DE60007290T2

DE60007290T2 - Einbringen von makromolekülen in zellen

Info

Publication number: DE60007290T2
Application number: DE60007290T
Authority: DE
Inventors: D. Alan King; E. Richard Walters
Original assignee: Cyto Pulse Sciences Inc
Current assignee: Cyto Pulse Sciences Inc
Priority date: 1999-01-28
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2020-01-13
Also published as: CN1191872C; WO2000044438A1; JP2002535100A; EP1163024A4; CN1346290A; ATE256484T1; JP4499295B2; DE60007290D1; EP1163024A1; CA2372409A1; CA2372409C; EP1163024B1; US6603998B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Vorrichtungen zum Einbringen von Molekülen in biologische Zellen. Insbesondere werden durch die vorliegende Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zum Einbringen von Substanzen, wie z. B. Makromolekülen, z. B. Polynukleotidimpfstoffe (DNA-Impfstoff und/oder RNA-Impfstoff) und Impfstoffe auf Proteinbasis, in ausgewählte Zellen in Epidermisgewebe mit verminderter Sensibilität (vermindertem Schmerzempfinden) bereitgestellt.
Das erste DNA-Impfverfahren im Stand der Technik wurde als Impfung mit bloßer DNA bezeichnet, da eine flüssige DNA-Lösung ohne Zusatzstoffe zur Verbesserung der Transfektion in Mausmuskel injiziert wurde. Bei diesem Verfahren werden einige wenige Zellen transfiziert und eine Immunantwort auf das exprimierte Antigen in Mäusen induziert. In Menschen und Primaten funktioniert dieses Verfahren jedoch nicht gut.
Im Stand der Technik wurde durch Verwendung eines biolistischen Verfahrens zur Einbringung von DNA eine Verbesserung der DNA-Impfstoffwirkung erzielt. Das biolistische Verfahren wird durchgeführt, indem Mikrokügelchen aus Metall mit DNA beschichtet und die Partikel nach Beschleunigen derselben auf eine gewählte Geschwindigkeit in die Haut geschossen werden. Dieses Verfahren funktioniert wesentlich besser als bloße DNA. Der Grund dafür liegt zum Teil darin, daß die mit DNA beschichteten Partikel bis zu einer Tiefe in die Haut injiziert werden, durch die die Chance einer Transfektion von Langerhans'schen Zellen erhöht wird. Das biolistische Verfahren besitzt allerdings einige Nachteile. Erstens führt es zu einer gewissen Schädigung der Haut, die in einigen Individuen zur Narbenbildung führen kann. Zweitens wird trotz der erhöhten Effizienz eine größere Effizienz benötigt. Drittens verbleibt das ballistische Partikel nach Behandlung im Patienten zurück. Diesbezüglich wäre es wünschenswert, falls ein Verfahren zum Einbringen von DNA in biologische Zellen zur Verfügung stünde, durch das keine Hautschädigung, die zur Narbenbildung führt, verursacht würde. Es wäre ebenfalls wünschenswert, falls ein Verfahren zum Einbringen von DNA in biologische Zellen zur Verfügung stünde, bei dem keine Reste an ballistischen Partikeln in den behandelten Zellen zurückblieben. Bei Interesse können biolistische Verfahren in den folgenden US-Patenten nachgelesen werden: 5,036,006 und 5,478,744.
Eine Anzahl zusätzlicher Ansätze zum Einbringen von Makromolekülen in biologische Zellen sind im Stand der Technik bekannt und durch folgenden US-Patente oder andere Veröffentlichungen wie folgt repräsentiert.
Aus dem US-Patent Nr. 5,019,034 von Weaver et al. ist ein Verfahren zum Elektroporation von Geweben bekannt, bei dem Elektroden auf der Gewebeoberfläche, wie z. B. Haut, eines Patienten plaziert werden. Für die Behandlung der Haut verwendete Moleküle werden dann in Reservoirs auf der Hautoberfläche plaziert, wobei die Behandlungsmoleküle transdermal in die Hautgewebe eindringen müssen. Das heißt, daß die Behandlungsmoleküle von außerhalb der Haut in die Haut gelangen müssen. Dabei ist die Oberflächenschicht der Haut nicht nur relativ undurchlässig, sondern, falls die zu behandelnden Hautschichten in der Nähe der Basalmembran der Epidermis liegen, die Behandlungsmoleküle müssen dann eine beträchtliche Menge an Hautgewebe durchqueren, bevor die zu behandelnden Zellen von den Behandlungsmolekülen erreicht werden. Ein solches Behandlungsverfahren ist zur Behandlung von Zellen nahe der Basalmembran ineffizient. Anstatt auf der Hautoberfläche plazierte Elektroden zu verwenden, wobei Behandlungsmoleküle transdermal die Haut durchqueren müssen, um biologische Zellen nahe der Basalmembranepidermis zu behandeln, wäre es wünschenswert, falls ein Elektroporationsverfahren für die Zuführung von Molekülen zu biologischen Zellen in der Epidermis, nahe der Basalmembran, bereitgestellt würde, bei dem die Behandlungsmoleküle die Haut nicht transdermal durchqueren müßten.
Aus dem US-Patent Nr. 5,273,525 von Hofmann ist eine Vorrichtung zur Elektroporation von Arzneistoffen und genetischem Material in Gewebe bekannt, bei der zur Plazierung der Arzneistoffe und des genetischen Materials in die Nachbarschaft der zu elektroporierenden Gewebe eine hohle Injektionsnadel verwendet wird. Wann immer eine subkutane Hohlinjektion bei einem Gewebe verwendet wird, so wird dieses Gewebe von der hohlen Injektionsnadel kreisförmig geschnitten. Als Ergebnis empfindet ein Patient, der eine subkutane Injektion erhält, beträchtliche Schmerzen. Zur Vermeidung eines solchen kreisförmigen Schnitts und der dabei auftretenden beträchtlichen Schmerzen wäre es wünschenswert, falls ein Verfahren zur Zuführung von Molekülen zu biologischen Zellen zur Verfügung stünde, bei dem keine Injektionsnadel verwendet wird.
Aus dem US-Patent Nr. 5,318,514 von Hofmann ist ein Applikationsgerät für die Elektroporation von Arzneistoffen und Genen in Zellen bekannt. Das Applikationsgerät enthält mehrere Nadelelektroden, die in die Haut eines Patienten eindringen können. Das in die Haut zu elektroporierende Material wird in einem Flüssigkeitsreservoir gehalten, mit dem ein offener Zellschaumelastomerträger für die Flüssigkeit benetzt wird. Da das zu elektroporierende Material in einer Flüssigkeit, sowohl im Reservoir als auch dem offenen Zellschaumelastomer, gehalten wird, ist eine sorgfältige Kontrolle der Menge des Materials an den Elektrodenoberflächen schwierig. Es ist schwer zu kontrollieren, wieviel Flüssigkeit aus dem Reservoir und dem offenen Zellschaumelastomer hinunter auf die Oberflächen der Nadelelektroden fließt, wodurch schwer zu kontrollieren ist, wieviele der Behandlungsmoleküle tatsächlich auf den Oberflächen der Elektroden 16 vorhanden sind, wenn der Elektroporationsvorgang am Patienten durchgeführt wird. Außerdem kann die Gegenwart des Flüssigmediums einen Spül- oder Wascheffekt auf die elektroporierten Gewebe ausüben, so daß der Elektroporationsvorgang gestört wird. Diesbezüglich wäre es wünschenswert, falls ein Elektroporationsverfahren zur Zuführung von Molekülen zu biologischen Zellen bereitstünde, bei dem kein Flüssigmedium verwendet wird, das auf die Elektroden hinunterfließt, wenn der Elektroporationsvorgang an dem Patienten durchgeführt wird.
Weitere Offenbarungen im Zusammenhang mit der Verwendung von Elektroporation zur Vermittlung des Gentransfers in Epidermiszellen finden sich in einem Artikel von Reiss et al. mit dem Titel „DNA-mediated gene transfer into epidermal cells using electroporation" in Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 137, Nr. 1, (1986), Seite 244–249, sowie in einem Artikel von Titomirov unter dem Titel „In vivo electroporation and stable transformation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA" in Biochim. Biophys. Acta., Bd. 1088, Nr. 1, (1991), Seite 131–134.
Aus dem US-Patent Nr. 5,389,069 von Weaver sind ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur in-vivo-Elektroporation von Geweben bekannt, wobei in dem Verfahren eine zylindrische Hohlnadel verwendet wird, um Behandlungssubstanzen tief in die Gewebe zu bringen. Wie oben erwähnt, wäre es wünschenswert, die Verwendung zylindrischer Hohlnadeln und dadurch die damit verbundenen Schmerzen zu vermeiden.
Aus den US-Patenten Nr. 5,580,859 und 5,589,466, beide von Felgner et al., ist ein Verfahren zum Einbringen von Makromolekülen in Muskeln und Haut eines Patienten mittels eines Injektionsverfahrens bekannt. Bei diesem Verfahren wird keine Elektroporation verwendet.
Aus dem US-Patent Nr. 5,697,901 von Eriksson wird das Einbringen von Genen in Gewebe unter Verwendung eines gentragenden Flüssigmediums bekannt, das in Verbindung mit Mikrohohlnadeln unter Druck gesetzt wird. Probleme hinsichtlich Kontrolle und Spülen bei Verwendung von Flüssigmedien wurden bereits weiter oben diskutiert. Im Eriksson-Patent wird kein Elektroporationsschritt verwendet. Interessanterweise wird von Erikson das Thema Schmerzen in zweierlei Hinsicht adressiert. Zum einen wird angegeben, daß das Mikrohohlnadelsystem zur Schmerzbehandlung verwendet werden kann. Zum zweiten wird angegeben, daß Wundschmerzen durch Kühlen gelindert werden können. Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung wird hierin bemerkt, daß Eriksson sein Behandlungsverfahren nicht per se als ein Behandlungsverfahren ohne Schmerzen bzw. mit geringen Schmerzen erörtert. Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung wird daher die Theorie aufgestellt, daß das von Eriksson verwendete Flüssigkeitsinjektionsverfahren unter Druck nicht zu einem Behandlungsverfahren ohne Schmerzen oder mit verminderten Schmerzen beiträgt. Diesbezüglich wäre es wünschenswert, ein Gentherapiebehandlungsverfahren bereitzustellen, bei dem zwar Nadeln im Mikromaßstab verwendet werden, jedoch kein Flüssigkeitsinjektionsschritt unter Druck zur Injektion von Flüssigkeit in einen Patienten.
Aus einem Artikel von Henry et al. unter dem Titel „Microfabricated Microneedles: A Novel Approach to Transdermal Drug Delivery" in Journal of Pharmaceutical Sciences, Bd. 87, Nr. 8, August 1998, Seite 922–925 ist bekannt, daß ein Array aus Mikronadeln zur Penetration der Epidermis verwendet wird, so daß Perforationen im Mikromaßstab zurückbleiben, so daß die transdermale Permeabilität flüssigkeitsgeträgerter Behandlungsagentien in die mikroperforierte Epidermis erleichtert wird. Da die Mikronadeln nur über eine mikroskopisch kurze Distanz in die Epidermis eingelassen werden, ist die Verwendung der Mikronadeln potentiell nicht schmerzhaft. Dabei wird nicht offenbart, daß die Mikronadeln als Elektroden verwendet werden sollen. Ebenso wird in dem Artikel von Henry et al. kein Elektroporationsschritt offenbart.
Weiterhin wird im Hinblick auf den Punkt einer Behandlung unter verringerten Schmerzen angemerkt, daß zwei wichtige elektrische Parameter bei der Elektroporation eng mit einem empfundenen Schmerz in vivo in Zusammenhang stehen. Ein Parameter ist die von dem in-vivo-Gewebe erfahrene absolute Spannung. Ein anderer Parameter ist die von dem in-vivo-Gewebe erfahrene Impulsbreite. Diesbezüglich wäre es wünschenswert, ein Elektroporationsverfahren zum Zuführen von Molekülen zu biologischen Zellen bereitzustellen, bei dem eine relativ geringe absolute Spannung an die der Elektroporation unterzogenen Zellen angelegt wird und das, falls gewünscht, dazu verwendet werden kann, Impulse mit einer relativ kurzen Impulsbreite an die Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden, anzulegen.
Wiederum andere Merkmale wäre in Vorrichtungen zur Einbringung von Makromolekülen in Epidermiszellen wünschenswert. So können beispielsweise, wenn Elektroden in die Epidermis eingelassen werden, die leitenden Elektrodenbasisteile sowie die leitenden Elektrodenspitzen elektrische Eigenschaften zeigen, die hinsichtlich des Elektroporationsvorgangs im allgemeinen und der behandelten biologischen Zellen im besonderen unerwünscht sind. Diesbezüglich wäre es wünschenswert, falls Vorrichtungen zur Einbringung von Makromolekülen in Epidermiszellen bereitstünden, bei denen die Elektrodenbasisteile und die Elektrodenspitzenteile nicht leitend wären.
Nach dem Einsatz von Elektrodenanordnungen mit mehreren Nadelelektroden an einem Patienten kann deren Reinigung und Sterilisierung für eine nachfolgende Verwendung eine schwierige Aufgabe darstellen. Diesbezüglich wäre es wünschenswert, falls Vorrichtungen zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitstünden, bei denen es sich bei den Elektrodenanordnungen um Einwegeinheiten handelte.
Bei Verwendung von Einweg-Elektrodenanordnungen wäre es wünschenswert, wenn die Einweg-Elektrodenanordnungen in einer sterilen Verpackung abgepackt wären.
Obschon in dem vorstehenden Abschnitt zum Stand der Technik angedeutet ist, daß die Verwendung der Elektroporation zum Zuführen von Molekülen zu biologischen Zellen allgemein bekannt ist, wird von dem obenbeschriebenen Stand der Technik eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen, die den größten Teil der folgenden Kombination aus wünschenswerten Merkmalen: (1) kein Herbeiführen von Hautschädigung, die zur Narbenbildung führt; (2) kein Zurückbleiben ballistischer Partikelreste in behandelten Zellen; (3) Bereitstellen eines Elektroporationsverfahrens zum Zuführen von Molekülen zu biologischen Zellen in der Epidermis, nahe der Basalmembran, ohne daß die Behandlungsmoleküle die Haut transdermal durchqueren müssen; (4) keine Verwendung einer Injektionsnadel; (5) keine Verwendung eines Flüssigmediums, das auf die Elektroden hinunterfließt, wenn der Elektroporationsvorgang am Patienten durchgeführt wird; (6) keine Verwendung eines Flüssigkeitsinjektionsschritts unter Druck zum Injizieren von Flüssigkeit in einen Patienten; (7) Anlegen einer relativ geringen absoluten Spannung an Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden; (8) gewünschtenfalls mögliche Verwendung zum Anlegen von Impulsen mit relativ kurzer Impulsbreite an die Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden; (9) Nichtleitendmachen der Elektrodenbasisteile und -spitzenteile; (10) Bereitstellen von Einweg-Elektrodenanordnungen; und (11) Bereitstellung von Elektrodenanordnungen, die in einer sterilen Verpackung abgepackt sind, aufweist, weder gelehrt noch vorgeschlagen. Die vorstehenden gewünschten Eigenschaften werden durch die einzigartige Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in biologische Zellen bereitgestellt, wie aus der folgenden Beschreibung davon ersichtlich wird. Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik werden ebenfalls verdeutlicht.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Molekülen in biologische Zellen, gemäß dem nachfolgenden Anspruch 1, bereitgestellt.
Die Elektrodenanordnung kann aus dem Halter für die Elektrodenanordnung entfernbar und austauschbar sein. Diesbezüglich enthält die Elektrodenanordnung leitfähige Elektrodenanordnungsstreifen. Der Halter für die Elektrodenanordnung enthält Halterleiter, die mit den leitfähigen Elektrodenanordnungsstreifen registrierbar sind, wenn die Elektrodenanordnung mit dem Halter für die Elektrodenanordnung mechanisch verbunden ist. Ebenso enthält der Halter für die Elektrodenanordnung elektrisch leitende Wege zwischen den Halterleitern und dem Wellenformgenerator.
Mit der Vorrichtung läßt sich eine sterile Verpackung für die Elektrodenanordnung bereitstellen. Die sterile Verpackung wird von der Elektrodenanordnung entfernt, sobald die Elektrodenanordnung von dem Halter für die Elektrodenanordnung mechanisch gestützt und mit dem Wellenformgenerator elektrisch verbunden ist.
Bei der Vorrichtung gibt der Wellenformgenerator gewünschtenfalls Impulswellenformen, die eine Abfolge von wenigstens drei einzelnen, vom Anwender kontrollierten, unabhängig programmierten elektrischen Gleichstromimpulsen enthalten, an die biologischen Zellen ab, wobei die Abfolge von wenigstens drei elektrischen Gleichstromimpulsen eine, zwei oder drei der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) mindestens zwei der wenigstens drei Impulse unterscheiden sich in ihrer Impulsamplitude voneinander, (b) mindestens zwei der wenigstens drei Impulse unterscheiden sich in ihrer Impulsbreite voneinander, und (c) ein erstes Impulsintervall für einen ersten Satz aus zwei der wenigstens drei Impulse unterscheidet sich von einem zweiten Impulsintervall für einen zweiten Satz aus zwei der wenigstens drei Impulse.
Die Elektroden können Elektrodenspitzenteile mit elektrisch isolierter Außenfläche und Elektrodenbasisteile mit elektrisch isolierter Außenfläche enthalten. Die Elektroden sind mit Makromolekülen, die einen Polynukleotidimpfstoff (einen DNA-Impfstoff und/oder einen RNA-Impfstoff) und/oder einen Impfstoff auf Proteinbasis umfassen können, beschichtet. Der Polynukleotidimpfstoff oder der Impfstoff auf Proteinbasis kann in fester Form vorliegen, wobei die Elektroden damit vor Anwendung an einem Patienten beschichtet sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine verpackte sterile Elektrodenanordnung gemäß dem nachfolgenden Anspruch 6 bereitgestellt.
Bei der verpackten sterilen Elektrodenanordnung können die Elektroden Elektrodenspitzenteile mit elektrisch isolierter Außenfläche und Elektrodenbasisteile mit elektrisch isolierter Außenfläche enthalten.
Bei der verpackten sterilen Elektrodenanordnung sind die Elektroden mit Makromolekülen beschichtet, die einen Festphasen-Polynukleotidimpfstoff (DNA-Impfstoff und/oder RNA-Impfstoff) und/oder einen Festphasen- Impfstoff auf Proteinbasis umfassen können.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei der Transfektion von Zellen mit DNA in vivo unter Verwendung einer durch ein elektrisches Feld vermittelten Transfektion um ein wirksames Verfahren. Darüber hinaus können elektrische Felder zum Einbringen anderer Makromoleküle, wie z. B. RNA und Proteinen, in Zellen eingesetzt werden. Im Stand der Technik weist das Einbringen mittels elektrischem Feld einen Nachteil auf, nämlich die durch die für die Transfektion benötigten elektrischen Hochspannungsimpulse ausgelösten Schmerzen. Im Gegensatz dazu wird, wie hierin beschrieben, eine Vorrichtung zur Zuführung von Makromolekülen (DNA, RNA und Protein) an Zellen, in Geweben in vivo, bereitgestellt, wobei eine schmerzlose (oder nahezu schmerzlose) sowie wirksame Zuführung mittels elektrischem Feld verwendet wird.
Die für die DNA-Tranfektion mittels elektrischem Feld durch Elektroporation benötigten elektrischen Felder liegen im Bereich von 100 Volt pro cm bis 20000 Volt pro cm. Erfindungsgemäß wird bei Verwendung eines maximalen Abstands zwischen den Elektroden von 500 Mikron (0,5 mm) dieser Bereich in einen Bereich von 5 bis 1000 Volt absoluter Spannung umgerechnet. Unter Berücksichtigung der elektrophoretischen Spannung zum Vertreiben der DNA von den Elektroden liegt der Bereich absoluter Spannungen in einem Bereich von 0,1 bis 1000 Volt.
Eine von einem elektrischen Reiz hervorgerufene Schmerzempfindung hängt von mehreren Faktoren ab. Zu diesen gehören die Spannung, Stromstärke, Impulsanstiegszeit, Impulsbreite und Impulsfrequenz. Eine oberhalb eines direkt am Gewebe in vivo angelegten Schwellenwerts erhöhte Spannung oder erhöhte Impulsbreite führt zu verstärkten Schmerzen.
Bei der schmerzlosen Zuführung von Makromolekülen mittels elektrischem Feld in vivo sind zwei Schwellenwerte von Bedeutung. Ein erster Schwellenwert ist der Schwellenwert für Schmerzen. Dabei ist es wünschenswert, die direkt an Gewebe in vivo angelegte absolute Spannung (und gewünschtenfalls ebenso die Impulsbreite) auf einen Wert unterhalb des Schwellenwerts für Schmerzen zu reduzieren. Ein dem entgegenstehender zweiter Schwellenwert ist jedoch das minimale elektrische Feld, das für die Zuführung von Makromolekülen mittels elektrischem Feld benötigt wird. Normalerweise führen auf oberhalb dieses zweiten Schwellenwerts ansteigende Impulsparameter zu einer erhöhten Effizienz bei der Zuführung von Makromolekülen. Ein übermäßiger Anstieg führt zum Zelltod.
Glücklicherweise ist der wichtige elektrische Feldparamter für die Zuführung von Makromolekülen mittels elektrischem Feld Volts pro cm statt absolute Spannung. Zur Beibehaltung eines konstanten elektrischen Felds mit abnehmendem Abstand zwischen den Elektroden muß die absolute Spannung verringert werden. In analoger Weise wird das elektrische Feld bei sich verringerndem Elektrodenabstand verstärkt, wenn die absolute Spannung gleich bleibt. Somit erlaubt eine Verringerung des Abstands zwischen den Elektroden eine Abnahme der direkt an Gewebe in vivo angelegten absoluten Spannung.
Zusätzlich zur absoluten Spannung ist die Impulsbreite ebenfalls von Bedeutung. Sehr enge Impulsbreiten erhöhen in signifikanter Weise die für die Schmerzempfindung benötigte Schwellenspannung. Die Elektroporationseffizienz ist innerhalb gewisser Grenzen proportional zum Produkt der Impulsspannung multipliziert mit der Impulsbreite. Dies bedeutet, daß die Impulsbreite verringert werden kann, falls die Spannung erhöht werden kann. Daher erlaubt eine Abnahme des Abstands zwischen den Elektroden auch die Verwendung verringerter Impulsbreiten.
Ein weiterer Vorteil eines verkürzten Abstands zwischen den Elektroden ist, daß bei denjenigen Teilen der Elektroden, die durch die Epidermis hindurch in die Dermis eindringen können, weniger Dermisnerven zwischen den Elektroden lokalisiert sind. Bei einer gegebenen angelegten Spannung wird umso weniger Schmerz empfunden, je weniger Nerven zwischen den Elektroden liegen.
Ein weiterer schmerzbeeinflussender Faktor ist die Nähe des elektrischen Felds zu Nervenden. In der Haut kommen Nerven und Nervenden in der gesamten Dermis vor, wohingegen sie in der Epidermis fehlen. Allerdings sind in der oberen Papillarschicht der Dermis Nerven relativ dünn gesät. Dies bedeutet, daß Elektroden, die nur die Epidermis oder die Epidermis und die obere Dermis (Papillarschicht der Dermis) durchdringen, nicht in die Nähe vieler Nerven gelangen. Somit würden sehr kurze Elektroden nach ihrer Einführung fast keine Schmerzen auslösen, noch würde nach Anlegen eines elektrischen Feldes Schmerz induziert werden, da das Feld größtenteils zwischen den Elektroden liegt, die sich in der Epidermis befinden.
Es wird eine Reihe von Anwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen in Betracht gezogen. Kurz gesagt gehören zu derartigen Anwendungen eine Impfung mit Polynukleotid, eine Impfung mit Protein und die Gentherapie.
Für die Impfung mit DNA gibt es zwei vorrangige Forderungen. Die eine ist die Genexpression in vivo und die andere ist, daß wenigstens einige der das Antigen exprimierenden Zellen antigenpräsentierende Zellen sein müssen. Die höchste Konzentration an zugänglichen, antigenpräsentierenden Zellen liegt in der Haut in Form von Zellen mit der Bezeichnung Langerhans'sche Zellen vor. Diese Zellen sind Teil einer sehr wirksamen Gruppe von antigenpräsentierenden Zellen mit der Bezeichnung dendritische Zellen. Die Elektroporation ist ein realisierbares alternatives Verfahren zur Transfektion ausgewählter Zellen in vivo.
Proteine lassen sich ebenfalls in Zellen unter Verwendung einer Zuführung mittels elektrischem Feld einführen. Bei der herkömmlichen Impfung werden Proteine mit einer Injektionsnadel außen an Zellen gebracht. Diese Art der Zuführung ist für die Induktion einer zellvermittelten cytotoxischen Lymphozyten-Immunantwort ineffizient. Einige Infektionskrankheiten erfordern eine cytotoxische Lymphozytenantwort als Bestandteil der Immunantwort für eine wirksame Beseitigung der Infektion. Das Einbringen von Proteinen in Zellen fördert die Induktion dieser Antwort.
Das Einbringen genetischer Therapeutika in Zellen, um die Zellen dazu zu bringen, ein fehlendes Protein zu exprimieren, ist die Grundlage der Gentherapie. Die erfindungsgemäße Vorrichtung läßt sich zum Einbringen therapeutischer DNA in Zellen auf der Oberfläche eines beliebigen zugänglichen Organs zusätzlich zur Haut einsetzen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung sorgt für eine schmerzlose, wirksame Zuführung von Makromolekülen an Gewebe, in vivo, zum Zwecke der Impfung (oder Behandlung), der Impfung mit DNA, der Gentherapie oder aus anderen Gründen. Für das Einbringen von Makromolekülen in Zellen in Gewebe wird eine Elektrode mit mindestens zwei Eigenschaften verwendet. Eine der beiden Eigenschaften ist eine Elektrode, die kurz genug ist, so daß sie nicht bis zu einer Tiefe in Gewebe mit Nervenden durchdringt. Eine weitere Eigenschaft ist, daß die Abstände zwischen den Elektroden klein genug sind, um die Verwendung von Impulsparamtern (Spannung und Impulsbreite), die schmerzlos sind, zu erlauben.
Nur jeweils einer dieser Eigenschaften wird bei einer gegebenen Anwendung benötigt, doch können sie auch beide zusammen verwendet werden.
In der obigen kurzen Beschreibung werden die wichtigeren Merkmale der vorliegenden Erfindung eher allgemein dargelegt, so daß die nachfolgende ausführliche Beschreibung davon besser verständlich ist und die vorliegenden Beiträge zum Stand der Technik besser ersichtlich sind. Natürlich gibt es zusätzliche erfindungsgemäße Merkmale, die im nachfolgenden beschrieben werden und Gegenstand der anhängenden Ansprüche sind.
In dieser Hinsicht versteht es sich, bevor nun eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ausführlich erläutert wird, daß die Erfindung in ihrer Anwendung nicht auf die Einzelheiten der Konstruktion und die Anordnungen der in der vorliegenden Beschreibung dargelegten bzw. in den Zeichnungen dargestellten Komponenten beschränkt ist. Die Erfindung kann weitere Ausführungsformen aufweisen und auf verschiedene Weise praktiziert und durchgeführt werden. Es sollte sich ebenso verstehen, daß die hierin verwendete Ausdrucksweise und Terminologie der Beschreibung dienen und nicht als Beschränkung anzusehen sind.
Im Hinblick auf das oben gesagte ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, durch die keine Hautschädigung, die zur Narbenbildung führt, verursacht wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, durch die keine Reste an ballistischen Partikeln in behandelten Zellen zurückgelassen werden.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zur Zuführung von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, die ein Elektroporationsverfahren zum Zuführen von Molekülen an biologische Zellen in der Epidermis, in der Nähe der Basalmembran, ohne daß die Behandlungsmoleküle die Haut transdermal durchqueren müssen, bereitstellt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, bei der es sich nicht um eine Injektionsnadel handelt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wiederum besteht darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, bei der kein Flüssigmedium eingesetzt wird, daß hinunter auf die Elektroden fließt, während das Elektroporationsverfahren am Patienten durchgeführt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, bei der keine Flüssigkeitsinjektion unter Druck zum Injizieren von Flüssigkeit in einen Patienten eingesetzt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht wiederum darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, bei der eine relativ niedrige absolute Spannung an Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden, angelegt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, die gewünschtenfalls dazu verwendet werden kann, Impulse mit relativ kurzer Impulsbreite an Zellen anzulegen, die einer Elektoporation unterzogen werden.
Wiederum eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, durch die die Basisteile und Spitzenteile der Elektroden nichtleitend gemacht werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht auch darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, mit der Einweg-Elektrodenanordnungen bereitgestellt werden.
Wiederum eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine neue und verbesserte Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitzustellen, wobei die Elektrodenanordnungen in steriler Verpackung abgepackt sind.
Ruf diese erfindungsgemäßen Aufgaben wird zusammen mit weiteren erfindungsgemäßen Aufgaben und den verschiedenen Neuheitsmerkmalen, die die Erfindung kennzeichnen, im Detail in den dieser Offenbarung anhängigen Ansprüchen, die einen Teil derselben bilden, hingewiesen. Zum besseren Verständnis der Erfindung, ihrer arbeitstechnischen Vorteile sowie der durch ihre Verwendungen gelösten spezifischen Aufgaben sei auf die beiliegenden Zeichnungen und Beschreibungen verwiesen, in denen bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen veranschaulicht werden.
Die Erfindung läßt sich besser verstehen, und die obigen Aufgaben werden ebenso wie andere Aufgaben als die oben dargelegten ersichtlicher, nachdem die folgende ausführliche Beschreibung davon studiert wurde. Bei dieser Beschreibung wird auf die anhängende Zeichnung verwiesen, in der:
1 eine schematische Gesamtdarstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt,
2 eine schematische Darstellung der in eine Epidermisschicht eindringenden und zum Einbringen von Makromolekülen in Epidermiszellen durch Impulswellenformen angetriebenen vorbeschichteten Elektroden der Erfindung zeigt,
3 eine schematische Darstellung der Elektrodenspitzenteile zeigt,
4 eine Seitenansicht einer Elektrodenanordnung zeigt,
5 eine Ansicht der in 4 gezeigten Elektrodenanordnung von unten zeigt,
6 eine Teilkantenansicht der in 5 dargestellten Elektrodenanordnung zeigt, wobei die alternierende Polarität alternierender Reihen von Elektroden dargestellt ist,
7 eine vergrößerte Draufsicht der in 4 dargestellten Elektrodenanordnung zeigt, in der jeweils alternierende Leiter zum Kontaktieren alternierender Reihen von Elektroden dargestellt sind,
8 schematisch eine in einer sterilen Verpackung abgepackte Elektrodenanordnung zeigt,
9 schematisch eine Vorrichtung zur Beschichtung der Elektroden mit Makromolekülen zeigt.
Es werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren und die Vorrichtung unter Bezug auf die Zeichnungen im folgenden beschrieben sind. Das Verfahren zum Einbringen von Molekülen in biologische Zellen verwendet die dargestellte Vorrichtung und enthält die Schritte (a) Beschichten der Elektroden 16 in einer Elektrodenanordnung 12 mit den einzubringenden Molekülen, (b) Anbringen der Elektrodenanordnung 12 mit den beschichteten Elektroden 16 an einen Halter 13 für die Elektrodenanordnung, (c) Bereitstellen eines Wellenformgenerators 15, (d) Herstellen elektrisch leitender Wege zwischen den Elektroden 16 und dem Wellenformgenerator 15, (e) Lokalisieren der Elektroden 16, so daß sich die biologischen Zellen dazwischen befinden und (f) Bereitstellen von Impulswellenformen aus dem Wellenformgenerator 15 an die Elektroden 16, so daß Moleküle auf den Elektroden 16 von den Elektroden 16 vertrieben und in die biologischen Zellen eingebracht werden.
In einer Variante des Verfahrens werden die Moleküle Langerhans'schen Zellen 22 in der Epidermis 20 eines Patienten zugeführt, der dabei weniger verspürt. Die Impulswellenformen weisen eine absolute angelegte Spannung in einem Bereich von 0,1 bis 300 Volt auf. Elektroden 16 mit entgegengesetzter Polarität sind durch einen Trennabstand im Bereich von 50 bis 500 Mikron voneinander getrennt. Die Elektroden 16 werden in das Epidermisgewebe bis zur und leicht unterhalb der Basalmembranschicht des Epidermisgewebes eingelassen.
Die Impulswellenformen, die die Beschichtungsmoleküle von den Elektroden 16 vertreiben, sind elektrophoretische Wellenformen. Die elektrophoretischen Wellenformen können in einem Bereich von 0,1 bis 100 Volt/cm liegen. Bei den Impulswellenformen, mit denen die vertriebenen Moleküle in die biologischen Zellen eingebracht werden, handelt es sich um Elektroporationswellenformen. Die Elektroporationswellenformen können in einem Bereich von 100 bis 10000 Volt/cm liegen. Gewöhnliche Impulswellenformen können sowohl die Beschichtungsmoleküle von den Elektroden 16 vertreiben und vertriebenen Moleküle in die biologischen Zellen einbringen.
Die biologischen Zellen, denen die Moleküle zugeführt werden, können in vivo, ex vivo oder in vitro vorliegen. Insbesondere können die biologischen Zellen in der Epidermis 20 (Epidermisgewebe) vorliegen, wobei es sich bei ihnen um Langerhans'sche Zellen 22 in dem Epidermisgewebe handeln kann.
Die von den Elektroden 16 durch elektrische elektrophoretische Impulse vertriebenen Moleküle werden den Zellen mittels Elektroporationsimpulsen zugeführt. Gemäß einer beispielhaften Vorschrift werden die Impulswellenformen durch den Wellenformgenerator 15 bereitgestellt, indem eine Abfolge von wenigstens drei einzelnen, vom Anwender kontrollierten, unabhängig programmierten elektrischen Gleichstromimpulsen an die biologischen Zellen angelegt wird. Die Abfolge von wenigstens drei elektrischen Gleichstromimpulsen weist eine, zwei oder drei der folgenden Eigenschaften auf: (1) mindestens zwei der wenigstens drei Impulse unterscheiden sich in ihrer Impulsamplitude voneinander, (2) mindestens zwei der wenigstens drei Impulse unterscheiden sich in ihrer Impulsbreite voneinander, und (3) ein erstes Impulsintervall für einen ersten Satz aus zwei der wenigstens drei Impulse unterscheidet sich von einem zweiten Impulsintervall für einen zweiten Satz aus zwei der wenigstens drei Impulse.
Der Halter 13 für die Elektrodenanordnung ist mit elektrisch leitenden Wegen, zu denen die Leiter 21 gehören, zwischen der Elektrodenanordnung 12 und dem Wellenformgenerator 15 versehen.
Die Elektrodenanordnung 12 läßt sich in einer sterilen Verpackung 24 bereitstellen, die vor Gebrauch von der Elektrodenanordnung 12 entfernt wird.
Vorzugsweise weisen die Elektroden 16 konische Spitzen auf, weswegen sie als Nadelelektroden bezeichnet werden. Die Elektroden 16 können mit Elektrodenspitzenteilen 17 mit elektrisch isolierter Außenfläche sowie Elektrodenbasisteilen 19 mit elektrisch isolierter Außenfläche bereitgestellt werden. Die Elektrodenbasisteile 19 mit elektrisch isolierter Außenfläche minimieren den Stromfluß über die obere Hautoberfläche, wenn die Impulsspannung angelegt wird. Darüber hinaus bindet DNA nur schwach an die Elektrodenbasisteile 19 mit elektrisch isolierter Außenfläche. Die Außenfläche der Elektroden 16 zwischen den Elektrodenspitzenteilen 17 mit elektrisch isolierter Außenfläche und den Elektrodenbasisteilen 19 mit elektrisch isolierter Außenfläche besitzt keine äußere Isolationsschicht und ist daher als Oberfläche zur DNA-Bindung gut geeignet. Die Außenflächen zwischen den Elektrodenspitzenteilen 17 mit elektrisch isolierter Außenfläche und den Elektrodenbasisteilen 19 mit elektrisch isolierter Außenfläche sind leitend und können als aktive Elektrodenfläche bezeichnet werden. Die Elektrodenspitzenteile 17 mit elektrisch isolierter Außenfläche verhindern eine große lokale Intensität des elektrischen Felds, durch die im Gewebe eine Verbrennung verursacht werden könnte.
Eine für die Zuführung von DNA-Impfstoffen an Langerhans'sche Zellen 22 in der Epidermis 20 des Unterarms geeignete Elektrodenanordnung 12 besitzt die folgenden Eigenschaften:

(a) Elektrodenlänge – 130 Mikron
(b) Resistivität des Elektrodenmaterials – weniger als 0,1 Ohm-cm
(c) Isolierung an der Spitze – Ausdehnung um 10 Mikron nach oben vom Spitzenende
(d) Isolierung an der Basis – Ausdehnung um 55 Mikron nach unten vom Elektrodenträger
(e) Abplattung der Elektrodenspitze – weniger als 1 Quadratmikron
(f) Elektrodendurchmesser an Basis – 43 Mikron
(g) Elektrodenabstand in einer leitfähigen Reihe – 130 Mikron
(h) Anzahl der Elektroden in einer leitfähigen Reihe – 35
(i) Abstand zwischen leitenden Reihen – 260 Mikron (2 × 130)
(j) Anzahl an leitfähigen Reihen – 25.

Für Anwendungen in der Epidermis werden die Längen der Elektroden 16 durch die Dicke der Epidermis 20 festgelegt. Die Dicke der Epidermis 20 variiert in unterschiedlichen Teilen des menschlichen Körpers. So ist die Dicke der Epidermis 20 am mittleren Unterarm oder am seitlichen Oberarm oberhalb des Deltamuskels deutlich geringer als die Dicke der Epidermis 20 an der Ferse oder Fußsohle.
Die Moleküle in der Elektrodenbeschichtung liegen in fester Phase vor und sind vorzugsweise Makromoleküle 18. Die Makromoleküle 18 in der Elektrodenbeschichtung können einen DNA-Impfstoff und/oder einen Impfstoff auf Proteinbasis umfassen. Dabei können der DNA-Impfstoff und der Impfstoff auf Proteinbasis in Form eines Festphasen-DNA-Impfstoffs bzw. Festphasen-Impfstoffs auf Proteinbasis auf den Elektroden 16 aufgebracht sein.
Vorzugsweise kann die Elektrodenanordnung 12 aus dem Halter 13 für die Elektrodenanordnung entfernt und ausgetauscht werden. Die Elektrodenanordnung 12 enthält leitfähige Elektrodenanordnungsstreifen 26. Der Halter 13 für die Elektrodenanordnung enthält Halterleiter, die mit den leitfähigen Elektrodenanordnungsstreifen 26 registrierbar sind, wenn die Elektrodenanordnung 12 mit dem Halter 13 für die Elektrodenaordnung mechanisch verbunden ist. Der Halter 13 für die Elektrodenanordnung enthält elektrisch leitende Wege zwischen den Halterleitern und dem Wellenformgenerator 15.
Wie oben angegeben, gibt es drei Hauptkomponenten, die für das Einbringen von Makromolekülen in Zellen in Gewebe benötigt werden. Diese sind ein Wellenformgenerator 15, ein Halter 13 für die Elektrodenanordnung sowie eine Elektrodenanordnung 12. Der Wellenformgenerator liefert die elektrischen Impulse, die zur Erzeugung des elektrischen Felds in dem Gewebe notwendig sind. Die Elektrodenanordnung 12 enthält die Elektroden 16, auf die die DNA- oder Protein-Makromoleküle aufgebracht werden. Der Halter 13 für die Elektrodenanordnung verbindet die Elektrodenanordnung 12 mit dem Wellenformgenerator 15.
Die Elektrodenanordnung 12 kann in Form eines Elektronenarrays vorliegen, der in Form eines einmal verwendbaren Einweg-Elektronenarrays, bei dem die Elektroden bereits mit den Makromolekülen beladen sind, vorliegen kann. Diesbezüglich läßt sich der vorbeladene Elektrodenarray in Form einer sterilen Verpackung bereitstellen. Zur Verwendung eines solchen Elektroden arrays wird die sterile Verpackung geöffnet und der Elektrodenarray mit dem Halter für den Elektrodenarray verbunden. Der Halter für die Elektrodenanordnung wird von einer Person gegriffen, die Elektrodenanordnung auf die Haut eines Patienten gedrückt und dann in die Haut des Patienten gedrückt, so daß die Elektrodenanordnung in das Stratum corneum der Epidermis eindringt. Dabei sind die Spitzen der Elektroden in der Elektrodenanordnung vorzugsweise im Bereich der Langerhans'schen Zellen, bei denen es sich um dendritische Zellen der Epidermis handelt, lokalisiert.
Danach wird eine Impulswellenform vom Wellenformgenerator durch den Halter für die Elektrodenanordnung und zur Elektrodenanordnung gesendet. Die Impulswellenform treibt zuvor geladene Makromoleküle von der Elektrodenanordnung und in die Epidermis. In der Epidermis werden die Epidermis-Zielzellen von der Impulswellenform elektropermeabilisiert, so daß die Makromoleküle in die Zielzellen eintreten können.
Wie in 2 dargestellt, umfaßt eine Elektrodenanordnung 12 einen nichtleitenden Elektrodenträger 14 und mehrere einzelne Nadelelektroden 16, die von dem Elektrodenträger 14 gestützt werden. Die aktiven Flächen 29 der Elektroden 16 sind mit Makromolekülen beschichtet, die als kleine „x" 18 auf den Oberflächen der Elektroden 16 dargestellt sind. Unter dem Einfluß der Impulswellenformen werden einige der Makromoleküle 18 von den Elektroden 16 durch elektrophoretische Spannung vertrieben und treten in die Epidermis 20 ein und werden durch Elektroporationsspannung den dendritischen Langerhans'schen Zellen 22 und den lebenden Epithelzellen 23 in der lebenden Epidermis oberhalb der Basalmembran 25 in der Epidermis 20 zugeführt.
Der Wellenformgenerator 15 produziert die Impulse für die Vorschrift. Das Ausgangssignal des Wellenform generators kann in herkömmlicher Form mit einer einzigen Auswahl von Impulsparamtern, wie z. B. Spannung, Impulsbreite, Intervall zwischen Impulsen, Anzahl an Impulsen und Impulsvektor, vorliegen. Als Alternative kann das Ausgangssignal des Wellenformgenerators programmierbar sein, wobei von Impuls zu Impuls einer der Parameter (Spannung, Impulsbreite, Intervall zwischen Impulsen, Anzahl an Impulsen) verändert werden kann. Das variable Ausgangssignal wird für eine optimale Leistung benötigt, da für die makromolekulare Wegbewegung von den Elektroden 16 ein anderes elektrisches Feld als für das Einbringen von Makromolekülen in Zellen mittels elektrischem Feld benötigt wird. Ein geeigneter programmierbarer Impulsgenerator ist das Gerät PulseAgile (registriert beim US Patent and Trademark Office), Modell PA-4000 Electroporation System, hergestellt von Cyto Pulse Sciences, Inc., P. O. Box 609, Columbia, MD 21045. Es sei hier angemerkt, daß das Modell PA-4000 Rechteckwellen unterschiedlicher Amplituden (Spannungen), Breite und Intervalle liefert.
Neben der programmierbaren Steuerung von Spannung, Impulsbreite, Intervall zwischen Impulsen und Anzahl von Impulsen von Impuls zu Impuls ist auch eine programmierbare Steuerung von zwei anderen Parametern gewünscht. Zum einen ist dies die Steuerung der Richtung oder des Vektors des angelegten elektrischen Felds, zum anderen die Steuerung der Elektrodenauswahl. In einer Anwendung könnte man die Richtung des elektrischen Felds umgekehrt, um eine bessere Verteilung des Makromoleküls zu gewährleisten. In einer anderen Anwendung könnten individuelle Paare von Elektrodenarrays nacheinander ausgewählt werden.
Eine geeignete Vorrichtung zur Elektrodenauswahl und der Auswahl der Elektrodenfeldrichtung ist der programmierbare Impulsschalter, der eine optionale Komponente des obenerwähnten PA-4000 Electroporation System darstellt.
Die Elektrodenanordnung 12 dient zwei Funktionen. Sie führt das Makromolekül an die gewünschte Stelle und das elektrische Feld an das Gewebe.
Die Elektrodenanordnung 12 besteht aus:

1. einem nichtleitenden Elektrodenträger 14.
2. einem Array aus Nadelelektroden 16, hergestellt auf dem Elektrodenträger 14.
3. leitfähigen Elektrodenanordnungsstreifen 26 für die elektrische Verbindung zu den Halterleitern auf dem Halter 13 für die Elektrodenanordnung zur elektrischen Verbindung mit dem Wellenformgenerator 15.

Bei der Durchführung des Verfahrens werden die Spitzen der Nadelelektroden 16 gegen die Epidermis 20 eines Patienten gedrückt, wobei die Nadeln das Stratum corneum 27 durchstoßen und in die Epidermis 20 und die obere Dermis 31 vordringen, wie in 2 gezeigt.
Mit Bezug auf 4, 5 und 6 besteht der Nadel-Array aus N Reihen, die leitfähig sind. Jede Nadelelektrode 16 in einer Reihe ist mit allen anderen Nadeln in dieser Reihe elektrisch verbunden. Die Reihen werden durch elektrische Impulse angetrieben, entweder:

1. unabhängig
2. paarweise
3. indem alle Reihen gleichzeitig aktiv sind, wobei eine Reihe eine Kathode, die nächste Reihe eine Anode, die nächste Reihe eine Kathode usw. darstellt.

Die für die makromolekulare Zuführung mittels elektrischem Feld (für DNA-Transfektion und Proteinzuführung) an Langerhans'sche Zellen 22 in der Epidermis 20 benötigten Elektrodenanordnungen (Arrays) weisen die folgenden technischen Daten auf:

1. mehrere leitfähige Reihen pro Array, wobei die Nadelelektroden in einer leitfähigen Reihe jeweils elektrisch miteinander verbunden sind.
2. benachbarte Reihen sind voneinander elektrisch isoliert.
3. zwei bis einhundert Elektroden-Nadelelektroden pro leitfähiger Reihe.
4. Nadellänge wird zur Anpassung an die Epidermisdicke in der behandelten Zone ausgewählt.
5. Abstand zwischen isolierten Reihen von Elektrodennadeln wird der angelegten Spannung und den elektromechanischen Eigenschaften des durchdrungenen Gewebes entsprechend ausgewählt.
6. Abstand zwischen den nächsten elektrisch miteinander verbundenen Elektrodennadeln wird so ausgewählt, daß eine Gewebsverletzung minimiert und das elektrische Feld maximiert wird.
7. die Elektroden können elektrisch entweder einzeln, in Reihen oder in Gruppen von Reihen angesteuert werden.

Die Elektrodennadeln können mehrere Formen aufweisen. Beispiele für Nadelelektrodenformen sind: zylindrische Nadeln, flache Nadeln, kegelförmige Nadeln und klingenförmige Nadeln. Dabei können die Nadeln abgerundete oder stumpfe Enden aufweisen. Jede dieser Formen kann pro Elektrodenreihe ein- oder mehrmals auftreten.
Der Zweck des Halters für die Elektrodenanordnung ist die Herstellung einer elektrischen Verbindung zwischen dem Wellenformgenerator und der Elektrodenanordnung sowie die Bereitstellung einer Stütze für die Elektrodenanordnung, wenn die Elektrodenanordnung bei dem Patienten angewendet wird. Durch den Halter wird eine mechanische Verbindung bei der Anwendung am Patienten bereitgestellt. Ebenso wird dadurch ein Mittel zur Zuführung der Elektrodenanordnung an das Patientengewebe unter Beibehaltung der Sterilität der Elektrodenanordnung bereitgestellt.
Die Elektrodenanordnung kann die folgenden optionalen Merkmale aufweisen. Sie kann ein Mittel zur Lieferung des korrekten Drucks auf die Elektrodenanordnung zum Gewebe aufweisen. Sie kann Indikatoren, die den korrekten Auftragsdruck, den Verlauf der elektrischen Zuführung und die Beendigung der elektrischen Zuführung anzeigen, aufweisen. Sie kann einen Schalter für den Start des Impulsprotokolls aufweisen. Sie kann ein Mittel für den automatischen Start eines Impulsprotokolls, wenn der korrekte Druck an dem Halter der Elektrodenanordnung anliegt, aufweisen.
Wie oben angegeben, müssen Makromoleküle, einschließlich DNA- und Protein-Makromoleküle, von den beschichteten Elektroden 16 durch elektrophoretische Spannungen vertrieben werden, so daß sie durch die Extrazellulärräume des Gewebes wandern können, bevor die Elektroporationsimpulse zum Einbringen der Makromoleküle in die biologischen Zielzellen in dem Gewebe angelegt werden.
Wie oben angegeben, sind die Makromoleküle zu Anfang an die äußeren Oberflächen der Elektroden 16 gebunden. In einem mechanischen Ansatz zur Beschichtung der Elektroden 16 mit Makromolekülen 18 wird eine relativ hohe Konzentration an Makromolekülen 18 in einem Lösungsmittel oder flüssigen Trägerstoff gelöst oder suspendiert. Die Elektroden 16 werden dann in die Lösung bzw. Suspension getaucht. Danach wird das Lösungsmittel bzw. der flüssige Träger verdampft, wobei eine feste Beschichtung von Makromolekülen 18 auf den Elektroden 16 zurückbleibt. Alternativ werden die Elektroden 16 durch Sprühen beschichtet. Andere mechanische Mittel zur Beschichtung der Elektroden 16 sind denkbar.
Makromoleküle, wie z. B. DNA, binden mit guter Effizienz an viele Oberflächen. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Materials lassen sich zur Verstärkung der Bindung an Elektrodenoberflächen verwenden.
Moleküle neigen dazu, aneinander über verschiedene molekulare Wechselwirkungen zu binden, wobei jede dieser Wechselwirkungen jeweils eine unterschiedliche Bindungsstärke aufweist. Dieselben Kräfte sind zwischen festen Substraten und löslichen Molekülen ebenso wie zwischen Molekülen in Lösung wirksam. Bei diesen molekularen Wechselwirkungen handelt es sich um:

1. Solvatisierung: Lösungsmittelbindung. Eine Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen eines Moleküls und den Lösungsmittelmolekülen.
2. Hydrophobe Wechselwirkung: Eine Wechselwirkung zwischen gelöstem Stoff und gelöstem Stoff als Folge der Unfähigkeit, mit dem Lösungsmittel zu Wechselwirken; eine Vermeidungswechselwirkung.
3. Van-der-Waals-Kräfte sind schwache Anziehungskräfte, die zwischen allen Molekülen existieren. Sie sind nur über kurze Distanzen wirksam und können stärker sein, wenn die Wechselwirkungen auf komplementären Formen beruhen.
4. Wasserstoffbrückenbindungen sind Bindungen, die sich zwischen Wasserstoff und anderen Molekülen, wie z. B. Stickstoff und Sauerstoff, ausbilden.
6. Ionische Bindungen sind Anziehungskräfte, die auf der Anziehung entgegengesetzt geladener Teile von Molekülen beruhen.
6. Kovalente Bindungen sind die stärksten molekularen Bindungen.

Bezüglich DNA im besonderen ist DNA sowohl schwer löslich in Wasser als auch geladen. Die organischen Ringe innerhalb der Nukleotide verleihen DNA ihre hydrophoben Eigenschaften. Die Phosphatmoleküle im DNA-Polymer verleihen eine negative Nettoladung.
Die stärkste Bindung zwischen einer Elektrodenoberfläche und DNA ist die hydrophobe Bindung. Besitzt eine Elektrode eine positive Ladung, so bewegt sich die DNA auf die Elektrode zu, wodurch die Wechselwirkung der DNA mit der leitenden hydrophoben Oberfläche verstärkt wird. Für die Zuführung wird die elektrische Ladung umgekehrt. Die Wanderung von der Elektrodenoberfläche findet statt, sobald die Abstoßungskraft ähnlicher Ladungen die Kraft der hydrophoben und anderer molekularer Wechselwirkungen übersteigt.
Bestimmte Stellen können mit DNA beschichtet werden, indem die DNA an Metall (wie z. B. einer Elektrodenoberfläche) oder einem anderen leitfähigen Material durch Einsatz einer positiven Ladung gebunden wird. Anschließend wird zum Vertreiben der DNA von der Elektrodenoberfläche sowie für die nachfolgende Zuführung der DNA an biologische Zellen eine negative Ladung an dieselbe Oberfläche angelegt. Die negativ geladene DNA wandert in einem elektrischen Feld in Richtung der positiven Elektrode. Dieses Phänomen wird Elektrophorese genannt. Falls es sich bei der positiven Elektrode um eine hydrophobe Oberfläche handelt, wie bei den meisten Metallen, wirken die positive Ladung und die hydrophobe Wechselwirkung zusammen, um die DNA auf der Oberfläche zu halten.
Die meisten Makromoleküle weisen in Lösung bei einem von ihrem isoelektrischen Punkt verschiedenen pH-Wert eine Nettoladung auf. DNA ist beispielsweise bei physiologischem pH negativ geladen. Dies bedeutet, daß ein DNA-Molekül auf eine positive Elektrode zuwandert. Diese Eigenschaft wird dazu verwendet, das Makromolekül in Kontakt mit der Elektrode zu bringen, wo eine Bindung über die anderen aufgeführten molekularen Wechselwirkungen stattfindet. DNA kann beispielsweise aufgrund ihrer Hydrophobizität binden.
Die elektrische Beschichtung nutzt die Ladung der Makromoleküle zu ihrem Vorteil aus. Wie oben angegeben, ist DNA negativ geladen und wandert daher zu einer positiv geladenen Elektrode. Mit Bezug auf 9, worin eine zur Beschichtung der Elektroden 16 verwendete Vorrichtung dargestellt ist, wird in einem Beschichtungsverfahren DNA zu einer Pufferlösung gegeben und danach in einer Kammer mit einer Elektrode plaziert, die als Kathode dient. Vorzugsweise ist diese Elektrode vom Puffer durch eine Gel-Zwischenphase getrennt, um zu verhindern, daß Metall auf der Kathode in Kontakt mit der DNA kommt. Die Elektrodenvorrichtung wird in die Flüssigkeit eingeführt und danach eine positive Ladung an die Elektrodenvorrichtung angelegt, wodurch die DNA zur Oberfläche der Elektrodenvorrichtung gezogen wird. Die DNA bindet an die Oberfläche der Elektrodenvorrichtung über eine hydrophobe oder andere Wechselwirkung, bis sie durch eine Umkehrladung abgestoßen wird. Die DNA wird auf der Vorrichtung mit oder ohne Schutzmittel, wie z. B. Zucker, sowie mit oder ohne weitere Trägermoleküle getrocknet. Der Beschichtung auf den Elektroden können ebenfalls Substanzen beigegeben werden, die die Aufnahme des Behandlungsmaterials in die Zielzellen fördern.
Die Menge an Makromolekül auf der Elektrodenanordnung variiert je nach Anwendung. Für eine Immunisierung mit DNA wird die Elektrodenanordnung beispielsweise mit 0,01 bis 100 Mikrogramm Plasmid-DNA beladen.
Bei der Herstellung der Elektrodenanordnung mit dem Makromolekül können sterile Materialien sowie eine sterile lokale Umgebung verwendet werden. Alternativ läßt sich die Anordnung nach der Herstellung sterilisieren.
Eine typische Abfolge von Schritten bei der Verabreichung von Makromolekülen 18 an einen Patienten unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird wie folgt beschrieben. In einer Klinik würde der Wellenformgenerator 15 mit dem Halter 13 für die Elektrodenanordnung verbunden. Für eine Einzelanwendung wird eine Elektrodenanordnung 12, deren Elektroden 16 mit dem gewünschten Makromolekül beladen wurden, ausgewählt. Die Elektrodenanordnung 12 wird dann mechanisch mit dem Halter 13 für die Elektrodenanordnung verbunden. Während der Halter 13 für die Elektrodenanordnung von einem Anwender ergriffen wird, werden die Elektroden 16 auf das Patientengewebe (typischerweise Haut) gedrückt. Die Elektroden 16 dringen in die Epidermis 20 ein und reichen im wesentlichen nur bis zur Basalmembranschicht. Nachdem die Elektroden 16 so in der Epidermis 20 lokalisiert wurden, wird der Vorgang der Makromolekülzuführung gestartet und das ausgewählte Muster an elektrischen Feldern initiiert. Nach Beendigung des Zuführungsprotokolls werden die Elektroden 16 aus der Epidermis 20 entfernt und die Elektrodenanordnung 12 wird verworfen.
Wie oben angegeben, ist das elektrische Protokoll so gestaltet, daß die Makromoleküle von den Elektroden 16 in das Gewebe getrieben werden und anschließend in die Zellen in dem Gewebe eingebracht werden. Bei DNA läuft eine typische Abfolge von elektrischen Impulsen wie folgt ab. Zunächst wird eine Reihe von Impulsen mit niedriger Spannung (elektrophoretische Impulse) an die Elektroden 16 angelegt, um die DNA von allen negativ geladenen Elektroden zu entfernen. Typischerweise ist jede zweite Reihe von Elektroden negativ geladen. Als nächstes werden Elektroporationsimpulse mit höherer Spannung an die Elektroden 16 angelegt, um die DNA in die Zellen zu treiben. Danach werden die Elektrodenpolarität umgekehrt und Niedrigspannungsimpulse mit entgegengesetzter Polarität zugeführt, um die DNA von den verbliebenen Elektroden zu entfernen. Anschließend werden Elektroporationsimpulse mit höherer Spannung angelegt, um die DNA in die Zellen zu zwingen.
Eine signifikante Verwendung dieses Makromolekülzuführungssystems besteht darin, Makromoleküle der Haut zuzuführen. Für diese Verwendung wird eine Elektrodennadellänge gewählt, die das Eindringen der Elektrode bis zum Stratus basalis und zur Basalmembran gestattet. Dabei kann ein gewisses leichtes Eindringen in die Dermis auftreten. Für diese Verwendung an einem Patientenarm wird eine Elektrodenlänge von 130 Mikron ausgewählt. Diese Tiefe gestattet die Behandlung von Zellen der Epidermis. Für einen DNA-Impfstoff oder eine Gentherapie handelt es sich bei den mit diesem Zuführungsverfahren transfizierten Zellen um dendritische Zellen (Langerhans'sche Hautzellen 22) sowie um Epithelzellen.
Neben der Verabreichung von Makromolekülen an biologische Zellen in der Epidermis läßt sich die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in anderen biologischen Umgebungen wie z. B. Geweben während einer Operation und bei Pflanzen einsetzen.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 12 können viele verschiedene Verfahren eingesetzt werden. Eine Reihe von Beispielen ist unten angegeben.
Standardverfahren der Mikrochipherstellung können zur Produktion der leitfähigen Mikronadeln auf einem nichtleitenden Träger im Sinne der vorliegenden Erfindung angepaßt werden. In einem Beispiel würde ein unbeschichteter Wafer, bestehend aus einer Silicon- oder anderen, nichtleitenden Schicht und einer Metallschicht, verwendet werden. Die Maske wäre dabei so gestaltet, daß ein stärkeres Ätzen zwischen den Reihen als innerhalb der Reihen gefördert würde, wodurch leitfähige Reihen von Elektroden mit nichtleitenden Zwischenräumen zwischen den Reihen entstünden.
Ein weiteres Verfahren zur Konstruktion einer Elektrodenanordnung besteht darin, daß die bekannte Technik der Extrusions-Mikroherstellung angepaßt wird, beispielsweise wie folgt. Das Elektrodenmaterial und angrenzendes Isolationsmaterial werden durch Vermischen eines Keramik-, Metall- oder anderen Pulvers mit einem thermoplastischen Bindemittel hergestellt. Die einzelnen Komponenten werden zusammengelagert und zum Zusammenhalten heiß gepreßt. Der entstandene Stab wird zur Größenverkleinerung extrudiert. Nach der Extrusion werden die neuen Stäbe in einem Stab zusammengelagert, der sich aus einem Vielfachen des extrudierten Stabs zusammensetzt. Dieser neueste Stab wird wiederum zur Größenverkleinerung der mehreren Stäbe auf die Größe des ersten extrudierten Stabs extrudiert. Nachdem auf die gewünschte Größe verkleinert wurde, können die Teile zur Entfernung des Bindemittels erhitzt werden. Eine zweite, stärkere Hitze wird zum Zusammensintern der Metall- bzw. Keramikpulver verwendet. Die Stäbe werden vor und nach dem Sintern in Scheiben geschnitten. Um die Nadeln auf ein Niveau oberhalb der Oberfläche des Isolators zu bringen, können differenzielles Sandstrahlen oder andere mechanische oder chemische Techniken verwendet werden.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung bestünde darin, Laserfräsetechniken zur Entfernung von Material von einem aus leitenden und nichtleitenden Schichten zusammengesetzten Sandwich zu verwenden. Bei einigen der Elektrodenarrays ist der Abstand zwischen den Elektroden groß genug für einen mechanischen Zusammenbau, der beispielsweise wie folgt durchgeführt wird. Draht der gewünschten Metallzusammensetzung und des gewünschten Durchmessers wird auf Spulen zum Zusammenbau angeordnet. Die Drähte werden in eine Vorrichtung geleitet, die den Draht auf den korrekten Abstand voneinander ausrichtet. Keramik- oder Plastikmaterial wird in ein Durchflußsystem injiziert, wobei die Lücke zwischen den Elektroden vollständig gefüllt und die Form des äußeren Rands der Elektrode gebildet wird. Das Plastik bzw. die Keramik wird gehärtet und in Scheiben geschnitten. Die erhaltenen Scheiben werden differenziell abgetragen, wobei man die weichere Matrix ausnutzt. Die Abtragung kann mit mechanischen Verfahren, chemischen Verfahren oder einer Kombination von Verfahren durchgeführt werden. Durch die Oberflächenabtragung bleiben Nadeln der gewünschten Länge zurück, die über die Trägermatrix hinausreichen.
Eine weitere Herstellungstechnik wird wie folgt beschrieben. Man bezieht rostfreie Stahlnadeln mit einer Länge von 30 mm und einem Durchmesser von 120 Mikron. Eine Quelle dafür ist eine Firma für Akupunkturzubehör. Ein Beispiel sind Seirin Nr. 02-Nadeln. Die Nadeln werden aus dem eventuell vorhandenen Griff herausgeschnitten. Für jede Reihe der Vorrichtung wird eine Anzahl Nadeln ausgewählt. In diesem Beispiel werden 35 Nadeln pro Reihe verwendet.
Die Nadeln werden sorgfältig nebeneinander plaziert, wobei die Spitzen der Nadeln eine Linie bilden. Dieser Schritt erfordert Sorgfalt, wobei eine aus einem Mikroskop-Objektträger, der in einem Winkel von 90 Grad auf einen zweiten Mikroskop-Objektträger geklebt ist, hergestellte Einspannvorrichtung als Hilfswerkzeug bei der Ausrichtung dient. Der Objektträger läßt sich auch zum Überprüfen der Ausrichtung unter einem Mikroskop verwenden. Die Nadelreihe (das Nadelbündel) wird mit einem 50 Mikron dicken Klebeband zusammengeklebt. Zwei oder mehrere dieser Nadelbündel werden zur Bildung eines Elektroden-Arrays gestapelt, wobei die Spitzen eines jeden Bündels jeweils auf das nächste Bündel ausgerichtet sind. Die Nadeln werden mit Silber zu einem Draht verlötet, und jedes Nadelbündel wird jeweils mit dem übernächsten Nadelbündel elektrisch verbunden. Zum Stützen des Elektrodenarrays aus Nadelbündeln wird eine Gesamtträgerstruktur bereitgestellt.
Aus dem oben gesagten ist ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung alle dargelegten Aufgaben erfüllt, indem eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt wird, durch. die keine Hautschädigung, die zur Narbenbildung führt, verursacht wird. Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, bei der keine Reste ballistischer Partikel in behandelten Zellen zurückbleiben. Die Vorrichtung ist in der Lage, Moleküle biologischen Zellen in der Epidermis, in der Nähe der Basalmembran, zuzuführen, ohne daß die Behandlungsmoleküle die Haut transdermal durchqueren. Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, bei der keine Injektionsnadel verwendet wird. Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, bei der kein Flüssigmedium verwendet wird, das hinunter auf die Elektroden fließt, während das Elektro porationsverfahren am Patienten durchgeführt wird.
Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, bei der kein Mittel zur Injektion von Flüssigkeit unter Druck in einen Patienten verwendet wird. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden relativ niedrige absolute Spannungen an Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden, angelegt. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können Impulse, die an die Zellen angelegt werden, gewünschtenfalls relativ kurze Impulsbreiten zu den Zellen, die einer Elektroporation unterzogen werden, aufweisen. Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, bei der gewünschtenfalls Elektroden verwendet werden können, deren Basisteile und Spitzenteile jeweils nichtleitend sind. Mit der Erfindung werden durch eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen Einweg-Elektrodenanordnungen bereitgestellt. Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Einbringen von Makromolekülen in Zellen bereitgestellt, bei der die Elektrodenanordnungen in steriler Verpackung abgepackt sind.

Claims

Vorrichtung zum Einbringen von Molekülen in biologische Zellen, umfassend einen Wellenformgenerator (15), der Impulswellenformen abgibt einen Halter (13) für eine Elektrodenanordnung und eine Elektrodenanordnung (12), die von dem Halter (13) für die Elektrodenanordnung mechanisch gestützt wird und die mit dem Wellenformgenerator (15) durch elektrisch leitende Wege (2) elektrisch verbunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenanordnung (12) Elektroden enthält, die mit den in die biologischen Zellen einzubringenden Molekülen (18) beschichtet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Elektrodenanordnung (12) aus dem Halter (13) für die Elektrodenanordnung entfernt und ausgetauscht werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Elektrodenanordnung (12) leitfähige Elektrodenanordnungsstreifen (26) enthält und der Halter (13) für die Elektrodenanordnung Halterleiter enthält, die mit den leitfähigen Elektrodenanordnungsstreifen (26) registrierbar sind, wenn die Elektrodenanordnung mit dem Halter für die Elektrodenanordnung mechanisch verbunden ist, und wobei der Halter für die Elektrodenanordnung elektrisch leitende Wege zwischen den Halterleitern und dem Wellenformgenerator (15) enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, die weiterhin eine sterile Verpackung für die Elektrodenanordnung (12) enthält, die von der Elektrodenanordnung entfernt werden kann, sobald die Elektrodenanordnung von dem Halter (13) für die Elektrodenanordnung mechanisch gestützt und mit dem Wellenformgenerator (15) elektrisch verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wellenformgenerator (15) so eingestellt wird, daß er Impulswellenformen, die eine Abfolge von wenigstens drei einzelnen, vom Anwender kontrollierten, unabhängig programmierten elektrischen Gleichstromimpulsen enthalten, an die biologischen Zellen abgibt, wobei die Abfolge von wenigstens drei elektrischen Gleichstromimpulsen eine, zwei oder drei der folgenden Eigenschaften aufweist: (a) mindestens zwei der wenigstens drei Impulse unterscheiden sich in ihrer Impulsamplitude voneinander; (b) mindestens zwei der wenigstens drei Impulse unterscheiden sich in ihrer Impulsbreite voneinander; und (c) ein erstes Impulsintervall für einen ersten Satz aus zwei der wenigstens drei Impulse unterscheidet sich von einem zweiten Impulsintervall für einen zweiten Satz aus zwei der wenigstens drei Impulse.
Vorrichtung, umfassend eine verpackte Elektrodenanordnung, die eine Elektrodenanordnung (12) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrodenanordnung Elektroden (16), die mit den in biologische Zellen einzubringenden Molekülen (18) beschichtet sind, leitfähige Elektrodenanordnungsstreifen (26) zur Verbindung mit elektrisch leitenden Wegen zu einem Wellenformgenerator, sowie eine Verpackung (24), die die darin enthaltene Elektrodenanordnung umschließt, enthält.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektroden (16) in Form von Nadelelektroden vorliegen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Elektroden (16) Elektrodenspitzenteile (17) mit elektrisch isolierter Außenfläche und Elektroden basisteile (19) mit elektrisch isolierter Außenfläche enthalten.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Elektroden (16) mit Makromolekülen (18) beschichtet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Makromoleküle einen Polynukleotidimpfstoff, einen Festphasen-Polynukleotidimpfstoff, einen DNA-Impfstoff, einen Festphasen-DNA-Impfstoff, einen RNA-Impfstoff, einen Festphasen-RNA-Impfstoff, einen Impfstoff auf Proteinbasis oder einen Festphasen-Impfstoff auf Proteinbasis umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Elektroden (16) mit einem Festphasen-DNA-Impfstoff beschichtet sind.