DE60033026T4

DE60033026T4 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren durch Verstärkung des zwf Gens

Info

Publication number: DE60033026T4
Application number: DE60033026.5T
Authority: DE
Inventors: Kevin Burke; Hermann Sahm; Lothar Eggeling; Bernd Moritz; L. Dunican; Ashling McCormack; Cliona Stapelton; Bettina Möckel; Georg Thierbach
Original assignee: Evonik Degussa GmbH; Forschungszentrum Juelich GmbH; National University of Ireland
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Evonik Operations GmbH; National University of Ireland
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2015-09-10
Anticipated expiration: 2020-07-06
Also published as: CN101029310B; AU6821900A; CA2374261C; HK1047136A1; CA2374261A1; KR100715641B1; BR0011283A; DE60033026D1; PL205611B1; CN1289676C; ATE351908T1; CN1353758A; SK287997B6; MXPA01011644A; SK16532001A3; EP1179073B1; CN101029310A; EP1179073A1; DE60033026T2; PL358914A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Threonin unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen mindestens das zwf-Gen verstärkt ist.
STAND DER TECHNIK
L-Aminosäuren werden in der Tierernährung, in der Humanmedizin und in der Arzneimittelindustrie verwendet.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere von Corynebacterium glutamicum hergestellt werden. Aufgrund der großen Bedeutung dieses Verfahrens werden fortwährend Anstrengungen zu seiner Verbesserung unternommen. Die Verbesserungen des Verfahrens können sich auf Maßnahmen im Bereich der Fermentation wie beispielsweise das Rühren und die Sauerstoffzufuhr oder die Zusammensetzung des Nährmediums hinsichtlich beispielsweise der Zuckerkonzentration während der Fermentation beziehen, oder aber auf die Aufarbeitung bis zum Endprodukt, z. B. mittels Ionenaustauschchromatographie, oder auf die intrinsischen Produktionseigenschaften des Mikroorganismus selbst.
Um die Produktionseigenschaften dieser Mikroorganismen zu verbessern, kommen Verfahren der Mutagenese, der Selektion und der Mutantenselektion zum Einsatz. Auf diese Weise werden Stämme erhalten, die gegen Antimetaboliten wie beispielsweise die Threonin-analoge α-Amino-β-hydroxyvaleriansäure (AHV) resistent oder für Metaboliten von regulatorischer Bedeutung auxotroph sind und L-Aminosäuren wie beispielsweise Threonin produzieren.
Seit einigen Jahren kommen auch Verfahren der rekombinanten DNA-Technik zur Anwendung, um denjenigen Stamm von den Corynebacterium glutamicum-Stämmen, der L-Aminosäuren produziert, zu verbessern.
In JP-A-9224661 (Mitsubishi Chem. Corp.) ist ein Plasmid für das Klonieren des zwf-Gens offenbart.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Den Erfindern stellte sich die Aufgabe, neuartige verbesserte Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin und L-Threonin mittels coryneformer Bakterien bereitzustellen.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
L-Aminosäuren werden in der Humanmedizin, in der Arzneimittelindustrie, in der Lebensmittelindustrie und insbesondere in der Tierernährung eingesetzt. Daher besteht ein allgemeiner Bedarf dafür, neuartige verbesserte Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren bereitzustellen.
Die Erfindung stellt ein Gen bereit, das aus Corynebacterium glutamicum isoliert ist (zwf-Gen) und durch Anwendung von PCR auf C. glutamicum ATCC BO32 aus C. glutamicum ATCC13032 mittels des folgenden Oligonukleotidprimers erhalten werden kann:
zwf-vorwärts (SEQ ID Nr.: 10):
5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3'

zwf-rückwärts (SEQ ID Nr.: 11):
5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3'
und welches und welches für ein Polypeptid codiert, das eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität aufweist, wobei das Polypeptid die N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 9) Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp enthält.
Die Erfindung stellt weiterhin L-Lysin- oder L-Threonin produzierende rekombinante coryneforme Bakterien bereit, wobei die Bakterien durch das Gen nach Anspruch 1, welches für ein Polypeptid codiert, das eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität aufweist und die N-terminale Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr.: 9) Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp enthält, verändert sind.
Das Gen ist vorzugsweise durch Erhöhen der Anzahl der Kopien des Gens verstärkt, oder das Gen ist mit einem Promotor verbunden.
Ein weiterer Teil der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Threonin durch Fermentieren von coryneformen Bakterien, welches das Ausführen folgender Schritte umfasst:

a) Fermentieren der L-Aminosäure produzierenden Bakterien, wobei mindestens das zwf-Gen gemäß Anspruch 1, welches für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, verstärkt ist.
b) Konzentrieren der L-Aminosäure im Medium oder in den Bakterienzellen sowie
c) Isolieren der produzierten L-Aminosäure.

Die eingesetzten Stämme produzieren vorzugsweise bereits vor der Verstärkung des zwf-Gens L-Lysin oder L-Threonin.
Die bevorzugten Ausführungsformen sind in den Ansprüchen aufgeführt.
In diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff ”Verstärkung” das Erhöhen der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine), welche von der entsprechenden DNA codiert werden, in einem Mikroorganismus, wobei dies zum Beispiel durch das Erhöhen der Anzahl der Kopien des Gens oder der Gene, durch Verwendung eines leistungsfähigen Promotors oder durch Einsatz eines Gens, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) mit hoher Aktivität codiert, erfolgen kann, wobei diese Maßnahmen wahlweise auch kombiniert werden können.
Die Mikroorganismen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können L-Lysin und L-Threonin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molasse, Stärke, Zellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es handelt sich um Vertreter der coryneformen Bakterien, insbesondere um die Gattung Corynebacterium. Aus der Gattung Corynebacterium wäre insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu erwähnen, welche unter Fachleuten für ihre Fähigkeit bekannt ist, diese L-Aminosäuren herzustellen.
Als Beispiele für geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind folgende bekannte Wildtypenstämme zu nennen:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
sowie L-Aminosäure produzierende Mutanten, die daraus hergestellt wurden,
wie beispielsweise die L-Threonin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC21649
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM5399
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum TBB-10.
Die Beschreibung stellt darüber hinaus, zum Beispiel, die L-Isoleucin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871
bereit sowie, beispielsweise, die L-Tryptophan produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC21850 und
Corynebacterium glutamicum KY9218(pKW9901)
sowie, beispielsweise, die L-Lysin produzierenden Stämme
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DSM12866.
Es wurde entdeckt, dass coryneforme Bakterien L-Lysin und L-Threonin nach Überexpression des zwf-Gens, welches für das Zwf-Protein codiert, in verbesserter Weise produzieren.
Allele des zwf-Gens, die aufgrund der Degenerationsneigung des genetischen Codes oder aufgrund von sense-Mutationen neutraler Art entstehen, können ebenfalls eingesetzt werden.
In JP-A-09224661 ist die Nukleotidsequenz des Glucose-6-phosphate-Dehydrogenasegens, zwf genannt, aus Brevibacterium flavum MJ-223 (FERM BP-1497) offenbart. JP-A-09224661 beschreibt die N-terminale Aminosäuresequenz des Zwf-Polypeptids als Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu.
Es war indes nicht möglich, dies zu bestätigen. Stattdessen wurde die folgende N-terminale Aminosäuresequenz gefunden: Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp. Im Rahmen der post-translationellen Modifizierung kann das Valylradikal in der N-Stellung abgespalten werden, woraufhin Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp als N-terminale Aminosäuresequenz erhalten wird.
Um eine Verstärkung (z. B. eine Überexpression) zu erzielen, wird die Anzahl der Kopien des entsprechenden Gens erhöht, oder es wird eine Mutation der Promotor- und Steuerungsregion oder der strangaufwärts des Strukturgens liegenden Ribosomenbindungsstelle bewirkt. Expressionskassetten, die strangaufwärts des Strukturgens eingefügt werden, zeigen die gleiche Wirkung. Darüber hinaus ist es möglich, die Expression im Laufe der fermentativen L-Aminosäurebildung mit Hilfe von induzierbaren Promotoren zu erhöhen. Gleichermaßen wird die Expression durch Maßnahmen zur Verlängerung des Lebens der m-RNA verbessert. Weiterhin wird die Enzymaktivität auch erhöht, indem der Abbau des Enzymproteins verhindert wird. Im vorliegenden Fall befinden sich die Gene oder Genkonstrukte entweder auf Plasmiden, wobei die Anzahl der Kopien variieren kann, oder sie sind in das Chromosom integriert, um dort verstärkt zu werden. Alternativ dazu kann die Überexpression der fraglichen Gene auch erzielt werden, indem die Zusammensetzung des Mediums sowie das Kulturverfahren verändert werden.
Diesbezügliche Anweisungen kann der Fachmann, unter anderem, bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)) sowie in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869 , in der US-Patentschrift 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der Japanischen Patent-Auslegeschrift JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) sowie in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie finden.
Als Beispiel wurde das Zwf-Protein mit Hilfe eines Plasmids überexprimiert. Dazu wurde der binäre Vektor E. coli – C. glutamicum namens pEC-T18mob2, der in 1 dargestellt ist, verwendet. Durch Einfügen des zwf-Gens in die KpnI/SalI-Spaltstelle von pEC-T18mob2 wurde das Plasmid pEC-T18mob2zwf erhalten, das in 2 dargestellt ist.
Andere Plasmidvektoren, die zur Replikation in C. glutamicum befähigt sind, wie beispielsweise pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pZ8-1 ( EP-B-0 375 889 ) können in gleicher Weise verwendet werden.
Darüber hinaus kann es für die Herstellung von L-Lysin und L-Threonin vorteilhaft sein, zusätzlich zu der Verstärkung des zwf-Gens, ein oder mehrere Enzyme des spezifischen Biosyntheseweges, der Glycolyse, der Anaplerose, des Pentosephosphatweges oder des Aminosäureexportes zu verstärken.
So können beispielsweise, insbesondere zur Herstellung von L-Threonin, ein oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus:

– dem hom-Gen, welches für Homoserin-Dehydrogenase codiert (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63–72 (1988)) oder dem hom^dr-Allel, welches für eine ”rückkopplungsresistente” Homoserin-Dehydrogenase codiert (Archer et al., Gene 107, 53–59 (1991),
– dem gap-Gen, welches für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076–6086 (1992)),
– dem pyc-Gen, welches für Pyruvat-Carboxylase codiert (Peters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915–927 (1998)),
– dem mqo-Gen, welches für malat:chinon-Oxidoreductase codiert (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
– dem tkt-Gen, welches für Transketolase codiert (Registrierungsnummer AB023377 bei der European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Deutschland)),
– dem gnd-Gen, welches für 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codiert ( JP-A-9-224662 ),
– dem thrE-Gen, welches für den Threoninexport codiert ( DE 199 41 478.5 ; DSM 12840),
– dem zwa1-Gen ( DE 199 59 328.0 ; DSM 13115),
– dem eno-Gen, welches für Enolase codiert ( DE: 199 41 478.5 )

So können beispielsweise, insbesondere zur Herstellung von L-Lysin, ein oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus:

– dem dapA-Gen, welches für Dihydrodipicolat-Synthase codiert ( EP-B 0 197 335 ),
– dem lysC-Gen, welches für eine rückkopplungsresistente Aspartat-Kinase codiert (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317–324),
– dem gap-Gen, welches für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
– dem pyc-Gen, welches für Pyruvat-Carboxylase codiert ( DE-A-198 31 609 ),
– dem tkt-Gen, welches für Transketolase codiert (Registrierungsnummer AB023377 bei der European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Deutschland)),
– dem gnd-Gen, welches für 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codiert ( JP-A-9-224662 ),
– dem lysE-Gen, welches für den Lysinexport codiert ( DE-A-195 48 222 ),
– dem zwa1-Gen ( DE 199 59 328.0 ; DSM 13115),
– eno-Gen, welches für Enolase codiert ( DE 199 47 791.4 )

Darüber hinaus kann es für die Herstellung von L-Lysin und L-Threonin vorteilhaft sein, gleichzeitig eines der Gene, die aus der Gruppe gewählt sind, die aus:

– dem pck-Gen, welches für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codiert ( DE 199 50 409.1 ; DSM 13047),
– dem pgi-Gen, welches für Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert ( EP 1087015A , DSM 12969,
– dem poxB-Gen, welches für Pyruvat-Oxidase codiert ( DE 199 51 975.7 ; DSM 13114),
– dem zwa2-Gen ( DE: 199 59 327.2 ; DSM 13113) besteht, zusätzlich zur Verstärkung des zwf-Gens abzuschwächen.

Zusätzlich zur Überexpression des Zwf-Proteins kann es weiterhin für die Herstellung der L-Aminosäuren vorteilhaft sein, unerwünschte Nebenreaktionen zu auszuschalten (Nakayama: ”Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms”, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
Zum Zwecke der Produktion von L-Lysin und L-Threonin können die Mikroorganismen, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, kontinuierlich oder diskontinuierlich, d. h. chargenweise (Chargenkultur), oder auch chargenweise mit Eduktzufuhr (”feed process”) oder mit wiederholter Eduktzufuhr (”repetitive feed process”) gezüchtet werden. Eine beschreibende Kurzdarstellung der bekannten Zuchtverfahren findet sich in dem Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Das zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der jeweiligen Mikroorganismen in geeigneter Weise gerecht werden. Das Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthält Beschreibungen der Kulturmedien für verschiedenartige Mikroorganismen. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Molasse, Stärke und Zellulose, sowie Öle und Fette wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, sowie Fettsäuren wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, sowie Alkohole wie beispielsweise Glycerin and Ethanol, sowie organische Säuren wie beispielsweise Essigsäure verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie etwa Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser (CSL), Sojamehl und Harnstoff, sowie anorganische Verbindungen wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss darüber hinaus Metallsalze wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat umfassen, die für das Wachstum erforderlich sind. Schließlich können zusätzlich zu den oben genannten Substanzen auch essentielle Wachstumssubstanzen wie etwa Aminosäuren und Vitamine eingesetzt werden. Darüber hinaus können dem Kulturmedium geeignete Vorläufersubstanzen zugesetzt werden. Die erwähnten Ausgangssubstanzen können dem Kulturansatz in Form einer einzigen Charge zugesetzt oder in geeigneter Weise während der Zuchtdauer zugeführt werden.
Basische Verbindungen wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder aber saure Verbindungen wie etwa Phosphorsäure oder Schwefelsäure können in geeigneter Weise eingesetzt werden, um den pH-Wert einzustellen. Schaumverhüter wie beispielsweise Fettsäurepolyglykolester können eingesetzt werden, um die Entwicklung von Schaum einzudämmen. Geeignete Substanzen mit einer selektiven Wirkung, z. B. Antibiotika, können dem Medium zugesetzt werden, um die Stabilität der Plasmide aufrechtzuerhalten. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, können Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie beispielsweise Luft dem Kulturansatz zugeführt werden. Die Temperatur des Kulturansatzes beträgt üblicherweise 20°C bis 45°C und vorzugsweise 25°C bis 40°C. Es wird solange weitergezüchtet, bis ein Maximum an L-Aminosäure gebildet ist. Dieses Ziel wird üblicherweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse der L-Aminosäuren kann mittels Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung durchgeführt werden, wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben ist, oder sie kann mittels Umkehrphasen-HPLC erfolgen, wie bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben ist.
Die folgenden Mikroorganismen sind bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt worden:
Escherichia coli K-12 DH5α/pEC-T18mob2 als DSM 13244
Die folgenden Figuren sind als Anlagen beigefügt:
1: Kartierung des Plasmids pEC-T18mob2
2: Kartierung des Plasmids pEC-T18mob2zwf
3: Kartierung des Plasmids pAMC1
4: Kartierung des Plasmids pMC1
5: Kartierung des Plasmids pCR2.1poxBint
Bei der angegebenen Anzahl an Basenpaaren handelt es sich um Näherungswerte, die im Kontext der Reproduzierbarkeit erhalten wurden.
Zu Fig. 1 und Fig. 2:
Die verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

Tet:: Resistenzgen für Tetrazyklin
oriV:: Plasmidcodierter Replikationsursprung von E. coli
RP4mob:: mob-Region für die Mobilisierung des Plasmids
rep:: Plasmidcodierter Replikationsursprung des C. glutamicum-Plasmids pGA1
per:: Steuerungsgen für die Anzahl der Kopien von pGA1
lacZ-alpha:: lacZα-Genfragment (N-Terminus) des β-Galactosidase-Gens
lacZalpha':: 5'-Terminus des lacZα-Genfragments
'lacZalpha:: 3'-Terminus des lacZα-Genfragments

Zu Fig. 3 und Fig. 4:
Die verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

Neo r:: Neomycin/Kanamycin-Resistenz
ColE1 ori:: Replikationsursprung des Plasmids ColE1
CMV:: Cytomegalovirus-Promoter
lacP:: Lactose-Promoter
pgi:: Phosphoglucose-Isomerase-Gen
lacZ:: Teil des β-Galactosidase-Gens
SV40 3' splice: 3' Spleißstelle des Affenvirus 40
SV40 polyA:: Polyadenylierungsstelle des Affenvirus 40
fl(-)ori:: Replikationsursprung des filamentösen Phagen f1
SV40 ori:: Replikationsursprung des Affenvirus 40
kan r:: Kanamycin-Resistenz
pgi insert:: Internes Fragment des pgi-Gens
ori:: Replikationsursprung des Plasmids pBGS8

Zu Fig. 5:
Die verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

ColE1 ori:: Replikationsursprung des Plasmids ColE1
lacZ:: Klonierungsüberrest des lacZα-Genfragments
fl ori:: Replikationsursprung des Phagen f1
KmR:: Kanamycin-Resistenz
ApR:: Ampicillin-Resistenz
poxBint:: Internes Fragment des poxB-Gens

Die Bedeutung der Abkürzungen für die verschiedenen Restriktionsenzyme (z. B. BamHI, EcoRI usw.) ist aus dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise bei Kessler und Höltke (Gene 47, 1–153 (1986)) oder Roberts et al. (Nucleic Acids Research 27, 312–313 (1999)) zusammenfassend dargestellt.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung dieser Erfindung. Die angewendeten molekularbiologischen Techniken, z. B. die Isolierung plasmidischer DNA, die Behandlung mit Restriktionsenzymen, die Ligation und die Standardtransformationen von Escherichia coli usw. sind (wenn keine anderslautenden Angaben gemacht werden) bei Sambrook et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) beschrieben.
Beispiel 1
Expression des Zwf-Proteins
1.1 Herstellung des Plasmids pEC-T18mob2
Der binäre Vektor E. coli – C. glutamicum pEC-T18mob2 wurde gemäß dem Stand der Technik konstruiert. Der Vektor enthält eine Replikationsregion rep des Plasmids pGA1 einschließlich des Replikationseffektors per ( US-A-5,175,108 ; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), des Tetrazyklinresistenz verleihenden tetA(Z)-Gens des Plasmids pAG1 ( US-A-5,158,891 ; Gendatenbankeintrag beim National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) mit der Registrierungsnummer AF121000), der Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77–90 (1979)), des lacZα-Genfragments mit lac-Promotor und einer multiplen Klonierungsstelle (mcs) (Norrander et al. Gene 26, 101–106 (1983) sowie der mob-Region des Plasmids RP4 (Simon et al., (1983) Bio/Technology 1: 784–791). Der konstruierte Vektor wurde in den E. coli-Stamm DH5α (Brown (Hrsg.) Molecular Biology Labfax, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK, 1991) transformiert. Die Selektion im Hinblick auf plasmidtragende Zellen erfolgte durch Ausstrichen der Transformationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^te Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), welchem zuvor 5 mg/l an Tetrazyklin zugesetzt worden war. Mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Qiagen wurde die plasmidische DNA aus einem Transformanten isoliert, woraufhin eine Überprüfung durch Restriktion mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII und anschließende Elektrophorese auf Agarosegel (0,8%) erfolgte.
Das Plasmid wurde als pEC-T18mob2 bezeichnet und ist in 1 dargestellt. Es wurde in Form des Escherichia-coli-Stamms K-12, Stamm DH5αpEC-T18mob2, bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Deutschland) als DSM 13244 hinterlegt.
1.2 Herstellung des Plasmids pEC-T18mob2zwf
Das Gen aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde zuerst durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mittels der folgenden Oligonukleotidprimer vervielfältigt:
SEQ ID Nr.: 10
zwf-vorwärts:
5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3'

SEQ ID Nr.: 11
zwf-rückwärts:
5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3'
Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 μM an Desoxynukleotid-Triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), jeweils 1 μM des entsprechenden Oligonukleotids, 100 ng chromosomaler DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10-Volumen 10fachen Reaktionspuffers und 2,6 Einheiten einer hitzebeständigen Taq/Pwo-DNA Polymerasemischung (Expand High Fidelity PCR System von Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) in einem Heizzyklusgerät (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 64°C für 1 Minuten und 68°C für 3 Minuten.
Das vervielfältigte Fragment einer Größe von ungefähr 1,8 kb wurde anschließend mit Hilfe eines SureClone Ligationskits (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) und gemäß den Anweisungen des Herstellers in die SmaI-Spaltungsstelle des Vektors pUC18 ligiert. Der E. coli-Stamm DH5α mcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645–4649) wurde mit der gesamten Ligationscharge transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Carbenicillin-Resistenz auf LB-Agarplatten, die 50 μg/mL an Carbenicillin enthielten, identifiziert. Aus 7 der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein eines 1,8-kb-PCR-Fragments als Insert überprüft. Das rekombinante Plasmid, welches auf diese Weise gebildet wurde, wird im Folgenden als Puc18zwf bezeichnet.
Für die Konstruktion von pEC-T18mob2zwf wurde pUC18zwf mit KpnI und SalI verdaut und das Produkt wurde mit Hilfe des NucleoSpin Extraktionskits von Macherey-Nagel (Düren, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und anschließend mit dem Vektor pEC-T18mob2, der ebenfalls mit KpnI und SalI gespalten worden war, ligiert und dephosphoryliert. Der E. coli-Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645–4649) wurde mit der gesamten Ligationscharge transformiert. Transformanten wurden anhand ihrer Tetrazyklin-Resistenz auf LB-Agarplatten, die 5 μg/mL an Tetrazyklin enthielten, identifiziert. Aus 12 der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein eines 1,8-kb-PCR-Fragments als Insert überprüft. Eines der rekombinanten Plasmide, die auf diese Weise isoliert wurden, wurde als pEC-T18mob2zwf bezeichnet (2).
Beispiel 2
Herstellung von Aminosäureproduzenten mit einem verstärkten zwf-Gen
Der L-Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum DSM5715 ist in EP-B-0435132 beschrieben, und der L-Threonin produzierende Stamm Brevibacterium flavum DSM5399 ist in EP-B-0385940 beschrieben. Beide Stämme sind gemäß dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig (Deutschland) hinterlegt worden.
2.1 Herstellung der Stämme DSM5715/pEC-T18mob2zwf und DSM5399/pEC-T18mob2zwf
Die Stämme DSM5715 und DSM5399 wurden mit dem Plasmid pEC-T18mob2zwf unter Verwendung des Elektroporationsverfahren, welches bei Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)) beschrieben ist, transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, welcher 18,5 g/l an Hirn-Herz-Infusionsbouillon, 0,5 M Sorbit, 5 g/l an Bakto-Trypton, 2,5 g/l an Bakto-Hefeextrakt, 5 g/l an NaCl und 18 g/l an Bakto-Agar umfasste und welchem zuvor 5 mg/l an Tetrazyklin zugesetzt worden waren. Es wurde 2 Tage lang bei 33°C inkubiert.
Die plasmidische DNA wurde aus den jeweiligen Transformanten mit Hilfe herkömmlicher Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915–927) isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und KpnI gespalten, und das Plasmid wurde durch anschließende Elektrophorese auf Agarosegel überprüft. Die Stämme, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden als DSM5715/pEC-T18mob2zwf und DSM5399/pEC-T18mob2zwf bezeichnet.
2.2 Herstellung von L-Threonin
Der C. glutamicum-Stamm DSM5399/pEC-T18mob2zwf, der in Beispiel 2.1 erhalten wurde, wurde in einem Nährmedium weitergezüchtet, das für die Produktion von Threonin geeignet ist, und der Threoningehalt im Kulturüberstand wurde bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetrazyklin (5 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde ein Vorkulturansatz beimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). In dem Vorkulturansatz wurde das Vollmedium CgIII als Medium eingesetzt.

Medium Cg III

NaCl 2,5 g/l

Bakto-Pepton 10 g/l

Bakto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (separat autoklaviert) 2% (w/v)
Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt

Diesem Ansatz wurde Tetrazyklin (5 mg/l) zugesetzt. Der Vorkulturansatz wurde 16 Stunden lang bei 33°C auf einem Rüttler mit 240 U/min. inkubiert. Ein Hauptkulturansatz wurde derart aus diesem Vorkulturansatz beimpft, das der anfängliche OD-Wert (660 nm) des Hauptkulturansatzes 0,1 betrug. Im Hauptkulturansatz wurde das Medium MM eingesetzt.

Medium MM
CSL (Maisquellwasser)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (separat autoklaviert)	50 g/l
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7H₂O	1,0 g/l
CaCl₂·2H₂O	10 mg/l
FeSO₄·7H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (sterilfiltriert)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

Die Lösung von CSL, MOPS und Salzen wurde mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das CaCO₃, das in trockenem Zustand sterilisiert wurde, hinzugefügt.
Die Anzucht erfolgte in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Tetrazyklin (5 mg/l) hinzugefügt. Die Anzucht erfolgte bei 33°C und 80% atmosphärischer Feuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 Gerät (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Threoninmenge wurde mit einem Aminosäure-Analysator von EppendorfBioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1

Stamm OD L-Threonin g/l

DSM5399 12,3 0,74

DSM5399/pEC-T18mob2zwf 10,2 1,0
2.3 Herstellung von L-Lysin
Der C. glutamicum-Stamm DSM5715/pEC-T18mob2zwf, der in Beispiel 2.1 erhalten wurde, wurde in einem Nährmedium weitergezüchtet, das für die Produktion von Lysin geeignet ist, und der Lysingehalt im Kulturüberstand wurde bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetrazyklin (5 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde ein Vorkulturansatz beimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). In dem Vorkulturansatz wurde das Vollmedium CgIII als Medium eingesetzt.

Medium Cg III

NaCl 2,5 g/l

Bakto-Pepton 10 g/l

Bakto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (separat autoklaviert) 2% (w/v)
Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt

Medium MM
CSL (Maisquellwasser)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (separat autoklaviert)	58 g/l
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7H₂O	1,0 g/l
CaCl₂·2H₂O	10 mg/l
FeSO₄·7H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (sterilfiltriert)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

Die Lösung von CSL, MOPS und Salzen wurde mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das CaCO₃, das in trockenem Zustand sterilisiert wurde, hinzugefügt.
Die Anzucht erfolgte in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurde Tetrazyklin (5 mg/l) hinzugefügt. Die Anzucht erfolgte bei 33°C und 80% atmosphärischer Feuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 Gerät (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäure-Analysator von EppendorfBioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

Stamm OD L-Lysin HCl g/l

DSM5715 10,8 16,0

DSM5715/pEC-T18mob2zwf 7,2 17,1
Beispiel 3
Konstruktion einer Genbank des Corynebacterium glutamicum-Stamms AS019
Unter Verwendung des λ Zap Express^TM-Systems, (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583–7600) wurde eine DNA-Bank des Corynebacterium glutamicum-Stamms ASO19 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591–597 (1985)) konstruiert, und zwar gemäß der Beschreibung bei O'Donohue (O'Donohue, M. (1997). The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National University of Ireland, Galway). Das λ Zap Express^TM Kit stammte von Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037) und wird gemäß den Anweisungen des Herstellers eingesetzt. Die AS019-DNA wurde mit dem Restriktionsenzymen Sau3A verdaut und in λ Zap Express^TM-Vektorarme ligiert, die zuvor mit BamHI behandelt und dephosphoryliert worden waren.
Beispiel 4
Klonieren und Sequenzieren des pgi-Gens
1. Klonieren
Der Escherichia-coli-Stamm DF1311, welcher Mutationen des pgi- und des pgl-Gens aufweist, wie bei Kupor und Fraenkel, (Journal of Bacteriology 100: 1296–1301 (1969)) wurde mit ungefähr 500 ng der AS019 λ Zap Express^TM-Plasmidbank, die in Beispiel 3 beschrieben ist, transformiert. Die Selektion hinsichtlich der Transformanten erfolgte auf M9-Minimalmedium (Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratories, USA), welches Kanamycin mit einer Konzentration von 50 mg/l enthielt, wobei 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert wurde. Aus einem der Transformanten wurde die plasmidische DNA gemäß Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7: 1513–1523 (1979)) isoliert und als pAMC1 bezeichnet (3).
2. Sequenzieren
Für die Sequenzanalyse des klonierten Inserts von pAMC1 kam das Verfahren von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463–5467 (1977)) zur Anwendung, wobei Primer eingesetzt wurden, die zur Unterscheidung mit einem Farbmarker versehen waren. Die Durchführung erfolgte unter Verwendung eines genetischen Analysegeräts ABI prism 310 von Perkin Elmer Applied Biosystems, (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, U.S.A) sowie des Kits ”ABI prism Big Dye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready”, ebenfalls von Perkin Elmer.
Die ursprüngliche Sequenzanalyse wurde unter Einsatz des universellen Vorwärts- sowie des M13-Rückwärtsprimers durchgeführt, die von Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, AL1 3AW, UK) stammten:
Universeller Vorwärtsprimer:
GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C

M13-Rückwärtsprimer:
GGA AAC AGC TAT GAC CAT G
Anschließend wurden aus den erhaltenen Sequenzen interne Primer erstellt, mit Hilfe derer das gesamte pgi-Gen hergeleitet werden konnte. Die internen Primer wiesen folgende Sequenzen auf:
Interner Primer 1: GGA AAC AGG GGA GCC GTC
Interner Primer 2: TGC TGA GAT ACC AGC GGT
Anschließend wurde die erhaltene Sequenz unter Anwendung des Programms DNA-Strider (Marck, (1988). Nucleic Acids Research 16: 1829–1836) Version 1.0 auf einem Apple Macintosh Computer analysiert. Mit Hilfe dieses Programms konnten Analysen wie etwa Untersuchungen hinsichtlich der Verwendung von Restriktionsstellen, Untersuchungen auf offene Leserahmen sowie die Bestimmung der Verwendung der Codons durchgeführt werden. Der Suchvorgang einerseits in der erhaltenen DNA-Sequenz und andererseits in denjenigen aus den Datenbanken von EMBL und Genbank erfolgte unter Verwendung den BLAST-Programms (Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402). Die DNA- und Proteinsequenzen wurden unter Verwendung der Programme Clustal V und Clustal W (Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237–244) aliniert.
Die auf diese Weise erhaltene Sequenz ist in SEQ ID Nr. 1 dargestellt. Die Analyse der erhaltenen Nukleotidsequenz zeigte einen offenen Leserahmen von 1650 Basenpaar, welcher als pgi-Gen bezeichnet wurde. Es codiert für ein Protein mit 550 Aminosäuren, das in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist.
Beispiel 5
Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des pgi-Gens.
Ein internes Segment des pgi-Gens wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt, wobei genomische DNA, die aus Corynebacterium glutamicum AS019 (Heery and Dunican, (1993) Applied and Environmental Microbiology 59: 791–799) isoliert wurde, als Template diente. Es wurden die folgenden pgi-Primer eingesetzt:
Vorwärts- Primer: ATG GAR WCC AAY GGH AA
Rückwärts- Primer: YTC CAC GCC CCA YTG RTC
wobei R = A + G; Y = C + T; W = A + T; H = A + T + C waren.
Die PCR-Parameter waren wie folgt:
35 Zyklen
94°C für 1 min.
47°C für 1 min.
72°C für 30 sec.
1,5 mM MgCl₂
ungefähr 150 bis 200 ng DNA-Template.
Das erhaltene PCR-Produkt wurde in einen gewerblich erhältlichen pGEM-T Vektor, der von Promega Corp., (Promega UK, Southampton.) stammte, kloniert, wobei der Stamm E. coli JM109, (Yanisch-Perron et al., 1985. Gene, 33: 103–119) als Wirtsorganismus diente. Die Sequenz des PCR-Produktes ist als SEQ ID Nr. 3 dargestellt. Anschließend wurde der klonierte Insert als EcoRI-Fragment ausgeschnitten und in das Plasmid pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337–342 (1986)), das zuvor mit EcoRI behandelt worden war, ligiert. Die eingesetzten Restriktionsenzyme stammten von Boehringer Mannheim UK Ltd., (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK.) und wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller verwendet. Anschließend wurde E. coli JM109 mit dieser Ligationsmischung transformiert und die Elektrotransformanten wurden auf Luria-Agar, dem IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid), XGAL (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-D-galactopyranosid) und Kanamycin in Konzentrationen von 1 mM, 0,02% beziehungsweise 50 mg/l zugesetzt worden waren, selektiert. Die Agarplatte wurden zwölf Stunden lang bei 37°C inkubiert. Aus einem der Transformanten wurde die plasmidische DNA isoliert und unter der Bezeichnung pMC1 (4) mittels Restriktionsenzymanalyse unter Einsatz von EcoRI, BamHI und SalI charakterisiert.
Das Plasmid pMC1 wurde in Form des Escherichia-coli-Stammes DH5α/pMC1 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag als DSM 12969 hinterlegt.
Beispiel 6
Integrationsmutagenese des pgi-Gens in den Lysinproduzenten DSM 5715
Der in Beispiel 5 erwähnte Vektor pMC1 wurde mittels des Elektroporationsverfahrens von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Der Stamm DSM 5715 ist ein AEC-resistenter Lysinproduzent.
Der Vektor pMC1 kann sich in DSM 5715 nicht selbstständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle, wenn er in das Chromosom von DSM 5715 integriert wird. Die Selektion von Klonen, bei welchen pMC1 in das Chromosom integriert worden war, erfolgte durch Ausstreichen der Elektroporationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^te Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), welchem zuvor 15 mg/l an Kanamycin zugesetzt worden war. Um die Integration nachzuweisen, wurde das interne pgi-Fragment (Beispiel 5) mit Hilfe des Hybridisierungskits Dig von Boehringer Mannheim nach dem Verfahren aus ”The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) markiert. Die chromosomale DNA eines Transformanten wurde mittels des Verfahrens von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII gespalten. Die gebildeten Fragmente wurden durch Elektrophorese auf Agarosegel aufgetrennt und bei 68°C mit Hilfe des Hybridisierungskits Dig von Boehringer hybridisiert. Auf diese Weise wurde festgestellt, dass das Plasmid pMC1 innerhalb des chromosomalen pgi-Gens des Stammes DSM5715 eingefügt wurde. Das Stamm wurde als DSM5715::pMC1 bezeichnet.
Beispiel 7
Auswirkung der Überexpression des zwf-Gens bei gleichzeitiger Ausschaltung des pgi-Gens auf die Herstellung von Lysin
7.1 Herstellung des Stammes DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf
Der in Beispiel 1.2 erwähnte Vektor pEC-T18mob2zwf wurde mittels des Elektroporationsverfahrens von Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347) in das Corynebacterium glutamicum DSM 5715::pMC1 elektroporiert. Die Selektion hinsichtlich plasmidtragender Zellen erfolgt durch Ausstreichen der Elektroporationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2te Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), welchem zuvor 15 mg/l an Kanamycin und 5 mg/l an Tetrazyklin zugesetzt worden waren. Aus einem der Transformanten wurde die plasmidische DNA mittels herkömmlicher Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915–927) isoliert und durch Behandlung mit den Restriktionsenzymen KpnI und SalI mit anschließender Agarosegelelektrophorese überprüft. Der Stamm wurde als DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf bezeichnet.
7.2 Herstellung von Lysin
Der C. glumaticum-Stamm DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf, der in Beispiel 7.1 erhalten wurde, wurde in einem in einem Nährmedium weitergezüchtet, das für die Produktion von Lysin geeignet ist, und der Lysingehalt im Kulturüberstand wurde bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetrazyklin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Die Kulturansätze der Vergleichsstämme wurden gemäß ihrer jeweiligen Resistenz gegenüber Antibiotika mit diesen versetzt. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde ein Vorkulturansatz beimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). In dem Vorkulturansatz wurde das Vollmedium CgIII als Medium eingesetzt.

Medium Cg III

NaCl 2,5 g/l

Bakto-Pepton 10 g/l

Bakto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (separat autoklaviert) 2% (w/v)
Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt

Diesem Ansatz wurden Tetrazyklin (5 mg/l) und Kanamycin (5 mg/l) zugesetzt. Der Vorkulturansatz wurde 16 Stunden lang bei 33°C auf einem Rüttler mit 240 U/min. inkubiert. Ein Hauptkulturansatz wurde derart aus diesem Vorkulturansatz beimpft, das der anfängliche OD-Wert (660 nm) des Hauptkulturansatzes 0,1 betrug. Im Hauptkulturansatz wurde das Medium MM eingesetzt.

Die Lösung von CSL, MOPS und Salzen wurde mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das CaCO₃, das in trockenem Zustand sterilisiert wurde, hinzugefügt.
Die Anzucht erfolgte in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurden Tetrazyklin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Anzucht erfolgte bei 33°C und 80% atmosphärischer Feuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 Gerät (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäure-Analysator von EppendorfBioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3

Stamm OD L-Lysin HCl g/l

DSM5715 7,3 14,3

DSM5715/pEC-T18mob2zwf 7,1 14,6

DSM5715::pMC1/pECTmob2zwf 10,4 15,2
Beispiel 8
Herstellung einer genomischen Cosmidgenbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde gemäß der Beschreibung von Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168–179) isoliert und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen dephosphoryliert (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250). Die DNA des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), geliefert von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmidvektor-Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und gleichermaßen mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen dephosphoryliert. Die cosmidische DNA wurde anschließend mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die cosmidische DNA, die auf diese Weise behandelt wurde, wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt, woraufhin diese Charge mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt wurde. Anschließend wurde die Ligationsmischung mit Hilfe von Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli-Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension gemischt. Die Infektion und Titerung der Cosmidbank wurde gemäß der Beschreibung von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg/ml Ampicillin ausgestrichen wurden. Nachdem über Nacht bei 37°C inkubiert wurde, erfolgte die Selektion einzelner rekombinanter Klone.
Beispiel 9
Isolierung und Sequenzierung des poxB-Gens
Die cosmidische DNA einer Einzelkolonie (Beispiel 7) wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen dephosphoryliert (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250). Nach der Auftrennung mittels Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente im Größenbereich von 1.500 bis 2.000 bp mit dem QiaExII Gelextraktionskit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, geliefert von Invitrogen (Groningen, Holland, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde gemäß der Beschreibung von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) durchgeführt, wobei die DNA-Mischung über Nacht mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) inkubiert wurde. Diese Ligationsmischung wurde anschließend elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–7), und zwar in den E. coli-Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645–4649), und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausgestrichen. Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit Änderungen gemäß Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde das ”RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit” von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Auftrennung mittels Gelelektrophorese und die Analyse der Sequenzierungsreaktion erfolgten in einem ”Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid”-Gel (29:1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem ”ABI Prism 377” Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Roh-Sequenzdaten wurden anschließend unter Verwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231), Version 97-0 verarbeitet. Die Einzelsequenzen der pZerol-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig zusammengefügt. Die computerunterstützte Codierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit dem ”BLAST search program” (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402) im Abgleich mit der nichtredundanten Datenbank des ”National Center for Biotechnology Information” (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in der SEQ ID Nr. 4 dargestellt. Die Analyse der Nukleotidsequenz zeigte einen offenen Leserahmen mit 1737 Basenpaaren, der als poxB-Gen bezeichnet wurde. Das poxB-Gen codiert für ein Polypeptid mit 579 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 5).
Beispiel 10
Herstellung eines Integrationsvektors für die Integrationsmutagenese des poxB-Gens.
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde die chromosomale DNA mittels des Verfahrens von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert. Auf der Grundlage der Sequenz des poxB-Gens, die für C. glutamicum aus Beispiel 8 bekannt ist, wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion gewählt:
poxBint1:
5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'
poxBint2:
5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'
Die dargestellten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde mittels des Standard-PCR-Verfahrens von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase von Boehringer durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion wurde ein DNA-Fragment einer Größe von näherungsweise 0,9 kb isoliert, wobei dieses ein internes Fragment des poxB-Gens trug und in der SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.
Das vervielfältigte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Klonierkit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalognummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657–663) ligiert. Anschließend wurde der E. coli-Stamm DH5α mit der Ligationscharge elektroporiert (Hanahan, in: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Die Selektion hinsichtlich plasmidtragender Zellen erfolgte durch Ausstreichen der Transformationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^te Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), welchem zuvor 25 mg/l an Kanamycin zugesetzt worden war. Mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Qiagen wurde die plasmidische DNA aus einem Transformanten isoliert, woraufhin eine Überprüfung durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließende Elektrophorese auf Agarosegel (0,8%) erfolgte. Das Plasmid wurde als pCR2.1poxBint (5) bezeichnet.
Das Plasmid pCR2-1poxBint ist in Form des Escherichia-coli-Stamms DH5α/pCR2.1poxBint bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag als DSM 13114 hinterlegt worden.
Beispiel 11
Integrationsmutagenese des poxB-Gens in den Lysinproduzenten DSM 5715
Der in Beispiel 10 erwähnte Vektor pCR2.1poxBint wurde mittels des Elektroporationsverfahrens von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 elektroporiert. Der Stamm DSM 5715 ist ein AEC-resistenter Lysinproduzent. Der Vektor pCR2.1poxBint kann sich in DSM 5715 nicht selbstständig replizieren und bleibt nur dann in der Zelle, wenn er in das Chromosom von DSM 5715 integriert wird. Die Selektion von Klonen, bei welchen pCR2.1poxBint in das Chromosom integriert worden war, erfolgte durch Ausstreichen der Elektroporationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^te Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), welchem zuvor 15 mg/l an Kanamycin zugesetzt worden war. Um die Integration nachzuweisen, wurde das poxBint-Fragment mit Hilfe des Hybridisierungskits Dig von Boehringer nach dem Verfahren aus ”The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) markiert. Die chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wurde mittels des Verfahrens von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert und jeweils mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII gespalten. Die gebildeten Fragmente wurden durch Elektrophorese auf Agarosegel aufgetrennt und bei 68°C mit Hilfe des Hybridisierungskits Dig von Boehringer hybridisiert. Das Plasmid pCR2.1poxBint, das in Beispiel 9 erwähnt ist, ist in das Chromosom von DSM5715 innerhalb des chromosomalen poxB-Gens eingefügt worden. Der Stamm wurde als DSM5715::pCR2.1poxBint bezeichnet.
Beispiel 12
Auswirkung der Überexpression des zwf-Gens bei gleichzeitiger Ausschaltung des poxB-Gens auf die Herstellung von Lysin
12.1 Herstellung des Stammes DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf
Der Stamm DSM5715::pCR2.1poxBint wurde mit dem Plasmid pEC-T18mob2zwf unter Verwendung des Elektroporationsverfahren, welches bei Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)) beschrieben ist, transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, welcher 18,5 g/l an Hirn-Herz-Infusionsbouillon, 0,5 M Sorbit, 5 g/l an Bakto-Trypton, 2,5 g/l an Bakto-Hefeextrakt, 5 g/l an NaCl und 18 g/l an Bakto-Agar umfasste und welchem zuvor 5 mg/l an Tetrazyklin und 25 mg/l an Kanamycin zugesetzt worden waren. Es wurde 2 Tage lang bei 33°C inkubiert.
Die plasmidische DNA wurde aus den jeweiligen Transformanten mit Hilfe herkömmlicher Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915–927) isoliert und mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und KpnI gespalten, und das Plasmid wurde durch anschließende Elektrophorese auf Agarosegel überprüft. Der Stamm, der auf diese Weise erhalten wurde, wurde als DSM5715:pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf bezeichnet.
12.2 Herstellung von L-Lysin
Der C. glumaticum-Stamm DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf, der in Beispiel 12.1 erhalten wurde, wurde in einem in einem Nährmedium weitergezüchtet, das für die Produktion von Lysin geeignet ist, und der Lysingehalt im Kulturüberstand wurde bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetrazyklin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Die Vergleichsstämme wurden gemäß ihrer jeweiligen Resistenz gegenüber Antibiotika mit diesen versetzt. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde ein Vorkulturansatz beimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). In dem Vorkulturansatz wurde das Vollmedium CgIII als Medium eingesetzt.

Medium Cg III

NaCl 2,5 g/l

Bakto-Pepton 10 g/l

Bakto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (separat autoklaviert) 2% (w/v)
Der pH-Wert wurde auf 7,4 eingestellt

Diesem Ansatz wurden Tetrazyklin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Der Vorkulturansatz wurde 16 Stunden lang bei 33°C auf einem Rüttler mit 240 U/min. inkubiert. Ein Hauptkulturansatz wurde derart aus diesem Vorkulturansatz beimpft, das der anfängliche OD-Wert (660 nm) des Hauptkulturansatzes 0,1 betrug. Im Hauptkulturansatz wurde das Medium MM eingesetzt.

Die Lösung von CSL, MOPS und Salzen wurde mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das CaCO₃, das in trockenem Zustand sterilisiert wurde, hinzugefügt.
Die Anzucht erfolgte in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Es wurden Tetrazyklin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) zugesetzt. Die Anzucht erfolgte bei 33°C und 80% atmosphärischer Feuchtigkeit.
Nach 72 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 Gerät (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäure-Analysator von EppendorfBioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrindetektion bestimmt.
Das Ergebnis des Versuchs ist in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4

Stamm OD L-Lysin HCl g/l

DSM5715 10,8 16,0

DSM5715/pEC-T18mob2zwf 8,3 17,1

DSM5715::pCR2.1poxBint 7,1 16,7

DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-Tmob2zwf 7,8 17,7

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Aus Corynebacterium glutamicum isoliertes Gen (zwf-Gen), welches durch Anwendung von PCR auf C. glutamicum ATCC13032 mittels des folgenden Oligonucleotidprimers erhalten werden kann: zwf-vorwärts (SEQ ID Nr.: 10): 5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3' zwf-rückwärts (SEQ ID Nr.: 11): 5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3' und welches für ein Polypeptid codiert, das eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität aufweist, wobei das Polypeptid die N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 9) Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp enthält.
L-Lysin- oder L-Threonin produzierende rekombinante coryneforme Bakterien, wobei die Bakterien durch das Gen nach Anspruch 1, welches für ein Polypeptid codiert, das eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität aufweist und die N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr.: 9) Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp enthält, verändert sind.
Coryneforme Bakterien nach Anspruch 2, wobei das Gen durch Erhöhen der Anzahl der Kopien dieses Gens verstärkt ist.
Coryneforme Bakterien nach Anspruch 2, wobei das Gen mit einem Promotor verbunden ist.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin oder L-Threonin durch Fermentieren von coryneformen Bakterien, welches das Ausführen folgender Schritte umfasst: a) Fermentieren der L-Aminosäure produzierenden Bakterien, wobei mindestens das zwf-Gen gemäß Anspruch 1, welches für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, verstärkt ist. b) Konzentrieren der L-Aminosäure im Medium oder in den Bakterienzellen sowie c) Isolieren der produzierten L-Aminosäure.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei coryneforme Bakterien, die L-Threonin oder L-Lysin herstellen, verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Bakterien der Gattung Corynebacterium, die L-Lysin herstellen, verwendet werden.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin gemäß Anspruch 5, wobei in den coryneformen Bakterien eines oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt werden, die aus folgenden Genen besteht: a) dapA-Gen, welches für Dihydrodipicolinat-Synthase codiert, b) lysC-Gen, welches für eine rückkopplungsresistente Aspartat-Kinase codiert, c) gap-Gen, welches für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert, d) pyc-Gen, welches für Pyruvat-Carboxylase codiert, e) tkt-Gen, welches für Transketolase codiert, f) gnd-Gen, welches für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, g) lysE-Gen, welches für den Lysinexport codiert, h) als zwa1 bezeichnetes Gen, welches unter der Nummer DSM 13115 hinterlegt ist, i) eno-Gen, welches für Enolase codiert, verstärkt ist oder gleichzeitig verstärkt sind.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin gemäß Anspruch 5, wobei in den coryneformen Bakterien eines oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt werden, die aus folgenden Genen besteht: a) dapA-Gen, welches für Dihydrodipicolinat-Synthase codiert, b) lysC-Gen, welches für eine rückkopplungsresistente Aspartat-Kinase codiert, c) gap-Gen, welches für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert, d) pyc-Gen, welches für Pyruvat-Carboxylase codiert, e) tkt-Gen, welches für Transketolase codiert, f) gnd-Gen, welches für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codiert, g) lysE-Gen, welches für den Lysinexport codiert, h) als zwa1 bezeichnetes Gen, welches unter der Nummer DSM 13115 hinterlegt ist, i) eno-Gen, welches für Enolase codiert, überexprimiert wird oder gleichzeitig überexprimiert werden.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin gemäß Anspruch 5, wobei in den coryneformen Bakterien eines oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt werden, die aus folgenden Genen besteht: a) hom-Gen, welches für Homoserin-Dehydrogenase codiert oder hom^dr-Allel, welches für eine ”rückkopplungsresistente” Homoserin-Dehydrogenase codiert, b) gap-Gen, welches für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert, c) pyc-Gen, welches für Pyruvat-Carboxylase codiert, d) mqo-Gen, welches für malat:chinon-Oxidoreductase codiert, e) tkt-Gen, welches für Transketolase codiert, f) gnd-Gen, welches für 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codiert, g) thrE-Gen, welches für den Threoninexport codiert, h) als zwa1 bezeichnetes Gen, welches unter der Nummer DSM 13115 hinterlegt ist, i) eno-Gen, welches für Enolase codiert, verstärkt ist oder gleichzeitig verstärkt sind.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin gemäß Anspruch 5, wobei in den coryneformen Bakterien eines oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt werden, die aus folgenden Genen besteht: a) hom-Gen, welches für Homoserin-Dehydrogenase codiert oder hom^dr-Allel, welches für eine ”rückkopplungsresistente” Homoserin-Dehydrogenase codiert, b) gap-Gen, welches für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codiert, c) pyc-Gen, welches für Pyruvat-Carboxylase codiert, d) mqo-Gen, welches für malat:chinon-Oxidoreductase codiert, e) tkt-Gen, welches für Transketolase codiert, f) gnd-Gen, welches für 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codiert, g) thrE-Gen, welches für den Threoninexport codiert, h) als zwa1 bezeichnetes Gen, welches unter der Nummer DSM 13115 hinterlegt ist, i) eno-Gen, welches für Enolase codiert, überexprimiert wird oder gleichzeitig überexprimiert werden.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin oder L-Threonin gemäß Anspruch 5, wobei Bakterien, in denen eines oder mehrere Gene, die aus der Gruppe gewählt werden, die aus folgenden Genen besteht: a) pck-Gen, welches für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codiert, b) pgi-Gen, welches für Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert, c) poxB-Gen, welches für Pyruvat-Oxidase codiert, oder d) ein als zwa2 bezeichnetes Gen, welches unter der Nummer DSM 13113 hinterlegt ist, abgeschwächt ist oder gleichzeitig abgeschwächt sind, fermentiert werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Anzahl der Kopien des zwf-Gens gemäß Anspruch 1 durch Veränderung der Bakterien mittels Plasmid-Vektoren, die dieses Gen tragen, erhöht wird, um die Verstärkung zu erzielen.
Verfahren nach Anspruch 5 bis 11, wobei die Anzahl der Kopien der weiteren Gene oder Nucleotidsequenzen durch Veränderung der Bakterien mittels Plasmid-Vektoren, die diese Gene oder Nucleotidsequenzen tragen, erhöht wird, um die Verstärkung der Gene oder Nucleotidsequenzen zu erzielen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei Allele des zwf-Gens gemäß Anspruch 1, die aufgrund der Degenerationsneigung des genetischen Codes entstehen, verstärkt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei Allele des zwf-Gens gemäß Anspruch 1, die aufgrund von sense-Mutationen neutraler Art entstehen, verstärkt werden.