewinnung von spezifischen Antikörpern vorgenommen.

Eine chemische Verbindung wird zur Verfügung gestellt insbesondere durch chemische Synthese oder durch Isolierung chemischer Stoffe aus biologischem Material. Biologisches Material enthält lebende oder nicht lebende Zellen oder Bestandteile von diesen.

Für die chemische Synthese einer Verbindung bzw. die Isolierung eines Stoffes aus biologischen Zellen kann der Fachmann auf Routinemethoden zurückgreifen. Solche Methoden stehen dem Fachmann zur Verfügung in Lehrbüchern wie dem "Organic Synthesis Workbook; 1995; John Wiley & Sons; ISBN 3-527-30187-9", dem "The Organic Chemistry of Drug Synthesis; 1998; John Wiley & Sons; ISBN 0-471-24510-0" oder dem ""Bioactive Compounds from Natural Sources; 2001; Taylor & Francis; ISBN0-7484-0890-8".

Die durch Synthese oder Isolierung gewonnenen Verbindungen können in einem geeigneten Lösungsmittel in Lösung gebracht werden. Geeignete Lösungsmittel können Wasser, Puffersubstanzen (z. B. Tris, Hepes, Mops u. a.) einwertige und/oder zweiwertige Ionen (z. B. K+, Na+, Mg²⁺, Ca²⁺ u. a.), Säuren (z. B. HCL, H₂SO₄, Ameinsensäure, Essigsäure u. a.), Laugen (z. B. NaOH u. a.), Alkohol (z. B. Methanol, Ethanol, Glycerin), Detergenzien (z. B. Na-dodecylsulfat u. a.), organische Lösungsmittel (z. B. Formamid, Azeton, Dimethylsulfoxid u. a.) sowie weitere Bestandteile insbesondere zur Lösungsvermittlung oder Stabilisierung enthalten. Eine chemische Verbindung für das erfindungsgemäße Verfahren sollte sich als Ligand für einen GPCR eignen. Diese chemische Verbindung könnte aufgrund von Ähnlichkeit der GPR3, 6 und 12 zu Lipid-GPCRs ebenfalls ein Lipid sein.

Eine solche Verbindung kann insbesondere aus Geweben oder Organen von Wirbeltieren wie z. B. Endothelzellgewebe, Herzgewebe, Gehirngewebe, Blut, Serum oder Plasma gewonnen werden. Bevorzugt eignet sich zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahrens der natürliche Ligand eines GPCR.

Zum In-Kontakt-Bringen der chemischen Verbindung mit der genannten Zellinie kann der Fachmann Routinemethoden aus dem Labor verwenden. Das In-Kontakt- Bringen erfolgt beispielsweise in Erlenmayergefäßen, Röhrchen, Eppendorfgefäßen oder auf Mikrotiterplatten. Zum In-Kontakt-Bringen können temperierte Brutschränke verwendet werden, in denen eine konstante Temperatur von beispielsweise 30°C oder 37°C sowie gleichmäßige CO₂-Bedingungen oder Luftfeuchtigkeitsbedingungen einregelbar sind. Das In-Kontakt-Bringen kann insbesondere auch in dafür vorgesehenen Vorrichtungen eines Laborroboters (FLIPR) vorgenommen werden. Das In-Kontakt-Bringen ist über unterschiedliche Zeitspannen von wenigen Sekunden, über Minuten bis zu mehreren Stunden möglich. Die jeweils zu wählenden Bedingungen hängen vom Rezeptor, der Zellinie und der chemischen Verbindung ab.

Nach dem In-Kontakt-Bringen wird eine Fluoreszenzmessung mittels FLIPR durchgeführt. FLIPR steht für Fluometric Imaging Plate Reader. Das System eignet sich zur Messung von intrazellulären Ca²⁺-Signalen. Die Bestimmungen werden in Miktotiterplatten mit 96 bzw. 384 Vertiefung durchgeführt. Die Bindung eines Liganden an einen GPCR führt zur intrazellulären Freisetzung von Ca²⁺. Die Menge des freigesetzten Ca²⁺ kann über einen calziumsensitiven Fluoreszenzfarbstoff (z. B. fluo-4) bestimmt werden. Durch Vergleich des Ca²⁺-Signals einer Zelle mit dem Ca²⁺-Signal einer GPR3, 6 oder 12-überexprimierenden Zelle kann ein Ligand für diesen GPCR ermittelt werden. Ein solcher Ligand aktiviert die Ca²⁺-Freisetzung viel stärker in der Zelle, die einen GPCR funktionell überexprimiert. Die technische Ausrüstung des FLIPR-Systems einschließlich der Reagenzien zur Bestimmung von Ca²⁺ sind kommerziell erhältlich. Ein Anbieter ist insbesondere die Firma Molecular Devices mit Büros unter anderem in Sunnyvale (CA), Ismaning (AE) oder Ashiya (JP).

Die Erfindung betrifft auch einen Liganden, der über das vorstehend beschriebene Verfahren identifiziert wurde. S1P und DHS1P bewirken eine Ca²⁺-Freisetzung in HEK293 Zellen. Suramin wurde im vorliegenden Assay zur Reduktion des endogenen Lipidbackground eingesetzt.

Ein natürlicher Ligand wird von einem Organismus z. B. einem Wirbeltier gebildet, um einen GPCR im Kontext des Organismus zweckhaft zu aktivieren. Der Zweck besteht insbesondere in der Initiierung biochemischer Funktionen wie z. B. der Anschaltung von Aktionspotentialen, um Sinnesreize zu verarbeiten, dem Anschalten einer Gensynthese für ein strukturelles oder als Botenstoff fungierendes Protein, der Ausschüttung von Botenstoffen, der Regulierung von Stoffwechselfunktionen, der Regulierung von Organfunktionen wie dem Herzschlag der dem Blutdruck oder ähnlichen biologischen Abläufen. Eine chemische Verbindung, die sich als Ligand für einen GPCR eignet, bindet an diesen GPCR. Die Bindung eines Liganden löst eine Aktivierung dieses Rezeptors aus. Die Aktivierung eines GPCR führt im erfindungsgemäßen Verfahren zur Freisetzung intrazelluläen Ca²⁺ in der Zelle.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Arzneimittel welches einen vorstehend genannten Liganden enthält sowie weiterhin Zusatzstoffe zur Stabilisierung des Liganden und/oder zur Formulierung eines Arzneimittels. Die Erfindung bezieht sich auch auf die Herstellung eines Arzneimittels. Hierzu wird der vorstehend genannte Ligand mit den Zusatzstoffen gemischt, anschließend wird das Arzneimittel zur Endform prozessiert, abgefüllt, mit einem Beipackzettel versehen und abgepackt.

Die Endform eines Arzneimittels betrifft die Endformulierung beispielsweise als Tablette, Granulat, Spray, Lösung, Salbe, Tinktur oder andere Formulierungsformen. Die Prozessierung zur Endform bezieht sich auf die Herstellung der jeweiligen Formulierung.

Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung eines Liganden wie vorstehend genannt zur Herstellung eines Arzneimittels, welches sich zur Behandlung einer Krankheit eignet, die auf einer Fehlfunktion der GPCR, an den dieser Ligand bindet. Bevorzugt wird der Ligand zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzkreislauferkrankungen sowie ZNS-Erkrankungen verwendet.

Der Ligand liegt vorzugsweise mit einem verträglichen Trägen in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vor. Der Träger muß natürlich verträglich sein, in dem Sinne, daß er mit den anderen Bestandteilen der Zusammensetzung kompatibel ist und nicht gesundheitsschädlich für den Patienten ist. Der Träger kann ein Feststoff oder eine Flüssigkeit oder beides sein und wird vorzugsweise mit der Verbindung als Einzeldosis formuliert, beispielsweise als Tablette, die von 0,05% bis 95 Gew.-% des Wirkstoffes enthalten kann.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach einer der bekannten pharmazeutischen Methoden hergestellt werden, die im wesentlichen darin bestehen, die Bestandteile mit pharmakologisch verträglichen Träger- und/oder Hilfsstoffen zu mischen. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen sind solche, die für orale, rektale, topische, perorale (z. B. sublinguale) und parenterale (z. B. subkutane, intramuskuläre, intradermale oder intravenöse) Verabreichungen geeignet sind.

Die Menge eines wie vorstehend genannten Liganden, die erforderlich ist, um einen gewünschten biologischen Effekt zu erzielen, ist abhängig von einer Reihe von Faktoren wie z. B. der gewählten spezifischen Verbindung, der beabsichtigten Verwendung, der Art der Verabreichung oder dem klinischen Zustand des Patienten. Im folgenden genannte Mengenangaben beziehen sich auf einen Liganden.

Im allgemeinen liegt die Tagesdosis im Bereich von 0,3 mg bis 100 mg (typischerweise von 3 mg und 50 mg) pro Tag pro Kilogramm Körpergewicht, z. B. 3-10 mg/kg/Tag. Eine intravenöse Dosis kann z. B. im Bereich von 0,3 mg bis 1,0 mg/kg liegen, die geeigneterweise als Infusion von 10 ng bis 100 ng pro Kilogramm pro Minute verabreicht werden kann. Geeignete Infusionslösungen für diese Zwecke können z. B. von 0,1 ng bis 10 mg, typischerweise von 1 ng bis 10 mg pro Milliliter, enthalten. Einzeldosen können z. B. von 1 mg bis 10 g des Wirkstoffes enthalten. Somit können Ampullen für Injektionen beispielsweise von 1 mg bis 100 mg, und oral verabreichbare Eizeldosisformulierungen, wie zum Beispiel Tabletten oder Kapseln, können beispielsweise von 1,0 bis 1000 mg, typischerweise von 10 bis 600 mg enthalten.

Die Erfindung bezieht sich auch auf eine Polynukleotidsequenz gemäß Seq ID Nr. 1, welche für ein GPR3 der Ratte codiert. Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Protein für den GPR3 der Ratte enthaltend wenigstens eine Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2.

Die Erfindung enthält auch einen Expressionvektor, in welchen vorstehend genannte Polynuklestidsequenz des GPR3 der Ratte gemäß Seq ID Nr. 1 eingebaut wurde. Die Erfindung betrifft außerdem die Herstellung einer Zelle, welche den GPR3 der Ratte enthaltend wenigstens die Aminosäuresequenz gemäß Seq ID Nr. 2 exprimiert, wobei diese Zelle mittels des vorstehend genannten Expressionsvektor transfiziert wurde.

Bezüglich Expressionsvektoren und Zellen sei auf die in früheren Abschnitten gemachten Ausführungen dieser Erfindung verwiesen. Der Fachmann findet die Methoden zur Herstellung und Charakterisierung der Polynuklestidsequenz nach Seq ID Nr. 1, des Proteins enthaltend wenigstens die Aminosäuresequenz nach Seq ID Nr. 2, des Expressionsvektors und der Zellen in Handbüchern wie den "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; ISBN 0-471-50338-x" oder in "Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN 0-87969-309-6"

Beispiele Beispiel 1 Klonierung der humanen GPR3, 6 und 12

Die humanen Gene von GPR3, 6 und 12 enthalten keine Introns. Sie können deshalb mittels PCR (polymerase chain reaction) aus humaner genomischer DNA amplifiziert werden. Über die Hind III/XbaI Stellen von pcDNA 3.1 (Invitrogen) wurden die codierenden Sequenzen kloniert.

Beispiel 2 Klonierung des GPR3 der Ratte

Die Sequenz des vollständigen Gens von GPR3 der Ratte wurde mittels PCR- Amplifizierung aus cDNA des Rattengehirns unter Verwendung des 5'-Primers 5'- ATG CTT GCC ATG GCC TGG TTC TCA GCC GCC TCA-3' ('Seq ID3) und des 3'Primers (mouse) 5'-TCT AGA CTA GAC ATC ACT AGG GGA CCG GGA-3'(Seq ID4) vermehrt. Der 5'-Primer stellt zusätzlich eine Hind III-Stelle zur Verfügung und erzeugt eine Kozac-Sequenz vor dem Start-Codon. Im 3'Primer ist eine XbaI-Stelle mit berücksichtigt. Das 990 bp lange Amplifizierungsprodukt wurde in die Hind III/XbaI-Stellen von pcDNA 3.1 (Invitrogen) kloniert und anschließend sequenziert.

Beispiel 3 Expression der GPR-Gene

HEK293-Zellen (Zelllinie aus Human Embryonic Kidneys) wurden kultiviert in DMEM, welches ergänzt war durch 10% fötales Rinderserum 10 000 lU/ml Penicillin, 10 000 µg/ml Streptomycin und 25 mM Hepes ph 7,0. CHO-K1-Zellen (Zelllinie aus Chinese Hamster Ovary) wurde kultiviert in Iscove-Medium, welches ergänzt war durch 10% fötales Rinderserum, 10 000 lU/ml Penicillin, 10 000 µg/ml Streptomycin, Gentamycin und 2 mM L-Glutamin. Iscove-Medium ist kommerziell erhältlich z. B. von Biochrom.

Zur Durchführung transienter Transfektionen wurden 5 × 10⁵ HEK293-Zellen oder 2 × 10⁵ CHO-K1-Zellen in 6 weIl Platten 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit 1 bis 2 µg eines Vectors, in welchen ein GPR3, 6 oder 12 unter Kontrolle des eukoryotischen CMV-Promotors oder eines Kontrollplasmids ohne entsprechendes Klonierungsinsert transfiziert. Die Transfektion wurde im Falle der HEK293-Zellen mit Hilfe von FuGene 6 transfection reagent (kommerziell erhältlich, beispielsweise von Roche Diagnostics) und im Falle von CHO-Zellen mit Hilfe von Lipofectamine reagent (kommerziell erhältlich, beispielsweise von GIBCO- BRL) nach Vorschrift der Hersteller durchgeführt.

Beispiel 4 Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR)-Assay

HEK293-Zellen wurden 24 Stunden nach transienter Transfektion auf 96 well Mikrotiterplatten überführt. Die Zelldichte betrug 80 000 Zellen pro well. Die Mikrotiterplatten waren mit poly-D-Lysin beschichtet. Die Zellen wurden für 18 bis 24 Stunden in Medium mit 1% FCS (fötales Kälberserum) gehalten. Nach dem Trypsinieren wurden die Zellen in DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium), welches zusätzlich 25 mM HEPES (N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N'-2- ethansulfonsäure) ph 7,0, 1% FCS, 10 000 lU/ml Penicillin, 10 000 µg/ml Streptomycin und 4 µM dye fluo4 (fluorescent calcium indicator von Molecular Dynamics) enthielt suspendiert und anschließend für 1 Std. bei 37°C unter 5% Co₂ inkubiert. Die Zellen wurden danach 3 mal mit PBS (Phosphat gepufferte Saline) gewaschen, welches 1 mM MgCl₂, 1 mM EDTA und 0,4 mg/ml FAF-BSA (Rinderserumalbumin frei von Fettsäuren) enthielt. Nach dem letzten Waschschritt betrug das Volumen 100 µM pro weil. Die zu untersuchenden Verbindungen lagen zumeist als 2 mM Stammlösungen in DMSO (Dimethylsulfoxid) vor. Diese verdünnte man im Verhältnis 1 : 500 mit der PBS-Lösung, welche 1 mM MgCl₂ 1 mM EDTA und 0,4 mg/ml FAF-BSA enthielt. Lipide lagen vor dem Assay als dreifach konzentrierte Lösungen vor. Suramin (Sigma) wurde in PBS enthaltend 1 mM MgCl₂, 1 MEDTA und 0,4 mg/ml FAF BSA als dreifach konzentrierte Lösung angesetzt.

Der FLIPR wurde so programmiert, daß 50 µl aus der dreifach konzentrierten Stammlösung des Suramin zu den Zellen gegeben wurde. Man erhielt damit eine Endkonzentration von 300 µM bezüglich Suramin. Die Fluoreszenz wurde die ersten 3 Minuten in 3 Sekunden Intervallen und die letzten 2 Minuten in 10 Sekunden Intervallen gemessen. Analog wurden Ca²⁺-Signale von Liganden bestimmt. Die Fluoreszenzmeßwerte des Zeitintervalls von 18 Sekunden bis 37 Sekunden wurden verwendet, um Agonistaktivität zu bestimmen.

Das Gerät selbst nimmt einen internen Vergleich der Nullwerte vor.

Beispiel 5 Identifizierung von Liganden für GPCR 3, 6 und 12

GPCR 3, 6 und 12 sind orphan Rezeptoren der GPCR-Proteinfamile Mit Hilfe von Genbank-Recherchen (EMBL) konnten die Lipidrezeptoren EDG-, (endothelial differentation gene) und Cannabinoid-GPCRs als die strukturell am nächsten Verwandten von GPR3, 6 und 12 identifiziert werden. Innerhalb einer Spezies beträgt die Homologie bezogen auf die Nukleotidsequenz 65-68%. Die humanen Sequenzen zeigen im Vergleich zu den Ratten-Sequenzen jeweils 87% (GPR3), 83% (GPR 6) bzw. 88% (GPR 12) Homologie.

RT-PCR-Analysen (RT-PCR = Reverse transcripase polymerase chain reaction) zeigen die übereinstimmende Expression von hGPR3, 6 und 12 in cerebralen Geweben und Herz-Kreislauf-relevanten Organen (z. B. Herz, Niere). Darauf aufbauend konnte die Expression in isolierten Endothel-, und glatten Muskelzellen belegt werden.

Mit Hilfe eines Ca²⁺-FLIPR-Assays in HEK293-Zellen konnten die Lipide Sphingosin 1-Phosphat (S1P) und Dihydrosphingosin 1-Phosphat (DHS1P), als physiologische Liganden von hGPR3, 6 und 12 identifiziert werden. Die EC₅₀-Werte lagen bei kleiner als 100 nM für S1P und DHS1P. Der Einsatz einer Lipidlibrary aus 200 bioaktiven Lipide lieferte keinen weiteren Liganden und zeigte darüber hinaus die Unwirksamkeit von Cannabinoiden. Der neu klonierte rGPR3 (L 32829, 33 bp partielle Sequenz) läßt sich ebenso wie sein humanes Homolog durch S1P/DHS1P in einem Ca²⁺-FLIPR-Assay anschalten.

Die Kopplung von GPR3, 6 und 12 an den Ca²⁺-Signaltransduktionsweg funktioniert in HEK293-Zellen ohne die Kotransfektion von G16 oder anderen chimären, promiscous Gα-Untereinheiten. Die S1P/DHS1P-induzierte Ca²⁺ Freisetzung in HEK293-Zellen ist Pertussistoxin-sensitiv, d. h. die Signaltransduktionskaskade läuft über G-Proteine des Typs Gαi. Außerdem ist die Ca²⁺-Freisetzung partiell sensitiv gegenüber Inhibitoren der Sphingosin-Kinase.

Da sie mit S1P/DHS1P den identischen Liganden wie Mitglieder der EDG-Familie haben, und auch in ihrem Expressionsmuster größtenteils mit den EDGs übereinstimmen, ist anzunehmen, daß sie vergleichbare physiologische Funktionen ausüben (Schutz vor Apoptose, Angiogenese, Proliferationsförderung und - hemmung, Plättchenaktivierung, vasoaktive Effekte, Chemotaxis, Zelldifferenzierung etc.).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (21)

1. Verfahren zur Identifizierung eines Liganden eines G-Protein gekoppelten Rezeptors (GPCRs) wobei

• 1. a] eine Zelle zur Verfügung gestellt wird, die ein G alpha Protein enthält, welches mindestens einen GPCR an den Ga/Ca²⁺ Signalweg koppelt,
• 2. b] die Zelllinie aus a] mit einem rekombinanten Konstrukt eines GPCR so transformiert wird, daß gesagtes GPCR in oder auf dieser Zelllinie exprimiert wird,
• 3. c] mindestens eine chemische Verbindung, zur Verfügung gestellt wird,
• 4. d] die chemische Verbindung aus c] mit der Zelllinie aus b] in Kontakt gebracht wird,
• 5. e] eine Fluoreszenzmessung in einem FLIPR mittels eines Calcium sensitiven Fluoreszenzfarbstoff nach In-Kontakt-Bringen gemäß d] durchgeführt wird,
• 6. f] eine Auswertung der Messergebnisse durch Vergleich der Ergebnisse der Fluoreszenzmessung aus e] mit den Ergebnissen einer Fluoreszenzmessung nach In-Kontakt-Bringen einer Zelle gemäß a] mit einer chemischen Verbindung gemäß c] vorgenommen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen eine HEK 293, CHO-, COS-, Maus 3T3-, HeLa-Zelle ist, aus dem Organ eines Säugetiers präpariert und in Kultur genommen wurde oder eine Hefezelle ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das G alpha Protein GPCRs unterschiedlicher Spezifität bezüglich der Liganden an den Gq/Ca²⁺-Signalweg koppelt.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei für den GPCR noch kein Ligangd identifiziert werden konnte.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei der GPCR aus der Gruppe der GPR3, 6 oder 12 eines Säugetiers oder des Menschen gewählt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der GPR3 der Ratte verwendet wird.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6 wobei als chemische Verbindung ein Peptid, Polysaccharid, eine Fettsäureverbindung, ein Polynukleotid oder ein organisches Molekül, wobei das Molekulargewicht der chemischen Verbindung zwischen 0,1 bis 25 kDa liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Molekulargewicht zwischen 0,1 bis 10 kDa liegt.

9. Ligand eines GPCR, welcher durch ein Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 identifizierbar ist.

10. Ligand gemäß Anspruch 9, wobei das Molekulargewicht des Liganden zwischen 0,1 bis 25 kDa liegt.

11. Ligand gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei der Ligand ein Protein, Polysaccharid, eine Fettsäureverbindung oder ein Polynukleotid ist.

12. Ligand für GPR3, 6 oder 12 nach Anspruch 9, 10 oder 11, der aus LPA, S1P oder Suramin besteht.

13. Arzneimittel enthaltend einen Liganden nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 12, sowie Zusatzstoffe zur Stabilisierung des Liganden und/oder zur Formulierung eines Arzneimittels.

14. Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 13, wobei der Ligand zuerst mit den Zusatzstoffen gemischt wird, das Arzneimittel zur Endform prozessiert wird, anschließend abgefüllt, mit dem Beipackzettel versehen und abgepackt wird.

15. Verwendung eines Liganden nach einem der Ansprüche 9 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, die auf der Fehlfunktion eines GPCR, an die besagter Ligand bindet, beruht.

16. Verwendung eines Liganden nach Anspruch 16 zur Behandlung von Herzkreislauferkrankungen.

17. Eine Polynukleotidsequenz kodierend für den GPR3 der Ratte gemäß SEQ ID. NO. 1.

18. Ein Protein für den GPR3 der Ratte enthaltend die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. NO. 2.

19. Ein Expressionsvektor enthaltend eine Polynukleotidsequenz nach Anspruch 17.

20. Eine Zelle enthaltend einen Expressionsvektor nach Anspruch 19.

21. Herstellung einer Zelle nach Anspruch 20, welche ein Protein nach Anspruch 18 exprimiert, durch Transformation der Zelle mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 19.