DE60033783T2

DE60033783T2 - Regulatorische/entfaltende peptide von ezrin

Info

Publication number: DE60033783T2
Application number: DE60033783T
Authority: DE
Inventors: Rupert Donald Holms
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-15
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2020-09-16
Also published as: PL348635A1; CZ20011689A3; HUP0104254A2; AU770208B2; ES2283317T3; JP2003511389A; EP1760090A1; GB2354241A; EP1131348B1; ATE356144T1; BR0007158A; PT1131348E; RU2215005C2; HUP0104254A3; CA2348780A1; WO2001025275A9; WO2001025275A1; CN100387619C; CY1106644T1; ZA200103938B

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Peptide, die sich bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, Krebs und Zuständen des Immunsystems eignen.
Hintergrund
Ezrin ist ein Mitglied der ERM-Familie (Ezrin-Radixin-Moesin) von Proteinen, die in einem großen Bereich von Zelltypen strukturelle und regulatorische Rollen spielen. Es gibt erhebliche Anzeichen dafür, dass Ezrin die Struktur des kortikalen Zytoskeletts reguliert, um die Zelloberflächentopographie zu steuern.
Eine ausführliche Analyse der Sekundärstruktur von Ezrin zeigt, dass drei Hauptstrukturdomänen vorliegen: eine N-terminate Domäne von den Aminosäuren 1 bis 300, eine hochgradig geladene α-Domäne von den Aminosäuren 300 bis 470 und eine C-terminate Domäne von den Aminosäuren 470 bis 585.
WO-95/33768 beschreibt, dass ein als HEP1 identifiziertes Peptid mit 14 Aminosäuren, d. h. TEKKRRETEREKE (identisch mit den Aminosäuren 324-337 von humanem Ezrin), das eine 70%ige Identität mit dem C-Terminus von gp120 aufweist, in vivo die HIV-Replikation beim Menschen hemmen kann. Zu diesem Zeitpunkt nahm ich an, dass die beobachtete anti-HIV-Wirkung auf die Induktion einer immunologischen Toleranz gegen autoreaktive Immunreaktionen, die durch den C-Terminus von HIV-gp120 induziert werden, zurückzuführen ist.
Gould et al., EMBO J., Bd. 8(13) (1989), 4133-42 beschreibt Peptide, die mit Teilen des HEP-Rezeptors identisch sind.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die lösliche Konformation von Ezrin, die im Zytoplasma auftritt, umfasst zwei benachbarte helikale α-Domänen, die an einer Gelenkregion (M339-M340) zu zwei antiparallelen Helices zusammengefaltet sind, die durch komplementäre Seitenkettenladungen der primären Aminosäuresequenz stabilisiert werden. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die positiv und negativ geladenen Seitenketten der Aminosäuresequenz der HEP-Rezeptordomäne A komplementär zu den positiv und negativ geladenen Seitenketten der Aminosäuresequenz der HEP-Rezeptordomäne B sind.
In der aktivierten offenen Konformation von Ezrin ermöglicht die Wechselwirkung der Domäne A und der Domäne B der HEP-Rezeptoren von zwei verschiedenen Ezrin-Molekülen die Bildung von antiparallelen Dimeren. Zusätzlich zu den antiparallelen Dimeren von Ezrin, die unter der Zelloberfläche entstehen, habe ich festgestellt, dass diese Dimeren zwischen einem HEP-Rezeptor, der an der Oberfläche an einer Zelle exponiert ist, mit einem HEP-Rezeptor, der an der Oberfläche einer anderen Zelle exponiert ist, entstehen können. Wenn die beiden HEP-Rezeptoren während einer engen Assoziation von zwei Zelloberflächen in Kontakt gelangen, wird in beiden Zellen ein Aktivierungssignal initiiert. Beliebige geladene Moleküle, die partiell die Wechselwirkung zwischen den Seitenkettenladungen der Domäne A und der Domäne B des HEP-Rezeptors nachahmen, veranlassen die Entstehung einer medizinisch wertvollen biologischen Reaktion.
Die Erfindung beruht auch auf der Erkenntnis, dass die anti-HIV-Aktivität von HEP1 auf dessen Bindung an die HEP-Rezeptordomäne B und die Induktion einer neuen Immunreaktion zurückzuführen ist.
Erfindungsgemäß umfasst ein Peptid zur Behandlung von infektiösen Erkrankungen, Krebs oder einem Zustand des Immunsystems mindestens 5 aufeinanderfolgende Aminosäuren der folgenden Sequenz mit 34 Aminosäuren:
MREKEELMLRLQDY(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ.
Bei der Sequenz mit 34 Aminosäuren handelt es sich um die HEP-Rezeptordomäne B (Aminosäuren 340-373 von humanem Ezrin), wobei in der membranassoziierten Konformation von Ezrin Tyrosin 353 [Y] zu Phosphotyrosin [Yp] phosphoryliert sein kann. Ich habe festgestellt, dass die Domäne B des HEP-Rezeptors die Stelle von Ezrin ist, an die HIV-gp120 während einer Hirninfektion bindet (HIV gp120 bindet an die HEP-Rezeptordomäne B unter Heranziehung seiner geladenen C-terminalen Aminosäuren, die eine 70%ige Identität mit einem Teil der HEP-Rezeptordomäne A aufweisen). Neue geladene Moleküle, die an den HEP-Rezeptor binden, können sich zur Behandlung von HIV-bedingter Demenz eignen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein erfindungsgemäßes Peptid zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von infektiöser Erkrankung, Krebs oder einem Zustand des Immunsystems verwendet.
Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Peptide weisen vorzugsweise 5 bis 13 Aminosäuren auf. Beispielhafte erfindungsgemäße Peptide sind die folgenden, die HEP-Rezeptordomäne A bindenden Peptide:

Rupe2024: KEELM
Rupe2032: KEELMLRLQDYEE
Rupe2032p: KEELMLRLQDYpEE
Rupe2132: EELMLRLQDYEE
Rupe2132p: EELMLRLQDYpEE
Rupe2232: ELMLRLQDYEE
Rupe2232p: ELMLRLQDYpEE
Rupe2428: MLRLQ
Rupe2832: QDYEE
Rupe2832p: QDYpEE

Weitere Peptide oder andere geladene Moleküle, die die Domäne A des HEP-Rezeptors binden, sind vermutlich biologisch aktiv. Diese Peptide oder andere geladene Moleküle können oral oder auf anderen Wegen verabreicht werden, um verschiedene infektiöse Krankheiten und Krebs zu behandeln.
Herstellung
Erfindungsgemäß verwendete Peptide lassen sich beispielsweise unter Anwendung eines Festphasenverfahrens herstellen, wobei man sich der Boc- oder Fmoc-Chemie oder einer anderen praxisgerechten Möglichkeit der Peptidsynthese, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannt sind, bedient.
Eine stufenweise Festphasensynthese mit Boc-Aminosäuren lässt sich auf der Grundlage des Verfahrens von Merrifield durchführen (Journal of American Chemical Society, Bd. 85, S. 2149-2154). Die folgenden Verbindungen können verwendet werden: Novabiochem-Harz: Boc-Glu(OBzl)-PAM, Aminosäuren: Boc-Lys (2Cl-Z-)OH, Boc-Glu(OBzl)OH, Boc-Arg(Tos)OH, Boc-Val-OH, Boc-Thr (Bzl)-OH, Lösungsmittel: DMF (Rathburn), Dichlormethan (BDH), Ethylacetat (BDH), Reagenzien: HBTU (Phase Separations Ltd.), p-Cresol (Lanchester), TFA (Halocarbon Products Corporation), HF (BOC), DIEA (Fluka). Empfohlene reaktive Seitenketten-Schutzgruppen für Boc-Aminosäuren sind: Arg (Tos), Asn (Xan), Asp (OcHxl), Glu (OcHxl), Gln (Xan) oder Gln, His (DNP), Lys (CIZ), Serin (Bzl), Tyr (BrZ), Trp (CHO). Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen: DCC = Dicyclohexylcarbodiimid, DIC = Diisopropylcarbodiimid, DCM = Dichlormethan, DMF = Dimethylformamid, TFA = Trifluoressigsäure, Boc = tert.-Butyloxycarbonyl, HOBT = Hydroxybenzotriazol, DIEA = Diisopropylethylamin, DCU = Dicyclohexylharnstoff.
Beispielsweise kann die Boc-Synthese eines erfindungsgemäßen Peptids folgendermaßen durchgeführt werden. Für eine HBTU-Aktivierung/in situ-Neutralisation im 0,5 mmol-Maßstab verwendet man 0,5 mmol Harz und einen 3-fachen Überschuss einer aktivierten Boc-Aminosäure. Die Boc-Aminosäure und das Aktivierungsreagenz (HBTU) sollen in äquimolaren Mengen verwendet werden, d. h. jeweils 2 mmol entsprechen in diesem Fall einem 3-fachen Überschuss. DIEA wird sowohl zur Neutralisation des Harzes für die Kupplung als auch zur Aktivierung der Boc-Aminosäure verwendet (somit werden 2,5 mmol verwendet, 1 Äquivalent Boc-Aminosäure und 1 Äquivalent Harz). Reagenzien: 0,5 M HBTU in DMF (MG = 379, 0,5 M = 18,95 g in 100 ml; gegenüber Licht nicht stabil) erfordern 2 mmol = 4 ml und 2,5 mmol DIEA = 0,46 ml (MG = 129, d = 0,742). Aktivierung von Aminosäuren: die Boc-Aminosäure soll erst unmittelbar vor der Zugabe zum Harz aktiviert werden, insbesondere im Fall von Arg (Tos). Für sämtliche Boc-Aminosäuren: 2 mmol Boc-Aminosäure werden in ein 20 ml fassendes Probenfläschchen aus Glas eingewogen. 4 ml 0,5 M HBTU-Lösung werden zugegeben und zur Auflösung des Feststoffes geschüttelt. 0,46 ml DIEA werden zugegeben und vermischt (es kann eine gewisse Farbänderung auftreten). Verfahren: Das Harz wird mit DMF gewaschen. Die Boc-Schutzgruppe wird mit 100 % TFA entfernt. Sodann wird 2-mal 1 Minute geschüttelt, wobei man dazwischen die Flüssigkeit ablaufen lässt. Nach Ablaufen der Flüssigkeit, 1-minütigem Waschen mit fließendem DMF, Ablaufen, Zugeben von aktivierter Aminosäure und 10-minütigem Schütteln wird die Probe aufgenommen und einem Ninhydrintest unterzogen, um den Kupplungswirkungsgrad festzustellen. Nach Beendigung der Synthese wird ein Waschvorgang mit fließendem DMF und anschließend mit DCM durchgeführt. Sodann wird das Produkt getrocknet. Die Synthese bei der ersten und allen anschließenden Stufen der Peptidkonstruktion wird unter Verwendung eines 3-fachen Überschusses an HBTU-aktivierter Boc-Aminosäure in DMF erreicht. Bei sämtlichen Kupplungsvorgängen soll der Kupplungsgrad mehr als 99 % betragen, wie durch quantitativen Ninhydrintest festgestellt wird. Eine Schutzgruppenentfernung an den N-Termini wird in 100 % TFA vorgenommen. Das Harzpeptid wird vor und nach der Schutzgruppenentfernung sorgfältig gewaschen. Nach der letzten Kupplung und Entfernen der Boc-Schutzgruppe wird das Peptidharz mit Dichlormethan gewaschen und an der Luft getrocknet. Das Peptid wird vom Harzträger durch das Verfahren mit hoher HF-Konzentration entfernt (2 g Harzpeptid, 2 g Cresol, 20 ml HF, 1,5 Stunden bei –5 °C), wodurch man das rohe Peptid erhält, das mit Ethylacetat (100 ml) gefällt und in 6 M Guanidin-HCl-0,1 M TRIS-Lösung (20 ml) wieder in Lösung gebracht wird.
Das Peptid lässt sich auf folgende Weise unter Anwendung einer analytischen HPLC-Trennung an einer Vydac-C₁₈-5-RAC-Säule reinigen. Acetonitril von HPLC-Qualität (Aldrich) und Wasser werden durch einen Membranfilter filtriert und vor der Verwendung mit einem Heliumstrom entgast. Eine analytische Trennung wird mit einem Lösungsmittelgradienten erreicht, wobei man mit 0 % Acetonitril beginnt, dessen Konzentration konstant innerhalb von 20 Minuten auf 60 % erhöht, diese Konzentration 20 Minuten beibehält und sodann stetig 10 Minuten lang auf 0 % Acetonitril absenkt, wobei eine konstante Strömungsgeschwindigkeit von 1,2 ml pro Minute eingehalten wird. Eine präparative Trennung des Peptids wird an einer präparativen TSK-Gel-C₁₈-Säule erreicht. Die Trennung wird mit einem Lösungsmittelgradienten erreicht, der mit 0 °C Acetonitril beginnt, wonach eine konstante Zunahme innerhalb von 60 Minuten auf 18 % Acetonitril folgt, anschließend die Konzentration innerhalb von 80 Minuten auf 60 % erhöht wird und diese Konzentration 30 Minuten aufrechterhalten wird, wobei eine konstante Strömung von 8 ml pro Minute eingehalten wird. Der Gradient kann durch zwei mikroprozessorgesteuerte Gilson 302-Einzelkolbenpumpen gesteuert werden. Die Verbindungen lassen sich mit einem Waters 486 Tunable Absorbance Detector bei 214 nm und analytische Chromatographen bei Aufzeichnung mit einem HP-Laserjet 5L nachweisen. Ein Holochrome UV-VIS-Detektor mit 220 nm für präparative Chromatographen kann unter Verwendung eines LKB 2210-Einzelkanal-Rekorders verwendet werden. Eine Qualitätskontrolle durch Kapillarelektrophorese kann unter Verwendung einer Waters Quanta 4000-Einrichtung unter Einsatz von Phosphatpuffer (75 μM), pH-Wert 2,5, durchgeführt werden: 15 kV, Probenzeit 20 Sekunden, Aufsetzen durch hydrostatische Injektion auf eine 60 cm-Säule, Laufzeit 12 Minuten. Die Syntheseausbeute für 1 g (0,46 mmol Harz) soll etwa 250 mg reines Peptid betragen.
Alternative Syntheseverfahren in Lösung können ebenfalls zur Herstellung größerer Mengen der erfindungsgemäßen Peptide verwendet werden. Geschützte Trimerfragmente lassen sich durch stufenweise Synthese nach dem Aktivesterverfahren, das dem Fachmann auf dem Gebiet der Peptidsynthese geläufig ist, erhalten. Die Fragmente werden sodann unter Verwendung von DCC/HOBT nach Entfernung der entsprechenden C- und N-terminalen Schutzgruppen zusammengesetzt. Nach Entfernung sämtlicher Schutzgruppen wird das rohe Peptid partiell durch SP-Sephadex-C25-Ionenaustauschchromatographie gereinigt, wonach sich eine präparative HPLC und eine Lyophilisation anschließen.
Anwendung
0,01 bis 1 000 mg lyophilisiertes Peptid können in 1-10 ml destilliertem Wasser gelöst und oral oder vaginal verabreicht werden. 0,01 bis 1 000 mg können zu einer Pille, einer Kapsel oder einem Suppositorium zusammen mit Trägern, die vom Fachmann auf dem Gebiet der Herstellung von Pillen, Kapseln oder Suppositorien verwendet werden, zubereitet und oral, vaginal oder anal verabreicht werden. Eine steril filtrierte Lösung von 0,001 bis 100 mg Peptid in destilliertem Wasser kann subkutan, intravenös oder intramuskulär injiziert werden.
Die nachstehenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sind in keiner Weise als Beschränkung anzusehen.
Beispiel 1A
Ich habe nachgewiesen, dass HEP-Rezeptorpeptide eine signifikante Adjuvanswirkung besitzen. Dies wird durch Verstärkung der IgG-Antikörperreaktion auf Ovalbumin bei Mäusen und durch Verstärkung der antikörperabhängigen, zytotoxischen Reaktion im Thymus gegen rote Blutkörperchen des Schafes (SRBC) bei Mäusen unter Verwendung von Rupe2032 nachgewiesen.
Die IgG-Reaktion bei Mäusen 2 Wochen nach Injektion von 50 μg Ovalbumin und verschiedenen Konzentrationen an Rupe2032 wurde bestimmt. Die IgG-Reaktion wurde durch die optische Dichte (OD) bei einer 1:100-Verdünnung von Mäuseserum in Gegenwart von Ovalbumin gemessen. In der nachstehenden Tabelle ist die als OD aufgezeichnete IgG-Reaktion angegeben:
In der nachstehenden Tabelle ist die IgG-Reaktion bei Aufzeichnung als OD als relativer Wert bezogen auf 100 für die einzelnen Kontrollen angegeben
Beispiel 1B
Der Einfluss von HEP-Rezeptorpeptiden auf die Aktivierung von Antikörper gegen Schaferythrozyten bildenden Zellen (SRBC) bei Mäusen (CBA-C57B1-Fi-Hybride, Alter 2 Monate, Gewicht 18-22 g) wurde bestimmt. Die Mäuse erhielten zunächst eine intraperitoneale Injektion unter Verwendung von entweder 0,5 ml steriler Kochsalzlösung als Kontrolle oder Rupe2032 im gleichen Volumen wie die Kochsalzlösung. 30 Minuten nach der Injektion von Peptiden wurde jeder Maus eine Zellsuspension mit einem Gehalt an 5 Millionen SRBC intraperitoneal verabreicht. 4 Tage nach der Immunisierung wurden die Tiere durch Gehirndislokation getötet. Die Milzorgane wurden aseptisch gewonnen. Jede Milz wurde in 2 ml Medium 199 homogenisiert. Anschließend wurden 100 ml dieser Suspension in 1 ml in Medium 199 vorbereiteter Agarose (aufbewahrt in einem Wasserbad bei 48 °C) gegeben und die SRBC-Suspension wurde zugegeben, wobei sich eine Endkonzentration von 1 % Agarose ergab. Das 1 ml-Agarose-Zell- Gemisch wurde bewegt und sodann auf eine Petri-Schale übertragen und zum Absetzen gebracht. Nachdem die Agarose einen festen Zustand erreicht hatte, wurde die Petri-Schale 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 0,5 ml eines 1 + 20 verdünnten Meerschweinchenserums in Medium 199 oben auf das Agarosegel als Komplementquelle aufgesetzt. Die Inkubation wurde eine weitere Stunde fortgesetzt. Sodann wurden die Schalen unter Verwendung eines 8x Binokularmikroskops betrachtet und die Anzahl an Plaques wurde gezählt (jede Plaque entspricht einer Antikörper sezernierenden Mäuse-Milzzelle). Die Ergebnisse wurden sowohl als die Anzahl der Antikörper sezernierenden Zellen pro 1 Million nukleierten Milzzellen als auch als Anzahl von Antikörper sezernierenden Zellen pro vollständige Milz angegeben. Da keine mitogene Wirkung beobachtet wurde (die Verabreichung von HEP-Rezeptorpeptid führte zu Mäuse-Milzorganen von normaler Größe), ergaben diese beiden Berechnungen ähnliche Ergebnisse.
In der nachstehenden Tabelle sind die Mittelwerte (30 Mäuse pro Datenpunkt) der Anzahl von Antikörper bildenden Zellen pro 1 Million nukleierten Milzzellen angegeben. Die Daten wurden auf den Wert 100 für jede Kontrollgruppe bezogen.

Claims

Peptid zur Behandlung von infektiöser Erkrankung, Krebs oder einem Zustand, der Stimulation der Immunantwort erfordert, wobei das Peptid mindestens 5 aufeinanderfolgende Aminosäuren der folgenden 34 Aminosäuren-Sequenz umfasst: MREKEELMLRLQDY_(p)EEKTKKAERELSEQIQRALQ
Peptid nach Anspruch 1, das 5 bis 13 Aminosäuren aufweist.
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz KEELM
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz KEELMLRLQDYEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz KEELMLRLQDYpEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz EELMLRLQDYEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz EELMLRLQDYpEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz ELMLRLQDYEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz ELMLRLQDYpEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz MLRLQ
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz QDYEE
Peptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz QDYpEE
Verwendung eines Peptids nach irgendeinem vorhergehendem Anspruch zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von infektiöser Erkrankung, Krebs oder einem Zustand, der Stimulation der Immunantwort erfordert.