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DE60115600T2 - Virusstämme für die onkolytische behandlung von krebs - Google Patents

Virusstämme für die onkolytische behandlung von krebs Download PDF

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DE60115600T2
DE60115600T2 DE60115600T DE60115600T DE60115600T2 DE 60115600 T2 DE60115600 T2 DE 60115600T2 DE 60115600 T DE60115600 T DE 60115600T DE 60115600 T DE60115600 T DE 60115600T DE 60115600 T2 DE60115600 T2 DE 60115600T2
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DE
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gene
strain
hsv
virus
functional
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DE60115600T
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Stuart Robert COFFIN
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Original Assignee
Biovex Ltd
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Publication date
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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nicht-Labor-HSV-Stämme mit verbesserten onkolytischen Fähigkeiten im Vergleich zu Laborvirusstämmen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Viren wurden bei einer Vielfalt von Anwendungen in der Biotechnologie und Medizin für viele Gelegenheiten als nützlich vorgeschlagen oder nachgewiesen. Dies liegt jeweils an der einzigartigen Fähigkeit von Viren, mit hoher Effizienz in Zellen einzudringen. Dem folgt bei diesen Anwendungen entweder die Expression und Replikation eines viralen Gens und/oder die Expression eines eingeführten heterologen Gens. So können Viren entweder Gene in Zellen transportieren und exprimieren (entweder virale oder andere Gene), die zum Beispiel in der Gentherapie oder der Entwicklung von Impfstoffen nützlich sein können, oder sie können zur selektiven Abtötung von Zellen durch lytische Replikation oder die Aktivität eines übertragenen Gens bei beispielsweise Krebs nützlich sein.
  • Herpes-simplex-Virus (HSV) wurde als nützlich sowohl als ein Genübertragungsvektor in das Nervensystem und an anderen Stellen als auch für die onkolytische Behandlung von Krebs vorgeschlagen. Bei beiden Anwendungen muss das Virus jedoch unschädlich gemacht werden, so dass es nicht mehr pathogen ist, doch nach wie vor in Zellen eindringen und die gewünschte Funktion erfüllen kann. Daher ist für die nicht-toxische Genübertragung an Zielzellen unter Verwendung von HSV erkannt worden, dass in den meisten Fällen die Immediate-Early-Gen-Expression vom Virus verhindert/minimiert werden muss. Für die onkolytische Behandlung von Krebs, was auch die Übertragung von Gen(en) zur Erhöhung der therapeutischen Wirkung um fassen kann, wurde eine Anzahl von Mutationen an HSV identifiziert, die dem Virus nach wie vor das Replizieren in Kultur oder in sich in vivo aktiv teilenden Zellen (z.B. in Tumoren) erlauben, die aber eine signifikante Replikation in gesundem Gewebe verhindern. Zu solchen Mutationen zählt die Zerstörung der ICP34.5-, ICP6- und Thymidinkinase-codierenden Gene. Von diesen haben Viren mit Mutationen an ICP34.5, oder ICP34.5 in Verbindung mit Mutationen z.B. von ICP6, bisher das günstigste Sicherheitsprofil gezeigt. Von Viren, die lediglich für ICP34.5 deletiert sind, wurde die Replikation in vielen Tumorzelltypen in vitro nachgewiesen und eine selektive Replikation in künstlich induzierten Hirntumoren in Mäusen unter Aussparung des umgebenden Gewebes gezeigt. In klinischen Frühphasen-Studien wurde außerdem ihre Sicherheit für den Menschen nachgewiesen.
  • Obschon sich allerdings verschiedene Viren einschließlich HSV für den Gentransfer/Therapie oder für die onkolytische Behandlung von Krebs als vielversprechend erwiesen haben, wurden beim Großteil dieser Arbeit Virusstämme verwendet, die für viele Jahre in Gewebekulturzellen aufbewahrt worden sind. Bei Anwendungen, bei denen das Virus zur Übertragung der Gene lediglich in Zellen einzudringen braucht, muss sich dies nicht als problematisch erweisen, da die Aufbewahrung in Zellkultur ebenfalls das Eindringen des Virus in Zellen erfordert, obschon oftmals in Zellen eines unterschiedlichen Typs oder Spezies im Vergleich zu den wahrscheinlichen Zielzellen für einen Vektor. Bei Anwendungen jedoch, bei denen andere Eigenschaften erforderlich sind, bietet die Verwendung von Laborvirusstämmen möglicherweise nicht das volle Potenzial eines bei einer speziellen Anwendung auszunützenden Virus.
  • HSV weist unter den derzeit als Vektoren in Entwicklung befindlichen Viren das einzigartige Merkmal auf, dass es sich natürlich dahin entwickelt hat, Neuronen zu infizieren und darin latent zu bleiben. HSV hat sich auch dahin entwickelt, bei hoher Effizienz entlang der Nerven von der Infektionsstelle, die üblicherweise an der Peripherie liegt, zum neuronalen Zellkörper, der üblicherweise in den Spinalganglien liegt, transportiert zu werden. Diese Fähigkeiten sind in Zellkultur nicht erforderlich, und da diese Fähigkeiten spezifisch entwickelte Eigenschaften des HSV erfordern, könnte eine weitere Anpassung an das Wachstum in Kultur zum Verlust der optimal effizienten axonalen Transportfähigkeiten geführt haben. HSV-Vektoren für den Gentransfer zum zentralen oder peripheren Nervensystem zeigen mit einiger Wahrscheinlichkeit eine maximale Wirksamkeit, wenn die axonalen Transporteigenschaften bei maximaler Effizienz aufrecherhalten geblieben sind. Hierbei würde eine Einimpfung an einer peripheren Stelle dann einen maximal effizienten Gentransfer zu peripheren Neuronenzellkörpern ermöglichen, und eine Einimpfung in das Gehirn würde einen maximal effizienten Gentransfer an vielfache damit verbundene Stellen ermöglichen. Die aktuellen, auf Laborstämmen des HSV basierenden Vektoren, lassen dies möglicherweise nicht bei der maximal möglichen Effizienz eintreten. In der Tat liegt aufgrund der hohen Transportfähigkeit des HSV entlang der Nerven potenziell eine besonders große Diskrepanz zwischen den Eigenschaften vor, die es erwünschterweise konservieren soll und jenen, die wahrscheinlich in Kultur erhalten bleiben.
  • HSV und andere Viren, wie z.B. Adeno- oder Rheovirus, weisen außerdem einen potenziellen Nutzen in der onkolytischen Behandlung von Krebs auf. Allerdings sind auch hier die für diese Zwecke in Entwicklung befindlichen Viren zuvor umfangreich in Kultur gehalten worden. Da die onkolytische Behandlung von Krebs eine aktive Replikation in oftmals relativ langsam wachsenden humanen Tumorzellen erfordert, wäre anzunehmen, dass die Anpassung von Laborvirusstämmen an das Wachstum in speziellen kultivierten Zellen die Effizienz möglicherweise herabgesetzt hat, mit der diese lytische Replikation in humanen Tumorzellen, oder die Infektion von humanen Tumorzellen, optimalerweise erfolgen könnte.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Viren mit verbesserten in vivo-Fähigkeiten für eine lytische Zerstörung von Tumorzellen bereit. Für diese Zwecke geeignete Virusstämme werden auf der Basis jüngerer klinischer Isolate des entsprechenden Virus anstelle der reihenweise passagierten Laborstämme, die zuvor verwendet worden sind, konstruiert. Die vorliegende Erfindung stellt daher Viren mit verbesserten Fähigkeiten zum Infizieren humaner Zellen in vivo und einer verbesserten replikativen/lytischen Fähigkeit in diesen Zellen bereit.
  • Wir haben gezeigt, dass zwei klinische Isolate von HSV1 (Stämme JS1 und BL1) eine erhöhte Replikation in einigen humanen Tumorzelllinien im Vergleich zum HSV1-Stamm 17+ (einen standardmäßigen Laborstamm) zeigen.
  • Wir haben ICP34.5 aus dem klinischen Isolat JS1-Stamm deletiert und nochmals das replikative Potenzial in humanen Tumorzelltypen im Vergleich zum HSV1-Stamm 17+ (einem standardmäßigen Laborstamm) verglichen, in welchen ICP34.5 ebenfalls deletiert war. Dieser Stamm (JS1/ICP34.5-) ist ein modifizierter Stamm, der von einem klinischen Isolat abgeleitet ist, und stellt daher einen modifizierten Nicht-Laborstamm der Erfindung dar.
  • JS1 mit dem deletierten ICP34.5 zeigte ein erhöhtes Wachstum in einigen humanen Tumorzellen, das im Vergleich zu HSV1-ICP34.5-deletiertem Stamm 17+, d.h. einem Laborvirusstamm mit derselben Modifikation, getestet wurde. Im Vergleich zu dem von Stamm 17+ abgeleiteten Laborstamm war jedoch das Zellabtötungsvermögen mit dem Virus JS1/ICP34.5- bei allen getesteten Tumorzelllinien erhöht.
  • In der Folge ist bei Verwendung dieser Nicht-Laborvirusstämme eine Steigerung der Antitumor-Kapazitäten dieser Viren erkennbar und war bei allen bisher getesteten Tumorzelllinien evident. Dies wird eine Anwendbarkeit für die Krebsbehandlung bei Humanpatienten erbringen.
  • Eine weiter erhöhte Aktivität kann ebenfalls erwartet werden, wenn diese Viren dann zur Übertragung von Genen mit Antitumor-Aktivität verwendet werden. Zu solchen Genen zählen jene, die Prodrug-Aktivatoren, Tumorsuppressoren oder proapoptotische Faktoren oder immunstimulatorische Proteine codieren.
  • Zu diesem Zweck haben wir ein ICP34.5-deletiertes klinisches Isolat von HSV1 erzeugt, welches humanen GMCSF exprimiert. Dieses Virus ist daraufhin designed, Antitumor-Immunreaktionen auf die intratumorale Injektion hin zu erhöhen.
  • Die Erfindung stellt auch Viren der Erfindung bereit, die ein heterologes Gen/Gene tragen. Der Begriff heterologes Gen soll jegliches Gen umfassen, das nicht im viralen Genom zu finden ist. Das heterologe Gen kann jegliche allele Variante eines Wildtyp-Gens sein, oder es kann ein mutiertes Gen sein. Heterologe Gene sind vorzugsweise an einer Kontrollsequenz operativ geknüpft, die die Expression dieses heterologen Gens in einer Zelle in vivo ermöglicht. Viren der Erfindung können daher zum Transfer eines heterologen Gens/Gene in eine Zelle in vivo verwendet werden, in welcher es exprimiert werden wird. Für die onkolytische Virustherapie codieren solche Gene typischerweise Proteine, die zur Erhöhung der Tumor-zerstörenden Eigenschaften des Virus fähig sind. Diese Gene können Proteine codieren, die selbst cytotoxisch sind, die Prodrug-aktivierend sind oder die zur Stimulierung/Verstärkung einer Antitumor-Immunreaktion fähig sind.
  • In allen Fällen können einzelne oder mehrfache heterologe Gene von einem einzigen Virus getragen werden.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung bereit:
    HSV1-Stamm JS1, wie hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) unter der Zugriffsnummer V01010209, oder ein davon abgeleiteter HSV1-Stamm, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die solch ein Virus umfasst; dieses Virus zur Verwendung in der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers; die Verwendung dieses Virus in der Herstellung eines Medikaments für die onkolytische Behandlung von Krebs und ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein Gen die Antitumor-Effekte eines HSV-Stamms verstärkt, umfassend:
    • (i) Bereitstellen eines HSV-Stamms, wie hierin definiert;
    • (ii) Einführen dieses Gens in den HSV-Stamm; und
    • (iii) Auswerten der Fähigkeit dieses modifizierten, onkolytischen HSV-Stamms zum Replizieren in oder Abtöten von Tumorzellen im Vergleich zur Fähigkeit des Vorläufer-Stamms, wie in Schritt (i) bereitgestellt.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Viren
  • Von oben nach unten zeigen die Diagramme: Labor-HSV1-Stamm 17+, klinischer Stamm BL1, klinischer Stamm JS1, 17+/ICP34.5-, JS1/ICP34.5-, JS1/ICP34.5-/ICP47-/hGMCSF.
  • 2. Klinische Isolate zeigen ein erhöhtes Wachstum in Tumorzellen
    • (1) Wachstum von 17+, BL1 und JS1. Linkes Diagramm: U87-Zellen. rechtes Diagramm: LNCaP-Zellen.
    • (2) Wachstum von ICP34.5- 17+ und JS1 auf Tumorzellen. Linkes Diagramm: LNCaP-Zellen. Rechtes Diagramm: MDA-MB-231-Zellen.
    • (3) JS1/34.5- wächst nicht auf Zellen, die für HSV ICP34.5-Mutanten nicht-permissiv sind. Linkes Diagramm: 3T6-Zellen – 17+, JS1. Rechtes Diagramm: 3T6-Zellen – 17+, JS1 ICP34.5-.
  • 3. Ein ICP34.5-deletiertes klinisches HSV-Isolat zeigt eine erhöhte Lyse in allen getesteten Tumorzellen
  • Die Tumorzelllinien wurden entweder mock-infiziert, mit HSV1-Stamm 17+/34.5- infiziert oder mit HSV1-Stamm JS1/34.5- bei der angegebenen MOI infiziert und mit Kristallviolett zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion angefärbt, um eine Sichtbarmachung der Zellen zu ermöglichen. Jeder Block der Fotographien bezieht sich auf einen Zelltyp. Von oben nach unten sind dies HT29-kolorektales Adenokarzinom, LNCaP.FGC-Prostataadenokarzinom, MDA-MB-231-Brustadenokarzinom, SK-MEL-28-malignes Melanom und U-87-MG-Glioblastom-Astrozytom. Die linken Blöcke betreffen die Ergebnisse für den HSV1-Stamm 17+/34.5-. Die rechten Blöcke betreffen die Ergebnisse für den HSV1-Stamm JS1/34.5-. Die zentralen Blöcke betreffen mock-infizierte Zellen. Innerhalb jedes Blocks stellt die obere Reihe einen 24-Stunden-Zeitpunkt dar, die zweite Reihe einen 48-Stunden-Zeitpunkt und die dritte einen 72-Stunden-Zeitpunkt innerhalb jedes Blocks dar, die linke Spalte steht für MOI = 0,2, die mittlere Spalte für MOI = 0,1 und die rechte Spalte für MOI = 5.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • A. Viren
  • Virusstämme der Erfindung
  • Ein Virusstamm der Erfindung ist Herpes-simplex-Virus 1 (HSV1) Stamm JS1 oder ein davon abgeleiteter Stamm.
  • Die Derivate weisen vorzugsweise mindestens 70% Sequenzhomologie zum HSV1-Genom, bevorzugter mindestens 80%, sogar noch bevorzugter mindestens 90% oder 95% auf. Bevorzugter weist ein Derivat mindestens 70% Sequenzidentität zum HSV1-Genom, bevorzugter mindestens 80% Identität, sogar noch bevorzugter mindestens 90%, 95% oder 98% Identität auf.
  • Zum Beispiel stellt das UWGCG-Package das BESTFIT-Programm bereit, das zur Berechnung der Homologie (zum Beispiel in seinen Standardeinstellungen) angewendet werden kann (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, Seiten 387–395). Die PILEUP und BLAST-Algorithmen können zur Berechnung der Homologie oder zum Abgleich von Sequenzen (typischerweise in ihren Standardeinstellungen) verwendet werden, zum Beispiel wie von Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290–300; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403–10 beschrieben.
  • Die Software für die Durchführung der BLAST-Analysen ist über das National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich zugänglich. Dieser Algorithmus beinhaltet erstens die Identifizierung von high-scoring-Sequenzpaaren (HSPs) durch die Identifizierung kurzer Wörter der Länge W in der Abfragesequenz, die entweder paaren oder einen gewissen positiv bewerteten Schwellenwert T erfüllen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T ist als eine nachbarliche Wort-Score-Schwelle bezeichnet (Altschul et al., 1990). Diese ersten nachbarlichen Worttreffer dienen als Ausgangsbasis für erste Suchen nach HSPs, die sie enthalten. Die Worttreffer werden in beide Richtungen über jede Sequenz erweitert, sofern der kumulative Alignment-Score erhöht werden kann. Erweiterungen für die Worttreffer in jeder Richtung kommen zum Stillstand, wenn: der kumulative Alignment-Score um die Größe X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Score auf null oder darunter fällt, aufgrund der Akkumulation eines oder mehrerer negativer Scoring-Residue-Alignments; oder das Ende einer Sequenz erreicht ist. Die BLAST-Algorithmen-Parameter W, T und X legen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit des Alignments fest. Das BLAST-Programm verwendet als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, die BLOSUM62 Scoring-Matrix (siehe Henikoff und Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 10915–10919) Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und ein Vergleich beider Stränge.
  • Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5787. Ein Maß für die von dem BLAST-Algorithmus gelieferte Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), die einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit liefert, mit der eine Paarung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zufälligerweise erfolgen würde. Zum Beispiel wird eine Sequenz als ähnlich mit einer anderen Sequenz erachtet, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit beim Vergleich der ersten Sequenz mit der zweiten Sequenz kleiner als etwa 1, bevorzugt kleiner als etwa 0,1, bevorzugter kleiner als etwa 0,01 und am bevorzugtesten kleiner als etwa 0,001 ist.
  • Ein Derivat kann die Sequenz eines HSV1-Genoms aufweisen, das durch Nukleotidsubstitutionen, bei beispielsweise 1, 2 oder 3 bis 10, 25, 50 oder 100 Substitutionen, modifiziert ist. Das HSV1- oder HSV2-Genom kann alternativ oder zusätzlich durch ein oder mehrere Insertionen und/oder Deletionen und/oder durch eine Extension an einem oder beiden Enden modifiziert sein.
  • Eigenschaften des Virusstamms der Erfindung
  • Die HSV1-JS1-Stämme der Erfindung sind "Nicht-Labor"-Stämme. Sie können auch als "klinische" Stämme bezeichnet werden. Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres zur Unterscheidung zwischen einem Laborstamm und einem Nicht-Laborstamm, oder einem klinischen Stamm, in der Lage sein. Weitere Richtlinien zu den Eigenschaften, die von den Virusstämmen wahrscheinlich gezeigt werden, sind nachstehend angegeben.
  • Der grundlegende Unterschied zwischen einem Labor- und einem Nicht-Laborstamm ist der, dass die derzeit allgemein gebräuchlichen Laborstämme für lange Zeiträume, in manchen Fällen von einigen Jahren, in Kultur gehalten wurden. Die Kultur von Viren, wie etwa HSV, beinhaltet eine als Serienpassage bekannte Technik. Um die Viren zu züchten und zu erhalten, werden geeignete Zellen mit dem Virus infiziert, das Virus innerhalb der Zelle repliziert und das Virus dann geerntet; daraufhin werden frische Zellen reinfiziert: dieser Prozess stellt einen Zyklus der Serienpassage dar. Jeder dieser Zyklen kann zum Beispiel einige Tage im Falle von HSV benötigen. Wie oben erörtert, kann diese Serienpassage zu Veränderungen in den Eigenschaften des Virusstamms führen, d.h. es kann eine Selektion nach Eigenschaften erfolgen, die das Wachstum in Kultur begünstigen (z.B. schnelle Replikation), im Gegensatz zu Eigenschaften, die für praktische Anwendungen nützlich sind.
  • Die Virusstämme der Erfindung sind Nicht-Laborstämme, da sie von Stämmen abgeleitet sind, die erst kurz zuvor von infizierten Individuen isoliert wurden. Die Stämme der Erfindung sind im Vergleich zu den ursprünglichen klinischen Isolaten modifiziert und können eine gewisse Zeit in Kultur verbracht haben, doch wird jegliche in Kultur verbrachte Zeit vergleichsweise kurz sein. Die Stämme der Erfindung werden in solcher Weise präpariert, dass sie die gewünschten Eigenschaften der ursprünglichen klinischen Isolate, von denen sie abgeleitet sind, im Wesentlichen beibehalten.
  • Ein Virus der Erfindung ist zum wirksamen Infizieren von humanen Zielzellen fähig. Solch ein Virus ist vor kurzem von einem infizierten Individuum isoliert worden und wird dann auf die gewünschte erhöhte Replizierfähigkeit in Tumor- und/oder anderen Zellen in vitro und/oder in vivo im Vergleich zu standardmäßigen Laborstämmen, oder (im Falle neurotropher Viren wie HSV) auf eine erhöhte Transportfähigkeit entlang von Nerven im Vergleich zu standardmäßigen Laborstämmen unter Verwendung eines in vivo-Modells gescreent. Diese Viren mit verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu Laborvirusstämmen stellen die Viren der Erfindung dar. Identifizierte Viren mit diesen gewünschten verbesserten Eigenschaften können dann so gentechnisch verändert werden, dass sie selektiv Tumorzellen durch die Mutation eines geeigneten Gens/e abtöten können. Diese modifizierten Viren stellen ebenfalls Viren der Erfindung dar. Alternativ können Virusstämme aus einem infizierten Individuum isoliert werden und für eine onkolytische Therapie geeignete Mutationen vorgenommen werden. Diese modifizierten Viren werden dann auf die gewünschten verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu Laborstämmen gescreent, wobei Viren mit diesen verbesserten Eigenschaften ebenfalls Viren der Erfindung darstellen.
  • Weitere Richtlinien zu den wahrscheinlichen Eigenschaften der Virusstämme der Erfindung sind nachstehend angegeben.
  • Vorzugsweise hat ein Virusstamm der Erfindung seit der Isolierung seines unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamms aus seinem Wirt drei Jahre oder weniger in Kultur zugebracht. Bevorzugter hat ein Stamm der Erfindung ein Jahr oder weniger in Kultur zugebracht, zum Beispiel neun Monate oder weniger, sechs Monate oder weniger, drei Monate oder weniger oder zwei Monate oder weniger, einen Monat oder weniger, zwei Wochen oder weniger oder eine Woche oder weniger. Mit diesen Definitionen der Zeit in Kultur ist die tatsächlich in Kultur zugebrachte Zeit gemeint. Daher stellt es zum Beispiel eine verbreitete Praxis dar, die Virusstämme zur Konservierung einzufrieren. Einleuchtenderweise entspricht Konservieren durch Einfrieren oder in entsprechender Weise nicht einer Aufbewahrung des Stamms in Kultur. Daher ist die gefroren oder anderweitig konserviert verbrachte Zeit nicht von den obigen Definitionen von in Kultur verbrachter Zeit umfasst. Die in Kultur verbrachte Zeit ist typischerweise die Zeit, die eigentlich unter Durchlaufung einer Serienpassage verbracht wird, d.h. die Zeit, während welcher eine Selektion auf nicht erwünschte Eigenschaften erfolgen kann.
  • Ein Virusstamm der Erfindung hat vorzugsweise 10 oder weniger Zyklen einer Serienpassage seit der Isolierung seines unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamms aus seinem Wirt vollzogen.
  • Vorzugsweise weist ein Virus der Erfindung eine höhere Fähigkeit auf, wie mittels standardmäßigen statistischen Tests gemessen, als ein Referenz-Laborstamm mit den entsprechenden Modifikationen, bestimmte bei der vorliegenden Anwendung nützliche Funktionen zu erfüllen. Zum Beispiel weist im Falle eines onkolytischen Virus für die Tumorbehandlung ein Virusstamm der Erfindung vorzugsweise eine höhere Fähigkeit als ein Referenz-Laborstamm mit entsprechenden Modifikationen auf, jegliche Tumorzelle zu infizieren oder zu replizieren, Tumorzellen abzutöten oder sich zwischen Zellen in Gewebe auszubreiten. Bevorzugter ist diese höhere Fähigkeit eine statistisch signifikante höhere Fähigkeit. Zum Beispiel kann ein Virus der Erfindung das bis zu 1,1-fache, 1,2-fache, 1,5-fache, 2-fache, 5-fache, 10-fache, 20-fache, 50-fache oder 100-fache der Kapazität des Referenz-Stamms bezüglich der getesteten Eigenschaft aufweisen.
  • Vorzugsweise weist ein Virus der Erfindung im Wesentlichen die Fähigkeit seines unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamms bezüglich einer oder mehrerer der Eigenschaften auf, d.h. behält sie bei, die für die Nützlichkeit bei der vorliegenden Anwendung charakteristisch ist. Zum Beispiel weist im Falle eines onkolytischen Virus, das für die Behandlung von Tumoren vorgesehen ist, ein Virusstamm der Erfindung vorzugsweise im Wesentlichen die Fähigkeit seines unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamms zum Infizieren oder Replizieren einer Tumorzelle, Abtöten von Tumorzellen oder Ausbreiten zwischen Zellen in Gewebe auf.
  • Vorzugsweise behält ein Virus gemäß der Erfindung im Wesentlichen die Eigenschaften seines unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamms bei, wenn es in einem quantitativen Test 75%, bevorzugter 80, 90, 95, 98, 99 oder 100% der Kapazität des unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamms bezüglich der zu testenden Eigenschaft beibehält. Bevorzugter werden bezüglich der zu testenden Eigenschaft jegliche Unterschiede zwischen dem unmodifizierten klinischen Vorläufer-Stamm und dem modifizierten Stamm der Erfindung statistisch nicht signifikant sein.
  • Eine statistische Analyse der hierin beschriebenen Eigenschaften kann mittels standardmäßiger Tests vorgenommen werden, zum Beispiel t-Tests, ANOVA oder Chi-Squared-Tests. Typischerweise wird die statistische Signifikanz bei einem Niveau von p = 0,05 (5%), bevorzugter p = 0,01, p = 0,001, p = 0,0001, p = 0,000001 gemessen.
  • Modifikationen
  • Die Viren der Erfindung sind im Vergleich zu ihren klinischen Vorläufer-Stämmen typischerweise modifiziert. Insbesondere bestimmte Gene werden typischerweise nicht-funktionell gemacht, und die Viren können außerdem ein heterologes Gen/e umfassen. Typischerweise sind die Viren der Erfindung abgeschwächt.
  • Die für die hierin beschriebenen Zwecke veränderten viralen Regionen können entweder eliminiert (vollständig oder teilweise) oder nicht-funktionell gemacht werden, oder durch andere Sequenzen, insbesondere durch eine heterologe Gensequenz, substituiert werden. Ein oder mehrere Gene können nicht-funktionell gemacht werden, und ein oder mehrere heterologe Gene können inseriert werden.
  • Onkolytische Viren der Erfindung
  • Bei einer Ausführungsform sind die Viren der Erfindung modifizierte, onkolytische Nicht-Laborviren. Diese werden für der onkolytischen Behandlung von Krebs nützlich sein. Diese Viren infizieren und replizieren in Tumorzellen, wodurch sie anschließend die Tumorzellen abtöten. Daher sind diese Viren replikationskompetent. Vorzugsweise sind sie selektiv replikationskompetent in Tumorzellen. Dies bedeutet, dass sie entweder in Tumorzellen replizieren und nicht in Nicht-Tumorzellen, oder dass sie in Tumorzellen effizienter replizieren als in Nicht-Tumorzellen. Die Messung der selektiven Replikationskompetenz kann mittels der hierin zur Messung der Replikation und der Tumorzell-Abtötkapazität beschriebenen Tests durchgeführt und außerdem mittels der hierin erwähnten statistischen Techniken analysiert werden, sofern erwünscht.
  • Ein onkolytisches Virus der Erfindung weist vorzugsweise eine höhere Fähigkeit als ein Referenz-Laborstamm mit denselben Modifikationen auf, eine Tumorzelle zu infizieren und darin zu replizieren, Tumorzellen abzutöten oder sich zwischen Zellen in Geweben auszubreiten. Vorzugsweise ist diese Fähigkeit eine statistisch signifikant höhere Fähigkeit, wie hierin beschrieben. Die Eigenschaften des Virusstamms bezüglich der Tumorzellen können in jeglicher im Fachgebiet bekannter Weise gemessen werden.
  • Zum Beispiel kann die Kapazität eines Virus zum Infizieren einer Tumorzelle durch Messen der Dosis an Virus quantifiziert werden, die zur Messung eines gegebenen Prozentsatzes von Zellen, zum Beispiel 50% oder 80% der Zellen, erforderlich ist. Die Kapazität zum Replizieren in einer Tumorzelle kann durch Wachstumsmessungen gemessen werden, wie etwa in den Beispielen durchgeführt (siehe 2), z.B. durch Messen des Viruswachstums in Zellen über einen Zeitraum von 6, 12, 24, 36, 48 oder 72 Stunden oder länger.
  • Die Fähigkeit eines Virus, Tumorzellen abzutöten, lässt sich grob mit dem bloßen Auge quantifizieren (siehe 3) oder exakter durch Zählen der Anzahl lebender Zellen, die im Zeitverlauf für einen gegebenen Zeitpunkt und MOI für einen gegebenen Zelltyp verbleiben. Zum Beispiel können Vergleiche über 24, 48 oder 72 Stunden unter Verwendung irgendeines bekannten Tumorzelltyps vorgenommen werden. Insbesondere können HT29-kolorektales Adenokarzinom, LNCaP.FGC-Prostataadenokarzinom, MDA-MB-231-Brustadenokarzinom, SK-MEL-28-malignes Melanom oder U-87-MG-Glioblastom-Astrozytomzellen verwendet werden. Jeglicher dieser Zelltypen oder jegliche Kombination dieser Zelltypen kann verwendet werden, ebenso wie andere Tumorzelltypen. Die Konstruktion eines standardmäßigen Panels von Tumorzelltypen mag für diese Zwecke wünschenswert sein. Zur Zählung der Anzahl lebender Zellen, die zu einem gegebenen Zeitpunkt verblieben sind, kann die Zahl der Trypanblau-ausschließenden Zellen (d.h. lebende Zellen) gezählt werden. Die Quantifizierung kann auch mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) oder MTT-Assay erfolgen. Die Fähigkeit zur Tumorzellabtötung kann auch in vivo gemessen werden, z.B. durch eine Messung der Verminderung des Tumorvolumens, wie durch ein bestimmtes Virus hervorgebracht.
  • Die Fähigkeit eines Virus, sich in Gewebe, insbesondere festem Gewebe, auszubreiten, kann durch Bestimmen der Anzahl von Zellen an Stellen bestimmt werden, die mit der Stelle der ursprünglichen Infektion in Verbindung stehen.
  • Um die Eigenschaften der Viren der Erfindung zu bestimmen, wird allgemein die Verwendung eines standardmäßigen Referenz-Laborstamms für Vergleichszwecke wünschenswert sein. Der standardmäßige Referenz-Laborstamm ist einer oder meh rere vom HSV1-Stamm 17+, HSV1-Stamm F und HSV1-Stamm KOS. Der Referenzstamm wird typischerweise äquivalente Modifikationen zum zu testenden Stamm der Erfindung aufweisen. So wird der Referenzstamm typischerweise äquivalente Modifikationen aufweisen, wie z.B. Gendeletionen und/oder heterologe Geninsertionen. Sind beispielsweise die ICP34.5- und IC47-codierenden Gene im Virus der Erfindung nicht-funktionell gemacht worden, so werden diese auch im Referenzstamm nicht-funktionell gemacht worden sein. Die am Referenzstamm vorgenommenen Modifikationen können identisch mit denen am Stamm der Erfindung vorgenommenen sein. Damit ist gemeint, dass die Genzerstörungen im Referenzstamm an exakt entsprechenden Positionen zu denen im Stamm der Erfindung vorliegen werden, z.B. werden Deletionen von derselben Größe und an derselben Stelle sein. Ähnlich werden bei diesen Ausführungsformen heterologe Gene an derselben Stelle inseriert sein und von demselben Promotoren gesteuert werden etc. Allerdings ist es nicht wesentlich, dass identische Modifikationen erzeugt werden. Wichtig ist, dass das Referenz-Gen funktionell äquivlente Modifikationen aufweist, z.B. dass dieselben Gene nicht-funktionell gemacht werden und/oder dasselbe heterologe Gen oder Gene inseriert wird.
  • In einem onkolytischen Virus der Erfindung werden geeignete Modifikationen am Virus zur Verleihung einer onkolytischen Aktivität, sofern diese nicht natürlicherweise vorhanden ist, und vorzugsweise zur Verleihung einer selektiven onkolytischen Aktivität, vorgenommen werden.
  • Zu diesen Mutationen, die eine selektive onkolytische Aktivität ermöglichen, zählt eine Mutation an den Genen, die ICP34.5, ICP6 und/oder Thymidinkinase (TK) codieren, vorzugsweise ICP34.5. Solche Mutationen am ICP34.5-codierenden Gen in Laborstämmen von HSV sind beschrieben bei Chou et al. 1990, Maclean et al. 1991, obschon jegliche Mutation, bei der ICP34.5 nicht-funktionell ist, angewendet werden kann.
  • Demgemäß ist der HSV-Stamm vorzugsweise so modifiziert, dass ihm ein oder mehrere von einem funktionellen ICP34.5-codierenden Gen, einem funktionellen ICP6-codierenden Gen, einem funktionellen Glykoprotein H-codierenden Gen, einem funk tionellen Thymidinkinase-codierenden Gen fehlen.
  • Bevorzugter fehlt dem Virus ein funktionelles IC34.5-codierendes Gen.
  • Weitere Modifikationen können ebenfalls vorgenommen werden. Insbesondere kann das Virus so modifiziert werden, dass ihm ein funktionelles ICP47-Gen fehlt. Dies liegt daran, dass ICP47 üblicherweise darauf hinwirkt, die Antigen-Präsentation in HSV-infizierten Zellen zu blockieren, so dass seine Zerstörung zu einem Virus führt, das infizierten Tumorzellen keine speziellen Eigenschaften verleiht, die diese HSV-infizierten Zellen vor dem Immunsystem des Wirts schützen würden.
  • Viren, bei denen irgendwelche anderen Gene deletiert/mutiert sind, die onkolytische Eigenschaften verleihen (d.h. selektive Replikation in Tumoren gegenüber dem umgebenden Gewebe), stellen ebenfalls Viren der Erfindung dar. Fachleute des Gebiets werden ohnehin erkennen, dass die obige Liste nicht erschöpfend ist und dass die Identifizierung der Funktion weiterer Gene in jedem der obigen Viren die Konstruktion neuer Viren nahe legen kann, die ebenfalls Viren der Erfindung darstellen.
  • Heterologe/s Gen(e) können ebenfalls in solche Viren der Erfindung mittels im Fachgebiet bekannter und/oder hierin beschriebener Techniken eingeführt werden. In einem onkolytischen Virus wird das heterologe Gen typischerweise ein solches sein, das die Kapazität des Virus zum Wirken gegen Tumoren erhöht. Folglich kann jegliches Gen, das dem Virus Antitumor-Eigenschaften verleiht, inseriert werden. Insbesondere kann das heterologe Gen ein Gen sein, das zur Modifikation der Immunreaktion gegen die Tumorzellen in einer günstigen Weise fähig ist, insbesondere ein immunstimulatorisches Polypeptid wie CD40L, Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor (GMCSF), ein anderes Zytokin oder Chemokin (z.B. RANTES), B7.1 oder B7.2 oder IL 12. Alternativ kann das heterologe Gen einen Prodrug-Aktivator wie Nitroreduktase oder Zytochrom P450 codieren. In diesem Zusammenhang wird die kombinierte Behandlung von Tumoren mit der durch den Prodrug-Aktivator aktivierten Prodrug und einem Virus der Erfindung ins Auge gefasst. Alternativ kann das heterologe Gen einen Tumorsuppressor wie p53 codieren.
  • B. Komplementierende Zelllinien
  • Ist das Virus der Erfindung ein Herpes-simplex-Virus, dem ein bestimmtes funktionelles essentielles Gen fehlt, zum Beispiel ein Gen, das ICP4 oder ICP27 codiert, so wird das Virus der Erfindung auf einer Zelllinie vermehrt, die jenes essentielle Gen exprimiert. Fehlt dem Virus beispielsweise ein funktionelles ICP27-Gen, so kann das Virus auf V27-Zellen (Rice und Knipe, 1990), 2-2-Zellen (Smith et al., 1992) oder B130/2-Zellen (Howard et al., 1998) vermehrt werden. Fehlt dem Virus ein funktionelles ICP4-Gen, so kann das Virus auf einer Zelllinie vermehrt werden, die ICP4 exprimiert, zum Beispiel E5-Zellen (DeLuca et al., 1985). Fehlt dem Virus ein funktionelles ICP4-Gen und ein funktionelles ICP27-Gen, so wird das Virus auf einer Zelllinie vermehrt, die sowohl ICP4 als auch ICP27 exprimiert (wie etwa E26-Zellen; Samaniego et al., 1995), und fehlt dem Virus zusätzlich ein funktionelles vmw65-Gen, so kann das Virus auf einer Zelllinie vermehrt werden, die außerdem ein Nicht-HSV-Homologon von vmw65 enthält (z.B. von equinem Herpes-Virus wie bei Thomas et al., 1999). Mutationen von vmw65 können auch durch Aufnahme von Hexamethylenbisacetamid (HMBA) in das für das Viruswachstum verwendete Medium (MacFarlane et al., 1992) teilweise kompensiert werden.
  • ICP27-exprimierende Zelllinien können durch Cotransfektion von Säugerzellen, zum Beispiel den Vero- oder BHK-Zellen, mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmidvektor, der ein funktionelles HSV ICP27-Gen umfasst, das in jenen Zellen exprimierbar ist, und einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmidvektor, der einen selektierbaren Marker, zum Beispiel die Neomycin-Resistenz, codiert, produziert werden. Die Klone, die den selektierbaren Marker besitzen, werden dann weiter gescreent, um zu bestimmen, welche Klone auch funktionelles ICP27 exprimieren, zum Beispiel auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, das Wachstum von ICP27-HSV-Stämmen zu unterstützen, unter Anwendung von Methoden, wie sie den Fachleuten des Gebiets bekannt sind (zum Beispiel wie beschrieben bei Rice und Knipe, 1990).
  • Zelllinien, die keine Umkehrung eines ICP27-mutierten HSV-Stamms zu einem Stamm mit einem funktionellen ICP27 erlauben, werden wie oben beschrieben produziert, wobei sichergestellt wird, dass der ein funktionelles ICP27-Gen umfassende Vektor keine Sequenzen enthält, die mit Sequenzen überlappen (d.h. dazu homolog sind), die im ICP27-mutierten Virus verbleiben.
  • Wo HSV-Stämme der Erfindung inaktivierende Modifikationen in weiteren essentiellen Genen umfassen, zum Beispiel ICP4, werden komplementierende Zelllinien ein funktionelles HSV-Gen umfassen, welches das modifizierte essentielle Gen in derselben Weise wie für ICP27 beschrieben komplementiert. Zum Beispiel wird im Falle von HSV-Stämmen, die Mutationen sowohl in ICP27 als auch ICP4 umfassen, eine Zelllinie, die sowohl ICP27 als auch ICP4 exprimiert, verwendet (wie etwa beschrieben bei Samaniego et al., 1995 oder bei Thomas et al., 1999). HSV-Stämme, die weitere essentielle Gene exprimieren, können in ähnlicher Weise zu der für ICP27 beschriebenen konstruiert werden. Auch hierbei ist, wenn sichergestellt ist, dass keine Sequenzüberlappung zwischen der verbliebenen Virus-DNA und der in die Zelllinie für das Viruswachstum inserierten DNA vorliegt, die Möglichkeit einer Reversion des Virus zu einer weniger unschädlich gemachten Form während des Wachstums minimiert.
  • C. Methoden der Mutation
  • Die verschiedenen genannten viralen Gene können mittels mehrerer im Fachgebiet wohlbekannter Techniken funktionell inaktiv gemacht werden. Zum Beispiel können sie durch Deletion(en), Substitution(en) oder Insertion(en), vorzugsweise durch Deletion, funktionell inaktiv gemacht werden. Eine Deletion kann einen Abschnitt von Genen oder das gesamte Gen entfernen. Zum Beispiel kann die Deletion von lediglich einem Nukleotid vorgenommen werden, was zu einem Frame-Shift führt. Vorzugsweise wird jedoch eine größere Deletion vorgenommen von zum Beispiel mindestens 25%, bevorzugter mindestens 50% der gesamten codierenden und nicht-codierenden Sequenz (oder alternativ, absolut ausgedrückt, mindestens 10 Nukleotiden, bevorzugter mindestens 100 Nukleotiden, am bevorzugtesten mindestens 1000 Nukleotiden). Besonders bevorzugt wird das gesamte Gen und ein Teil der flankierenden Sequenzen entfernt. Eine inserierte Sequenz kann ein oder mehrere der nachstehend beschriebenen heterologen Gene enthalten. Im Falle des vmw65-Gens wird nicht das gesamte Gen deletiert, da es ein essentielles Strukturprotein codiert, doch wird eine kleine inaktivierende Mutation vorgenommen, durch welche die Fähigkeit von vmw65 zur Aktivierung transkriptioneller IE-Gene beseitigt wird (z.B. wie bei Ace et al., 1989 oder Smiley et al., 1997).
  • Die Mutationen werden in den Herpes-Viren durch den Fachleuten des Gebiets wohlbekannte homologe Rekombinationsmethoden vorgenommen. Zum Beispiel wird HSV-genomische DNA zusammen mit einem Vektor, vorzugsweise einem Plasmidvektor, der die mutierte Sequenz, flankiert durch homologe HSV-Sequenzen, umfasst, transfiziert. Die mutierte Sequenz kann eine Deletion(en), Insertion(en) oder Substitution(en) umfassen, die alle mittels routinemäßiger Techniken konstruiert werden können. Zu Insertionen können selektierbare Markergene zählen, zum Beispiel lacZ oder GFP, um rekombinante Viren zum Beispiel anhand der β-Galactosidase-Aktivität oder Fluoreszenz zu screenen.
  • D. Heterologe Gene und Promotoren
  • Die Viren der Erfindung können so modifiziert werden, dass sie ein heterologes Gen/Gene tragen. Der Begriff "heterologes Gen" umfasst jegliches Gen. Obschon ein heterologes Gen typischerweise ein Gen ist, das nicht im Genom eines Herpesvirus vorhanden ist, können Herpes-Gen/Gene verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Codierungssequenz nicht mit den viralen Kontrollsequenzen operativ verknüpft ist, mit denen sie natürlicherweise verbunden ist. Das heterologe Gen kann jegliche allele Variante eines Wildtyp-Gens sein oder kann ein mutiertes Gen sein. Der Begriff "Gen" soll Nukleinsäure-Sequenzen abdecken, die zumindest transkribierbar sind. So sind Sequenzen, die mRNA, tRNA und rRNA codieren, innerhalb dieser Definition enthalten. Allerdings betrifft die vorliegende Erfindung die Expression von Polypeptiden und nicht von tRNA und rRNA. mRNA-codierende Sequenzen werden wahlweise einen Teil oder die gesamten 5'- und/oder 3'-transkribierten, doch untranslatierten flankierenden Sequenzen umfassen, die natürlicherweise, oder anderweitig, mit der translatierten Codierungssequenz assoziiert sind. Sie kann wahlweise außerdem die assoziierten transkriptionellen Kontrollsequenzen umfassen, die normalerweise mit den tanskribierten Sequenzen assoziiert sind, zum Beispiel Transkriptions-Stoppsignale, Polyadenylierungsstellen und stromabwärts-Enhancerelemente.
  • Das heterologe Gen/Gene kann in das virale Genom durch homologe Rekombination von HSV-Stämmen mit beispielsweise Plasmidvektoren eingeführt werden, die das heterologe Gen/Gene, flankiert durch HSV-Sequenzen, tragen. Das heterologe Gen/Gene kann in einem geeigneten Plasmidvektor, der Herpes-Virus-Sequenzen umfasst, unter Anwendung von im Fachgebiet wohlbekannten Klonierungstechniken eingeführt werden. Das heterologe Gen/Gene kann in das virale Genom an jeglicher Lokalisation eingeführt werden, vorausgesetzt, dass das Virus nach wie vor vermehrt werden kann. Vorzugsweise wird das heterologe Gen/Gene in ein essentielles Gen inseriert. Heterologe Gene können an vielfachen Stellen innerhalb des Virusgenoms eingeführt werden.
  • Die transkribierte Sequenz des heterologen Gens/Gene ist vorzugsweise an eine Kontrollsequenz operativ geknüpft, die die Expression des heterologen Gens/Gene in Säugerzellen, vorzugsweise einer Tumorzelle oder einer Zelle des Nervensystems, erlaubt. Der Begriff "operativ verknüpft" bezieht sich auf eine Juxtaposition, worin die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die ihnen die Funktion in ihrer vorgesehenen Weise erlaubt. Eine an eine Codierungssequenz "operativ geknüpfte" Kontrollsequenz wird in solcher Weise ligiert, dass die Expression der Codierungssequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit der Kontrollsequenz kompatibel sind.
  • Die Kontrollsequenz umfasst einen Promotor, der die Expression des heterologen Gens/Gene erlaubt, und ein Signal für die Beendigung der Transkription. Der Promotor wird aus Promotoren ausgewählt, die in Säugern, vorzugsweise Menschen, Zellen des Nervensystems oder in Tumoren oder in Zellen des Immunsystems funktionell sind. Der Promotor/Promotoren kann von Promotorsequenzen von eukaryontischen Genen abgeleitet sein. Zum Beispiel können Promotoren vom Genom einer Zelle abgeleitet sein, in der die Expression des heterologen Gens erfolgen soll, vorzugsweise einem Säuger, bevorzugt einer menschlichen Zelle. Bezüglich der eukaryontischen Promotoren können dies Promotoren sein, die in einer generalisierten Weise funktionieren (wie etwa Promotoren von β-Actin, Tubulin), oder alternativ einer Gewebe-spezifischen Weise, wie etwa der Neuronen-spezifische Enolase-(NSE)-Promotor. Es können auch Promotoren sein, die auf spezifische Reize reagieren, zum Beispiel Promotoren, die Steroidhormon-Rezeptoren binden. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel der murine Moloney-Leukämievirus-Long-Terminal-Repeat (MMLV LTR)-Promotor oder andere retrovirale Promotoren, der humane oder Maus-Zytomegalovirus-(CMV)-IE-Promotor, oder Promotoren von Herpesvirus-Genen, einschließlich derer, die die Expression von Latenz-assoziierten Transkripten steuern.
  • Expressionskassetten und andere geeignete Konstrukte, die das heterologe Gen/Gene und Kontrollsequenzen umfassen, können unter Anwendung routinemäßiger Kloniertechniken, wie sie den Fachleuten des Gebiets bekannt sind, hergestellt werden (siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A laboratory manual: Cold Spring Harbor Press).
  • Es mag auch von Vorteil sein, dass die Promotoren induzierbar sind, so dass die Expressionshöhen des heterologen Gens während der Lebensdauer der Zelle reguliert werden können. Induzierbar bedeutet, dass die unter Verwendung des Promotors erzielten Expressionshöhen reguliert werden können. Zum Bespiel würde in einer bevorzugten Ausführungsform, bei der mehr als ein heterologes Gen in das HSV-Genom eingeführt wird, ein Promotor einen solchen umfassen, der für das tet-Repressor/VP16-Transkriptionsaktivator-Fusionsprotein, das bereits zuvor berichtet wurde (Goosen und Bujard, 1992, Grossen et al., 1995) verantwortlich ist und würde er das heterologe Gen steuern, dessen Expression reguliert werden soll. Der zweite Promotor würde einen starken Promotor umfassen (z.B. den CMV IE-Promotor) der die Expression des tet-Repressor/VP16-Fusionsproteins steuert. Daher würde in diesem Beispiel die Expression des ersten heterologen Gens von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Tetracyclin abhängen.
  • Heterologe Gene werden typischerweise Polypeptide von therapeutischem Nutzen codieren. Bei onkolytischen Anwendungen können heterologe Gene Proteine codie ren, die selbst zytotoxisch sind, Prodrug-aktivierende Enzyme oder solche, die zur Stimulierung oder Steigerung einer Antitumor-Immunreaktion fähig sind, codieren.
  • Heterologe Gene können auch Markergene (die zum Beispiel β-Galactosidase oder grünes Fluoreszenzprotein oder andere Fluoreszenzproteine codieren) oder Gene, deren Produkte die Expression weiterer Gene regulieren (zum Beispiel Transkriptions-regulierende Faktoren einschließlich des oben beschriebenen tet-Repressor/vmw65-Transkriptionsaktivator-Fusiosproteins) umfassen.
  • Die therapeutischen Anwendungen können durchaus die Verabreichung vielfacher Gene erforderlich machen. Die Expression multipler Gene kann für die Behandlung einer Vielzahl von Zuständen von Vorteil sein. Herpes-Viren sind in einzigartiger Weise geeignet, da sie nicht die beschränkten Verpackungskapazitäten der anderen viralen Vektorsysteme aufweisen. So können vielfache heterologe Gene innerhalb ihres Genoms untergebracht werden. Zum Beispiel können zwei bis fünf Gene in das Genom eingeführt werden.
  • Es gibt beispielsweise mindestens zwei Wege, auf denen dies erreicht werden könnte. Zum Beispiel könnten mehr als ein heterologes Gen und assoziierte Kontrollsequenzen in einen bestimmten HSV-Stamm entweder an einer einzelnen Stelle oder an vielfachen Stellen im Virusgenom eingeführt werden. Es wäre auch möglich, Paare von Promotoren (dieselben oder unterschiedliche Promotoren) zu verwenden, die in entgegengesetzte Orientierungen voneinander weg zeigen, wobei diese Promotoren jeweils die Expression eines heterologen Gens (desselben oder eines unterschiedlichen heterologen Gens) steuern, wie oben beschrieben.
  • E. Therapeutische Anwendungen
  • Die Viren der Erfindung können bei therapeutischen Methoden verwendet werden. Insbesondere können die onkolytischen Viren der Erfindung bei Anwendungen einschließlich der onkolytischen Behandlung von Krebs, z.B. durch direkte Intra-Tumorinjektion, verwendet werden. Wo das Virus ein heterologes Gen umfasst, das einen Prodrug-Aktivator codiert, kann eine zusätzliche Prodrug-Therapie durchge führt werden. Außerdem kann die Behandlung mit der Stimulierung einer Immunreaktion mittels irgendeiner im Fachgebiet bekannten Methode kombiniert werden. Die Viren der Erfindung können bei der therapeutischen Behandlung irgendeines festen Tumors in einem Säuger, vorzugsweise in einem Menschen, verwendet werden. Zum Beispiel können die Viren der Erfindung einem Patienten mit Prostata-, Brust-, Lungen-, Leber-, Endometrium-, Blasen-, Darm- oder Gebärmuuterhalskarzinom; Adenokarzinom; Melanom; Lymphom; Gliom; oder Sarkomen wie Weichteil- und Knochensarkomen, verabreicht werden.
  • F. Verabreichung
  • Die Viren der Erfindung können daher bei einem Patienten, vorzugsweise einem menschlichen Patienten, der behandlungsbedürftig ist, verwendet werden. Die Viren der Erfindung können für die onkolytische Behandlung von Krebs verwendet werden. Das Ziel der therapeutischen Behandlung ist die Verbesserung des Zustands des Patienten. Eine typische therapeutische Behandlung unter Verwendung eines Virus der Erfindung wird die Symptome der Erkrankung oder des Zustands des zu behandelnden Patienten mildern. Eine Behandlungsmethode gemäß der Erfindung umfasst daher die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Virus der Erfindung an einen an Krebs leidenden Patienten.
  • Die Verabreichung eines onkolytischen Virus der Erfindung an einen Patienten, der an einem Tumor leidet, wird typischerweise die Zellen des Tumors abtöten und somit die Größe des Tumors vermindern und/oder die Ausbreitung der malignen Zellen vom Tumor verhindern.
  • Eine Methode zur Verabreichung einer Therapie umfasst das Kombinieren des Virus mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel zum Erhalt einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Zu geeigneten Trägern und Verdünnungsmitteln zählen isotonische Salinelösungen, zum Beispiel Phosphat-gepufferte Saline.
  • Die onkolytische Behandlung und/oder der Gentransfer zu Zellen für therapeutische Zwecke kann dann im Anschluss an eine Direktinjektion der Vektorzusammensetzung in das Zielgewebe erfolgen. Die Menge an verabreichtem Virus liegt im Falle von HSV im Bereich von 104 bis 1010 pfu, vorzugsweise von 105 bis 108 pfu, bevorzugter etwa 106 bis 108 pfu. Bei Injektion für eine onkolytische Behandlung werden typischerweise bis zu 500 μl, typischerweise von 1 bis 200 μl, bevorzugt von 1 bis 10 μl einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus dem Virus und einem pharmazeutisch verträglichen geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel besteht, für die Injektion verwendet. Allerdings können für einige onkolytische Therapieanwendungen auch größere Volumina von bis zu 10 ml in Abhängigkeit von dem Tumor oder der Beimpfungsstelle verwendet werden.
  • Die beschriebenen Verabreichungswege und Dosierungen sollen lediglich als eine Richtlinie dienen, da ein geübter Fachmann ohne weiteres zur Bestimmung des optimalen Verabreichungswegs und der Dosierung in der Lage sein wird. Die Dosierung kann entsprechend verschiedener Parameter bestimmt werden, insbesondere entsprechend dem Alter, Gewicht und Zustand des zu behandelnden Patienten, dem Schweregrad der Erkrankung oder des Zustands und dem Verabreichungsweg.
  • Der bevorzugte Verabreichungsweg für einen an Krebs leidenden Patienten besteht in der Direktinjektion in den Tumor. Das Virus kann auch systemisch oder durch Injektion in ein den Tumor versorgendes Blutgefäß verabreicht werden. Der optimale Verabreichungsweg hängt von der Lokalisation und der Größe des Tumors ab. Die Dosierung kann entsprechend verschiedener Parameter bestimmt werden, insbesondere entsprechend der Lokalisation des Tumors, der Größe des Tumors, dem Alter, Gewicht und Zustand des zu behandelnden Patienten und dem Verabreichungsweg.
  • G. Nicht-therapeutische Aspekte
  • Ebenfalls bereitgestellt werden Methoden zum Identifizieren geeigneter klinischer Stämme für die Modifikation gemäß der Erfindung. Außerdem werden Methoden zur Zielvalidierung bereitgestellt. Dies betrifft die Identifizierung von Genen, die zur Ver wendung beiden therapeutischen Anwendungen der Erfindung geeignet sind, wie oben beschrieben.
  • Methoden zur Produktion der Viren der Erfindung werden ebenfalls bereitgestellt.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung
  • Herpes-simplex-Typ-1-Virus (HSV1), in welchem der Neurovirulenz-Faktor ICP34.5 inaktiviert ist, ist bereits zuvor als die Tumor-spezifische Zelllyse lenkend in Tumormodellen sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen worden. Diese Viren wurden auch in Phase I-klinischen Studien durch direkte intracerebrale Injektion bei Gliompatienten im Spätstadium als sicher nachgewiesen.
  • In einer früheren Arbeit sind serienpassagierte Laborisolate von HSV1 (von HSV1-Stamm 17+ oder HSV1-Stamm F abgeleitete Viren) verwendet worden, die als in ihrer lytischen Fähigkeit in humanen Tumorzellen im Vergleich zu jüngeren klinischen Isolaten als abgeschwächt erwartet werden könnten.
  • In einer auf die Produktion von IC34.5-deletiertem HSV mit erhöhtem onkolytischem und Antitumor-Potenzial gerichteten Arbeit haben wir ICP34.5 aus einem klinischen HSV1-Isolat deletiert und das replikative und lytische Potenzial in einer Anzahl von humanen Tumorzelltypen im Vergleich zum HSV1-Stamm 17+ (einem standardmäßigen Laborstamm) verglichen.
  • Viruskonstruktion (siehe 1)
  • Die verwendeten Viren basierten entweder auf dem HSV1-Stamm 17+ (einem standardmäßigen Laborstamm) oder zwei klinischen Isolaten, die von Lippenbläschen von häufigen Reaktivatoren von HSV1 abgeleitet waren. Diese Stämme wurden als BL1 und JS1 bezeichnet. ICP34.5 wurde vollständig aus Stamm 17+ und JS1 deletiert, zusammen mit der Insertion einer CMV-GFP-Kassette. JS1 wurde ebenfalls durch die Insertion von humanem oder Maus-GM-CSF weiter gentechnisch verändert, um das ICP34.5-Gen zu ersetzen. BL1 und JS1 sind daher klinische Isolate oder "Nicht-Labor"-Stämme. Die hierin erörterten Derivate von JS1 sind ebenfalls Nicht-Laborstämme, d.h. modifizierte Nicht-Laborstämme der Erfindung.
  • Viruswachstum in Tumorzellen (siehe 2)
  • JS1 und BL1 zeigten ein erhöhtes Wachstum in einigen getesteten humanen Tumorzellen im Vergleich zu HSV1 IC34.5-deletiertem Stamm 17+, wenn über einen Zeitraum von 72 Stunden getestet (2). JS1 wurde für eine weitere Studie ausgewählt, und die oben beschriebenen Modifikationen (siehe 1 und oben) wurden daran vorgenommen.
  • Lytische Fähigkeiten der Viren (siehe 3)
  • Die lytischen (zellabtötenden) Fähigkeiten waren mit dem Virus, das von JS1-abgeleiteten Nicht-Laborstämmen abgeleitet war, in allen getesteten Tumorzelllinien erhöht. Genauer gesagt und bezugnehmend auf 3 zeigte das Virus JS1/34.5-, d.h. JS1 mit durch Deletion entferntem ICP34.5, erhöhte lytische Fähigkeiten in HT29-kolorektalem Adenokarzinom, LNCaP.FGC-Prostataadenokarzinom, MDA-MB-231-Brustadenokarzinom, SK-MEL-28-maglinem Melanom und U-87-MG-Glioblastom-Astrozytomzellen.
  • Die lytischen Fähigkeiten wurden auch in SK-MEL-28-, MDA-MB-231- und HT29-Zellen durch Trypanblau-Ausschluss-Assay der infizierten Zellen bei verschiedenen Dosen und Zeiten nach Infektion mit BL1, JS1 im Vergleich zum Stamm 17+ ausgewertet. Trypanblau wird von lebenden Zellen ausgeschlossen, wodurch die Anzahlen der in einer Kultur verbliebenen lebenden Zellen in dieser Weise ausgewertet werden können. Die Duplikat-Wells von Sechs-Well-Schalen kultivierte Tumorzelllinien wurden für 24, 48 oder 72 Stunden bei einem MOI von 0,1 oder 1 mit entweder 17+, BL1 oder JS1 infiziert, und die Zahlen an lebenden Zellen wurden gezählt. Die prozentualen Anzahlen der lebenden Zellen in den äquivalenten uninfizierten Kontroll-Wells sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • So werden wie in allen Fällen mehr Tumorzellen mit den Viren der klinischen Isolate BL1 und JS1 als mit dem Laborisolat 17+ abgetötet, was eine erhöhte onkolytische Aktivität ergibt. Die Verwendung der jüngeren klinischen Virusstämme neigt zur Erhöhung der Antitumor-Kapazitäten dieser Viren, die zum Erhalt einer Tumorselektiven Replikation (z.B. durch die Deletion von ICP34.5) modifiziert sind, wenn bei menschlichen Patienten für die Krebsbehandlung angewendet.
  • Tabelle 1
    Figure 00260001
  • Weiter erhöhte Antitumor-Aktivität
  • Eine weiter erhöhte Aktivität kann auch erwartet werden, wenn diese Viren dann zum Transfer von Genen mit Antitumor-Aktivität verwendet werden. Zu diesen Genen zählen solche, die Prodrug-Aktivatoren oder immunstimulatorische Proteine codieren.
  • Zu diesem Zweck haben wir aus JS1 ein ICP34.5-deletiertes klinisches Isolat von HSV1 erzeugt, welches humanes oder Maus-GM-CSF exprimiert. GM-CSF ist ein potenter Immunstimulator. Dieses Virus ist zur Erhöhung der Antitumor-Immunreaktionen auf die intratumorale Injektion hin designed.
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  • Hinterlegungsinformation
  • HSV1-Stamm JS1 ist bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, United Kingdom, am 02. Januar 2001 unter der Zugriffsnummer V01010209 hinterlegt worden.

Claims (13)

  1. HSV1-Stamm JS1, wie hinterlegt bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) unter der Zugriffsnummer V01010209, oder ein davon abgeleiteter HSV1-Stamm.
  2. HSV-Stamm nach Anspruch 1, welcher so modifiziert ist, dass ihm ein oder mehrere von einem funktionellen ICP34.5-codierenden Gen, einem funktionellen ICP6-codierenden Gen, einem funktionellen Glycoprotein H-codierenden Gen und einem funktionellen Thymidinkinase-codierenden Gen fehlen.
  3. HSV-Stamm nach Anspruch 2, welchem ein funktionelles ICP34.5-codierendes Gen fehlt.
  4. HSV-Stamm nach Anspruch 3, welchem außerdem ein funktionelles ICP47-Gen fehlt.
  5. HSV-Stamm nach einem der vorangehenden Ansprüche, welcher außerdem ein heterologes Gen umfasst.
  6. HSV-Stamm nach Anspruch 5, worin das heterologe Gen ein zum Modifizieren von Immunantworten fähiges Gen ist.
  7. HSV-Stamm nach Anspruch 6, worin das zum Modifizieren von Immunantworten fähige Gen ein immunstimulatorisches Polypeptid oder ein anderes Genprodukt, das zum Modifizieren von Immunantworten fähig ist, einen Prodrug-Aktivator, ei nen Tumorsuppressor oder ein proapoptotisches Genprodukt codiert.
  8. HSV-Stamm nach Anspruch 7, worin das immunstimulatorische Polypeptid ein Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GMCSF), ein anderes Zytokin oder Chemokin, RANTES, B7.1 oder B7.2 oder IL12 ist, wobei der Prodrug-Aktivator Nitroreduktase oder Zytochrom p45 ist oder wobei der Tumorsuppressor p53 ist.
  9. HSV-Stamm nach Anspruch 8, welcher so modifiziert ist, dass ihm ein funktionelles ICP34.5-Gen, und wahlweise ein funktionelles ICP47-Gen, fehlt; und welcher wahlweise außerdem ein GMCSF-codierendes heterologes Gen umfasst.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Virus nach einem der vorangehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
  11. HSV-Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung in der Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
  12. Verwendung eines HSV-Stamms nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in der Herstellung eines Medikaments für die onkolytische Behandlung von Krebs.
  13. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Gen die Antitumor-Effekte eines HSV-Stamms verstärkt, umfassend. (i) Bereitstellen eines HSV nach einem der Ansprüche 1 bis 9; (ii) Einführen des Gens in den HSV-Stamm; und (iii) Auswerten der Fähigkeit des modifizierten, onkolytischen HSV-Stamms, in Tumorzellen zu replizieren oder diese abzutöten, im Vergleich zur Fähigkeit des in Schritt (i) bereitgestellten Vorläufer-Stamms.
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