DE60127116T2

DE60127116T2 - Für das glbo-gen kodierende nukleotidsequenzen aus corynebacterium glutamicum

Info

Publication number: DE60127116T2
Application number: DE60127116T
Authority: DE
Inventors: Bettina Möckel; Achim Marx; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa GmbH
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2021-04-28
Also published as: ATE356210T1; US20020081673A1; CN1432066A; AU2001273977A1; WO2001094569A2; US20030166173A1; US6759218B2; WO2001094569A3; EP1287143A2; EP1287143B1; DE60127116D1

Description

Gegenstand der folgenden Erfindung sind coryneforme Bakterien, in denen eine Nukleotidsequenz des glbO-Gens überexprimiert wird, sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das glbO-Gen überexprimiert wird.
Stand der Technik
L-Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, doch ganz besonders in der Tierernährung Anwendung.
Es ist bekannt, daß L-Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen ihrer großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung des Herstellungsverfahrens gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rühren und Versorgen mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform, zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl verwendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite, wie beispielsweise das Lysinanalog S-(2-Aminoethyl)cystein, oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Lysin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Verbesserung von L-Aminosäuren produzierenden Corynebacterium-Stämmen eingesetzt, indem man einzelne Biosynthesegene für L-Aminosäuren amplifiziert und die Auswirkungen auf die L-Aminosäureproduktion untersucht. Übersichtsartikel zu diesem Thema finden sich unter anderem bei Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain und Solomon (Hrsg.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger, (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) und Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)). Die WO92/03546 richtet sich auf ein Verfahren zur Expression von bakteriellem Hämoglobin in coryneformen Bakterien. Das glbO-Gen wurde aus Vitreoscilla erhalten.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin bereitzustellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt wird, so ist damit nicht nur die Base, sondern sind auch Salze, wie beispielsweise Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat, gemeint.
In der Beschreibung wird ein isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien bereitgestellt, das eine aus der folgenden Gruppe ausgewählte Polynukleotidsequenz enthält:

a) Polynukleotid das mindestens zu 70% mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2, codiert, identisch ist,
b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 70% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:2 identisch ist, codiert,
c) Polynukleotid, das zu den Polynukleotiden in a) oder b) komplementär ist, und
d) Polynukleotid mit wenigstens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Polynukleotidsequenz in a), b) oder c), wobei das Polypeptid vorzugsweise die Aktivität des hämoglobinartigen Proteins zeigt.

Gegenstand der folgenden Beschreibung ist ebenso ein Polynukleotid, bei dem es sich vorzugsweise um in coryneformen Bakterien replizierbare rekombinante DNA handelt.
Gegenstand der vorliegenden Beschreibung ist ebenso ein Polynukleotid, bei dem es sich um RNA handelt.
Gegenstand der folgenden Beschreibung ist ebenso ein wie oben beschriebenes Polynukleotid, wobei dieses vorzugsweise eine das folgende enthaltende replizierbare DNA umfaßt:

(i) die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleotidsequenz, oder
(ii) wenigstens eine Sequenz, die mit der Sequenz (i) im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen Codes übereinstimmt, oder
(iii) wenigstens eine Sequenz, die mit der zu Sequenz (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
(iv) funktionell neutrale Sense-Mutationen in (i).

Gegenstand der vorliegenden Beschreibung ist ebenso ein das Polynukleotid gemäß der Beschreibung enthaltender Vektor.
Gegenstand der Erfindung sind als Wirtszellen fungierende coryneforme Bakterien, die den Vektor enthalten oder in denen das glbO-Gen überexprimiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Beschreibung sind ebenso Polynukleotide, die weitgehend aus einer Polynukleotidsequenz, die durch Screening mittels Hybridisierung einer geeigneten Genbibliothek, welche das vollständige Gen mit der Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des angegebenen Polynukleotids gemäß SEQ ID NO: 1 enthält oder einem Fragment davon, erhältlich sind, sowie die Isolierung der angegebenen DNA-Sequenz.
Die Sequenzen gemäß der Beschreibung enthaltende Polynukleotide eignen sich als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA zur Isolierung von Vollängen-cDNA, die für das hämoglobinartige Protein (glbO) codieren, sowie zur Isolierung solcher cDNA oder Gene, deren Sequenz große Ähnlichkeit zu der des Gens für das hämoglobinartige Protein zeigt.
Polynukleotide, die die Sequenzen gemäß der Beschreibung enthalten, eignen sich weiterhin als Primer für die Herstellung von DNA von Genen, die für das hämoglobinartige Protein codieren, mittels Polymerasekettenreaktion (PCR).
Derartige Oligonukleotide, die als Sonden oder Primer fungieren, enthalten mindestens 30, vorzugsweise mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15, aufeinander folgende Nukleotide. Oligonukleotide mit einer Länge von wenigstens 40 oder 50 Nukleotiden sind ebenso geeignet.
"Isoliert" bedeutet getrennt von seiner natürlichen Umgebung.
"Polynukleotid" bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide, wobei die RNA bzw. DNA nicht modifiziert oder modifiziert sein kann.
Unter "Polypeptiden" versteht man Peptide oder Proteine, die mindestens zwei durch Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
Die Polypeptide gemäß der Beschreibung umfassen ein Polypeptid gemäß SEQ ID NO:2, insbesondere solche mit der biologischen Aktivität des hämoglobinartigen Proteins und ebenso solche, die mindestens zu 70% mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO:2 identisch sind und die vorzugsweise mindestens 80% und insbesondere mindestens 90% bis 95% Identität mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO:2 sowie die angegebene Aktivität zeigen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien, die insbesondere bereits L-Lysin produzieren und in denen die Nukleotidsequenzen das glbO-Gens überexprimiert werden.
In diesem Zusammenhang beschreibt der Begriff "Verstärkung" die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die von der entsprechenden DNA codiert werden, beispielsweise durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, durch Verwendung eines starken Promoters oder eines Gens, das für ein entsprechendes Enzym mit erhöhter Aktivität codiert, sowie gegebenenfalls durch Kombinieren dieser Maßnahmen.
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Mikroorganismen können L-Lysin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose, oder aus Glycerin und Ethanol produzieren. Die Mikroorganismen können Vertreter der coryneformen Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium, umfassen. Innerhalb der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in Fachkreisen für ihre Fähigkeit zur Produktion von L-Aminosäuren bekannt ist.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
sowie daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten oder Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
Das glbO-Gen, das für das hämoglobinartige Protein aus C. glutamicum codiert, wurde isoliert.
Das glbo-Gen oder auch andere Gene aus C. glutamicum werden isoliert, indem man zunächst eine Genbibliothek dieses Mikroorganismus in E. coli konstruiert. Die Konstruktion von Genbibliotheken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern beschrieben. Zu nennen sind hier beispielsweise das Lehrbuch von Winnacker, Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim; Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Eine sehr bekannte Genbibliothek ist die des E. coli K-12-Stamms W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in λ-Vektoren konstruiert wurde. Von Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) wird eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032 beschrieben, die unter Verwendung des Cosmid Vektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) im E. coli K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) konstruiert wurde.
Von Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326, 1992)) wird ebenso eine Genbibliothek von C. glutamicum ATCC13032 mit Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). beschrieben.
Eine Genbibliothek von C. glutamicum in E. coli kann auch unter Verwendung von Plasmiden wie etwa pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268), hergestellt werden. Als Wirte sind insbesondere diejenigen E. coli Stämme geeignet, die Restriktions- und Rekombinationsdefekte aufweisen. Ein Beispiel für einen solchen Stamm ist der Stamm DH5αMCR, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können dann wiederum in herkömmlichen zur Sequenzierung geeigneten Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, wie beispielsweise bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977) beschrieben.
Die für das glbO-Gen codierende DNA-Sequenz aus C. glutamicum wurde erhalten und wird durch die vorliegende Beschreibung als SEQ ID NO:1 bereitgestellt. Weiterhin wurde die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins aus der obigen DNA-Sequenz unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren abgeleitet. SEQ ID NO:2 zeigt die erhaltene Aminosäuresequenz des Produkts des glbO-Gens.
Sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes aus der SEQ ID NO:1 ergebende codierende DNA-Sequenzen sind ebenso Gegenstand der vorliegenden Beschreibung. Konservative Austausche von Aminosäuren in Proteinen, beispielsweise der Austausch von Alanin gegen Glycin oder von Glutaminsäure gegen Asparaginsäure, sind in Fachkreisen als "Sense Mutationen" bekannt, die zu keiner grundlegenden Änderung der Aktivität des Proteins führen. d.h. die funktionell neutral sind. Weiterhin ist bekannt, daß Änderungen am N- und/oder C-terminus eines Proteins dessen Funktion weitgehend nicht beeinträchtigen oder diese sogar stabilisieren können. Informationen in diesem Zusammenhang findet der Fachmann unter anderem in Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), in O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) sowie in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Sich in entsprechender Weise aus der SEQ ID NO:2 ergebende Aminosäuresequenzen sowie DNA-Sequenzen, die für diese Aminosäuresequenzen codieren, sind ebenso Gegenstand der vorliegenden Beschreibung.
In ähnlicher Weise sind DNA-Sequenzen, die mit der SEQ ID NO:1 oder Teilen der SEQ ID NO:1 hybridisieren, Gegenstand der Erfindung. Schließlich sind DNA-Sequenzen, die mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von aus der SEQ ID NO:1 erhaltenen Primern hergestellt werden, ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Derartige Oligonukleotide weisen typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden auf.
Für den Fachmann finden sich Angaben zu Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" von Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und in Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) sind für den Fachmann unter anderem im Lehrbuch von Gait, Oligonucleotide Synthesis: a Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) sowie bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) zu finden.
Es stellte sich heraus, daß coryneforme Bakterien L-Lysin in verbesserter Weise produzieren, sobald das glbO-Gen überexprimiert wird.
Eine Überexpression kann durch Erhöhen der Kopienzahl der entsprechenden Gene oder Mutieren des Promotor- und Regulationsbereichs oder der stromaufwärts vom Strukturgen liegenden Ribosomen-Bindungsstelle erzielt werden. Stromaufwärts vom Strukturgen eingebaute Expressionskassetten wirken auf die gleiche Weise. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die Expression während der fermentativen Produktion von L-Aminosäuren mittels induzierbarer Promotoren zu erhöhen. Ebenso wird die Expression durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA verbessert. Zudem wird die Enzymaktivität durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden in variabler Kopienanzahl vorliegen, oder im Chromosom integriert und amplifiziert werden. Als Alternative kann man eine Überexpression der betreffenden Gene auch durch Modifizierung der Zusammensetzung der Nährmedien und Kulturbedingungen erreichen.
Der Fachmann findet in diesem Zusammenhang Anleitungen unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in EP 0 472 869 , in US 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), bei WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)), sowie in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Als Beispiel wurde das erfindungsgemäße glbO-Gen mit Hilfe von Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide sind solche, die in coryneformen Bakterien replizieren, geeignet. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie beispielsweise pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren, wie beispielsweise die auf pCG4 (US-A 4,489,160), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), oder pAG1 (US-A 5,158,891) beruhenden Vektoren können auf die gleiche Weise verwendet werden.
Ferner sind als Plasmidvektoren solche geeignet, mit deren Hilfe die Genamplifikation über die Integration in das Chromosom durchgeführt werden kann, wie beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), für die Vervielfältigung bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei diesem Verfahren wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al, Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison WI, USA, pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84, US-A 5,487,993), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541(1993)) oder pEM1 (Schrumpf et al, 1991 Journal of Bacteriology 173:4510-4516) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Das Verfahren der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Verfahren zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "crossing over"-Ereignisses enthält der erhaltene Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend auch ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, bei dem ein mit einem Plasmidvektor transformierter Stamm verwendet wird und der Plasmidvektor die Nukleotidsequenz des für das hämoglobinartige Protein codierenden Gens trägt.
Darüber hinaus kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, nicht nur das glbO-Gen sondern auch weitere Gene des Biosynthesewegs der gewünschten L-Aminosäure überzuexprimieren, so daß ein oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosynthesewegs, der Glykolyse, des anaplerotischen Stoffwechsels oder des Aminosäureexports überexprimiert wird/werden.
Somit besteht beispielsweise für die Herstellung von L-Lysin die Möglichkeit, zusätzlich zur Überexpression des glbO-Gens gleichzeitig ein oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Dihydropicolinat-Synthase codierende dapA-Gen (EP-B 0 197 335),
• das für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase codierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
• das für die Triosephosphat-Isomerase codierende tpi-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
• das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase codierende pgk-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),
• das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086), und
• das für ein Protein des Lysin-Exports codierende lysE-Gen (DE-A-195 48 222)

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des glbO-Gens die Expression

• des für die Phosphorenolpyruvat-Carboxykinase codierenden pck-Gens ( DE 199 50 409.1 , DSM 13047), und/oder des für die Glucose-6-phosphat Isomerase codierenden pgi-Gens (US 09/396,478, DSM 12969),
• des für die Pyruvat-Oxidase codierenden poxB-Gens (DE: 199 51 975.79) gleichzeitig abzuschwächen, insbesondere zu reduzieren.

Weiterhin kann es für die Herstellung von L-Lysin vorteilhaft sein, zusätzlich zur Überexpression des glbO-Gens unerwünschte Nebenreaktionen zu unterdrücken (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
Zum Zwecke der Herstellung von L-Lysin, können die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen kontinuierlich oder diskontinuierlich im Batch-(Satzkultivierung) oder im Fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) bzw. Repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquellen können Zucker und Kohlenhydrate wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie beispielsweise Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie beispielsweise Glycerin und Ethanol, sowie organische Säuren, wie beispielsweise Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Gemische verwendet werden.
Als Stickstoffquellen können organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie etwa Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen, wie etwa Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, verwendet werden. Dabei können die Stickstoffquellen einzeln oder als Gemische verwendet werden.
Als Phosphorquellen können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß darüber hinaus Salze von Metallen enthalten, wie beispielsweise Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle wachstumsfördernde Stoffe, wie etwa Aminosäuren und Vitamine, ebenso zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Überdies können dem Kulturmedium geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen, wie etwa Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser, oder saure Verbindungen, wie etwa Phosphor- oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäure-Polyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie beispielsweise Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie beispielsweise Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 ºC bis 45 ºC und vorzugsweise bei 25 ºC bis 40 ºC. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:

a) Fermentation der L-Lysin produzierenden coryneformen Bakterien, bei der wenigstens das für das hämoglobinartige Protein codierende glbO-Gen überexprimiert wird;
b) Anreicherung des L-Lysins im Medium oder in den Bakterienzellen und
c) Isolierung des L-Lysins.

Die Analyse von L-Lysin kann, wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben, durch Anionenaustauschchromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbibliothek aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
Chromosomale von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 DNAe wurde wie bei Tauch et al., (1995 Plasmid 33: 168-179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) teilweise geschnitten. Die DNA-Fragmente wurden mit SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250)) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), bezogen von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) geschnitten und ebenso mit SAP dephosphoryliert.
Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) geschnitten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC-13032-DNA gemischt, und der Ansatz wurde mit T4 DNA- Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4 DNA Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Der Ligationsansatz wurde dann in Phagen unter Verwendung von Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt.
Der E. coli-Stamm NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) wurde infiziert, indem die Zellen im 10 mM MgSO₄ suspendiert und mit einem Aliquot der Phagensuspension gemischt wurden. Die Cosmid-Bibliothek wurde wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben infiziert und titriert, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37 ºC wurden einzelne rekombinante Klone selektioniert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des glbO-Gens
Cosmid-DNA aus einer Einzelkolonie wurde gemäß der Anweisungen des Herstellers mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) teilweise geschnitten. Die DNA-Fragmente wurden mit SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach Trennung mittels Gelelektrophorese wurden die Cosmidfragmente mit einer Größe von 1500 bis 2000 Bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die DNA des Sequenziervektors pZero-1, bezogen von Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01, wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) geschnitten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 erfolgte wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour) beschrieben, wobei das DNA-Gemisch über Nacht mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) inkubiert wurde. Dieser Ligationsansatz wurde dann mittels Elektroporation in den E. coli-Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) übertragen, und der Ansatz wurde auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert.
Plasmide der rekombinanten Klone wurden unter Verwendung des Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland) präpariert. Die Sequenzierung erfolgte mit dem Didesoxykettenterminationsverfahren nach Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) mit der Modifikation nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Dabei wurde der "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Trennung mittels Gelelektrophorese sowie die Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem "Rotiphorese NF"-Acrylamid/Bisacrylamid-Gel (29:1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung des "ABI Prism 377"-Sequenzierautomaten von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen rohen Sequenzdaten wurden dann unter Verwendung des Softwarepakets Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231), Version 97-0, prozessiert. Dabei wurden die einzelnen Sequenzen der pZero1-Derivate zu einem kohäsiven "Contig" zusammengesetzt. Eine rechnergestützte Analyse des codierenden Bereichs wurde mit der Software XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) durchgeführt. Die weitere Analyse erfolgte mit den "BLAST search programs" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) gegen die nichtredundante Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in der Sequenz ID Nr. 1 angegeben. Die Analyse der Nukleotidsequenz ergab ein offenes Leseraster von 393 Basenpaaren, das die Bezeichnung glbO-Gen erhielt. Das glbO-Gen codiert für ein Protein aus 131 Aminosäuren.
Beispiel 3
Herstellung eines Shuttle-Vektors pEC-K18mob2glbOexp zur Überexpression des glbO-Gens in C. glutamicum.
3.1 Herstellung des E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Vektors pEC-K18mob2
Der E. coli-C.glutamicum-Shuttle-Vektor wurde gemäß dem Stand der Technik konstruiert. Der Vektor enthält den Replikationsbereich rep des Plasmids pGA1, einschließlich des Replikationseffektors per (US-A-5,175,108: Nesvera et al.; Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), das aph(3')-IIa-Gen des Transposons Tn5, das Kanamycinresistenz verleiht (Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982)), den Replikationsbereich oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), das lacZα-Genfragment, einschließlich des lac-Promotors und einer Mehrfachklonierungsstelle (mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101-106 (1983)), sowie den mob-Bereich des Plasmids RP4 (Simon et al., Bio/Technology 1:784-791 (1983)). Der konstruierte Vektor wurde dann in den E. coli-Stamm DH5α (Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. Bd. I IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert.
Plasmidtragende Zellen wurden durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war, selektioniert. Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit der Firma Qiagen isoliert und durch Restriktion mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII und nachfolgender Agarosegelelektrophorese (0,8%) verifiziert. Das Plasmid wurde pEC-K18mob2 genannt und ist in 1 dargestellt.
Der folgende Mikroorganismus wurde am 20. Januar 2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt:

• C. glutamicum-Stamm DSM 5715/pEC-K18mob2 als DSM 13245

3.2 Klonierung von glbO im E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-K18mob2
Bei dem verwendeten Vektor handelt es sich um den in Beispiel 3.1 beschriebenen E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-K18mob2. DNA aus diesem Plasmid wurde vollständig mit dem Restriktionsenzym Ecl136II geschnitten und anschließend mit SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert.
Chromosomale DNA wurde aus dem Stamm ATCC 13032 unter Verwendung des Verfahrens von Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) isoliert. Auf der Grundlage der aus Beispiel 2 bekannten Sequenz des glbO-Gens für C. glutamicum wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion ausgewählt:
glb-exp1, dargestellt in SEQ ID No: 3
5'GGT CGG TGA GAT AAT CAG 3'
glb-exp2, dargestellt in SEQ ID No: 4
5'TGG CAG AAG TTA AGC GTG 3'
Die angegebenen Primer wurden von der Firma ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) synthetisiert und die PCR-Reaktion gemäß dem Standard PCR-Verfahren von Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) unter Verwendung von Pwo-Polymerase von Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Deutschland) durchgeführt. Mittels der Polymerasekettenreaktion wird durch die Primer die Amplifikation eines 936 kb großen DNA-Fragments, das das glbO-Gen trägt, gestattet.
Das auf diese Weise erhaltene glbO-Fragment wurde mit dem vorbereiteten Vektor pEC-K18mob2 gemischt und der Ansatz mit T4 DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4 DNA Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Anschließend wurde der Ligationsansatz in den E. coli-Stamm DH5α (Hanahan, in: DNA cloning. A Practical Approach. Bd. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA) transformiert. Plasmidtragende Zellen wurden durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1:1990) mit 25 mg/l Kanamycin selektioniert. Nach Inkubation über Nacht bei 37 ºC wurden einzelne rekombinante Klone ausgewählt. Aus einem Transformanten wurde Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI und EcoRI/PstI geschnitten, um das Plasmid mit der anschließenden Agarosegelelektrophorese zu überprüfen. Die DNA-Sequenz des amplifizierten DNA-Fragments wurde durch Sequenzieren überprüft. Das erhaltene Plasmid wurde pEC-K18mob2glbOexp genannt. Es ist in 2 dargestellt.
Beispiel 4
Transformation des Stamms DSM5715 mit dem Plasmid pEC-K18mob2glbOexp
Der Stamm DSM5715 wurde dann mit dem Plasmid pEC-K18mob2glbOexp unter Verwendung des von Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsverfahrens transformiert. Die Tranformantenselektion erfolgte auf LBHIS-Agar, bestehend aus 18,5 g/l Brain-Heart Infusion-Bouillon, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, supplementiert mit 25 mg/l Kanamycin. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 2 Tagen bei 33 ºC.
Plasmid-DNA wurde aus einem Tansformanten mit den üblichen Verfahren (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927) isoliert, mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und EcoRI/PstI geschnitten, und das Plasmid wurde durch anschließende Agarosegelelektrophorese überprüft.
Eine Reinkultur des Stamms wurde DSM5715/pEC-K18mob2glbOexp genannt.
Beispiel 5
Herstellung von Lysin
Der in Beispiel 4 erhaltene Stamm C. glutamicum DSM5715/pEC-K18mob2glbOexp wurde in einem zur Lysinproduktion geeigneten Nährmedium kultiviert und der Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Dazu wurde der Stamm zunächst auf einer Agarplatte 24 Stunden bei 33º C mit dem entsprechenden Antibiotikum (Brain-Heart-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (auf 10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). Als Medium für diese Vorkultur wurde das Komplett-Medium CgIII verwendet. Medium CgIII

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Hefeextrakt 25 g/l

Glucose (getrennt autoklaviert) 2% (w/v)
Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt.

Dieses Medium wurde mit Kanamycin (25 mg/l) versetzt. die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33 ºC auf einem Schüttler bei 240 UpM inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur so angeimpft, daß der OD (660 nm)-Anfangswert der Hauptkultur bei 0,05 lag. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM

CSL (Corn Steep Liquor; Maisquellwasser)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert)	50 g/l
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7 H₂O	1,0 g/l
CaCl₂·2 H₂O	10 mg/l
FeSO₄·7 H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (steril filtriert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (steril filtriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (steril filtriert)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 eingestellt und autoklaviert.
Anschließend werden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen sowie das trocken autoklavierte CaCO₃ zugesetzt.
Die Kultivierung erfolgt in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen.
Kanamycin (25 mg/l) wurde zugegeben. Die Kultivierung erfolgte bei 33 ºC und 80 % Luftfeuchte.
Nach 72 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Meßwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Die gebildete Lysinmenge wurde mit einem Aminosäureanalysator der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) über Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
In Tabelle 1 ist das Ergebnis des Versuchs dargestellt.
Tabelle 1
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Karte des Plasmids pEC-K18mob2
2: Karte des Plasmids pEC-K18mob2glbOexp
Die Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgenden Bedeutungen. Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um Näherungswerte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit von Messungen erhalten werden.

per:: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl aus pGA1
oriV:: ColE1-ähnlicher Ursprung aus pMB1
rep:: Plasmidcodierter Replikationsbereich aus dem C. glutamicum-Plasmid pGA1
RP4mob: RP4-Mobilisierungsstelle
lacZ-alpha:: lacZ-Gen-Fragment aus E. coli
Kan:: Kanamycinresistenz-Gen
glbO:: glbO-Gen aus C. glutanicum
EcoRI:: Restriktionsstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII:: Restriktionsstelle des Restriktionsenzyms HindIII
PstI:: Restriktionsstelle des Restriktionsenzyms PstI
Ecl136II:: Restriktionsstelle des Restriktionsenzyms Ecl136II

SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

L-Lysin produzierendes coryneformes Bakterium, wobei ein für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die mindestens zu 90% mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist, codierendes Polynukleotid aus Corynebacterium glutamicum rekombinant überexprimiert wird, wobei es sich bei dem Polypeptid um das hämoglobinartige Protein handelt.
Bakterium gemäß Anspruch 1, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 95% mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz identisch ist.
Bakterium gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotid aus der folgenden Gruppe gewählt wird: a) Polynukleotid mit der wie in SEQ ID NO:1 angegebenen Sequenz; oder b) Polynukleotide mit den der Sequenz SEQ ID NO:1 im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen c) Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen; o, der d) Polynukleotide mit den Nukleotidsequenzen mit neutralen Sense-Mutationen in SEQ ID NO:1.
Bakterium nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid die in SEQ ID NO:2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist.
Bakterium gemäß Ansprüchen 1 bis 4, wobei das Bakterium mit einem Vektor transformiert wird, der ein aus der folgenden Gruppe gewähltes Polynukleotid enthält: a) Polynukleotid mit der wie in SEQ ID NO:1 angegebenen Sequenz; oder b) Polynukleotide mit den der Sequenz SEQ ID NO:1 im Rahmen der Degeneriertheit des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen; oder c) Polynukleotide mit den Nukleotidsequenzen mit neutralen Sense-Mutationen in SEQ ID NO:1.
Verfahren zur Herstellung von L-Lysin, bei dem man ein Bakterium gemäß Anspruch 1 bis 5 in einem geeigneten Medium fermentiert.
Verfahren zur fermentativen Herstellung gemäß Anspruch 6, wobei man die folgenden Schritte ausführt: a) Fermentation der coryneformen Bakterien; b) Anreicherung von L-Lysin im Medium oder in den Bakterienzellen und c) Isolierung von L-Lysin.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei coryneforme Bakterien aus der Gattung Corynebacterium stammen.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Bakterium fermentiert wird, in dem ein Gen bzw. mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe das für die Dihydropicolinat-Synthase codierende dapA-Gen, das für die Pyruvat-Carboxylase codierende pyc-Gen, das für die Triosephosphat-Isomerase codierende tpi-Gen, das für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierende gap-Gen, das für die 3-Phosphoglycerat-Kinase codierende pgk-Gen und das für ein Protein des Lysin-Exports codierende lysE-Gen, gleichzeitig überexprimiert wird bzw. werden.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Bakterium fermentiert wird, in dem ein Gen bzw. mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pck-Gen, das für die Glucose-6-phosphat-Isomerase codierende pgi-Gen, das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen, gleichzeitig abgeschwächt wird bzw. werden.
Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 10, wobei Mikroorganismen der Spezies Corynebacterium glutamicum verwendet werden.
Sonde oder Primer, bestehend aus den Oligonukleotiden der SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 oder dem Komplement davon.