DE60127972T2

DE60127972T2 - Nukleotidsequenzen die für das dep34-gen kodieren

Info

Publication number: DE60127972T2
Application number: DE60127972T
Authority: DE
Inventors: Mike Farwick; Klaus Huthmacher; Walter Pfefferle; Thomas Hermann; Brigitte Bathe
Original assignee: Evonik Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-09-09
Filing date: 2001-08-11
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-08-12
Also published as: DE60127972D1; DE10112429A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Beschreibung stellt Nukleotidsequenzen aus coryneformen Bakterien bereit, die für das dep34-Gen kodieren und die Erfindung stellt ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von Bakterien bereit, in denen das dep34-Gen eliminiert ist.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, werden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, in der Nahrungsmittelindustrie und vor allem in der Tierernährung verwendet.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation aus Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Aufgrund ihrer großen Bedeutung wird beständig daran gearbeitet, die Herstellungsverfahren zu verbessern. Verbesserungen des Verfahrens können sich auf die Fermentationsmaßnahmen beziehen, wie zum Beispiel Rühren und Sauerstoffzufuhr, oder auf die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder auf die Aufarbeitung zur Produktform, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie, oder auf die inneren Output-Eigenschaften des Mikroorganismus selbst.
Methoden zur Mutagenese, Selektion und Mutantenselektion werden verwendet, um die Outputeigenschaften dieser Mikroorganismen zu verbessern. Stämme, die gegen Antimetaboliten resistent sind oder für Metaboliten von regulatorischer Bedeutung auxotroph sind, und Aminosäuren produzieren, werden auf diese Weise erhalten.
Methoden der DNA-Rekombinantionstechnik wurden ebenfalls einige Jahre lang benutzt, um den Stamm der Corynebacterium-Stämme zu verbessern, die L-Aminosäure produzieren, indem einzelne Aminosäuren-Biosynthesegene amplifiziert wurden und die Wirkung auf die Aminosäureproduktion erforscht wurde.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder hatten zur Aufgabe, neue Maßnahmen für die verbesserte fermentative Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Kurzdarstellung der Erfindung
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt wird, sind damit nicht nur die Basen sondern auch die Salze, wie z. B. Lysinmonohydrochlorid oder Lysinsulfat gemeint.
Die Beschreibung stellt ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien bereit, das eine Polynukleotidsequenz umfasst, die für das dep34-Gen kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

a) Polynukleotid, das bis zu einem Umfang von mindestens 70 % mit einem Polynukleotid identisch ist, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 2 umfasst,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die bis zu einem Umfang von mindestens 70 % mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 2 identisch ist,
c) Polynukleotid, das komplementär zu den Polynukleotiden aus a) oder b) ist, und
d) Polynukleotid, das mindestens 15 aufeinander folgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz aus a), b) oder c) umfasst,

Die Beschreibung stellt ebenfalls das oben genannte Polynukleotid bereit, wobei dieses bevorzugt eine DNA ist, die zur Replikation fähig ist, umfassend:

(i) die Nukleotidsequenz, die in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt wird, oder
(ii) mindestens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Degenerationsbereichs des genetischen Codes entspricht, oder
(iii) mindestens eine Sequenz, die mit den Sequenzen hybridisiert, die zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementär sind, und optional
(iv) Sinnmutationen neutraler Funktion in (i).

Die Beschreibung stellt ebenfalls bereit:
ein Polynukleotid, insbesondere DNA, die zur Replikation fähig ist, und die Nukleotidsequenz, wie in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt, umfasst;
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ-ID-Nr. 2 gezeigt, umfasst;
Die Erfindung stellt bereit:
Einen Vektor, dessen Restriktionskarte in 1 reproduziert ist,
und coryneforme Bakterien, bei denen das dep34-Gen, insbesondere durch eine Insertion oder Deletion, eliminiert ist.
Die Beschreibung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die im Wesentlichen eine Polynukleotidsequenz umfassen, die erhältlich sind durch Screenen mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank eines coryneformen Bakteriums, die das vollständige Gen oder Teile davon umfasst, mit einer Sonde, die die Sequenz des Polynukleotids gemäß der Erfindung gemäß SEQ-ID-Nr. 1 oder einem Fragment davon umfasst, und die Isolierung der erwähnten Polynukleotidsequenz.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Beschreibung umfassen, sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um in voller Länge Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die für das Effluxprotein Dep34 kodieren oder jene Nukleinsäuren oder Polynukleotide oder Gene zu isolieren, die eine starke Ähnlichkeit mit der Sequenz des dep34-Gens aufweisen. Sie sind auch zur Inkorporation in so genannte "Arrays", "Mikroarrays" oder "DNA-Chips" geeignet, um die entsprechenden Polynukleotide nachzuweisen und zu bestimmen.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Beschreibung umfassen, sind ferner als Primer geeignet, mit deren Hilfe die DNA von Genen, die für das Effluxprotein Dep34 kodieren, durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden können.
Solche Oligonukleotide, die als Sonden oder Primer dienen, umfassen mindestens 25, 26, 27, 28, 29 oder 30, bevorzugt mindestens 20, 21, 22, 23 oder 24, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18 oder 19 aufeinander folgende Nukleotide.
Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40, oder mindestens 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 oder 50 Nukleotiden sind auch geeignet.
Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 100, 150, 200, 250 oder 300 Nukleotiden sind optional auch geeignet.
"Isoliert" bedeutet aus seiner natürlichen Umgebung separiert.
"Polynukleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydeoxyribonukleotide, wobei es möglich ist, dass diese nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sind.
Die Polynukleotide gemäß der Beschreibung beinhalten ein Polynukleotid gemäß SEQ-ID-Nr. 1 oder ein Fragment, das daraus hergestellt wurde, und auch jene, die mindestens 70 % bis 80 %, bevorzugt mindestens 81 % bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 86 % bis 90 %, und ganz besonders bevorzugt mindestens 91 %, 93 %, 95 %, 97 % oder 99 % identisch sind mit dem Polynukleotid gemäß SEQ-ID-Nr. 1 oder einem Fragment, das daraus hergestellt wurde.
"Polypeptide" sind in der Bedeutung von Peptiden oder Proteinen zu verstehen, die zwei oder mehr Aminosäuren umfassen, die über Peptidbindungen verbunden sind.
Die Polypeptide gemäß der Erfindung beinhalten ein Polypeptid gemäß SEQ-ID-Nr. 2, insbesondere jene mit der biologischen Aktivität des Effluxproteins Dep34 und auch jene, die mindestens 70% bis 80%, bevorzugt mindestens 81% bis 85%, besonders bevorzugt mindestens 86% bis 90% und ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 93%, 95%, 97% oder 99% identisch mit dem Polypeptid gemäß SEQ-ID-Nr. 2 sind und die erwähnte Aktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur fermentativen Herstellung coryneformer Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren und in denen Nukleotidsequenzen, die für das dep34-Gen kodieren, eliminiert sind.
Der Begriff "Attenuation" beschreibt in diesem Zusammenhang die Verringerung oder Elimination der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden DNA kodiert sind, zum Beispiel unter Verwendung eines schwachen Promoters oder unter Verwendung eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym mit einer geringen Aktivität kodiert, oder das entsprechende Gen oder Enzym (Protein) deaktiviert, und optional die Kombination dieser Maßnahmen.
Durch Attenuationsmaßnahmen wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen auf 0 bis 75%, 0 bis 50%, 0 bis 25%, 0 bis 10% oder 0 bis 5% der Aktivität oder Konzentration des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins im Ausgangsmikroorganismus reduziert.
Die Mikroorganismen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können Aminosäuren aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Zellulose oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Sie können Repräsentanten coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium sein. Aus der Gattung Corynebacterium kann insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum erwähnt werden, die unter Experten für ihre Fähigkeit, L-Lysin zu produzieren, bekannt ist.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum (C. glutamicum), sind insbesondere die bekannten Wildtyp-Stämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 and
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und L-Lysin-produzierende Mutanten oder Stämme, die daraus hergestellt werden.
Das neue dep34-Gen aus C. glutamicum, das für das Effluxprotein Dep34 kodiert, wurde isoliert.
Um das dep34-gen oder auch andere Gene aus C. glutamicum zu isolieren, wird zuerst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) aufgebaut. Der Aufbau von Genbanken wird in allgemein bekannten Lehr- und Handbüchern beschrieben. Das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie [Genes and Clones, An Introduction to Genetic Engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) können als Beispiel erwähnt werden. Eine gut bekannte Genbank ist die des E.-coli-K-l2-Stamms W3110, der in λ-Vektoren von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) aufgebaut wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E.-coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) aufgebaut wurde.
Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326)) (1992)) beschreiben ihrerseits eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn and Collins, 1980, Gene 11, 291–298).
Um eine Genbank von C. glutamicum in E. coli herzustellen, ist es auch möglich, Plasmide zu verwenden, wie etwa pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807–818) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268). Geeignete Wirte sind insbesondere jene E.-coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefektiv sind, wie zum Beispiel der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die langen DNA-Fragmente, die mit Hilfe von Cosmiden oder anderen λ-Vektoren kloniert werden, können ihrerseits subkloniert und anschließend in den üblichen Vektoren sequenziert werden, die zur DNA-Sequenzierung geeignet sind, z. B. von Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben.
Die resultierenden DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen oder Sequenzanalyseprogrammen erforscht werden, wie z. B. das von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), das von Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829–1836 (1988)) oder das GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)).
Die DNA-Sequenz von C. glutamicum, die für das dep34-Gen kodiert, und die als SEQ-ID-Nr. 1 Bestandteil der vorliegenden Beschreibung ist, wurde gezeigt. Ferner wurde die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins aus der vorliegenden DNA-Sequenz durch die oben beschriebenen Methoden abgeleitet. Die resultierende Aminosäuresequenz des dep34-Genprodukts wird in SEQ-ID-Nr. 2 gezeigt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die aus SEQ-ID-Nr. 1 durch Degeneration des genetischen Codes resultieren, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung. Auf die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ-ID-Nr. 1 oder Teilen von SEQ-ID-Nr. 1 hybridisieren, ein Bestandteil der Beschreibung. Herkömmliche Aminosäureaustausche, wie z. B. der Austausch von Glycin für Alanin oder von Asparaginsäure für Glutaminsäure in Proteinen, sind ferner unter Fachleuten als "Sinnmutationen" bekannt, die nicht zu einer grundlegenden Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. dass sie von neutraler Funktion sind. Es ist ferner bekannt, dass Veränderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen können oder sie sogar stabilisieren können. Informationen in diesem Kontext kann der Fachmann unter anderem in Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), in O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), in Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), in Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern zu Genetik und Molekularbiologie finden. Aminosäuresequenzen, die auf entsprechende Weise aus SEQ-ID-Nr. 2 resultieren, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
Auf die gleiche Weise sind DNA-Sequenzen, die mit SEQ-ID-Nr. 1 oder Teilen von SEQ-ID-Nr. 1 hybridisieren, ein Bestandteil der Beschreibung. Schließlich sind DNA-Sequenzen, die durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primer hergestellt werden, die aus SEQ-ID-Nr. 1 resultieren, ein Bestandteil der Beschreibung. Solche Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifikation von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung kann der Fachmann unter anderem in dem Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255–260 (1991)) finden. Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt also, dass nur Hybride gebildet werden, in denen die Sonden- und Targetsequenz, d. h. die Polynukleotide, die mit der Sonde behandelt wurden, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung, einschließlich der Waschschritte, durch die Variation der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst oder bestimmt wird.
Die Hybridisierungsreaktion wird bevorzugt unter einer, verglichen mit den Waschschritten, relativ niedrigen Stringenz durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Ein 5 × SSC-Puffer bei einer Temperatur von ungefähr 50 °C bis 68 °C kann zum Beispiel für die Hybridisierungsreaktion benutzt werden. Sonden können hier ebenfalls mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% mit der Sequenz der Sonde identisch sind. Solche Hybride sind weniger stabil und werden unter stringenten Bedingungen durch Waschen entfernt.
Dies kann zum Beispiel durch Absenken der Salzkonzentration auf 2 × SSC und optional anschließend auf 0,5 × SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ungefähr 50 °C bis 68 °C etabliert wird. Es ist optional möglich, die Salzkonzentration auf 0,1 × SSC zu senken. Polynukleotidfragmente, die Zum Beispiel mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% identisch mit der Sequenz der benutzten Sonde sind, können isoliert werden, indem die Hybridisierungstemperatur schrittweise von 50 °C auf 68 °C, in Schritten von ungefähr 1 bis 2 °C, erhöht wird. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form so genannter Kits auf dem Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Katalog-Nr. 1603558).
Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann der Fachmann unter anderem in dem Handbuch von Gait: Oligonukleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and in Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) finden.
Es wurde herausgefunden, dass coryneforme Bakterien L-Lysin nach der Elimination des dep34-Gens auf verbesserte Weise produzieren.
Um eine Elimination zu erreichen können entweder die Expression des dep34-Gens oder die katalytischen Eigenschaften des Enzymproteins eliminiert werden. Die beiden Maßnahmen können optional kombiniert werden.
Die Reduktion der Genexpression kann durch geeignete Kultivierung oder durch genetische Modifikation (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression stattfinden. Signalstrukturen der Genexpression sind zum Beispiel Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promoter, Attenuatoren, Ribosomen-Bindungsstellen, der Startcodon und Terminatoren.
Der Fachmann kann Informationen dazu z. B. in der Patentanmeldung WO 96/15246 , in Boyd and Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), in Voskuil and Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), in Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), in Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)), Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)) und in bekannten Lehrbüchern zur Genetik und Molekularbiologie, wie z. B. das Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder das von Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) finden.
Mutationen, die zu einer Veränderung oder Reduktion der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind auf dem Stand der Technik bekannt; Beispiele, die erwähnt werden können, sind die Arbeiten von Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611–8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760–1762 (1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: Canceling the allosteric regulation and structure of the enzyme]", Reports from the Jülich Research Center, Jul-2906, ISSN09442952, Jülich, Deutschland, 1994). Zusammenfassende Beschreibungen können in bekannten Lehrbüchern zur Genetik und Molekularbiologie gefunden werden, wie z. B. das von Hagemann ("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mögliche Mutationen sind Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen. Abhängig von der Wirkung des Aminosäureaustauschs auf die Enzymaktivität beziehen sich "Fehlsinnmutationen" oder "Nichtsinnmutationen" darauf.
Insertionen oder Deletionen mindestens eines Basenpaars (bp) in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen, in deren Folge unrichtige Aminosäuren inkorporiert werden, oder die Translation vorzeitig unterbrochen wird. Deletionen mehrerer Codone führen typischerweise zu einem vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung solcher Mutationen sind Stand der Technik sind in bekannten Lehrbüchern zur Genetik und Molekularbiologie zu finden, wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers ("Molekulare Genetik [Molecular Genetics]", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und Klone [Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Eine übliche Methode zum Mutieren von Genen von C. glutamicum ist eine Methode der "Genunterbrechung" und des "Genersatzes", die von Schwarzer and Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)) beschrieben wird.
Bei der Methode der Genunterbrechung wird ein zentraler Teil der kodierenden Region des interessierenden Gens in einen Plasmidvektor geklont, der sich in einem Wirt (typischerweise E. coli), aber nicht in C. glutamicum, replizieren kann. Mögliche Vektoren sind zum Beispiel pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pK18mobsacB oder pK19mobsacB (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174: 5462–65 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; US-Patentschrift 5,487,993 ), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516). Der Plasmidvektor, der den zentralen Teil der kodierenden Region des Gens enthält, wird dann in den gewünschten Stamm von C. glutamicum durch Konjugation oder Transformation transferiert. Das Verfahren der Konjugation wird zum Beispiel von Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation werden zum Beispiel von Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican and Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "Crossing-over-Ereignisses", wird die kodierende Region des fraglichen Gens durch die Vektorsequenz unterbrochen, und es werden zwei unvollständige Allele erhalten, wobei einem das 3'-Ende und dem anderen das 5'-Ende fehlt. Diese Methode wurde zum Beispiel von Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575–580 (1994)) verwendet, um das recA-Gen von C. glutamicum zu eliminieren.
Bei der Methode des "Genersatzes" wird eine Mutation, wie z. B. eine Deletion, Insertion oder ein Hasenaustausch in vitro in dem interessierenden Gen etabliert. Das hergestellte Allel wird seinerseits in einen Vektor kloniert, der für C. glutamicum nicht replikativ ist, und dieser wird dann in den gewünschten Wirt von C. glutamicum durch Transformation oder Konjugation tranferiert.
Nach homologer Rekombination mittels eines ersten "Crossing-over-Ereignisses", das die Integration bewirkt und eines geeigneten zweiten "Crossing-over-Ereignisses", das die Exzision in dem Targetgen oder in der Targetsequenz bewirkt, wird die Inkorporation der Mutation oder des Allels erreicht. Diese Methode wurde zum Beispiel von Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915–927 (1998)) verwendet, um das pyc-Gen von C. glutamicum durch eine Deletion zu eliminieren.
Eine Deletion, Insertion oder ein Basenaustausch kann auf diese Weise in das dep34-Gen inkorporiert werden.
Außerdem kann es für die Produktion con L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Elimination des dep34-Gens, ein oder mehrere Enzyme des speziellen Biosynthesewegs, der Glycolyse, der Anaplerose, des Citronensäurezyklus, des Pentosephosphatzyklus, des Aminosäureexports und optional von Regulationsproteinen zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang den Anstieg der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme (Proteine) in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden DNA kodiert sind, zum Beispiel durch Erhöhen der Anzahl der Kopien des Gens oder der Gene unter Verwendung eines potenten Promoters oder unter Verwendung eines Gens oder Allels, das für ein entsprechendes Enzym (Protein) kodiert, das eine hohe Aktivität aufweist, und optional die Kombination dieser Maßnahmen.
Durch Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Proteins im Allgemeinen um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, bis zu einem Maximalwert von 1.000% oder 2.000% erhöht, basierend auf der des Wildtyp-Proteins oder der Aktivität oder Konzentration des Proteins in dem Ausgangsmikroorganismus.
Somit können zur Herstellung von L-Aminosäuren zusätzlich zur Elimination des dep34-Gens gleichzeitig ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

• dem dapA-Gen, das für Dihydrodipicolinatsynthase kodiert ( EP-B 0 197 335 ),
• dem gap-Gen, das für Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem tpi-Gen, das für Triosephosphat-Isomerase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem pgk-Gen, das für 3-Phosphoglyceratkinase kodiert (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• dem zwf-Gen, das für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase kodiert ( JP-A-09224661 ),
• dem pyc-Gen, das für Pyruvate-Carboxylase kodiert ( DE-A 198 31 609 ),
• dem mqo-Gen, das für Malatchinon-Oxidoreductase kodiert (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
• dem lysC-Gen, das für eine Feedback-resistente Aspartatkinase kodiert (Zulassungsnr. P26512; EP-B-0387527 ; EP A-0699759 ; WO 00/63388 ),
• dem lysE-Gen, das für Lysinexport kodiert ( DE-A-195 48222 ),
• dem hom-Gen, das für Homoserin-Dehydrogenase kodiert ( EP-A 0131171 ),
• dem ilvA-Gen, das für Threonin-Dehydratase kodiert (Möckel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065 8072)) oder dem ilvA(Fbr)-Allel, das für eine "Feedback-restistente" Threonindehydratase kodiert (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833–842),
• dem ilvBN-Gen, das für Acetohydroxysäure-Synthase kodiert ( EP-B 0356739 ),
• dem ilvD-Gen, das für Dihydroxysäure-Dehydratase kodiert (Sahm and Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973–1979),
• dem zwa1-Gen, das für das Zwa1-Protein kodiert ( DE: 19959328.0 , DSM 13115), überexprimiert werden.

Es kann ferner zur Produktion von L-Aminosäuren zusätzlich zur Elimination des dep34-Gens vorteilhaft sein, wenn gleichzeitig ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

• dem pck-Gen, das für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodiert ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047),
• dem pgi-Gen, das für Glucose-6-phosphat-Isomerase kodiert ( US 09/396,478 , DSM 12969),
• dem poxB-Gen, das für Pyruvatoxidase kodiert ( DE: 1995 1975.7 , DSM 13114),
• dem zwa2-Gen, das für das Zwa2-Protein kodiert ( DE: 19959327.2 , DSM 13113),

Zusätzlich zur Elimination des dep34-Gens kann es ferner vorteilhaft für die Produktion von Aminosäuren sein, unerwünschte Nebenreaktionen zu eliminieren (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die Erfindung stellt auch die Mikroorganismen bereit, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, und diese können kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder in Fed-Batch (Zulaufverfahren) oder im wiederholten Fed-Batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zweck der Produktion von L-Lysin kultiviert werden. Eine Zusammenfassung der bekannten Kulturmethoden ist in dem Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss den Anforderungen der speziellen Stämme auf geeignete Weise entsprechen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind in dem Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.
Zucker und Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Ole und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie zum Beispiel Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure können als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie etwa Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, können als Stickstoffquelle verwendet werden. Diese Stickstoffquellen können einzeln oder als Gemisch verwendet werden.
Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze können als Phosphorquelle verwendet werden.
Das Kulturmedium muss ferner Metallsalze umfassen, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können wesentliche Wachstumssubstanzen, wie etwa Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben erwähnten Substanzen benutzt werden.
Geeignete Vorläufer können dem Kulturmedium überdies zugefügt werden. Die erwähnten Ausgangssubstanzen können der Kultur in Form einer Einzelcharge zugefügt werden, oder sie können auf geeignete Weise während der Kultur zugeführt werden.
Basische Verbindungen, wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder Ammoniak in wässriger Lösung, oder saure Verbindungen, wie etwa Phosphorsäure oder Schwefelsäure können auf geeignete Weise benutzt werden, um den pH-Wert der Kultur einzustellen. Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglycolester, können benutzt werden, um die Schaumentwicklung zu steuern. Geeignete Substanzen, die eine selektive Wirkung aufweisen, wie zum Beispiel Antibiotika, können dem Medium zugefügt werden, um die Stabilität der Plasmide aufrecht zu erhalten. Um die aeroben Bedingungen aufrecht zu erhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie zum Beispiel Luft, in die Kultur eingeführt. Die Temperatur der Kultur liegt üblicherweise zwischen 20 °C und 45 °C, und bevorzugt zwischen 25 °C und 40 °C. Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis sich eine maximale Menge des gewünschten Produkts gebildet hat. Dieses Ziel wird üblicherweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Methoden zur Bestimmung von L-Aminosäuren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Analyse kann somit zum Beispiel durchgeführt werden, wie von Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, durch Anionenaustauschchromatographie mit nachfolgender Ninhydrinableitung, oder sie kann durch Umkehrphasen-HPLC durchgeführt werden, wie zum Beispiel von Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174) beschrieben.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird zur fermentativen Herstellung von L-Lysin verwendet.
Die folgenden Mikroorganismen wurden am 05.03.2001 als Reinkultur bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany) in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag hinterlegt:

• Escherichia coli top10/pCR2.1dep34int als DSM 14144.

Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden mit Hilfe der Ausführungsbeispiele ausführlicher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli und alle Techniken der Restriktion, Klenow- und alkalischen Phosphatasebehandlung wurden mit der Methode von Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) durchgeführt.
Methoden zur Transformation von Escherichia coli werden ebenfalls in diesem Handbuch beschrieben.
Die Zusammensetzung der üblichen Nährmedien, wie etwa LB- oder TV-Medium ist ebenfalls in dem Handbuch von Sambrook et al. zu finden.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus C. glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde isoliert wie von Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84:2160–2164), erhalten von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vector Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzyme XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 270948-02) gespalten und ebenso mit alkalischer Shrimp-Phosphatase dephosphoryliert. Die Cosmid-DNA wurde dann mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und die Charge wurde mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde dann mit Hilfe von Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack IIXL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen gepackt.
Zur Infektion des E.-coli-Stramms NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension gemischt. Die Infektion und Titrierung der Cosmidbank wurde durchgeführt, wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg/ml Ampicillin plattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37 °C wurden einzelne rekombinante Klone selektiert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des dep34-Gens
Die Cosmid-DNA einer einzelnen Kolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) in Übereinstimmung mit den Anleitungen des Herstellers isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Shrimp-Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert.
Nach Separation durch Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente in der Größenordnung von 1.500 bis 2.000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, erhalten von Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in dem Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde durchgeführt wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben, wobei das DNA-Gemisch über Nacht mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde dann einer Elektroporation (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol. Letters, 123: 343–7) in den E.-coli-Stamm DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S. A., 87: 4645–4649). Letters, 123: 343–7) unterzogen und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert.
Die Plasmidherstellung der rekombinanten Klone wurde mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die Sequenzierung wurde durchgeführt mit der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen gemäß Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Das "RRdRhodamin Terminator Cycle Sequenzing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) wurde verwendet. Die Separation durch Gelelektrophorese und Analyse der Sequenzierungsreaktion wurden durchgeführt in einem "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide"-Gel (29: 1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prism 377" Sequenzierer von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Sequenz-Rohdaten wurden dann unter Verwendung des Staden-Programmpakets verarbeitet (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) Version 97-0. Die einzelnen Sequenzen der pZeroI-Derivate wurden zu einer kontinuierlichen Contig zusammengefügt. Die computergestützten Analysen der kodierenden Region wurden mit dem XNIP-Programm (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) hergestellt. Weitere Analysen wurde mit dem "BLAST Search Program" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402) gegen die nicht redundante Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
Die resultierende Nukleotidsequenz wird in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt. Die Analyse der Nucleotidsequenz zeigte einen offenen Leserahmen von 1.650 bp, der dep34-Gen genannt wurde. Das dep34-Gen kodiert für ein Polypeptid von 549 Aminosäuren.
Beispiel 3
Herstellung eines Integrationsvektors zur Integrationsmutagenese des dep34-Gens
Aus dem Stamm ATCC 13032 wurde chromosomale DNA mit der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert. Auf der Basis der Sequenz des dep34-Gens, die für C. glutamicum aus Beispiel 2 bekannt ist, wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion ausgewählt (vgl. SEQ-ID- Nr. 3 und SEQ-ID-Nr. 4):
dep34-int1:
5' CTG TGC TGC TGA AAC TTC C 3'
dep34-int2:
5' AGIT CCA ATG AGA GCC AAG C 3'
Die gezeigten Primer wurden von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion wurde mit der Standard-PCR-Methode von Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) mit der Taq-Polymerase von Boehringer Mannheim (Deutschland, Produktbeschreibung Taq DNA polymerase, Produkt-Nr. 1 146 165) durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion ermöglichen die Primer die Amplifikation eines inneren Fragments des dep34-Gens mit einer Größe von 541 bp. Das auf diese Weise amplifizierte Produkt wurde elektrophoretisch in einem 0,8%-igen Agarosegel getestet.
Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA Cloning Kit von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalognummer K4500-01) in den Vektor pCR2.1-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657–663) ligiert.
Der E.-coli-Stamm TOP10 wurde dann mit der Ligationscharge einer Elektroporation unterzogen (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Die Selektion der Plasmid tragenden Zellen wurde durchgeführt, indem die Transformationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), das mit 50 mg/l Kanamycin angereichert worden war, ausplattiert wurde. Die Plasmid-DNA wurde aus einer Transformante mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließender Agarosegelelektrophorese (0,8%) überprüft. Das Plasmid wurde pCR2.1dep34int genannt und wird in 1 gezeigt.
Beispiel 4
Integrationsmutagenese des dep34-Gens in den Stamm DSM 5715
Der in Beispiel 3 erwähnte Vektor pCR2.1dep34int wurde einer Elektrophorese unterzogen mit einer Elekroporationsmethode von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715. Der Stamm DSM 5715 ist ein AEC-resistenter Lysinproduzent. Der Vektor pCR2.1dep34int kann sich nicht unabhängig in DSM5715 replizieren und wird in der Zelle nur dann zurückgehalten, wenn er sich in das Chromosom von DSM 5715 integriert hat. Die Selektion von Klonen, die pCR2.1dep34int in das Chromosom integriert hatten, wurde durchgeführt, indem die Elektroporationscharge auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), das mit 15 mg/l Kanamycin angereichert worden war, ausplattiert wurde.
Zum Nachweis der Integration wurde das dep34int-Fragment mit dem Dig hybridization kit von Boehringer durch die Methode "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) markiert. Chromosomale DNA eines potentiellen Integranten wurde mit der Methode von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) isoliert, und in jedem Fall mit den Restriktionsenzymen KpnI, EcoRI und PstI gespalten. Die gebildeten Fragmente wurden mittels Agarosegelelektrophorese separiert und bei 68 °C mit dem Dig Hybridization Kit von Boehringer hybridisiert. Das in Beispiel 3 erwähnte Plasmid pCR2.1dep34int wurde in das Chromosom von DSM5715 innerhalb des chromosomalen dep34-Gens inseriert. Der Stamm wurde DSM5715::pCR2.1dep34int genannt.
Beispiel 5
Herstellung von Lysin
Der C.-glutamicum-Stamm DSM5715::pCR2.1dep34int, der in Beispiel 4 erhalten wurde, wurde in einem Nährmedium kultiviert, das zur Produktion von Lysin geeignet ist, und der Lysingehalt in dem Kulturüberstand wurde bestimmt.
Hierfür wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33 °C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyer-Kolben). Das vollständige CgIII-Medium wurde als Medium für die Vorkultur verwendet. CgIII-Medium

NaCl 2,5 g/l

Baktopepton 10 g/l

Bakto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (separat autoklaviert) 2 % (w/v)

Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 gebracht.

Kanamycin (25 mg/l) wurde hier zugefügt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden lang bei 33 °C bei 240 U/Min. auf einer Rüttelmaschine inkubiert. Eine Hauptkultur wurde aus dieser Vorkultur angeimpft, so dass die anfängliche OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 OD betrug. Für die Hauptkultur wurde MM-Medium verwendet. MM-Medium

CSL (Maisquellwasser)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (separat autoklaviert)	50 g/l
Salze:
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7 H₂O	1,0 g/l
CaCl₂·2 H₂O	10 mg/l
FeSO₄·7 H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (sterilgefiltert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (sterilgefiltert)	0,2 mg/l
Leucin (sterilgefiltert)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurde mit Ammoniak in wässriger Lösung auf einen pH-Wert von 7 gebracht und autoklaviert. Die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen wurden dann zugefügt, und das in trockenem Zustand autoklavierte CaCO₃ wird zugefügt.
Die Kultivierung wird in einem 10 ml Volumen in einem 100-ml-Erlenmeyer-Kolben mit Dampfsperre durchgeführt. Kanamycin (25 mg/l) wurde zugefügt. Die Kultivierung wurde bei 33 °C und 80% Luftfeuchtigkeit durchgeführt.
Nach 72 Stunden wurde die OD mit einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Reckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge an Lysin, die sich gebildet hatte, wurde mit einem Aminosäurenanalysator von Eppendorf BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
Das Ergebnis des Versuchs wird in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Stamm OD (660 nm) Lysin HCl g/l

DSM5715 8,7 12,64

DSM5715::pCR2.1d ep34int 9,1 14,14
Kurze Beschreibung der Figur:
1: Karte des Plasmids pCR2.1dep34int.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung.

KmR:: Kanamycinresistenzgen
KpnI:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms KpnI
EcoRI:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
PstI:: Spaltstelle des Restriktionsenzyms PstI
dep34int:: Internes Fragment des dep34-Gens
ColE1:: Replikationsstartpunkt des Plasmids ColE1

Sequenzprotokoll

Claims

Coryneforme Bakterien in denen die Expression eines Polynukleotids, das ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ-ID-Nr: 2 aufweist, wobei das Polypeptid die Funktion eines Effluxproteins aufweist, eliminiert wird.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Bakterium von der Gattung Corynebacterium ist.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Bakterium von der Spezies Corynebacterium glutamicum ist.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz von 259 bis 1905 der SEQ-ID-Nr: 1 aufweist.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid die Nukleotidsequenz der SEQ-ID-Nr: 1 aufweist.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, das die Fermentation der Bakterien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, die L-Lysin produzieren, umfasst.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, das die Fermentation der L-Lysin produzierenden Bakterien umfasst, wobei die intrazelluläre Aktivität des Polypeptids, das in SEQ-ID-Nr: 2 gezeigt wird, eliminiert wird.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, das die Fermentation der L-Lysin produzierenden Bakterien umfasst, wobei die Expression des Polynukleotids (dep34 Gen), die in SEQ-ID-Nr: 1 dargelegt ist, eliminiert wird.
Integrationsvektor pCR2.1dep34int, der 9.1. ein 541 bp großes internes Fragment des dep34-Gens trägt, wobei das dep34-Gen ein Polynukleotid ist, das ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ-ID-Nr: 2 aufweist, 9.2. dessen Restriktionskarte in 1 reproduziert ist, und 9.3. der im E.-coli-Stamm Top10/pCR2.1dep34int unter der Nr. DSM 14144 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellenkulturen hinterlegt ist.
Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Schritte ausgeführt werden: a) Fermentation eines coryneformen Bakteriums, das L-Lysin produziert und in dem mindestens das dep34-Gen eliminiert wird, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz mit der SEQ-ID-Nr: 2 umfasst; b) Konzentration des L-Lysins in dem Medium oder in den Zellen der Bakterien, und c) Isolierung des L-Lysins.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das coryneforme Bakterium von der Gattung Corynebacterium ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das coryneforme Bakterium von der Spezies Corynebacterium glutamicum ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nukleotid sequenz die Nukleotide 259 bis 1905 der SEQ-ID-Nr: 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Nukleotidsequenz die SEQ-ID-Nr: 1 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei zur Herstellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert werden, bei denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 15.1 dem dapA-Gen, das für Dihydrodipicolinatsynthase kodiert, 15.2 dem gap-Gen, das für Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, 15.3 dem tpi-Gen, das für Triosephosphat-Isomerase kodiert, 15.4 dem pgk-Gen, das für 3-Phosphoglyceratkinase kodiert, 15,5 dem zwf-Gen, das für Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase kodiert, 15.6 dem pyc-Gen, das für Pyruvat-Carboxylase kodiert, 15.7 dem mqo-Gen, das für Malatchinin-Oxidoreductase kodiert, 15.8 dem lysC-Gen, das für eine Feedback-resistente Aspartatkinase kodiert, 15.9 dem lysE-Gen, das für Lysinexport kodiert, 15.10 dem hom-Gen, das für Homoserin- Dehydrogenase kodiert, 15.11 dem ilvA-Gen, das für Threonin-Dehydratase kodiert, oder dem ilvA(Fbr)-Allel, das für eine Feedback-resistente Threonin-Dehydratase kodiert, 15.12 dem ilvBN-Gen, das für Acetohydroxysäure-Synthase kodiert, 15.13 dem ilvD-Gen, das für Dihydroxysäure-Dehydratase kodiert, 15.14 dem zwa1-Gen, das für das Zwa1-Protein kodiert, überexprimiert ist oder sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei zur Hestellung von L-Lysin coryneforme Mikroorganismen fermentiert werden, bei denen gleichzeitig eines oder mehrere der Gene, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 16.1 dem pck-Gen, das für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodiert, 16.2 dem pgi-Gen, das für Glucose-6-Phosphat-Isomerase kodiert, 16.3 dem poxB-Gen, das für Pyruvatoxidase kodiert, 16.4 dem zwa2-Gen, das für das Zwa2-Protein kodiert, eliminiert wird oder werden.