DE60106901T2

DE60106901T2 - Vorrichtung zur Elektroporation unter kontinuierlichen Steuerung der Zellendurchlässigkeit

Info

Publication number: DE60106901T2
Application number: DE60106901T
Authority: DE
Inventors: Damijan Miklavcic; Lluis Mir; Eberhard Neumann; Bertil Persson
Original assignee: Igea SRL
Current assignee: Igea SRL
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2021-04-21
Also published as: AU2001258728A1; ES2232621T3; IT1320187B1; EP1274830A1; ITTO20000390A1; ATE281513T1; US20040039327A1; ITTO20000390A0; WO2001081532A1; DE60106901D1; US7306940B2; EP1274830B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektroporationsvorrichtung und -verfahren zum Liefern eines modulierten Signals unter ständiger Kontrolle der Zellelektropermeabilisierung.
Stand der Technik
Bekanntlich beinhalten jüngste biologische, mikrobiologische und pharmakologische Anwendungen das Einbringen von Molekülen in Zellen, was durch Einsetzen der Moleküle durch die Zellmembranen hindurch erfolgt.
Die Moleküle können anorganische Substanzen (beispielsweise Arzneimittel) oder organische Moleküle sein (beispielsweise kennt man das Einsetzen von DNA-Molekülen in Zellen).
Moleküle werden unter Verwendung verschiedener Methoden eingebracht, einschließlich:

– Virales Vektoring: Versehen der Moleküle mit einem Virus, welches dann in die Zelle eingebracht wird;
– chemisches Vektoring: Versehen der Moleküle mit einer chemischen Substanz zum Verringern des Zellmembranwiderstands, um hierdurch das Einbringen des Moleküls in die Zelle zu ermöglichen; und
– ballistische Verfahren: Beschleunigen des Moleküls, so dass es auf die Zellmembran auftrifft und eindringt.

Bekannte Verfahren enthaltenen verschiedene Nachteile, einschließlich: das Risiko einer Vektor-Immunitätsreaktion; Herstellungsschwierigkeiten und geringe Stabilität des Vektors selbst (virales Vektoring); Ineffektivität, Toxizität und schlechte Selektivität (chemisches Vektoring). Was ballistische Verfahren angeht, so sind diese nur auf Oberflächenzellen anwendbar.
Neue sogenannte Elektroporationsverfahren wurden jüngst entwickelt, die es ermöglichen, kurzfristig ein starkes elektrisches Feld an die Zellen anzulegen, um die Zellmembran zu permeabilisieren und somit das Eindringen von Substanzen zu ermöglichen. Beispielsweise beschreiben die US-A-5,134,070 und die WO-A-96/39531 Elektroporationsverfahren. Auch die PCT-Anmeldung WO-A-01/07583 sowie die WO-A-01/07584, die ältere Rechte darstellen, beschreiben Elektroporationsverfahren.
Ein Problem, das sich bei bekannten Elektroporationsverfahren stellt, ist die Ermittlung des Werts des angelegten elektrischen Felds, der hoch genug sein muss, um die Zellmembran zu permeabilisieren, jedoch nicht so hoch, dass der Zelle irreversibler Schaden zugefügt wird.
Insbesondere verwenden bekannte Elektroporationsvorrichtungen und -verfahren einen festen Ausgangsspannungswert (der beispielsweise experimentell bestimmt wird), so dass unter bestimmten Operationsbedingungen das elektrische Feld zu schwach sein kann, so dass das Einbringen der Substanzen verhindert wird, und/oder zu hoch, was zu irreversiblem Schaden an der Zelle führt.
Offenbarung der Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Elektroporationsvorrichtung und ein -verfahren vorzuschlagen, die dazu ausgelegt sind, die Nachteile bekannter Elektroporationsvorrichtungen und -verfahren zu beseitigen.
Erfindungsgemäß wird eine Elektroporationsvorrichtung wie in Anspruch 1 beschrieben vorgeschlagen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Elektroporationsverfahren, wie in Anspruch 13 beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Eine bevorzugte nicht-beschränkende Ausführungsform der Erfindung wird beispielhaft mit Bezug zu den beigefügten Zeichnungen beschrieben werden, in denen:
1 schematisch eine Elektroporationsvorrichtung gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung zeigt;
2 ein logisches Operationsdiagramm der Vorrichtung aus 1 zeigt;
3 und 3a Signale zeigen, die durch die Vorrichtung aus 1 erzeugt werden;
4 eine Variation der Signale aus 3, 3a zeigt.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Bezugszeichen 1 in 1 bezeichnet eine Elektroporationsvorrichtung als Ganzes.
Die Vorrichtung 1 umfasst einen Signalgenerator, insbesondere einen Pulsgenerator 3, mit wenigstens zwei Ausgangselektroden 5; ein an die Ausgangselektroden 5 angeschlossenes Messsystem 7; und eine elektronische Steuer-/Regeleinheit 10 zum Steuern/Regeln des Pulsgenerators 3 und des Messsystems 7.
Die elektronische Steuer/Regeleinheit 10 umfasst wenigstens einen Mikroprozessor 12, der mit Speichervorrichtungen zusammenwirkt, beispielsweise einem RAM-Speicher 14 und einem EPROM-Speicher 16; sowie Schnittstellenvorrichtungen 18.
Der Pulsgenerator 3 umfasst einen Digital/Analog-D/A-Wandler 20, der ein Steuer/Regelsignal CNTRL von der Einheit 10 empfängt und am Ausgang mit einer Vorverstärkerschaltung 21 zusammenwirkt. Die Vorverstärkerschaltung 21 weist einen Ausgang auf, der an den Eingang eines Leistungsverstärkers 22 angeschlossen ist, welcher wiederum einen Ausgang hat, der in Verbindung mit den Elektroden 5 steht, und die Elektroden 5 sind in der gezeigten beispielhaften Ausführungsform jeweils definiert durch ein flaches rechteckiges Metallblatt, an das das Ausgangssignal vom Leistungsverstärker 22 angelegt wird.
Selbstverständlich können die Elektroden hinsichtlich Form, Struktur und Größe von den gezeigten abweichen, und können beispielsweise für eine Verwendung in einem Laparoskopieprozess ausgelegt sein.
Ferner können die Elektroden 5 eine Zahl elektrischer Anschlüsse (1) umfassen, die beispielsweise entlang eines kreisförmigen (dreieckigen oder hexagonalen) geschlossenen Wegs C angeordnet sind und paarweise sequentiell mit dem Ausgangssignal des Leistungsverstärkers 22 versorgt werden. In diesem Fall ist eine (nicht gezeigte) Multiplexerschaltung vorgesehen, um Elektrodenpaare auszuwählen und zu versorgen, beispielsweise Elektrodenpaare auf entgegengesetzten Seiten des Kreiswegs C. Die Multiplexerschaltung kann ferner einer (nicht gezeigten) Schaltung zur Bestimmung der Impedanz zwischen der Zahl von Elektrodenpaaren zugeordnet sein, sowie einer (nicht gezeigten) Schaltung zum Richten des Signals zu einem automatisch ausgewählten Elektrodenpaar. Das Paar kann automatisch ausgewählt werden durch Vergleich der gemessenen Impedanz und Auswahl des Elektrodenpaars (oder der Paare), dessen/deren Impedanz einen vorbestimmten Zusammenhang mit der Impedanz der anderen Paare aufweist, beispielsweise größer als diese ist.
Das Messsystem 7 umfasst eine Oszillationsschaltung 24 zur Versorgung der Elektroden 5 mit einem Anregungssignal, und eine Umwandlungsschaltung 26, die von den Elektroden 5 mit einem Signal in Antwort auf das Anregungssignal versorgt wird. Die Umwandlungsschaltung 26 wirkt zusammen mit einem Speicher 28 (beispielsweise einem RAM-Speicher), der ferner mit einer bekannten Messschaltung 30 verbunden ist, die ebenfalls mit der Umwandlungsschaltung 26 und mit der Oszillationsschaltung 24 zusammenwirkt. Man beachte, dass die Impedanzmessung sowohl im Frequenzbereich als auch im Zeitbereich erfolgen kann.
2 zeigt ein Blockdiagramm der Operationen, die von der Elektroporationsvorrichtung 1 unter der Kontrolle der elektronischen Einheit 10 durchgeführt werden.
Wenn die Vorrichtung 1 aktiviert wird, erzeugt ein erster Block 100 ein erstes Steuer/Regelsignal CNTRL 1 für den Pulsgenerator 3, welcher in Antwort hierauf eine erste Zahl von ersten Spannungspulsen l1 erzeugt, die an die Elektroden 5 angelegt werden (3). Die ersten Pulse l1, die vorzugsweise rechteckig sind, weisen eine konstante Amplitude und Breite auf und sind in der Zeit gleichmäßig beabstandet.
Der Spannungswert jedes ersten Pulses hängt von der Geometrie der Elektroden 5 ab, wohingegen die Gesamtanlegezeit T1 der ersten Pulse von dem Zeitpunkt abhängt, an dem eine Impedanzänderung erfasst wird.
Genauer folgt auf den Block 100 ein Block 105, der die Impedanz Z (w) zwischen den Elektroden 5 misst. Insbesondere berechnet der Block 105 die Impedanzvariation ΔZ(ω) zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitpunkten t-1 und t, d.h. ΔZ(ω) = ΔZ(ω)_t – ΔZ(ω)_t-1.
Wenn die Impedanzvariation ΔZ(ω) im Wesentlichen gleich 0 bleibt (d.h. keine spürbare Impedanzänderung), geht der Block 105 zum Block 100 zurück. Wenn die Impedanzänderung kleiner als 0 ist (d.h. die Impedanz nimmt ab und ändert sich daher zeitlich), folgt auf den Block 105 ein Block 110.
Der Block 110 erzeugt ein zweites Steuer/Regelsignal CNTRL 2 für den Pulsgenerator 3, welcher in Antwort hierauf eine zweite Zahl von zweiten Pulsen l2 erzeugt, die an die Elektroden 5 angelegt werden (3). Die Amplitude der zweiten Pulse l2 hängt von der zwischen den Elektroden 5 gemessenen Impedanz Z(ω) ab. Die Impedanz Z(ω) wird in bekannter Weise durch das Messsystem 7 gemessen, und der gemessene Impedanzwert wird der elektronischen Steuer/Regeleinheit 10 zugeführt, die in Antwort hierauf die Amplitude der zweiten Pulse l2 steuert/regelt.
Insbesondere nimmt die Amplitude der zweiten Pulse l2 bei einer Verringerung der Impedanz ab, sie nimmt bei einer Erhöhung der Impedanz zu, und sie kann ferner zunehmen, wenn die Impedanz für eine gegebene Zeitdauer konstant bleibt.
Die Impedanzmessung kann eine Messung des absoluten Impedanzwerts |Z(ω)| enthalten, oder eine Berechnung des Impedanzrealteils Zr, des Imaginärteils jZo und des Winkels α = arctg (Zo/Zr).
An Stelle von oder zusätzlich zu der Impedanzberechnung könnte die Vorrichtung auch andere elektrische Eigenschaften messen, beispielsweise Admittanz, Widerstand oder Leitfähigkeit, einschließlich des dynamischen Widerstands oder der dynamischen Leitfähigkeit. Die Vorrichtung könnte ferner den Strom bei konstanter Spannung und umgekehrt messen.
Im Durchschnitt haben die zweiten Pulse l2 eine kleinere Amplitude als die ersten Pulse.
Die zweiten Pulse l2 werden erzeugt, bis die gemessene Impedanz einen vorbestimmten unteren Schwellenwert zp erreicht, der anzeigt, dass die Permeabilität der Zellmembranen erreicht wurde und keine weiteren Impedanzänderungen zwischen aufeinanderfolgenden Pulsen erfasst werden (Block 115 folgt auf Block 110). Sobald der untere Schwellenwert erreicht ist, geht Block 115 weiter zu einem Block 120 und bewirkt somit die Steuerung/Regelung der Amplitude der Pulse l2 in einer geschlossenen Schleife.
Alternativ kann Block 110 einen einzigen Puls lu2 (3a) mit einer Amplitude erzeugen, die von der zwischen den Elektroden 5 gemessenen Impedanz Z(ω) abhängt und somit eine Steuerung/Regelung der Amplitude des Pulses lu2 in einer geschlossenen Schleife bewirken.
Insbesondere nimmt wie bei den Pulsen l2 die Amplitude des einzigen Pulses lu2 bei einer Verringerung der Impedanz ab, sie nimmt bei einer Erhöhung der Impedanz zu, und sie kann ferner zunehmen, wenn die Impedanz während einer gegebenen Zeitdauer konstant bleibt.
Speziell nimmt der Puls lu2 normalerweise in der Amplitude ab, wenn die Impedanz zeitlich abnimmt, und die geschlossene Steuer/Regelschleife regelt durch Abnahme die Amplitude des Pulses lu2. Die Amplitude des Pulses lu2 kann auch zunehmen, wenn die Impedanz für eine gegebene Zeitdauer konstant bleibt.
Block 120 erzeugt ein drittes Steuer/Regelsignal CNTRL 3 für den Pulsgenerator 3, der in Antwort hierauf eine dritte Zahl von dritten Pulsen l3 erzeugt, welche an die Elektroden 5 angelegt werden (3). Die dritten Pulse l3 haben eine viel kleinere Amplitude als die ersten und zweiten Pulse l1 und l2, und sind beispielsweise rechteckförmig, sie werden während einer vorbestimmten Zeit T3 angelegt, weisen jeweils eine größere zeitliche Breite als die Pulse l1 und l2 auf, und können auch einen einzelnen Puls l3 umfassen.
Auf Block 120 folgt ein Block 130, der abfragt, ob ein weiterer Elektroporationszyklus durchzuführen ist. Wenn dies der Fall ist, geht Block 130 zurück zu Block 100, andernfalls wird die Elektroporation unterbrochen.
Im tatsächlichen Gebrauch werden die Elektroden 5 an einen Gewebeabschnitt 35 angelegt (schematisch in 1 gezeigt), der lebende Zellen enthält. Der Gewebe abschnitt kann Teil eines Lebewesens sein (Mensch, Tier oder Pflanze) oder Zellen enthalten, die von einem Lebewesen entfernt wurden (Mensch, Tier oder Pflanze). Es versteht sich, dass Gewebeabschnitte auch Kulturen aus ein- oder mehrzelligen Organismen umfassen (Prokarioten oder Eukarioten). In anderen Worten soll ein Gewebeabschnitt allgemein ein Substrat beliebiger Art bedeuten, bei dem lebende Zellen oder zellulare Organismen vorhanden sind.
Auf dem Gewebeabschnitt 35 wird ferner eine Substanz 37 aufgetragen (organisch oder anorganisch oder biopolymerisch), die in die Zellen eingebracht werden soll. Die Substanz kann auf viele verschiedene Weisen aufgetragen werden, von denen einige nachfolgend als nicht beschränkende Beispiele aufgelistet sind:

– direktes Auftragen der Substanz auf den Gewebeabschnitt, beispielsweise durch Auftragen eines die Substanz enthaltenden Fluids auf den Gewebeabschnitt;
– indirektes Auftragen der Substanz, beispielsweise durch Einführen der Substanz in das Kreislaufsystem des Gewebeabschnitts;
– Injizieren der Substanz, beispielsweise unter Verwendung nadelartiger Elektroden 5, die jeweils eine innere Leitung aufweisen, die die in den Gewebeabschnitt zu injizierende Substanz enthält. Ferner kann die Substanz unter Verwendung von Nadeln injiziert werden, die von den Elektroden getrennt sind.

Die eingeführte Substanz kann anorganisch oder organisch oder biopolymerisch sein, beispielsweise

– eine Nucleinsäure;
– ein DNA-Molekül, das Kontrollsequenzen und eine Sequenz enthält, die für therapeutische Gene oder Gene codiert, die für biomedizinische oder biotechnologische Zwecke von Interesse sind;
– eine Oligonucleotid, entweder natürlich (Phosphordiester) oder modifiziert (innerhalb der Hauptkette des Oligonucleotids, beispielsweise Phosporsul fate, oder an den Enden durch Hinzugabe von Gruppen zum Schützen der Oligonucleotide vor einem Nucleoaseaufschluss, wobei die Beschreibung von Oligonucleotidmodifikationen nicht beschränkend ist);
– ein Protein oder Peptid, entweder natürlich oder genetisch oder chemisch modifiziert, extrahiert aus natürlichen Quellen oder durch Synthese erhalten, oder ein die Struktur eines Proteins oder Peptids simulierendes Molekül unabhängig von seiner Struktur;
– ein cytotoxisches Agens, insbesondere das antibiotische Bleomycin oder Cisplatinum;
– ein Penicillin;
– ein anderes pharmakologisches Agens als eine Nucleinsäure.

Die Vorrichtung 1 wird aktiviert, um erste Pulse l1 zu erzeugen, die an die Elektroden 5 angelegt werden, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, welches in den Gewebeabschnitt gerichtet wird, um die Permeabilisierung der Gewebezellmembranen zu starten. Die Permeabilisierung ist nahe den Elektroden 5 (wo das elektrische Feld stärker ist) intensiver und wird kontinuierlich geringer, wenn der Abstand von den Elektroden wächst. Als Folge der Permeabilisierung der Zellmembranen ändern sich die elektrischen Eigenschaften des Gewebes. Insbesondere nimmt die Leitfähigkeit des Gewebes zu, so dass die Gewebeimpedanz abnimmt.
Zweite Pulse l2 (oder ein Puls lu2) werden dann angelegt, deren Wert von der gemessenen Gewebeimpedanz abhängt. Auf die Permeabilisierung der Zellmembranen folgt daher ein Abfall der Impedanz, der durch das Messsystem 7 erfasst wird, um eine automatische Reaktion der Vorrichtung 1 in geschlossener Schleife zu ermöglichen, um die Amplitude der Pulse l2 (oder des Pulses lu2) zu reduzieren und somit die Intensität des angelegten elektrischen Felds. Ähnlich macht sich eine geringe Permeabilisierung der Zellmembranen durch eine geringe Impedanzvariation bemerkbar, was durch das Messsystem 7 erfasst wird, um eine automatische Reaktion der Vorrichtung 1 in geschlossener Schleife zu ermöglichen, um die Amplitude der Impulse l2 (oder des Pulses lu2) und somit die Intensität des angelegten elektrischen Felds zu erhöhen.
Die Amplitude der Pulse (oder des einzelnen Pulses) wird daher entsprechend den momentanen elektrischen Eigenschaften des Gewebes geregelt, welche wiederum von dem Ausmaß abhängen, in dem die Zellmembranen permeabilisiert sind. Dies verhindert somit eine Beschädigung der Zellen aufgrund eines zu starken elektrischen Felds, das an ein bereits permeabilisiertes Gewebe angelegt wird. Gleichzeitig nimmt in dem Fall, in dem das Gewebe nicht auf die angelegten Pulse "reagiert", d.h. die Permeabilisierung der Zellmembranen nicht beginnt, die Amplitude der Pulse (oder des einzelnen Pulses) und des elektrischen Felds zu. Die Erzeugung der zweiten Pulse (oder des Pulses) gewährleistet, dass die gesamte Gewebeabschnittsfläche zwischen den Elektroden permeabilisiert wird.
Dann werden Pulse l3 angelegt, um die Einbringung geladener Substanzen mit hoher Molekülmasse zu erleichtern, beispielsweise DNA.
Dann wird die Substanz 37 in die Zellen eingebracht.
Das vom Anmelder gesammelte Wissen zeigt an, dass das Anlegen wenigstens eines Pulses mit einer entsprechend der gemessenen Impedanz einstellbaren Amplitude die Erzielung eines hohen Permeabilisierungsgrads der Zellmembranen ermöglicht und gleichzeitig eine Beschädigung des Zellgewebes verhindert wird.
Im Gegensatz zu einer Messung unter Verwendung des gleichen Elektrodenpaars, das zum Anlegen des elektrischen Felds an das Substrat 35 verwendet wird, wie in der oben beschriebenen Ausführungsform, kann die Impedanz des Substrats 35 offensichtlich auch mittels eines separaten Paars von Hilfselektroden 5a gemessen werden (schematisch mit gepunkteten Linien in 1 gezeigt), und zwar nahe den Elektroden 5, die elektrisch von den Elektroden 5 getrennt und in Kontakt mit dem zu permeabilisierenden Gewebeabschnitt 35 platziert sind. Im Gegensatz zu Pulsen können kontinuierliche Signale erzeugt werden. In diesem Fall kann im Gegensatz zur Erzeugung einer Zahl separater Pulse (l1, l2, l3) der Signalgenerator 3 ein einziges kontinuierliches Analogsignal erzeugen (4), das drei angrenzende Ab schnitte enthält, die den Pulsen l1, l2 bzw. l3 entsprechen. Das kontinuierliche Analogsignal kann einen ersten Hochamplitudenabschnitt umfassen, der den ersten Pulsen l1 entspricht, einen zweiten Abschnitt (entsprechend den Pulsen l2) mit einer Amplitude, die als Funktion der gemessenen Impedanz Z(ω) variiert, und einen dritten Abschnitt mit kleinerer Amplitude entsprechend den Pulsen l3, als Pulssequenz. Die Sequenzen können ferner vom exponentiellen Typ sein und können auch Bipolarpulse umfassen, um die Polarisation der Elektroden zu verhindern.

Claims

Elektroporationsvorrichtung, umfassend eine Signalerzeugungseinrichtung (3), deren Ausgang an Elektroden (5) anschließbar ist, die mit einem Substrat (35) verbindbar sind, das Zellen enthält, wobei die Elektroden (5) in dem Substrat (35) ein elektrisches Feld erzeugen, das eine Permeabilisierung der Membranen der Zellen induziert, um das Einbringen von Substanzen (37) in die Zellen zu erleichtern, wobei die Vorrichtung ferner eine Regeleinrichtung (7, 10, 3) zum Steuern/Regeln charakteristischer Größen des an die Elektroden angelegten Signals (l2) basierend auf der im Substrat (35) gemessenen Impedanz (Z(ω)) umfasst, wobei die Impedanz (Z(ω)) eine Funktion des von den Membranen der Zellen erreichten Permeabiliserungsgrads ist, wobei die Signalerzeugungseinrichtung eine Pulserzeugungseinrichtung (3) umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalerzeugungseinrichtung (3) Mittel umfasst, um Folgendes zu erzeugen: – eine Zahl erster Pulse (l1), die an die Elektroden (5) angelegt werden, wobei jeder erste Puls eine konstante Amplitude hat und vorzugsweise rechteckig ist; – wenigstens einen zweiten Puls (l2; lu2), der an die Elektroden (5) angelegt wird, wobei der zweite Puls (l2; lu2) eine Amplitude hat, die eine Funktion der im Substrat (35) gemessenen Impedanz (Z(ω)) ist; und – wenigstens einen dritten Puls (l3), der an die Elektroden (5) angelegt wird, wobei der dritte Puls (l3) eine viel kleinere Amplitude als die ersten Pulse (l1) und der zweite Puls (l2; lu2) hat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Regeleinrichtung (7, 10, 3) die Amplitude des wenigstens einen zweiten Pulses (l2) verringert, wenn die Impedanz (Z(ω)) abnimmt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Regeleinrichtung (7, 10, 3) die Amplitude des wenigstens einen zweiten Pulses (l2) erhöht, wenn die Impedanz (Z(ω)) zunimmt oder im Wesentlichen konstant bleibt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei eine Testeinrichtung (115) vorgesehen ist, die die Erzeugung des zweiten Pulses erlaubt, bis die gemessene Impedanz einen vorbestimmten unteren Schwellenwert erreicht, der anzeigt, dass die Permeabilität der Zellmembranen erzielt worden ist, wobei die Testeinrichtung (115) die Erzeugung des dritten Pulses beginnt, wenn der untere Schwellenwert erreicht ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektroden (5) eine Zahl von Elektroden umfassen, die entlang eines geschlossenen Wegs, insbesondere eines kreisförmigen Wegs, angeordnet sind, und paarweise sequentiell mit dem Ausgangssignal des Signalgenerators (3) versorgt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 5, bei der eine Einrichtung zum Bestimmen der Impedanz zwischen der Zahl von Elektrodenpaaren vorgesehen ist, sowie eine Einrichtung zum Richten des Signals zu einem automatisch ausgewählten Elektrodenpaar, wobei das Paar automatisch ausgewählt wird durch Vergleichen der gemessenen Impedanzen und durch Auswählen desjenigen Elektrodenpaars, dessen Impedanz einen vorbestimmten Zusammenhang mit den Impedanzen der anderen Paare aufweist, bspw. größer als diese ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die Pulserzeugungseinrichtung einen Einzelpuls (lu2) erzeugt, dessen Amplitude basierend auf den im Substrat (35) gemessenen elektrischen Eigenschaften (Z(ω)) einstellbar ist.